EP3931567A1 - Verfahren zur funktionalisierung einer oberfläche, erzeugnis mit einer nach dem verfahren funktionalisierten oberfläche und verwendungen derselben - Google Patents

Verfahren zur funktionalisierung einer oberfläche, erzeugnis mit einer nach dem verfahren funktionalisierten oberfläche und verwendungen derselben

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Publication number
EP3931567A1
EP3931567A1 EP20707261.2A EP20707261A EP3931567A1 EP 3931567 A1 EP3931567 A1 EP 3931567A1 EP 20707261 A EP20707261 A EP 20707261A EP 3931567 A1 EP3931567 A1 EP 3931567A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polyphenol
functional molecule
minutes
layer
iodine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20707261.2A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nenad Gajovic-Eichelmann
Marina NEUMANN
Frank Bier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP3931567A1 publication Critical patent/EP3931567A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing

Definitions

  • the surfaces typically first have to be converted into high-energy surfaces with the help of complex processes.
  • a further complicating factor is that functional molecules, especially those of biological origin, are usually very sensitive and can only be processed under gentle conditions, for example in an aqueous solution with a neutral pH value and at temperatures below about 40 ° C.
  • functional molecules especially those of biological origin, are usually very sensitive and can only be processed under gentle conditions, for example in an aqueous solution with a neutral pH value and at temperatures below about 40 ° C.
  • Metals and semiconductors can e.g. B. be coated with a high-energy oxide layer by chemical, plasma-chemical or electrochemical oxidation. This can then be z.
  • ceramics and glasses can be functionalized in a similar way.
  • Process steps such as B. include a plasma chemical oxidation and a sequence of different wet chemical treatments in an organic and aqueous medium. Such surfaces are therefore often only subject to a great deal of equipment and time
  • plastic items are usually relatively inexpensive and are therefore often used as disposable items such. B. for bioanalysis, diagnostics and medicine produced in very large numbers, so that a suitable functionalization process should be quickly feasible and as inexpensive as possible.
  • EP 0 644 904 A1 discloses a method in which plastic surfaces are coated with a thin layer of lacquer or a reactive polymer thin layer in order to enable the binding of biologically active molecules. Disadvantages of this process are the relatively high technical complexity and the often inadequate resistance or stability of the resulting surfaces, so that
  • the functionalization which is technically much easier to implement, is still predominantly based on direct adsorption of functional molecules such as B.
  • functional molecules such as B.
  • Proteins on plastic surfaces are used.
  • the surface attachment or adhesion is based on a partial unfolding and denaturation of the proteins on the hydrophobic plastic surface. This process is not only lengthy and relatively inefficient, but also means that a large proportion of the surface-bound proteins are denatured and inactive. This increases due to mostly
  • a “functional molecule” within the meaning of the present invention can be any molecule that has a specific or technical
  • a biomolecule such as. B. a protein, for example an enzyme, an antigen or an antibody, or a nucleic acid.
  • a functional molecule can be a chemical molecule, in particular a polymer such as. B. a
  • “functionalizing” a surface with the aid of the attachment of such a functional molecule means a specific one, in particular not one of the surface itself
  • degree of functionalization here is understood to mean the ratio of those functional molecules which are bound on the surface in an active or functional form to those which have lost their function as a result of the surface binding.
  • Polyphenol compounds or “polyphenols” are used here as a collective term for a diverse structural class that is more chemical
  • polyphenolic compounds are nitrogen-free chemical ones
  • a "polyphenol layer” accordingly corresponds to a layer on a surface which is a polyphenol or a
  • polyphenol layer also expressly includes those layers which
  • Oxidizing agent is a substance that can oxidize other substances in a redox reaction and is itself reduced in the process. Oxidizing agents can accept electrons and are therefore also referred to as electron acceptors.
  • quinone an oxidation product of a polyphenol or a polyphenol compound is referred to here, in which the
  • a method for functionalizing a surface is specified.
  • at least one is initially applied or deposited
  • Polyphenol layer generated on the surface In one
  • the polyphenol layer is then attached to the polyphenol layer in order to functionalize the surface in this way.
  • the method according to the invention is characterized in that the polyphenol layer at least in a further step
  • the treatment with the oxidizing agent can be carried out here and / or after the functional molecule has been tied up, but treatment during the tethering of the functional molecule is also possible.
  • Oxidizing agent at least partially, preferably completely, carried out after the functional molecule has been bound to the polyphenol layer. In the latter case, the attachment of the functional molecule and the subsequent treatment with the oxidizing agent are consequently separate process steps.
  • the inventors have recognized that the surface functionalization with the help of polyphenol layers according to the teaching of WO 2014/116812 A2 is often not sufficient, despite the advantages in principle, to meet the high demands on degree of functionalization, stability, reproducibility and cost efficiency. B. be placed on the functionalized surfaces of analytical and diagnostic products.
  • the proteins can spontaneously detach themselves from the surface or be displaced by other proteins or substances with a higher surface affinity. This is particularly problematic in analytical and
  • the present invention solves this problem by providing the
  • the polyphenol compound in the layer is at least partially converted into an oxidized or reactive form and thereby enabled to form a covalent bond to
  • a reactive quinone can form through the oxidation of the polyphenol compound, to which the functional molecule z. B. via amino, thiol and / or
  • Hydroxyl groups add nucleophilically. This ensures that functional molecules, in particular proteins, which, according to the previously known methods, are only bound to the polyphenol layer by adsorption and accordingly reversibly, are covalently and thus essentially irreversibly coupled to the surface with the aid of the oxidation treatment, without further chemical activation reagents being added to the reaction must be added as in conventional bioconjugation techniques.
  • any polyphenol compound which is known and suitable to the person skilled in the art from the prior art, for example WO 2014/116812 A2, can be used to produce the polyphenol layer.
  • it can be a naturally occurring or vegetable polyphenol compound.
  • these are readily available, inexpensive and non-toxic, which makes the handling of the
  • functionalized surfaces are intended for use on or in the human body, as is the case e.g. B. at
  • polyphenol compound is essentially free from amines (-NR 3) or amino groups (-NH2) or does not contain any amines or amino groups.
  • amine-containing polyphenol compounds in the method according to the invention leads to colored, dark
  • Polyphenolic layers can lead.
  • the method according to the invention can be used to produce transparent and colorless polyphenol layers, which are particularly preferred for many applications in analysis and diagnostics.
  • the polyphenol compound has at least one ortho-diphenol group, which is converted into an ortho-quinone group by treatment with the oxidizing agent.
  • the inventors have found that in this way a particularly high reactivity of the oxidized polyphenol layer can be achieved, which enables particularly rapid and efficient covalent attachment of the
  • the method according to the invention can be used to achieve efficient functionalization or a high degree of functionalization of the modified surface even when using small amounts of the functional molecule.
  • the polyphenolic compound can e.g. B. comprise or consist of a tannin, in particular a gallotannin or an ellagitannin, or a catechin.
  • the polyphenol compound is preferably selected from the group comprising or consisting of
  • Tannic acid, gallocatechin, epicatechin, epigallocatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin-3-gallate and pyrogallol can also be used to produce the polyphenol layer, so that any desired combinations of the aforementioned compounds are also possible.
  • the polyphenolic compound particularly preferably comprises tannic acid.
  • the polyphenol compound can in principle be applied using any of the methods described in the prior art for producing a polyphenol layer. Suitable methods are the Those skilled in the art are known from WO 2014/116812 A2, GB 190707775 A and GB 260290 A, among others.
  • the polyphenolic compound can e.g. B. at a concentration of 0.1 to 10 milligrams per
  • Milliliters preferably 0.5 to 5 milligrams per milliliter, particularly preferably 1 to 2 milligrams per milliliter, are present in the coating solution.
  • Deposition of the polyphenol compound is carried out under milder conditions and / or for a shorter time than is the case with the previously known methods.
  • the pH is
  • Coating solution greater than or equal to pH 6.0, greater than or equal to pH 6.5 or greater than or equal to pH 7.0 and / or less than or equal to pH 9.0, less than or equal to pH 8.0 or less than or equal to pH 7.5.
  • the pH of the coating solution is preferably in a range from pH 7.0 to pH 7.6, in particular pH 7.2 to pH 7.5.
  • the coating solution can expediently contain one or more buffer substances. Suitable buffers such as B. Phosphate buffers are known to those skilled in the art or can be readily determined on the basis of this description. They are preferably inorganic or amine-free buffer substances.
  • the coating solution contains a salt or a mixture of salts in one
  • the concentration is in a range of 50 to 500 millimoles per liter, preferably 100 to 250 millimoles per liter
  • the salt or the mixture of salts can e.g. B. a sodium salt, a potassium salt
  • the salt or the mixture of salts can be selected from NaCl, NaNCL, Na2SC> 4, KCl, K 2 SO 4 , MgCl2, CaCl2, CUCI2 and / or ZnCl2.
  • the surface is in contact with the coating solution for at least 1 minute, at least 10 minutes, at least 20 minutes or at least 30 minutes and / or at most 120 minutes, at most 90 minutes or at most 60 minutes.
  • the contact time can be, for example, 1 to 120 minutes, preferably 10 to 90 minutes, preferably 30 to 70 minutes, particularly preferably 40 to 60 minutes. It is a particular benefit of the
  • the method according to the invention has an improved efficiency compared to conventional methods and enables a higher production throughput, which is particularly suitable for mass production.
  • the coating solution has a low viscosity, so that z. B. also the surfaces of porous materials such as
  • Agents can be coated.
  • the composition can be coated.
  • Coating solution has a viscosity of 1 to 100
  • Millipascal seconds preferably from 2 to 20 millipascal seconds, particularly preferably from 2 to 10 millipascal seconds.
  • the polyphenol layer can in principle be contacted with any suitable oxidizing agent and under conditions which lead to the polyphenol compound in the layer being at least partially converted into an oxidized form.
  • any suitable oxidizing agent in addition to a preferred chemical
  • Oxidation is e.g. B. enzymatic oxidation is also possible.
  • Preferred oxidizing agents are e.g. B. hydrogen peroxide (H2O2), elemental iodine (12) and / or iodide, the oxidizing agent in particular in the form of a buffered, aqueous
  • Oxidizing agent solution can be present or is contained therein. Suitable concentrations of the aforementioned oxidizing agents in the oxidizing agent solution are e.g. B. in the range from 0.01 to 100 milligrams per milliliter of iodine and / or iodide or 0.01 to 10% (v / v) hydrogen peroxide.
  • concentrations of the aforementioned oxidizing agents in the oxidizing agent solution are e.g. B. in the range from 0.01 to 100 milligrams per milliliter of iodine and / or iodide or 0.01 to 10% (v / v) hydrogen peroxide.
  • the inventors have found that with these oxidizing agents, e.g. B. with elemental iodine (12), the polyphenol layer can be oxidized within a very short time without the unwanted side reactions
  • the polyphenol layer is for at least 10 seconds, at least 30 seconds or at least 60 seconds and / or at most 75 minutes, at most 60 minutes, at most 45 minutes, at most 30 minutes, at most 15 Minutes, a maximum of 10 minutes or a maximum of 5 minutes treated with the oxidizing agent.
  • Preferred treatment times are in the range from 0.1 to 75 minutes, 0.5 to 30 minutes or 1 to 5 minutes. In this way, the polyphenol layer can be oxidized very efficiently and without damage or undesirable side reactions.
  • the iodine and / or iodide is at least partially present as an iodine-iodide-starch complex or polyiodide-starch complex, also referred to below as iodine starch.
  • iodine starch e.g. B. by mixing elemental iodine or iodine-iodide solutions (z. B. iodine-potassium iodide solution or iodine-sodium iodide solution) with starch, especially water-soluble starch.
