EP3946732A1 - Mikrotropfenrückhalteanordnung - Google Patents

Mikrotropfenrückhalteanordnung

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Publication number
EP3946732A1
EP3946732A1 EP20707555.7A EP20707555A EP3946732A1 EP 3946732 A1 EP3946732 A1 EP 3946732A1 EP 20707555 A EP20707555 A EP 20707555A EP 3946732 A1 EP3946732 A1 EP 3946732A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microdroplet
microchannel
retention
retention arrangement
drops
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20707555.7A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Henkel
Günter Mayer
Elmar Herbst
Karina WEBER
Anett Reichert
Theresa Heckmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV
Original Assignee
Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV filed Critical Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV
Publication of EP3946732A1 publication Critical patent/EP3946732A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502746—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means for controlling flow resistance, e.g. flow controllers, baffles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0684—Venting, avoiding backpressure, avoid gas bubbles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions

Definitions

  • the invention relates to a microdroplet retention arrangement, a method for operating and the use of this arrangement according to the preamble of the claims, in particular for microfluidic systems.
  • WO 2010036352 A1 a system is known which allows the separation of sample components by dividing them into droplets or other components, amplifying or otherwise reacting the components within the droplets, detecting the amplified components or properties thereof and / or analyzing the resulting Data enables.
  • the main area of application of the system is the polymerase chain reaction.
  • the system comprises a droplet generator which is configured to generate droplets which contain parts of a sample to be analyzed, the droplets being arranged in an immiscible fluid that forms a sample emulsion, a heating and cooling station with a fluid inlet and a fluid outlet, a detection point downstream of the heating and cooling station, a channel that forms a continuous fluid path from the fluid inlet to the fluid outlet of the heating and cooling station, a pump for moving the sample emulsion through the channel, a controller that programs to operate fluid transport through the channel and an analyzer configured to process data collected at the sensing station.
  • a droplet reservoir can be provided, the first fluid line connecting the droplet generator to the reservoir, and a second fluid line which connects the reservoir to the fluid inlet of the heating and cooling station.
  • the controller can be programmed to set the droplet generator to change the droplet size based on data received from the detection station.
  • One design of the system includes: • at least one droplet generator that forms a plurality of emulsions including droplets each containing a sample partition prepared as a reaction mixture for amplification of a nucleic acid target,
  • a detection arrangement for detecting signals from intact droplets of the emulsions; and a controller in communication with the detection arrangement and programmed to estimate a presence of the nucleic acid target in a sample, if any, based on signals detected from the intact droplets.
  • the droplet generator is a capillary gap chamber which is provided with valves that can be controlled.
  • DE 101 04 323 A1 discloses a method for producing a groove with a constriction in the surface of a component by etching.
  • groove sections spaced apart from one another are produced by isotropic etching.
  • a groove piece with a relatively narrow cross-section is produced between the groove sections by further etching, which connects the two groove sections with one another to form a constriction, so-called Throttle point, connects.
  • an etching mask with two spaced-apart etching openings is etched isotropically until the partially penetrate formed groove sections on the front side to form a narrow point.
  • a fluid plate that can be produced by bonding the two components using two silicon wafers with grooves produced according to the method, the grooves having an inner channel that forms a throttle point so that there - for example by integrated pressure sensors - The pressure difference is detected at the throttle point and thus measured variables for determining the flow can be obtained in a simple manner.
  • the bottleneck so-called Throttle point, according to this technical teaching, is used to generate a measurable pressure difference to determine the flow of a fluid flow and it is not suitable for removing air bubbles from the fluid flow, storing drops in a chamber or driving them out of the chamber.
  • WO 2018/186 881 A1 discloses an inertia pump. This
  • Inertia pump can include a microfluidic channel, a fluid actuator in the microfluidic channel, and a check valve in the microfluidic channel.
  • the check valve may include a movable valve element, a narrowed channel segment that is disposed upstream of the movable valve element, and a blocking element that is formed in the microfluidic channel downstream of the movable valve element.
  • the narrowed channel segment can have a width smaller than a width of the movable valve element, so that the movable valve element can block the flow of fluid through the check valve when the movable valve element is positioned in the narrowed channel segment.
  • the blocking element can be configured such that the blocking element restricts the movable valve element within the check valve and at the same time allows the flow of fluid when the movable valve element is positioned against the blocking element.
  • US 2003/0121644 A1 discloses a thermal mass transport device that uses microchannels and micropumps in order to achieve a thinner design and thus to achieve a higher thermal conductivity.
  • the thermal mass transfer device has a structure in which the microchannels for passage of a coolant and the micropumps for transportation of the coolant form a single unit.
  • a channel layer in which the microchannels are formed and a pump layer in which the micropumps are arranged can be laminated in a multilayer structure.
  • the thermal mass transport device is designed to be flexible in such a way that the microchannels and micropumps are implemented on a resin substrate using flexible material. It can also be provided here that the heat mass transport device has a section of the microchannel which represents a constriction in a closed circuit of the microchannel and the micropump.
  • US 2016/0193605 A1 discloses isolating or identifying a cell in a cell suspension for differentiating tumor cells from non-tumor cells based on a physical property of these cells and guiding the cell suspension through a microfluidic channel that contains a constriction and guiding the cell suspension through allows this narrowing.
  • the constriction according to this technical teaching can be dimensioned in such a way that it deforms a relatively larger cell in preference to a relatively smaller cell.
  • the microfluidic system comprises a microfluidic channel through which a tumor cell suspended in a buffer can pass and which is narrowed in comparison to a non-tumor cell, this narrowing of the microfluidic channel serving to deform the cells in which the Constriction is dimensioned so that it deforms a tumor cell preferably more than a non-tumor cell.
  • DE 20 2012 013 668 U1 discloses a method for quantifying an amount of enzyme molecules which, for example, uses a device for the formation of drops.
  • This device has an inlet channel, an outlet channel and two carrier fluid channels. The channels meet at a junction.
  • the inlet channel directs a sample liquid to the node.
  • the carrier fluid channels conduct a carrier fluid, which is immiscible with the sample fluid, to the node.
  • the inlet channel narrows at its distal portion, where it connects to the junction.
  • the inlet channel is oriented at right angles to the carrier liquid channels. Drops are formed when the sample liquid flows from the inlet channel to the node, where the sample liquid interacts with the flowing carrier liquid which is supplied to the node via the carrier liquid channels.
  • the outlet channel receives the drops of the sample liquid which are surrounded by the carrier liquid.
  • US 2010/0252118 A1 discloses microfluidic structures and a method for manipulating liquids, fluid components and reactions, such structures and the method enabling the production of droplets with a precise volume, which can be stored in certain areas of the device.
  • the microfluidic structures and the process are designed in such a way that they can accommodate components (e.g. biological cells) in an arrangement and position them in order to manipulate and observe them.
  • the drop flows in a flow path in one direction in that it is carried by a carrier fluid which flows in the same direction.
  • the droplet flows due to its lower flow resistance in this flow path relative to the other flow path with a fluid restriction area, e.g. a narrow fluid path section and / or an area with a smaller cross-sectional area than the fluid path section contains, see above that the drop can no longer flow through the microfluidic network.
  • the droplet is in an area, e.g. a "microtub” or a "chamber" of the microfluidic network positioned.
  • the drop is held in an area, although the carrier fluid continues to flow in the microfluidic network. It is generally stated that any suitable fluid path that has a higher hydrodynamic drag and / or a smaller cross-sectional area for fluid flow can be used as the fluid restriction area.
  • a fluid restriction area in the form of a narrow fluid path or a channel with the same dimensions as the flow path, in which an obstacle in the form of a valve is arranged, is mentioned as an example.
  • the fluid restriction area is a porous membrane, semi-permeable plug (e.g., gel), valve, or other structure.
  • a microfluidic network can be provided that has a fluid restriction area in the form of a narrow opening through which the droplet cannot flow due to a high hydrodynamic resistance.
  • the droplet bypasses the liquid restriction area and flows into a different fluid path.
  • This reversal of the flow in the Microfluidic network the droplets can be removed one after the other from this area of the microfluidic network in which they were previously.
  • the disadvantage of this technical solution is that different fluidic components are provided for realizing the individual functionalities, such as, for example, the removal of bubbles, the retention of drops and the expulsion of drops from the storage element
  • US 2018/0003611 A1 discloses a device (a biological test chip) with a microfluidic channel structure formed on a substrate, with a fluid actuator located in the channel, which separates biological target particles in the fluid flow for counting in a detection area, the chip specifically comprising the following components:
  • a microfluidic channel structure which is formed on the substrate and includes a first channel
  • an exclusion structure upstream of the sensor area to exclude biological particles that are larger than the volume of the sensor area
  • US 2011/0275143 A1 discloses a platform for the analysis of individual cells or molecules in a liquid which comprises the following components:
  • a detection or measuring device which is used to detect or measure a property of the cell or the molecule which is contained in the drop or the bubble
  • a fluidic bubble logic screening device for screening the cell or the molecule contained in the droplet or the bubble according to the detected or measured property in order to identify at least one selected cell or a selected molecule
  • a fluidic bubble logic routing circuit for routing the selected cell or molecule contained in the droplet or bubble from a sieve device to a storage element.
  • the object of the present invention is to provide a microdroplet retention arrangement and a method for operating this in a microfluidic system, which avoid the aforementioned disadvantages of the prior art and in particular a retention of sample drops at low volume flows, a central expulsion of sample drops at medium flow rates Volume flows and at the same time allows air bubbles to pass through.
  • the essence of the invention is that in a monolithically produced, integrated microfluidic arrangement based on a chip, which for example corresponds to the technical teaching of WO 2010/036352 A1, instead of the known valves, at least one microdroplet retention arrangement with a special geometry in one microfluidic channel is arranged.
  • the storage chamber is delimited on the inlet and outlet side by retaining structures implemented as three-dimensional geometric arrangements.
  • the inlet side denotes the side of the retention structure on which small drops are retained.
  • On the outlet side denotes the Side of the retention structure from which air bubbles and drops leave the structure at higher flow rates.
  • the wall running into the narrowed point of the microchannel and the wall running out of the narrowed point of the microchannel are each designed in a concave (i.e. inwardly curved) shape of the microchannel, the concavity being the same or different.
  • the course of the wall of the microchannel at its narrowing corresponds approximately or exactly to a concave or strictly concave function.
  • a function is concave if its graph lies above each line connecting two of its points. This is synonymous with the fact that the hypograph of the function, i.e. the set of points below the graph, is a convex set.
  • a real-valued function f: C—> R which is defined on a concave subset C of a real vector space, is called concave if for all x, y in C and for all t e [0,1] it holds that
  • the wall In the case of the concave or strictly concave course of the wall of the microchannel at its narrowing towards the passage and away from the passage, the wall is designed to narrow or widen with a continuously uniform course.
  • the narrowing of the microchannel formed at the passage is designed such that the length of the passage in the flow direction of the channel is very short to almost point-like.
  • the edge of the constriction at the passage is rounded, i.e. it must not be square.
  • These retention structures serve for the orderly storage of drops in a storage chamber and the avoidance of an undesired escape of drops from the storage chamber as well as the handling of undesired air bubbles.
