EP3969565A1 - Zellkultursubstrat zur kultivierung von adhärenten zellen - Google Patents

Zellkultursubstrat zur kultivierung von adhärenten zellen

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EP3969565A1
EP3969565A1 EP20726785.7A EP20726785A EP3969565A1 EP 3969565 A1 EP3969565 A1 EP 3969565A1 EP 20726785 A EP20726785 A EP 20726785A EP 3969565 A1 EP3969565 A1 EP 3969565A1
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EP
European Patent Office
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cell culture
polymer
saccharide
culture substrate
substrate
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP20726785.7A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ruben R. Rosencrantz
Lena THORING
Stefan Kubick
Alena Lisa PALKOWITZ
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Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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Publication date
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Publication of EP3969565A1 publication Critical patent/EP3969565A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/028—Polyamidoamines
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Definitions

  • adherent cells especially mammalian cells
  • adherent cells need to be attached to the surface of a cell culture substrate in order to be able to grow. This cell adhesion is mediated by integrin receptors and transmembrane proteins. If the entire growth area is covered by cultured adherent cells, strictly adherent cell lines generally no longer grow. Furthermore, after the formation of a closed monolayer of adherent cells in the cell culture vessel, the growth of the cells can be slowed down and the culture can also die.
  • the cells are diluted before they reach their maximum density (surface is about 70-80% overgrown), this being done by the "passing" of the cells, in which the cells are detached from the cell culture substrate and brought into suspension the cells are placed in a new cell culture vessel for further cultivation.
  • "passaging" is therefore carried out regularly in order to avoid negative consequences for the adherent cells.
  • a frequently used method for detaching the adherent cells from the cell culture substrate is "trypsinization", in which the serine protease trypsin is used, which cleaves the surface proteins of the cells and thus interrupts the adhesion to the cell culture vessel. Since trypsin not only cleaves molecules that are relevant for adherence but also unspecifically surface proteins of the adherent cells, surface proteins such as growth factors or membrane proteins, which play an essential role in cell metabolism, are also cleaved. The “trypsinization” therefore at least partially has a negative influence on the metabolism of the adherent cells and leads to cell stress and thus reduces the overall vitality of the adherent cells during "passage".
  • An alternative method to Detachment of adherent cells consists in using thermoresponsive polymers which, depending on the temperature, have a switchable hydrophilicity / hydrophobicity and thus cause the detachment of the cells during "passage".
  • the cells can be detached, for example, by changing the temperature from standard culture conditions from 37 ° C to 22 ° C. This change in temperature can also lead to changes in the metabolism of the adherent cells and negatively affect the growth behavior of the cells.
  • the object of the present invention is to provide a cell culture substrate for cultivating adherent cells, a method for cultivating adherent cells using the cell culture substrate, a use of the cell culture substrate for culturing adherent cells and a kit for culturing the adherent cells which are related to the above mentioned disadvantages are improved.
  • a cell culture substrate according to claim 1.
  • Further embodiments of the cell culture substrate, a kit, a method for producing the cell culture substrate and further embodiments of the method for culturing adherent cells are the subject of further claims.
  • the present invention relates to a cell culture substrate for cultivating adherent cells, comprising
  • this cell culture substrate is that the firm binding of the saccharide to the polymer having amino groups and the binding of the polymer to the substrate result in a particularly good binding of the adherent cells to the cell culture substrate.
  • This allows a particularly reliable cultivation of adherent cells.
  • the detachment of the cells from the cell culture substrate can occur in the
  • the present cell culture substrate can be carried out particularly simply by adding a saccharide, which competitively interrupts the interactions between the surface proteins of the adherent cells and the cell culture substrate and thus allows adherent cells to “pass” easily.
  • the cell metabolism is not impaired in the present invention, since neither a cleavage of the surface proteins of the adherent cells, nor a change in temperature or a change in the pH of the cell culture medium are required.
  • At least one monosaccharide unit of the saccharide can be present cyclically as a so-called “half-acetate”, which enables the surface proteins of the adherent cell to bind to the saccharide particularly well.
  • This monosaccharide unit can in particular be a hexose, a saccharide with 6 carbon atoms. It is also possible to use pentoses, saccharides with 5 carbon atoms.
  • the saccharide has an open-chain monosaccharide unit, the saccharide being connected to a secondary or primary amine group of the polymer (P) via this monosaccharide unit.
  • the saccharide of the cell culture substrate according to the invention has at least two monosaccharide units, since as a rule, when the saccharide is linked to the polymer (P) containing amino groups, an open-chain monosaccharide unit is preferably linked directly to an amino group of the polymer (P) and this monosaccharide -Unit is then no longer or only to a minor extent available for connection to the adherent cells. Recognition by the adherent cells can then take place via the second monosaccharide unit of the saccharide. This enables a particularly simple connection of the saccharide to the polymer.
  • the secondary or primary amine bridge between the open-chain monosaccharide unit of the saccharide and the polymer (P) can in particular be the product of a reductive amination of an originally reducing monosaccharide unit of the saccharide and an amino group of the polymer. This enables the open-chain monosaccharide unit of the saccharide directly to the To bind the amino group of the polymer without linking linker groups between the polymer and the saccharide.
  • the saccharide of the cell culture substrate can in particular be an oligosaccharide or polysaccharide, preferably an oligosaccharide or polysaccharide with 2 to 500 monosaccharide repeat units, preferably 2 to 20 monosaccharide repeat units, more preferably 2 to 10 monosaccharide repeat units.
  • a disaccharide such as, for example, lactose, maltose, cellobiose or melibiose, is particularly preferred.
  • Hydrolyzed mannan can also be used.
  • the saccharide can be a polysaccharide and e.g. B. 50 to 500 mannose repeat units, preferably 100 to 300 mannose repeat units. It is also possible to use polysaccharides such as cellulose, starch or amylopectin.
  • the substrate comprises or consists of glass or synthetic polymers, such as plastic.
  • Glass as well as synthetic polymers are particularly favorable and suitable substrates for the cell culture substrate.
  • the plastics can in particular be polyolefins such as polyethylene or polypropylene or other plastics such as polystyrene (PS) or polycarbonate (PC). Borosilicate glass, for example, can be used as glass. Polystyrene is particularly preferred.
  • Glass in particular is suitable as a substrate for reusable cell culture substrates. After use, these can also be sterilized again (20 min at 121 ° C) and then reused.
  • the substrate is covalently bonded to the polymer (P) containing amino groups.
  • P polymer
  • the substrate and the polymer in the cell culture substrate can be covalently bonded to one another via amino groups, amide groups and / or via imine groups.
  • Oxygen-containing groups for example hydroxyl groups, keto groups, carboxylate groups or even radical oxygen groups, which, for example by means of treatment with an oxygen plasma, can be present on the surface of the Substrate can be generated.
  • oxygen-containing groups enable particularly simple attachment to the polymer via its amino groups. It is particularly possible to treat the surfaces of polystyrene cell culture substrates with an oxygen plasma, in which case the above-mentioned groups can then be formed. Treatment with oxygen plasma to form functional groups is also possible on glass surfaces.
  • the polymer of the cell culture substrate can furthermore comprise or consist of synthetic polymers containing amino groups, such as poly (ethyleneimine) (PEI) or poly (amidoamine) (PAMAM).
  • PPI poly (ethyleneimine)
  • PAMAM poly (amidoamine)
  • Such polymers have a large number of amino groups and thus make it particularly easy to bind a large number of saccharides for binding the adherent cells.
  • the large number of amino groups can also promote the binding of the polymer to the substrate.
  • chitosan a polyglucosamine as a polymer containing amino groups
  • the linking of the saccharide to the chitosan as a polymer can take place analogously to the polymers already described above by means of reductive amination. Not all of the amino groups of the chitosan are made to react with the saccharide, so that amino groups of the chitosan are still available for binding to the substrate.
  • branched amino group-containing polymers so-called dendrimers
  • dendrimers can also be used, which due to their high degree of branching can have a particularly large number of amino groups.
  • the parameter x is a natural integer and represents the number of repeat units in the polymer P.
  • the parameter x can in particular be between 15 and 6000 repeat units, preferably between 25 and 2000 repeat units, more preferably between 1200 up to 1800 repeat units.
  • the PEI used in the exemplary embodiments had approximately 1500 repeat units, for example.
  • the polymer P can comprise repeating units which are selected from a group of the repeating units with the general formulas A to F:
  • the group Z represents the saccharide.
  • the parameters a, b, c, d, e and f can, in particular, independently of one another, be between 20 and 5000, preferably between 25 and 2000.
  • one saccharide molecule per repeat unit is bound to the polymer P.
  • At least the repeating units of the general formulas A, B and C which are bound to one or more saccharides Z are particularly preferably present in the polymer.
  • the repeating units of the general formulas D and E represent repeating units in which the amino groups present in the polymer P have not reacted with the saccharide Z.
  • the repeat units F are repeat units with Branching points which are particularly present in polymer P when branched dentrimers are used as polymers.
  • the positions marked with “ * ” indicate the attachment points of the repeat units to further repeat units in the polymer P, or in the case of terminal repeat units, the attachment to the group A or to the terminal amino group -NH 2 in the general formula I.