  • Suitable oxidant solutions can be about 0.01 to 80 milligrams per milliliter or about 10 to 50 milligrams per milliliter of starch, about 0.01 to 100 milligrams per milliliter or about 0.1 to 10 milligrams per milliliter of iodine and / or about 0.01 to 100 milligrams per milliliter or about 0.1 to 10 milligrams per milliliter of iodide, especially sodium and / or potassium iodide.
  • iodide especially sodium and / or potassium iodide.
  • iodine starch the oxidizing effect of elemental iodine can be used, but at the same time the reactivity of the iodine is reduced to such an extent that the reaction time and effective dose can be controlled better than when using pure iodine.
  • Polyphenolic layer begins to disintegrate the inclusion compound, z. B. by cross-linking the starch, whereby the iodine or
  • Iodide is released locally and can oxidize the polyphenol compound. Reactive iodine or iodide is therefore not released in the volume, but directly at the interface with the polyphenol layer, and only as long as oxidizable phenol groups are still present in the polyphenol layer.
  • Reactive iodine or iodide is therefore not released in the volume, but directly at the interface with the polyphenol layer, and only as long as oxidizable phenol groups are still present in the polyphenol layer.
  • Functional molecule is treated with the oxidizing agent.
  • iodine starch has a blue, blue-violet to black color and becomes discolored with the disintegration of the inclusion compound.
  • the inventors have found that the starch itself also with the oxidized polyphenol layer, e.g. B. by nucleophiles
  • the starch binding also increases the hydrophilicity of the surface and makes it chemically inert.
  • the method according to the invention is therefore particularly suitable for the production of solid phase reagents for bioanalytical or immunological tests such as ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) and for the hydrophilization or passivation of microfluidic components and systems, in particular
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the starch itself can therefore be used as a functional molecule in the context of the present invention, eg. B. if with the functionalization predominantly the goal of
  • the functional molecule is preferably bound to the polyphenol layer from a solution, also referred to below as a functionalization solution, with which the
  • Polyphenol layer is contacted under conditions that allow the functional molecule to bind or adsorb to the surface of the polyphenol layer.
  • functional molecules of biological origin such as B.
  • Proteins are particularly aqueous, salt-containing buffer solutions as functionalization solution with essentially physiological ionic strength and a pH in the range from pH 5.0 to pH 9.0. Suitable is e.g. B. a physiological phosphate-buffered saline solution (PBS-buffer) with pH 7.4.
  • PBS-buffer physiological phosphate-buffered saline solution
  • Further suitable buffer solutions are known to the person skilled in the art or can be readily determined with the aid of the present description.
  • the functionalization solution contains at least 0.01 micrograms per milliliter, at least 0.05 micrograms per milliliter or at least 0.1 micrograms per milliliter and / or at most 10 milligrams per milliliter, at most 1 milligrams per milliliter, at most 100 micrograms each Milliliters, not more than 10 micrograms per milliliter,
  • the concentration of the functional molecule is preferably in a range from 0.01 micrograms to 10 milligrams per milliliter
  • the functional molecule can, for. B. in a mixture of at least two or more
  • the total concentration of the functional molecules in the mixture preferably corresponds to the aforementioned concentration data
  • the method is hardly reproducible because the
  • reaction speed and the binding energy in this case depend on the individual physico-chemical properties of the various functional molecules. Since adsorption generally favors the binding of molecules with high abundance and / or high surface affinity and, in addition, when a stable absorption equilibrium is established in the presence of several proteins, low-affinity molecules can be displaced by high-affinity molecules, which means that surface functionalization is reproducible and controllable by adsorptive coupling of mixtures of different
  • the polyphenol layer for at least 1 minute, at least 2 minutes, at least 3 minutes or at least 5 minutes and / or for a maximum of 120 minutes, a maximum of 60 minutes or a maximum of 30 minutes with the
  • Preferred contact times are in the range from 1 to 120 minutes, preferably 2 to 60 minutes, particularly preferably 5 to 30 minutes.
  • the functional molecule is preferably bound at a temperature of 10 ° C to 60 ° C, preferably 15 ° C to 40 ° C, particularly preferably 20 ° C to 37 ° C or 20 ° C to 25 ° C
  • the method according to the invention provides a particularly homogeneous and
  • the method according to the invention is suitable in principle for all functional molecules that react with the oxidized form of the polyphenol layer and, in particular, can form a covalent bond.
  • Non-limiting examples are therefore chemical or biological functional molecules which contain at least one nucleophilic group such.
  • B. contain an amino group (-NH 2) , a thiol group (-SH) and / or a hydroxy group (-OH).
  • the functional molecule is particularly preferably a biomolecule, for example a protein and in particular an antibody, which, under the above-mentioned conditions, is particularly gently and, in contrast to conventional methods, safely coupled to the surface while largely maintaining the biological or biochemical function can be.
  • the polyphenol layer is additionally treated, at least in sections, with at least one di- or multivalent nucleophile, i.e. a compound with two or more nucleophilic groups, hereinafter also as a blocking or blocking agent.
  • the blocking or cross-linking step can take place after the functional molecule has been attached, after the treatment with the oxidizing agent and / or during the treatment with the oxidizing agent. In preferred embodiments, the blocking or crosslinking step is carried out after the functional molecule has been attached and after treatment with the oxidizing agent.
  • the functional molecule and the di- or multivalent nucleophile are preferably different molecules. But it is also possible that the blocking or cross-linking step, the connection of the
  • Functional molecule contains or replaces, in that the di- or multivalent nucleophile is at the same time a functional molecule, for example a protein which contributes to the inertization and / or hydrophilization of the surface.
  • the nucleophilic groups in particular include two or more groups selected from -NTQ, -SH, -OH and any Combinations of these. Suitable nucleophiles can e.g. B.
  • Some non-limiting examples are bovine serum albumin (BSA), casein, gelatin or their fragments.
  • BSA bovine serum albumin
  • a mixture of protein fragments obtained from gelatin is preferably used, which in
  • the polyphenol layer is treated with the di- or multivalent nucleophile for at least 10 minutes, preferably at least 20 minutes, particularly preferably at least 30 minutes and / or at most 600 minutes, preferably at most 240 minutes, particularly preferably at most 120 minutes.
  • the treatment time is preferably 10 to 600 minutes, in particular 30 to 240 minutes.
  • the treatment is preferably carried out with the di- or
  • multivalent nucleophile by contacting the polyphenol layer with a solution which is at least 0.1 percent by weight, preferably at least 0.5 percent by weight, particularly preferably at least 1 percent by weight and / or at most 50
  • Weight percent preferably at most 10 weight percent
  • Suitable concentrations range from 0.1 to 50 percent by weight, 1 to 10
  • the sequence of the method steps according to the invention is not particularly restricted.
  • the binding of the functional molecule to the polyphenol layer preferably before the treatment of the Polyphenol layer is carried out with the oxidizing agent, it is also possible to first oxidize the polyphenol layer and only then to bind the functional molecule to it.
  • Another possibility is to combine the attachment of the functional molecule and the treatment with the oxidizing agent at least partially or completely in one step. This can be
  • the two treatments with the oxidizing agent and with the di- or multivalent nucleophile can be exchanged or combined into one step, i. H. Oxidation and simultaneous blocking and
  • Cross-linking step This can be particularly advantageous for further shortening the overall process duration.
  • Certain versions can also include the three process steps, binding of the functional molecule, treatment with the
  • the surfaces can be coated over with an aqueous saccharide, polysaccharide, protein or polymer solution, which then z. B. is removed or dried at atmospheric pressure, negative pressure or in vacuo.
  • Suitable protective substances such as trehalose, pectin, gelatin or polyvinyl alcohol and corresponding processes are well known to the person skilled in the art.
  • the method according to the invention is particularly distinguished by the fact that it is suitable in an unexpectedly universal way for surface functionalization of the most varied of materials and for the most varied of applications.
  • the surface can e.g. B. a plastic surface, a ceramic surface, a
  • the method comprises the functionalization of a plastic surface, the plastic being in particular made of polystyrene, polyvinyl chloride
  • optical properties e.g. B. a high transparency and low birefringence, such as are used for optical devices or diagnostic methods with optical detection, functionalized with the method according to the invention.
  • plastics such as COC
  • the invention relates to a product or a carrier with a surface which
  • Product according to the invention characterized in that at least in sections a polyphenol layer is present on the surface at least one functional molecule attached to the polyphenol layer is arranged, wherein between the
  • the functional molecule comprises a protein, in particular an antibody or an antigen.
  • at least two or more different functional molecules for example two or more different proteins, in particular two or more different antibodies and / or two or more different antigens, are covalently attached to the polyphenol layer
  • the polyphenol layer additionally has a cross-linking between two or more
  • Nucleophile is formed or can be formed on the polyphenol layer.
  • the crosslinking or the di- or multivalent nucleophile comprises a biological or synthetic polymer, which is preferably composed of protein,
  • Protein fragment peptide, polyethyleneimine, poly-L-lysine,
  • Polyvinyl alcohol, hydroxyethyl cellulose, pectin and / or starch or a respective part thereof is selected.
  • the product is a
  • the product is a microtiter plate (microplate) or a cell culture plate.
  • the product is a microfluidic component, for example a chip laboratory or a so-called "lab-on-a-chip device"
  • the product is a solid particle, in particular a micro or nanoparticle.
  • the product is a filter or a membrane. In still other configurations, the product is a
  • Medical product for example a prosthesis, an implant, an implantable data chip, an artificial vessel or organ, a catheter, a stent, a tube, a blood bag, a probe, a contact lens or the like.
  • a third aspect of the invention relates to a use of a method according to the first aspect or a use of a product according to the second aspect for technical,
  • Purposes are, for example, separation and / or cleaning processes.
  • Non-exhaustive possibilities for biotechnical purposes are e.g. B. analytical and / or diagnostic tests, in particular antibody-based or antigen-based
  • Detection methods immunoassays and here in particular those in the so-called ELISA format.
  • Implantation technology as well as in the hygiene area into consideration.
  • a fourth aspect of the invention relates to a kit for functionalizing a surface.
  • the kit includes
  • a polyphenol layer can be produced in sections on the surface and then at least one functional molecule can be attached to the polyphenol layer in order to functionalize the surface.
  • the kit contains at least one oxidizing agent with which the polyphenol layer can be treated at least in sections and in an oxidized form
  • kit be set up to carry out a method according to the first aspect or to manufacture a product according to the second aspect. It is provided, for example, that one or more articles with the to be coated in the kit
  • the oxidizing agent contained in the kit comprises hydrogen peroxide (H 2 O 2) , iodine (1 2) and / or iodide.
  • the kit preferably contains the iodine and / or iodide at least partially as an iodine-iodide or polyiodide-starch complex or in a form with which an iodine-iodide or polyiodide-starch complex can be produced, e.g. B. as iodine-potassium iodide solution or iodine-sodium iodide solution.
  • the kit can also contain starch, especially water-soluble starch,
  • the kit can have one or more buffers and / or
  • Buffer substances e.g. B. in powder form, for the preparation of a buffered solution of the polyphenol compound, des
  • Preferred and advantageous embodiments of the product according to the second aspect of the invention, the use according to the third aspect of the invention and of the kit according to the fourth aspect of the invention correspond, as far as applicable, to those of the method according to the first aspect of the invention.
  • Features that are disclosed above and below for the method can therefore also relate to the product, the use and the kit and vice versa.
  • FIG. 1 shows the water contact angle in degrees (y-axis) of tannic acid layers on polystyrene as a function of the duration in minutes (x-axis) of an oxidative treatment with iodine or iodine starch of different composition.
