DE102019112937A1

DE102019112937A1 - Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zellen

Info

Publication number: DE102019112937A1
Application number: DE102019112937.0A
Authority: DE
Inventors: Ruben R. Rosencrantz; Lena Thoring; Stefan Kubick; Alena Lisa Palkowitz
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2020-11-19
Also published as: WO2020229666A1; EP3969565A1; US20220195381A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zellen, umfassend:
- ein Substrat (S),
- ein Aminogruppen aufweisendes, an das Substrat gebundenes Polymer (P), und
- ein Saccharid (Z) mit zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten zur Anbindung der adhärenten Zellen,
- wobei das Saccharid (Z) kovalent über die Aminogruppen mit dem Polymer (P) verbunden ist.
Ein derartiges Zellkultursubstrat ist besonders gut zur Kultivierung von adhärenten Zellen geeignet und ermöglicht es durch Zugabe eines Saccharids die Zellen besonders schonend vom Zellkultursubstrat abzulösen.

Description

Die „in vitro“-Zellkultivierung von adhärenten Zellen, insbesondere Säugetierzellen im Labor ist notwendig für die pharmazeutische Forschung und die Entwicklung von Zelltherapien. Adhärente Zellen benötigen im Gegensatz zu Suspensionszellen die Anbindung an die Oberfläche eines Zellkultursubstrats, um wachsen zu können. Diese Zelladhäsion wird vermittelt durch Integrinrezeptoren und Transmembranproteine. Wenn die gesamte Wachstumsfläche von kultivierten adhärenten Zellen bedeckt ist, wachsen strikt adhärente Zelllinien in der Regel nicht mehr weiter. Weiterhin kann es nach der Ausbildung einer geschlossenen Mono-Schicht von adhärenten Zellen im Zellkulturgefäß zum verlangsamten Wachstum der Zellen und auch zum Absterben der Kultur kommen. Aus diesem Grund werden die Zellen vor Erreichen der Maximaldichte (Oberfläche ist circa 70-80% bewachsen) verdünnt, wobei dies durch das „Passagieren“ der Zellen passiert, bei dem die Zellen vom Zellkultursubstrat abgelöst und in Suspension gebracht werden. Nach entsprechender Verdünnung werden die Zellen in ein neues Zellkulturgefäß zur weiteren Kultivierung eingebracht. Zur fortgesetzten Kultivierung der adhärenten Zellen wird daher regelmäßig das „Passagieren“ durchgeführt um negative Folgen für die adhärenten Zellen zu vermeiden.
Eine häufig angewandte Methode zur Ablösung der adhärenten Zellen vom Zellkultursubstrat ist die „Trypsinierung“, bei der die Serinprotease Trypsin eingesetzt wird, die die Oberflächenproteine der Zellen spaltet und somit die Adhäsion an das Zellkulturgefäß unterbricht. Da Trypsin neben Molekülen, die für die Adhärenz relevant sind auch unspezifisch Oberflächenproteine der adhärenten Zellen spaltet, werden auch Oberflächenproteine, wie Wachstumsfaktoren oder Membranproteine gespalten, die eine essenzielle Rolle im Zellmetabolismus übernehmen. Die „Trypsinierung“ hat daher zumindest teilweise einen negativen Einfluss auf den Metabolismus der adhärenten Zellen und führt zu Zellstress und reduziert somit die Gesamtvitalität der adhärenten Zellen während des „Passagierens“. Eine alternative Methode zur Ablösung von adhärenten Zellen besteht darin, thermoresponsive Polymere zu verwenden, die in Abhängigkeit von der Temperatur eine schaltbare Hydrophilie/Hydrophobizität aufweisen und dadurch die Ablösung der Zellen während des „Passagierens“ bewirken. Eine Ablösung der Zellen kann beispielsweise durch einen Temperaturwechsel von Standardkulturbedingungen von 37 °C auf 22 °C erfolgen. Auch diese Änderung der Temperatur kann zu Veränderungen im Metabolismus der adhärenten Zellen führen und das Wachstumsverhalten der Zellen negativ beeinflussen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zellen, ein Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen unter Verwendung des Zellkultursubstrats, eine Verwendung des Zellkultursubstrats zur Kultivierung von adhärenten Zellen und einem Kit zur Kultivierung der adhärenten Zellen anzugeben, die bezüglich der oben genannten Nachteile verbessert sind.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Zellkultursubstrat nach Anspruch 1. Weitere Ausgestaltungen des Zellkultursubstrats, ein Kit, ein Verfahren zur Herstellung des Zellkultursubstrats und weitere Ausgestaltungen des Verfahrens zu Kultivierung von adhärenten Zellen sind Gegenstand weiterer Patentansprüche.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zellen, umfassend

- ein Substrat (S),
- ein Aminogruppen aufweisendes, an das Substrat gebundenes Polymer (P), und
- ein Saccharid (Z) mit zumindest 2 Monosaccharid-Einheiten zur Anbindung der adhärenten Zellen,
- wobei das Saccharid (Z) kovalent über die Aminogruppen mit dem Polymer (P) verbunden ist.