  • the nitrogen atom of these groups characterizes an amino group of the polymer which reacts with the above-mentioned oxygen-containing groups of the substrate, the corresponding linking groups A being formed.
  • the positions in the groups marked with mark the attachment points of the group A to the polymer P and to the substrate S.
  • Such groups are particularly well suited to form a stable covalent bond between the polymer P and the substrate S.
  • the saccharide Z is preferably selected from a group consisting of the following groups with the formulas G to J:
  • the parameters g, i and j are, independently of one another, a natural integer between 0 and 400, preferably 0 to 300, more preferably 0 to 10, or 0 (disaccharide).
  • the positions marked with represent the points of attachment of the saccharide Z to the polymer P.
  • the saccharide can have glycosidic bonds, in particular 1, 4- or 1,6-glycosidic bonds, for example ⁇ -1,4-glycosidic bonds, ⁇ -1,4-glycosidic bonds, and a-1,6 glycosidic bonds.
  • the saccharide Z of the two formulas I has, for example, ⁇ -1,4-glycosidic bonds, as occur in lactose, or in cellobiose as disaccharides, or in cellulose as polysaccharide.
  • the saccharide of the formula G has a-1,4-glycosidic bonds, such as those found in maltose as a disaccharide.
  • Maltose is the breakdown product of the starch polysaccharide by the enzyme beta-amylase.
  • the formula H shows melibiose with an ⁇ -1,6 glycosidic bond.
  • Such saccharides Z are particularly suitable for forming adherent cells, since many of these structures contain the monosaccharide galactose, which is recognized by many receptors on the cells.
  • the saccharide of formula J is derived from Mannan and can, for example, be the hydrolysis product of mannan, as described in the exemplary embodiments.
  • the cell culture substrate can be designed as a cell culture vessel, for example as a Petri dish or as a microtiter plate. Furthermore, the cell culture substrate can also be designed as particles, for example glass or polystyrene particles, on which adherent cells can grow.
  • the present invention also relates to a process for the production of a cell culture substrate with the process steps:
  • a reducing saccharide Z can be provided particularly advantageously in process step A) and the covalent conjugate can be formed by means of reductive amination in process step B).
  • Reducing saccharides are mono-, di-, oligo- or polysaccharides that have a free aldehyde group in solution. This aldehyde group reacts with an amino group of the polymer P, and the subsequently formed imine group can be reduced to an amine, in particular a primary or secondary amine, under mild reducing conditions, for example using sodium cyanoborohydride (NaBHsCN).
  • NaBHsCN sodium cyanoborohydride
  • the reductive amination is a particularly simple method to be carried out in which the polymer having amino groups can be directly covalently linked to the saccharide without additional linking linker groups having to be present.
  • a synthetic polymer is provided that can be poly (ethyleneimine) (PEI) or poly (amidoamine) (PAMAM).
  • PEI poly (ethyleneimine)
  • PAMAM poly (amidoamine)
  • branched dentrimers of these polymers is also possible.
  • a substrate in method step C) of a variant of the method according to the invention for producing a cell culture substrate, can be used that by means of an oxygen plasma and thus has functional groups on the surface, for example carboxylate groups, keto groups or hydroxide groups, which can react with the amino groups of the polymer P.
  • Such substrates are particularly suitable for forming covalent bonds between the substrate and the polymer-saccharide conjugate via the amino groups of the polymer.
  • the conjugate is taken up in an aqueous solvent and preferably brought into contact with the substrate at elevated temperatures, for example 80 ° C., for coupling.
  • the polymer-saccharide conjugate is preferably brought into contact with the substrate shortly after activation with the plasma.
  • the polymer-saccharide conjugate can be coupled to the substrate within 2 to 5 minutes after the plasma treatment thereof.
  • the present invention also relates to a method for culturing adherent cells using a cell culture substrate, as described above, with the method steps:
  • Bringing the cells into contact with the saccharide can advantageously take place in that the cell culture medium in which the adherent cells are located is exchanged for a solution which contains the saccharide.
  • the saccharide can, for example, be dissolved in an isotonic salt solution or in a cell-free cell culture medium.
  • Such a method for cultivating adherent cells makes it particularly easy to detach the cells from the cell culture substrate and “pass through” them in method step 3) by using a saccharide.
  • a saccharide To detach the cells from the cell culture substrate in method step 3), no treatment of the cells with enzymes, for example trypsin, or a change in temperature is necessary.
  • the pH of the cell culture medium does not have to be changed either, so that the cells be removed particularly gently, without the cell metabolism or protein expression in the adherent cells being influenced as strongly as is the case with conventional methods of “passing”.
  • Process step 3) is preferably initiated when, in process step 2), the cell culture substrate is largely, e.g. B. is overgrown with the adherent cells to about 70% to 80%. This can be determined, for example, using microscopic methods.
  • the same saccharide can be used that is also part of the cell culture substrate.
  • lactose can be used to detach the adherent cells if lactose has been bound to the polymer P as saccharide in the cell culture substrate.
  • maltose, celiobiose or mannose can also be used if these saccharides are part of the cell culture substrate.
  • These saccharides are particularly inexpensive compounds that allow the adherent cells to be detached from the cell culture substrate in process step 3) in a simple and reliable manner. Since the adherent cells are bound to the cell culture substrate via the same saccharide that is also used to detach the cells, detachment of the cells can be achieved particularly reliably.
  • saccharides can also be used to detach the adherent cells from the cell culture substrate than those which are part of the cell culture substrate.
  • the saccharide used for the detachment should, however, be able to detach the adherent cells competitively from the cell substrate.
  • the saccharide can be used in a concentration of 5 mM to 25 mM, preferably 5 mM to 10 mM, to detach the adherent cells from the cell substrate be used.
  • the saccharide is preferably dissolved in either PBS or cell-free cell culture medium in these concentrations and the existing cell culture medium of a cell culture is exchanged for this solution, which leads to the cells becoming detached from the cell culture vessel.
  • concentrations on the one hand, a reliable detachment of the adherent cells from the cell culture substrate can be achieved, but on the other hand osmotic stress for the adherent cells, which only occurs at higher concentrations of about 100 to 200 mM, can be avoided.
  • method steps 1) to 3) can be repeated cyclically one after the other in order to enable continued cultivation of the adherent cells over a longer period of time.
  • the cell culture substrate according to the invention can also be specific for certain cell lines, for example lactose as a saccharide component of the cell culture substrate is particularly well suited for the cultivation of CHO cell lines.
  • lactose as a saccharide component of the cell culture substrate is particularly well suited for the cultivation of CHO cell lines.
  • HeLa cells can be cultivated particularly well on cell culture substrates according to the invention which contain mannan or maltose as saccharide constituents.
  • the invention also relates to a use of the cell culture substrate, as described above, for the cultivation of adherent cells.
  • the invention also relates to a kit for culturing adherent cells, comprising:
  • the kit can be packaged as a commercial product for
  • the saccharide can already be used as a solution
  • kits in particular as a stock solution in, for example, an aqueous solution in the kit.
  • a cell culture vessel or polymer particles to which the polymer-saccharide conjugate has already been bound is preferably used as the cell culture substrate. These cell culture vessels or polymer particles can also already be sterilized for immediate use.
  • the kit can also include an instruction manual for carrying out a method for culturing adherent cells, as described above.
  • FIG. 2 shows exemplary functional groups which can be formed on a polystyrene surface by an oxygen plasma treatment.
  • FIG. 4 shows the results of a lactate dehydrogenase assay for determining the cell integrity in adherent cells which have been detached from cell culture plates either by means of a method according to the invention or by means of a trypsin treatment.
  • FIG. 5 shows the results of a fluorescence test for determining a caspase as evidence of the cell integrity in adherent cells which have been detached from cell culture plates either by means of a method according to the invention or by means of a trypsin treatment.
  • FIG. 6 shows the results of protein SDS gels and Western blots for determining the surface protein E-cadherin on the surface of adherent cells which have been detached from cell culture plates either by trypsin treatment or by means of a method according to the invention.
  • FIG. 7 growth curves for adherent cells which were cultivated on different cell culture plates.
  • the saccharide lactose can be linked directly to the amino groups of the PEG by means of reductive amination with NaBH 3 CN, whereby one of the cyclic hemiacetal units of lactose opens and only the galactose is still present in the cyclic hemiacetal form and is available for binding the adherent cells.
  • Fig. 2 shows the functional groups formed by means of an oxygen plasma on the surface of polystyrene.
  • carboxylates, hydroxide groups and keto groups can be formed.
  • radical oxygen species can also be formed. These groups can react with the amino groups of the polymer and form a permanent covalent bond.
  • FIG. 3 shows such covalent bonds between an exemplary polystyrene substrate and the amino groups of the polymer.
  • amide groups, imine groups or amine groups can be formed on the.