  • A 2 milligrams per milliliter of iodine;
  • B 0.4 milligrams per milliliter of starch + 0.02 milligrams per milliliter of iodine;
  • C 4 milligrams per milliliter
  • Figure 2 shows the water contact angles in degrees (y-axis) of
  • FIG. 3 shows dose-effect curves of a sandwich immunoassay for
  • FIG. 4 shows the quantitative evaluation of the fluorescence signals from IgG-Cy5 (y-axis) on a conventional functionalized surface (A) and one
  • FIG. 5 shows the quantitative evaluation of the fluorescence signals from IgG-Cy5 on the conventionally functionalized
  • FIG. 6 shows the quantitative evaluation of the fluorescence signals from IgG-Cy5 (y-axis) on a conventional
  • FIG. 7 shows dose-effect curves of a sandwich immunoassay for
  • Example 1 Production of a polyphenol layer on a polystyrene surface
  • Polystyrene is a widely used standard plastic for single-use plastic items from daily laboratory use, such as microtiter plates, cuvettes and cell culture vessels. In many applications such as B. in the production of immunoassays, it is necessary to the polystyrene surface with functional molecules such. B. to functionalize antibodies or antigens.
  • uncoated polystyrene surface is 90 °. Treatment with the coating solution lowers the contact angle by 40 ° to about 50 ° (FIG. 1: time 0), i.e. H. the
  • the oxidation step i.e. H. the treatment of
  • Polyphenolic layer with an oxidizing agent is a
  • polystyrene surfaces coated with tannic acid were produced according to Example 1 and then with an iodine solution at a concentration of 2 milligrams per milliliter (A) or with an iodine starch solution at 0.4
  • Milliliters of iodine (B) 4 milligrams per milliliter of starch and 0.2 milligrams per milliliter of iodine (C) or 40 milligrams per
  • a suitable iodine solution in a concentration of 2 milligrams per milliliter can be z. B. from nine parts
  • Iodine starch solution with 40 milligrams per milliliter of starch and 2 milligrams per milliliter of iodine can be prepared from nine parts of starch solution with 4 percent by weight of soluble starch according to Zulkowsky (Sigma-Aldrich, Germany) in water and one part of 2% Lugol's solution.
  • Oxidizing agent Treatment with iodine (A) alone leads to high-energy phenolic groups due to the oxidation
  • FIG. 2 shows the results of this experiment, the diagram again showing the change in the contact angle (y-axis) as a measure of the surface energy or hydrophilicity of the treated surface over the treatment time in minutes (x-axis) depending on the respective oxidizing agent.
  • Perfect Block lowers the contact angle of an untreated reference polystyrene surface (PS + PB) from 90 ° to around 60 °.
  • the blocking and crosslinking step lowers the contact angle of the
  • Tannic acid layers on the other hand at 35 °.
  • Example 3 Comparison of the amount of active antibody of a
  • a central field of application of functionalized surfaces is the production of solid phase reagents for analytical or diagnostic detection methods.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • sandwich ELISA an antibody is bound to the surface of a solid phase, usually the polystyrene surface of a microtiter plate with 96 separate wells, the so-called "wells".
  • the sample with the antigen to be detected is placed in the wells and incubated.
  • the to the plate bound antibodies the antigen present in the sample, which can then be detected or quantified in further steps.
  • the measurement signal is directly proportional to the amount of the antibody that is immobilized in functional or active form on the surface, ie the amount of antibody that is not caused by the
  • the signal level or the dynamic sensitivity of the sandwich ELISA provides direct information about how the amounts of active surface-bound antibodies vary with different
  • the aim of this experiment was to compare the active amount of antibody in a microtiter plate, which was functionalized in a customary industrial manner by direct adsorption of antibodies to the polystyrene surface, with that amount of active antibody in a microtiter plate
  • inventively functionalized polystyrene surface is achieved.
  • a tannic acid layer analogous to Example 1 was first produced in the wells of the microtiter plate. Thereafter, the antibody was raised under the same conditions as described in (A) above the tannic acid layer bound. After removing the
  • Antibody solution was carried out in the next step, the treatment with oxidizing agent, with 100 microliters of an iodine starch solution (40 milligrams per milliliter of starch, 2 milligrams per
  • Antibody-HRP conjugate (HyTest Ltd., Finland) was incubated in PBS buffer pH 7.4 for 15 minutes without shaking.
  • FIG. 3 shows the result of this experiment using the dose-effect curves determined for the conventionally functionalized microtiter plate (A) and the microtiter plate modified according to the invention (B). It can be seen immediately that the surface functionalization according to the invention in all
  • a polymer or a protein can be adsorbed.
  • the technically important adsorption of proteins is only mentioned using the example of lysozyme. Lysozyme is considered one of the
  • Oxidizing agents that have been functionalized with a protein.
  • IgG-Cy5 As an example of a technically relevant protein, an antibody was used for the functionalization, here immunoglobulin G from sheep, which was labeled with the fluorescent dye Cy5 (hereinafter “IgG-Cy5”; Sigma-Aldrich, Germany). IgG-Cy5 can be obtained by means of fluorescence-based imaging processes can be made visible and quantified directly on a technical surface
  • 96-well microtiter plates made of polystyrene (Sarstedt AG & Co. KG, Germany) were included in each well 150 microliters of a tannic acid solution in a concentration of 1 millimole per liter in PBS buffer and incubated at a temperature of 20 ° C to 23 ° C for one hour without shaking. The tannic acid solution was then removed and each well washed with 300 microliters of deionized water and dried.
  • the polyphenol layer was treated with an oxidizing agent prior to contacting with IgG-Cy5.
  • an oxidizing agent for this purpose, one half of the wells of one of the microtiter plates coated with tannic acid was oxidized with an iodine starch solution.
  • 1.0 gram of iodine and 2.0 grams of sodium iodide were first dissolved in 50 milliliters of deionized water and, separately, 20.0 grams of Zulkowsky starch in 1.5 liters of deionized water.
  • the wells of the microtiter plate were each filled with 150 microliters of the starch iodine solution and incubated for 5 minutes at 20 ° C to 25 ° C.
  • the comparison wells in the other half of the microtiter plate were incubated with PBS buffer during this time.
  • Fluorescence signals on the surface of the wells as a measure of the amount of surface-bound IgG-Cy5 (y-axis) as a function of the IgG-Cy5 concentration used during the
  • Immobilization (x-axis) before treating the surface with Perfect Block solution The mean values and standard deviations from three different wells after conventional functionalization (A) and inventive functionalization (B) are shown for each concentration.
  • the surface loading with IgG-Cy5 on the surface (B) functionalized according to the invention was accordingly about 13% higher than on the comparison surface (A), which was not treated with the oxidizing agent according to the prior art.
  • FIG. 5 shows the corresponding quantitative evaluation for the amount of IgG-Cy5 that was still bound to the surface (B) functionalized according to the invention and the comparison surface (A) after the treatment with Perfect Block solution.
  • the surface concentration of IgG-Cy5 was accordingly on the surface (B) functionalized according to the invention after
  • Treatment with Perfect Block Solution could detach from the surface again.
  • the significantly improved stability of the surface functionalized according to the invention is z. B. for the production of solid phase reagents for diagnostics and especially as a solid phase in ELISA tests, because such
  • the polyphenol layer was not before, but during
  • Microtiter plates coated with tannic acid were filled in equal parts with iodine starch solution and a doubly concentrated IgG-Cy5 solution, so that the final concentrations of IgG-Cy5 in the wells again corresponded to the above-mentioned concentrations of the first variant.
  • the comparison wells of the other half of the microtiter plate were filled in equal parts with the doubly concentrated IgG-Cy5 solution and PBS buffer instead of the starch iodine solution. This was followed by incubation for 15 minutes on a horizontal shaker at 200-300 rpm in the dark. After removing the antibody solution and washing the wells with PBS buffer, the concentration of surface-bound IgG-Cy5 in the wells was quantified as described above.
  • Antibody solution on the surface (B) functionalized according to the invention about 25% higher fluorescence signals were measured than on the conventionally functionalized surface (A) which was not treated with the oxidizing agent. This means that in the variant of the invention
  • Oxidizing agent is treated, about 25% more IgG-Cy5 molecules were bound to the surface per unit of time than in the conventional method.
  • a polyphenol layer was produced in the wells of the microtiter plate with tannic acid as described in Example 1, to which monoclonal anti-myoglobin antibodies were then bound as described in Example 3.
  • the surface functionalized in this way was used as a reference directly in the subsequent sandwich ELISA (A).
  • the surface was treated with Perfect Block as a further reference (B).

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Funktionalisierung einer Oberfläche angeben, bei dem auf der Oberfläche durch Aufbringen einer Polyphenolverbindung eine Polyphenolschicht erzeugt und die Oberfläche anschließend durch Anbinden eines Funktionsmoleküls an die Polyphenolschicht funktionalisiert wird. Zusätzlich wird die Polyphenolschicht vor, während oder nach Anbinden des Funktionsmoleküls mit einem Oxidationsmittel behandelt.Ferner werden ein zugehöriges Erzeugnis und eine zugehörige Verwendung angegeben sowie ein Kit zur Durchführung des Verfahrens bzw. zur Herstellung des Erzeugnisses.

Description

Titel
VERFAHREN ZUR FUNKTIONALISIERUNG EINER OBERFLÄCHE, ERZEUGNIS MIT EINER NACH DEM VERFAHREN FUNKTIONALISIERTEN OBERFLÄCHE UND VERWENDUNGEN DERSELBEN
Verweis auf frühere Anmeldungen
Diese Patentanmeldung beansprucht die Priorität der deutschen Patentanmeldung Nr. 10 2019 105 192.4, deren Offenbarungsgehalt hiermit durch Verweis in seiner Gesamtheit einbezogen wird.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der gezielten Modifizierung von Oberflächen technischer Materialien wie
Kunststoffen, Metallen, Halbleitern, Keramiken und Gläsern mit funktionellen Molekülen wie beispielsweise Proteinen,
Nukleinsäuren, Polyelektrolyten und Funktionspolymeren. Solche Oberflächen finden unter anderem in analytischen und
diagnostischen Tests sowie in Medizinprodukten Anwendung.
Hintergrund der Erfindung
Eine Vielzahl technischer, biotechnischer und medizinischer Anwendungen erfordert eine Anbindung von natürlichen bzw.
biologischen oder synthetischen Molekülen an Oberflächen
unterschiedlichster Materialien, um diesen bestimmte Eigenschaf ten zu verleihen. Bedeutende Beispiele sind die Kopplung von Antikörpern oder Antigenen an die Oberfläche von Einweg- Kunststoffartikeln wie z. B. Mikrotiterplatten in der klinischen Diagnostik, die Kopplung von Ionenaustauscher-Polymeren an die Oberfläche von Membranen und Filtern aus natürlichen oder synthetischen Polymeren für Trenn- und Reinigungsverfahren oder die Beschichtung von medizinischen Implantaten mit Wachstums faktoren oder Antibiotika zur Verbesserung der Einheilung bzw. Prävention von implantatassoziierten Infektionen.
Eine zentrale Herausforderung besteht darin, dass viele
technisch genutzte Materialien eine im Wesentlichen inerte bzw. niederenergetische Oberfläche aufweisen und dementsprechend auf solchen Substraten kaum oder keine chemischen Gruppen
bereitstehen, die zur physikalischen oder chemischen Anbindung von spezifische Funktionen verkörpernden Molekülen, sogenannten Funktionsmolekülen, geeignet sind.
Um Funktionsmoleküle dennoch an solchen Substraten anbinden zu können, nachfolgend auch als „Immobilisieren" bezeichnet, müssen die Oberflächen typischerweise zunächst mithilfe aufwändiger Verfahren in hochenergetische Oberflächen umgewandelt werden.
Erschwerend kommt hinzu, dass Funktionsmoleküle, insbesondere solche biologischen Ursprungs, meist sehr empfindlich sind und nur unter schonenden Bedingungen, beispielsweise in wässriger Lösung mit neutralem pH-Wert und bei Temperaturen unterhalb von etwa 40 °C verarbeitet werden können. Unter solchen
Reaktionsbedingungen verläuft die physikalische oder chemische Anbindung von Funktionsmolekülen in der Regel langsam und kann zu einer unvollständigen bzw. ungleichmäßigen
Oberflächenbedeckung führen.