  • the retention structure In order to fill the storage chamber with sample drops, the retention structure enables drops to be stored in the storage chamber, in which they are retained.
  • the retention structure For the emptying of the sample drops stored in the storage chamber, the retention structure enables them to leave the storage chamber as a linear sequence of evenly spaced drops in the channel center of the microchannel serving as an outlet.
  • Low volume flows are used to store the drops in the storage chamber.
  • High volume flows are used to drive out air bubbles with high interfacial tension and low viscosity.
  • Medium volume flows are used to expel the sample drops as a centrally guided, uniformly spaced sequence of drops.
  • the height HR of the restraint structure is approx. HR 2/3 * HC.
  • the retaining structure is formed by two substructures which are mirror-symmetrical with respect to the vertical main plane of the channel in the flow direction and are spaced apart from one another.
  • the smallest distance AT MIN between the substructures is AT MIN-HC / 3.
  • the substructures facing the middle of the channel are rounded with a radius RI of 121 HR.
  • the length of the retention structure in the flow direction increases towards the delimiting sidewalls.
  • This part of the geometry can be described by an arc with a radius R2 with E2 N 0.6 * WC.
  • the retaining structure designed in this way can be produced entirely using a two-stage etching process (photolithography + plasma etching in silicon) and then transferred by means of galvanic molding into an injection molding tool for cost-effective mass production, e.g. monolithically produced integrated microfluidic components and systems with retaining structure (s) .
  • the restraint structure designed in accordance with the above-mentioned geometric specifications has three functionalities that can be switched by the strength of the volume flows of the liquid medium in the microchannel:
  • High volume flows are used for the passage of air bubbles through the retention structure.
  • air bubbles are characterized by a high interfacial tension, a high volume and a low viscosity. Due to the hydrodynamic forces, the air bubble is positively locked into the Pressed retention structure. It can overcome this in the area of the central aperture. During the subsequent passage, a constriction of the air bubble forms in the area of the central opening. This bottleneck must be interpreted as the preferred position for fragmentation of the air bubble.
  • this structure is alternatively defined by a capillary channel deviating from the retention structure according to the state of the art, the fragmentation generates small air bubbles which can no longer pass through the structure and which become the desired functionality for retaining small sample drops or their controlled passage (expulsion) not trained.
  • the first incoming sample drop is transported to the center of the channel by the resulting hydrodynamic forces and closes the opening located there due to the interface forces generated by its interfaces.
  • the hydrodynamic forces formed by the flowing carrier fluid exceed the forces required for a drop to pass through the central area of the restraint structure.
  • drops can pass and become the opening arranged in the central area at the same time passed through the fluid flowing over the retaining structure in the middle of the channel.
  • the interfacial forces generated by the interfacial tension of the sample drop are overcompensated for by the hydrodynamic forces of the flowing carrier fluid.
  • a capillary gap chamber known per se is delimited on one or both sides by the retaining structures.
  • the geometrically designed retention structures for drops always use the interplay of hydrodynamic forces with the forces generated by interfaces.
  • a mathematical description of these phenomena is given by the Navier-Stokes balance equation for "Body Forces", known to the person skilled in the art, in the context of the constructive boundary conditions of the retention structure.
  • the aim is the identification and optional separation of drops whose material composition meets the criteria specified by the user.
  • the criterion is the formation of an optical Method of readable marker in the volume of the sample drop for use. These methods are known to those skilled in the art as digital drop-based assays.
  • a suspension of sample drops with different material compositions is generated using a drop generator as a suspension of the sample fluid in a carrier fluid that cannot be mixed with it.
  • This suspension of sample drops is stored in the capillary gap chamber (storage chamber) delimited by the retention structures.
  • the drops corresponding to the target properties are identified using optical spectroscopic or imaging methods and their number is determined.
  • the intended result of the initial population analysis is the number of drops in relation to the total number of drops.
  • the sample drops from the capillary gap chamber (storage chamber) are then fed to a sorting structure for the separation and extraction of the sample drops corresponding to the target criteria. For this it is absolutely necessary to transport them in the middle of the outlet duct.
  • the drops corresponding to the target criteria are obtained for subsequent recovery and analytical evaluation of the content.
  • the system with the droplet retention arrangement enables sample components to be separated by dividing them into droplets, amplifying or otherwise reacting the components within the droplets, detecting the amplified components or properties thereof in the droplets, and / or analyzing the resulting data.
  • the advantage of the present technical solution compared to the solution disclosed in WO 2010/036352 A1 is that, in the case of the drop retention arrangement, the strength of the volume flow of the liquid medium in the microchannel three functionalities can be switched and the previously known valves can be dispensed with.
  • the droplet retention arrangement enables sample droplets to be retained in the case of low volume flows, a central expulsion of sample droplets in the case of medium volume flows and, at the same time, the passage of air bubbles in the case of strong volume flows.
  • This technical solution improves the reliability and manageability of monolithically integrated chip systems for performing digital, drop-based microfluidic assays.
  • sample drops are generated as a suspension in a carrier fluid that is immiscible with the sample liquid, stored in a capillary gap chamber and incubated. After completion or during the incubation, the drops are a.
  • a carrier fluid that is immiscible with the sample liquid
  • Microdroplet retention arrangements in integrated microfluidic chip systems are flow analysis in monolithically integrated or modular arrangements, stationary storage and incubation of droplets in the form of monolithically integrated or modular arrangements.
  • the microdroplet retention arrangement limits the capillary gap chamber in the integrated chip systems for the incubation of the sample drops on both the inlet and outlet sides and prevents the sample drops from escaping during filling and incubation.
  • microfluidic sorting structures can be integrated on the outlet side of the capillary gap chamber will. Examples of such microfluidic sorting structures are already known from the prior art. The prerequisite for the applicability of these structures is that the drops are fed into the sorting structure as a uniformly spaced sequence of drops in the center of the inlet channel of the sorting structure. This task is also covered by the microdroplet retention arrangement.
  • microdroplet retention arrangement thus extends the functional scope of known integrated microfluidic chip systems for performing digital, drop-based assays.
  • Microdroplet retention assembly only require two different channel heights.
  • the overall system can thus be produced using established, two-stage structuring processes.
  • Fig. La a schematic, laterally inclined plan view of a
  • Fig. Lb a schematic sectional view of the microdroplet retaining arrangement according to Fig. La along the channel in a plan view with planes A, B and C,
  • Fig. 2a a schematic sectional view along plane A of
  • FIG. 2b a schematic sectional illustration along plane B of FIG
  • FIG. 2c a schematic sectional illustration along plane A of FIG
  • Microdroplet retention arrangement according to Fig. Lb, 3a-d a schematic representation of four variants of the geometry of the retention structure of the microdroplet retention arrangement according to FIG.
  • FIG. 4 the schematic representation of a microdrop retention arrangement according to FIG. 1b in a microfluidic
  • FIG. 5 a detailed, enlarged cross-section of a detail from FIG. 4.
  • Embodiment 1 :
  • the microdroplet retention arrangement (1) shown in Fig.la and Fig. Lb and Figs. 2a to c is designed in the form of a ford in a microchannel (3) as a constriction of the microchannel (3) with a passage (4) for liquids as a flow constriction .
  • the wall (ew) running into the narrowed point of the microchannel and the wall (aw) running out of the narrowed point of the microchannel (3) are each designed in a concave (ie inwardly curved) shape of the microchannel (3) Concavity can be the same or different.
  • the wall (w) of the microchannel (3) With the approximately concave course of the wall (w) of the microchannel (3) at its constriction towards the passage (4) and away from the passage (4), the wall (w) can meander uniformly or unevenly in long, flat or short, strong wave shapes or else be designed stepped (not shown in Fig. 1).
  • the narrowing of the microchannel (3) formed at the passage (4) is designed so that the length of the passage (4) in the flow direction of the microchannel (3) is very short to almost point-shaped.
  • the edge of the constriction at the passage (4) is rounded, i.e. it must not be square.
  • Shape of the wall (w) of the microchannel (3) of the retention structure (111) is less than the height of the channel section opening into / outgoing into the retention structure (111).
  • the height transition is expediently designed as a step with a flank angle between 30 and 120 °.
  • the retaining structure (111) is equipped with a passage (4) in the middle of the channel.
  • This passage (4) expediently has the same channel height as the channel section opening into / outgoing into the retaining structure (4).
  • the hydrodynamic resistance caused by the barrier has a maximum value at the transition to the side walls of the microchannel (3) and decreases towards the center of the channel.
  • the shape of the barrier on the inlet side approximates the geometry of the front side of an air bubble that completely fills the microchannel (3) - generally an arc of a circle or an ellipse.
  • the outlet-side geometry can be adjusted, taking into account the following points:
  • the total height of the retaining structure (111) integrated into the microchannel (3) is less than the height of the channel section opening into / outgoing into the retaining structure (111).
  • This passage (4) expediently has the same channel height as the channel section opening into / outgoing into the retaining structure (111).
  • FIG. 3 Examples of the geometric design of the retaining structure (111) are shown in FIG. 3.
  • a steady line layout is advantageous for the design of the geometry. If necessary, this can be approximated using polygon lines. This is particularly true for production using photolithography, in which the geometries on the photo-lithography masks used are usually generated by linking / lining up polygons. Dimensioning of the retention structure (111):
  • the width of the channel running into the retaining structure (111) is in the range from 120 to 1200 ⁇ m.
  • the height of the channel running into the retaining structure (111) is in the range from 10 to 400 gm.
  • the microchannel (3) is in the range from 20 to 1200 ⁇ m and preferably corresponds to the width of the microchannel (3) running into the retaining structure (111). The height of the drainage from the retention structure (111)
  • the microchannel (3) is in the range from 10 to 400 ⁇ m and preferably corresponds to the height of the microchannel (3) entering the retaining structure (111).
  • the height of the barrier structure is at least 0.1 * height of the microchannel (3) entering the restraint structure (111) and a maximum of 0.9 * height of the microchannel (3) entering the restraint structure (111)
  • the minimum width of the passage (4) is at least 0.5 * height of the barrier structure and a maximum of 2.0 * height of the channel running into the retention structure (111).
  • High volume flows in which large air bubbles pass through the structure are 100 - 500 mm / s flow velocity measured in the on the inlet side in the retaining structure (111) opening into the microchannel (3).
  • Average volume flows at which small droplets pass through the retention structure (111) in the passage (4) are 10-100 mm / s average speed measured in the microchannel (3) opening into the retention structure (111) on the inlet side.
  • Low volume flows in which small droplets are retained by the retention structure (111) and do not pass through the passage (4), are 0.1-10 mm / s mean velocity measured in the microchannel (3) opening into the retention structure (111) on the inlet side.
  • a drop diameter of 3 - 50 ⁇ m with a generation rate of 5 kHz-100 kHz is used, for example, for digital PCR, isothermal DNA amplification assays, assays for single molecule detection, single-cell assays, single bacteria assays, single phage assays (digital phage display ) used.
  • a droplet diameter of 20-100 ⁇ m with a generation rate of 1 kHz - 50 kHz is used, for example, for microbial and cell-based reporter assays with preculture, digital PCR in the presence of DNA capture beads for next generation sequencing.