  • Polyethyleneimine solution (Mn -60,000 GPC (gel permeation chromatography), Mw -750,000 LS (light scattering spectroscopy), 50 wt.% In water) (PEI, 20 g, 0.1667 mmol) and D-lactose monohydrate (38.028 g, 105.5 mmol , 5 eq. Per ideal repetition unit of PEI) are dissolved in MeOH (70 mL) and 50 mM sodium tetraborate solution (aq) (100 mL) and heated to 60 ° C. After the components had completely dissolved, the system was cooled again and the pH was adjusted to a value of 3 with formic acid. NaBHsCN (33.148 g, 527.5 mmol, 5 eq.
  • galactomannan e.g. locust bean gum or guar gum
  • 500 mg galactomannan are incompletely dissolved in 49 mL H 2 O and 1 mL 1 M H2SO4 is added.
  • the solution is hydrolyzed in the microwave at 600 W for 60 s and then filtered. This leads to a hydrolysis of the galactomannan, with polysaccharides with 200 to 300 mannose repeating units being formed.
  • the filtrate is mixed with 1 g of PEI, 6 mL of glacial acetic acid and 664 mg of NaBH 3 CN and stirred at 60 ° C. for 3 h.
  • the solution is then dialyzed over a cellulose membrane (exclusion limit 10 kDa) and freeze-dried.
  • the cell culture substrate for example cell culture plates, can be treated with an oxygen plasma as follows:
  • Untreated 24-well polystyrene plates are activated at 150 W for 90 seconds with oxygen plasma in a vacuum (0.2 mbar) and then 500 pL of a 1 mg / mL aqueous solution of the PEI derivatives (polymer-saccharide conjugates) are poured into the wells. given.
  • the plates were incubated for 2 h at RT, washed with water and heated, covered, at 80 ° C. for one hour. The plates are then directly suitable as cell culture substrates according to the invention for use in cell culture.
  • FCS fetal calf serum
  • HEK293 and HeLa cell lines DMEM with 10% (v / v) FCS and 2% glutamine
  • the incubation took place at 37 ° C. and a CO content of 5% in the atmosphere.
  • 0.05-1 x 10 ® cells / mL 500 pL are added to the wells. Passing is carried out by replacing the medium with 500 pL of a 5-50 mM solution of the respective sugar in PBS or medium and an incubation time of 15-30 minutes at room temperature or 37 ° C.
  • a cell line specificity can be achieved.
  • PEI-lactose surfaces are well suited for CHO cell lines.
  • HeLa cells prefer mannan-PEI or maltose-PEI.
  • adherent cells which have been detached from a cell substrate according to the invention by means of the method according to the invention are compared with adherent cells which have been detached from conventional cell culture plates surface-modified by means of a plasma by means of a trypsin treatment.
  • the cells are CHO-1 cells which have been cultivated on polystyrene Petri dishes with PEI-lactose.
  • Lactate dehydrogenase assay to determine cell integrity
  • Lactate dehydrogenase is released into the cell culture media by various adherent cells when the plasma membrane is damaged.
  • the released LDH can be quantified by a coupled enzymatic reaction.
  • LDH catalyzes the conversion of lactate to pyruvate by reducing NAD + to NADH.
  • the NADH then serves to reduce a tetrazolium salt to a red formazan product by the enzyme diaphorase.
  • the amount of formazan formed which is determined at a wavelength of 490 nm, is directly proportional to the amount of LDH released in the medium.
  • the lactate dehydrogenase Assay was carried out with a commercially available kit “Pie ree LDH Cytotoxicity Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA).
  • FIG. 4 shows a bar diagram in which the difference between the absorption at 490 nm (absorption of formazan) and the absorption at 680 nm (background signal of the instrument) is plotted on the y-axis.
  • apoptosis (programmed cell death) is measured by detecting a caspase in cell cultures.
  • a caspase-3/7 green detection reagent is used, which is a peptide with four amino acids (DEVD) with a cleavage site for caspase-3/7, which is conjugated to a nucleic acid-binding dye.
  • the dye is not fluorescent as long as it is conjugated to the peptide. After cleavage of the peptide by the caspase, the dye is activated, binds to DNA and can be detected using fluorescence with an excitation / emission maximum of approx. 502/530 nm.
  • FIG. 5 shows a bar diagram in which the fluorescence of the caspase-3/7 green detection reagent is plotted for HeLa cells which were subjected to different treatments for 30 minutes (black bars) and 24 hours (light bars).
  • the assay was performed with the Cell Event TM Caspase-3/7 Green Detection Reagent kit (Thermo Fisher Scientific, USA).
  • the bars labeled “Medium” and “PBS” in the diagram show the caspase-mediated fluorescence of cells that were only exposed to the cell culture medium or PBS ("Phosphate Buffered Saline”) and were therefore not exposed to any cell stress.
  • the bars labeled “Staurosporine [10pM]” show the caspase-mediated fluorescence of cells that were treated with Staurosporine, a broad-spectrum kinase inhibitor, apoptosis in many cells.
  • the caspase-mediated fluorescence of HEK cells that have been subjected to a trypsin treatment is marked with "Trypsin-EDTA [0.5 and 20% / 0.02%]”.
  • the caspase-mediated activity of the cells not exposed to cell stress is comparable to the activity of the caspase in adherent cells which were cultivated and detached using a method according to the invention.
  • the caspase-mediated activity is significantly increased in cells that have been subjected to trypsin treatment.
  • the experimental data in FIG. 5 clearly show that with a cultivation method according to the invention, or when using a cell culture substrate according to the invention, the cell integrity is improved compared to a trypsin treatment.
  • FIG. 6 shows the detection of the protein E-cadherin, a transmembrane glycoprotein in cells which were exposed to the same conditions as those shown in FIG.
  • E-cadherin was also digested so that this protein can no longer be detected in the SDS protein gel.
  • the band for E-cadherin can still be clearly seen, similar to the cells treated with medium or PBS, which speaks for high cell integrity. This shows that surface proteins important for cell metabolism are also impaired by trypsin digestion, whereas this is not the case with the present invention.
  • FIG. 7 shows the growth curve of CHO-1 cells on various cell culture vessels.
  • the CHO cells that were cultivated on a cell culture substrate according to the invention show similar growth curves as cells that were cultivated in conventional cell culture vessels (growth curve labeled “standard”).
  • the growth curve called “untreated” shows the growth of the cells untreated cell culture plates, which were also used as a substrate for the cell culture substrate according to the invention in this experiment.
  • the curve labeled “O2 plasma” shows the growth on cell culture plates that have been plasma-treated, but to which the polymer-saccharide conjugate has not been bound.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zeilen umfassend: ein Substrat (S), ein Aminogruppen aufweisendes, an das Substrat gebundenes Polymer (P), und ein Saccharid (Z) mit zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten zur Anbindung der adhärenten Zellen, wobei das Saccharid (Z) kovalent über die Aminogruppen mit dem Polymer (P) verbunden ist. Ein derartiges Zellkultursubstrat ist besonders gut zur Kultivierung von adhärenten Zellen geeignet und ermöglicht es durch Zugabe eines Saccharids die Zellen besonders schonend vom Zellkultursubstrat abzulösen.

Description

Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zellen
Beschreibung
Die„in vitro“- Zellkultivierung von adhärenten Zellen, insbesondere Säugetierzellen im Labor ist notwendig für die pharmazeutische Forschung und die Entwicklung von Zelltherapien. Adhärente Zellen benötigen im Gegensatz zu Suspensionszellen die Anbindung an die Oberfläche eines Zellkultursubstrats, um wachsen zu können. Diese Zelladhäsion wird vermittelt durch Integrinrezeptoren und Transmembranproteine. Wenn die gesamte Wachstumsfläche von kultivierten adhärenten Zellen bedeckt ist, wachsen strikt adhärente Zelllinien in der Regel nicht mehr weiter. Weiterhin kann es nach der Ausbildung einer geschlossenen Mono-Schicht von adhärenten Zellen im Zellkulturgefäß zum verlangsamten Wachstum der Zellen und auch zum Absterben der Kultur kommen. Aus diesem Grund werden die Zellen vor Erreichen der Maximaldichte (Oberfläche ist circa 70-80% bewachsen) verdünnt, wobei dies durch das „Passagieren" der Zellen passiert, bei dem die Zellen vom Zellkultursubstrat abgelöst und in Suspension gebracht werden. Nach entsprechender Verdünnung werden die Zellen in ein neues Zellkulturgefäß zur weiteren Kultivierung eingebracht. Zur fortgesetzten Kultivierung der adhärenten Zellen wird daher regelmäßig das „Passagieren“ durchgeführt um negative Folgen für die adhärenten Zellen zu vermeiden.