Es sind verschiedene Verfahren zur Steigerung der
Oberflächenenergie bekannt. Metalle und Halbleiter können z. B. durch chemische, plasmachemische oder elektrochemische Oxidation mit einer hochenergetischen Oxidschicht überzogen werden. Diese lässt sich anschließend mit z. B. Silan- oder Phosphorsäure- derivaten chemisch modifizieren, um die Anbindung von Funktionsmolekülen zu ermöglichen. Keramiken und Gläser können im Prinzip in ähnlicher Weise funktionalisiert werden.
Nachteilig ist, dass diese Verfahren typischerweise mehrere, technisch sehr unterschiedliche Anforderungen stellende
Prozessschritte wie z. B. eine plasmachemische Oxidation und eine Abfolge verschiedener nasschemischer Behandlungen im organischen und wässrigen Milieu umfassen. Solche Oberflächen sind daher oft nur unter hohem apparativem und zeitlichem
Aufwand herstellbar.
Die Funktionalisierung von Kunststoffen stellt eine besondere Herausforderung dar, da diese unter den gebräuchlichen
technischen Materialien die vergleichsweise energieärmsten Oberflächen aufweisen. Andererseits sind Kunststoffartikel in der Regel verhältnismäßig preiswert und werden daher oft als Einwegartikel z. B. für die Bioanalytik, Diagnostik und Medizin in sehr hohen Stückzahlen hergestellt, sodass ein geeignetes Funktionalisierungsverfahren schnell durchführbar und möglichst kostengünstig sein sollte.
Aus US 3,057,792 A ist ein Verfahren bekannt, bei dem zur
Erhöhung der Oberflächenenergie von Kunststoffen durch
Plasmabehandlung oder Koronaentladung Sauerstoff- bzw.
Stickstoffgruppen eingeführt werden. In EP 0 644 904 Al ist ein Verfahren offenbart, bei dem Kunststoffoberflächen mit einer dünnen Lackschicht bzw. einer reaktiven Polymerdünnschicht überzogen werden, um eine Anbindung biologisch aktiver Moleküle zu ermöglichen. Nachteilig an diesen Verfahren ist der relativ hohe technische Aufwand und die oft unzureichende Beständigkeit bzw. Stabilität der resultierenden Oberflächen, sodass
entsprechend behandelte Kunststoffartikel für viele Anwendungen zu teuer oder nicht praktikabel sind. Daher wird beispielsweise bei der Herstellung von Einweg- Produkten für die Labordiagnostik noch immer überwiegend auf die technisch wesentlich einfacher zu realisierende Funktionali- sierung durch eine direkte Adsorption von Funktionsmolekülen wie z. B. Proteinen an Kunststoffoberflachen zurückgegriffen. Die Oberflächenanlagerung bzw. -haftung beruht hierbei auf einer partiellen Entfaltung und Denaturierung der Proteine an der hydrophoben Kunststoffoberflache . Dieser Prozess ist nicht nur langwierig und relativ ineffizient, sondern führt auch dazu, dass ein Großteil der oberflächengebundenen Proteine denaturiert und inaktiv vorliegt. Dies erhöht aufgrund der meist
hochwertigen Proteine nicht nur die Herstellungskosten
erheblich, sondern kann auch die Reproduzierbarkeit der so hergestellten Erzeugnisse erschweren.
Schließlich wird in WO 2014/116812 A2 die unter anderem aus GB 190707775 A und GB 260290 A seit langem bekannte Eigenschaft von Polyphenolen, auf verschiedensten Oberflächen hydrophile
Schichten auszubilden, genutzt, um auf einer Kunststoff-,
Metall- oder Keramikoberfläche zunächst eine Polyphenolschicht zu erzeugen, an welche anschließend z. B. ein Polymer oder ein Protein angebunden werden kann.
Nach wie vor weisen die bisher bekannten Verfahren zur
Herstellung funktionalisierter Oberflächen verschiedene
Nachteile auf. Insbesondere können eine geringe Effizienz einzelner oder mehrerer Verfahrensschritte, ein geringer
Funktionalisierungsgrad und/oder eine unzureichende Stabilität der resultierenden Oberflächen limitierende Faktoren darstellen.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Funktionalisierung von Oberflächen bzw. entsprechende Erzeugnisse mit verbesserten Eigenschaften hinsichtlich einzelner oder mehrerer der oben genannten
Nachteile bereitzustellen. Insbesondere besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein verbessertes Verfahren zur Funktionalisierung von Kunststoffoberflächen mit Proteinen, insbesondere mit Antikörpern, für eine Anwendung in der Analytik bzw. Diagnostik und entsprechend verbesserte Erzeugnisse, welche mit diesem Verfahren herstellbar sind, bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Weitere Ausgestaltungsmöglich keiten sowie bevorzugte und vorteilhafte Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Definitionen und allgemeine Erläuterungen
In dieser Beschreibung werden verschiedene Dokumente zitiert, um einen allgemeinen technischen Hintergrund in Bezug auf die vorliegende Erfindung zu vermitteln. Auf die Offenbarung und Lehre dieser Dokumente wird in Ergänzung nachfolgender
Beschreibung vollinhaltlich Bezug genommen, um den Stand der Technik, auf den sich diese Erfindung stützt, vollständiger zu beschreiben .
Die nachfolgenden Definitionen und allgemeinen Erläuterungen sollen den fachkundigen Leser beim Verständnis, in der Auslegung und bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung anleiten und unterstützen. Vorbehaltlich anderer Angaben sollen alle
technischen und wissenschaftlichen Begriffe diejenige Bedeutung haben, welche dem üblichen Begriffsverständnis eines
Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung entspricht . So, wie sie hier verwendet werden, schließen unbestimmte Artikel wie „ein" oder „eine" die Möglichkeit mit ein, dass auch zwei oder mehrere dieser Merkmale vorhanden sein können.
Ein „Funktionsmolekül" im Sinne der vorliegenden Erfindung kann jedes Molekül sein, das eine spezifische bzw. technisch
nutzbare, physikalische, chemische und/oder biologische
Eigenschaft bzw. Aktivität aufweist. In bestimmten Varianten der Erfindung wird unter einem Funktionsmolekül ein Biomolekül wie z. B. ein Protein, beispielsweise ein Enzym, ein Antigen oder ein Antikörper, oder eine Nukleinsäure verstanden. In wiederum anderen Varianten der Erfindung kann ein Funktionsmolekül ein chemisches Molekül, insbesondere ein Polymer wie z. B. ein
Polyelektrolyt oder ein Funktionspolymer beinhalten.
Dementsprechend bedeutet „Funktionalisieren" einer Oberfläche mithilfe der Anbindung eines solchen Funktionsmoleküls eine bestimmte, insbesondere eine der Oberfläche selbst nicht
inhärente, physikalische, chemische oder biologische Eigenschaft zu verleihen.
Als „Funktionalisierungsgrad" wird hierbei das Verhältnis derjenigen Funktionsmoleküle, welche auf der Oberfläche in aktiver bzw. funktioneller Form gebunden sind, zu denjenigen, welche durch die Oberflächenbindung ihre Funktion verloren haben, verstanden.
So, wie der Begriff hier verwendet wird, kann „Anbinden" bzw. „Anbindung" sowohl die Ausbildung einer physikalischen bzw.
adsorptiven Bindung als auch die Ausbildung einer chemischen bzw. kovalenten Bindung an eine, insbesondere feste, Oberfläche bedeuten . „Polyphenolverbindungen" bzw. „Polyphenole" werden hier als Sammelbegriff für eine diverse Strukturklasse chemischer
Verbindungen verwendet, die sich durch eine oder mehrere
Struktureinheiten mit zwei oder mehr direkt an einen oder mehrere aromatische Ringe gebundene Hydroxygruppen (-OH) , nachfolgend auch als „Phenolgruppe" bezeichnet, auszeichnet. Innerhalb einer Polyphenolverbindung wird ein aromatischer Ring mit zwei Hydroxygruppen als Substituenten im Folgenden als „Diphenolgruppe" , mit drei Hydroxygruppen als Substituenten als „Triphenolgruppe" bezeichnet. Zwei vicinale Hydroxygruppen innerhalb einer Diphenolgruppe bzw. Triphenolgruppe werden im Folgenden auch als „ortho-Diphenolgruppe" bezeichnet. Neben Hydroxygruppen können Polyphenole zusätzlich auch andere
Heteroatomsubstituenten wie Ether- und Estergruppen sowie
Carbonyl- und Carboxylgruppen enthalten. In bevorzugten
Ausführungen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei Polyphenolverbindungen um Stickstoff-freie chemische
Verbindungen .
Eine „Polyphenolschicht" entspricht demzufolge einer Schicht auf einer Oberfläche, welche ein Polyphenol bzw. eine
Polyphenolverbindung oder mehrere Polyphenole bzw.
Polyphenolverbindungen enthält oder aus diesen besteht. So, wie der Begriff hier verwendet wird, schließt „Polyphenolschicht" ausdrücklich auch solche Schichten mit ein, welche
erfindungsgemäß mit einem Oxidationsmittel behandelt wurden bzw. bei denen zumindest ein Teil der in der Schicht vorhandenen Polyphenolverbindungen in eine oxidierte Form umgewandelt vorliegt oder zumindest zeitweise vorlag.
Ein „Oxidationsmittel" ist ein Stoff, der andere Stoffe in einer Redoxreaktion oxidieren kann und dabei selbst reduziert wird. Oxidationsmittel können Elektronen aufnehmen und werden deshalb auch als Elektronenakzeptoren bezeichnet.
Als „Chinon" wird hier ein Oxidationsprodukt eines Polyphenols bzw. einer Polyphenolverbindung bezeichnet, bei dem die
Hydroxygruppen einer Diphenolgruppe bzw. Triphenolgruppe unter Aufhebung der Aromatizität des Ringes an zwei Kohlenstoffatomen durch doppelbindigen Sauerstoff ersetzt sind. Man unterscheidet zwischen einem 1 , 2- (ortho- ) Chinon, nachfolgend auch als „ortho- Chinongruppe" bezeichnet, und einem 1 , 4- (para- ) Chinon,
nachfolgend „para-Chinongruppe" .
Sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachfolgende detaillierte Beschreibung sind als Beispiel aufzufassen und sollen zur Erläuterung der beanspruchten
Erfindung dienen. Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Patentansprüchen ersichtlich.
Beschreibung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Funktionalisierung einer Oberfläche angegeben. Dabei wird zunächst durch Aufbringen bzw. Abscheiden mindestens einer
Polyphenolverbindung zumindest abschnittsweise eine
Polyphenolschicht auf der Oberfläche erzeugt. In einem
darauffolgenden Verfahrensschritt wird anschließend mindestens ein Funktionsmolekül an die Polyphenolschicht angebunden, um die Oberfläche auf diese Weise zu funktionalisieren . Dabei ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch charakterisiert, dass die Polyphenolschicht in einem weiteren Schritt zumindest
abschnittsweise mit einem Oxidationsmittel behandelt wird.
Hierbei kann die Behandlung mit dem Oxidationsmittel vor und/oder nach dem Anbinden des Funktionsmolekül durchgeführt werden, aber auch eine Behandlung während des Anbindens des Funktionsmoleküls ist möglich. In einer bevorzugten Verfahrens variante wird die Behandlung der Polyphenolschicht mit dem
Oxidationsmittel zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig, nach dem Anbinden des Funktionsmoleküls an die Polyphenolschicht durchgeführt. Im letzteren Fall handelt es sich bei dem Anbinden des Funktionsmolekül und der anschließenden Behandlung mit dem Oxidationsmittel folglich um separate Verfahrensschritte.