  • a droplet diameter of 50-200 ⁇ m with a generation rate of 0.5 kHz -15 kHz is used, for example, for testing mammalian cell cultures and stem cells, microfermentation experiments, spheride production, hybridoma cell cultures for strain optimization / strain maintenance in antibody production and for testing microbial ones Consortia used.
  • Embodiment 2 :
  • the microdroplet retention arrangement (1) can be implemented in an integrated microfluidic component, in which a microdroplet retention arrangement (1) is arranged on the inlet side (e) in a microchannel (3) which is in a storage chamber (2) designed as a capillary gap for sample droplets of a predetermined size opens and a second microdroplet retention arrangement (1) is arranged on the outlet side (a) in a microchannel (3) which arises from the storage chamber (2), so that the storage chamber (4 ) is limited on the inlet side (e) and outlet side (a) by the microdroplet retention arrangement (1), so that the separation of sample components by dividing them into droplets or other components, the amplification or other reaction of the components within the droplets, the detection of the amplified components or properties thereof n and / or the analysis of the resulting data is enabled.
  • the functionality of the microdroplet retention arrangement (1) is set by the liquid volume flows, which are controllable in the component, in which low volume flows in the range of 0.1 to 10 mm / s to retain sample drops for the passage of air bubbles through the microdroplet retention arrangement (1) through the microdroplet retention arrangement (1), mean volume flows in the range from 10 to 100 mm / s for the central expulsion of sample droplets through the microdrop retention assembly (1) and high volume flows in the range from 100 to 500 mm / s for expelling air bubbles in the microfluidic component according to the known prior art can be set.
  • Embodiment 3 is a diagrammatic representation of Embodiment 3
  • Microdroplet retention arrangement in an integrated microfluidic component to determine the number of anti-beta-lactam Antibiotics (penicillins) resistant pathogens in a sample and the extraction of the pathogen for a subsequent microbiological / molecular biological analysis.
  • Pathogens that are resistant to beta-lactam antibiotics secrete the enzyme beta-lactamase as an exoenzyme. This causes the splitting of the beta-lactam ring of the antibiotic and thus deactivates the antibacterial effect of this active ingredient.
  • a microfluidic component according to FIG. 1 in an integrated fluid arrangement is used to determine the number of pathogens resistant to beta-lactam antibiotics in a sample and to obtain the pathogens for a subsequent microbiological and / or molecular biological analysis.
  • a sample containing the microorganisms to be examined is mixed with a chromogenic beta-lactamase substrate (sigma Product ID: MAK221) and transferred into a droplet suspension.
  • this substrate In the presence of the enzyme beta-lactamase, this substrate is cleaved and releases a dye.
  • the droplet suspension is stored in the capillary gap chamber (storage chamber) delimited by the microdroplet retention arrangement (1), incubated and, after incubation, by a microdroplet retention arrangement (1) according to
  • Fig. 5 passed through. After the individual drops have passed through, they are examined / analyzed optically according to the state of the art. Based on the formation of a colored species, droplets containing penicillin-resistant microorganisms are identified based on the formation of the dye. The determined number of positive drops (colored drops) serves as the primary diagnostic finding. By subsequently driving the drops out of the incubation chamber and sorting them, the drops with a positive color are obtained and one subsequent microbiological or molecular biological analysis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the system comprises a droplet generator configured to generate droplets containing parts of a sample to be analyzed, the droplets being arranged in an immiscible fluid (11) that forms a sample emulsion, a heating and cooling station with a fluid inlet and a fluid outlet, a detection point downstream of the heating and cooling station, a channel that forms a continuous fluid path from the fluid inlet to the fluid outlet of the heating and cooling station, a pump for moving the sample emulsion through the channel, a controller that is programmed to control a To operate fluid transport through the channel, and an analyzer configured to process data collected at the acquisition station.
  • a droplet generator configured to generate droplets containing parts of a sample to be analyzed, the droplets being arranged in an immiscible fluid (11) that forms a sample emulsion
  • a heating and cooling station with a fluid inlet and a fluid outlet, a detection point downstream of the heating and cooling station, a channel that forms a continuous fluid path from the fluid inlet to the fluid
  • a droplet reservoir can be provided, a first fluid line connecting the droplet generator to the droplet reservoir, and a second fluid line which connects the droplet reservoir to the fluid inlet of the heating and cooling station.
  • a controller can be programmed to adjust the droplet generator to determine the droplet size and the Droplet generation frequency changes based on the data received at the detection point.
  • the at least one droplet generator forms a plurality of emulsions, including droplets, each containing a sample partition that is prepared as a reaction mixture for amplification of a nucleic acid target.
  • planar system for the polymerase chain reaction is defined by its cavities and holds / guides / conducts the emulsions.
  • the heating and cooling device is used to heat / cool the emulsions arranged in the cavities (usually sequentially in time) in order to induce nucleic acid amplification in the droplets.
  • a detection arrangement which can be positioned at the detection point, is used to detect signals from the intact droplets of the emulsions
  • a controller which is connected to the detection arrangement and is programmed to detect the presence of the nucleic acid target in a sample (if any) based on signals detected on the intact droplets to detect and analyze.
  • sorting following the assay for the extraction of drops and drop contents with selectable properties is of the greatest importance.
  • the multifunctional retention structure according to the invention now opens up the possibility of combining digital drop-based assays on just one chip with sorting processes and thus complete To implement high-performance screening processes on a single integrated lab-on-a-chip component.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Mikrotropfenrückhalteanordnung, ein Verfahren zum Betreiben und die Verwendung dieser Anordnung gemäß der Gattung der Patentansprüche, insbesondere für mikrofluidische Systeme. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Mikrotropfenrückhalteanordnung und ein Verfahren zum Betreiben dieser in einem mikrofluidischen System anzugeben, welche ein Zurückhalten von Probetropfen bei geringen Volumenströmen, ein mittiges Austreiben von Probetropfen bei mittleren Volumenströmen und gleichzeitig den Durchtritt von Luftblasen ermöglicht, wird dadurch gelöst, dass eine Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) in Form einer Furt in einem Mikrokanal (3) als Verengung des Mikrokanals (3) mit einem Durchlass (4) für Flüssigkeiten als Strömungsverengung ausgebildet ist, wobei die in die verengte Stelle des Mikrokanals (3) einlaufende Wand (ew) und die aus der verengten Stelle des Mikrokanals (3) auslaufende Wand (aw) jeweils in einer konkaven Form des Mikrokanals (3) ausgeführt ist und dabei die ausgebildete Verengung des Mikrokanals (3) am Durchlass (4) so ausgestaltet ist, dass die Länge des Durchlasses (4) in Flussrichtung des Mikrokanals (3) sehr kurz bis nahezu punktförmig und gleichzeitig der Rand der Verengung am Durchlass (4) verrundet ist.

Description

Mikrotropfenrückhalteanordnung
Erfindung betrifft eine Mikrotropfenrückhalteanordnung, ein Verfahren zum Betreiben und die Verwendung dieser Anordnung gemäß der Gattung der Patentansprüche, insbesondere für mikrofluidische Systeme.
Von der WO 2010036352 Al ist ein System bekannt, das das Trennen von Probenkomponenten durch Unterteilen derselben in Tröpfchen oder andere Komponenten, das Verstärken oder anderweitiges Reagieren der Komponenten innerhalb der Tröpfchen, das Detektieren der amplifizierten Komponenten oder Eigenschaften davon und / oder das Analysieren der resultierenden Daten ermöglicht.
Hauptanwendungsgebiet des Systems ist dabei die Polymerasekettenreaktion .
Gemäß der Offenbarung der WO 2010036352 Al umfasst das System einen Tröpfchengenerator, der zum Erzeugen von Tröpfchen konfiguriert ist, die Teile einer zu analysierenden Probe enthalten, wobei die Tröpfchen in einem nicht mischbaren Fluid angeordnet sind, das eine Probenemulsion bildet, eine Heiz- und Kühlstation mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass, eine Detektionsstelle stromabwärts von der Heiz- und Kühlstation, einen Kanal, der einen kontinuierlichen Fluidweg vom Fluideinlass zum Fluidauslass der Heiz- und Kühlstation bildet, eine Pumpe zum Bewegen der Probenemulsion durch den Kanal, eine Steuerung, die programmiert ist, um einen Fluidtransport durch den Kanal zu betreiben, und einen Analysator, der konfiguriert ist, um Daten zu verarbeiten, die an der Erfassungs Station gesammelt werden.
Dabei kann ein Tröpfchenreservoir vorgesehen sein, wobei die erste Fluidleitung den Tröpfchengenerator mit dem Reservoir verbindet, und eine zweite Fluidleitung, die das Reservoir mit dem Fluideinlass der Heiz- und Kühlstation verbindet.
Der Controller kann so programmiert sein, dass er den Tröpfchengenerator so einstellt, dass er die Tröpfchengröße basierend auf von der Detektions Station empfangenen Daten ändert.
Eine Ausgestaltung des Systems umfasst: • mindestens einen Tröpfchengenerator, der eine Vielzahl von Emulsionen einschließlich Tröpfchen bildet, die jeweils eine Probenpartition enthalten, die als eine Reaktionsmischung zur Amplifikation eines Nukleinsäureziels vorbereitet ist,
• eine Platte, die eine Anordnung von Hohlräumen definiert, um die Emulsionen zu halten,
• eine Heiz- und Kühlvorrichtung, um die in den Hohlräumen angeordneten Emulsionen zu erhitzen, um eine Nukleinsäureamplifikation in Tröpfchen zu induzieren und
• eine Detektionsanordnung zum Detektieren von Signalen von intakten Tröpfchen der Emulsionen; und eine Steuerung, die mit der Detektionsanordnung in Verbindung steht und programmiert ist, um eine Anwesenheit des Nukleinsäuretargets in einer Probe, falls vorhanden, zu schätzen, basierend auf Signalen, die von den intakten Tröpfchen detektiert werden.
Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass der Tröpfchengenerator eine Kapillarspaltkammer ist, welche mit Ventilen versehen ist, die ansteuerbar sind.
Auf Grund der Initialbefüllung dieses Systems kommt es zu unerwünschten Luftblasen, welche nicht aus dem System ausgetrieben werden und die Ventile nicht in jedem Fall passieren können, so dass das System in der Praxis bereits von Hersteller als Einwegartikel Luftblasen frei vorgefüllt und daher nicht wiederverwendbar ist.
DE 101 04 323 Al offenbart ein Verfahren zum Herstellen einer Rille mit einer Engstelle in der Oberfläche eines Bauteils durch Ätzen. Um ein solches Bauteil in einfacher Weise herstellen zu können, werden durch isotropes Ätzen voneinander beabstandete Rillenabschnitte erzeugt. Anschließend wird zwischen den Rillenabschnitten durch ein weiteres Ätzen ein Rillenstück mit relativ engem Querschnitt erzeugt, das die beiden Rillenabschnitte miteinander unter Bildung einer Engstelle, s.g. Drosselstelle, verbindet.
Bei einer Verfahrensvariante wird mit einer Ätzmaske mit zwei beabstandeten Ätzöffnungen solange isotrop geätzt, bis sich die gebildeten Rillenabschnitte stimseitig unter Bildung einer Engstelle teilweise durchdringen.