Eine häufig angewandte Methode zur Ablösung der adhärenten Zellen vom Zelikultursubstrat ist die„Trypsinierung“ , bei der die Serinprotease Trypsin eingesetzt wird, die die Oberflächenproteine der Zellen spaltet und somit die Adhäsion an das Zellkulturgefäß unterbricht. Da Trypsin neben Molekülen, die für die Adhärenz relevant sind auch unspezifisch Oberflächenproteine der adhärenten Zellen spaltet, werden auch Oberflächenproteine, wie Wachstumsfaktoren oder Membranproteine gespalten, die eine essenzielle Rolle im Zellmetabolismus übernehmen. Die„ Trypsinierung“ hat daher zumindest teilweise einen negativen Einfluss auf den Metabolismus der adhärenten Zellen und führt zu Zellstress und reduziert somit die Gesamtvitalität der adhärenten Zellen während des „Passagierens" . Eine alternative Methode zur Ablösung von adhärenten Zellen besteht darin, thermoresponsive Polymere zu verwenden, die in Abhängigkeit von der Temperatur eine schaltbare Hydrophilie/Hydrophobizität aufweisen und dadurch die Ablösung der Zellen während des „Passagierens“ bewirken. Eine Ablösung der Zellen kann beispielsweise durch einen Temperaturwechsel von Standardkulturbedingungen von 37 °C auf 22 °C erfolgen. Auch diese Änderung der Temperatur kann zu Veränderungen im Metabolismus der adhärenten Zellen führen und das Wachstumsverhaiten der Zellen negativ beeinflussen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zellen, ein Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen unter Verwendung des Zellkultursubstrats, eine Verwendung des Zellkultursubstrats zur Kultivierung von adhärenten Zellen und einem Kit zur Kultivierung der adhärenten Zellen anzugeben, die bezüglich der oben genannten Nachteile verbessert sind.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Zellkultursubstrat nach Anspruch 1 . Weitere Ausgestaltungen des Zellkultursubstrats, ein Kit, ein Verfahren zur Herstellung des Zellkultursubstrats und weitere Ausgestaltungen des Verfahrens zu Kultivierung von adhärenten Zellen sind Gegenstand weiterer Patentansprüche.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zellen, umfassend
ein Substrat (S),
ein Aminogruppen aufweisendes, an das Substrat gebundenes Polymer (P), und
ein Saccharid (Z) mit zumindest 2 Monosaccharid-Einheiten zur Anbindung der adhärenten Zellen,
- wobei das Saccharid (Z) kovalent über die Aminogruppen mit dem Polymer (P) verbunden ist.
Der Vorteil dieses Zellkultursubstrats besteht darin, dass durch die feste Anbindung des Saccharids an das Aminogruppen aufweisende Polymer und die Bindung des Polymers an das Substrat eine besonders gute Anbindung der adhärenten Zellen an das Zellkultursubstrat erfolgt. Dies erlaubt eine besonders zuverlässige Kultivierung von adhärenten Zellen. Das Ablösen der Zellen vom Zellkultursubstrat kann bei dem vorliegenden Zellkultursubstrat besonders einfach durch Zugabe eines Saccharids erfolgen, das kompetitiv die Wechselwirkungen zwischen den Oberflächenproteinen der adhärenten Zellen und dem Zellkultursubstrat unterbricht und so besonders einfach das „Passagieren“ von adhärenten Zellen erlaubt. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren wird bei der vorliegenden Erfindung der Zellmetabolismus nicht beeinträchtigt, da weder eine Spaltung der Oberflächenproteine der adhärenten Zellen, noch eine Temperaturänderung oder eine Änderung des pH-Werts des Zellkulturmediums benötigt werden.
Zumindest eine Monosaccharid-Einheit des Saccharids kann dabei zyklisch als sogenanntes „ Halbacetat ' vorliegen, was besonders gut die Bindung der Oberflächenproteine der adhärenten Zelle an das Saccharid ermöglicht. Bei dieser Monosaccharid-Einheit kann es sich insbesondere um eine Hexose, ein Saccharid mit 6 Kohlenstoffatomen handeln. Möglich ist auch die Verwendung von Pentosen, Sacchariden mit 5 Kohlenstoffatomen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats weist das Saccharid eine offenkettige Monosaccharid-Einheit auf, wobei das Saccharid über diese Monosaccharid-Einheit mit einer sekundären oder primären Amingruppe des Polymers (P) verbunden ist. Das Saccharid des erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats weist zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten auf, da in der Regel bei der Verknüpfung des Saccharids mit dem Aminogruppen aufweisenden Polymer (P) eine offenkettige Monosaccharid-Einheit bevorzugt direkt mit einer Aminogruppe des Polymers (P) verknüpft wird und diese Monosaccharid-Einheit dann nicht mehr oder nur noch im untergeordneten Maß zur Anbindung an die adhärenten Zellen zur Verfügung steht. Die Erkennung durch die adhärenten Zellen kann dann über die zweite Monosaccharid-Einheit des Saccharids erfolgen. Dies ermöglicht eine besonders einfache Anbindung des Saccharids an das Polymer.
Die sekundäre oder primäre Aminbrücke zwischen der offenkettigen Monosaccharid- Einheit des Saccharids und dem Polymer (P) kann insbesondere das Produkt einer reduktiven Aminierung einer ursprünglich reduzierenden Monosaccharid-Einheit des Saccharids und einer Aminogruppe des Polymers sein. Dies ermöglicht es besonders einfach die offenkettige Monosaccharid-Einheit des Saccharids direkt an die Aminogruppe des Polymers anzubinden, ohne dass zwischen dem Polymer und dem Saccharid verknüpfende Linkergruppen vorhanden sein müssen.
Das Saccharid des Zellkultursubstrats kann insbesondere ein Oligosaccharid oder Polysaccharid sein, bevorzugt ein Oligo- bzw. Polysaccharid mit 2 bis 500 Monosaccharid-Wiederholeinheiten, bevorzugt 2 bis 20 Monosaccharid- Wiederholeinheiten, weiter bevorzugt 2 bis 10 Monosaccharid-Wiederholeinheiten. Besonders bevorzugt ist ein Disaccharid, wie beispielsweise Laktose, Maltose, Cellobiose oder Melibiose. Weiterhin kann auch hydrolisiertes Mannan eingesetzt werden. In diesem Fall kann das Saccharid ein Polysaccharid sein und z. B. 50 bis 500 Mannose-Wiederholeinheiten, bevorzugt 100 bis 300 Mannose-Wiederholeinheiten aufweisen. Möglich ist auch die Verwendung von Polysacchariden, wie beispielsweise Cellulose, Stärke oder Amylopektin.
Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats umfasst das Substrat Glas oder synthetische Polymere, wie Kunststoff oder besteht aus diesen. Glas wie auch synthetische Polymere sind besonders günstige und geeignete Substrate für das Zellkultursubstrat. Die Kunststoffe können insbesondere Polyolefine, wie Polyethylen oder Polypropylen sein oder andere Kunststoffe wie beispielsweise Polystyrol (PS) oder Polycarbonat (PC). Als Glas kommt beispielsweise Borosilikatglas infrage. Besonders bevorzugt ist Polystyrol.
Besonders Glas ist als Substrat für wiederverwendbare Zellkultursubstrate geeignet. Diese können insbesondere nach Verwendung auch erneut sterilisiert werden (20 min bei 121 °C) und danach wiederverwendet werden.
Besonders bevorzugt ist es, wenn bei dem erfindungsgemäßen Zellkultursubstrat das Substrat kovalent mit den Aminogruppen aufweisenden Polymer (P) verbunden ist. Dies ermöglicht eine besonders zuverlässige Anbindung des Polymers an das Substrat. Insbesondere können das Substrat und das Polymer im Zellkultursubstrat über Aminogruppen, Amidgruppen und/oder über Imin-Gruppen kovalent miteinander verbunden sein. Besonders vorteilhaft können auf dem Substrat vor der Anbindung an das Polymer sauerstoffhaltige Gruppen, beispielsweise Hydroxylgruppen, Ketogruppen Carboxylatgruppen oder auch radikalische Sauerstoffgruppen vorhanden sein, die beispielsweise mittels Behandlung mit einem Sauerstoffplasma auf der Oberfläche des Substrats erzeugt werden können. Diese sauerstoffhaltigen Gruppen ermöglichen eine besonders einfache Anbindung an das Polymer über dessen Aminogruppen. Besonders gut ist eine Behandlung der Oberflächen von Polystyrol-Zellkultursubstraten mit einem Sauerstoffplasma möglich, wobei dann die oben genannten Gruppen gebildet werden können. Eine Behandlung mit Sauerstoffplasma zur Bildung von funktionellen Gruppen ist auch bei Glasoberflächen möglich.
Das Polymer des Zellkultursubstrats kann weiterhin Aminogruppen aufweisende synthetische Polymere, wie Poly(ethylenimin) (PEI) oder Poly(amidoamin) (PAMAM) umfassen oder daraus bestehen. Derartige Polymere weisen eine Vielzahl von Aminogruppen auf und ermöglichen es somit besonders einfach eine Vielzahl von Sacchariden zur Bindung der adhärenten Zellen zu binden. Die Vielzahl der Aminogruppen kann weiterhin auch die Anbindung des Polymers an das Substrat begünstigen.
Möglich ist auch die Verwendung von Chitosan, einem Polyglucosamin als Aminogruppen aufweisendes Polymer. Die Anknüpfung des Saccharids an das Chitosan als Polymer kann analog zu den bereits oben beschriebenen Polymeren mittels einer reduktiven Aminierung erfolgen. Dabei werden nicht alle Aminogruppen des Chitosans mit dem Saccharid zur Reaktion gebracht, sodass noch Aminogruppen des Chitosans zur Anbindung an das Substrat zur Verfügung stehen.