Der Vorteil dieses Zellkultursubstrats besteht darin, dass durch die feste Anbindung des Saccharids an das Aminogruppen aufweisende Polymer und die Bindung des Polymers an das Substrat eine besonders gute Anbindung der adhärenten Zellen an das Zellkultursubstrat erfolgt. Dies erlaubt eine besonders zuverlässige Kultivierung von adhärenten Zellen. Das Ablösen der Zellen vom Zellkultursubstrat kann bei dem vorliegenden Zellkultursubstrat besonders einfach durch Zugabe eines Saccharids erfolgen, das kompetitiv die Wechselwirkungen zwischen den Oberflächenproteinen der adhärenten Zellen und dem Zellkultursubstrat unterbricht und so besonders einfach das „Passagieren“ von adhärenten Zellen erlaubt. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren wird bei der vorliegenden Erfindung der Zellmetabolismus nicht beeinträchtigt, da weder eine Spaltung der Oberflächenproteine der adhärenten Zellen, noch eine Temperaturänderung oder eine Änderung des pH-Werts des Zellkulturmediums benötigt werden.
Zumindest eine Monosaccharid-Einheit des Saccharids kann dabei zyklisch als sogenanntes „Halbacetat“ vorliegen, was besonders gut die Bindung der Oberflächenproteine der adhärenten Zelle an das Saccharid ermöglicht. Bei dieser Monosaccharid-Einheit kann es sich insbesondere um eine Hexose, ein Saccharid mit 6 Kohlenstoffatomen handeln. Möglich ist auch die Verwendung von Pentosen, Sacchariden mit 5 Kohlenstoffatomen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats weist das Saccharid eine offenkettige Monosaccharid-Einheit auf, wobei das Saccharid über diese Monosaccharid-Einheit mit einer sekundären oder primären Amingruppe des Polymers (P) verbunden ist. Das Saccharid des erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats weist zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten auf, da in der Regel bei der Verknüpfung des Saccharids mit dem Aminogruppen aufweisenden Polymer (P) eine offenkettige Monosaccharid-Einheit bevorzugt direkt mit einer Aminogruppe des Polymers (P) verknüpft wird und diese Monosaccharid-Einheit dann nicht mehr oder nur noch im untergeordneten Maß zur Anbindung an die adhärenten Zellen zur Verfügung steht. Die Erkennung durch die adhärenten Zellen kann dann über die zweite Monosaccharid-Einheit des Saccharids erfolgen. Dies ermöglicht eine besonders einfache Anbindung des Saccharids an das Polymer.
Die sekundäre oder primäre Aminbrücke zwischen der offenkettigen Monosaccharid-Einheit des Saccharids und dem Polymer (P) kann insbesondere das Produkt einer reduktiven Aminierung einer ursprünglich reduzierenden Monosaccharid-Einheit des Saccharids und einer Aminogruppe des Polymers sein. Dies ermöglicht es besonders einfach die offenkettige Monosaccharid-Einheit des Saccharids direkt an die Aminogruppe des Polymers anzubinden, ohne dass zwischen dem Polymer und dem Saccharid verknüpfende Linkergruppen vorhanden sein müssen.
Das Saccharid des Zellkultursubstrats kann insbesondere ein Oligosaccharid oder Polysaccharid sein, bevorzugt ein Oligo- bzw. Polysaccharid mit 2 bis 500 Monosaccharid-Wiederholeinheiten, bevorzugt 2 bis 20 Monosaccharid-Wiederholeinheiten, weiter bevorzugt 2 bis 10 Monosaccharid-Wiederholeinheiten. Besonders bevorzugt ist ein Disaccharid, wie beispielsweise Laktose, Maltose, Cellobiose oder Melibiose. Weiterhin kann auch hydrolisiertes Mannan eingesetzt werden. In diesem Fall kann das Saccharid ein Polysaccharid sein und z. B. 50 bis 500 Mannose-Wiederholeinheiten, bevorzugt 100 bis 300 Mannose-Wiederholeinheiten aufweisen. Möglich ist auch die Verwendung von Polysacchariden, wie beispielsweise Cellulose, Stärke oder Amylopektin.
Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats umfasst das Substrat Glas oder synthetische Polymere, wie Kunststoff oder besteht aus diesen. Glas wie auch synthetische Polymere sind besonders günstige und geeignete Substrate für das Zellkultursubstrat. Die Kunststoffe können insbesondere Polyolefine, wie Polyethylen oder Polypropylen sein oder andere Kunststoffe wie beispielsweise Polystyrol (PS) oder Polycarbonat (PC). Als Glas kommt beispielsweise Borosilikatglas infrage. Besonders bevorzugt ist Polystyrol.
Besonders Glas ist als Substrat für wiederverwendbare Zellkultursubstrate geeignet. Diese können insbesondere nach Verwendung auch erneut sterilisiert werden (20 min bei 121 °C) und danach wiederverwendet werden.
Besonders bevorzugt ist es, wenn bei dem erfindungsgemäßen Zellkultursubstrat das Substrat kovalent mit den Aminogruppen aufweisenden Polymer (P) verbunden ist. Dies ermöglicht eine besonders zuverlässige Anbindung des Polymers an das Substrat. Insbesondere können das Substrat und das Polymer im Zellkultursubstrat über Aminogruppen, Amidgruppen und/oder über Imin-Gruppen kovalent miteinander verbunden sein. Besonders vorteilhaft können auf dem Substrat vor der Anbindung an das Polymer sauerstoffhaltige Gruppen, beispielsweise Hydroxylgruppen, Ketogruppen Carboxylatgruppen oder auch radikalische Sauerstoffgruppen vorhanden sein, die beispielsweise mittels Behandlung mit einem Sauerstoffplasma auf der Oberfläche des Substrats erzeugt werden können. Diese sauerstoffhaltigen Gruppen ermöglichen eine besonders einfache Anbindung an das Polymer über dessen Aminogruppen. Besonders gut ist eine Behandlung der Oberflächen von Polystyrol-Zellkultursubstraten mit einem Sauerstoffplasma möglich, wobei dann die oben genannten Gruppen gebildet werden können. Eine Behandlung mit Sauerstoffplasma zur Bildung von funktionellen Gruppen ist auch bei Glasoberflächen möglich.