Im Zusammenhang mit dieser Engstelle wird eine Fluidplatte gelehrt, die durch zwei Siliziumscheiben mit gemäß dem Verfahren hergestellten Rillen durch Bonden der beiden Bauteile hergestellt werden kann, wobei die Rillen einen inneren Kanal aufweisen, der eine Drosselstelle bildet, so dass dort - beispielsweise durch integrierte Drucksensoren - die Druckdifferenz an der Drosselstelle erfasst und damit Messgrößen zur Ermittlung des Durchflusses in einfacher Weise gewonnen werden können.
Die Engstelle, s.g. Drosselstelle, gemäß dieser technischen Lehre dient der Erzeugung einer messbaren Druckdifferenz zur Ermittlung des Durchflusses eines Fluidstromes und sie ist nicht dazu geeignet, Luftblasen aus dem Fluidstrom zu entfernen, Tropfen in einer Kammer einzulagem oder diese aus der Kammer auszutreiben.
WO 2018/186 881 Al offenbart eine Trägheitspumpe. Diese
Trägheitspumpe kann einen mikrofluidischen Kanal, ein Fluidstellglied im mikrofluidischen Kanal und ein Rückschlagventil im mikrofluidischen Kanal beinhalten. Das Rückschlagventil kann ein bewegliches Ventilelement, ein verengtes Kanalsegment, das stromaufwärts des beweglichen Ventilelements angeordnet ist, und ein Sperrelement beinhalten, das im mikrofluidischen Kanal stromabwärts des beweglichen Ventilelements ausgebildet ist. Das verengte Kanalsegment kann eine Breite kleiner als eine Breite des beweglichen Ventilelements aufweisen, so dass das bewegliche Ventilelement den Fluidstrom durch das Rückschlagventil blockieren kann, wenn das bewegliche Ventilelement im verengten Kanalsegment positioniert ist. Das Sperrelement kann so konfiguriert werden, dass das Sperrelement das bewegliche Ventilelement innerhalb des Rückschlagventils einschränkt und gleichzeitig den Fluidfluss ermöglicht, wenn das bewegliche Ventilelement gegen das Sperrelement positioniert ist. Diese technische Lösung ist nicht dazu geeignet, Luftblasen aus dem Fluidstrom zu entfernen, Tropfen in einer Kammer einzulagern oder diese aus der Kammer auszutreiben.
US 2003/0121644 Al offenbart eine Wärmemassentransportvorrichtung, die Mikrokanäle und Mikropumpen verwendet, um eine dünnere Bauform zu erreichen und damit eine höhere Wärmeleitfähigkeit zu erzielen. Die Wärmemassentransportvorrichtung weist eine Struktur auf, in der die Mikrokanäle für den Durchgang durch ein Kühlmittel und die Mikropumpen für den Transport des Kühlmittels eine einzige Einheit bilden.
So können bspw. eine Kanalschicht, in der die Mikrokanäle gebildet sind, und eine Pumpschicht, in der die Mikropumpen angeordnet sind, in eine Mehrschichtstruktur laminiert sein. Darüber hinaus ist die Wärmemassentransportvorrichtung in der Form flexibel ausgestaltet, dass die Mikrokanäle und Mikropumpen auf einem Harzsubstrat unter Verwendung von flexiblem Material ausgeführt sind. Dabei kann auch vorgesehen sein, dass die Wärmemassentransportvorrichtung einen Abschnitt des Mikrokanals aufweist, der eine Verengung in einem geschlossenen Kreislauf von Mikrokanal und Mikropumpe darstellt.
Dabei ist nicht vorgesehen, dass ein Entfernen von Luftblasen, das Einlagem von Tropfen in einer Kammer oder das Austreiben von Tropfen aus der Kammer möglich ist.
US 2016/0193605 Al offenbart das Isolieren oder Identifizieren einer Zelle in einer Zellsuspension zur Unterscheidung von Tumorzellen von Nicht-Tumorzellen basierend auf einer physikalischen Eigenschaft dieser Zellen und dem Leiten der Zellsuspension durch einen mikrofluidischen Kanal, der eine Verengung beinhaltet und das Leiten der Zellsuspension durch diese Verengung ermöglicht. Die Engstelle gemäß dieser technischen Lehre kann so bemessen sein, dass sie eine relativ größere Zelle gegenüber einer relativ kleineren Zelle bevorzugt verformt. Dazu umfasst das mikrofluidische System einen Mikrofluidikkanal, durch den eine in einem Puffer suspendierte Tumorzelle hindurchtreten kann und der im Vergleich zu einer Nicht-Tumorzelle verengt ist, wobei diese Verengung des Mikrofluidikkanals der Zellverformung dient, in dem die Engstelle so bemessen ist, dass sie eine Tumorzelle vorzugsweise mehr verformt als eine Nicht-Tumorzelle.
Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass sie ausschließlich der Zelltrennung dient. Ein Entfernen von Luftblasen, welche durch die Probeneingabe in das Fluid entstehen, ein Einlagem von Tropfen in einer Kammer sowie das Austreiben der Tropfen aus der Kammer wird nicht ermöglicht.
DE 20 2012 013 668 Ul offenbart ein Verfahren zum Quantifizieren einer Menge von Enzymmolekülen, welches bspw. eine Vorrichtung für die Tropfenbildung verwendet. Diese Vorrichtung weist einen Einlasskanal, einen Auslasskanal und zwei Trägerflüssigkeitskanäle auf. Die Kanäle treffen sich an einem Knotenpunkt. Der Einlasskanal leitet eine Probenflüssigkeit zu dem Knotenpunkt. Die Trägerflüssigkeitskanäle leiten eine Trägerflüssigkeit, die mit der Probenflüssigkeit unmischbar ist, zu dem Knotenpunkt. Der Einlasskanal verengt sich an seinem distalen Abschnitt, wobei er sich mit dem Knotenpunkt verbindet. Der Einlasskanal ist rechtwinklig zu den Trägerflüssigkeitskanälen orientiert. Tropfen werden gebildet, wenn die Probenflüssigkeit aus dem Einlasskanal zu dem Knotenpunkt fließt, wo die Probenflüssigkeit mit der fließenden Trägerflüssigkeit, die über die Trägerflüssigkeitskanäle dem Knotenpunkt zugeführt wird, interagiert. Der Auslasskanal nimmt die Tropfen der Probenflüssigkeit, die von der Trägerflüssigkeit umgeben sind, auf.
Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass lediglich eine Tropfenbildung generiert wird. Das Befreien von Luftblasen kombiniert mit der Rückhaltung sowie dem Austreiben von Tropfen wird mit dieser technischen Lösung nicht ermöglicht.
US 2010/0252118 Al offenbart mikrofluidische Strukturen und ein Verfahren zur Manipulation von Flüssigkeiten, Fluidkomponenten und Reaktionen, wobei solche Strukturen und das Verfahren die Produktion von Tröpfchen mit einem genauen Volumen ermöglichen, die in bestimmten Bereichen der Vorrichtung gespeichert können. Dabei sind die mikrofluidischen Strukturen und das Verfahren so konzipiert, dass sie Komponenten (bspw. biologische Zellen) in einer Anordnung aufnehmen und positionieren können, um diese zu manipuliert und dabei zu beobachten.
Gemäß der technischen Lehre von US 2010/0252118 Al strömt der Tropfen in einem Strömungspfad in eine Richtung, indem er von einem Trägerfluid getragen wird, das in die gleiche Richtung strömt. Beim Passieren der Verbindung zwischen zwei Strömungspfaden am stromaufwärts gelegenen Abschnitt strömt das Tröpfchen aufgrund seines geringeren Strömungswiderstands in diesem Strömungspfad relativ zu dem anderen Strömungspfad mit einen Fluidbeschränkungsbereich, bspw. einem schmalen Fluidpfadabschnitt und/oder einen Bereich mit einer kleineren Querschnittsfläche als der Fluidwegabschnitt beinhaltet, so dass der Tropfen nicht weiter durch das mikrofluidische Netzwerk fließen kann. Dementsprechend ist das Tröpfchen in einem Bereich, z.B. einem "Mikrotopf" oder einer "Kammer" des mikrofluidischen Netzwerks positioniert.
Es besteht dabei auch die Möglichkeit, dass der Tropfen in einem Bereich festgehalten wird, obwohl das Trägerfluid weiterhin im mikrofluidischen Netzwerk fließt. Dabei wird allgemein festgestellt, dass jeder geeignete Fluidweg als Fluideinschränkungsbereich verwendet werden kann, der einen höheren hydrodynamischen Widerstand und/oder eine kleinere Querschnittsfläche für die Fluidströmung aufweist.
Als Beispiel wird ein Fluideinschränkungsbereich in Form eines schmalen Fluidpfades oder eines Kanals mit den gleichen Abmessungen wie der Strömungspfad genannt, wobei in diesem ein Hindernis in Form eines Ventils, angeordnet ist.
In einem anderen Beispiel ist der Fluideinschränkungsbereich eine poröse Membran, einen semipermeablen Stopfen (z.B. ein Gel), ein Ventil oder eine andere Struktur.
Dabei kann ein Mikrofluidiknetz vorgesehen sein, dass einen Flüssigkeitsrestriktionsbereich in Form einer engen Öffnung aufweist, durch welchen das Tröpfchen aufgrund eines hohen hydrodynamischen Widerstands nicht hindurchfließen kann. Infolgedessen umgeht das Tröpfchen den Flüssigkeitsrestriktionsbereich und fließt in einen andern Fluidweg. Durch diese Umkehrung des Durchflusses im Mikrofluidiknetz können die Tröpfchen nacheinander aus diesem Bereich des Mikrofluidiknetzes entfernt werden, in denen sie sich zuvor befanden. Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass unterschiedliche fluidische Komponenten zur Realisierung der einzelnen Funktionalitäten, wie bspw. die Entfernung von Blasen, das Zurückhalten von Tropfen und das Austreiben von Tropfen aus dem Speicherelement vorgesehen sind
US 2018/0003611 Al offenbart eine Vorrichtung (einen biologischen Testchip) mit einer auf einem Substrat ausgebildeten mikrofluidischen Kanalstruktur, wobei sich im Kanal ein Fluidaktuator befindet, der im Fluidstrom biologische Zielpartikel zum Zählen in einem Detektionsbereich vereinzelt, wobei der Chip konkret folgende Komponenten umfasst:
• ein Substrat;
• eine mikrofluidische Kanalstruktur, die auf dem Substrat gebildet ist und einen ersten Kanal beinhaltet;
· ein Fluid-Stellglied innerhalb der mikrofluidischen Kanalstruktur.
• ein Sensorbereich innerhalb des ersten Kanals, um einen Fluidstrom biologischer Partikel auf einer einmaligen Basis durch den Betrieb des Fluidaktuators zu empfangen, wobei der Sensorbereich ein Volumen in der gleichen Größenordnung wie ein Volumen eines einzelnen der biologischen Partikel aufweist,
Dabei sind folgende Ausgestaltungen dieser Komponenten vorgesehen:
- mindestens ein Impedanzsensor, der im Sensorbereich angeordnet ist, um biologische Partikel zu zählen, die durch den Sensorbereich geführt werden,
- eine Ausschlussstruktur stromaufwärts von dem Sensorbereich, um biologische Partikel auszuschließen, die größer sind als das Volumen des Sensorbereichs sind, und
- eine Einlassstruktur mit einer sich allmählich verengende
Querschnittsfläche in der stromabwärts gerichteten Ausrichtung beinhaltet. wobei der Kanal eine Verengung aufweist, die wesentlich kleiner als die sonstige Querschnittsfläche ist und die biologischen Partikel Blutzellen sind.
Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass nur eine Verengung zum Vereinzeln der Blutzellen in einem Flüssigkeitsstrom vorgesehen ist, welche keine Entfernung von Luftblasen der Probeeingabe, das Zurückhalten von Tropfen sowie das Austreiben von Tropfen aus einem Rückhalteelement ermöglicht.
US 2011/0275143 Al offenbart eine Plattform für die Analyse einzelner Zellen oder Moleküle in einer Flüssigkeit, welche folgende Komponenten umfasst:
• einen Generator, zum Erzeugen von Tröpfchen oder Blasen zu erzeugen, die einzelne Zellen oder einzelne Moleküle enthalten,
• einen Sortierer, zum Entfernen unerwünschter bzw. leerer Tröpfchen oder Blasen, die vom Generator erzeugt wurden,
• eine Detektions- oder Messvorrichtung, die zum Detektieren oder Messen einer Eigenschaft der Zelle oder des Moleküls, welche in dem Tropfen oder der Blase enthalten ist,
• eine fluidische Blasenlogik-Screeningvorrichtung zum Screenen der im Tröpfchen oder der Blase enthaltenen Zelle oder des Moleküls gemäß der erfassten oder gemessenen Eigenschaft, um mindestens eine ausgewählte Zelle oder ein ausgewähltes Molekül zu identifizieren,
• mindestens ein logisches Speicherelement für Fluidblasen zum Speichern der ausgewählten Zelle oder des ausgewählten Moleküls, das in dem Tropfen oder der Blase enthalten ist, und
• eine fluidische Blasenlogik-Leitweglenkungsschaltung zum Leiten der ausgewählten Zelle oder des ausgewählten Moleküls, das in dem Tröpfchen oder der Blase enthalten ist, von einer Siebvorrichtung zu einem Speicherelement.
Der Nachteil dieser sehr komplexen technischen Lösung besteht in der Vielzahl unterschiedlicher fluidischer Komponenten zur Realisierung der einzelnen Funktionalitäten, wie bspw. die Entfernung von Blasen, das Zurückhalten von Tropfen und das Austreiben von Tropfen aus dem Speicherelement.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Mikrotropfenrückhalteanordnung und ein Verfahren zum Betreiben dieser in einem mikrofluidischen System anzugeben, welche die zuvor stehend genannten Nachteile des Standes der Technik vermeiden und insbesondere ein Zurückhalten von Probetropfen bei geringen Volumenströmen, ein mittiges Austreiben von Probetropfen bei mittleren Volumenströmen und gleichzeitig den Durchtritt von Luftblasen ermöglicht.
Darüber hinaus sollen verschiedene Anwendungen dieser Anordnung des Verfahrens zum Betreiben dieser Anordnung angegeben werden.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale des 1. Patentanspruchs gelöst. Weitere günstige Ausgestaltungsmöglichkeiten der Erfindung sind in den nachgeordneten Patentansprüchen angegeben.
Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass in einer monolithisch hergestellten integrierten mikrofluidischen Anordnung auf Chip-Basis, welche bspw. der technischen Lehre von WO 2010/036352 Al entspricht, an Stelle der bekannten Ventile mindestens eine Mikrotropfenrückhalte-anordnung mit einer speziellen Geometrie in einem mikrofluidischen Kanal angeordnet ist.
Diese Mikrotropfenrückhalteanordnung ist als multifunktionale mikrofluidische Funktions Struktur (= „Rückhaltestruktur“) für das Zurückhalten von Tropfen eines Probefluids (= "Probetropfen") in einer als Kapillarspalt ausgestalteten Speicherkammer für Probetropfen einer vorgegebenen Größe ausgeführt. Dabei wird die Speicherkammer Einlass- und Auslassseitig durch als dreidimensionale geometrische Anordnungen realisierte Rückhaltestrukturen begrenzt.
Einlassseitig bezeichnet die Seite der Rückhaltestruktur, auf welcher kleine Tropfen zurückgehalten werden. Auslassseitig bezeichnet die Seite der Rückhaltestruktur, aus welcher Luftblasen und Tropfen die Struktur bei höheren Flussraten verlassen.
Die Mikrotropfenrückhalteanordnung ist in Form einer Barriere als Engstelle des Kanals mit einem mittig angeordneten Durchlass für Flüssigkeiten (= Strömungsverengung / Furt) in einem Mikrokanal vor und / oder nach der als Kapillarspalt ausgestalteten Speicherkammer für Probetropfen ausgebildet, so dass die Die Rückhaltestruktur zwei Teilbereiche, eine Barrierestruktur und einen Durchlass, umfasst
Dazu sind die in die verengte Stelle des Mikrokanals einlaufende Wand und die aus der verengten Stelle des Mikrokanals auslaufende Wand jeweils in einer konkaven (d.h. nach innen gewölbter) Form des Mikrokanals ausgeführt, wobei die Konkavität gleich oder unterschiedlich sein kann.
Der Verlauf der Wand des Mikrokanals an seiner Verengung entspricht dabei annähernd oder genau einer konkaven oder streng konkaven Funktion.
Eine Funktion ist konkav, wenn ihr Graph oberhalb jeder Verbindungsstrecke zweier seiner Punkte liegt. Dies ist gleichbedeutend dazu, dass der Hypograph der Funktion, also die Menge der Punkte unterhalb des Graphen, eine konvexe Menge ist.
Eine reellwertige Funktion f: C— >R, die auf einer konkaven Teilmenge C eines reellen Vektorraums definiert ist, heißt konkav, wenn für alle x, y aus C und für alle t e [0,1] gilt, dass
f (tx + (1 - t) y) > tf (x) + (1 - t) f (y), so wird die Funktion konkav genannt.
Eine Funktion heißt streng konkav oder strikt konkav, wenn die obige Ungleichung im strengen Sinn gilt; das heißt für zwei Elemente x y aus C und alle t e [0,1] gilt, dass
f (tx + (1 - t) y) > tf (x) + (1 - t) f (y). [Harro Heuser: Lehrbuch der Analysis (Teil 1), 10. Auflage, B. G. Teubner, Stuttgart 1993, ISBN 3-519-32231-5. (49.2)] Beim annähernd konkaven Verlauf der Wand des Mikrokanals an seiner Verengung zum Durchlass hin und vom Durchlass weg kann die Wand mäanderförmig gleichmäßig oder ungleichmäßig in langen flachen oder kurzen starken Wellenformen oder aber auch stufenförmig ausgestaltet sein
Beim konkaven oder streng konkaven Verlauf der Wand des Mikrokanals an seiner Verengung zum Durchlass hin und vom Durchlass weg ist die Wand mit einem durchgehend gleichmäßigem Verlauf verengend bzw. erweiternd ausgeführt.
Die ausgebildete Verengung des Mikrokanals am Durchlass ist so ausgestaltet, dass die Länge des Durchlasses in Flussrichtung des Kanals sehr kurz bis nahezu punktförmig ist.
Gleichzeitig ist der Rand der Verengung am Durchlass verrundet, d.h. er darf nicht eckig ausgeführt sein.
Durch diese Ausgestaltung (Länge und Verrundung) des Durchlasses in Kombination mit dem Verlauf der Wand des Mikrokanals (in Flussrichtung) zum Durchlass hin und von Durchlass weg, ist die bestimmungsgemäße Funktionsweise der Rückhaltestruktur gewährleistet.
Diese Rückhaltestrukturen dienen der geordneten Einlagerung von Tropfen in einer Speicherkammer und der Vermeidung eines unerwünschten Austritts von Tropfen aus der Speicherkammer sowie der Handhabung von unerwünschten Luftblasen.
Bei der Initialbefüllung passieren große Luftblasen die Rückhaltestruktur vollständig, so dass eine zuverlässige, Luftblasen-freie Initialbefüllung sowie das Austreiben von unerwünschten, im mikrofluidischen System befindlichen Luftblasen für eine bestimmungsgemäße Nutzung der Speicherkammer erfolgt.
Für die Befüllung der Speicherkammer mit Probetropfen ermöglicht die Rückhaltestruktur die Einlagerung von Tropfen in die Speicherkammer, in dem diese zurückgehalten werden.
Für die Entleerung der in der Speicherkammer gespeicherten Probetropfen ermöglicht die Rückhaltestruktur, dass diese die Speicherkammer als eine lineare Folge gleichmäßig beabstandeter Tropfen in der Kanalmitte des als Auslass dienenden Mikrokanals verlassen.
Die Steuerung dieser drei einzelnen Funktionen der Rückhaltestruktur erfolgt über die zur Anwendung kommenden Flussraten (V olumenströme) .
Für das Einlagem der Tropfen in der Speicherkammer kommen geringe Volumenströme zur Anwendung.
Für das Austreiben von Luftblasen mit hoher Grenzflächenspannung und geringer Viskosität kommen hohe Volumenströme zur Anwendung.
Für das Austreiben der Probetropfen als mittig geführte, gleichförmig beabstandete Folge von Tropfen kommen mittlere Volumenströme zur Anwendung.
Die Rückhaltestruktur weist für das Zurückhalten und das Vereinzeln von Tropfen einen Nenndurchmesser DT auf, wobei die Rückhaltestruktur in einem Kapillarspaltkanal mit der Höhe HC = DT und der Weite WC integriert ist.
Die Höhe HR der Rückhaltestruktur beträgt ca. HR 2/3 * HC.
Die Rückhaltestruktur wird durch zwei bezüglich der vertikalen Hauptebene des Kanals in Flussrichtung spiegelsymmetrische und zueinander beabstandeten Teilstrukturen gebildet. Der kleinste Abstand AT MIN zwischen den Teilstrukturen beträgt AT MIN— HC/3.
Die der Kanalmitte zugewandten Teilstrukturen sind mit einem Radius RI von 121— HR verrundet.
Die Länge der Rückhaltestruktur in Flussrichtung nimmt zu den begrenzenden Seitenwänden zu. Dieser Teil der Geometrie kann durch einen Kreisbogen mit einem Radius R2 mit E2 N 0.6 * WC beschrieben werden.
Alle genannten Linienzüge können durch Polygone, Splines oder unter Verwendung geeigneter mathematische Funktionen, wie zum Beispiel Polynome beliebiger Ordnung, Reihenentwicklungen (z.B. Tailor- Reihe) oder andere geeignete mathematische Ausdrücke approximiert werden.
Die so ausgestaltete Rückhaltestruktur kann vollständig unter Verwendung eines zweistufigen Ätzprozesses (Fotolithografie + Plasmaätzen in Silizium) hergestellt werden und nachfolgend mittels galvanischer Abformung in ein Spritzgusswerkzeug für die kostengünstige Massenfertigung, bspw. monolithisch hergestellter integrierter mikrofluidische Bauelemente und Systeme mit Rückhaltestruktur(en), überführt werden.