Weiterhin können auch verzweigte Aminogruppen-haltige Polymere, sogenannte Dendrimere eingesetzt werden, die aufgrund ihres hohen Verzweigungsgrades eine besonders große Anzahl an Aminogruppen aufweisen können.
Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats weist dieses die folgende allgemeine Struktur der Formel I auf:
Dabei ist S das Substrat, P das Polymer mit daran gebundenem Saccharid und A eine das Polymer P und das Substrat S verknüpfende Gruppe. Der Parameter x ist eine natürliche ganze Zahl und stellt die Anzahl der Wiederholeinheiten im Polymer P dar. Der Parameter x kann insbesondere zwischen 15 bis 6000 Wiederholeinheiten liegen, bevorzugt zwischen 25 bis 2000 Wiederholeinheiten, weiter bevorzugt zwischen 1200 bis 1800 Wiederholeinheiten. Das in den Ausführungsbeispielen verwendete PEI wies beispielsweise etwa 1500 Wiederholeinheiten auf.
Weiterhin kann das Polymer P Wiederholeinheiten umfassen, die ausgewählt sind aus einer Gruppe der Wiederholeinheiten mit den allgemeinen Formeln A bis F:
Dabei stellt die Gruppe Z das Saccharid dar. Die Parameter a, b, c, d, e und f sind jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen und bezeichnen die Anzahl der jeweiligen Wiederholeinheiten im Polymer P, wobei gilt a+b+c+d+e+f =x. Die Parameter a, b, c, d, e und f können insbesondere unabhängig voneinander zwischen 20 bis 5000 liegen, bevorzugt zwischen 25 bis 2000. Häufig ist im Durchschnitt ein Saccharid-Molekül je Wiederholungseinheiten an das Polymer P gebunden. Besonders bevorzugt sind zumindest die Wiederholeinheiten der allgemeinen Formeln A, B und C im Polymer vorhanden, die an ein oder mehrere Saccharide Z gebunden sind. Die Wiederholeinheiten der allgemeinen Formeln D und E stellen Wiederholeinheiten dar, bei denen die im Polymer P vorhandenen Aminogruppen nicht mit dem Saccharid Z reagiert haben. Die Wiederholeinheiten F sind Wiederholeinheiten mit Verzweigungsstellen, die insbesondere dann im Polymer P vorhanden sind, wenn als Polymere verzweigte Dentrimere verwendet werden. Die mit„*“ markierten Positionen kennzeichnen die Anknüpfungsstellen der Wiederholeinheiten an weitere Wiederholeinheiten im Polymer P, bzw. bei terminalen Wiederholeinheiten die Anknüpfung an die Gruppe A oder an die terminale Aminogruppe -NH2 in der allgemeinen Formel I.
Die das Polymer P und das Substrat S verknüpfende Gruppe A kann vorteilhafterweise ausgewählt sein aus einer Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen:
Das Stickstoff-Atom dieser Gruppen kennzeichnet eine Aminogruppe des Polymers, die mit den bereits oben genannten sauerstoffhaltigen Gruppen des Substrats reagiert, wobei die entsprechenden verknüpfenden Gruppen A gebildet werden. Die mit markierten Positionen in den Gruppen kennzeichnen die Anknüpfungsstellen der Gruppe A an das Polymer P und an das Substrat S. Derartige Gruppen sind besonders gut geeignet eine stabile kovalente Bindung zwischen dem Polymer P und dem Substrat S zu bilden.
Das Saccharid Z ist bevorzugt ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen mit den Formeln G bis J:
in den Formeln sind die Parameter g, i und j unabhängig voneinander eine natürliche ganze Zahl zwischen 0 und 400, bevorzugt 0 bis 300, weiter bevorzugt 0 bis 10, bzw. 0 (Disaccharid). Die mit markierten Positionen stellen die Anknüpfungsstellen des Saccharids Z an das Polymer P dar.
Generell kann das Saccharid glykosidische Bindungen, insbesondere 1 ,4- oder 1 ,6- glykosidische Bindungen, beispielsweise ß-1 ,4-glykosidische Bindungen, a-1 ,4- glykosidische Bindungen, sowie a-1 ,6 glykosidische Bindungen aufweisen. Das Saccharid Z der beiden Formeln I weist beispielsweise ß-1 ,4-glykosidische Bindungen auf, wie sie bei der Laktose, oder bei der Cellobiose als Disacchariden, bzw. bei der Cellulose als Polysaccharid auftreten. Das Saccharid der Formel G weist a-1 ,4- glykosidische Bindungen auf, wie sie beispielsweise bei der Maltose als Disaccharid auftreten. Maltose ist das Abbauprodukt des Polysaccharids Stärke durch das Enzym Beta-Amylase. Die Formel H zeigt Melibiose mit einer a-1 ,6 glykosidischen Bindung. Derartige Saccharide Z sind besonders dazu geeignet an adhärente Zellen zu bilden, da viele dieser Strukturen das Monosaccharid Galaktose aufweisen, das von vielen Rezeptoren auf den Zellen erkannt wird. Das Saccharid der Formel J leitet sich von Mannan ab und kann beispielsweise das Hydrolyseprodukt des Mannans, wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben, sein.
Das Zellkultursubstrat kann als Zellkulturgefäß, beispielsweise als Petrischale oder als Mikrotiterplatte ausgebildet sein. Weiterhin kann das Zellkultursubstrat auch noch als Partikel, zum Beispiel Glas- oder Polystyrolpartikel ausgebildet sein, auf denen adhärente Zellen wachsen können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursubstrats mit den Verfahrensschritten:
A) Bereitstellen eines Aminogruppen aufweisenden Polymers (P) und eines Saccharids (Z) mit zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten,
B) Bildung eines kovalenten Konjugats zwischen dem Polymer (P) und dem Saccharid
(Z),
C) Verknüpfen des Konjugats mit einem Substrat (S).
Besonders vorteilhaft kann im Verfahrensschritt A) ein reduzierendes Saccharid Z bereitgestellt werden, und im Verfahrensschritt B) das kovalente Konjugat mittels reduktiver Aminierung gebildet werden. Reduzierende Saccharide sind Mono, Di-, Oligo- oder Polysaccharide, die in Lösung eine freie Aldehydgruppe aufweisen. Diese Aldehydgruppe reagiert mit einer Aminogruppe des Polymers P, wobei die anschließend gebildete Imin-Gruppe unter milden reduzierenden Bedingungen, beispielsweise unter Verwendung von Natriumcyanoborhydrid (NaBHsCN) zu einem Amin, insbesondere einem primären oder sekundären Amin reduziert werden kann. Die reduktive Aminierung stellt eine besonders einfach durchzuführende Methode dar, bei der das Aminogruppen aufweisende Polymer direkt kovalent mit dem Saccharid verbunden werden kann, ohne dass zusätzliche verknüpfende Linkergruppen vorhanden sein müssen.
Besonders bevorzugt wird im Verfahrensschritt A) ein synthetisches Polymer bereitgestellt, dass Poly(ethylenimin) (PEI) oder Poly(amidoamin) (PAMAM) sein kann. Möglich ist auch die Verwendung von verzweigten Dentrimeren dieser Polymere.
Im Verfahrensschritt C) einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Zellkultursubstrats kann ein Substrat verwendet werden, dass mittels eines Sauerstoffplasmas aktiviert wurde und somit an der Oberfläche funktionelle Gruppen, beispielsweise Carboxylat-Gruppen, Keto-Gruppen oder Hydroxid-Gruppen aufweist, die mit den Aminogruppen des Polymers P reagieren können. Derartige Substrate sind besonders dazu geeignet, kovalente Bindungen zwischen dem Substrat und dem Polymer-Saccharid-Konjugat über die Aminogruppen des Polymers auszubilden. Zur Kupplung des Polymer-Saccharid-Konjugats mit dem Substrat wird das Konjugat in einem wässrigen Lösungsmittel aufgenommen und bevorzugt bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise 80 °C zur Kupplung mit dem Substrat in Kontakt gebracht. Bevorzugt wird das Polymer-Saccharid-Konjugat mit dem Substrat zeitnah nach der Aktivierung mit dem Plasma in Kontakt gebracht. Insbesondere kann das Polymer-Saccharid-Konjugat innerhalb von 2 bis 5 min nach der Plasmabehandlung des Substrats mit diesem gekoppelt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen unter Verwendung eines Zellkultursubstrats, wie oben beschrieben, mit den Verfahrensschritten:
1 ) Inkontaktbringen der adhärenten Zellen mit dem Zellkultursubstrat, wobei die Zellen über das Saccharid an das Zellkultursubstrat binden,
2) Kultivierung der Zellen mit dem Zellkultursubstrat in einem Zellkulturmedium,
3) Ablösen der Zellen vom dem Zellkultursubstrat durch Inkontaktbringen eines Saccharids mit den Zellen.
Das Inkontaktbringen der Zellen mit dem Saccharid kann vorteilhafterweise dadurch geschehen, dass das Zellkulturmedium in dem sich die adhärenten Zellen befinden gegen eine Lösung ausgetauscht wird, die das Saccharid enthält. Das Saccharid kann beispielsweise in einer isotonischen Salzlösung gelöst sein oder in einem zellfreien Zellkulturmedium.
