EP4003406A1 - Anticorps dirigé contre la protéine oprf de pseudomonas aeruginosa, son utilisation en tant que médicament et composition pharmaceutique le contenant - Google Patents

Anticorps dirigé contre la protéine oprf de pseudomonas aeruginosa, son utilisation en tant que médicament et composition pharmaceutique le contenant

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EP4003406A1
EP4003406A1 EP20742744.4A EP20742744A EP4003406A1 EP 4003406 A1 EP4003406 A1 EP 4003406A1 EP 20742744 A EP20742744 A EP 20742744A EP 4003406 A1 EP4003406 A1 EP 4003406A1
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EP
European Patent Office
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seq
residue
antibody
sequences
xaa
Prior art date
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Pending
Application number
EP20742744.4A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Luc Lenormand
Landry GAYET
Géraldine MAYEUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Polytechnique de Grenoble
Universite Grenoble Alpes
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Polytechnique de Grenoble
Universite Grenoble Alpes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Polytechnique de Grenoble, Universite Grenoble Alpes filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/21—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Pseudomonadaceae (F)

Definitions

  • the present invention relates to the field of the treatment of bacterial infections, in particular infections of the type caused by bacteria of the species Pseudomonas aeruginosa.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody directed against the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa or a functional fragment of this antibody.
  • the invention also relates to a nucleic acid molecule encoding this antibody or antibody fragment, an expression vector comprising such a nucleic acid molecule and a host cell comprising such a nucleic acid molecule or such a vector. expression.
  • the invention also relates to a process for preparing an antibody or antibody fragment according to the invention, as well as the use of this antibody or antibody fragment as a medicament, in particular for the preventive or curative treatment of infections. to Pseudomonas aeruginosa.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition containing such an antibody or antibody fragment.
  • the invention also relates to the use of an antibody or antibody fragment according to the invention for the detection of the bacterium Pseudomonas aeruginosa in a body fluid obtained from an individual, and a kit for such detection, containing such a antibody or antibody fragment.
  • nosocomial infections The prevention and treatment of nosocomial infections is a major concern in the hospital sector. The incidence of these infections is steadily increasing, especially as the pathogens responsible for these infections are increasingly resistant to antibiotics.
  • Pseudomonas aeruginosa in particular represents one of the major causes of nosocomial infections, as well as pneumonia, in hospitals. It is estimated that Pseudomonas aeruginosa is responsible for 10% of nosocomial diseases. The number of people affected by this pathogen is very important, and the associated mortality rate is high in people with impaired immune defenses.
  • Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterium which is particularly involved in acute and chronic infections in artificially ventilated patients as well as those with cystic fibrosis, and which is responsible for septicemia in immunocompromised patients, including transplant patients and severe burns.
  • the strains of Pseudomonas aeruginosa responsible for nosocomial infections are characterized by intrinsic resistance to a wide range of antibiotics and to conventional antibiotic treatments. The elimination of the bacteria is made difficult because of this resistance to antibiotics as well as its ability to form a biofilm in the lungs of patients.
  • Another therapeutic approach envisaged by the prior art is based on the use of antibodies directed against molecular targets conserved in all strains of Pseudomonas aeruginosa.
  • Three antibodies are currently under study: an anti-PcrV which targets the type III secretion system (Shionogi et al., 2016, Hum Vaccin Immunother. 12 (1 1): 2833-2846), an anti-LPS antibody making it possible to kill the bacterium and recruit effectors of the innate immune system, and a bispecific antibody targeting the PcrV and Psi proteins.
  • the present invention thus aims to provide a therapeutic active agent making it possible to fight effectively against bacterial infections, in particular Pseudomonas aeruginosa infections, which overcomes the problems associated with the resistance of Pseudomonas aeruginosa to antibiotics and the absence of effective therapies against this. infectious agent responsible for nosocomial infections and the main cause of death in patients with cystic fibrosis.
  • the present inventors sought to develop new active agents of the anti-infectious antibody type, and they were more particularly interested for this, as a molecular target, in the membrane protein OprF, also called porin OprF.
  • the OprF protein is a very abundant, large diameter, conductive pore 38 kDa protein involved in a large number of varied functions and which is highly conserved in all strains of Pseudomonas aeruginosa (Genbank Accession No .: AFM37279.1) . Its important role in the virulence of Pseudomonas aeruginosa, described by the prior art, makes it a potential target for anti-infectious therapies.
  • Antibodies directed against the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa have been proposed by the prior art, illustrated in particular by documents WO 2016/033547, Moon et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1988, 29: 1277-1284, and Rawling et al., 1995, Infection and Immunity, 63: 38-42.
  • these antibodies are obtained from inoculation, either from soluble fragments of the OprF protein, or of the entire OprF protein solubilized by means of a detergent, that is to say in a form which does not correspond to the native conformation of the protein as adopted within the bacterial membrane. These antibodies therefore cannot recognize conformational epitopes naturally exposed by the protein within the bacteria.
  • the present inventors have discovered that particular antibodies, or parts of these antibodies, directed against the OprF membrane antigen, possess a particularly strong biological neutralization activity of the OprF protein, and this for all of its linear and conformational epitopes. native, and therefore have great therapeutic efficacy against bacterial infections by Pseudomonas aeruginosa. Seeking to produce antibodies which bind specifically to the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa, the present inventors have developed an innovative method, which has led to the discovery of antibodies having a particularly strong affinity for the protein in its native membrane form.
  • This process consists, schematically, in producing antibodies from immune libraries produced in primates from proteoliposomes containing the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa. It is also applicable to antigens other than the OprF porin of Pseudomonas aeruginosa
  • the method for preparing antibodies, or functional fragments of antibodies comprises a step of producing proteoliposomes in which the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa is found in its native and active form, exposing the epitopes conformational.
  • This step can be carried out by bringing an expression vector containing the coding sequence of the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa into contact with a synthetic liposome, in the presence of a cell-free protein synthesis system to form a reaction medium, this system allowing the transcription and simultaneous translation of the protein.
  • the protein fits into the lipid bilayer of the synthetic liposome to form a proteoliposome.
  • the OprF protein is therein in an orientation adequate to exhibit a native conformation and an open channel conformation. More particularly, within the proteoliposomes, the OprF protein is advantageously found in its two forms, open and closed, which are naturally present within the bacterial membrane or in the vesicles released by the bacterium to thwart the immune response.
  • the analysis of the proteoliposomes carried out by the inventors has shown that the OprF protein: is found there in the correct orientation within the liposomal membrane; is present in its two membrane topologies, open and closed, characterized by 8 and 16 transmembrane passages respectively; y forms pores / channels within the liposomal membrane; is found there in oligomerized form.
  • the method developed by the inventors then comprises a step of immunizing a non-human mammal, preferably a macaque (Macaca fascicularis), with these proteoliposomes, then the manufacture of an antibody bank, and in particular of a library of scFv fragments, from bone marrow samples of the immunized subject.
  • a non-human mammal preferably a macaque (Macaca fascicularis)
  • an antibody bank and in particular of a library of scFv fragments
  • the screening by an expression technique, in particular by phage expression (for the English “phage display”), of this scFv bank has enabled the inventors to identify more than 11 sequences associated with positive clones, including the regions. complementarity determination were determined. It has thus been discovered by the present inventors that the antibodies directed against the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa exhibiting specific sequences for the three regions for determining the complementarity of each of the heavy chain and light chain variable regions exhibit an affinity and a particularly important specificity for the native epitopes of this protein, making them active ingredients of choice for the therapeutic treatment of Pseudomonas aeruginosa infections, and all the more so since their primatized nature makes them particularly well tolerated in humans.
  • the term treatment is understood to mean both curative treatment and preventive treatment. We will not prejudge here the phenomena underlying the obtaining of such an advantageous result. However, we can think, as explained above, that it comes at least in part from the combination of the technique of expression of the OprF protein in proteoliposomes and the use of these proteoliposomes to carry out immunization in the macaque . None in the prior art suggested that such a combination could lead to the identification of antibody regions responsible for a specific binding with a very strong affinity of these antibodies with the membrane porin OprF of Pseudomonas aeruginosa, and more particularly its native linear and conformational epitopes.
  • This antibody or functional fragment comprises:
  • CDR complementarity
  • VH-CDR1 GYXaa ! FXaa 2 Xaa 3 Xaa 4 G (SEQ ID NO: 1) in which Xaa ! represents a threonine residue or a serine residue, Xaa2 represents a serine residue or an asparagine residue, Xaa3 represents an arginine residue, a serine residue or a threonine residue and Xaa 4 represents a phenylalanine residue or a tyrosine residue,
  • VFI-CDR2 INAXaasTGKXaa 6 (SEQ ID NO: 2) in which Xaas represents a glutamic acid residue or an aspartic acid residue and Xaa 6 represents an alanine residue or a serine residue,
  • VH-CDR3 VR
  • VL-CDR1 SSVXaa 7 TXaa 8 Xaa 9 (SEQ ID NO: 3) in which Xaa 7 represents a threonine residue, an asparagine residue, a serine residue, an alanine residue or an arginine residue, Xaa 8 represents an asparagine residue, a glycine residue or a serine residue and Xaag represents a tyrosine residue or a phenylalanine residue,
  • VL-CDR2 Xaa-
  • VL-CDR3 QQGXaanXaai2Xaai3 (SEQ ID NO: 4) in which Xaa-n represents a histidine residue or an asparagine residue, Xaa-
  • An antibody within the meaning of the present invention, denotes in a conventional manner in itself a glycoprotein composed of two types of glycopolypeptide chains, called heavy chain and light chain, an antibody consisting of two heavy chains and two light chains, linked by disulfide bridges. Each chain consists of a variable region and a constant region.
  • the VH heavy chain and VL light chain variable regions each have three hypervariable areas, called complementarity determining regions (CDRs).
  • region for determining complementarity is understood to mean, in a conventional manner in itself, each of the three hypervariable regions of the variable regions of the heavy and light chains of an antibody, which constitute the elements of the paratope and make it possible to determine the complementarity of the antibody with the epitope of the antigen. These three hypervariable regions are flanked by four constant regions which constitute the framework (FR regions) and give a stable configuration to the variable domain.
  • the CDRs of an antibody are defined, from the amino acid sequence of the heavy and light chains of the antibody, according to criteria well known to those skilled in the art.
  • the CDRs of the antibodies according to the invention are more particularly determined according to the IMGT nomenclature.
  • the term “functional fragment of the antibody” is also understood to mean any fragment of the antibody which retains the ability to bind to the antigen and therefore has the same affinity for the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa as the original antibody. .
  • Such fragments can in particular be Fv, scFv, Fab, Fab ', F (ab') 2 fragments, nanobodies, etc.
  • the antibody fragments according to the present invention can also comprise peptide sequences not belonging to the original antibody, corresponding for example to binding peptides between parts of the antibody, such as heavy chain parts. and light chain, or to peptide tags, for example C-terminal, for example allowing their purification, detection, etc., such as a polyhistidine tag and a c-myc tag, well known to those skilled in the art. job.
  • antibody fragment also encompasses multivalent forms of antibody fragments, in particular the bi-, tri- or tetravalent forms of two, three or four fragments, in particular of scFv, such as diabodies, triabodies and tetrabodies.
  • the monoclonal antibody according to the invention can be of the bispecific type, or more generally have any multivalent form.
  • Single-chain variable fragments scFv
  • scFv fragments can in particular comprise, between these variable regions, a linking peptide connecting the heavy chain variable region and the light chain variable region.
  • This binding peptide can be any peptide which is conventional per se in the field of scFvs. It preferably comprises at least 5 amino acids, and preferably between 5 and 20 amino acids approximately. It may for example have the sequence GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1 1).
  • Other examples of binding peptides which can be used according to the invention are described in the publication by Chen et al., 2013, Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (10): 1357-1369 (especially in Table 3).
  • the binding peptide can connect the N-terminus of the heavy chain variable region and the C-terminus of the light chain variable region. Preferably, it connects the N-terminal end of the light chain variable region and the C-terminus of the heavy chain variable region.
  • the scFv fragments can be produced from complementary DNA (cDNA) encoding the VH heavy chain variable region and cDNA encoding the VL light chain variable region, for example obtained from a hybridoma, of a bacterium, of an acellular system or of any other system for the production of recombinant proteins producing the antibody according to the invention, according to conventional protein expression techniques. More generally, the antibodies or antibody fragments according to the invention can be produced by genetic recombination or by chemical synthesis, or be isolated by purification from a natural source, in particular from a hybridoma.
  • the antibodies or antibody fragments meeting the definition of the invention exhibit a high affinity for the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa.
  • the dissociation constant of the binding of these antibodies or antibody fragments with the antigen can in particular be of the order of 200 nM.
  • These antibodies also have a strong neutralizing power vis-à-vis the bacteria in cellulo.
  • the monoclonal antibody according to the invention will be designated by the term “antibody”, and the functional fragment of this antibody by the expression “antibody fragment” or “fragment of this antibody”. .
  • a sequence having at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, and preferably at least 99%, identity with a reference sequence is a sequence exhibiting one or more variations with respect to this reference sequence, while ensuring the antibody or the fragment of antibody an affinity for the antigen, as for the reference sequence.
  • These variations can be deletions, substitutions and / or insertions of one or more amino acids in the sequence.
  • Percent identity is the percentage of amino acids identical between the compared sequences, obtained after optimal alignment of the two sequences. Optimal alignment of the sequences can be achieved in any manner conventional in itself to those skilled in the art, for example using BLAST software. Percent identity is calculated by determining the number of positions for which the amino acid is identical between the two sequences, and dividing it by the total number of positions in the sequence, the result being multiplied by 100.
  • the CDR sequence of an antibody or antibody fragment according to the invention has a percentage identity of less than 100% relative to one of the sequences listed above, in particular relative to one of the sequences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, it may have insertions, deletions and / or substitutions with respect to this reference sequence.
  • the substitution is preferably carried out by an amino acid of the same family as the original amino acid, for example from a basic residue such as arginine by another residue basic like a lysine residue, from an acidic residue like aspartate by another acidic residue like glutamate, from a polar residue like serine by another polar residue like threonine, from an aliphatic residue like leucine by another aliphatic residue such as isoleucine, etc.
  • a basic residue such as arginine by another residue basic like a lysine residue
  • an acidic residue like aspartate by another acidic residue like glutamate
  • a polar residue like serine by another polar residue like threonine
  • an aliphatic residue like leucine by another aliphatic residue such as isoleucine, etc.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention meets one or more of the following characteristics:
  • - Xaas represents a glutamic acid residue
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention is such that in the sequence SEQ ID NO: 1, corresponding to the CDR of the heavy chain VH-CDR1, Xaa 3 represents an arginine residue and in the sequence SEQ ID NO: 2, corresponding to the CDR of the heavy chain VH-CDR2, Xaa 6 represents an alanine residue.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention is also preferably such as in the sequence SEQ ID NO: 1, corresponding to the CDR of the heavy chain VH-CDR1, Xaai represents a threonine residue, in the sequence SEQ ID NO: 2, corresponding to the CDR of the heavy chain VH- CDR2, Xaas represents a glutamic acid residue and in the sequence SEQ ID NO: 4, corresponding at the CDR of the VL-CDR3 light chain, Xaa-i 3 represents a valine residue.