Die gemäß den zuvor stehend ausgeführten geometrischen Vorgaben ausgestaltete Rückhaltestruktur verfügt über drei Funktionalitäten, welche durch die Stärke der Volumenströmen des flüssigen Mediums im Mikrokanal schaltbar sind:
· Durchtritt von Luftblasen durch die Rückhaltestruktur
Für den Durchtritt von Luftblasen durch die Rückhaltestruktur kommen hohe Volumenströme zur Anwendung. Im Gegensatz zu Probentropfen zeichnen sich Luftblasen durch eine hohe Grenzflächenspannung, ein hohes Volumen und eine geringe Viskosität aus. Durch die hydrodynamischen Kräfte wird die Luftblase formschlüssig in die Rückhaltestruktur gepresst. Im Bereich der zentralen Apertur kann sie diese überwinden. Beim nachfolgenden Durchtritt bildet sich im Bereich der zentrale Öffnung eine Engstelle der Luftblase aus. Diese Engstelle muss als bevorzugte Position für eine Fragmentierung der Luftblase interpretiert werden.
Die Wahrscheinlichkeit der Fragmentierung steigt mit der Länge dieser Struktur in Flussrichtung. Für die Vermeidung der Fragmentierung muss dieser Bereich in seiner Längenausdehnung minimiert werden. Dies gelingt durch die Verrundung der Struktur mit dem vorgegeben Radius RI.
Wird diese Struktur alternativ durch einen von der Rückhaltestruktur abweichenden Kapillarkanal gemäß dem Stand der Technik definiert, so erzeugt die Fragmentierung kleine Luftblasen, welche die Struktur nicht mehr passieren können und der angestrebten Funktionalität für das Zurückhalten kleiner Probetropfen oder deren kontrollierter Passage (dem Austreiben) wird nicht ausgebildet.
• Zurückhalten von Probetropfen bei geringen Volumenströmen
Geringe Volumenströme kommen für die Erzeugung und Einlagerung von Probetropfen in der Speicherkammer zur Anwendung. Unter diesen Prozessbedingungen können Probetropfen die Rückhaltestruktur nicht passieren, da die durch die Rückhaltestruktur erzeugten Rückhaltekräfte durch die hydrodynamischen Kräfte des strömenden Trägerfluids nicht überkompensiert werden können.
Der erste eintreffende Probetropfen wird durch die entstehenden hydrodynamischen Kräfte zur Kanalmitte transportiert und verschließt die dort angeordnete Öffnung aufgrund der von seinen Grenzflächen erzeugten Grenzflächenkräfte.
• Mittiges Austreiben von Probetropfen bei mittleren Volumenströmen
Bei mittleren Volumenströmen übersteigen die durch das strömenden Trägerfluid gebildeten die hydrodynamischen Kräfte die für den Durchtritt eines Tropfens durch den zentralen Bereich der Rückhaltestruktur erforderlichen Kräfte. Im Ergebnis können Tropfen die im mittleren Bereich angeordnete Öffnung passieren und werden zugleich durch das die Rückhaltestruktur überströmende Fluid in der Kanalmitte geführt. Die durch die Grenzflächenspannung des Probetropfens erzeugten Grenzflächenkräfte werden durch die hydrodynamischen Kräfte des strömenden Trägerfluids überkompensiert.
Zu den zuvor stehenden drei Funktionalitäten wird eine an sich bekannte Kapillarspaltkammer ein- oder beidseitig durch die Rückhaltestrukturen begrenzt.
Das Verfahren zum Betreiben des Systems mit dieser Kapillarspaltkammer und die Anwendung der Kapillarspaltkammer sind an sich aus der WO 2010/036352 Al bekannt, wobei die Ventile der vorbekannten technischen Lösung durch die Rückhaltestrukturen ersetzt und die Abmessungen sowie die Volumenströme an diese Rückhaltestrukturen angepasst sind, so dass die bestehenden Nachteile der technischen Lösung gemäß der Offenbarung der WO 2010/036352 Al überwunden werden.
Auf Grund der Geometrie der Rückhaltestruktur und deren Verwendung ergeben sich jedoch auch weitere, neue verfahrenstechnische Anwendungsmöglichkeiten (neben der PCT), wie z.B. das Sortieren der Tropfen unmittelbar nach Verlassen der Kapillarspaltkammer.
Die geometrisch ausgestalteten Rückhaltestrukturen für Tropfen nutzen dabei immer das Wechselspiel hydrodynamischer Kräfte mit den durch Grenzflächen erzeugten Kräften. Eine mathematische Beschreibung dieser Phänomene ist durch die dem Fachmann bekannte Navier-Stokes- Bilanzgleichung für "Body Forces“ im Kontext mit den konstruktiven Randbedingungen der Rückhaltestruktur gegeben. Das vermittels der an ihrem Ein- und Ausgang mit mindestens einer Mikrotropfenrückhalteanordnung versehenen Kapillarspaltkammer durchführbare Verfahren dient der Populationsanalyse einer Population von Probetropfen mit unterschiedlicher stofflicher Zusammensetzung. Ziel ist die Identifizierung und optionale Separation von Tropfen, deren stoffliche Zusammensetzung die vom Anwender vorgegebenen Kriterien erfüllen. Als Kriterium kommt die Bildung eines mit optischen Verfahren auslesbaren Markers im Volumen des Probetropfens zur Anwendung. Der Fachwelt sind diese Verfahren als digitale tropfenbasierte Assays bekannt.
Im ersten Schritt wird eine Suspension von Probetropfen mit unterschiedlicher stofflicher Zusammensetzung unter Verwendung eines Tropfengenerators als Suspension des Probefluids in einem mit diesem nicht mischbaren Trägerfluid erzeugt.
Diese Suspension von Probetropfen wird in die durch die Rückhaltestrukturen begrenzte Kapillarspaltkammer (Speicherkammer) eingelagert.
Nach Inkubation werden die den Zieleigenschaften entsprechenden Tropfen mit optisch spektroskopischen oder bildgebenden Verfahren identifiziert und deren Anzahl bestimmt.
Deren Anzahl in Relation zur Gesamtanzahl der Tropfen ist das angestrebte Ergebnis intitialen Populationsanalyse.
Nachfolgend werden die Probetropfen aus der Kapillarspaltkammer (Speicherkammer) einer Sortierstruktur für die Separation und Gewinnung der den Zielkriterien entsprechenden Probetropfen zugeführt. Hierfür ist deren Transport in der Mitte des Auslasskanals zwingend erforderlich.
Im Ergebnis des Sortierprozesses werden die den Zielkriterien entsprechenden Tropfen für eine nachfolgende Rückgewinnung und analytische Bewertung des Inhaltes gewonnen.
Das System mit der Tropfenrückhalteanordnung ermöglicht das Trennen von Probenkomponenten durch Unterteilen derselben in Tröpfchen, das Verstärken oder anderweitiges Reagieren der Komponenten innerhalb der Tröpfchen, das Detektieren der amplifizierten Komponenten oder Eigenschaften davon in den Tröpfchen und / oder das Analysieren der resultierenden Daten.
Der Vorteil der vorliegenden technischen Lösung gegenüber der in WO 2010/036352 Al offenbarten Lösung besteht darin, dass bei der Tropfenrückhalteanordnung durch die Stärke der Volumenströmung des flüssigen Mediums im Mikrokanal drei Funktionalitäten schaltbar sind und auf die vorbekannten Ventile verzichtet werden kann.
Dabei wird durch die Tropfenrückhalteanordnung ein Zurückhalten von Probetröpfchen bei geringen Volumenströmen, ein mittiges Austreiben von Probetröpfchen bei mittleren Volumenströmen und gleichzeitig der Durchtritt von Luftblasen bei starken Volumenströmen ermöglicht.
Durch diese technische Lösung erfolgt die Verbesserung der Zuverlässigkeit und Handhabbarkeit von monolithisch integrierten Chipsystemen für die Durchführung digitaler, tropfenbasierter mikrofluidischer Assays.
Für die Durchführung dieser Assays werden Probetropfen als Suspension in einem mit der Probenflüssigkeit unmischbaren Trägerfluid erzeugt, in eine Kapillarspaltkammer eingelagert und inkubiert. Nach Abschluss oder während der Inkubation werden die Tropfen unter Verwendung optisch-spektroskopischer oder bildgebender Verfahren einer
Populationsanalyse unterzogen. Dieser Ablauf entspricht an sich den klassischen, durch den vorbekannten Stand der Technik offenbarten Workflow für die Durchführung digitaler tropfen- basierter Assays.
Anwendungsbeispiele für den Einsatz der
Mikrotropfenrückhalteanordnung in integrierten mikrofluidischen Chipsystemen sind die Durchfluss-Analyse in monolithisch integrierten oder modularen Anordnungen, die stationäre Einlagerung und Inkubation von Tropfen in Form monolithisch integrierter oder modularer Anordnungen.
Die Mikrotropfenrückhalteanordnung begrenzt dabei die Kapillarspaltkammer in den integrierten Chipsystemen für die Inkubation der Probetropfen sowohl Einlass- als auch auslassseitig und verhindert ein Austreten der Probetropfen während der Befüllung und Inkubation.
Die Erweiterung um ein Sortierverfahren für die Gewinnung von Probentropfen ist dabei möglich. Hierfür können auslassseitig der Kapillarspaltkammer mikrofluidische Sortierstrukturen integriert werden. Für derartige mikrofluidische Sortierstrukturen sind bereits Beispiele aus dem Stand der Technik bekannt. Voraussetzung für die Anwendbarkeit dieser Strukturen ist die Zufuhr der Tropfen in die Sortierstruktur als gleichförmig beabstandete Folge von Tropfen in der Mitte des Einlasskanals der Sortierstruktur. Auch diese Aufgabenstellung wird durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung abgedeckt.
Somit erfolgt durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung eine Erweiterung des Funktionsumfanges an sich bekannter integrierter mikrofluidische Chipsysteme für die Durchführung digitaler, tropfenbasierter Assays.