Die Erfinder haben erkannt, dass die Oberflächenfunktionalisie- rung mithilfe von Polyphenolschichten nach der Lehre der WO 2014/116812 A2 trotz prinzipieller Vorzüge alleine oft nicht ausreicht, um den hohen Anforderungen an Funktionalisierungs- grad, Stabilität, Reproduzierbarkeit und Kosteneffizienz zu genügen, die z. B. an die funktionalisierten Oberflächen von analytischen und diagnostischen Produkten gestellt werden.
Während es für die meisten (bio ) technischen und medizinischen Anwendungen von immobilisierten Proteinen wie z. B.
Immunoassays , Zellkulturplatten, medizinischen Geräten und
Implantaten wünschenswert ist, die Proteine unter weitgehender Erhaltung Ihrer Funktionalität möglichst irreversibel zu
immobilisieren, konnten die Erfinder in umfangreichen
Untersuchungen herausfinden, dass Proteine überwiegend
reversibel, das heißt mit geringer Bindungsenergie, an
Polyphenolschichten binden. Aufgrund der geringen
Bindungsenergie können sich die Proteine spontan wieder von der Oberfläche lösen oder von dieser durch andere Proteine oder Substanzen mit höherer Oberflächenaffinität verdrängt werden. Problematisch ist dies insbesondere in analytischen und
diagnostischen Anwendungen, da diese Effekte zu starken
Ergebnisschwankungen führen und Qualitätsmerkmale wie die Reproduzierbarkeit und Präzision solcher Anwendungen erheblich beeinträchtigen können.
Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem, indem die
Polyphenolschicht zur verbesserten Anbindung von
Funktionsmolekülen zusätzlich mit einem Oxidationsmittel behandelt wird. Mithilfe dieses Oxidationsschrittes wird
erreicht, dass die Polyphenolverbindung in der Schicht zumindest teilweise in eine oxidierte bzw. reaktive Form umgewandelt und dadurch befähigt wird, eine kovalente Bindung zum
Funktionsmolekül auszubilden. Die kovalente Bindung führt gegenüber der Adsorption zu einer verbesserten Stabilität des Anbindungsproduktes und es lassen sich die Funktionsmoleküle in einer höheren Dichte auf der Oberfläche immobilisieren.
Insbesondere kann sich durch die Oxidation der Polyphenol verbindung ein reaktives Chinon bilden, an welches sich das Funktionsmolekül z. B. über Amino-, Thiol- und/oder
Hydroxygruppen nukleophil anlagert. Dadurch wird erreicht, dass Funktionsmoleküle, insbesondere Proteine, die gemäß den bisher bekannten Verfahren lediglich durch Adsorption und entsprechend reversibel an die Polyphenolschicht gebunden vorliegen, mithilfe der Oxidationsbehandlung kovalent und somit im Wesentlichen irreversibel an die Oberfläche gekoppelt werden, ohne dass der Reaktion weitere chemische Aktivierungsreagenzien wie bei herkömmlichen Biokonj ugationstechniken zugesetzt werden müssen.
Durch die kombinierte Wirkung der vorteilhaften Eigenschaft von Polyphenolverbindungen, auf niederenergetischen Substraten verschiedenster Art hochenergetische, gut mit Wasser benetzbare Schichten auszubilden und der Vorzüge einer weitgehend
irreversiblen Bindung von Funktionsmolekülen an die Polyphenol schichten mithilfe der zusätzlichen Oxidationsbehandlung der Schichten wird gegenüber den bisher im Stand der Technik bekannten Verfahren eine universellere, mit einfacheren technischen Mitteln realisierbare, zeit- und kosteneffizientere Lösung zur Funktionalisierung von Oberflächen für verschiedenste Anwendungen bereitgestellt. Diesbezüglich wird auch auf die nachfolgende Beschreibung und die Ausführungsbeispiele
verwiesen .
Zur Erzeugung der Polyphenolschicht kann im Grunde genommen jede Polyphenolverbindung verwendet werden, welche dem Fachmann zu diesem Zweck aus dem Stand der Technik, beispielsweise der WO 2014/116812 A2 , bekannt und geeignet ist. Insbesondere kann es sich um eine natürlich vorkommende bzw. pflanzliche Polyphenol verbindung handeln. Diese sind in der Regel gut verfügbar, preiswert und untoxisch, was zum einen die Handhabung der
Verbindungen und die Durchführung des Verfahrens vereinfacht und zum anderen eine wichtige Eigenschaft ist, wenn die
funktionalisierten Oberflächen für eine Anwendung am oder im menschlichen Körper vorgesehen sind, wie es z. B. bei
medizinischen Implantaten der Fall ist.
Es ist außerdem vorteilhaft, wenn die Polyphenolverbindung im Wesentlichen frei von Aminen (-NR3) bzw. Aminogruppen (-NH2) ist oder keine Amine bzw. Aminogruppen enthält. Die Erfinder haben erkannt, dass die Verwendung aminhaltiger Polyphenolverbindungen in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu gefärbten, dunklen
Polyphenolschichten führen kann. Mit aminfreien Polyphenol verbindungen lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hingegen transparente und farblose Polyphenolschichten erzeugen, welche insbesondere für viele Anwendungen in der Analytik und Diagnostik bevorzugt sind.
In bevorzugten Verfahrensausführungen weist die Polyphenol verbindung mindestens eine ortho-Diphenolgruppe auf, welche durch die Behandlung mit dem Oxidationsmittel in eine ortho- Chinongruppe umgewandelt wird. Die Erfinder haben festgestellt, dass sich auf diese Weise eine besonders hohe Reaktivität der oxidierten Polyphenolschicht erreichen lässt, welche eine besonders schnelle und effiziente kovalente Anbindung des
Funktionsmoleküls auch unter milden bzw. physiologischen
Reaktionsbedingungen gewährleistet. Solche schnellen und
effizienten Bindungsreaktionen verkürzen nicht nur die
Prozesszeit erheblich, sondern sind insbesondere auch für einen weitgehenden Erhalt der Funktion von empfindlichen
Funktionsmolekülen wie z. B. Proteinen von entscheidendem
Nutzen. In Zusammenwirkung dieser Vorteile kann mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bereits bei Einsatz geringer Mengen des Funktionsmoleküls eine effiziente Funktionalisierung bzw. ein hoher Funktionalisierungsgrad der modifizierten Oberfläche erreicht werden.
Die Polyphenolverbindung kann z. B. ein Tannin, insbesondere ein Gallotannin oder ein Ellagitannin, oder ein Catechin umfassen oder daraus bestehen. Vorzugsweise ist die Polyphenolverbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus
Tanninsäure, Gallocatechin, Epicatechin, Epigallocatechin, Epicatechingallat, Epigallocatechin-3-gallat und Pyrogallol. Selbstverständlich können auch zwei oder mehrere verschiedene Polyphenolverbindungen zur Erzeugung der Polyphenolschicht verwendet werden, sodass auch beliebige Kombinationen der vorgenannten Verbindungen möglich sind. Besonders bevorzugt umfasst die Polyphenolverbindung Tanninsäure.
Das Aufbringen der Polyphenolverbindung kann im Prinzip mit allen im Stand der Technik zur Erzeugung einer Polyphenolschicht beschriebenen Verfahren erfolgen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann unter anderem aus WO 2014/116812 A2, GB 190707775 A und GB 260290 A bekannt.
In bevorzugten Ausführungen des Verfahrens ist die
Polyphenolverbindung in einer, vorzugsweise wässrigen,
Beschichtungslösung enthalten, mit welcher die Oberfläche unter Bedingungen kontaktiert wird, die zu einer Abscheidung der
Polyphenolverbindung auf der Oberfläche führen, um die
Polyphenolschicht zu erzeugen. Die Polyphenolverbindung kann z. B. in einer Konzentration von 0,1 bis 10 Milligramm pro
Milliliter, vorzugsweise 0,5 bis 5 Milligramm pro Milliliter, besonders bevorzugt 1 bis 2 Milligramm pro Milliliter in der Beschichtungslösung vorliegen.
Überraschenderweise ist es für die erfindungsgemäße
Funktionalisierung von Oberflächen vorteilhaft, wenn die
Abscheidung der Polyphenolverbindung unter milderen Bedingungen und/oder für kürzere Zeit durchgeführt wird, als es bei den bisher bekannten Verfahren der Fall ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der pH-Wert der
Beschichtungslösung größer gleich pH 6,0, größer gleich pH 6,5 oder größer gleich pH 7,0 und/oder kleiner gleich pH 9,0, kleiner gleich pH 8,0 oder kleiner gleich pH 7,5. Vorzugsweise liegt der pH-Wert der Beschichtungslösung in einem Bereich von pH 7,0 bis pH 7,6, insbesondere pH 7,2 bis pH 7,5. Zur Pufferung des pH-Wertes kann die Beschichtungslösung zweckmäßigerweise eine oder mehrere Puffersubstanzen enthalten. Geeignete Puffer wie z. B. Phosphatpuffer sind dem Fachmann bekannt oder können auf Grundlage dieser Beschreibung ohne Weiteres bestimmt werden. Vorzugsweise handelt es sich um anorganische bzw. aminfreie PufferSubstanzen . In einer weiteren Ausführungsform enthält die Beschichtungs lösung ein Salz oder eine Mischung von Salzen in einer
Konzentration von mindestens 50 Millimol pro Liter, mindestens 100 Millimol pro Liter oder mindestens 150 Millimol pro Liter und/oder höchstens 500 Millimol pro Liter, höchstens 300
Millimol pro Liter oder höchstens 200 Millimol pro Liter.
Vorzugsweise liegt die Konzentration in einem Bereich von 50 bis 500 Millimol pro Liter, bevorzugt 100 bis 250 Millimol pro
Liter, besonders bevorzugt 120 bis 200 Millimol pro Liter.
Physiologische Salzkonzentrationen um etwa 150 Millimol pro Liter haben sich für das erfindungsgemäße Verfahren als
besonders vorteilhaft erwiesen. Das Salz oder die Mischung von Salzen kann z. B. ein Natriumsalz, ein Kaliumsalz, ein
Kalziumssalz, ein Magnesiumsalz, ein Kupfersalz, ein Zinksalz oder beliebige Kombinationen davon umfassen. Insbesondere kann das Salz bzw. die Mischung von Salzen aus NaCl, NaNCL, Na2SC>4, KCl, K2SO4, MgCl2, CaCl2, CUCI2 und/oder ZnCl2 ausgewählt sein.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die
Oberfläche für mindestens 1 Minute, mindestens 10 Minuten, mindestens 20 Minuten oder mindestens 30 Minuten und/oder höchstens 120 Minuten, höchstens 90 Minuten oder höchstens 60 Minuten mit der Beschichtungslösung kontaktiert. Die Kontaktzeit kann zum Beispiel 1 bis 120 Minuten, vorzugsweise 10 bis 90 Minuten, bevorzugt 30 bis 70 Minuten, besonders bevorzugt 40 bis 60 Minuten betragen. Es ist ein besonderer Vorteil des
erfindungsgemäßen Verfahrens, dass für die Funktionalisierung besonders geeignete Polyphenolschichten in kürzerer Zeit erzeugt werden können, als durch die bisher bekannten Verfahren
nahegelegt wurde. Hierdurch weist das erfindungsgemäße Verfahren eine verbesserte Effizienz gegenüber konventionellen Verfahren auf und ermöglicht einen höheren Produktionsdurchsatz, der insbesondere für die Massenproduktion geeignet ist. Außerdem weist die Beschichtungslösung eine geringe Viskosität auf, sodass z. B. auch die Oberflächen poröser Materialien wie
Filter, Membranen und offenporiger Schäume mit einfachsten
Mitteln beschichtet werden können. Beispielsweise kann die
Beschichtungslösung eine Viskosität von 1 bis 100
Millipascalsekunden, bevorzugt von 2 bis 20 Millipascalsekunden, besonders bevorzugt von 2 bis 10 Millipascalsekunden aufweisen.