  • GYTFSRFG (SEQ ID NO: 5), GYSFSSYG (SEQ ID NO: 6), GYSFSTYG (SEQ ID NO: 7), GYSFSRYG (SEQ ID NO: 8), GYSFNTYG (SEQ ID NO: 9) or GYSFSTFG (SEQ ID NO: 10);
  • VH-CDR2 INAETGKA (SEQ ID NO: 12), INADTGKS
  • SSVTTNY (SEQ ID NO: 16), SSVTTGY (SEQ ID NO: 17), SSVNTNY (SEQ ID NO: 18), SSVSTNY (SEQ ID NO: 19), SSVATGF (SEQ ID NO: 20) , SSVSTSY (SEQ ID NO: 21), SSVRTGY (SEQ ID NO: 22) or SSVSTGY (SEQ ID NO: 23);
  • VL-CDR2 GTS or RTS
  • QQGHSV (SEQ ID NO: 24), QQGHTI (SEQ ID NO: 25), QQGNTI (SEQ ID NO: 26) or QQGHSI (SEQ ID NO: 27).
  • CDR complementarity determining regions
  • VH-CDR1 GYTFSRFG (SEQ ID NO: 5)
  • VH-CDR2 INAETGKA (SEQ ID NO: 12)
  • CDR complementarity determination regions
  • VL-CDR1 SSVTTNY (SEQ ID NO: 16)
  • VL-CDR2 GTS
  • VL-CDR3 QQGHSV (SEQ ID NO: 24).
  • antibodies or fragments of specific antibodies according to the invention are such as:
  • CDR complementarity determining regions
  • VH-CDR1 GYSFSSYG (SEQ ID NO: 6)
  • VH-CDR2 INADTGKS (SEQ ID NO: 13)
  • CDR complementarity determining regions
  • VL-CDR1 SSVTTGY (SEQ ID NO: 17) or SSVTTNY (SEQ ID NO: 16)
  • VL-CDR2 GTS
  • VL-CDR3 QQGHTI (SEQ ID NO: 25) or QQGNTI (SEQ ID NO: 26).
  • CDR complementarity determining regions
  • VH-CDR1 GYSFSTYG (SEQ ID NO: 7) or GYSFSRYG (SEQ ID NO: 8)
  • VH-CDR2 INADTGKS (SEQ ID NO: 13) or INADTGKA (SEQ ID NO: 14)
  • VH-CDR3 VR
  • CDR complementarity determining regions
  • VL-CDR1 SSVNTNY (SEQ ID NO: 18), SSVTTGY (SEQ ID NO: 17) or SSVTTNY (SEQ ID NO: 16)
  • VL-CDR2 GTS
  • VL-CDR3 QQGHTI (SEQ ID NO: 25) or QQGNTI (SEQ ID NO: 26).
  • An antibody or a particular antibody fragment according to the invention comprises a pair of sequences chosen from the following pairs of sequences: SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 49, or a pair of sequences having at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least less 97%, preferably at least 98%, and preferably at least 99%, identity with one of these pairs of sequences.
  • each of the sequences has at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least. less 97%, preferably at least 98%, and preferably at least 99%, of identity with respectively one of the sequences of a pair of sequences from among the pairs of sequences listed above.
  • sequences of a sequence pair can be linked directly to each other, in particular by a peptide bond, or be linked to each other by a sequence of a linking peptide.
  • a particular antibody fragment according to the invention comprises, and preferably consists of, a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 60, or a sequence having at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, and preferably at least 99%, identity with one of these sequences.
  • the binding peptide of sequence (G4S) 3 (SEQ ID NO: 1 1) appearing in these sequences can be replaced by any other binding peptide.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region of the antibody or antibody fragment according to the invention originate from the macaque (Macaca fascicularis). The same can be done with the heavy chain constant region and / or the light chain constant region.
  • the macaque has in particular the advantage of a very great homology of genetic sequences with humans. Otherwise, one or more of these regions can be from a transgenic animal.
  • the antibody or antibody fragment according to the invention does not have the amino acid sequence SEQ ID NO: 73. It does not in particular comprise a light chain variable region having the sequence SEQ ID NO: 74, or yet a light chain variable region CDR having the sequence SEQ ID NO: 75, that is to say a light chain variable region CDR of sequence SSVXaa 7 TXaa 8 Xaa9 (SEQ ID NO: 3) in which Xaa 7 , Xaa 8 and Xaag are as defined above, but Xaa 7 and Xaa 8 do not simultaneously represent an asparagine residue for Xaa 7 and a serine residue for Xaa 8 .
  • the antibody or antibody fragment according to the invention can be an antibody or recombinant antibody fragment comprising the paratope of an antibody produced by a hybridoma, in particular from a macaque, and whose constant regions have been modified so as to minimize human immunogenicity.
  • it is a chimeric antibody or antibody fragment or a humanized antibody or antibody fragment.
  • An antibody or chimeric antibody fragment here denotes, conventionally in itself, an antibody or antibody fragment which contains a natural variable region derived from an antibody of a given species, in association with the constant regions of an antibody of a species heterologous to that species.
  • Such antibodies can for example be prepared by genetic recombination.
  • the antibody or chimeric antibody fragment according to the invention is preferably such that the heavy chain constant region and / or the light chain constant region, when it contains any, are of human origin, the variable regions being quantified. to them preferably derived from the macaque.
  • a humanized antibody or antibody fragment comprises CDRs derived from a antibody from non-human mammal, preferably according to the present invention, macaque, and FR and C framework regions derived from human antibody.
  • this humanization can be carried out by fusion with a heavy chain constant region of sequence SEQ ID NO: 61 (human IgG1, allotype G1 m1, 17).
  • modified antibodies or fragments of antibodies while retaining their affinity for the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa, for example to optimize some of their effector functions.
  • Modifications can be made on an amino acid residue or on a peptide bond.
  • An example of such a modification is the polyethylene glycol bond.
  • Another aspect of the invention relates to a nucleic acid molecule encoding a monoclonal antibody or functional fragment of said antibody according to the invention.
  • This nucleic acid molecule may for example have a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 62 to SEQ ID NO: 72. These sequences code for antibody fragments in accordance with the invention, in which a binding peptide of sequence (G 4 S) 3 (SEQ ID NO: 1 1) connects the heavy chain variable region and the light chain variable region.
  • the invention also relates to an expression vector comprising a nucleic acid molecule according to the invention.
  • This expression vector can be of any type known per se for implementation in genetic engineering, in particular a plasmid, a cosmid, a virus, a bacteriophage, containing the elements necessary for the transcription and the translation of the sequence. encoding the antibody or functional fragment of this antibody according to the invention.
  • the present invention also relates to a host cell comprising a nucleic acid molecule or an expression vector according to the invention.
  • This host cell may equally well be a prokaryotic cell, in particular a bacterial cell, in particular for the mass production of the antibody or functional fragment of this antibody, than a eukaryotic cell, which may be lower or higher, for example from yeast, invertebrates or mammals.
  • a prokaryotic cell in particular a bacterial cell, in particular for the mass production of the antibody or functional fragment of this antibody
  • a eukaryotic cell which may be lower or higher, for example from yeast, invertebrates or mammals.
  • cell lines expressing, in a stable, inducible or constitutive manner, or else transiently, an antibody or functional fragment of this antibody according to the invention.
  • the antibodies or antibody fragments according to the invention can be produced by any conventional method known to those skilled in the art. They can in particular be obtained by genetic recombination or by chemical synthesis.
  • a process for preparing an antibody or antibody fragment according to the invention comprises the culture of host cells according to the invention, that is to say comprising a nucleic acid molecule encoding an antibody or antibody fragment according to the invention, or an expression vector containing such a nucleic acid molecule, under conditions allowing the expression of said monoclonal antibody or functional fragment of said antibody, and recovering the antibody, or functional fragment thereof, thus produced.
  • Alternative methods of preparing an antibody or antibody fragment according to the invention also come within the scope of the invention, in particular by inoculation of a non-human mammal with the OprF antigen of Pseudomonas aeruginosa, where appropriate with a Freund's adjuvant, and screening of hybridomas producing an antibody exhibiting an affinity for this antigen, the antibodies or antibody fragments in accordance with the invention being identified by analysis of their sequence.
  • the OprF protein used for inoculation is in the form of proteoliposomes, as described in the publication by Maccarini et al. above.
  • Inoculation can be carried out by any route, in particular by subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraperitoneal injection, etc. One or more injections can be given, several days apart.
  • This step can be carried out by bringing into contact, to form a reaction medium, an expression vector containing the coding sequence of the OprF porin of Pseudomonas aeruginosa and a synthetic liposome, in particular of defined lipid composition, in the presence of 'a cell-free protein synthesis system, this system possibly being derived from a bacterial lysate or from any other lysate originating from yeasts, mammalian cells, wheat germ or any other biological source, this system allowing transcription and simultaneous translation of the protein, for example according to the protocol described in the publication by Maccarini et al. aforementioned;
  • a clone is reactive against the proteoliposomal target when its dissociation constant, as measured by ELISA, with respect to this target, is less than or equal to 10 mM.
  • the method comprises, for the clones reactive with respect to the proteoliposomes thus selected, a step of isolating and verifying their possible redundancy by sequencing.
  • the construction of a library of antibodies or antibody fragments, in particular of scFv, from RNA extracted from B lymphocytes of said mammal can for example comprise amplification by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT- PCR) of messenger RNAs (mRNA) encoding the variable domains VLk, VLA and VH of antibodies, construction of a library of scFv by sequential cloning of the variable domains VLk, n ⁇ _l and VH in a phagemid vector, and encapsidation and amplification of the scFv library in phage, in particular in phage M13K07 from the company Invitrogen®.
  • RT- PCR reverse transcription and polymerase chain reaction
  • the process for preparing an antibody or functional antibody fragment according to the invention can comprise a step of humanizing an antibody or antibody fragment produced from the non-human mammal, by grafting at least one. CDR sequence of this antibody or antibody fragment on an FR framework region of a human antibody.
  • It may further comprise substitutions, insertions and / or deletions of one or more amino acids of an antibody or antibody fragment produced from the non-human mammal.
  • the antibody or antibody fragment according to the invention finds a particularly advantageous application for the treatment of bacterial infections, in particular Pseudomonas aeruginosa infections.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, in particular a vaccine composition, for combating bacterial infections, in particular Pseudomonas aeruginosa infections, and in particular acute and chronic pulmonary infections.
  • This composition comprises a monoclonal antibody or functional fragment of said antibody according to the invention as an active substance, in a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be in any galenic form suitable for administration to a mammal, in particular in a galenic form suitable for oral or parenteral administration.
  • it can be in a galenic form suitable for intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection, or for administration by intranasal route or by inhalation.
  • the vehicle can consist of any vehicle that is conventional in itself, in particular in the field of vaccine compositions. It can in particular be an aqueous vehicle.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can also contain any additive conventional in itself, as well as optionally other active ingredients.
  • additives which can be used in the pharmaceutical composition according to the invention mention may be made of surfactants, in particular of polysorbate type, solvents or even stabilizing agents, for example of glycine, arginine or other type, etc.
  • Another aspect of the invention relates to the use, for prophylactic or curative purposes, of a monoclonal antibody or functional fragment of this antibody as a medicament, and in particular for combating bacterial infections, in particular against infections with Pseudomonas aeruginosa, in particular infections of the respiratory system, and more particularly pulmonary infections, in particular acute and chronic pulmonary infections.
  • This use comprises the administration of said antibody or antibody fragment, or of a pharmaceutical composition containing it, to a mammal, in particular a human, in a therapeutically effective dose.
  • This administration can be carried out by any route. It is preferably carried out orally or parenterally, in particular by intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection, or intranasally or by inhalation.
  • the antibody or antibody fragment according to the invention can be administered to the individual treated as a single dose, or in several doses, in particular distributed over several days apart.
  • the effective dose, duration of administration and number of administrations depend on the individual being treated, in particular their age, weight, symptoms, etc. It is up to the practitioner to determine the exact treatment conditions.
  • a therapeutically effective dose of the antibody or functional antibody fragment according to the invention may be between 1 and 1000 mg, for a single dose treatment.
  • the antibody or antibody fragment according to the invention can be used to treat any individual in need thereof, in particular any individual suffering from a bacterial infection, in particular an infection with Pseudomonas aeruginosa, or, as a preventive measure, any individual with risk of contracting such an infection, for example for example, patients with weakened immune systems, patients with cystic fibrosis, patients undergoing mechanical ventilation or severe burns during hospitalization.
  • a preventive measure any individual with risk of contracting such an infection, for example for example, patients with weakened immune systems, patients with cystic fibrosis, patients undergoing mechanical ventilation or severe burns during hospitalization.
  • Such preventive treatment considerably eliminates the risk of infection with Pseudomonas aeruginosa.
  • the present invention also relates to other uses of the antibody or antibody fragment according to the invention, for example for the detection, and where appropriate the purification, of the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa.
  • the present invention thus relates to the use of a monoclonal antibody or functional antibody fragment according to the invention for the detection, in vitro or ex vivo, of the bacterium Pseudomonas aeruginosa in a biological fluid, in particular a body fluid derived from an individual, in particular a human or animal individual. By this is meant that the bodily fluid has been extracted from said individual.
  • This detection can be carried out by any technique conventional in itself for those skilled in the art, for example by Western blot, flow cytometry, surface plasma resonance, ELISA, etc.
  • kits for the detection of the bacterium Pseudomonas aeruginosa in a biological fluid, in particular a bodily fluid obtained from an individual, in particular a human or animal individual contains an antibody or functional antibody fragment according to the invention, and instructions for carrying out a method for the detection, in vitro or ex vivo, of the bacterium Pseudomonas aeruginosa in a body fluid obtained from a individual, by means of this monoclonal antibody or functional fragment of antibody.
  • This kit can also include any reagent that is conventional in itself for the implementation of such a detection method.
  • the antibody or antibody fragment according to the invention can otherwise be used for the preparation of bispecific antibodies.
  • Figure 1 is a graph showing the optical density at 450 nm, in function of the serum dilution rate, for an ELISA test (affinity for the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out on sera taken from a macaque, on days 0, 24 and 38 after immunization of this macaque with proteoliposomes containing the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa (OPRF J0, OPRF J24, OPRF J38) and on a serum taken from a macaque, on day 38 after immunization of the macaque with bovine serum albumin (BSA J38).
  • an ELISA test affinity for the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa
  • FIG. 2 shows the sequences of 6 scFv fragments directed against the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa in accordance with the invention, in which the sequences corresponding to the 6 CDRs are underlined, as well as the sequence of the binding peptide binding the heavy chain variable region to the light chain variable region - in these sequences, the N-terminus is on the left, and the C-terminus is on the right, in a conventional manner.
  • FIG. 3 shows the sequences of 5 other scFv fragments directed against the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa in accordance with the invention, in which the sequences corresponding to the 6 CDRs are underlined, as well as the sequence of the binding peptide binding the chain variable region heavy to light chain variable region - in these sequences, the N-terminus is on the left, and the C-terminus is on the right, in a conventional manner.
  • FIG. 4 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a conforming scFv fragment. to the invention (E2) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • E2 affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 5 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a conforming scFv fragment. to the invention (E5) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • E5 affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 6 is a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein from Pseudomonas aeruginosa) produced for different dilutions of an scFv fragment in accordance with the invention (F8) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • FIG. 7 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a conforming scFv fragment. according to the invention (G9) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • G9 a conforming scFv fragment. according to the invention
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 8 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a conforming scFv fragment. to the invention (E3) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • E3 affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 9 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a conforming scFv fragment. to the invention (E7) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • E7 affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 10 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a conforming scFv fragment. according to the invention (F10) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • F10 a conforming scFv fragment. according to the invention
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 11 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a scFv fragment in accordance with the invention (F3) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • F3 a scFv fragment in accordance with the invention
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 12 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a conforming scFv fragment. to the invention (F4) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • FIG. 13 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a conforming scFv fragment. to the invention (A1) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • FIG. 14 represents a graph showing the optical density at 450 nm, as a function of the dilution rate, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out for different dilutions of a conforming scFv fragment. to the invention (A8) and for bovine serum albumin (BSA) as negative control.