Für die Herstellung eines integrierten Chipsystems als mikrofluidisches Netzwerk mit einem oder mehreren
Mikrotropfenrückhalteanordnung(en) werden nur zwei unterschiedliche Kanalhöhen benötigt. Damit ist das Gesamtsystem unter Verwendung etablierter, zweistufiger Strukturierungsverfahren herstellbar. Für die Massenfertigung mittels Spritzguss muss nur ein strukturiertes Formteil hergestellt werden, welches justagefrei mit einem nicht strukturierten Decksubstrat verbondet werden kann.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand der schematischen
Zeichnungen und der Ausführungsbeispiele näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein. Dabei zeigen:
Fig. la: eine schematische, seitlich geneigte Aufsicht einer
Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mikrotropfenrückhalteanordnung,
Fig. lb: eine schematische Schnittdarstellung der Mikrotropfenrück halteanordnung gemäß Fig. la entlang des Kanals in der Aufsicht mit den Ebenen A, B und C,
Fig. 2a: eine schematische Schnittdarstellung entlang der Ebene A der
Mikrotropfenrückhalteanordnung gemäß Fig. lb,
Fig. 2b: eine schematische Schnittdarstellung entlang der Ebene B der
Mikrotropfenrückhalteanordnung gemäß Fig. lb,
Fig. 2c: eine schematische Schnittdarstellung entlang der Ebene A der
Mikrotropfenrückhalteanordnung gemäß Fig. lb, Fig. 3a-d: eine schematische Darstellung von vier Varianten der Geometrie der Rückhaltestruktur der der Mikrotropfenrückhalteanordnung gemäß Fig. lb,
Fig. 4: die schematische Darstellung eines Mikrotropfenrückhalte- anordnungen gemäß Fig. lb in einem mikrofluidischen
Bauelement und
Fig. 5: einen detaillierten, vergrößerten Querschnitt eines Ausschnitts aus Fig. 4. Ausführungsbeipiel 1:
Aufbau der Mikrotropfenrückhalteanordnung
Die in Fig.la und Fig. lb sowie den Fig. 2a bis c dargestellte Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) ist in Form einer Furt in einem Mikrokanal (3) als Verengung des Mikrokanals (3) mit einem Durchlass (4) für Flüssigkeiten als Strömungsverengung ausgebildet.
Dazu sind die in die verengte Stelle des Mikrokanals einlaufende Wand (ew) und die aus der verengten Stelle des Mikrokanals (3) auslaufende Wand (aw) jeweils in einer konkaven (d.h. nach innen gewölbter) Form des Mikrokanals (3) ausgeführt, wobei die Konkavität gleich oder unterschiedlich sein kann.
Beim konkaven oder streng konkaven Verlauf der Wand (w) des Mikrokanals (3) ist dieser an seiner Verengung zum Durchlass (4) hin und vom Durchlass (4) weg mit einem durchgehend gleichmäßigem Verlauf ausgeführt [verengend einlaufende Wand (ew) und erweiternd auslaufende Wand (aw)].
Beim annähernd konkaven Verlauf der Wand (w) des Mikrokanals (3) an seiner Verengung zum Durchlass (4) hin und vom Durchlass (4) weg kann die Wand (w) mäanderförmig gleichmäßig oder ungleichmäßig in langen flachen oder kurzen starken Wellenformen oder aber auch stufenförmig ausgestaltet sein (in der Fig. 1 nicht dargestellt). Die ausgebildete Verengung des Mikrokanals (3) am Durchlass (4) ist so ausgestaltet, dass die Länge des Durchlasses (4) in Flussrichtung des Mikrokanals (3) sehr kurz bis nahezu punktförmig ist.
Gleichzeitig ist der Rand der Verengung am Durchlass (4) verrundet, d.h. er darf nicht eckig ausgeführt sein.
Durch diese Ausgestaltung (Länge und Verrundung) des Durchlasses (4) in Kombination mit dem Verlauf der Wand (w) des Mikrokanals (4) in Flussrichtung zum Durchlass hin und von Durchlass weg, ist die bestimmungsgemäße Funktionsweise der
Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gewährleistet.
Form der Wand (w) des Mikrokanals (3) der Rückhaltestruktur (111): Die Gesamthöhe der in den Kanal integrierten Rückhaltestruktur (111) ist geringer als die Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden / auslaufenden Kanalabschnittes.
Der Höhenübergang ist zweckmäßigerweise als Stufe mit einem Flanken winkel zwischen 30 und 120° ausgeführt.
In Kanalmitte ist die Rückhaltestruktur (111) mit einem Durchlass (4) ausgestattet. Zweckmäßigerweise hat dieser Durchlass (4) die gleiche Kanalhöhe wie der in die Rückhaltestruktur (4) einmündende / auslaufende Kanalabschnitt.
Der durch die Barriere bewirkte hydrodynamische Widerstand besitzt einen Maximalwert am Übergang zu den Seitenwänden des Mikrokanals (3) und nimmt zur Kanalmitte hin ab.
Dies wird durch:
a) eine zur Kanal-Seitenwand hin zunehmende Länge der
Barrierenstruktur in Flussrichtung oder
b) eine zur Kanal-Seitenwand hin zunehmende Höhe der
Barrierenstruktur oder
c) eine Kombination beider Merkmale
realisiert. Die einlassseitige Form der Barriere ist der Geometrie der Vorderseite einer den Mikrokanal (3) vollständig ausfüllenden Luftblase - im Allgemeinen ein Kreis- oder Ellipsenbogen angenähert.
Für bidirektionalen Betrieb ist eine bezüglich der Schnittebene C spiegelsymmetrische Form vorteilhaft.
Für unidirektionalen Betrieb kann die auslassseitige Geometrie unter Berücksichtigung der Punkte:
• Die Gesamthöhe der in den Mikrokanal (3) integrierten Rückhaltestruktur (111) ist geringer als die Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden / auslaufenden Kanal abschnittes.
· Der Höhenübergang ist zweckmäßigerweise als Stufe mit einem
Flanken winkel zwischen 30 und 120° ausgeführt.
• In Kanalmitte ist die Rückhaltestruktur (111) mit einem
Durchlass (4) ausgestattet. Zweckmäßigerweise hat dieser Durchlass (4) die gleiche Kanalhöhe wie der in die Rückhaltestruktur (111) einmündende/auslaufende Kanalabschnitt frei gestaltet sein.
Beispiele für die geometrische Gestaltung der Rückhaltestruktur (111) sind in der Fig. 3 gezeigt.
Für die Gestaltung des Durchlasses (4) ist es vorteilhaft, wenn dessen minimale Weite an nur an einem Punkt erreicht wird und die Annäherung an diesen Punkt durch eine von Kreis- oder Parabel-Bögen abgeleitete Linienführung erreicht wird.
Für die Gestaltung der Geometrie ist eine stetige Linienführung vorteilhaft. Bei Bedarf kann diese durch Polygon Linien approximiert werden. Dies trifft besonders für die Fertigung mittels Fotolithografie zu, bei der die Geometrien auf den genutzten Foto-Lithografie- Masken üblicherweise durch die Verknüpfung/Aneinanderreihung von Polygonen erzeugt werden. Dimensionierung der Rückhaltestruktur (111):
Die Breite des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Kanals liegt im Bereich von 120 bis 1200 gm.
Die Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Kanals liegt im Bereich von 10 bis 400 gm. Die Breite des aus der Rückhaltestruktur (111) auslaufenden
Mikrokanals (3) liegt im Bereich von 20 bis 1200 gm und entspricht vorzugsweise der Breite des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Mikrokanals (3). Die Höhe des aus der Rückhaltestruktur (111) auslaufenden
Mikrokanals (3) liegt im Bereich von 10 bis 400 gm und entspricht vorzugsweise der Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Mikrokanals (3). Die Höhe der Barrierenstruktur beträgt mindestens 0.1 * Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Mikrokanals (3) und maximal 0.9 * Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden
Mikrokanals (111). Die minimale Weite des Durchlasses (4) beträgt mindestens 0.5 * Höhe der Barrierenstruktur und maximal 2.0 * Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Kanals.
Zu den zur Anwendung kommenden Volumenströmen Q:
Der Volumenstrom Q sind an den Kanalquerschnitt A gekoppelt. Dabei gilt: Q = u * A.
Hohe Volumenströme, bei denen große Luftblasen die Struktur passieren, betragen 100 - 500 mm/s Flussgeschwindigkeit gemessen im einlas seitig in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden Mikrokanal (3).
Mittlere Volumenströme, bei denen kleine Tropfen die Rückhalte struktur (111) im Durchlass (4) passieren, betragen 10 - 100 mm/s mittlere Geschwindigkeit gemessen im einlasseitig in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden Mikrokanal (3).
Geringe Volumenströme, bei denen kleine Tropfen durch die Rückhaltestruktur (111) zurückgehalten werden und den Durchlass (4) nicht passieren, betragen 0.1 - 10 mm/s mittlere Geschwindigkeit gemessen im einlasseitig in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden Mikrokanal (3).
Auswahl möglicher Anwendungsfälle und hierfür genutzte Tropfengrößen.
Ein Tropfendurchmesser von 3 - 50 pm mit einer Erzeugungsrate von 5 kHz -100 kHz wird bspw. zur digitalen PCR, isotherrnale DNA Amplifikations-Assays, Assays für Einzelmolekül Nachweis, Single-Cell Assays, Single Bacteria Assays, Single Phage Assays (Digital Phage Display) eingesetzt.
Ein Tropfendurchmesser von 20-100 pm mit einer Erzeugungsrate von 1 kHz - 50 kHz wird bspw. für mikrobielle und zellbasierte Reporter Assays mit Vorkultivierung, Digitale PCR in Anwesenheit von DNA- Capture Beads für Next Generation Sequencing eingesetzt.
Ein Tropfendurchmesser 50-200 pm mit einer Erzeugungsrate von 0.5 kHz -15 kHz wird bspw. für Untersuchung an Säuger-Zellkulturen und Stammzellen, Mikrofermentation-Experimente, Spherid-Erzeugung, Hybridoma-Zellkulturen für Stammoptimierung/Stammplege in der Antikörper Produktion und zur Untersuchung mikrobieller Konsortien eingesetzt. Ausführungsbeispiel 2:
Mikrotropfenrückhalteanordnung in einem integriertem mikrofluidischen Bauelement Wie in Fig. 4 dargestellt, kann die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) in einem integriertem mikrofluidischen Bauelement realisiert werden, in dem eine Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) einlas sseitig (e) in einem Mikrokanal (3) angeordnet ist, welcher in eine als Kapillarspalt ausgestalteten Speicherkammer (2) für Probetröpfchen einer vorgegebenen Größe einmündet und eine zweite Mikrotropfen rückhalteanordnung (1) auslassseitig (a) in einem Mikrokanal (3) angeordnet ist, welcher aus der Speicherkammer (2) entspringt, so dass die Speicherkammer (4) einlassseitig (e) und auslassseitig (a) durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) begrenzt wird, so dass das Trennen von Probenkomponenten durch Unterteilen derselben in Tröpfchen oder andere Komponenten, das Verstärken oder anderweitiges Reagieren der Komponenten innerhalb der Tröpfchen, das Detektieren der amplifizierten Komponenten oder Eigenschaften davon und / oder das Analysieren der resultierenden Daten ermöglicht wird.
Dabei wird die Funktionalität der Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) durch die Flüssigkeitsvolumenströme, welche im Bauelement steuerbar sind, eingestellt, in dem zum Durchtritt von Luftblasen durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) geringe Volumenströme im Bereich von 0,1 bis 10 mm/s zum Zurückhalten von Probetropfen durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1), mittlere Volumenströme im Bereich von 10 bis 100 mm/s zum mittigen Austreiben von Probetropfen durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) und hohe Volumenströme im Bereich von 100 bis 500 mm/s zum Austreiben von Luftblasen im mikrofluidischen Bauelement gemäß dem vorbekannten Stand der Technik eingestellt werden.