Das Polymer des Zellkultursubstrats kann weiterhin Aminogruppen aufweisende synthetische Polymere, wie Poly(ethylenimin) (PEI) oder Poly(amidoamin) (PAMAM) umfassen oder daraus bestehen. Derartige Polymere weisen eine Vielzahl von Aminogruppen auf und ermöglichen es somit besonders einfach eine Vielzahl von Sacchariden zur Bindung der adhärenten Zellen zu binden. Die Vielzahl der Aminogruppen kann weiterhin auch die Anbindung des Polymers an das Substrat begünstigen.
Möglich ist auch die Verwendung von Chitosan, einem Polyglucosamin als Aminogruppen aufweisendes Polymer. Die Anknüpfung des Saccharids an das Chitosan als Polymer kann analog zu den bereits oben beschriebenen Polymeren mittels einer reduktiven Aminierung erfolgen. Dabei werden nicht alle Aminogruppen des Chitosans mit dem Saccharid zur Reaktion gebracht, sodass noch Aminogruppen des Chitosans zur Anbindung an das Substrat zur Verfügung stehen.
Weiterhin können auch verzweigte Aminogruppen-haltige Polymere, sogenannte Dendrimere eingesetzt werden, die aufgrund ihres hohen Verzweigungsgrades eine besonders große Anzahl an Aminogruppen aufweisen können.
Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats weist dieses die folgende allgemeine Struktur der Formel I auf:
Dabei ist S das Substrat, P das Polymer mit daran gebundenem Saccharid und A eine das Polymer P und das Substrat S verknüpfende Gruppe. Der Parameter x ist eine natürliche ganze Zahl und stellt die Anzahl der Wiederholeinheiten im Polymer P dar. Der Parameter x kann insbesondere zwischen 15 bis 6000 Wiederholeinheiten liegen, bevorzugt zwischen 25 bis 2000 Wiederholeinheiten, weiter bevorzugt zwischen 1200 bis 1800 Wiederholeinheiten. Das in den Ausführungsbeispielen verwendete PEI wies beispielsweise etwa 1500 Wiederholeinheiten auf.
Weiterhin kann das Polymer P Wiederholeinheiten umfassen, die ausgewählt sind aus einer Gruppe der Wiederholeinheiten mit den allgemeinen Formeln A bis F:
Dabei stellt die Gruppe Z das Saccharid dar. Die Parameter a, b, c, d, e und f sind jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen und bezeichnen die Anzahl der jeweiligen Wiederholeinheiten im Polymer P, wobei gilt a+b+c+d+e+f =x. Die Parameter a, b, c, d, e und f können insbesondere unabhängig voneinander zwischen 20 bis 5000 liegen, bevorzugt zwischen 25 bis 2000. Häufig ist im Durchschnitt ein Saccharid-Molekül je Wiederholungseinheiten an das Polymer P gebunden. Besonders bevorzugt sind zumindest die Wiederholeinheiten der allgemeinen Formeln A, B und C im Polymer vorhanden, die an ein oder mehrere Saccharide Z gebunden sind. Die Wiederholeinheiten der allgemeinen Formeln D und E stellen Wiederholeinheiten dar, bei denen die im Polymer P vorhandenen Aminogruppen nicht mit dem Saccharid Z reagiert haben. Die Wiederholeinheiten F sind Wiederholeinheiten mit Verzweigungsstellen, die insbesondere dann im Polymer P vorhanden sind, wenn als Polymere verzweigte Dentrimere verwendet werden. Die mit „*“ markierten Positionen kennzeichnen die Anknüpfungsstellen der Wiederholeinheiten an weitere Wiederholeinheiten im Polymer P, bzw. bei terminalen Wiederholeinheiten die Anknüpfung an die Gruppe A oder an die terminale Aminogruppe -NH₂ in der allgemeinen Formel I.
Die das Polymer P und das Substrat S verknüpfende Gruppe A kann vorteilhafterweise ausgewählt sein aus einer Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen:
Das Stickstoff-Atom dieser Gruppen kennzeichnet eine Aminogruppe des Polymers, die mit den bereits oben genannten sauerstoffhaltigen Gruppen des Substrats reagiert, wobei die entsprechenden verknüpfenden Gruppen A gebildet werden. Die mit „*“ markierten Positionen in den Gruppen kennzeichnen die Anknüpfungsstellen der Gruppe A an das Polymer P und an das Substrat S. Derartige Gruppen sind besonders gut geeignet eine stabile kovalente Bindung zwischen dem Polymer P und dem Substrat S zu bilden.
Das Saccharid Z ist bevorzugt ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen mit den Formeln G bis J:
In den Formeln sind die Parameter g, i und j unabhängig voneinander eine natürliche ganze Zahl zwischen 0 und 400, bevorzugt 0 bis 300, weiter bevorzugt 0 bis 10, bzw. 0 (Disaccharid). Die mit „*“ markierten Positionen stellen die Anknüpfungsstellen des Saccharids Z an das Polymer P dar.
Generell kann das Saccharid glykosidische Bindungen, insbesondere 1,4- oder 1,6-glykosidische Bindungen, beispielsweise β-1,4-glykosidische Bindungen, α-1,4-glykosidische Bindungen, sowie α-1,6 glykosidische Bindungen aufweisen. Das Saccharid Z der beiden Formeln I weist beispielsweise β-1,4-glykosidische Bindungen auf, wie sie bei der Laktose, oder bei der Cellobiose als Disacchariden, bzw. bei der Cellulose als Polysaccharid auftreten. Das Saccharid der Formel G weist α-1,4-glykosidische Bindungen auf, wie sie beispielsweise bei der Maltose als Disaccharid auftreten. Maltose ist das Abbauprodukt des Polysaccharids Stärke durch das Enzym Beta-Amylase. Die Formel H zeigt Melibiose mit einer α-1,6 glykosidischen Bindung. Derartige Saccharide Z sind besonders dazu geeignet an adhärente Zellen zu bilden, da viele dieser Strukturen das Monosaccharid Galaktose aufweisen, das von vielen Rezeptoren auf den Zellen erkannt wird. Das Saccharid der Formel J leitet sich von Mannan ab und kann beispielsweise das Hydrolyseprodukt des Mannans, wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben, sein.
Das Zellkultursubstrat kann als Zellkulturgefäß, beispielsweise als Petrischale oder als Mikrotiterplatte ausgebildet sein. Weiterhin kann das Zellkultursubstrat auch noch als Partikel, zum Beispiel Glas- oder Polystyrolpartikel ausgebildet sein, auf denen adhärente Zellen wachsen können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursubstrats mit den Verfahrensschritten:

A) Bereitstellen eines Aminogruppen aufweisenden Polymers (P) und eines Saccharids (Z) mit zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten,
B) Bildung eines kovalenten Konjugats zwischen dem Polymer (P) und dem Saccharid (Z),
C) Verknüpfen des Konjugats mit einem Substrat (S).

Besonders vorteilhaft kann im Verfahrensschritt A) ein reduzierendes Saccharid Z bereitgestellt werden, und im Verfahrensschritt B) das kovalente Konjugat mittels reduktiver Aminierung gebildet werden. Reduzierende Saccharide sind Mono, Di-, Oligo- oder Polysaccharide, die in Lösung eine freie Aldehydgruppe aufweisen. Diese Aldehydgruppe reagiert mit einer Aminogruppe des Polymers P, wobei die anschließend gebildete Imin-Gruppe unter milden reduzierenden Bedingungen, beispielsweise unter Verwendung von Natriumcyanoborhydrid (NaBH₃CN) zu einem Amin, insbesondere einem primären oder sekundären Amin reduziert werden kann. Die reduktive Aminierung stellt eine besonders einfach durchzuführende Methode dar, bei der das Aminogruppen aufweisende Polymer direkt kovalent mit dem Saccharid verbunden werden kann, ohne dass zusätzliche verknüpfende Linkergruppen vorhanden sein müssen.
Besonders bevorzugt wird im Verfahrensschritt A) ein synthetisches Polymer bereitgestellt, dass Poly(ethylenimin) (PEI) oder Poly(amidoamin) (PAMAM) sein kann. Möglich ist auch die Verwendung von verzweigten Dentrimeren dieser Polymere.
Im Verfahrensschritt C) einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Zellkultursubstrats kann ein Substrat verwendet werden, dass mittels eines Sauerstoffplasmas aktiviert wurde und somit an der Oberfläche funktionelle Gruppen, beispielsweise Carboxylat-Gruppen, Keto-Gruppen oder Hydroxid-Gruppen aufweist, die mit den Aminogruppen des Polymers P reagieren können. Derartige Substrate sind besonders dazu geeignet, kovalente Bindungen zwischen dem Substrat und dem Polymer-Saccharid-Konjugat über die Aminogruppen des Polymers auszubilden. Zur Kupplung des Polymer-Saccharid-Konjugats mit dem Substrat wird das Konjugat in einem wässrigen Lösungsmittel aufgenommen und bevorzugt bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise 80 °C zur Kupplung mit dem Substrat in Kontakt gebracht. Bevorzugt wird das Polymer-Saccharid-Konjugat mit dem Substrat zeitnah nach der Aktivierung mit dem Plasma in Kontakt gebracht. Insbesondere kann das Polymer-Saccharid-Konjugat innerhalb von 2 bis 5 min nach der Plasmabehandlung des Substrats mit diesem gekoppelt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen unter Verwendung eines Zellkultursubstrats, wie oben beschrieben, mit den Verfahrensschritten:

1) Inkontaktbringen der adhärenten Zellen mit dem Zellkultursubstrat, wobei die Zellen über das Saccharid an das Zellkultursubstrat binden,
2) Kultivierung der Zellen mit dem Zellkultursubstrat in einem Zellkulturmedium,
3) Ablösen der Zellen vom dem Zellkultursubstrat durch Inkontaktbringen eines Saccharids mit den Zellen.

Das Inkontaktbringen der Zellen mit dem Saccharid kann vorteilhafterweise dadurch geschehen, dass das Zellkulturmedium in dem sich die adhärenten Zellen befinden gegen eine Lösung ausgetauscht wird, die das Saccharid enthält. Das Saccharid kann beispielsweise in einer isotonischen Salzlösung gelöst sein oder in einem zellfreien Zellkulturmedium.
Ein derartiges Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen erlaubt es besonders einfach im Verfahrensschritt 3) durch Verwendung eines Saccharids die Zellen vom Zellkultursubstrat abzulösen und zu „passagieren“. Zum Ablösen der Zellen vom Zellkultursubstrat im Verfahrensschritt 3) ist keine Behandlung der Zellen mit Enzymen, beispielsweise Trypsin oder eine Veränderung der Temperatur notwendig. Auch der pH-Wert des Zellkulturmediums muss nicht geändert werden, sodass die Zellen besonders schonend abgelöst werden, ohne dass der Zellmetabolismus oder die Proteinexpression in den adhärenten Zellen so stark beeinflusst wird, wie dies bei herkömmlichen Methoden zum „Passagieren“ der Fall ist.
Bevorzugt wird der Verfahrensschritt 3) dann eingeleitet, wenn im Verfahrensschritt 2), das Zellkultursubstrat weitgehend, z. B. zu etwa 70% bis 80% mit den adhärenten Zellen bewachsen ist. Dies kann beispielsweise mittels mikroskopischer Methoden festgestellt werden.
Weiterhin kann bei einer Variante des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens im Verfahrensschritt 3) das gleiche Saccharid verwendet werden, dass auch Bestandteil des Zellkultursubstrats ist. Beispielsweise kann Laktose zur Ablösung der adhärenten Zellen verwendet werden, wenn Laktose als Saccharid im Zellkultursubstrat an das Polymer P angebunden wurde. Analog können auch Maltose, Cellobiose oder Mannose verwendet werden, wenn diese Saccharide Bestandteil des Zellkultursubstrats sind. Diese Saccharide sind besonders kostengünstige Verbindungen, die es einfach und zuverlässig erlauben die adhärenten Zellen im Verfahrensschritt 3) vom Zellkultursubstrat abzulösen. Da die Bindung der adhärenten Zellen an das Zellkultursubstrat über das gleiche Saccharid erfolgt, das auch zur Ablösung der Zellen verwendet wird, kann ein Ablösen der Zellen besonders zuverlässig erreicht werden.
Alternativ können auch andere Saccharide zum Ablösen der adhärenten Zellen vom Zellkultursubstrat verwendet werden als die, die Bestandteil des Zellkultursubstrats sind. Das zur Ablösung verwendete Saccharid sollte jedoch in der Lage sein, die adhärenten Zellen kompetitiv vom Zellsubstrat abzulösen. Dazu empfiehlt es sich, zumindest diejenigen Monosaccharide zum Ablösen der adhärenten Zellen einzusetzen, die Bestandteil der Oligo- oder Polysaccharide sind, die im Zellsubstrat vorhanden sind. Enthalten beispielsweise die im Zellkultursubstrat eingebauten Oligo- oder Polysaccharide Galaktose- oder Mannose-Einheiten, so können auch Galaktose bzw. Glucose als Monosaccharide zum Ablösen der adhärenten Zellen verwendet werden.
Im Verfahrensschritt 3) kann das Saccharid in einer Konzentration von 5 mM bis 25 mM, bevorzugt 5 mM bis 10 mM zum Ablösen der adhärenten Zellen vom Zellsubstrat verwendet werden. Dazu wird das Saccharid bevorzugt in entweder PBS oder zellfreien Zellkulturmedium in diesen Konzentrationen gelöst und das vorhandene Zellkulturmedium einer Zellkultur gegen diese Lösung ausgetauscht, was zum Ablösen der Zellen vom Zellkulturgefäß führt. Bei diesen Konzentrationen kann einerseits zuverlässig ein Ablösen der adhärenten Zellen vom Zellkultursubstrat erreicht werden, andererseits aber auch osmotischer Stress für die adhärenten Zellen, der erst bei höheren Konzentrationen von etwa 100 bis 200 mM auftritt, vermieden werden.
Nach der Durchführung des Verfahrensschrittes 3) können die Verfahrensschritte 1) bis 3) nacheinander zyklisch wiederholt werden, um eine fortgesetzte Kultivierung der adhärenten Zellen über einen längeren Zeitraum hinweg zu ermöglichen.
In Abhängigkeit von der chemischen Struktur des Saccharids kann das erfindungsgemäße Zellkultursubstrat auch spezifisch für bestimmte Zelllinien sein, beispielsweise ist Laktose als Saccharid-Bestandteil des Zellkultursubstrats besonders gut für die Kultivierung von CHO-Zelllinien geeignet. HeLa-Zellen können besonders gut auf erfindungsgemäßen Zellkultursubstraten kultiviert werden, die als Saccharid-Bestandteil Mannan oder Maltose umfassen.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Verwendung des Zellkultursubstrats, wie oben beschrieben, zur Kultivierung von adhärenten Zellen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Kultivierung von adhärenten Zellen, umfassend:

- ein Zellkultursubstrat wie oben beschrieben, und
- ein Saccharid zum Ablösen der Zellen von dem Zellkultursubstrat.

Der Kit kann beispielsweise als kommerzielles Produkt in einer Verpackung für mögliche Kunden angeboten werden. Das Saccharid kann bereits als Lösung, insbesondere als Stocklösung in beispielsweise wässriger Lösung im Kit vorhanden sein. Als Zellkultursubstrat wird bevorzugt ein Zellkulturgefäß oder Polymer-Partikel verwendet, an die bereits das Polymer-Saccharid-Konjugat gebunden wurde. Diese Zellkulturgefäße oder Polymer-Partikel können zum sofortigen Einsatz auch bereits sterilisiert sein.
Weiterhin kann der Kit auch noch eine Bedienungsanleitung zur Durchführung eines Verfahrens zur Kultivierung von adhärenten Zellen, wie oben beschrieben, umfassen.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

1 ein Syntheseschema eines Polymer-Saccharid-Konjugats mittels einer reduktiven Aminierung unter Verwendung von NaBH₃CN.
2 beispielhafte funktionelle Gruppen die durch eine Sauerstoffplasma-Behandlung auf einer Polystyrol-Oberfläche gebildet werden können.
3 Möglichkeiten einer direkten, kovalenten Bindung zwischen dem Aminogruppen enthaltenden Polymer und Polystyrol als Substrat.
4 die Ergebnisse eines Laktatdehydrogenase-Assays zur Bestimmung der Zellintegrität bei adhärenten Zellen, die entweder mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder mittels einer Trypsin-Behandlung von Zellkulturplatten abgelöst wurden.
5 die Ergebnisse eines Fluoreszenztests zur Bestimmung einer Caspase als Nachweis der Zellintegrität bei adhärenten Zellen, die entweder mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder mittels einer Trypsin-Behandlung von Zellkulturplatten abgelöst wurden.
6 die Ergebnisse von Protein-SDS-Gelen und Western-Blots zur Bestimmung des Oberflächenproteins E-Cadherin auf der Oberfläche von adhärenten Zellen, die entweder durch Trypsin-Behandlung oder mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens von Zellkulturplatten abgelöst wurden.
7 Wachstumskurven für adhärente Zellen, die auf verschiedenen Zellkulturplatten kultiviert wurden.