  • ELISA tests affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa
  • FIG. 15 represents graphs showing the optical density (OD) at 450 nm as a function of the concentration, for ELISA tests (affinity towards the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa) carried out respectively on four scFv fragments conforming to the invention, called E7, F8, F10 and G9.
  • Figure 16 shows a graph representing the value obtained by subtracting the absorbance at 680 nm from the absorbance at 490 nm ("A490-A680 nm"), during an in cellulo test for determining the neutralizing power, facing infection of macrophages (“Ma”) by Pseudomonas aeruginosa (“Pa”), of scFv fragments in accordance with the invention (F8, G9, E7), by assaying the activity of lactate dehydrogenase.
  • the recombinant vector plVEX2.4-OprF in which OprF comprises an N-terminal poly-histidine tag, is constructed by cloning the OprF gene amplified from genomic DNA of Pseudomonas aeruginosa amplified by polymerase chain reaction (PCR), using the following primers:
  • PCR product is then purified using the QIAquick gel kit (Qiagen) then digested with the restriction enzymes Ndel, Xhol (Roche Diagnostics), again purified and then linked using the Rapid DNA ligation kit (Roche Diagnostics) ) in the plasmid vector plVEX2.4d (Roche Diagnostics) previously digested with the enzymes Ndel and Xhol.
  • the resulting recombinant plasmid plVEX2.4-OprF is verified by sequencing (LGC Genomics) in order to validate the insertion of the gene encoding OprF in phase with the poly-histidine tag of the vector p1VEX2.4d.
  • Liposomes are prepared by drying a lipid composition previously solubilized in chloroform, for the following different lipid compositions (LC):
  • LC1 Lipidic composition 1 (LC1): cholesterol, 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1, 2-dimyristoyl- sn-glycero-3-phosphate (sodium salt) (DMPA), molar ratio [2-4-2-2];
  • DOPC 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPE 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DMPA 2-dimyristoyl- sn-glycero-3-phosphate
  • DMPA sodium salt
  • LC2 1 -palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (POPE), 1 - palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho- (1 '-rac-glycerol) (sodium salt ) (POPG), E. coli cardiolipin (CL), molar ratio [6-2-2];
  • the lipid film is then hydrated in 500 ml of a solution of Tris (50 mM, pH 7.5) by vortexing, then subjected to 4 cycles of freezing / thawing in liquid nitrogen.
  • the lipid mixture is extruded using an extruder (Avanti Polar Lipids) to produce liposomes averaging in size, around 200 nm.
  • the liposomes thus obtained are stored at 4 ° C.
  • the Pseudomonas aeruginosa membrane protein OprF is synthesized in the presence of the different liposome compositions (LC1, or LC2, or LC3 or LC1 ', or LC2' or LC3 ') using the cell-free RTS 500 ProteoMaster E. coli HY protein synthesis kit , from Biotechrabbit.
  • the recombinant plasmid plVEX2.4-OprF containing the gene encoding the OprF protein fused to a poly-histidine tag (6xHis) is added at a concentration of 15 ⁇ g / ml to the cell lysate of the kit in the presence of a quantity of 1 to 4 mg / ml of liposomes of one of the 6 lipid compositions LC1 to LC3 '.
  • the proteoliposomes containing the recombinant protein OprF are produced at 25 ° C. for 16 h with stirring (300 rev / min) in a ratio of 1/30 of reaction volume / volume of the container.
  • the resulting recombinant proteoliposomes are then purified in 2 steps:
  • Proteoliposomes containing the OprF protein of Pseudomonas aeruginosa are obtained.
  • ScFv fragments directed against the bacterial membrane antigen target OprF of Pseudomonas aeruginosa are obtained from an immunization with the proteoliposomes obtained from the lipid composition LC1, carried out on days D0, D14, D28 and D50 of a macaque (Macaca fascicularis).
  • the macaque is reared under sterile conditions in the presence of a congener and without any other species.
  • a blood test is carried out in order to know the physiological status of the animal.
  • composition LC1 in sterile phosphate buffered saline (PBS), mixed 50/50 with Freund's adjuvant are injected into it by subcutaneous injection at 2 points ( at a rate of 250 mI per point) in the scapular zone of the animal, according to the following profile: administrations on days 0, 14, 28, 50.
  • the immune response is analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) from sera taken on days D0, D24, D38 in order to titrate the antibodies directed against the membrane antigen target OprF.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Bone marrow samples are taken after the last injection (D50) on days D53, D60, D67 and D74 on the anesthetized animal.
  • the humoral response after immunization is analyzed by the indirect ELISA method using a series of dilutions of pre-immune and immune sera (dilutions of 100, 1000, 10,000, 1,000,000, 10,000,000 and 100,000,000) following the protocol described in the book “Phage Display”, Methods and Protocols, Springer Protocols, chapter “Construction of Macaque Immune Libraries”, Arnaud Avril et al., Methods Mol Biol. 2018; 1701: 83-1 12. doi: 10.1007 / 978-1 -4939-7447-4_5.
  • the OprF membrane antigen in the form of proteoliposomes or a negative control such as bovine serum albumin (BSA) is first deposited at the bottom of the ELISA plates and incubated for 16 h at 4 ° C. After a saturation step (2% dehydrated milk re-suspended in 200 ml of phosphate buffered saline PBS), each diluted serum (initially 1/100 then 1/10, in PBS / Tween® 0.05% / BSA 0, 5%) is then tested in parallel against the OprF antigen or the negative control (BSA) for 2 h at 37 ° C.
  • BSA bovine serum albumin
  • the specific antibodies directed against OprF are then revealed using a secondary anti-Fc macaque antibody conjugated to horseradish peroxidase HRP and by addition of tetramethylbenzidine (TMB) until the appearance of a coloration in the wells.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • the results are analyzed by reading the optical density at 450 nm. The results obtained are shown in figure 1. for the sera taken on days D0, D24 and D38 after immunization with the proteoliposomes containing OprF and for the sera obtained on day D38 for immunization with BSA.
  • Bone marrow sampling is performed on the anesthetized animal. Samples are taken from the femoral trochanteric fossa and from the tubercle of the humerus, using a Mallarmé trocar. Each sample is collected in a 50 ml Falcon® tube containing a 10-15% citrate solution. Approximately 5 ml of sample are obtained on days D53, D60, D67 and D74. Each sample is then centrifuged for 10 min at 500 g (1500 rpm) at 4 ° C. The supernatant is removed and placed in a cryotube, then stored at -20 ° C. The total RNA from each of the bone marrow is then extracted by the Trizol / Chloroform technique and quantified by reading the optical density (OD) at 260 nm and 280 nm using a spectrophotometer.
  • OD optical density
  • the messenger RNAs (mRNA) encoding the variable domains of the heavy and light chains G and k / l for each of the bone marrow samples are back-amplified to obtain a complementary DNA library (cDNA) using specific primers, described in the publication of Avril et al., 2018, Methods Mol. Biol., 1701: 83-1 12.
  • the quality of the amplification is checked by electrophoresis on agarose gel.
  • the PCR products amplified from the cDNA bank obtained on days D53 to D74 are cloned into the plasmid pGemT (Promega), according to the supplier's protocol, in order to obtain a bank of secure clones.
  • VH to obtain a construct in the format VH- [(G 4 S) X3 (SEQ ID NO: 1 1)] - VL-6xHistidine-EQKLISEEDL (SEQ ID NO: MM), in which the VH and VL fragments are linked by the GGGGSGGGGSGGGGS binding peptide (SEQ ID NO: 1 1) connecting the C-terminus of the VH fragment to the N-terminus of the VL fragment, and comprising at its C-terminus a poly-histidine tag (SEQ ID NO: 79) and a c-myc tag (SEQ ID NO: 78).
  • the library is encapsidated and amplified in phage M13Ko7 (Nebb), according to the supplier's protocol.
  • the scFv libraries contained in the phagemids are subjected to 4 rounds of selection against the proteoliposomes containing the OprF membrane antigen fixed on 96-well plates.
  • the screening protocol is as follows: a microtiter plate is coated overnight with the target antigen at a concentration of 10 ⁇ g / ml in PBS at 4 ° C. Then the plate is blocked with 3% BSA in PBS for 2 h at 37 ° C; after washing, the library is incubated for an additional 2 h at 37 ° C. During the first round, the plate is washed 2 times using PBS containing 0.1% Tween® 20 with an interval of 5 min between each wash. Finally, the plate is washed, rinsed with PBS sterile and the phage is eluted with trypsin (10 mg / ml in PBS) for 30 min at 37 ° C.
  • the eluted phages are used for the infection of Escherichia coli (strain SURE, Stratagene, cultured in SB medium (Super Broth) supplemented with tetracycline (10 ⁇ g / ml) and carbenicillin (50 ⁇ g / ml).
  • SB medium Super Broth
  • tetracycline 10 ⁇ g / ml
  • carbenicillin 50 ⁇ g / ml
  • the infected strain is co-infected with helper phage and cultured overnight at 30 ° C in SB medium supplemented with tetracycline (10 ⁇ g / mL), carbenicillin (50 pg / mL) and kanamycin (70 pg / mL).
  • Phage particles are precipitated using PEG / NaCl (4% (w / v) PEG-8000, 3% (w / v) NaCl) and used for the next cycle
  • the second round is carried out as described previously
  • the infected strains of the third round are grown on SB media in petri dishes and are used for screening.
  • 96 clones isolated from the second, third and fourth rounds of selection are harvested and used to produce soluble scFvs. Of these clones, 57 positive clones are selected and 15 of them are retained. An analysis of the nucleotide and peptide sequence of the 57 clones is carried out in order to determine the potential redundancy of certain sequences. 43 sequences are identified as non-redundant and non-recombinant. Among these 43 sequences, 1 1 of them are produced in Escherichia coli bacteria, according to the following protocol: the phagemid DNA isolated after the selection process is used to transform the strain of E. Coli non-suppressor so that it expresses the soluble scFv fragment.
  • Single colonies of randomly selected transformants are used to inoculate 5 ml of SB medium supplemented with carbenicillin.
  • the cultures are incubated overnight at 37 ° C. with vigorous shaking (250 rpm).
  • 500 ml of SB medium supplemented with carbenicillin are then inoculated with 500 ml of each culture.
  • the Cultures are grown at 30 ° C until the optical density at 600 nm reaches 1.5.
  • IPTG (1 mM) is then added overnight to induce gene expression at 22 ° C.
  • the cells are harvested by centrifugation at 2500 g for 15 min at 4 ° C.
  • the scFvs are extracted with polymyxin B sulfate and purified on a nickel column (Ni-NTA column, Qiagen) according to the manufacturer's instructions, then dialyzed against PBS.
  • the corresponding scFvs produced are then purified for confirmation of their affinity against the OprF target by the ELISA method.
  • sequences are extended there, at their C-terminal end, by a poly-histidine tag (SEQ ID NO: 79) and a c-myc tag (SEQ ID NO: 78).
  • CDR complementarity
  • VH-CDR1 GYXaai FXaa 2 Xaa 3 Xaa 4 G (SEQ ID NO: 1) in which Xaai represents a threonine residue or a serine residue, Xaa2 represents a residue serine or an asparagine residue, Xaa 3 represents an arginine residue, a serine residue or a threonine residue and Xaa4 represents a phenylalanine residue or a tyrosine residue,
  • VH-CDR2 INAXaa 5 TGKXaa 6 (SEQ ID NO: 2) in which Xaa 5 represents a glutamic acid residue or an aspartic acid residue and Xaa 6 represents an alanine residue or a serine residue,
  • VH-CDR3 VR
  • VL-CDR1 SSVXaa 7 TXaa 8 Xaa 9 (SEQ ID NO: 3) in which Xaa 7 represents a threonine residue, an asparagine residue, a serine residue, an alanine residue or an arginine residue, Xaa 8 represents an asparagine residue, a glycine residue or a serine residue and Xaa 9 represents a tyrosine residue or a phenylalanine residue,
  • VL-CDR2 Xaa-ioTS in which Xaa-io represents a glycine residue, an arginine residue or an alanine residue,
  • VL-CDR3 QQGXaaiiXaa-i2Xaa-i3 (SEQ ID NO: 4) in which Xaa-n represents a histidine residue or an asparagine residue, Xaa-12 represents a serine residue or a threonine residue and Xaa-13 represents a valine residue or an isoleucine residue.
  • each of the sequences of these scFv fragments is shown in figure 2 for A1, A8, E2, E3, E5, E7 and in figure 3 for F3, F4, F8, F10, G9.
  • CDR sequences are underlined therein. We can thus distinguish, from left to right, the successive sequences of the CDRs of the heavy chain variable region (VH-CDR1, then VH-CDR2, then VH-CDR3), then of the CRDs of the light chain variable region (VL -CDR1, then VL-CDR2, then VL-CDR3).
  • the sequence of the binding peptide is also underlined, between the two CDR triplets.
  • the 11 scFvs fragments produced above are purified.
  • each scFv fragment conforming to the invention 0.346 mg / ml E2, 0.401 mg / ml E3, 0.559 mg / ml E5, 0.453 mg / ml E7, 0.387 mg / ml F4, 0.436 mg / ml F3, 0.333 mg / ml F8, 0.403 mg / ml F10, 0.570 mg / ml G9, 0.385 mg / ml A1 and 0.626 mg / ml A8.
  • the plate is saturated with 2.5% dehydrated milk resuspended in 200 ml of phosphate buffered saline PBS.
  • the scFv fragments are incubated at different dilution rates: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, in PBS / Tween®-20 0.05 % / 0.5% BSA. Detection is performed using an anti-c-myc tag secondary antibody coupled to horseradish peroxidase. The optical density at 450 nm is recorded.
  • the dissociation constant Kd is determined for the scFv fragments E7, F8, F10 and G9, by an ELISA method.
  • the E7, F8 and G9 fragments were tested in this experiment, to determine their neutralizing power against the infection of macrophages by Pseudomonas aeruginosa (strain CHA) at an MOI (multiplicity of infection) of 10.
  • THP-1 cells human monocytic line
  • PMA phorbol myristate acetate
  • CHA strain Culture and preparation of P.aeruginosa (CHA strain): launch of a culture of P. aeruginosa bacteria (CHA strain) from a small amount of bacterial glycerol stock placed in 10 ml of LB culture medium; incubation of the bacterial culture at 37 ° C with shaking overnight; dilution of the culture in LB medium until an optical density measurement at 600 nm equal to 0.5 in 1 ml of culture (6 ⁇ 10 8 CFU / ml) is obtained; centrifugation at 4000 xg for 5 min; removing the supernatant and taking up the pellet in 1 ml of RPMI culture medium - 10% dSVF; 2nd centrifugation at 4000 g for 5 min; removing the supernatant and taking up the pellet in 1 ml of RPMI culture medium - 10% dSVF; dilution in the same medium in order to obtain a suspension containing 15,000,000 bacteria / ml; incubation at 37 ° C
  • aeruginosa + 35 mI of scFv E7 in PBS (0.453 mg / ml)
  • 35 mI of the suspension of P. aeruginosa + 35 mI of scFv F8 in PBS (0.333 mg / ml)
  • 35 ml of the suspension of P. aeruginosa + 35 ml of scFv G9 in PBS (0.570 mg / ml), 35 ml of the suspension of P.aeruginosa;
  • Table 6 - M represents macrophages - Carrying out of the cytotoxicity test making it possible to quantify the release of cellular LDH (Lactate Dehydrogenase) in the culture medium, according to the protocol defined in the leaflet of the lactate dehydrogenase (LDH) assay kit “Pierce® LDH cytotoxicity assay kit” : addition of 10 ml of sterile PBS to wells no. 1 to 5 of lines A, B, C and to wells no. 1 of lines D, E, F; addition of 10 ml of P.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • aeruginosa Pa
  • Pa aeruginosa
  • 20 mI of the mixture Pa + F8 to wells n ° 2 of lines D, E, F, Pa + G9 to wells n ° 3 of lines D, E, F, Pa + E7 to wells n ° 4 of lines D , E, F; addition of 10 ml of sterile ultrapure water to wells 1 and 3 of lines A, B, C; incubation of the plate in an oven at 37 ° C (atmosphere containing 5% CO2) for 16 h; addition of 10 ml of lysis buffer (10 x) to wells 2 and 5 of lines A, B, C; incubation for 45 min in an oven at 37 ° C (atmosphere containing 5% C0 2 ); centrifugation of the plate at 250 xg for 3 min; transfer of 50 mI from each well to a
  • proteoliposomes obtained in the experiment described in A / above were subjected to the following analyzes.