Für den Oxidationsschritt kann die Polyphenolschicht im Prinzip mit jedem geeigneten Oxidationsmittel und unter Bedingungen kontaktiert werden, welche dazu führen, dass die Polyphenol verbindung in der Schicht zumindest teilweise in eine oxidierte Form umgewandelt wird. Neben einer bevorzugten chemischen
Oxidation ist z. B. auch eine enzymatische Oxidation möglich.
Bevorzugte Oxidationsmittel sind z. B. Wasserstoffperoxid (H2O2) , elementares Iod ( 12 ) und/oder Iodid, wobei das Oxidationsmittel insbesondere in Form einer gepufferten, wässrigen
Oxidationsmittellösung vorliegen kann bzw. darin enthalten ist. Geeignete Konzentrationen der vorgenannten Oxidationsmittel in der Oxidationsmittellösung liegen z. B. im Bereich von 0,01 bis 100 Milligramm pro Milliliter Iod und/oder Iodid bzw. 0,01 bis 10% (v/v) Wasserstoffperoxid. Die Erfinder haben herausgefunden, dass mit diesen Oxidationsmitteln, z. B. mit elementarem Iod ( 12 ) , die Polyphenolschicht innerhalb kürzester Zeit oxidiert werden kann, ohne durch unerwünschte Nebenreaktionen die
Eigenschaften bzw. die Qualität der Polyphenolschicht, wie z. B. Transparenz und Hydrophilie, nachteilig zu beeinträchtigen.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Polyphenolschicht für mindestens 10 Sekunden, mindestens 30 Sekunden oder mindestens 60 Sekunden und/oder höchstens 75 Minuten, höchstens 60 Minuten, höchstens 45 Minuten, höchstens 30 Minuten, höchstens 15 Minuten, höchstens 10 Minuten oder höchstens 5 Minuten mit dem Oxidationsmittel behandelt. Bevorzugte Behandlungszeiten liegen im Bereich von 0,1 bis 75 Minuten, 0,5 bis 30 Minuten oder 1 bis 5 Minuten. Auf diese Weise lässt sich die Polyphenolschicht sehr effizient und ohne Schädigung oder unerwünschte Nebenreaktionen oxidieren .
Überraschenderweise hat es sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn das Iod und/oder Iodid zumindest teilweise als Iod-Iodid-Stärke-Komplex bzw. Polyiodid-Stärke-Komplex vorliegt, nachfolgend auch als lodstärke bezeichnet. Solche Komplexe sind z. B. durch Mischung von elementarem Iod bzw. Iod- Iodid-Lösungen (z. B. Iod-Kaliumiodid-Lösung oder Iod- Natriumiodid-Lösung) mit Stärke, insbesondere wasserlöslicher Stärke, erhältlich. Geeignete Oxidationsmittellösungen können etwa 0,01 bis 80 Milligramm pro Milliliter oder etwa 10 bis 50 Milligramm pro Milliliter Stärke, etwa 0,01 bis 100 Milligramm pro Milliliter oder etwa 0,1 bis 10 Milligramm pro Milliliter Iod und/oder etwa 0,01 bis 100 Milligramm pro Milliliter oder etwa 0,1 bis 10 Milligramm pro Milliliter Iodid, insbesondere Natrium- und/oder Kaliumiodid, enthalten. Im Rahmen der
vorliegenden Erfindung wurde erstmals erkannt, dass bei
Verwendung von lodstärke die oxidierende Wirkung von elementarem Iod nutzbar ist, gleichzeitig aber die Reaktivität des Iods soweit herabgesetzt wird, dass die Reaktionsdauer und wirksame Dosis besser gesteuert werden kann als bei der Verwendung von reinem Iod.
Ohne Bindung an theoretische Betrachtungen wird angenommen, dass das Iod bzw. Iodid durch den Einschluss in die helixförmigen Stärkemoleküle chemisch stabil gebunden und wenig oder gar nicht reaktiv ist. Erst bei Kontakt bzw. Reaktion mit der
Polyphenolschicht beginnt die Einschlussverbindung zu zerfallen, z. B. durch Quervernetzung der Stärke, wodurch das Iod bzw.
Iodid lokal freigesetzt wird und die Polyphenolverbindung oxidieren kann. Reaktives Iod bzw. Iodid wird daher nicht im Volumen, sondern direkt an der Grenzfläche zur Polyphenolschicht freigesetzt, und zwar nur solange noch oxidierbare Phenolgruppen in der Polyphenolschicht vorhanden sind. Durch diese bisher völlig unbekannte Form der selbstregulierenden Oxidationswirkung von lodstärke ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren z. B. möglich, eine oxidative Schädigung der Funktionsmoleküle zu vermeiden, wenn die Polyphenolschicht, wie in bevorzugten
Verfahrensvarianten vorgesehen, bereits während des Anbindens des Funktionsmoleküls oder erst nach dem Anbinden des
Funktionsmoleküls mit dem Oxidationsmittel behandelt wird.
Dazu kommt, dass lodstärke je nach Konzentration eine blaue, blauviolette bis schwarze Färbung aufweist und sich mit dem Zerfall der Einschlussverbindung entfärbt. Dies hat den Vorteil, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Reaktionsverlauf während der oxidativen Behandlung der Polyphenolschicht optisch leicht verfolgt bzw. der Endpunkt der Reaktion leicht bestimmt werden kann, z. B. mit dem bloßen Auge oder mithilfe optischer Messverfahren wie z. B. Photometrie oder Kolorimetrie . Dadurch wird das Verfahren zeiteffizienter und die Reproduzierbarkeit hergestellter Produkte wird weiter verbessert.
Als weiteren Bonuseffekt haben die Erfinder festgestellt, dass die Stärke während des Oxidationsschrittes selbst ebenfalls mit der oxidierten Polyphenolschicht, z. B. durch nukleophile
Addition, reagieren kann. Dies bewirkt zum einen eine
unregelmäßige Vernetzung der Polyphenolverbindungen innerhalb der Schicht durch die langkettigen Stärkemoleküle, wodurch eine erhebliche Verbesserung der Stabilität der Polyphenolschicht erreicht wird. Zum anderen erhöht die Stärkeanbindung zusätzlich die Hydrophilie der Oberfläche und macht sie chemisch inert.
Dies ist insbesondere in mikrofluidischen, analytischen und diagnostischen Einsätzen von Vorteil, da sich auf diese Weise unerwünschte Reaktionen der Oberfläche wie z. B. eine
unspezifische Proteinbindung im Vergleich zu herkömmlichen
Polyphenoloberflächen erheblich reduzieren lassen. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet zur Herstellung von Festphasenreagenzien für bioanalytische bzw. immunologische Tests wie beispielsweise ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) sowie für die Hydrophilierung bzw. Passivierung von mikrofluidischen Bauelementen und Systemen, insbesondere
sogenannten Lab-on-Chip Devices. In bestimmten Verfahrens varianten kann daher auch die Stärke selbst als Funktionsmolekül im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden, z. B. wenn mit der Funktionalisierung vorwiegend das Ziel der
Hydrophilierung bzw. Passivierung der Oberfläche verfolgt wird.
Das Anbinden des Funktionsmoleküls an die Polyphenolschicht erfolgt vorzugsweise aus einer Lösung, im Folgenden auch als Funktionalisierungslösung bezeichnet, mit der die
Polyphenolschicht unter Bedingungen kontaktiert wird, die es ermöglichen, dass das Funktionsmolekül an die Oberfläche der Polyphenolschicht bindet bzw. adsorbiert. Für Funktionsmoleküle biologischen Ursprungs wie z. B. Proteine kommen insbesondere wässrige, salzhaltige Pufferlösungen als Funktionalisierungs lösung mit im Wesentlichen physiologischer Ionenstärke und einem pH-Wert im Bereich von pH 5,0 bis pH 9,0 in Betracht. Geeignet ist z. B. eine physiologische Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS-Puffer) mit pH 7,4. Weitere geeignete Pufferlösungen sind dem Fachmann bekannt oder mithilfe der vorliegenden Beschreibung ohne Weiteres zu ermitteln. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Funktionalisier- ungslösung mindestens 0,01 Mikrogramm pro Milliliter, mindestens 0,05 Mikrogramm pro Milliliter oder mindestens 0,1 Mikrogramm pro Milliliter und/oder höchstens 10 Milligramm pro Milliliter, höchstens 1 Milligramm pro Milliliter, höchstens 100 Mikrogramm pro Milliliter, höchstens 10 Mikrogramm pro Milliliter,
höchstens 3 Mikrogramm pro Milliliter oder höchstens 1
Mikrogramm pro Milliliter des Funktionsmoleküls. Mit Vorzug liegt die Konzentration des Funktionsmoleküls in einem Bereich von 0,01 Mikrogramm bis 10 Milligramm pro Milliliter, bei
Proteinen bzw. Antikörpern insbesondere in einem Bereich von 0,01 bis 100 Mikrogramm pro Milliliter, vorzugsweise 0,02 bis 50 Mikrogramm pro Milliliter, bevorzugt 0,05 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter, besonders bevorzugt 0,1 bis 3 Mikrogramm pro
Milliliter oder 0,1 bis 1 Mikrogramm pro Milliliter,
insbesondere 0,2 bis 0,8 Mikrogramm pro Milliliter. Es hat sich bemerkenswerterweise gezeigt, dass für die erfindungsgemäße Oberflächenfunktionalisierung im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren deutlich geringere Mengen und höhere Verdünnungen des Funktionsmoleküls eingesetzt werden können, um die gleichen oder sogar bessere Funktionalisierungsergebnisse zu erzielen.
Diesbezüglich wird auch auf die nachfolgenden Ausführungs beispiele verwiesen. Dadurch können regelmäßig 50% oder mehr des Funktionsmoleküls eingespart werden, welches in der Regel die teuerste Komponente von Funktionalisierungsverfahren bildet.
Selbstverständlich ist es auch möglich, mehr als ein Funktions molekül an die Oberfläche zu binden. Das Funktionsmolekül kann z. B. in einer Mischung von mindestens zwei oder mehr
verschiedenen Funktionsmolekülen enthalten sein, wobei in diesem Fall vorzugsweise die Gesamtkonzentration der Funktionsmoleküle in der Mischung den vorgenannten Konzentrationsangaben
entspricht. Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass sich auch verschiedene Funktionsmoleküle mit unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften durch
Ausbildung einer im Wesentlichen irreversiblen, kovalenten
Bindung zur oxidierten Polyphenolschicht bei gleichzeitig hoher Geschwindigkeit der Anbindungsreaktion nebeneinander auf der funktionalisierten Oberfläche darstellen lassen. Dies war bisher mit konventionellen, auf adsorptiver Anbindung basierenden
Verfahren kaum reproduzierbar möglich, weil die
Reaktionsgeschwindigkeit und die Bindungsenergie in diesem Fall von den individuellen physiko-chemischen Eigenschaften der verschiedenen Funktionsmoleküle abhängt. Da die Adsorption in der Regel die Anbindung von Molekülen mit hoher Abundanz und/oder hoher Oberflächenaffinität begünstigt und es außerdem während der Einstellung eines stabilen Absorptionsgleichgewichts in Anwesenheit von mehreren Proteinen zu einer Verdrängung niederaffiner durch hochaffine Moleküle kommen kann, ist eine reproduzierbare bzw. steuerbare Oberflächenfunktionalisierung durch adsorptive Kopplung von Mischungen unterschiedlicher
Funktionsmoleküle kaum oder gar nicht realisierbar.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Polyphenolschicht für mindestens 1 Minute, mindestens 2 Minuten, mindestens 3 Minuten oder mindestens 5 Minuten und/oder für höchstens 120 Minuten, höchstens 60 Minuten oder höchstens 30 Minuten mit dem
Funktionsmolekül bzw. mit der Funktionalisierungslösung
kontaktiert. Bevorzugte KontaktZeiten liegen im Bereich von 1 bis 120 Minuten, vorzugsweise 2 bis 60 Minuten, besonders bevorzugt 5 bis 30 Minuten.