1 zeigt eine beispielhafte Synthese eines Polymer-Saccharid-Konjugats ausgehend von dem Polymer PEI. Das Saccharid Laktose kann mittels reduktiver Aminierung mit NaBH₃CN direkt mit den Aminogruppen des PEG verknüpft werden, wobei sich einer der zyklischen Halbacetal-Einheiten der Laktose öffnet und lediglich die Galaktose weiterhin als zyklische Halbacetal-Form vorliegt und zur Bindung der adhärenten Zellen zur Verfügung steht.
2 zeigt die mittels eines Sauerstoffplasmas gebildeten funktionellen Gruppen auf der Oberfläche von Polystyrol. Insbesondere können Carboxylate gebildet werden, Hydroxid-Gruppen, sowie Keto-Gruppen. Weiterhin können auch radikalische Sauerstoffspezies gebildet werden. Diese Gruppen können mit den Aminogruppen des Polymers reagieren und eine dauerhafte kovalente Bindung eingehen.
3 zeigt derartige kovalente Bindungen zwischen einem beispielhaften Polystyrol-Substrat und den Aminogruppen des Polymers. Insbesondere können am AmidGruppen, Imin-Gruppen oder Amin-Gruppen gebildet werden.
Ausführungsbeispiele
Im Folgenden werden beispielhafte Synthesen einiger Polymer-Saccharid-Konjugate vorgestellt.
Lactose-PEI:
Polyethylenimin Lösung (Mn -60,000 GPC (Gelpermeations-Chromatographie), Mw -750,000 LS (light scattering spectroscopy), 50 wt. % in Wasser) (PEI, 20 g, 0.1667 mmol) und D-Lactose monohydrat (38.028 g, 105.5 mmol, 5 eq. pro ideale Wiederholungseinheit von PEI) werden in MeOH (70 mL) and 50 mM Natriumtetraborat Lösung (aq) (100 mL) gelöst und auf 60 °C erhitzt. Nach vollständigem Lösen der Komponenten wurde das System wieder abgekühlt und der pH-Wert mit Ameisensäure auf einen Wert von 3 eingestellt. NaBH₃CN (33.148 g, 527.5 mmol ,5 Äq. bezogen auf Lactose) wurde in MeOH (30 mL) gelöst und in 6 Portionen dem System zugegeben. Die Reaktion erfolgte für 2 h bei 60°C. Anschließend wurde das MeOH im Vakuum entfernt und die Lösung über eine Cellulosemembran (Ausschlussgrenze 10 kDa) dialysiert und gefriergetrocknet.
Maltose-PEI:
PEI (10.286 g; s.o.) und Maltose-Monohydrat (27.124 g, 75.28 mmol; 7.5 eq. pro ideale Wiederholungseinheit von PEI) werden in 35 mL MeOH und 5 mM Natriumtetraborat Lösung (aq) bei 60°C vollständig gelöst. Nach Abkühlen und Einstellen des pH-Wertes (s.o.) wurde eine Suspension von NaBH₃CN (16.5870 g, 263.96 mmol) in 15 mL MeOH portionsweise zugegeben. Die Reaktion erfolgte für 17 h bei 60°C. Anschließend wurde das MeOH im Vakuum entfernt und die Lösung über eine Cellulosemembran (Ausschlussgrenze 10 kDa) dialysiert und gefriergetrocknet.
Mannan-PEI:
500 mg Galactomannan (z.B. Johannisbrotkernmehl oder Guarkernmehl) werden in 49 mL H₂O unvollständig gelöst und 1 mL 1 M H₂SO₄ hinzugegeben. Die Lösung wird bei 600 W für 60 s in der Microwelle hydrolysiert und anschließend filtriert. Dies führt zu einer Hydrolyse des Galactomannans, wobei Polysaccharide mit 200 bis 300 Mannose-Wiederholeinheiten gebildet werden.
Das Filtrat wird mit 1 g PEI, 6 mL Eisessig und 664 mg NaBH₃CN versetzt für 3 h bei 60 °C gerührt. Anschließend wird die Lösung über eine Cellulosemembran (Ausschlussgrenze 10 kDa) dialysiert und gefriergetrocknet.
Plasmabehandlung des Substrats und Bildung des Zellkultursubstrats:
Das Zellkultursubstrat, beispielsweise Zellkulturplatten können folgendermaßen mit einem Sauerstoffplasma handelt werden:

Unbehandelte 24-Well Polystyrolplatten werden bei 150 W für 90 Sekunden mit Sauerstoffplasma im Vakuum (0,2 mbar) aktiviert und im Anschluss in die Wells jeweils 500 µL einer 1 mg/mL wässrigen Lösung der PEI-Derivate (Polymer-Saccharid-Konjugate) gegeben. Die Platten wurden für 2 h bei RT inkubiert, mit Wasser gewaschen und für eine Stunde bei 80°C abgedeckt erhitzt. Im Anschluss sind die Platten als erfindungsgemäße Zellkultursubstrate direkt für den Einsatz in der Zellkultur geeignet.

Zellkultur auf glykopolymerbeschichteten 24-Well Platten als erfindungsgemäßen Zellkultursubstrat:
Medien:

CHO- K1 Zellinien: Ham's F12 mit 10% (v/v) FKS (FKS = fötales Kälberserum) HEK293 und HeLa-Zellinien: DMEM mit 10% (v/v) FKS und 2% Glutamin