  • LC1 Trypsin Digestion - OprF (LC1) proteoliposomes purified by sucrose gradient centrifugation were proteolysed using a trypsin: protein mass ratio of 1:10 at room temperature (RT). Samples were collected at different times and loaded onto an SDS-PAGE gel for subsequent Western blot analysis. Negative staining electron microscopy - Samples were prepared using the negative staining grid technique (SOG).
  • the samples of OprF proteoliposomes were adsorbed on a mica surface and analyzed by AFM using a probe functionalized with a Tris-Ni + -NTA group binding the N-terminal poly-histidine tag of OprF.
  • AFM analysis was performed with and without Triton® X-100 detergent.
  • the Triton® 1x solution was used to solubilize the OprF proteins from the liposomal membrane, thus exposing all the polyhistidine tags located inside the liposome and allowing them to be bound by the functionalized probe.
  • OprF proteoliposomes purified by sucrose gradient ultracentrifugation were subjected to a limited proteolysis experiment to determine the topology of OprF in the liposomal membrane.
  • the OprF protein sequence contains 32 trypsin cleavage sites. Without OprF membrane protection, trypsin generates peptides with a mass ranging from 146 to 4649 Da (PeptideCutter program).
  • OprF adopts at least two different membrane topologies in liposomes: a first topology in which OprF is fully inserted into the membrane and therefore protected from proteolysis, since the signal corresponding to the poly-histidine tag of the total OprF protein has not disappeared over time; and a second topology in which only about half of the 6xFlis-OprF protein is integrated into the membrane, because a smaller fragment of protein between molecular weight 20 and 25 kDa has been generated over time.
  • Negative staining electron microscopy and AFM analysis of OprF proteoliposomes visualized OprF pore-forming activity in the liposomal membrane.
  • a series of "holes" with an average size of 9.5 ⁇ 4 nm corresponding to pores were observed through the membranes of the liposomes in which OprF was reconstituted.
  • Such a perforation of the liposomal membrane was not observed on the images of the control liposomes, incubated with the cell lysate and the reaction mixture of the cell-free system without DNA (negative control).
  • AFM topographic images of the surface of OprF proteoliposomes also revealed the presence of pores surrounded by OprF proteins and having an average diameter of 10 nm. Pore formation has therefore been attributed to the activity of the OprF protein in the liposomal membrane.

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Abstract

L'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ou un fragment fonctionnel de cet anticorps. Cet anticorps ou fragment d'anticorps est particulièrement utile pour le traitement préventif ou curatif des infections à Pseudomonas aeruginosa.

Description

ANTICORPS DIRIGÉ CONTRE LA PROTÉINE OPRF DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA, SON UTILISATION EN TANT QUE MÉDICAMENT ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LE CONTENANT
La présente invention s’inscrit dans le domaine du traitement des infections bactériennes, notamment des infections du type causées par les bactéries de l’espèce Pseudomonas aeruginosa.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ou un fragment fonctionnel de cet anticorps. L’invention concerne également une molécule d’acide nucléique codant pour cet anticorps ou fragment d’anticorps, un vecteur d’expression comprenant une telle molécule d’acide nucléique et une cellule hôte comprenant une telle molécule d’acide nucléique ou un tel vecteur d’expression. L’invention concerne également un procédé de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention, ainsi que l’utilisation de cet anticorps ou fragment d’anticorps en tant que médicament, notamment pour le traitement préventif ou curatif des infections à Pseudomonas aeruginosa. L’invention concerne en outre une composition pharmaceutique contenant un tel anticorps ou fragment d’anticorps. L’invention concerne également l’utilisation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention pour la détection de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide corporel issu d’un individu, et un kit pour une telle détection, contenant un tel anticorps ou fragment d’anticorps.
La prévention et le traitement des infections nosocomiales constituent une préoccupation majeure dans le domaine hospitalier. L’incidence de ces infections est en augmentation constante, notamment car les pathogènes responsables de ces infections sont de plus en plus résistants aux antibiotiques.
La bactérie Pseudomonas aeruginosa en particulier représente une des causes majeures des infections nosocomiales, ainsi que des pneumonies, à l’hôpital. On estime que Pseudomonas aeruginosa est responsable de 10 % des maladies nosocomiales. Le nombre de personnes atteintes par ce pathogène est très important, et le taux de mortalité associé est élevé chez les personnes dont les défenses immunitaires sont altérées. Pseudomonas aeruginosa est une bactérie opportuniste, qui est notamment impliquée dans les infections aigues et chroniques chez les patients ventilés artificiellement ainsi que ceux atteints de mucoviscidose, et qui est responsable de septicémies chez les patients immunocompromis, parmi lesquels les transplantés et les grands brûlés.
Les souches de Pseudomonas aeruginosa responsables des infections nosocomiales sont caractérisées par une résistance intrinsèque à un large éventail d’antibiotiques et aux traitements antibiotiques classiques. L’élimination de la bactérie est rendue difficile à cause de cette résistance aux antibiotiques ainsi que de sa capacité de former un biofilm dans les poumons des malades.
Toutefois, malgré la large diffusion de ce pathogène et le nombre croissant de souches résistantes aux antibiotiques, aucun traitement efficace contre les infections à Pseudomonas aeruginosa n’a à ce jour été rendu disponible par l’industrie pharmaceutique.
Différentes approches thérapeutiques ont été envisagées par l’art antérieur pour développer un tel traitement.
Un certain nombre de protéines immunogéniques ont été identifiées chez Pseudomonas aeruginosa, grâce aux récentes études sur les mécanismes de virulence de la bactérie (Chevalier et al., 2017, FEMS, 41 : 698-722). Ces études ont permis de mettre en évidence que ces immunogènes sont principalement localisés dans certains compartiments structuraux tels que les flagelles, les pili, les lipopolysaccharides, les protéines de la membrane externe, ou font partie de produits sécrétés tels que les exopolysaccharides mucoïdes, l’exotoxine A et les protéases. Parmi les protéines de la membrane externe, les porines OprF et Oprl ont fait l’objet de travaux importants (Chevalier et al., 2017, FEMS, 41 : 698-722). Des protéines hybrides contenant des épitopes connus de ces protéines ont été produites par fusion et testées en modèle animal (Weimer et al., 2009, Infect. Immun., 77(6): 2356-2366).
Une autre approche thérapeutique envisagée par l’art antérieur repose sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre des cibles moléculaires conservées dans toutes les souches de Pseudomonas aeruginosa. Trois anticorps sont ainsi à l’étude à l’heure actuelle : un anti-PcrV qui cible le système de sécrétion de type III (Shionogi et al., 2016, Hum Vaccin Immunother. 12(1 1 ): 2833-2846), un anticorps anti-LPS permettant de tuer la bactérie et de recruter les effecteurs du système immunitaire inné, et un anticorps bispécifique ciblant les protéines PcrV et Psi.
Toutefois, si plusieurs approches thérapeutiques sont actuellement en cours de développement et de tests, de nouvelles solutions pour le traitement des infections à Pseudomonas aeruginosa doivent encore émerger afin de répondre au problème de santé publique important que constituent les infections par Pseudomonas aeruginosa.
La présente invention vise ainsi à proposer un actif thérapeutique permettant de lutter efficacement contre les infections bactériennes, en particulier les infections à Pseudomonas aeruginosa, qui remédie aux problèmes liés à la résistance de Pseudomonas aeruginosa aux antibiotiques et à l’absence de thérapies efficaces contre cet agent infectieux responsable d’infections nosocomiales et cause principale de mortalité des patients atteints de mucoviscidose.
A cet effet, les présents inventeurs ont recherché à développer de nouveaux actifs de type anticorps anti-infectieux, et ils se sont plus particulièrement intéressés pour cela, en tant que cible moléculaire, à la protéine membranaire OprF, également nommée porine OprF. La protéine OprF est une protéine de 38 kDa à pore conducteur de large diamètre, très abondante, impliquée dans un grand nombre de fonctions variées et qui est hautement conservée dans toutes les souches de Pseudomonas aeruginosa (No d’accession Genbank : AFM37279.1 ). Son rôle important dans la virulence de Pseudomonas aeruginosa, décrit par l’art antérieur, en fait une cible potentielle pour des thérapies anti-infectieuses.
Des anticorps dirigés contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ont été proposés par l’art antérieur, illustré en particulier par les documents WO 2016/033547, Moon et al., Investigative Ophtalmology & Visual Science, 1988, 29: 1277-1284, et Rawling et al., 1995, Infection and Immunity, 63: 38- 42. Ces anticorps sont cependant obtenus à partir de l’inoculation, soit de fragments solubles de la protéine OprF, soit de la protéine OprF entière solubilisée au moyen d’un détergent, c’est-à-dire se trouvant sous une forme ne correspondant pas à la conformation native de la protéine telle qu’adoptée au sein de la membrane bactérienne. Ces anticorps ne peuvent par conséquent pas reconnaître les épitopes conformationnels exposés naturellement par la protéine au sein de la bactérie.
Les présents inventeurs ont découvert que des anticorps particuliers, ou des parties de ces anticorps, dirigés contre l’antigène membranaire OprF, possèdent une activité biologique de neutralisation de la protéine OprF particulièrement forte, et ce pour l’ensemble de ses épitopes linéaires et conformationnels natifs, et possèdent de ce fait une grande efficacité thérapeutique contre les infections bactériennes par Pseudomonas aeruginosa. Cherchant à produire des anticorps se liant spécifiquement à la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa, les présents inventeurs ont développé un procédé innovant, qui a mené à la découverte d’anticorps présentant une affinité particulièrement forte pour la protéine sous sa forme membranaire native.
Ce procédé consiste, schématiquement, à produire des anticorps à partir de banques immunes produites chez le primate à partir de protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa. Il est également applicable à d’autres antigènes que la porine OprF de Pseudomonas aeruginosa
Plus particulièrement, le procédé de préparation d’anticorps, ou de fragments fonctionnels d’anticorps, selon l’invention comprend une étape de production de protéoliposomes dans lesquels la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa se trouve dans sa forme native et active, exposant les épitopes conformationnels. Cette étape peut être réalisée par mise en contact d’un vecteur d’expression contenant la séquence codante de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa et d’un liposome synthétique, en présence d’un système de synthèse protéique acellulaire pour former un milieu réactionnel, ce système permettant la transcription et la traduction simultanée de la protéine. La protéine s’insère alors dans la bicouche lipidique du liposome synthétique pour former un protéoliposome. Une telle étape est notamment décrite dans la publication de Maccarini et al., Langmuir 2017, 33, 9988-9996. La bicouche lipidique du liposome mimant la membrane de Pseudomonas aeruginosa, la protéine OprF s’y trouve dans une orientation adéquate pour présenter une conformation native et une conformation à canal ouvert. Plus particulièrement, au sein des protéoliposomes, la protéine OprF se trouve avantageusement sous ses deux formes, ouverte et fermée, qui sont naturellement présentes au sein de la membrane bactérienne ou dans les vésicules relarguées par la bactérie pour contrecarrer la réponse immunitaire. En particulier, l’analyse des protéoliposomes réalisée par les inventeurs a démontré que la protéine OprF : s’y trouve dans la bonne orientation au sein de la membrane liposomale ; y est présente dans ses deux topologies membranaires, ouverte et fermée, caractérisées par 8 et 16 passages transmembranaires respectivement ; y forme des pores / canaux au sein de la membrane liposomale ; s’y trouve sous forme oligomérisée.
Le procédé développé par les inventeurs comprend ensuite une étape d’immunisation d’un mammifère non humain, de préférence d’un macaque ( Macaca fascicularis), avec ces protéoliposomes, puis la fabrication d’une banque d’anticorps, et en particulier d’une banque de fragments scFv, à partir d’échantillons de moelle osseuse du sujet immunisé.
Le criblage par une technique d’expression, notamment par expression phagique (pour l’anglais « phage display »), de cette banque de scFv a permis aux inventeurs d’identifier plus de 1 1 séquences associées à des clones positifs, dont les régions de détermination de la complémentarité ont été déterminées. Il a ainsi été découvert par les présents inventeurs que les anticorps dirigés contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa présentant des séquences spécifiques pour les trois régions de détermination de la complémentarité de chacune des régions variables de chaîne lourde et de chaîne légère présentent une affinité et une spécificité particulièrement importantes pour les épitopes natifs de cette protéine, faisant d’eux des principes actifs de choix pour le traitement thérapeutique des infections à Pseudomonas aeruginosa, et ce d’autant plus que leur caractère primatisé les rend particulièrement bien tolérés chez l’humain. On entend dans la présente description, par le terme traitement, aussi bien le traitement curatif que le traitement préventif. On ne préjugera pas ici des phénomènes sous-tendant l’obtention d’un tel résultat avantageux. On peut cependant penser, comme exposé ci-avant, qu’il provient au moins en partie de la combinaison de la technique de l’expression de la protéine OprF dans les protéoliposomes et de l’utilisation de ces protéoliposomes réaliser une immunisation chez le macaque. Rien dans l’art antérieur ne laissait présager qu’une telle combinaison pouvait conduire à l’identification de régions d’anticorps responsables d’une liaison spécifique avec une très forte affinité de ces anticorps avec la porine membranaire OprF de Pseudomonas aeruginosa, et plus particulièrement ses épitopes linéaires et conformationnels natifs.
Ainsi, selon un aspect de la présente invention, il est proposé un anticorps monoclonal dirigé contre, c’est-à-dire se liant spécifiquement à, la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ou un fragment fonctionnel de cet anticorps. Cet anticorps ou fragment fonctionnel comprend :
- une région variable de chaîne lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYXaa! FXaa2Xaa3Xaa4G (SEQ ID NO : 1 ) dans laquelle Xaa! représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2 représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa3 représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa4 représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,
VFI-CDR2 : INAXaasTGKXaa6 (SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaas représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa6 représente un résidu alanine ou un résidu sérine,
VH-CDR3 : VR,
- et une région variable de chaîne légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVXaa7TXaa8Xaa9 (SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7 représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa8 représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaag représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,
VL-CDR2 : Xaa-|0TS dans laquelle Xaa-i0 représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,
VL-CDR3 : QQGXaanXaai2Xaai3 (SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaa-n représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa-|2 représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa-i3 représente un résidu valine ou un résidu isoleucine.