Vorzugsweise wird die Anbindung des Funktionsmoleküls bei einer Temperatur von 10 °C bis 60 °C, vorzugsweise 15 °C bis 40 °C, besonders bevorzugt 20 °C bis 37 °C oder 20 °C bis 25 °C
durchgeführt. Zur Verbesserung des Stofftransportes ist es außerdem möglich, während der Anbindungsreaktion zumindest zeitweise eine Durchmischung z. B. durch Rühren oder Schütteln vorzunehmen. Innerhalb der vorgenannten Parameter wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine besonders homogene und
hochgradige Funktionalisierung der Oberfläche erreicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich prinzipiell für alle Funktionsmoleküle, die mit der oxidierten Form der Polyphenol schicht reagieren und insbesondere eine kovalente Bindung ausbilden können. Nicht beschränkende Beispiele sind demzufolge chemische bzw. biologische Funktionsmoleküle, welche mindestens eine nukleophile Gruppe wie z. B. eine Aminogruppe (-NH2) , eine Thiolgruppe (-SH) und/oder eine Hydroxygruppe (-OH) enthalten. Mit besonderem Vorzug handelt es sich bei dem Funktionsmolekül um ein Biomolekül, beispielsweise ein Protein und insbesondere um einen Antikörper, die unter den oben genannten Bedingungen besonders schonend und im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren unter weitgehendem Erhalt der biologischen bzw. biochemischen Funktion sicher an die Oberfläche gekoppelt werden können.
Die Erfinder haben außerdem festgestellt, dass die
Polyphenolschicht von in herkömmlicher Weise funktionalisierten Oberflächen im praktischen Einsatz zu unspezifischer Absorption von z. B. Proteinen und anderen oberflächenaffinen Molekülen neigen kann. Dies ist insbesondere in analytischen und
diagnostischen Anwendungen wie z. B. Immunoassays , Biosensoren und ähnlichen Systemen ein Problem, da eine hohe unspezifische Bindung von Proteinen z. B. aus Blutplasma, -serum und anderen Körperflüssigkeiten die Qualität und Zuverlässigkeit solcher Testsysteme stark beeinträchtigen kann. Erschwerend kommt hinzu, dass konventionelle Polyphenolschichten nach Erkenntnis der Erfinder oft nicht die erforderliche Temperatur- und Langzeit stabilität aufweisen, die für eine Vielzahl von Erzeugnissen wie z. B. Diagnostika und Medizinprodukte erforderlich sind. Diese Nachteile wurden im Stand der Technik bisher nicht erkannt, geschweige denn in befriedigender Weise technisch gelöst.
Überraschenderweise lassen sich beide Probleme dadurch lösen, dass die Polyphenolschicht zusätzlich zumindest abschnittsweise mit mindestens einem di- oder multivalenten Nukleophil, also einer Verbindung mit zwei oder mehr nukleophilen Gruppen, behandelt wird, nachfolgend auch als Blockier- bzw.
Quervernetzungsschritt bezeichnet. Der Blockier- bzw. Querver netzungsschritt kann nach dem Anbinden des Funktionsmoleküls, nach der Behandlung mit dem Oxidationsmittel und/oder während der Behandlung mit dem Oxidationsmittel erfolgen. In bevorzugten Ausführungen wird der Blockier- bzw. Quervernetzungsschritt nach dem Anbinden des Funktionsmoleküls und nach Behandeln mit dem Oxidationsmittel durchgeführt. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Funktionsmolekül und dem di- oder multivalenten Nukleophil um verschiedene Moleküle. Es ist aber auch möglich, dass der Blockier- bzw. Quervernetzungsschritt die Anbindung des
Funktionsmoleküls beinhaltet bzw. ersetzt, indem das di- oder multivalente Nukleophil gleichzeitig Funktionsmolekül ist, beispielsweise ein Protein, welches zur Inertisierung und/oder Hydrophilierung der Oberfläche beiträgt. Ohne Bindung an
theoretische Überlegungen wird vermutet, dass di- oder
multivalente Nukleophile kovalent mit der oxidierten Polyphenol schicht reagieren, wodurch einerseits eine stabilisierende
Quervernetzung und andererseits eine Oberflächenabsättigung der Polyphenolschicht bewirkt wird, welche den Adsorptionseinfluss der Oberfläche deutlich herabsetzt. Diese Effekte sind auch aus den nachfolgenden Ausführungsbeispielen ersichtlich.
Die nukleophilen Gruppen umfassen insbesondere zwei oder mehrere Gruppen ausgewählt aus -NTQ, -SH, -OH und beliebigen Kombinationen davon. Geeignete Nukleophile können z. B.
Proteine, Proteinfragmente, Peptide, Polyethylenimin, Poly-L- Lysin, Polyvinylalkohol, Hydroxyethylcellulose, Pektin, Stärke, und beliebige Kombinationen sein. Einige nicht beschränkende Beispiele sind Rinderserumalbumin (BSA) , Casein, Gelatine oder deren Fragmente. Mit Vorzug wird eine Mischung von aus Gelatine gewonnenen Proteinfragmenten verwendet, welche bei
Raumtemperatur sehr gut wasserlöslich ist und niedrig viskose Lösungen bildet.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Polyphenolschicht für mindestens 10 Minuten, vorzugsweise mindestens 20 Minuten, besonders bevorzugt mindestens 30 Minuten und/oder höchstens 600 Minuten, vorzugsweise höchstens 240 Minuten, besonders bevorzugt höchstens 120 Minuten mit dem di- oder multivalenten Nukleophil behandelt. Vorzugsweise beträgt die Behandlungszeit 10 bis 600 Minuten, insbesondere 30 bis 240 Minuten.
Vorzugsweise erfolgt die Behandlung mit dem di- oder
multivalenten Nukleophil durch Kontaktieren der Polyphenol schicht mit einer Lösung, welche mindestens 0,1 Gewichtsprozent, vorzugsweise mindestens 0,5 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt mindestens 1 Gewichtsprozent und/oder höchstens 50
Gewichtsprozent, bevorzugt höchstens 10 Gewichtsprozent,
besonders bevorzugt höchstens 2 Gewichtsprozent des di- oder multivalenten Nukleophils enthält. Geeignete Konzentrationen liegen im Bereich von 0,1 bis 50 Gewichtsprozent, 1 bis 10
Gewichtsprozent und 0,5 bis 2 Gewichtsprozent.
Wie bereits oben mehrfach ausgeführt wurde, ist die Reihenfolge der erfindungsgemäßen Verfahrensschritte nicht sonderlich beschränkt. Wenngleich das Anbinden des Funktionsmoleküls an die Polyphenolschicht vorzugsweise vor der Behandlung der PolyphenolSchicht mit dem Oxidationsmittel durchgeführt wird, ist es auch möglich, die Polyphenolschicht zunächst zu oxidieren und erst dann das Funktionsmolekül daran zu binden. Eine weitere Möglichkeit ist es, das Anbinden des Funktionsmoleküls und die Behandlung mit dem Oxidationsmittel zumindest teilweise oder vollständig in einem Schritt zusammenzuführen. Dies kann
insbesondere dann zweckmäßig sein, wenn eine Denaturierung des Funktionsmoleküls durch das Oxidationsmittel nicht zu befürchten ist. Außerdem hat sich gezeigt, dass eine Oxidationsbehandlung während der Anbindung des Funktionsmoleküls zu einer
vorteilhaften Beschleunigung der Anbindungsreaktion führen kann. In weiteren Varianten können die beiden Behandlungen mit dem Oxidationsmittel und mit dem di- oder multivalenten Nukleophil vertauscht oder zu einem Schritt zusammengefasst werden, d. h. Oxidation und gleichzeitiger Blockier- und
Quervernetzungsschritt. Dies kann insbesondere für die weitere Verkürzung der Gesamtprozessdauer vorteilhaft sein. In
bestimmten Ausführungen können auch die drei Verfahrensschritte Anbinden des Funktionsmoleküls, Behandlung mit dem
Oxidationsmittel und Behandlung mit dem mit dem di- oder
multivalenten Nukleophil zusammengefasst werden.
Es ist möglich, die immobilisierten Funktionsmoleküle,
insbesondere wenn es sich um empfindliche Proteine handelt, abschließend mit einer Schutzschicht bzw. einem Schutzüberzug für längere Lagerzeiten zu stabilisieren. Beispielsweise können die Oberflächen mit einer wässrigen Saccharid-, Polysaccharid-, Protein- oder Polymerlösung überbeschichtet werden, welche anschließend z. B. bei Atmosphärendruck, Unterdrück oder im Vakuum abgezogen bzw. getrocknet wird. Geeignete Schutzsubstan zen wie Trehalose, Pektin, Gelatine oder Polyvinylalkohol und entsprechende Verfahren sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Es zeichnet das erfindungsgemäße Verfahren besonders aus, dass es sich in einer nicht zu erwartenden universellen Weise zur Oberflächenfunktionalisierung verschiedenster Materialien und für verschiedenste Anwendungen eignet. Die Oberfläche kann z. B. eine Kunststoffoberflache, eine Keramikoberflache, eine
Metalloberfläche und/oder eine Halbleiteroberfläche umfassen. Folien und beliebig geformte Formkörper und Halbzeuge, poröse oder fibrilläre Materialien wie z. B. Filtermembranen können mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gleichermaßen
funktionalisiert werden wie mikro- und nanoskalige Materialien und Partikel, z. B. Nanopartikel und Mikrokügelchen
(Microbeads) . In bevorzugten Ausführungen umfasst das Verfahren die Funktionalisierung einer Kunststoffoberfläche, wobei der Kunststoff insbesondere aus Polystyrol, Polyvinylchlorid
und/oder Polycarbonat ausgewählt ist. In weiteren bevorzugten Ausführungen werden Kunststoffe mit besonders günstigen
optischen Eigenschaften, z. B. einer hohe Transparenz und geringen Doppelbrechung, wie sie für optische Vorrichtungen oder diagnostische Verfahren mit optischer Detektion eingesetzt werden, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren funktionalisiert.
Mit Vorteil lassen sich beispielsweise Kunststoffe wie COC
(Cycloolefin-Copolymere, Markenname „Topas" von Topas Advanced Polymers GmbH, Deutschland; oder Zeonex/Zeonor von Zeon
Corporation, Japan) mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens funktionalisieren, ohne dass ihre Transparenz und ihre optische Oberflächenqualität sichtbar verändert wird.
Entsprechend betrifft die Erfindung in einem zweiten Aspekt ein Erzeugnis bzw. einen Träger mit einer Oberfläche, welche
zumindest abschnittsweise nach einem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt funktionalisiert wurde. Insbesondere ist das
erfindungsgemäße Erzeugnis dadurch charakterisiert, dass auf der Oberfläche zumindest abschnittsweise eine Polyphenolschicht mit mindestens einem an die Polyphenolschicht angebundenen Funktionsmolekül angeordnet ist, wobei zwischen der
Polyphenolschicht und dem Funktionsmolekül eine kovalente
Bindung ausgebildet ist.
In einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst das Funktionsmolekül ein Protein, insbesondere einen Antikörper oder ein Antigen. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung sind mindestens zwei oder mehrere verschiedene Funktionsmoleküle, beispielsweise zwei oder mehrere verschiedene Proteine, insbesondere zwei oder mehrere verschiedene Antikörper und/oder zwei oder mehrere verschiedene Antigene, kovalent an die Polyphenolschicht
angebunden .