Die Inkubation erfolgte bei 37 °C und einem CO₂ Gehalt von 5 % in der Atmosphäre. Üblicherweise werden 0,05-1×10⁶ Zellen/mL (500 µL) in die Wells gegeben. Das Passagieren erfolgt durch Ersetzen des Mediums mit 500 µL einer 5-50 mM Lösung des jeweiligen Zuckers in PBS oder Medium und einer Inkubationszeit von 15-30 Minuten bei Raumtemperatur oder 37 °C. Je nach PEI-Derivat kann eine Zelllinienspezifität erreicht werden. Z.B. sind PEI-Lactose Oberflächen gut geeignet für CHO-Zelllinien. HeLa Zellen bevorzugen Mannan-PEI oder Maltose-PEI.
Tests zur Bestimmung der Zellintearität:
Im Folgenden werden die Ergebnisse einiger Tests zur Bestimmung der Zellintegrität nach dem Ablösen der adhärenten Zellen vom Zellsubstrat gezeigt. Dabei werden adhärente Zellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens von einem erfindungsgemäßen Zellsubstrat abgelöst wurden, mit adhärenten Zellen verglichen, die mittels einer Trypsin-Behandlung von herkömmlichen, mittels eines Plasmas oberflächenmodifizierten Zellkulturplatten abgelöst wurden. Bei den Zellen handelt es sich um CHO-1 Zellen, die auf Polystyrol-Petrischalen mit PEI-Lactose kultiviert wurden.
Laktatdehydrogenase-Assay zur Bestimmung der Zellintearität:
Laktatdehydrogenase (LDH) wird bei der Beschädigung der Plasmamembran von verschiedenen adhärenten Zellen in das Zellkulturmedien freigesetzt. Die freigesetzte LDH kann durch eine gekoppelte enzymatische Reaktion quantifiziert werden. Zunächst katalysiert LDH die Umwandlung von Laktat in Pyruvat durch die Reduktion von NAD⁺ zu NADH. Anschließend dient das NADH dazu, ein Tetrazoliumsalz durch das Enzym Diaphorase zu einem roten Formazan-Produkt zu reduzieren. Die gebildete Menge an Formazan, die bei einer Wellenlänge von 490 nm bestimmt wird, ist direkt proportional zur Menge der freigesetzten LDH im Medium. Der Laktatdehydrogenase-Assay wurde mit einem kommerziell erhältlichen Kit „Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit“ (Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt.
4 zeigt ein Balken-Diagramm, bei dem auf der y-Achse die Differenz zwischen der Absorption bei 490 nm (Absorption von Formazan) und der Absorption bei 680 nm (Hintergrundsignal des Instruments) aufgetragen ist. Auf der x-Achse sind verschiedene Arten der Ablösung der adhärenten Zellen vom Zellsubstrat durch unterschiedliche Konzentrationen von Laktose (10 mM, 25 mM, 50 mM und 200 mM) im Vergleich zu einem herkömmlichen Verfahren, der Trypsin-Behandlung aufgelistet.
Deutlich ist in der 4 zu erkennen, dass die Laktatdehydrogenase-Aktivität im Zellkulturmedium bei den Zellen, die mit Trypsin behandelt wurden, deutlich größer ist als bei den adhärenten Zellen, die mit Laktose behandelt wurden. Dies zeigt deutlich, dass bei der vorliegenden Erfindung die Zellintegrität weniger beeinträchtigt wird als bei der Trypsin-Behandlung.
Caspase-Assay zur Bestimmung der Zellintearität:
Bei einem Fluoreszenz-basierten Caspase 3/7 Assay wird die Apoptose (programmierter Zelltod) durch die Detektion einer Caspase in Zellkulturen gemessen. Dazu wird ein Caspase-3/7 grünes Detektionsreagenz eingesetzt, das ein Peptid mit vier Aminosäuren (DEVD) mit einer Spaltstelle für Caspase-3/7 ist, das an einen nukleinsäurebindenden Farbstoff konjugiert ist. Der Farbstoff ist nicht fluoreszierend, solange er an das Peptid konjugiert ist. Nach Spaltung des Peptids durch die Caspase wird der Farbstoff aktiviert, bindet an DNA und kann mit einem Anregungs-/Emmissionsmaximum von ca. 502/530 nm mittels Fluoreszenz detektiert werden.
5 zeigt ein Balken-Diagramm bei dem die Fluoreszenz des Caspase-3/7 grünen Detektionsreagenzes für HeLa-Zellen aufgetragen ist, die unterschiedlichen Behandlungen für jeweils 30 Minuten (schwarze Balken) und 24 Stunden (helle Balken) unterzogen wurden. Der Assay wurde mit dem Kit „CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent“ (Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt.
Die im Diagramm mit „Medium“ und „PBS“ beschrifteten Balken zeigen die Caspase-vermittelte Fluoreszenz von Zellen, die jeweils nur mit dem Zellkulturmedium bzw. PBS („Phosphate Buffered Saline“) gewaschen wurden und daher keinerlei Zellstress ausgesetzt waren. Die mit „Staurosporine [10µM]“ beschrifteten Balken zeigen die Caspase-vermittelte Fluoreszenz von Zellen, die mit Staurosporine behandelt wurden, einem Breitband-Kinase-Inhibitor, der Apoptose in vielen Zellen auslöst. Die Caspase-vermittelte Fluoreszenz von HEK-Zellen, die einer Trypsin Behandlung unterzogen wurden ist mit „Trypsin-EDTA [0,5 und 20 %/0,02 %]“ gekennzeichnet. Weiterhin ist die Caspase-vermittelte Fluoreszenz von Zellen, die auf einem erfindungsgemäßen Zellkultursubstrat kultiviert wurden und dann durch Zugabe eines Saccharids, nämlich 10 mM Mannose, 25 mM oder 50 mM Mannose abgelöst wurden, gezeigt.
Die Caspase-vermittelte Aktivität der keinem Zellstress ausgesetzten Zellen ist vergleichbar mit der Aktivität der Caspase in adhärenten Zellen, die mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens kultiviert und abgelöst wurden. Im Gegensatz dazu ist die Caspase-vermittelte Aktivität bei Zellen, die einer Trypsin-Behandlung unterzogen wurden erheblich erhöht. Die experimentellen Daten der 5 zeigen deutlich, dass bei einem erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahren, bzw. bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Zellkultursubstrats die Zellintegrität gegenüber einer Trypsin-Behandlung verbessert ist.
6 zeigt den Nachweis des Proteins E-Cadherin, eines Transmembran-Glykoproteins in Zellen, die den gleichen Bedingungen wie in der 5 dargestellt, ausgesetzt wurden. Während der Trypsin-Behandlung wurde auch E-Cadherin verdaut, sodass dieses Protein im SDS-Proteingel nicht mehr nachweisbar ist. Bei den mittels Laktose abgelösten Zellen ist die Bande für E-Cadherin ähnlich wie bei dem mit Medium oder PBS behandelten Zellen noch deutlich zu sehen, was für eine hohe Zellintegrität spricht. Dies zeigt, dass durch die Trypsin-Verdauung auch für den Zellmetabolismus wichtige Oberflächenproteine beeinträchtigt werden, während dies bei der vorliegenden Erfindung nicht der Fall ist.
7 zeigt die Wachstumskurve von CHO-1-Zellen auf verschiedenen Zellkulturgefäßen. Die CHO-Zellen, die auf einem erfindungsgemäßen Zellkultursubstrat (Polystyrol-Petrischalen mit PEI-Lactose) kultiviert wurden, zeigen dabei ähnliche Wachstumskurven wie Zellen, die in herkömmlichen Zellkulturgefäßen (mit „Standard“ beschriftete Wachstumskurve) kultiviert wurden. Die als „untreated“ (unbehandelt) bezeichnete Wachstumskurve zeigt das Wachstum der Zellen auf unbehandelten Zellkulturplatten, die auch als Substrat für das erfindungsgemäße Zellkultursubstrat in diesem Experiment verwendet wurden. Die mit „O₂ Plasma“ bezeichnete Kurve zeigt das Wachstum auf Zellkulturplatten die plasmabehandelt wurden, an die aber nicht das Polymer-Saccharid-Konjugat gebunden wurde.
Die Erfindung ist nicht durch die Beschreibung anhand der Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr umfasst die Erfindung jedes neue Merkmal sowie jede Kombination von Merkmalen, was insbesondere jede Kombination von Merkmalen in den Patentansprüchen beinhaltet, auch wenn dieses Merkmal oder diese Kombination selbst nicht explizit in den Patentansprüchen oder Ausführungsbeispielen angegeben ist.