Un anticorps, au sens de la présente invention, désigne de manière conventionnelle en elle-même une glycoprotéine composée de deux types de chaînes glycopolypeptidiques, appelées chaîne lourde et chaîne légère, un anticorps étant constitué de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères, liées par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée d’une région variable et d’une région constante. Les régions variables de chaîne lourde VH et de chaîne légère VL possèdent chacune trois zones hypervariables, dites régions de détermination de la complémentarité (CDR). On entend ainsi dans la présente, par « région de détermination de la complémentarité », de manière classique en elle-même, chacune des trois régions hypervariables des régions variables des chaînes lourdes et légères d’un anticorps, qui constituent les éléments du paratope et permettent de déterminer la complémentarité de l’anticorps avec l’épitope de l’antigène. Ces trois régions hypervariables sont encadrées par quatre régions constantes qui constituent la charpente (régions FR) et donnent une configuration stable au domaine variable. Les CDR d’un anticorps sont définies, à partir de la séquence d’acides aminés des chaînes lourdes et légères de l’anticorps, selon des critères bien connus de l’homme du métier. Les CDR des anticorps selon l’invention sont plus particulièrement déterminées selon la nomenclature IMGT. On entend en outre, par fragment fonctionnel de l’anticorps, tout fragment de l’anticorps conservant la capacité de liaison à l’antigène et ayant de ce fait la même affinité pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa que l’anticorps d’origine. De tels fragments peuvent notamment être des fragments Fv, scFv, Fab, Fab’, F(ab‘)2, des nanobodies, etc. Les fragments d’anticorps selon la présente invention peuvent également comprendre des séquences peptidiques n’appartenant pas à l’anticorps d’origine, correspondant par exemple à des peptides de liaison entre des parties de l’anticorps, telles que des parties de chaîne lourde et de chaîne légère, ou encore à des étiquettes peptidiques, par exemple C-terminales, permettant par exemple leur purification, leur détection, etc., telles qu’une étiquette polyhistidine et une étiquette c-myc, bien connues de l’homme du métier.
On englobe également dans l’expression « fragment d’anticorps » les formes multivalentes de fragments d’anticorps, notamment les formes bi-, tri- ou tétravalente de deux, trois ou quatre fragments, notamment de scFv, telles que les diabodies, triabodies et tétrabodies.
L’anticorps monoclonal selon l’invention peut être du type bispécifique, ou plus généralement présenter toute forme multivalente.
Les fragments variables à chaîne unique (scFv), protéines de fusion entre la région variable de la chaîne lourde VH et la région variable de la chaîne légère VL, sont particulièrement préférés dans le cadre de l’invention. Ces fragments scFv peuvent notamment comprendre, entre ces régions variables, un peptide de liaison reliant la région variable de chaîne lourde et la région variable de chaîne légère. Ce peptide de liaison peut être tout peptide classique en lui- même dans le domaine des scFv. Il comprend de préférence au moins 5 acides aminés, et préférentiellement entre 5 et 20 acides aminés environ. Il peut par exemple présenter la séquence GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO : 1 1 ). D’autres exemples de peptides de liaison pouvant être mis en oeuvre selon l’invention sont décrits dans la publication de Chen et al., 2013, Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10): 1357-1369 (en particulier dans le tableau 3).
Le peptide de liaison peut connecter l’extrémité N-terminale de la région variable de chaîne lourde et l’extrémité C-terminale de la région variable de chaîne légère. Préférentiellement, il connecte l’extrémité N-terminale de la région variable de chaîne légère et l’extrémité C-terminale de la région variable de chaîne lourde.
Les fragments scFv peuvent être produits à partir de l’ADN complémentaire (ADNc) codant pour la région variable de la chaîne lourde VH et de l’ADNc codant pour la région variable de la chaîne légère VL, par exemple obtenus à partir d’un hybridome, d’une bactérie, d’un système acellulaire ou de tout autre système de production de protéines recombinantes produisant l’anticorps selon l’invention, selon les techniques d’expression de protéines conventionnelles. Plus généralement, les anticorps ou fragments d’anticorps selon l’invention peuvent être produits par recombinaison génétique ou par synthèse chimique, ou être isolés par purification à partir d’une source naturelle, notamment d’un hybridome.
Les anticorps ou fragments d’anticorps répondant à la définition de l’invention présentent une affinité élevée pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa. La constante de dissociation de la liaison de ces anticorps ou fragments d’anticorps avec l’antigène peut notamment être de l’ordre de 200 nM. Ces anticorps ont en outre un fort pouvoir neutralisant vis-à-vis de la bactérie in cellulo.
Par souci de simplification, on désignera dans la présente description l’anticorps monoclonal selon l’invention par le terme « anticorps », et le fragment fonctionnel de cet anticorps par l’expression « fragment d’anticorps » ou « fragment de cet anticorps ».
Au sens de la présente invention, une séquence ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec une séquence de référence est une séquence présentant une ou plusieurs variations par rapport à cette séquence de référence, tout en assurant à l’anticorps ou au fragment d’anticorps une affinité pour l’antigène, comme pour la séquence de référence. Ces variations peuvent être des délétions, des substitutions et/ou des insertions d’un ou plusieurs acides aminés dans la séquence.
Le pourcentage d’identité correspond au pourcentage d’acides aminés identiques entre les séquences comparées, obtenu après alignement optimal des deux séquences. L’alignement optimal des séquences peut être réalisée de toute manière classique en elle-même pour l’homme du métier, par exemple en utilisant le logiciel BLAST. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions pour lesquelles l’acide aminé est identique entre les deux séquences, et en le divisant par le nombre total de positions dans la séquence, le résultat étant multiplié par 100.
Lorsque la séquence du CDR d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention présente un pourcentage d’identité inférieur à 100 % par rapport à une des séquences listées ci-avant, en particulier par rapport à une des séquences SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 ou SEQ ID NO : 4, elle peut présenter des insertions, délétions et/ou substitutions par rapport à cette séquence de référence. Lorsqu’il s’agit d’une substitution, la substitution est de préférence réalisée par un acide aminé de la même famille que l’acide aminé d’origine, par exemple d’un résidu basique tel que l’arginine par un autre résidu basique comme un résidu lysine, d’un résidu acide tel que l’aspartate par un autre résidu acide comme le glutamate, d’un résidu polaire comme la sérine par un autre résidu polaire comme la thréonine, d’un résidu aliphatique comme la leucine par un autre résidu aliphatique comme l’isoleucine, etc.
Préférentiellement, l’anticorps ou le fragment d’anticorps selon l’invention répond à l’une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :
- Xaai représente un résidu thréonine,
- Xaa3 représente un résidu arginine,
- Xaas représente un résidu acide glutamique,
- Xaa6 représente un résidu alanine,
- et/ou Xaa-i3 représente un résidu valine.
De préférence, l’anticorps ou le fragment d’anticorps selon l’invention est tel que dans la séquence SEQ ID NO : 1 , correspondant au CDR de la chaîne lourde VH-CDR1 , Xaa3 représente un résidu arginine et dans la séquence SEQ ID NO : 2, correspondant au CDR de la chaîne lourde VH-CDR2, Xaa6 représente un résidu alanine.
L’anticorps ou le fragment d’anticorps selon l’invention est en outre de préférence tel que dans la séquence SEQ ID NO : 1 , correspondant au CDR de la chaîne lourde VH-CDR1 , Xaai représente un résidu thréonine, dans la séquence SEQ ID NO : 2, correspondant au CDR de la chaîne lourde VH- CDR2, Xaas représente un résidu acide glutamique et dans la séquence SEQ ID NO : 4, correspondant au CDR de la chaîne légère VL-CDR3, Xaa-i3 représente un résidu valine.
Des séquences particulièrement préférées selon l’invention sont les séquences suivantes :
- pour VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5), GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6), GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7), GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8), GYSFNTYG (SEQ ID NO : 9) ou GYSFSTFG (SEQ ID NO : 10) ;
- pour VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12), INADTGKS
(SEQ ID NO : 13), INADTGKA (SEQ ID NO : 14) ou INAETGKS (SEQ ID NO : 15) ;
- pour VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16), SSVTTGY (SEQ ID NO : 17), SSVNTNY (SEQ ID NO : 18), SSVSTNY (SEQ ID NO : 19), SSVATGF (SEQ ID NO : 20), SSVSTSY (SEQ ID NO : 21 ), SSVRTGY (SEQ ID NO : 22) ou SSVSTGY (SEQ ID NO : 23) ;
- pour VL-CDR2 : GTS ou RTS ;
- pour VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24), QQGHTI (SEQ ID NO : 25), QQGNTI (SEQ ID NO : 26) ou QQGHSI (SEQ ID NO : 27).
Des anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention sont tels que :
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5)
VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24).
D’autres anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention sont tels que :
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6)
VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16) VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).
D’autres anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention sont tels que : - les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7) ou GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8) VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13) ou INADTGKA (SEQ ID NO : 14) VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVNTNY (SEQ ID NO : 18), SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).
Des anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention présentent des CDR de séquences indiquées dans le tableau 1 ci-après, la séquence du VH-CDR3 étant VR :
Tableau 1
D’autres anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention présentent des CDR de séquences indiquées dans le tableau 2 ci-après, la séquence du VH-CDR3 étant VR :
Tableau 2 Un anticorps ou un fragment d’anticorps particulier selon l’invention comprend une paire de séquences choisie parmi les paires de séquences suivantes : SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32 et SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38 et SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40 et SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42 et SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44 et SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48 et SEQ ID NO : 49, ou une paire de séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec l’une de ces paires de séquences. On entend par là toute paire de séquences dans laquelle chacune des séquences présente au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec respectivement une des séquences d’une paire de séquences parmi les paires de séquences listées ci- avant.
Les séquences d’une paire de séquences peuvent être liées directement l’une à l’autre, en particulier par une liaison peptidique, ou être liées l’une à l’autre par une séquence d’un peptide de liaison.
Un fragment d’anticorps particulier selon l’invention, notamment un fragment scFv, comprend, et est de préférence constitué de, une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 51 , SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 60, ou une séquence ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec l’une de ces séquences.
En particulier, le peptide de liaison de séquence (G4S)3 (SEQ ID NO : 1 1 ) figurant dans ces séquences peut être remplacé par tout autre peptide de liaison. De préférence, la région variable de chaîne lourde et la région variable de chaîne légère de l’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention proviennent du macaque ( Macaca fascicularis). Il peut en être de même de la région constante de chaîne lourde et/ou de la région constante de chaîne légère. Le macaque présente notamment l’avantage d’une très grande homologie des séquences génétiques avec l’homme. Autrement, l’une ou plusieurs de ces régions peut provenir d’un animal transgénique.
Préférentiellement, l’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention ne présente pas la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 73. Il ne comprend notamment pas une région variable de chaîne légère présentant la séquence SEQ ID NO : 74, ou encore un CDR de région variable de chaîne légère présentant la séquence SEQ ID NO : 75, c’est-à-dire un CDR de région variable de chaîne légère de séquence SSVXaa7TXaa8Xaa9 (SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7, Xaa8 et Xaag sont comme définis précédemment, mais Xaa7 et Xaa8 ne représentent pas, simultanément, un résidu asparagine pour Xaa7 et un résidu sérine pour Xaa8.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut être un anticorps ou fragment d’anticorps recombinant comprenant le paratope d’un anticorps produit par un hybridome, notamment de macaque, et dont les régions constantes ont été modifiées de sorte à minimiser l’immunogénicité vis-à-vis de l’humain. Par exemple, il s’agit d’un anticorps ou fragment d’anticorps chimérique ou d’un anticorps ou fragment d’anticorps humanisé.
Un anticorps ou fragment d’anticorps chimérique désigne ici, de manière classique en elle-même, un anticorps ou fragment d’anticorps qui contient une région variable naturelle dérivée d’un anticorps d’une espèce donnée, en association avec les régions constantes d’un anticorps d’une espèce hétérologue à cette espèce. De tels anticorps peuvent par exemple être préparés par recombinaison génétique.
L’anticorps ou fragment d’anticorps chimérique selon l’invention est préférentiellement tel que la région constante de chaîne lourde et/ou la région constante de chaîne légère, lorsqu’il en comporte, sont d’origine humaine, les régions variables étant quant à elles de préférence dérivées du macaque.
Un anticorps ou fragment d’anticorps humanisé comprend des CDR issus d’un anticorps de mammifère non humain, de préférence, selon la présente invention, de macaque, et des régions charpente FR et C dérivées d’anticorps humain.
Il entre dans les compétences de l’homme du métier de déterminer quelles modifications peuvent être apportées à un anticorps donné pour l’humaniser. A titre d’exemple, cette humanisation peut être réalisée par fusion avec une région constante de chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 61 (lgG1 humain, allotype G1 m1 ,17).
Entrent également dans le cadre de la présente invention des anticorps ou fragments d’anticorps modifiés, tout en conservant leur affinité pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa, par exemple pour optimiser certaines de leurs fonctions effectrices. Les modifications peuvent être réalisées sur un résidu d’acide aminé ou sur une liaison peptidique. Un exemple de telle modification est la liaison de polyéthylène glycol.
Un autre aspect de l’invention concerne une molécule d’acide nucléique codant pour un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’invention.
Cette molécule d’acide nucléique peut par exemple présenter une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 62 à SEQ ID NO : 72. Ces séquences codent pour des fragments d’anticorps conformes à l’invention, dans lesquels un peptide de liaison de séquence (G4S)3 (SEQ ID NO : 1 1 ) relie la région variable de chaîne lourde et la région variable de chaîne légère.
L’invention concerne également un vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique selon l’invention. Ce vecteur d’expression peut être de tout type connu en lui-même pour une mise en oeuvre en ingénierie génétique, notamment un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codant pour l‘anticorps ou fragment fonctionnel de cet anticorps selon l’invention.
La présente invention concerne également une cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique ou un vecteur d’expression selon l’invention. Cette cellule hôte peut aussi bien être une cellule procaryote, en particulier bactérienne, notamment pour la production en masse de l'anticorps ou fragment fonctionnel de cet anticorps, qu’une cellule eucaryote, pouvant être inférieur ou supérieur, par exemple de levure, d’invertébrés ou de mammifères. En particulier, entrent dans le cadre de l’invention des lignées cellulaires exprimant, de manière stable, inductible ou constitutive, ou bien transitoire, un anticorps ou fragment fonctionnel de cet anticorps selon l’invention.
Les anticorps ou fragments d’anticorps selon l’invention peuvent être produits par toute méthode conventionnelle connue de l’homme du métier. Ils peuvent notamment être obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier de l’invention, un procédé de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention comprend la culture de cellules hôtes selon l’invention, c’est-à-dire comprenant une molécule d’acide nucléique codant pour un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention, ou un vecteur d’expression contenant une telle molécule d’acide nucléique, dans des conditions permettant l’expression dudit anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps, et la récupération de l’anticorps, ou fragment fonctionnel de cet anticorps, ainsi produit.
Des procédés alternatifs de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention entrent également dans le cadre de l’invention, notamment par inoculation d’un mammifère non humain avec l’antigène OprF de Pseudomonas aeruginosa, le cas échéant avec un adjuvant de Freund, et criblage des hybridomes produisant un anticorps présentant une affinité pour cet antigène, les anticorps ou fragments d’anticorps conformes à l’invention étant identifiés par analyse de leur séquence. A cet effet, la protéine OprF utilisée pour l’inoculation se trouve sous forme de protéoliposomes, tels que décrits dans la publication de Maccarini et al. précitée.
L’inoculation peut être réalisée par toute voie, notamment par injection sous- cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, etc. Il peut être réalisé une ou plusieurs injections, à plusieurs jours d’intervalle.