Ein derartiges Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen erlaubt es besonders einfach im Verfahrensschritt 3) durch Verwendung eines Saccharids die Zellen vom Zellkultursubstrat abzulösen und zu „passagieren“. Zum Ablösen der Zellen vom Zellkultursubstrat im Verfahrensschritt 3) ist keine Behandlung der Zellen mit Enzymen, beispielsweise Trypsin oder eine Veränderung der Temperatur notwendig. Auch der pH-Wert des Zellkulturmediums muss nicht geändert werden, sodass die Zellen besonders schonend abgelöst werden, ohne dass der Zellmetabolismus oder die Proteinexpression in den adhärenten Zellen so stark beeinflusst wird, wie dies bei herkömmlichen Methoden zum„Passagieren“ der Fall ist.
Bevorzugt wird der Verfahrensschritt 3) dann eingeleitet, wenn im Verfahrensschritt 2), das Zellkultursubstrat weitgehend, z. B. zu etwa 70% bis 80% mit den adhärenten Zellen bewachsen ist. Dies kann beispielsweise mittels mikroskopischer Methoden festgestellt werden.
Weiterhin kann bei einer Variante des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens im Verfahrensschritt 3) das gleiche Saccharid verwendet werden, dass auch Bestandteil des Zellkultursubstrats ist. Beispielsweise kann Laktose zur Ablösung der adhärenten Zellen verwendet werden, wenn Laktose als Saccharid im Zellkultursubstrat an das Polymer P angebunden wurde. Analog können auch Maltose, Celiobiose oder Mannose verwendet werden, wenn diese Saccharide Bestandteil des Zellkultursubstrats sind. Diese Saccharide sind besonders kostengünstige Verbindungen, die es einfach und zuverlässig erlauben die adhärenten Zellen im Verfahrensschritt 3) vom Zellkultursubstrat abzulösen. Da die Bindung der adhärenten Zellen an das Zellkultursubstrat über das gleiche Saccharid erfolgt, das auch zur Ablösung der Zellen verwendet wird, kann ein Ablösen der Zellen besonders zuverlässig erreicht werden.
Alternativ können auch andere Saccharide zum Ablösen der adhärenten Zellen vom Zellkultursubstrat verwendet werden als die, die Bestandteil des Zellkultursubstrats sind. Das zur Ablösung verwendete Saccharid sollte jedoch in der Lage sein, die adhärenten Zellen kompetitiv vom Zellsubstrat abzulösen. Dazu empfiehlt es sich, zumindest diejenigen Monosaccharide zum Ablösen der adhärenten Zellen einzusetzen, die Bestandteil der Oligo- oder Polysaccharide sind, die im Zellsubstrat vorhanden sind. Enthalten beispielsweise die im Zellkultursubstrat eingebauten Oligo- oder Polysaccharide Galaktose- oder Mannose-Einheiten, so können auch Galaktose bzw. Glucose als Monosaccharide zum Ablösen der adhärenten Zellen verwendet werden.
Im Verfahrensschritt 3) kann das Saccharid in einer Konzentration von 5 mM bis 25 mM, bevorzugt 5 mM bis 10 mM zum Ablösen der adhärenten Zellen vom Zellsubstrat verwendet werden. Dazu wird das Saccharid bevorzugt in entweder PBS oder zellfreien Zellkulturmedium in diesen Konzentrationen gelöst und das vorhandene Zellkulturmedium einer Zellkultur gegen diese Lösung ausgetauscht, was zum Ablösen der Zellen vom Zellkulturgefäß führt. Bei diesen Konzentrationen kann einerseits zuverlässig ein Ablösen der adhärenten Zellen vom Zellkultursubstrat erreicht werden, andererseits aber auch osmotischer Stress für die adhärenten Zellen, der erst bei höheren Konzentrationen von etwa 100 bis 200 mM auftritt, vermieden werden.
Nach der Durchführung des Verfahrensschrittes 3) können die Verfahrensschritte 1 ) bis 3) nacheinander zyklisch wiederholt werden, um eine fortgesetzte Kultivierung der adhärenten Zellen über einen längeren Zeitraum hinweg zu ermöglichen.
In Abhängigkeit von der chemischen Struktur des Saccharids kann das erfindungsgemäße Zellkultursubstrat auch spezifisch für bestimmte Zelllinien sein, beispielsweise ist Laktose als Saccharid-Bestandteil des Zellkultursubstrats besonders gut für die Kultivierung von CHO-Zelllinien geeignet. HeLa-Zellen können besonders gut auf erfindungsgemäßen Zellkultursubstraten kultiviert werden, die als Saccharid- Bestandteil Mannan oder Maltose umfassen.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Verwendung des Zellkultursubstrats, wie oben beschrieben, zur Kultivierung von adhärenten Zellen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Kultivierung von adhärenten Zellen, umfassend:
- ein Zellkultursubstrat wie oben beschrieben, und
- ein Saccharid zum Ablösen der Zellen von dem Zellkultursubstrat.
Der Kit kann beispielsweise als kommerzielles Produkt in einer Verpackung für
mögliche Kunden angeboten werden. Das Saccharid kann bereits als Lösung,
insbesondere als Stocklösung in beispielsweise wässriger Lösung im Kit vorhanden sein. Als Zellkultursubstrat wird bevorzugt ein Zellkulturgefäß oder Polymer-Partikel verwendet, an die bereits das Polymer-Saccharid-Konjugat gebunden wurde. Diese Zellkulturgefäße oder Polymer-Partikel können zum sofortigen Einsatz auch bereits sterilisiert sein. Weiterhin kann der Kit auch noch eine Bedienungsanleitung zur Durchführung eines Verfahrens zur Kultivierung von adhärenten Zellen, wie oben beschrieben, umfassen.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 ein Syntheseschema eines Polymer-Saccharid-Konjugats mittels einer reduktiven Aminierung unter Verwendung von NaBHsCN.
Fig. 2 beispielhafte funktionelle Gruppen die durch eine Sauerstoffplasma-Behandlung auf einer Polystyrol-Oberfläche gebildet werden können.
Fig. 3 Möglichkeiten einer direkten, kovalenten Bindung zwischen dem Aminogruppen enthaltenden Polymer und Polystyrol als Substrat.
Fig. 4 die Ergebnisse eines Laktatdehydrogenase-Assays zur Bestimmung der Zellintegrität bei adhärenten Zellen, die entweder mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder mittels einer Trypsin-Behandlung von Zellkulturplatten abgelöst wurden.
Fig. 5 die Ergebnisse eines Fluoreszenztests zur Bestimmung einer Caspase als Nachweis der Zellintegrität bei adhärenten Zeilen, die entweder mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder mittels einer Trypsin-Behandlung von Zellkulturplatten abgelöst wurden.
Fig. 6 die Ergebnisse von Protein-SDS-Gelen und Western-Blots zur Bestimmung des Oberflächenproteins E-Cadherin auf der Oberfläche von adhärenten Zellen, die entweder durch Trypsin-Behandlung oder mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens von Zellkulturplatten abgelöst wurden.
Fig. 7 Wachstumskurven für adhärente Zellen, die auf verschiedenen Zellkulturplatten kultiviert wurden.
Fig. 1 zeigt eine beispielhafte Synthese eines Polymer-Saccharid-Konjugats ausgehend von dem Polymer PEI. Das Saccharid Laktose kann mittels reduktiver Aminierung mit NaBH3CN direkt mit den Aminogruppen des PEG verknüpft werden, wobei sich einer der zyklischen Halbacetal-Einheiten der Laktose öffnet und lediglich die Galaktose weiterhin als zyklische Halbacetal-Form vorliegt und zur Bindung der adhärenten Zellen zur Verfügung steht.
Fig. 2 zeigt die mittels eines Sauerstoffplasmas gebildeten funktionellen Gruppen auf der Oberfläche von Polystyrol. Insbesondere können Carboxylate gebildet werden, Hydroxid-Gruppen, sowie Keto-Gruppen. Weiterhin können auch radikalische Sauerstoffspezies gebildet werden. Diese Gruppen können mit den Aminogruppen des Polymers reagieren und eine dauerhafte kovalente Bindung eingehen.
Fig. 3 zeigt derartige kovalente Bindungen zwischen einem beispielhaften Polystyrol- Substrat und den Aminogruppen des Polymers. Insbesondere können am Amid- Gruppen, Imin-Gruppen oder Amin-Gruppen gebildet werden.
Ausführungsbeispiele
Im Folgenden werden beispielhafte Synthesen einiger Polymer-Saccharid-Konjugate vorgestellt.