Ausführungsbeispiel 3:
Mikrotropfenrückhalteanordnung in einem integriertem mikrofluidischen Bauelement zur Bestimmung der Anzahl der gegen beta-Lactam- Antibiotika (Penicilline) resistenten Erreger in einer Probe und die Gewinnung der Erreger für eine nachfolgende mikrobiologische / molekularbiologische Analyse. Erreger mit einer Resistenz gegen beta-lactam-Antibiotika sezernieren das Enzym beta-Lactamase als ExoEnzym. Dieses bewirkt die Spaltung des beta-Lactam Ringes des Antibiotikums und damit eine Deaktivierung der antibakteriellen Wirkung dieses Wirkstoffes. Für die Durchführung der Bestimmung der der Anzahl der gegen beta- Lactam-Antibiotika resistenten Erreger in einer Probe und die Gewinnung der Erreger für eine nachfolgende mikrobiologische und/ oder molekularbiologische Analyse wird ein mikrofluidisches Bauelement gemäß Fig. 1 in einer integrierten Fluidanordnung verwendet.
Dabei wird eine Probe, enthaltend die zu untersuchenden Mikroorganismen, mit einem chromogenen beta-Lactamase Substrat (sigma Product ID: MAK221) versetzt und in eine Tropfensuspension überführt.
Bei Anwesenheit des Enzymes beta-Lactamase wird dieses Substrat gespalten und setzt einen Farbstoff frei. Die Tropfensuspension wird in der durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) begrenzten Kapillarspaltkammer (Speicherkammer) eingelagert, inkubiert und nach der Inkubation durch eine Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gemäß
Fig. 5 hindurchgeführt. Nach dem Hindurchtreten der einzelnen Tropfen werden diese optisch gemäß dem Stand der Technik untersucht / analysiert. Anhand der Bildung einer farbigen Spezies werden Tropfen, in denen sich Penicillin-resistente Mikroorganismen befinden anhand der Bildung des Farbstoffes identifiziert. Die ermittelte Anzahl positiver Tropfen (gefärbte Tropfen) dient als primärer diagnostischer Befund. Durch nachfolgendes Austreiben der Tropfen aus der Inkubationskammer und Sortieren werden die Tropfen mit positiver Färbung gewonnen und einer nachfolgenden mikrobiologischen oder molekularbiologischen Analyse zugeführt.
Ausführungsbeispiel 4
Mikrotropfenrückhalteanordnung in einem integriertem mikrofluidischen
Bauelement zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion (PCR)
Das System zur Polymerasekettenreaktion (PCR), welches mindestens zwei Mikrotropfenrückhalteanordnungen (1) enthält, dient dem Trennen von Probenkomponenten durch Unterteilen derselben in Tröpfchen, dem Verstärken oder anderweitiges Reagieren der Komponenten innerhalb der Tröpfchen, dem Detektieren der amplifizierten Komponenten oder Eigenschaften davon und / oder dem Analysieren der resultierenden Daten.
Das System umfasst einen Tröpfchengenerator, der zum Erzeugen von Tröpfchen konfiguriert ist, die Teile einer zu analysierenden Probe enthalten, wobei die Tröpfchen in einem nicht mischbaren Fluid (11) angeordnet sind, das eine Probenemulsion bildet, eine Heiz- und Kühlstation mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass , eine Detektionsstelle stromabwärts von der Heiz- und Kühlstation, einen Kanal, der einen kontinuierlichen Fluidweg vom Fluideinlass zum Fluidauslass der Heiz- und Kühlstation bildet, eine Pumpe zum Bewegen der Probenemulsion durch den Kanal, eine Steuerung, die programmiert ist, um einen Fluidtransport durch den Kanal zu betreiben, und einen Analysator, der konfiguriert ist, um Daten zu verarbeiten, die an der Erfassungsstation gesammelt werden.
Dabei kann ein Tröpfchenreservoir vorgesehen sein, wobei eine erste Fluidleitung den Tröpfchengenerator mit dem Tröpfchen reservoir verbindet, und eine zweite Fluidleitung, die das Tröpfchenreservoir mit dem Fluideinlass der Heiz- und Kühlstation verbindet. Ein Controller kann so programmiert sein, dass er den Tröpfchengenerator so einstellt, dass er die Tröpfchengröße und die Tröpfchenerzeugungsfrequenz basierend auf den an der Detektions stelle empfangenen Daten ändert.
Der mindestens eine Tröpfchengenerator, bildet eine Vielzahl von Emulsionen einschließlich Tröpfchen, die jeweils eine Probenpartition enthalten, die als eine Reaktionsmischung zur Amplifikation eines Nukleinsäureziels vorbereitet ist.
Das planare System zur Polymerasekettenreaktion ist durch seine Hohlräumen definiert, und hält /führt / leitet die Emulsionen.
Die Heiz- und Kühlvorrichtung dient dazu, die in den Hohlräumen angeordneten Emulsionen zu erhitzen / zu kühlen (meist zeitlich sequentiell), um eine Nukleinsäureamplifikation in den Tröpfchen zu induzieren.
Vermittels einer Detektionsanordnung, welche an der Detektions stelle positionierbar ist, dient dem Detektieren von Signalen aus den intakten Tröpfchen der Emulsionen, wobei eine Steuerung, die mit der Detektionsanordnung in Verbindung steht und programmiert ist, vorgesehen ist, um die Anwesenheit des Nukleinsäuretargets in einer Probe (falls vorhanden) basierend auf Signalen, die bei den intakten Tröpfchen detektiert werden, zu detektieren und zu analysieren.
Für eine Vielzahl der hier aufgezeigten Anwendungsbeispiele ist ein dem Assay nachgeschaltetes Sortieren für die Gewinnung von Tropfen und Tropfeninhalten mit selektierbaren Eigenschaften von höchster Bedeutung.
Für die Implementierung vollständiger Hochdurchsatz-Screening Verfahren ist die Gewinnung der identifizierten Hits für eine nachgeschaltete detaillierte Analyse und Verwertung fester Bestandteil des Workflows.
Die erfindungsgemäße multifunktionale Rückhaltestruktur eröffnet nunmehr die Möglichkeit, digital tropfenbasierte Assays auf nur einem Chip mit Sortierverfahren zu kombinieren und damit komplette Hochdursatz-Screening-Verfahren auf einen einzigen integrierten Lab- on-a-Chip-Bauelement zu implementieren.
Alle in der Beschreibung, den Ausführungsbeispielen und den nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.
Bezugszeichenliste
1 Mikrotropfenrückhalteanordnung
111 Rückhaltestruktur
10 zu analysierenden Probe
11 nicht mischbaren Fluid
15 Detektions stelle
16 Kanal
2 Speicherkammer
3 Mikrokanal
4 Durchlass a Fluidauslass
e Fluideinlass
aw auslaufende Wand
ew einlaufende Wand
w Wand
A erste Schnittebene
B zweite Schnittebene
C dritte Schnittebene x, y, z Raumkoordinaten
Transportrichtung (Flussrichtung)

Claims

Patentansprüche
1. Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) ausgebildet in Form einer Furt in einem Mikrokanal (3) als Verengung des Mikrokanals (3) mit einem Durchlass (4) für Flüssigkeiten als Strömungsverengung, wobei der Mikrokanal (3) in eine Speicherkammer (2) mündet, dadurch gekennzeichnet, dass die in die Verengung des Mikrokanals (3) einlaufende Wand (ew) und die aus der Verengung des Mikrokanals (3) auslaufende Wand (aw) jeweils in einer konkaven Form des Mikrokanals (3) ausgeführt ist und dabei die ausgebildete Verengung des Mikrokanals (3) am Durchlass (4) so ausgestaltet ist, dass die Länge des Durchlasses (4) in Flussrichtung des Mikrokanals (3) sehr kurz bis nahezu punktförmig und gleichzeitig der Rand der Verengung am Durchlass (4) verrundet ist, so dass eine Rückhaltestruktur (111) ausgebildet wird, wobei die Konkavität der einlaufenden Wand (ew) sowie der auslaufende Wand (aw) der Rückhaltestruktur (111) gleich oder ungleich ist und die einlaufende Wand (ew) sowie die auslaufende Wand (aw) der Rückhaltestruktur (111) mit einem durchgehend gleichmäßigem Verlauf ausgeführt ist, wobei die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) über die drei Funktionalitäten verfügt, indem
• die Tropfenrückhalteanordnung (1) mit einer sehr starken Flüssigkeitsgeschwindigkeit im Bereich von 100 bis 500 mm/s beaufschlagt wird, um das System von Luftblasen zu befreien, und
• die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) mit einer geringen
Flüssigkeitsgeschwindigkeit im Bereich von 0,1 bis 10 mm/s beaufschlagt wird, um ein das Einlagern von Tropfen in der Speicherkammer (2) durch die Rückhaltestruktur (111) zu bewirken,
und
• die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) mit einer mittleren
Flüssigkeitsgeschwindigkeit im Bereich von 10 bis 100 mm/s beaufschlagt wird, um ein Austreiben von Tropfen durch den Durchlass (4) als mittig geführte, gleichförmig beabstandete Folge von Tropfen zu bewirken.
2. Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einlaufende Wand (ew) und die auslaufende Wand (aw) der Rückhaltestruktur (111) mäanderförmig gleichmäßig oder ungleichmäßig in langen flachen oder kurzen starken Wellenformen oder stufenförmig ausgeführt ist.
3. Verfahren zum Betreiben einer Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gemäß Anspruch 1 oder 2 in einem mikrofluidischen System, wobei die Tropfenrückhalteanordnung (1) mit einer sehr starken Flüssigkeitsgeschwindigkeit im Bereich von 100 bis 500 mm/s beaufschlagt wird, um das System von Luftblasen zu befreien.
4. Verfahren zum Betreiben einer Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gemäß Anspruch 1 oder 2 in einem mikrofluidischen System, bei dem der Mikrokanal (3) in eine Speicherkammer (2) mündet und die
Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) in dem Mikrokanal (3) vor der Speicherkammer (2) angeordnet ist, wobei die
Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) mit einer geringen Flüssigkeits geschwindigkeit im Bereich von 0,1 bis 10 mm/s beaufschlagt wird, um ein Einlagem von Tropfen in der Speicherkammer (2) durch die Rückhaltestruktur (111) zu bewirken.
5. Verfahren zum Betreiben einer Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gemäß Anspruch 1 oder 2 in einem mikrofluidischen System, bei dem der Mikrokanal (3) in eine Speicherkammer (2) mündet und die
Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) in dem Mikrokanal (3) vor der Speicherkammer (2) angeordnet ist, wobei die
Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) mit einer mittleren Flüssigkeitsge-schwindigkeit im Bereich von 10 bis 100 mm/s beaufschlagt wird, um ein Austreiben von Tropfen durch den
Durchlass (4) als mittig geführte, gleichförmig beabstandete Folge von Tropfen zu bewirken.
6. Verwendung einer Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gemäß Anspruch 1 oder 2 in einem mikrofluidischen System auf Chip-Basis um einen Durchtritt von Luftblasen durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1), um ein Zurückhalten von Probetropfen bei geringen Volumenströmen durch die
Rückhaltestruktur (111) oder um ein mittigen Austreiben von Probetropfen durch den Durchlass (4) bei mittleren Volumenströmen zu bewirken.
7. Verwendung einer Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gemäß
Anspruch 6 bei der Polymerasekettenreaktion in einem integrierten mikrofluidischen Chipsystem für die Durchfluss-Analyse in monolithisch integrierten oder modularen Anordnungen.
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