Un procédé de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon un mode de réalisation particulier de l’invention comprend des étapes successives de :
- fabrication de protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa. Cette étape peut être réalisée par mise en contact, pour former un milieu réactionnel, d’un vecteur d’expression contenant la séquence codante de la porine OprF de Pseudomonas aeruginosa et d’un liposome synthétique, notamment de composition lipidique définie, en présence d’un système de synthèse protéique acellulaire, ce système pouvant par exemple être issu d’un lysat bactérien ou de tout autre lysat provenant de levures, de cellules de mammifères, de germe de blé ou de tout autre source biologique, ce système permettant la transcription et la traduction simultanée de la protéine, par exemple selon le protocole décrit dans la publication de Maccarini et al. précitée ;
- inoculation d’un mammifère non humain, notamment de l’espèce Macaca fascicularis, avec lesdits protéoliposomes ;
- construction d’une banque d’anticorps ou fragments d’anticorps, notamment de scFv, à partir d’ARN extrait de lymphocytes B dudit mammifère,
- criblage de ladite banque vis-à-vis desdits protéoliposomes, par une technique d’expression, notamment d’expression phagique (pour l’anglais « phage display ») et dosage d'immunoadsorption par enzyme liée (ELISA) par exemple,
- et sélection et récupération des clones réactifs contre la cible protéoliposomique.
Selon la présente invention, on considère de préférence qu’un clone est réactif contre la cible protéoliposomique lorsque sa constante de dissociation, telle que mesurée par ELISA, vis-à-vis de cette cible, est inférieure ou égale à 10 mM.
Préférentiellement, le procédé comprend, pour les clones réactifs vis-à-vis des protéoliposomes ainsi sélectionnés, une étape d’isolation et de vérification de leur redondance éventuelle par séquençage.
La construction d’une banque d’anticorps ou fragments d’anticorps, notamment de scFv, à partir d’ARN extrait de lymphocytes B dudit mammifère, peut par exemple comprendre l’amplification par transcription inverse et réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR) des ARN messagers (ARNm) codant les domaines variables VLk, VLÀ et VH des anticorps, construction d’une banque de scFv par clonage séquentiel des domaines variables VLk, nΐ_l et VH dans un vecteur phagemidique, et encapsidation et amplification de la banque de scFv en phage, notamment en phage M13K07 de la société Invitrogen®.
Le procédé de préparation d’un anticorps ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention peut comprendre une étape d’humanisation d’un anticorps ou fragment d’anticorps produit à partir du mammifère non-humain, par greffage d’au moins une séquence de CDR de cet anticorps ou fragment d’anticorps sur une région de charpente FR d’un anticorps humain.
Il peut en outre comprendre des substitutions, insertions et/ou délétions d’un ou plusieurs acides aminés d’un anticorps ou fragment d’anticorps produit à partir du mammifère non-humain.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention trouve une application particulièrement avantageuse pour le traitement des infections bactériennes, en particulier des infections à Pseudomonas aeruginosa.
Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique, notamment une composition de vaccin, pour lutter contre les infections bactériennes, en particulier les infections à Pseudomonas aeruginosa, et notamment les infections pulmonaires aigües et chroniques. Cette composition comprend un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’invention en tant que substance active, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut se présenter sous toute forme galénique adaptée à une administration à un mammifère, notamment sous une forme galénique adaptée à une administration orale ou parentérale. En particulier, elle peut se présenter sous une forme galénique adaptée à une injection intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou à une administration par voie intranasale ou par inhalation.
Le véhicule peut consister en tout véhicule classique en lui-même, notamment dans le domaine des compositions de vaccin. Il peut notamment s’agir d’un véhicule aqueux.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut en outre contenir tout additif classique en lui-même, ainsi éventuellement que d’autres principes actifs. A titre d’additifs pouvant être mis en œuvre dans la composition pharmaceutique selon l’invention on peut citer les agents tensioactifs, notamment de type polysorbate, les solvants ou encore les agents stabilisateurs, par exemple de type glycine, arginine ou autres, etc.
Un autre aspect de l’invention concerne l’utilisation, à titre prophylactique ou curatif, d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel de cet anticorps en tant que médicament, et en particulier pour lutter contre les infections bactériennes, en particulier contre les infections à Pseudomonas aeruginosa, notamment les infections du système respiratoire, et plus particulièrement les infections pulmonaires, notamment les infections pulmonaires aigües et chroniques.
Cette utilisation comprend l’administration dudit anticorps ou fragment d’anticorps, ou d’une composition pharmaceutique le contenant, à un mammifère, notamment un humain, dans une dose thérapeutiquement efficace.
Cette administration peut être réalisée par toute voie. Elle est de préférence réalisée par voie orale ou par voie parentérale, en particulier par injection intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie intranasale ou par inhalation.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut être administré à l’individu traité en dose unique, ou en plusieurs doses, notamment réparties à plusieurs jours d’intervalle.
La dose efficace, la durée d’administration et le nombre d’administrations dépendent de l’individu traité, en particulier de son âge, son poids, ses symptômes, etc. La détermination de conditions exactes du traitement est du ressort du praticien.
A titre d’exemple, une dose thérapeutiquement efficace de l’anticorps ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention peut être comprise entre 1 et 1000 mg, pour un traitement en dose unique.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut être utilisé pour traiter tout individu en ayant besoin, notamment tout individu souffrant d’une infection bactérienne, en particulier une infection à Pseudomonas aeruginosa, ou, à titre préventif, tout individu à risque susceptible de contracter une telle infection, par exemple les patients affaiblis sur le plan immunitaire, les patients atteints de mucoviscidose, les patients sous ventilation mécanique ou les grands brûlés, lors d’une hospitalisation. Un tel traitement préventif permet d’éliminer de manière considérable les risques d’infection à Pseudomonas aeruginosa.
La présente invention concerne également d’autres utilisations de l’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention, par exemple pour la détection, et le cas échéant la purification, de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa. La présente invention concerne ainsi l’utilisation d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention pour la détection, in vitro ou ex vivo, de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide biologique, notamment un fluide corporel issu d’un individu, en particulier d’un individu humain ou animal. On entend par là que le fluide corporel a été extrait dudit individu.
Cette détection peut être réalisée par toute technique classique en elle-même pour l’homme du métier, par exemple par Western blot, cytométrie de flux, résonance de plasma de surface, ELISA, etc.
Un autre aspect de l’invention concerne un kit de diagnostic pour la détection de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide biologique, notamment un fluide corporel issu d’un individu, en particulier un individu humain ou animal. Ce kit contient un anticorps ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention, et des instructions pour la mise en oeuvre d’un procédé de détection, in vitro ou ex vivo, de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide corporel issu d’un individu, au moyen de cet anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel d’anticorps.
Ce kit peut également comprendre tout réactif classique en lui-même pour la mise en oeuvre d’un tel procédé de détection.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut autrement être utilisé pour la préparation d’anticorps bi-spécifiques.
Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en oeuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l’invention, avec l’appui des figures 1 à 15, dans lesquelles :
La figure 1 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution du sérum, pour un test ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ) réalisé sur des sérums prélevés d’un macaque, aux jours 0, 24 et 38 après immunisation de ce macaque par des protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa (OPRF J0, OPRF J24, OPRF J38) et sur un sérum prélevé d’un macaque, au jour 38 après immunisation du macaque par l’albumine de sérum bovin (BSA J38).
La figure 2 montre les séquences de 6 fragments scFv dirigés contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa conformes à l’invention, dans lesquelles sont soulignées les séquences correspondant aux 6 CDR, ainsi que la séquence du peptide de liaison liant la région variable de chaîne lourde à la région variable de chaîne légère - dans ces séquences, l’extrémité N-terminale est à gauche, et l’extrémité C-terminale est à droite, de manière conventionnelle.
La figure 3 montre les séquences de 5 autres fragments scFv dirigés contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa conformes à l’invention, dans lesquelles sont soulignées les séquences correspondant aux 6 CDR, ainsi que la séquence du peptide de liaison liant la région variable de chaîne lourde à la région variable de chaîne légère - dans ces séquences, l’extrémité N-terminale est à gauche, et l’extrémité C-terminale est à droite, de manière conventionnelle.
La figure 4 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (E2) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 5 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (E5) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 6 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (F8) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 7 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (G9) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 8 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (E3) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 9 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (E7) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 10 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (F10) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 1 1 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (F3) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 12 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (F4) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif. La figure 13 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (A1 ) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 14 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (A8) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.
La figure 15 représente des graphes montrant la densité optique (DO) à 450 nm en fonction de la concentration, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés respectivement sur quatre fragments scFv conformes à l’invention, dénommés E7, F8, F10 et G9. La figure 16 montre un graphe représentant la valeur obtenue par soustraction de l’absorbance à 680 nm de l’absorbance à 490 nm (« A490-A680 nm »), lors d’un test in cellulo de détermination du pouvoir neutralisant, face à l’infection de macrophages (« Ma ») par Pseudomonas aeruginosa (« Pa »), de fragments scFv conformes à l’invention (F8, G9, E7), par dosage de l’activité de la lactate déshydrogénase.
A/ Production de protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa
Construction d’un vecteur recombinant exprimant OprF
Le vecteur recombinant plVEX2.4-OprF, dans lequel OprF comprend une étiquette poly-histidine N-terminale, est construit en clonant le gène OprF amplifié à partir d’ADN génomique de Pseudomonas aeruginosa amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), au moyen des amorces suivantes :
Sens 5’-GG AATT CCAT AT GAAACT G AAG AACACCTT AG-3' (SEQ ID NO : 76) Antisens 5’-T AG AAGCT G AAGCCAAGT AACT CG AGT AACGC-3' (SEQ ID NO : 77)
dans le vecteur d’expression plVEX2.4d (Roche Diagnostics). A cet effet, il est mis en œuvre 30 cycles de PCR en utilisant une ADN polymérase de haute fidélité. Le produit PCR ainsi obtenu est ensuite purifié grâce à l’utilisation du kit QIAquick gel (Qiagen) puis digéré avec les enzymes de restriction Ndel, Xhol (Roche Diagnostics), à nouveau purifié puis lié grâce au kit Rapid DNA ligation kit (Roche Diagnostics) dans le vecteur plasmidique plVEX2.4d (Roche Diagnostics) préalablement digéré par les enzymes Ndel et Xhol. Le plasmide recombinant résultant plVEX2.4-OprF est vérifié par séquençage (LGC Genomics) afin de valider l’insertion du gène codant pour OprF en phase avec l’étiquette poly-histidine du vecteur plVEX2.4d.
Préparation de liposomes
Des liposomes sont préparés en séchant une composition lipidique préalablement solubilisée dans du chloroforme, pour les différentes compositions lipidiques (LC) suivantes :
- Composition Lipidique 1 (LC1 ) : cholestérol, 1 ,2-dioléoyl-sn-glycéro-3- phosphocholine (DOPC), 1 ,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), 1 ,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphate (sel de sodium) (DMPA), ratio molaire [2-4-2-2] ;
- LC1’: LC1 + 1 mg/mL monophosphoryl lipide A (MPLA) ;
- LC2: 1 -palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (POPE), 1 - palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1 '-rac-glycérol) (sel de sodium) (POPG), E. coli cardiolipine (CL), ratio molaire [6-2-2] ;
- LC2’: LC2 + 1 mg/mL MPLA ;
- LC3: POPE, POPG, E. coli CL, DMPA, ratio molaire [6-2-1 -1] ;
- LC 3’: LC 3 + 1 mg/mL MPLA (Avanti Polar Lipids).
Le séchage est réalisé par évaporation sous azote. Les traces résiduelles de chloroforme sont éliminées en utilisant une pompe à vide. Le film lipidique est ensuite hydraté dans 500 mI d’une solution de Tris (50 mM, pH 7,5) en vortexant, puis soumis à 4 cycles de congélation/décongélation en azote liquide. Le mélange lipidique est extrudé en utilisant une extrudeuse (Avanti Polar Lipids) pour produire des liposomes de taille en moyenne, d’environ 200 nm. Les liposomes ainsi obtenus sont conservés à 4°C.
Production et purification de protéoliposomes contenant OprF en système acellulaire La protéine membranaire OprF de Pseudomonas aeruginosa est synthétisée en présence des différentes compositions de liposomes (LC1 , ou LC2, ou LC3 ou LC1’, ou LC2’ ou LC3’) en utilisant le kit de synthèse protéique acellulaire RTS 500 ProteoMaster E. coli HY, de Biotechrabbit. A cet effet, le plasmide recombinant plVEX2.4-OprF contenant le gène codant pour la protéine OprF fusionnée à une étiquette poly-histidine (6xHis) est ajouté à une concentration de 15 pg/ml au lysat cellulaire du kit en présence d’une quantité de 1 à 4 mg/ml de liposomes d’une des 6 compositions lipidiques LC1 à LC3’. Les protéoliposomes contenant la protéine recombinante OprF sont produits à 25°C pendant 16 h sous agitation (300 tr/min) dans un rapport de 1/30 de volume réactionnel/volume du contenant. Les protéoliposomes recombinants résultant sont ensuite purifiés en 2 étapes :
- tout d’abord dans un gradient de sucrose de 0-40% en tampon Tris 50 mM pH 7,5 sur lequel le mélange réactionnel est déposé sur le haut du gradient puis centrifugé à 287.660g pendant 2 h en utilisant un rotor TH-641. Des fractions de 1 ml sont récoltées à partir du haut du gradient et analysées par western blot en utilisant un anticorps anti-histidine couplé à la peroxydase de raifort HRP (Sigma),
- ensuite, 1 ml d’un tampon Tris 50 mM pH 7,5 est ajouté à chaque fraction contenant les protéoliposomes contenant OprF, et la solution est centrifugée à 30.000g pendant 30 min à 4°C, pour former un culot de protéoliposomes. Le culot est lavé 2 fois pendant 30 min à 4°C avec une solution de NaCI 5M et ensuite re-suspendu dans une solution de Tris 50 mM pH 7,5 à la concentration désirée. La pureté des échantillons est analysée sur un gel SDS- PAGE coloré au bleu de Coomassie.
On obtient des protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa.
B/ Préparation et criblage d’une banque de fragments scFv
Immunisation des animaux
Des fragments scFv dirigés contre la cible antigénique membranaire bactérienne OprF de Pseudomonas aeruginosa sont obtenus à partir d’une immunisation par les protéoliposomes obtenus à partir de la composition lipidique LC1 , effectuée aux jours J0, J14, J28 et J50 d’un macaque ( Macaca fascicularis). Le macaque est élevé en conditions stériles en présence d’un congénère et sans aucune autre espèce. Avant la première injection, une analyse sanguine est réalisée afin de connaître le statut physiologique de l’animal. 100 pg de la composition LC1 dans du tampon phosphate salin (PBS) stérile, mélangés à 50/50 avec un adjuvant de Freund (complet pour la primo injection, incomplet pour les suivantes) lui sont injectés en injection sous- cutanée en 2 points (à raison de 250 mI par point) dans la zone scapulaire de l’animal, selon le profil suivant : administrations aux jours 0, 14, 28, 50.
La réponse immunitaire est analysée par dosage immunoenzymatique (ELISA) à partir de sérums prélevés aux jours J0, J24, J38 pour faire une titration des anticorps dirigés contre la cible antigènique membranaire OprF. Des prélèvements de la moelle osseuse sont effectués après la dernière injection (J50) aux jours J53, J60, J67 et J74 sur l’animal anesthésié.