Lactose-PEI:
Polyethylenimin Lösung (Mn -60,000 GPC (Gelpermeations-Chromatographie), Mw -750,000 LS (light Scattering spectroscopy), 50 wt. % in Wasser) (PEI, 20 g, 0.1667 mmol) und D-Lactose monohydrat (38.028 g, 105.5 mmol, 5 eq. pro ideale Wiederholungseinheit von PEI) werden in MeOH (70 mL) and 50 mM Natriumtetraborat Lösung (aq) (100 mL) gelöst und auf 60 °C erhitzt. Nach vollständigem Lösen der Komponenten wurde das System wieder abgekühlt und der pH-Wert mit Ameisensäure auf einen Wert von 3 eingestellt. NaBHsCN (33.148 g, 527.5 mmol ,5 Äq. bezogen auf Lactose) wurde in MeOH (30 mL) gelöst und in 6 Portionen dem System zugegeben. Die Reaktion erfolgte für 2 h bei 60°C. Anschließend wurde das MeOH im Vakuum entfernt und die Lösung über eine Cellulosemembran (Ausschlussgrenze 10 kDa) dialysiert und gefriergetrocknet.
Maltose-PEI: PEI (10.286 g; s.o.) und Maltose-Monohydrat (27.124 g, 75.28 mmol; 7.5 eq. pro ideale Wiederholungseinheit von PEI) werden in 35 mL MeOH und 5 mM Natriumtetraborat Lösung (aq) bei 60°C vollständig gelöst. Nach Abkühlen und Einstellen des pH-Wertes (s.o.) wurde eine Suspension von NaBH3CN (16.5870 g, 263.96 mmol) in 15 mL MeOH portionsweise zugegeben. Die Reaktion erfolgte für 17 h bei 60°C. Anschließend wurde das MeOH im Vakuum entfernt und die Lösung über eine Cellulosemembran (Ausschlussgrenze 10 kDa) dialysiert und gefriergetrocknet.
Mannan-PEI:
500 mg Galactomannan (z.B. Johannisbrotkernmehl oder Guarkernmehl) werden in 49 mL H20 unvollständig gelöst und 1 mL 1 M H2SO4 hinzugegeben. Die Lösung wird bei 600 W für 60 s in der Microwelle hydrolysiert und anschließend filtriert. Dies führt zu einer Hydrolyse des Galactomannans, wobei Polysaccharide mit 200 bis 300 Mannose-Wiederholeinheiten gebildet werden.
Das Filtrat wird mit 1 g PEI, 6 mL Eisessig und 664 mg NaBH3CN versetzt für 3 h bei 60 °C gerührt. Anschließend wird die Lösung über eine Cellulosemembran (Ausschlussgrenze 10 kDa) dialysiert und gefriergetrocknet.
Plasmabehandlunq des Substrats und Bildung des Zellkultursubstrats:
Das Zellkultursubstrat, beispielsweise Zellkulturplatten können folgendermaßen mit einem Sauerstoffplasma handelt werden:
Unbehandelte 24-Well Polystyrolplatten werden bei 150 W für 90 Sekunden mit Sauerstoffplasma im Vakuum (0,2 mbar) aktiviert und im Anschluss in die Wells jeweils 500 pL einer 1 mg/mL wässrigen Lösung der PEI-Derivate (Polymer-Saccharid- Konjugate) gegeben. Die Platten wurden für 2 h bei RT inkubiert, mit Wasser gewaschen und für eine Stunde bei 80°C abgedeckt erhitzt. Im Anschluss sind die Platten als erfindungsgemäße Zellkultursubstrate direkt für den Einsatz in der Zellkultur geeignet.
Zellkultur auf qlykopolymerbeschichteten 24-Well Platten als erfindunqsqemäßen Zellkultursubstrat: Medien:
CHO- K1 Zellinien: Ham's F12 mit 10% (v/v) FKS (FKS = fötales Kälberserum)
HEK293 und HeLa-Zellinien: DMEM mit 10% (v/v) FKS und 2% Glutamin
Die Inkubation erfolgte bei 37 °C und einem C0 Gehalt von 5 % in der Atmosphäre. Üblicherweise werden 0,05-1 x 10® Zellen/mL (500 pL) in die Wells gegeben. Das Passagieren erfolgt durch Ersetzen des Mediums mit 500 pL einer 5-50 mM Lösung des jeweiligen Zuckers in PBS oder Medium und einer Inkubationszeit von 15-30 Minuten bei Raumtemperatur oder 37 °C. Je nach PEI-Derivat kann eine Zelllinienspezifität erreicht werden. Z.B. sind PEI-Lactose Oberflächen gut geeignet für CHO-Zelllinien. HeLa Zellen bevorzugen Mannan-PEI oder Maltose-PEI.
Tests zur Bestimmung der Zellinteqrität:
Im Folgenden werden die Ergebnisse einiger Tests zur Bestimmung der Zellintegrität nach dem Ablösen der adhärenten Zellen vom Zellsubstrat gezeigt. Dabei werden adhärente Zellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens von einem erfindungsgemäßen Zellsubstrat abgelöst wurden, mit adhärenten Zellen verglichen, die mittels einer Trypsin-Behandlung von herkömmlichen, mittels eines Plasmas oberflächenmodifizierten Zellkulturplatten abgelöst wurden. Bei den Zellen handelt es sich um CHO-1 Zellen, die auf Polystyrol-Petrischalen mit PEI-Lactose kultiviert wurden.
Laktatdehydroqenase-Assav zur Bestimmung der Zellinteqrität:
Laktatdehydrogenase (LDH) wird bei der Beschädigung der Plasmamembran von verschiedenen adhärenten Zellen in das Zellkulturmedien freigesetzt. Die freigesetzte LDH kann durch eine gekoppelte enzymatische Reaktion quantifiziert werden. Zunächst katalysiert LDH die Umwandlung von Laktat in Pyruvat durch die Reduktion von NAD+ zu NADH. Anschließend dient das NADH dazu, ein Tetrazoliumsalz durch das Enzym Diaphorase zu einem roten Formazan-Produkt zu reduzieren. Die gebildete Menge an Formazan, die bei einer Wellenlänge von 490 nm bestimmt wird, ist direkt proportional zur Menge der freigesetzten LDH im Medium. Der Laktatdehydrogenase- Assay wurde mit einem kommerziell erhältlichen Kit„Pie ree LDH Cytotoxicity Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt.
Fig. 4 zeigt ein Balken-Diagramm, bei dem auf der y-Achse die Differenz zwischen der Absorption bei 490 nm (Absorption von Formazan) und der Absorption bei 680 nm (Hintergrundsignal des Instruments) aufgetragen ist. Auf der x-Achse sind verschiedene Arten der Ablösung der adhärenten Zellen vom Zellsubstrat durch unterschiedliche Konzentrationen von Laktose (10 mM, 25 mM, 50 mM und 200 mM) im Vergleich zu einem herkömmlichen Verfahren, der Trypsin-Behandlung aufgelistet.
Deutlich ist in der Fig. 4 zu erkennen, dass die Laktatdehydrogenase-Aktivität im Zellkulturmedium bei den Zellen, die mit Trypsin behandelt wurden, deutlich größer ist als bei den adhärenten Zellen, die mit Laktose behandelt wurden. Dies zeigt deutlich, dass bei der vorliegenden Erfindung die Zellintegrität weniger beeinträchtigt wird als bei der Trypsin-Behandlung.
Caspase-Assay zur Bestimmung der Zellinteqrität:
Bei einem Fluoreszenz-basierten Caspase 3/7 Assay wird die Apoptose (programmierter Zelltod) durch die Detektion einer Caspase in Zellkulturen gemessen. Dazu wird ein Caspase-3/7 grünes Detektionsreagenz eingesetzt, das ein Peptid mit vier Aminosäuren (DEVD) mit einer Spaltstelle für Caspase-3/7 ist, das an einen nukleinsäurebindenden Farbstoff konjugiert ist. Der Farbstoff ist nicht fluoreszierend, solange er an das Peptid konjugiert ist. Nach Spaltung des Peptids durch die Caspase wird der Farbstoff aktiviert, bindet an DNA und kann mit einem Anregungs- /Emmissionsmaximum von ca. 502/530 nm mittels Fluoreszenz detektiert werden.
Fig. 5 zeigt ein Balken-Diagramm bei dem die Fluoreszenz des Caspase-3/7 grünen Detektionsreagenzes für HeLa-Zellen aufgetragen ist, die unterschiedlichen Behandlungen für jeweils 30 Minuten (schwarze Balken) und 24 Stunden (helle Balken) unterzogen wurden. Der Assay wurde mit dem Kit„Cell Event™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent (Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt.
Die im Diagramm mit„Medium“ und„PBS“ beschrifteten Balken zeigen die Caspase- vermittelte Fluoreszenz von Zellen, die jeweils nur mit dem Zellkulturmedium bzw. PBS („Phosphate Buffered Saline") gewaschen wurden und daher keinerlei Zellstress ausgesetzt waren. Die mit „Staurosporine [10pM]“ beschrifteten Balken zeigen die Caspase-vermittelte Fluoreszenz von Zellen, die mit Staurosporine behandelt wurden, einem Breitband-Kinase-Inhibitor, der Apoptose in vielen Zellen auslöst. Die Caspase- vermittelte Fluoreszenz von HEK-Zellen, die einer Trypsin Behandlung unterzogen wurden ist mit„Trypsin-EDTA [0,5 und 20 %/0, 02 %]" gekennzeichnet. Weiterhin ist die Caspase-vermittelte Fluoreszenz von Zellen, die auf einem erfindungsgemäßen Zellkultursubstrat kultiviert wurden und dann durch Zugabe eines Saccharids, nämlich 10 mM Mannose, 25 mM oder 50 mM Mannose abgelöst wurden, gezeigt.