Claims

Zellkultursubstrat zur Kultivierung von adhärenten Zellen, umfassend - ein Substrat (S), - ein Aminogruppen aufweisendes, an das Substrat gebundenes Polymer (P), und - ein Saccharid (Z) mit zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten zur Anbindung der adhärenten Zellen, - wobei das Saccharid (Z) kovalent über die Aminogruppen mit dem Polymer (P) verbunden ist.
Zellkultursubstrat nach Anspruch 1, wobei das Saccharid eine offenkettige Monosaccharid-Einheit aufweist und über diese Monosaccharid-Einheit mit einer sekundären Amingruppe des Polymers (P) verbunden ist.
Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei das Saccharid ein Oligosaccharid oder Polysaccharid mit 2 bis 500 Monosaccharid-Wiederholeinheiten, bevorzugt 2 bis 20 Monosaccharid-Wiederholeinheiten, weiter bevorzugt 2 bis 10 Monosaccharid-Wiederholeinheiten, weiter bevorzugt ein Disaccharid ist.
Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei das Substrat Glas oder einen Kunststoff umfasst oder daraus besteht.
Zellkultursubstrat nach dem vorhergehenden Patentanspruch, wobei das Substrat kovalent mit den Aminogruppen aufweisenden Polymer verbunden ist.
Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei das Polymer Poly(ethylenimin) (PEI) oder Poly(amidoamin) (PAMAM) umfasst oder daraus besteht.
Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche umfassend oder aufweisend die folgende Struktur der allgemeinen Formel I:
- wobei S das Substrat, P das Polymer mit daran gebundenem Saccharid und A eine das Polymer P und das Substrat S verknüpfende Gruppe darstellen, - wobei der Parameter x die Anzahl der Wiederholeinheiten im Polymer P ist, - wobei das Polymer P Wiederholeinheiten umfasst, die ausgewählt sind aus einer Gruppe der Wiederholeinheiten mit den allgemeinen Formeln A bis F:

- wobei Z das Saccharid darstellt, und die Parameter jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen sind und a, b, c, d, e und f die Anzahl der jeweiligen Wiederholeinheiten im Polymer P sind, wobei gilt a+b+c+d+e+f =x, und die mit „*“ markierten Positionen die Anknüpfungsstellen der Wiederholeinheiten an weitere Wiederholeinheiten im Polymer P darstellen bzw. bei terminalen Wiederholeinheiten die Anknüpfung an die Gruppe A oder an die terminale Aminogruppe -NH₂ in der allgemeinen Formel I.
Zellkultursubstrat nach dem vorhergehenden Patentanspruch, wobei die das Polymer P und das Substrat S verknüpfende Gruppe A ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen:
- wobei mit „*“ markierten Positionen die Anknüpfungsstellen der Gruppe A an das Polymer P und das Substrat S darstellen.
Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei das Saccharid Z ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen mit den Formeln G bis J:

- wobei die Parameter g, i und j unabhängig voneinander eine natürliche ganze Zahl zwischen 0 und 400, bevorzugt 0 bis 300, weiter bevorzugt 0 bis 10, bzw. 0 sind, und - wobei die mit „*“ markierten Positionen die Anknüpfungsstellen des Saccharids Z an das Polymer P darstellen.
Zellkultursubstrat nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, ausgebildet als Zellkulturgefäß oder als Partikel.
Verfahren zur Herstellung eines Zellkultursubstrats mit den Verfahrensschritten: A) Bereitstellen eines Aminogruppen aufweisenden Polymers (P) und eines Saccharids (Z) mit zumindest zwei Monosaccharid-Einheiten, B) Bildung eines kovalenten Konjugats zwischen dem Polymer (P) und dem Saccharid (Z), C) Verknüpfen des Konjugats mit einem Substrat (S).
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei im Verfahrensschritt A) ein reduzierendes Saccharid (Z) bereitgestellt wird, und im Verfahrensschritt B) das kovalente Konjugat mittels reduktiver Aminierung gebildet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 11 oder 12, wobei im Verfahrensschritt A) ein synthetisches Polymer bereitgestellt wird, bevorzugt Poly(ethylenimin) (PEI) oder Poly(amidoamin) (PAMAM), die auch verzweigt sein können.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 11 bis 13, wobei im Verfahrensschritt C) ein Substrat verwendet wird, das mittels eines SauerstoffPlasmas aktiviert wurde.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei im Verfahrensschritt C) kovalente Bindungen zwischen dem Substrat und dem Polymer-Saccharid-Konjugat über die Aminogruppen des Polymers (P) gebildet werden.
Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen unter Verwendung eines Zellkultursubstrats nach einem der Ansprüche 1 bis 10, mit den Verfahrensschritten: 1) Inkontaktbringen der adhärenten Zellen mit dem Zellkultursubstrat, wobei die Zellen über das Saccharid an das Zellkultursubstrat binden, 2) Kultivierung der Zellen mit dem Zellkultursubstrat in einem Zellkulturmedium, 3) Ablösen der Zellen vom dem Zellkultursubstrat durch Inkontaktbringen eines Saccharids mit den Zellen.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei im Verfahrensschritt 3) das gleiche Saccharid verwendet wird, das Bestandteil des Zellkultursubstrats ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 16 oder 17, wobei das Saccharid im Verfahrensschritt 3) in einer Konzentration von 5 bis 25 mM verwendet wird.
Verwendung eines Zellkultursubstrats nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Kultivierung von adhärenten Zellen.
Kit zur Kultivierung von adhärenten Zellen, umfassend: - ein Zellkultursubstrat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, und - ein Saccharid zum Ablösen der Zellen von dem Zellkultursubstrat.
Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, zusätzlich umfassend: - eine Bedienungsanleitung zur Durchführung eines Verfahrens zur Kultivierung von adhärenten Zellen nach einem der Ansprüche 16 bis 18.