Titration des sérums
La réponse humorale après immunisation est analysée par la méthode ELISA indirecte utilisant une série de dilutions des sérums pré-immuns et immuns (dilutions de 100, 1000, 10 000, 1 000 000, 10 000 000 et 100 000 000) en suivant le protocole décrit dans le livre « Phage Display », Methods and Protocols, Springer Protocols, chapitre « Construction of Macaque Immune Libraries », Arnaud Avril et al., Methods Mol Biol. 2018; 1701 : 83-1 12. doi: 10.1007/978-1 -4939-7447-4_5. Brièvement, l’antigène membranaire OprF sous forme de protéoliposomes ou un contrôle négatif tel que l’albumine de sérum bovin (BSA) est tout d’abord déposé au fond des plaques ELISA et incubé 16 h à 4°C. Après une étape de saturation (2% de lait déshydraté re-suspendu dans 200 mI de tampon phosphate salin PBS), chaque sérum dilué (à 1/100 initialement puis 1/10, dans du PBS/Tween® 0.05 %/BSA 0,5 %) est ensuite testé en parallèle contre l’antigène OprF ou le contrôle négatif (BSA) pendant 2 h à 37°C. Les anticorps spécifiques dirigés contre OprF sont ensuite révélés en utilisant un anticorps secondaire anti-Fc du macaque conjugué à la peroxydase de raifort HRP et par addition de tétraméthylbenzidine (TMB) jusqu’à l’apparition d’une coloration dans les puits. L’analyse des résultats s’effectue par lecture de la densité optique à 450 nm. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 1 . pour les sérums prélevés aux jours JO, J24 et J38 après immunisation avec les protéoliposomes contenant OprF et pour les sérums obtenus au jour J38 pour l’immunisation avec la BSA.
Au jour J38, un titre de 1/200000 est observé, qui est compatible avec la suite du procédé.
Prélèvements de la moelle osseuse et isolement des lymphocytes B
Le prélèvement des moelles osseuses s’effectue sur l’animal anesthésié. Les prélèvements s’effectuent au niveau de la fosse trochantérique fémorale et au niveau du tubercule de l’humérus, au moyen d’un trocart de Mallarmé. Chaque prélèvement est récolté dans un tube Falcon® de 50 ml contenant une solution de citrate à 10-15%. Approximativement, 5 ml d’échantillon sont obtenus aux jours J53, J60, J67 et J74. Chaque prélèvement est ensuite centrifugé pendant 10 min à 500g (1500 tr/min) à 4°C. Le surnageant est prélevé et placé dans un cryotube, puis conservé à -20°C. L’ARN total de chacune des moelles osseuses est ensuite extrait par la technique du Trizol/Chloroforme et quantifié par lecture de la densité optique (DO) à 260 nm et 280 nm en utilisant un spectrophotomètre.
Les résultats obtenus sont montrés dans le tableau 3 ci-après.
Tableau 3
Amplification par RT-PCR des ARN codant pour les parties variables VLK, VLÀ et VH
Les ARN messagers (ARNm) codant pour les domaines variables des chaînes lourdes et légères G et k/l pour chacun des échantillons de moelle osseuse sont rétro-amplifiés pour obtenir une banque d’ADN complémentaire (ADNc) en utilisant des amorces spécifiques, décrites dans la publication de Avril et al., 2018, Methods Mol. Biol., 1701 : 83-1 12. La qualité de l’amplification est contrôlée par électrophorèse sur gel d’agarose. Les produits PCR amplifiés à partir de la banque d’ADNc obtenue les jours J53 à J74 sont clonés dans le plasmide pGemT (Promega), selon le protocole du fournisseur, afin d’obtenir une banque de clones sécurisés.
Construction d’une banque de fragments scFv
A partir des ADN obtenus aux jours J53 et J60, 2 banques (une pour chaque jour) sont construites par clonage séquentiel en insérant, selon le protocole du fournisseur, d’abord les fragments VL dans le vecteur phagemidique pïh1 (Addgene) puis les fragments VH, pour obtenir une construction au format VH- [(G4S)X3 (SEQ ID NO : 1 1 )]-VL-6xHistidine-EQKLISEEDL (SEQ ID NO : MM), dans lequel les fragments VH et VL sont reliés par le peptide de liaison GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO : 1 1 ) reliant l’extrémité C-terminale du fragment VH à l’extrémité N-terminale du fragment VL, et dans comprenant à son extrémité C-terminale une étiquette poly-histidine (SEQ ID NO : 79) et une étiquette c-myc (SEQ ID NO : 78).
Pour les ADN obtenus au jour J53, on obtient une banque de 1 ,5.107 UFC (75 % d’inserts de taille complète). Pour les ADN obtenus au jour J60, on obtient une banque de 1.107 UFC (100 % d’inserts de taille complète).
Criblage des banques des fragments scFv par la technique d’expression phaqique (« phaqe displav ») - identification des fragments présentant une affinité pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa
La banque est encapsidée et amplifiée en phage M13Ko7 (Nebb), selon le protocole du fournisseur.
Les banques de scFv contenues dans les phagemides sont soumises à 4 tours de sélection contre les protéoliposomes contenant l’antigène membranaire OprF fixé sur des plaques 96 puits.
Le protocole de criblage est le suivant : une plaque de microtitrage est enduite pendant la nuit avec l'antigène ciblé à une concentration de 10 pg/ml dans du PBS à 4°C. Ensuite, la plaque est bloquée avec 3% de BSA dans du PBS pendant 2 h à 37°C ; après lavage, la banque est incubée pendant 2 h supplémentaires à 37°C. Au cours du premier tour, la plaque est lavée 2 fois en utilisant du PBS contenant 0,1 % de Tween® 20 avec un intervalle de 5 min entre chaque lavage. Finalement, la plaque est lavée, rincée avec du PBS stérile et le phage est élué avec de la trypsine (1 0 mg/ml dans du PBS) pendant 30 min à 37°C. Les phages élués sont utilisés pour l'infection d'Escherichia coli (souche SURE, Stratagene, cultivée dans un milieu SB (Super Broth) supplémenté avec de la tétracycline (10 pg/ml) et de la carbénicilline (50 pg/ml). Pour la production de nouvelles particules de phage, la souche infectée est co-infectée avec un phage auxiliaire et cultivée pendant une nuit à 30°C dans un milieu SB supplémenté avec de la tétracycline (10 pg/mL), de la carbénicilline (50 pg/mL) et de la kanamycine (70 pg/mL). Les particules de phage sont précipitées en utilisant du PEG / NaCI (4% (p/v) PEG- 8000, 3% (p/v) NaCI) et utilisées pour le cycle suivant. Le deuxième tour est réalisé comme décrit précédemment. Les souches infectées du troisième tour sont cultivées sur des milieux SB dans des boîtes de Pétri et sont utilisées pour le criblage.
Après chaque tour, seuls les phages ayant interagi avec OprF sont élués. La réactivité des phages après chaque tour de sélection contre la cible OprF est testée par dosage ELISA. Les phages montrent une augmentation du signal par un facteur 30 entre le premier tour de sélection et le 4eme tour, indiquant un enrichissement des scFvs réactifs contre OprF.
96 clones isolés à partir du deuxième, troisième et quatrième tours de sélection sont récoltés et utilisés pour produire des scFv solubles. De ces clones, 57 clones positifs sont sélectionnés et 15 d’entre eux sont retenus. Une analyse de la séquence nucléotidique et peptidique des 57 clones est réalisée afin de déterminer la redondance potentielle de certaines séquences. 43 séquences sont identifiées comme non redondantes et non recombinées. Parmi ces 43 séquences, 1 1 d’entre elles sont produites en bactérie Escherichia coli, selon le protocole suivant : l'ADN phagemidique isolé après le processus de sélection est utilisé pour transformer la souche d'E. Coli non suppresseur de telle sorte qu'elle exprime le fragment scFv soluble. Des colonies uniques de transformants choisis au hasard sont utilisées pour inoculer 5 ml de milieu SB supplémenté en carbénicilline. Les cultures sont incubées pendant une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse (250 tr/min). 500 ml de milieu SB supplémenté en carbénicilline sont ensuite inoculés avec 500 mI de chaque culture. Les cultures sont cultivées à 30°C jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteigne 1 ,5. De l'IPTG (1 mM) est ensuite ajouté pendant une nuit pour induire l'expression génique à 22°C. Les cellules sont récoltées par centrifugation à 2500 g pendant 15 min à 4°C. Les scFv sont extraits avec du sulfate de polymyxine B et purifiés sur une colonne de nickel (colonne Ni-NTA, Qiagen) selon les instructions du fabricant, puis dialysés contre du PBS.
Les scFv correspondants produits sont ensuite purifiés pour confirmation de leur affinité contre la cible OprF par la méthode ELISA.
Ces 1 1 fragments scFv comprennent les séquences indiquées dans le tableau 4 ci-après.
Tableau 4
Ces séquences y sont prolongées, à leur extrémité C-terminale, par une étiquette poly-histidine (SEQ ID NO : 79) et une étiquette c-myc (SEQ ID NO : 78).
Ces fragments scFv comprennent tous :
- une région variable de chaîne lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes :
VH-CDR1 : GYXaai FXaa2Xaa3Xaa4G (SEQ ID NO : 1 ) dans laquelle Xaai représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2 représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa3 représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa4 représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,
VH-CDR2 : INAXaa5TGKXaa6 (SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaa5 représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa6 représente un résidu alanine ou un résidu sérine,
VH-CDR3 : VR,
- et une région variable de chaîne légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes :
VL-CDR1 : SSVXaa7TXaa8Xaa9 (SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7 représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa8 représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaa9 représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,
VL-CDR2 : Xaa-ioTS dans laquelle Xaa-io représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,
VL-CDR3 : QQGXaaiiXaa-i2Xaa-i3 (SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaa-n représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa-12 représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa-13 représente un résidu valine ou un résidu isoleucine.
Ces fragments scFv sont tous conformes à la présente invention.
Chacune des séquences de ces fragments scFv est montrée sur la figure 2 pour A1 , A8, E2, E3, E5, E7 et sur la figure 3 pour F3, F4, F8, F10, G9. Les séquences des CDR y sont soulignées. On y distingue ainsi, de gauche à droite, les séquences successives des CDR de la région variable de chaîne lourde (VH-CDR1 , puis VH-CDR2, puis VH-CDR3), puis des CRD de la région variable de chaîne légère (VL-CDR1 , puis VL-CDR2, puis VL-CDR3). La séquence du peptide de liaison est également soulignée, entre les deux triplets de CDR.
C/ Analyse de l’affinité de fragments scFv conformes à l’invention pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa
Les 11 fragments scFvs produits ci-dessus sont purifiés.
On obtient les quantités suivantes de chaque fragment scFv conforme à l’invention : 0,346 mg/ml E2, 0,401 mg/ml E3, 0,559 mg/ml E5, 0,453 mg/ml E7, 0,387 mg/ml F4, 0,436 mg/ml F3, 0,333 mg/ml F8, 0,403 mg/ml F10, 0,570 mg/ml G9, 0,385 mg/ml A1 et 0,626 mg/ml A8.
Un dosage ELISA est réalisé sur des plaques MaxiSorp®, pour confirmer l’affinité de ces fragments scFv contre la cible OprF sous la forme de protéoliposomes, de la façon suivante.
La plaque est saturée par 2,5% de lait déshydraté re-suspendu dans 200 mI de tampon phosphate salin PBS.
Les fragments scFv sont incubés à différents taux de dilution : 1 /20, 1 /40, 1 /80, 1 /160, 1 /320, 1 /640, 1/1280, dans du PBS/Tween®-20 0,05%/BSA 0,5%. La détection est réalisée en utilisant un anticorps secondaire anti-étiquette c-myc couplé à la peroxydase de raifort. La densité optique à 450 nm est relevée.
Les résultats obtenus, pour le fragment selon l’invention et pour un témoin négatif (BSA) sont montrés sur la figure 4 pour E2, figure 5 pour E5, figure 6 pour F8, figure 7 pour G9, figure 8 pour E3, figure 9 pour E7, figure 10 pour F10, figure 1 1 pour F3, figure 12 pour F4, figure 13 pour A1 et figure 14 pour A8.
On y voit que l’ensemble des fragments scFv selon l’invention présentent une haute affinité pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa.
A titre d’exemple, la constante de dissociation Kd est déterminée pour les fragments scFv E7, F8, F10 et G9, par une méthode ELISA.
A cet effet, 100 mI de protéoliposomes OprF (contenant une concentration en OprF de 1 pg/ml) contenus dans du tampon de fixation (0,1 M carbonate de sodium, 0,1 M bicarbonate de sodium) sont fixés au fond des puits d’une plaque 96 puits (Thermo Scientific®) pendant une nuit à 4 °C et sous agitation. Les puits sont ensuite bloqués pendant 1 h à 21 °C avec 100 mI de tampon TBS Tween (TBST) contenant 5 % de lait. Après lavage des puits avec 100 mI de tampon TBST, 100 mI du fragment scFv (E7, F8, F10 ou G9), aux dilutions 1 /50 ; 1 /200 ; 1 /400 ; 1 /800 ; 1 /1600 et 1 /3200 dans du tampon TBST, sont ajoutés aux puits correspondants et incubés pendant 1 h à 37 °C sous agitation. Après lavage des puits, 100 mI d’anticorps anti-c-myc-Peroxidase (Roche) (dilution 1 /10000 dans du tampon TBST contenant 5 % de lait) sont ajoutés aux puits et incubés pendant 1 h à 37 °C sous agitation. Après 3 lavages des puits, 50 mI de TMB sont ajoutés aux puits et la plaque est incubée à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant environ 15 min. 50 mI d’HCI 1 M sont ensuite ajoutés et l’absorbance de chaque puit est mesurée à 450 nm. Ces données d’absorbance sont alors analysées à l’aide du logiciel GraphPad Prism (analyse par régression non linéaire, équation « un site - liaison spécifique » (« one site-specific binding »)) afin de calculer la constante de dissociation Kd de chaque fragment scFv testé. A titre comparatif, une mesure est également réalisée sur le tampon seul.
Les résultats obtenus, pour chacun des fragments E7, F8, F10 et G9, sont montrés sur la figure 15.
Les valeurs des constantes de dissociation Kd ainsi déterminées sont indiquées dans le tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5
Ces résultats témoignent d’une très bonne affinité des fragments selon l’invention pour la cible protéoliposomique contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa.
D / Détermination du pouvoir neutralisant de fragments scFv conformes à l’invention in cellulo
Les fragments E7, F8 et G9 ont été testés dans cette expérience, pour déterminer leur pouvoir neutralisant face à l’infection de macrophages par Pseudomonas aeruginosa (souche CHA) à une MOI (multiplicité d’infection) de 10.