Die Caspase-vermittelte Aktivität der keinem Zellstress ausgesetzten Zellen ist vergleichbar mit der Aktivität der Caspase in adhärenten Zellen, die mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens kultiviert und abgelöst wurden. Im Gegensatz dazu ist die Caspase-vermittelte Aktivität bei Zellen, die einer Trypsin-Behandlung unterzogen wurden erheblich erhöht. Die experimentellen Daten der Fig. 5 zeigen deutlich, dass bei einem erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahren, bzw. bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats die Zellintegrität gegenüber einer Trypsin- Behandlung verbessert ist.
Fig. 6 zeigt den Nachweis des Proteins E-Cadherin, eines Transmembran- Glykoproteins in Zellen, die den gleichen Bedingungen wie in der Fig. 5 dargestellt, ausgesetzt wurden. Während der Trypsin-Behandlung wurde auch E-Cadherin verdaut, sodass dieses Protein im SDS-Proteingel nicht mehr nachweisbar ist. Bei den mittels Laktose abgelösten Zellen ist die Bande für E-Cadherin ähnlich wie bei dem mit Medium oder PBS behandelten Zellen noch deutlich zu sehen, was für eine hohe Zellintegrität spricht. Dies zeigt, dass durch die Trypsin-Verdauung auch für den Zellmetabolismus wichtige Oberflächenproteine beeinträchtigt werden, während dies bei der vorliegenden Erfindung nicht der Fall ist.
Figur 7 zeigt die Wachstumskurve von CHO-1 -Zellen auf verschiedenen Zellkulturgefäßen. Die CHO-Zellen, die auf einem erfindungsgemäßen Zellkultursubstrat (Polystyrol-Petrischalen mit PEI-Lactose) kultiviert wurden, zeigen dabei ähnliche Wachstumskurven wie Zellen, die in herkömmlichen Zellkulturgefäßen (mit „Standard“ beschriftete Wachstumskurve) kultiviert wurden. Die als “ untreated‘ (unbehandelt) bezeichnete Wachstumskurve zeigt das Wachstum der Zellen auf unbehandelten Zellkulturplatten, die auch als Substrat für das erfindungsgemäße Zellkultursubstrat in diesem Experiment verwendet wurden. Die mit „O2 Plasma“ bezeichnete Kurve zeigt das Wachstum auf Zellkulturplatten die plasmabehandelt wurden, an die aber nicht das Polymer-Saccharid-Konjugat gebunden wurde.
Die Erfindung ist nicht durch die Beschreibung anhand der Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr umfasst die Erfindung jedes neue Merkmal sowie jede Kombination von Merkmalen, was insbesondere jede Kombination von Merkmalen in den Patentansprüchen beinhaltet, auch wenn dieses Merkmal oder diese Kombination selbst nicht explizit in den Patentansprüchen oder Ausführungsbeispielen angegeben ist.

Claims

Patentansprüche
1 . Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zellen, umfassend
- ein Substrat (S),
- ein Aminogruppen aufweisendes, an das Substrat gebundenes Polymer (P), und
- ein Saccharid (Z) mit zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten zur Anbindung der adhärenten Zellen,
- wobei das Saccharid (Z) kovalent über die Aminogruppen mit dem Polymer (P) verbunden ist.
2. Zellkultursubstrat nach Anspruch 1 , wobei das Saccharid eine offenkettige Monosaccharid-Einheit aufweist und über diese Monosaccharid-Einheit mit einer sekundären Amingruppe des Polymers (P) verbunden ist.
3. Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei das Saccharid ein Oligosaccharid oder Polysaccharid mit 2 bis 500 Monosaccharid- Wiederholeinheiten, bevorzugt 2 bis 20 Monosaccharid-Wiederholeinheiten, weiter bevorzugt 2 bis 10 Monosaccharid-Wiederholeinheiten, weiter bevorzugt ein Disaccharid ist.
4. Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei das Substrat Glas oder einen Kunststoff umfasst oder daraus besteht.
5. Zellkultursubstrat nach dem vorhergehenden Patentanspruch, wobei das Substrat kovalent mit den Aminogruppen aufweisenden Polymer verbunden ist.
6. Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei das Polymer Poly(ethylenimin) (PEI) oder Poly(amidoamin) (PAMAM) umfasst oder daraus besteht.
7 Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche umfassend oder aufweisend die folgende Struktur der allgemeinen Formel I: - wobei S das Substrat, P das Polymer mit daran gebundenem Saccharid und A eine das Polymer P und das Substrat S verknüpfende Gruppe darstellen,
- wobei der Parameter x die Anzahl der Wiederholeinheiten im Polymer P ist,
- wobei das Polymer P Wiederholeinheiten umfasst, die ausgewählt sind aus einer Gruppe der Wiederholeinheiten mit den allgemeinen Formeln A bis F:
wobei Z das Saccharid darstellt, und die Parameter jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen sind und a, b, c, d, e und f die Anzahl der jeweiligen Wiederholeinheiten im Polymer P sind, wobei gilt a+b+c+d+e+f =x, und die mit markierten Positionen die Anknüpfungsstellen der
Wiederholeinheiten an weitere Wiederholeinheiten im Polymer P darstellen bzw. bei terminalen Wiederholeinheiten die Anknüpfung an die Gruppe A oder an die terminale Aminogruppe -NF in der allgemeinen Formel I.
8. Zellkultursubstrat nach dem vorhergehenden Patentanspruch, wobei die das
Polymer P und das Substrat S verknüpfende Gruppe A ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen:
- wobei mit„*“ markierten Positionen die Anknüpfungsstellen der Gruppe A an das Polymer P und das Substrat S darstellen.
9. Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei das
Saccharid Z ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen mit den Formeln G bis J:
- wobei die Parameter g, i und j unabhängig voneinander eine natürliche ganze Zahl zwischen 0 und 400, bevorzugt 0 bis 300, weiter bevorzugt 0 bis 10, bzw. 0 sind, und
- wobei die mit markierten Positionen die Anknüpfungsstellen des Saccharids Z an das Polymer P darstellen.
10. Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, ausgebildet als Zellkulturgefäß oder als Partikel.
1 1 . Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursubstrats mit den Verfahrensschritten:
A) Bereitstellen eines Aminogruppen aufweisenden Polymers (P) und eines Saccharids (Z) mit zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten,
B) Bildung eines kovalenten Konjugats zwischen dem Polymer (P) und dem Saccharid (Z),
C) Verknüpfen des Konjugats mit einem Substrat (S).
12. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei im Verfahrensschritt A) ein reduzierendes Saccharid (Z) bereitgestellt wird, und im Verfahrensschritt B) das kovalente Konjugat mittels reduktiver Aminierung gebildet wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 1 oder 12, wobei im Verfahrensschritt A) ein synthetisches Polymer bereitgestellt wird, bevorzugt Poly(ethylenimin) (PEI) oder Poly(amidoamin) (PAMAM), die auch verzweigt sein können.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 1 bis 13, wobei im Verfahrensschritt C) ein Substrat verwendet wird, das mittels eines Sauerstoff- Plasmas aktiviert wurde.
15. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei im Verfahrensschritt C) kovalente Bindungen zwischen dem Substrat und dem Polymer-Saccharid-Konjugat über die Aminogruppen des Polymers (P) gebildet werden.
16. Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen unter Verwendung eines Zellkultursubstrats nach einem der Ansprüche 1 bis 10, mit den Verfahrensschritten:
1 ) Inkontaktbringen der adhärenten Zellen mit dem Zellkultursubstrat, wobei die Zellen über das Saccharid an das Zellkultursubstrat binden,
2) Kultivierung der Zellen mit dem Zellkultursubstrat in einem Zellkulturmedium, 3) Ablösen der Zellen vom dem Zellkultursubstrat durch Inkontaktbringen eines Saccharids mit den Zellen.
17. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei im Verfahrensschritt 3) das gleiche Saccharid verwendet wird, das Bestandteil des Zellkultursubstrats ist.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 16 oder 17, wobei das Saccharid im Verfahrensschritt 3) in einer Konzentration von 5 bis 25 mM verwendet wird.
19. Verwendung eines Zellkultursubstrats nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Kultivierung von adhärenten Zellen.
20. Kit zur Kultivierung von adhärenten Zellen, umfassend:
ein Zellkultursubstrat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, und
- ein Saccharid zum Ablösen der Zellen von dem Zellkultursubstrat.
21 . Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, zusätzlich umfassend:
- eine Bedienungsanleitung zur Durchführung eines Verfahrens zur Kultivierung von adhärenten Zellen nach einem der Ansprüche 16 bis 18.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NARDULLI M ET AL: "The study of specific and nonspecific hepatoma cells behavior by means of plasma-treated substrates", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH PART B: APPLIED BIOMATERIALS, JOHN WILEY & SONS, INC, US, vol. 94, no. 1, 1 July 2010 (2010-07-01), pages 97 - 107, XP009169765, ISSN: 1552-4981, [retrieved on 20100331], DOI: 10.1002/JBM.B.31629 *

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