Le protocole suivant a été mis en oeuvre :
- Différenciation des cellules THP-1 (lignée monocytaire humaine) en macrophages suite à l’ajout de phorbol myristate acétate (PMA) : ajout de 15 mI de PMA (solution stock à 0,1 mg/ml) à 10 ml de cellules THP-1 en suspension dans du milieu RPMI contenant 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté (dSVF) (440 000 cellules/ml) ; incubation de la boîte de culture T25 dans une étuve à 37 °C (atmosphère contenant 5 % de CO2) pendant minimum 48h afin de permettre la différenciation des cellules THP-1 en macrophages adhérents ;
- Culture et préparation de P.aeruginosa (souche CHA) : lancement d’une culture de bactéries P. aeruginosa (souche CHA) à partir d’une petite quantité de stock glycérol bactérien placé dans 10 ml de milieu de culture LB ; incubation de la culture bactérienne à 37 °C sous agitation pendant une nuit ; dilution de la culture dans du milieu LB jusqu’à obtention d’une mesure de densité optique à 600 nm égale à 0,5 dans 1 ml de culture (6 x 108 CFU/ml) ; centrifugation à 4000 g pendant 5 min ; retrait du surnageant et reprise du culot dans 1 ml de milieu de culture RPMI - 10 % dSVF ; 2eme centrifugation à 4000 g pendant 5 min ; retrait du surnageant et reprise du culot dans 1 ml de milieu de culture RPMI - 10 % dSVF ; dilution dans le même milieu afin d’obtenir une suspension contenant 15 000 000 de bactéries/ml ; incubation à 37 °C pendant 2h de : 35 mI de la suspension de P. aeruginosa + 35 mI de scFv E7 en PBS (0,453 mg/ml), 35 mI de la suspension de P. aeruginosa + 35 mI de scFv F8 en PBS (0,333 mg/ml), 35 mI de la suspension de P. aeruginosa + 35 mI de scFv G9 en PBS (0,570 mg/ml), 35 mI de la suspension de P.aeruginosa ;
- Préparation des macrophages : retrait du surnageant de culture ; ajout de
2 ml de Versène afin de décoller les cellules adhérentes ; après décollement du tapis cellulaire, ajout de 2 ml de milieu et récupération des cellules ; centrigugation à 400 g pendant 5 min ; resuspension du culot cellulaire dans 2 ml de milieu et comptage des cellules ; répartition de la suspension cellulaire dans les puits d’une plaque 96 puits de façon à obtenir 15000 cellules/puit et ajout de la quantité nécessaire de milieu RPMI-10 % dSVF afin d’obtenir les volumes finaux indiqués dans le tableau 6 ci-dessous :
Tableau 6 - M représente les macrophages - Réalisation du test de cytotoxicité permettant de quantifier le relarguage de LDH (Lactate Déshydrogénase) cellulaire dans le milieu de culture, selon le protocole défini dans la notice du kit de dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) « Pierce® LDH cytotoxicity assay kit » : ajout de 10 mI de PBS stérile aux puits n° 1 à 5 des lignes A, B, C et aux puits n° 1 des lignes D, E , F ; ajout de 10 mI de P. aeruginosa (Pa) aux puits n° 3 des lignes A, B, C et aux puits n° 1 des lignes D, E, F ; ajout de 20 mI du mélange : Pa + F8 aux puits n°2 des lignes D, E, F, Pa + G9 aux puits n°3 des lignes D, E, F, Pa + E7 aux puits n°4 des lignes D, E, F ; ajout de 10 mI d’eau stérile ultrapure aux puits n° 1 et 3 des lignes A, B, C ; incubation de la plaque dans une étuve à 37 °C (atmosphère contenant 5 % de CO2) pendant 16h ; ajout de 10 mI de tampon de lyse (10 x) aux puits n°2 et 5 des lignes A, B, C ; incubation pendant 45 min dans une étuve à 37 °C (atmosphère contenant 5 % de C02) ; centrifugation de la plaque à 250 g pendant 3 min ; transfert de 50 mI de chaque puit dans une nouvelle plaque 96 puits ; ajout à chaque puit de 50 mI du mélange réactionnel ; incubation de la plaque à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 30 min ; ajout à chaque puit de 50 mI de la solution stop ; mesure de l’absorbance de chaque puit à 490 et 680 nm ; soustraction des valeurs d’absorbances : A490nm - Aesonm-
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 16. On observe une diminution d’environ 2/3 de la cytotoxicité de P. aeruginosa envers les macrophages en présence des fragments ScFv selon l’invention. Ceci démontre une action neutralisante de ces fragments contre P. aeruginosa.
E / Analyse des protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa avant servi à l’obtention des ScFv conformes à l’invention
Les protéoliposomes obtenus dans l’expérience décrite en A/ ci-avant ont été soumis aux analyses suivantes.
E.1 / Matériel et méthodes
Digestion à la trypsine - Les protéoliposomes OprF (LC1 ) purifiés par centrifugation en gradient de saccharose ont été protéolysés en utilisant un rapport massique trypsine : protéine de 1 :10 à température ambiante (RT). Les échantillons ont été récupérés à différents moments et chargés sur un gel SDS-PAGE pour une analyse Western blot ultérieure. Microscopie électronique à coloration négative - Les échantillons ont été préparés en utilisant la technique de coloration négative sur grille (SOG). 10 pL de protéoliposomes OprF (LC1 , [OprF]: 0,1 mg / mL) ou 10 pL de liposomes (4 mg/mL) incubés dans le mélange réactionnel sans ADN (= contrôle négatif) ont été ajoutés à une grille à décharge luminescente recouverte d'un film de carbone pendant 3 min et la grille a été colorée avec 50 pl d'acide phosphotungstite (PTA, à 1 % dans de l'eau distillée) pendant 2 min. L'excès de solution a été absorbé par du papier filtre et la grille a été séchée à l'air. Les images ont été prises dans des conditions de faible dose (<10 e- / Â2) avec des valeurs de défocalisation entre 1 ,2 et 2,5 pm sur un microscope électronique Tecnai 12 LaB6 à une tension d'accélération de 120 kV à l'aide de la caméra CCD Gatan Orius® 1000. La taille moyenne des pores a été déterminée à l'aide du programme de traitement d'image open source ImageJ. Fonctionnalisation de la pointe AFM - Les pointes d'or (NPG-10, Bruker Nano AXS) ont été recouvertes de NTA-SAM après une nuit d'incubation dans une solution de NTA-SAM (Prochimia) 0,1 mM dans de l'éthanol. Ensuite, les pointes ont été rincées abondamment à l'éthanol, séchées à l'azote et incubées pendant 1 h dans du N1SO4 à 40 mM dans une solution de PBS et stockées à 0-5°C.
AFM basée sur la force/distance (FD) - Un AFM Résolve® (Bruker) a été utilisé en mode « PeakForceTapping ». Des cantilevers rectangulaires avec des constantes de ressort nominales d’environ 0,06-0,12 N.m 1 et une fréquence de résonance d’environ 18 kFlz dans l'eau ont été choisis. Toutes les expériences AFM ont été réalisées dans une solution tampon d'imagerie à température ambiante (environ 24 °C). Les cartes d'adhésion ont été obtenues en faisant osciller la pointe fonctionnalisée à 0,25 kFlz, avec une amplitude de 25 nm, et en appliquant une force d'imagerie de 100 pN. Des topographies de 128x128 ou 256x256 pixels ont été effectuées en numérisant 0,125 ligne par sec. La vitesse de rétraction était de 1500 nm/sec et le temps de contact entre la pointe et l'échantillon était de 500 ms.
Analyse des données
Les courbes force/distance (FD) de chaque expérience de reconnaissance d'interaction ont été enregistrées et exportées sous forme de fichiers texte. NanoScope Analysis v1.9 et BiomecaAnalysis ont été utilisés pour traduire les courbes force / temps en courbes FD montrant des événements d'adhésion spécifiques. Les courbes force / distance obtenues ont ensuite été analysées sur la base du modèle WLC (pour l’anglais Worm Like Chain, modèle du ver). Ce modèle est le plus approprié et le plus fréquemment utilisé pour décrire l'extension des polypeptides. L'extension z de la macromolécule est liée à la force de rétraction Facih par l’équation :
dans laquelle la longueur de persistance lp est une mesure directe de la rigidité de la chaîne, lc est la longueur totale de contour de la biomacromolécule et KB est la constante de Boltzmann.
Le nombre de monomères dans les chaînes polypeptidiques a ensuite été dérivé de l'équation suivante : c
N
P
E.2 / Détermination de l’orientation des protéines OprF au sein de la membrane liposomale par AFM (microscopie à force atomique)
Les échantillons de protéoliposomes OprF ont été adsorbés sur une surface de mica et analysés par AFM en utilisant une sonde fonctionnalisée par un groupement Tris-Ni+-NTA liant l’étiquette poly-histidine N-terminale d'OprF. L'analyse par AFM a été effectuée avec et sans détergent Triton® X-100. La solution de Triton® 1 x a été utilisée pour solubiliser les protéines OprF de la membrane liposomale, exposant ainsi tous les étiquettes poly-histidines situées à l'intérieur du liposome et leur permettant d'être liées par la sonde fonctionnalisée. Les images topographiques, acquises sans et avec Triton® X- 100, ont mis en évidence des protéoliposomes OprF à la surface de l'échantillon. En l'absence de Triton®, très peu de phénomènes d'adhésion spécifiques entre la sonde fonctionnalisée et l’étiquette poly-histidine N- terminale d'OprF se sont produits à la surface des protéoliposomes, comme l’ont montré les cartes d'adhésion correspondantes illustrant les forces d'adhésion entre 80 et 150 pN. En revanche, en présence de Triton®, de nombreux événements d'adhésion spécifiques ont été détectés. En moyenne, la sonde fonctionnalisée a lié l’étiquette poly-histidine d'une protéine OprF sur 6 sans Triton®, et de 5 protéines OprF sur 6 avec Triton®, démontrant que l’étiquette poly-histidine N-terminale d'OprF était principalement située à l'intérieur du liposome.
E.3/ Détermination de la topologie des protéines OprF dans la membrane liposomale par digestion à la trypsine et AFM
Les protéoliposomes OprF purifiés par ultracentrifugation en gradient de saccharose ont été soumis à une expérience de protéolyse limitée afin de déterminer la topologie d'OprF dans la membrane liposomale. La séquence de la protéine OprF contient 32 sites de clivage à la trypsine. Sans protection membranaire d’OprF, la trypsine génère des peptides d'une masse allant de 146 à 4649 Da (programme PeptideCutter). Le résultat de la digestion à la trypsine des protéoliposomes OprF, visualisé par Western blot en utilisant un anticorps anti-histidine, a démontré qu’OprF adopte au moins deux topologies membranaires différentes dans les liposomes : une première topologie dans laquelle OprF est entièrement insérée dans la membrane et donc protégée de la protéolyse, car le signal correspondant à l’étiquette poly-histidine de la protéine OprF totale n'a pas disparu avec le temps ; et une deuxième topologie dans laquelle environ seulement la moitié de la protéine 6xFlis-OprF est intégrée dans la membrane, car un plus petit fragment de protéine situé entre le poids moléculaire 20 et 25 kDa a été généré au fil du temps.
Ces premières observations ont ensuite été corroborées et affinées par AFM. L'analyse des courbes force/distance (FD) montrant des phénomènes d'adhésion spécifiques dans la solution de Triton® 1x a indiqué qu’OprF adopte deux topologies transmembranaires différentes dans la membrane liposomale, correspondant à ses conformations de canal fermé et ouvert. Sur la base du modèle WLC, 64 % des phénomènes d'adhésion spécifiques correspondaient à 8 domaines transmembranaires (conformation de canal fermé) et 36 % des phénomènes d'adhésion spécifiques correspondaient à 16 domaines transmembranaires (conformation de canal ouvert). E.4 / Étude de l'activité de formation de pores d’OprF dans les protéoliposomes en utilisant la microscopie électronique à coloration négative et l'AFM
La microscopie électronique à coloration négative et l'analyse AFM des protéoliposomes OprF ont permis de visualiser l'activité de formation de pores d’OprF dans la membrane liposomale. Sur les images de microscopie électronique, une série de « trous » d'une taille moyenne de 9,5 ± 4 nm correspondant à des pores ont été observés au travers des membranes des liposomes dans lesquels OprF a été reconstituée. Une telle perforation de la membrane liposomale n'a pas été observée sur les images des liposomes contrôles, incubés avec le lysat cellulaire et le mélange réactionnel du système acellulaire sans ADN (contrôle négatif). En outre, les images topographiques d’AFM de la surface des protéoliposomes OprF ont également révélé la présence de pores entourés de protéines OprF et ayant un diamètre moyen de 10 nm. La formation de pores a donc été attribuée à l'activité de la protéine OprF dans la membrane liposomale.

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps monoclonal dirigé contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ou fragment fonctionnel dudit anticorps, caractérisé en ce qu’il comprend :
- une région variable de chaîne lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYXaa! FXaa2Xaa3Xaa4G (SEQ ID NO : 1 ) dans laquelle Xaa! représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2 représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa3 représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa4 représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,
VFI-CDR2 : INAXaa5TGKXaa6 (SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaa5 représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa6 représente un résidu alanine ou un résidu sérine,
VH-CDR3 : VR,
- et une région variable de chaîne légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVXaa7TXaa8Xaa9 (SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7 représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa8 représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaag représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,
VL-CDR2 : Xaa-|0TS dans laquelle Xaa-i0 représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,
VL-CDR3 : QQGXaanXaai2Xaa-i3 (SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaan représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa-i2 représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa-i3 représente un résidu valine ou un résidu isoleucine.
2. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 1 , dans lequel Xaa3 représente un résidu arginine et Xaa8 représente un résidu alanine.
3. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel Xaai représente un résidu thréonine, Xaa5 représente un résidu acide glutamique et Xaa-i3 représente un résidu valine.
4. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5)
VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24).
5. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 1 , dans lequel :
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6)
VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16) VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).
6. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 1 , dans lequel :
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7) ou GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8) VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13) ou INADTGKA (SEQ ID NO : 14) VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVNTNY (SEQ ID NO : 18) ou SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).
7. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, consistant en un fragment variable à chaîne unique (scFv).
8. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 7, dans lequel la partie variable de chaîne lourde et la partie variable de chaîne légère sont reliées par un peptide de liaison.
9. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu’il comprend les paires de séquences choisies parmi les paires de séquences suivantes, SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32 et SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38 et SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40 et SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42 et SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44 et SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48 et SEQ ID NO : 49, ou des paires de séquences ayant au moins 80 % d’identité avec l’une de ces paires séquences.
10. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un anticorps ou fragment d’anticorps chimérique ou humanisé.
11. Molécule d’acide nucléique codant pour un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique selon la revendication 1 1.
13. Cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique selon la revendication 1 1 ou un vecteur d’expression selon la revendication 12.
14. Procédé de préparation d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu’il comprend la culture de cellules hôtes selon la revendication 13 dans des conditions permettant l’expression dudit anticorps monoclonal ou fragment dudit anticorps, et la récupération dudit anticorps ou fragment fonctionnel dudit anticorps ainsi produit.
15. Procédé de préparation d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu’il comprend des étapes successives de :
- fabrication de protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa,
- inoculation d’un mammifère non humain, notamment de l’espèce Macaca fascicularis, avec lesdits protéoliposomes,
- construction d’une banque d’anticorps ou fragments d’anticorps à partir d’ARN extrait de cellules dudit mammifère,
- criblage de ladite banque vis-à-vis desdits protéoliposomes, par une technique d’expression, notamment d’expression phagique,
- et sélection des clones réactifs vis-à-vis desdits protéoliposomes.
16. Composition pharmaceutique pour lutter contre les infections bactériennes, comprenant un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10 en tant que substance active, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10 pour son utilisation en tant que médicament.
18. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 17 pour son utilisation pour lutter contre les infections bactériennes à Pseudomonas aeruginosa.
19. Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 18 pour son utilisation pour lutter contre les infections pulmonaires.
20. Utilisation d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10 pour la détection in vitro ou ex vivo de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide corporel issu d’un individu.
21. Kit pour la détection in vitro ou ex vivo de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide corporel issu d’un individu, comportant un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, et des instructions pour la mise en oeuvre d’un procédé de détection, in vitro ou ex vivo, de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide corporel issu d’un individu, au moyen dudit anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps.
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