In einer weiteren Ausgestaltung weist die Polyphenolschicht zusätzlich eine Quervernetzung zwischen zwei oder mehreren
Polyphenolverbindungen auf, wobei die Quervernetzung
insbesondere durch eine kovalente Anbindung eines vom
Funktionsmolekül unterschiedlichen di- oder multivalenten
Nukleophils an die Polyphenolschicht ausgebildet oder ausbildbar ist. In bevorzugten Ausgestaltungen umfasst die Quervernetzung bzw. das di- oder multivalente Nukleophil ein biologisches oder synthetisches Polymer, welches vorzugsweise aus Protein,
Proteinfragment, Peptid, Polyethylenimin, Poly-L-Lysin,
Polyvinylalkohol, Hydroxyethylcellulose, Pektin und/oder Stärke bzw. eines jeweiligen Teils davon ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Erzeugnis ein
Kunststoffartikel, insbesondere ein Einweg-Kunststoffartikel . In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist das Erzeugnis eine Mikrotiterplatte (Microplate) oder eine Zellkulturplatte. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung ist das Erzeugnis ein mikrofluidisches Bauelement, beispielsweise ein Chiplabor bzw. ein sogenanntes „lab-on-a-chip device" . In weiteren
Ausgestaltungen ist das Erzeugnis ein Feststoffpartikel, insbesondere ein Mikro- oder Nanopartikel . In anderen
Ausgestaltungen ist das Erzeugnis ein Filter oder eine Membran. In noch anderen Ausgestaltungen ist das Erzeugnis ein
Medizinprodukt, beispielsweise eine Prothese, ein Implantat, ein implantierbarer Datenchip, ein künstliches Gefäß oder Organ, ein Katheter, ein Stent, ein Tubus, ein Blutbeutel, eine Sonde, eine Kontaktlinse oder dergleichen.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft eine Verwendung eines Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt bzw. eine Verwendung eines Erzeugnisses gemäß dem zweiten Aspekt für technische,
biotechnische und/oder medizinische Zwecke. Als technische
Zwecke sind beispielsweise Trenn- und/oder Reinigungsverfahren vorgesehen. Nicht abschließende Möglichkeiten für biotechnische Zwecke sind z. B. analytische und/oder diagnostische Tests, insbesondere antikörperbasierte oder antigenbasierte
Nachweisverfahren ( Immunoassays ) und hier insbesondere solche im sogenannten ELISA-Format . Als medizinische Zwecke kommen
insbesondere Einsätze im Bereich der Prothesen- bzw.
Implantationstechnik sowie im Hygienebereich in Betracht.
Schließlich betrifft ein vierter Aspekt der Erfindung ein Kit zur Funktionalisierung einer Oberfläche. Das Kit enthält
mindestens eine Polyphenolverbindung mit der zumindest
abschnittsweise eine Polyphenolschicht auf der Oberfläche erzeugbar und anschließend mindestens ein Funktionsmolekül an die Polyphenolschicht anbindbar ist, um die Oberfläche zu funktionalisieren . Zusätzlich enthält das Kit mindestens ein Oxidationsmittel, mit dem die Polyphenolschicht zumindest abschnittsweise behandelbar und in eine oxidierte Form
umwandelbar bzw. überführbar ist. Darüber hinaus kann das Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt bzw. zur Herstellung eines Erzeugnisses gemäß dem zweiten Aspekt eingerichtet sein. Vorgesehen ist beispielsweise, dass in dem Kit ein oder mehrere Artikel mit der zu beschichtenden
Oberfläche, z. B. Mikrotiterplatten, enthalten sind.
In bevorzugten Ausgestaltungen umfasst das im Kit enthaltene Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid (H2O2) , Iod ( 12 ) und/oder Iodid. Vorzugsweise enthält das Kit das Iod und/oder Iodid zumindest teilweise als Iod-Iodid- bzw. Polyiodid-Stärke-Komplex oder in einer Form, mit der ein Iod-Iodid- bzw. Polyiodid- Stärke-Komplex herstellbar ist, z. B. als Iod-Kaliumiodid-Lösung oder Iod-Natriumiodid-Lösung . In diesem Fall kann das Kit zusätzlich Stärke, insbesondere wasserlösliche Stärke,
enthalten .
Ferner kann das Kit einen oder mehrere Puffer und/oder
Puffersubstanzen, z. B. in Pulverform, zur Herstellung einer gepufferten Lösung der Polyphenolverbindung, des
Oxidationsmittels und/oder für das Funktionsmolekül zur
Anbindung an die Polyphenolschicht enthalten.
Bevorzugte und vorteilhafte Ausgestaltungen des Erzeugnisses gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung, der Verwendung gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung und des Kits gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung entsprechen, soweit anwendbar, denen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung. Merkmale, die weiter oben und im Folgenden für das Verfahren offenbart sind, können sich daher auch auf das Erzeugnis, die Verwendung und das Kit beziehen und umgekehrt.
Kurze Beschreibung der Figuren Figur 1 zeigt die Wasserkontaktwinkel in Grad (y-Achse) von Tanninsäure-Schichten auf Polystyrol in Abhängigkeit von der Dauer in Minuten (x-Achse) einer oxidativen Behandlung mit Iod bzw. Iodstärke unterschiedlicher Zusammensetzung. A: 2 Milligramm pro Milliliter Iod; B: 0,4 Milligramm pro Milliliter Stärke + 0,02 Milligramm pro Milliliter Iod; C: 4 Milligramm pro Milliliter
Stärke + 0,2 Milligramm pro Milliliter Iod; D: 40 Milligramm pro Milliliter Stärke + 2 Milligramm pro Milliliter Iod; PS: unbehandeltes Polystyrol (Referenz) .
Figur 2 zeigt die Wasserkontaktwinkel in Grad (y-Achse) von
Tanninsäure-Schichten auf Polystyrol in Abhängigkeit von der Dauer in Minuten (x-Achse) einer oxidativen Behandlung mit Iod bzw. Iodstärke mit anschließenden 60- minütigem Blockier- bzw. Quervernetzungsschritt mit 1% Perfect Block. A: 2 Milligramm pro Milliliter Iod; B:
0,4 Milligramm pro Milliliter Stärke + 0,02 Milligramm pro Milliliter Iod; C: 4 Milligramm pro Milliliter
Stärke + 0,2 Milligramm pro Milliliter Iod; PS+PB:
unbehandeltes Polystyrol mit 1% Perfect Block
(Referenz) .
Figur 3 zeigt Dosis-Effektkurven eines Sandwich-Immunoassays zum
Nachweis von Myoglobin mit herkömmlich
funktionalisierter Referenzoberfläche (A) und mit einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren funktionalisierten Oberfläche (B) . Beide Oberflächen wurden mit der gleichen Antikörpermenge und über die gleiche Zeitdauer von 15 min beschichtet.
Figur 4 zeigt die quantitative Auswertung der Fluoreszenzsignale von IgG-Cy5 (y-Achse) auf einer herkömmlich funktionalisierten Oberfläche (A) und einer
erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche (B) in Abhängigkeit von der eingesetzten IgG-Cy5-Konzentration (x-Achse) .
Figur 5 zeigt die quantitative Auswertung der Fluoreszenzsignale von IgG-Cy5 auf der herkömmlich funktionalisierten
Oberfläche (A) und der erfindungsgemäß
funktionalisierten Oberfläche (B) aus Figur 4 nach dem Blocken der Oberflächen mit 1% Perfect Block.
Figur 6 zeigt die quantitative Auswertung der Fluoreszenzsignale von IgG-Cy5 (y-Achse) auf einer herkömmlich
funktionalisierten Oberfläche (A) und einer weiteren erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche (B) in Abhängigkeit von der eingesetzten IgG-Cy5-Konzentration (x-Achse) .
Figur 7 zeigt Dosis-Effektkurven eines Sandwich-Immunoassays zum
Nachweis von Myoglobin mit herkömmlich
funktionalisierten Polyphenoloberflächen jeweils ohne (A) und mit Blockier- bzw. Quervernetzungsschritt (B) als Referenz und einer nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren funktionalisierten Polyphenoloberfläche (C) .
Detaillierte Beschreibung von Ausführungsbeispielen
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen in Anlehnung an die Figuren und experimentelle Daten näher erläutert. Dabei dienen die Ausführungsbeispiele allein der Veranschaulichung der Erfindung und nicht der Beschränkung auf spezifische Details. Beispiel 1: Erzeugen einer Polyphenolschicht auf einer Polystyroloberfläche
Polyphenolschichten wurden auf einer Reihe verschiedener
Oberflächen erzeugt. Lediglich exemplarisch wird hier die
Abscheidung einer Polyphenolschicht auf einer
Polystyroloberfläche als Beispiel für eine hydrophobe bzw.
niederenergetische Kunsstoffoberfläche beschrieben. Polystyrol ist ein weit verbreiteter Standardkunststoff für Einweg- Kunststoffartikel aus dem täglichen Laborbedarf wie zum Beispiel Mikrotiterplatten, Küvetten und Zellkulturgefäße. In vielen Anwendungen wie z. B. bei der Herstellung von Immunoassays ist es erforderlich, die Polystyroloberfläche mit Funktionsmolekülen wie z. B. Antikörpern oder Antigenen zu funktionalisieren .
Zunächst wurde eine frische Beschichtungslösung mit Tanninsäure ( Sigma-Aldrich, Deutschland) , einer bevorzugten
Polyphenolverbindung der vorliegenden Erfindung, in einer
Konzentration von 1 Millimol pro Liter bzw. 1,7 Gramm pro Liter in Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung mit pH 7,4 (PBS-Puffer nach Dulbecco) angesetzt. Anschließend wurde die Polystyroloberfläche mit der Beschichtungslösung bedeckt und für 60 Minuten bei Raumtemperatur (etwa zwischen 20 °C und 25 °C) ohne Schütteln inkubiert. Nach Ende der Inkubation wurde die überschüssige Beschichtungslösung entfernt und die
Polystyroloberfläche einmal mit PBS-Puffer gewaschen und
getrocknet .
Die Eigenschaften der beschichteten und der unbeschichteten Polystyroloberfläche wurden anschließend mithilfe einer
Wasserkontaktwinkel-Messung verglichen. Die Messung erfolgte mit einem manuellen Tropfenformanalysator DSA25 der Firma Krüss GmbH, Deutschland nach Herstellerangaben. Aus der Messung der Wasserkontaktwinkel können bestimmte Eigenschaften der Oberfläche eines Festkörpers bestimmt werden, z. B. die
Oberflächenenergie. Je stärker sich der Tropfen auf der
Oberfläche zusammenzieht, d. h. je größer der Kontaktwinkel ist, desto geringer ist die Oberflächenenergie des Festkörpers.
Aus Figur 1 ist ersichtlich, dass der Kontaktwinkel der
unbeschichteten Polystyroloberfläche (PS) bei 90° liegt. Die Behandlung mit der Beschichtungslösung senkt den Kontaktwinkel um 40° auf etwa 50° (Figur 1: Zeitpunkt 0), d. h. die
Oberflächenenergie steigt stark an, die Oberfläche wird
hydrophil. Dieses Ergebnis belegt, dass innerhalb kurzer Zeit eine geeignete Tanninsäure-Schicht auf der Polystyroloberfläche erzeugt wurde.
Beispiel 2: Vergleich verschiedener Oxidationsbehandlungen der PolyphenolSchicht
Der Oxidationsschritt, d. h. die Behandlung der
Polyphenolschicht mit einem Oxidationsmittel, ist ein
wesentlicher Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens. In diesem Beispiel wurde der zeitabhängige Einfluss verschiedener
erfindungsgemäßer Oxidationsmittel auf die Polyphenolschicht untersucht .
Zu diesem Zweck wurden mit Tanninsäure beschichtete Polystyrol oberflächen gemäß Beispiel 1 hergestellt und anschließend mit einer Iodlösung in einer Konzentration von 2 Milligramm pro Milliliter (A) oder mit einer Iodstärke-Lösung mit 0,4
Milligramm pro Milliliter Stärke und 0,02 Milligramm pro
Milliliter Iod, (B) 4 Milligramm pro Milliliter Stärke und 0,2 Milligramm pro Milliliter Iod (C) bzw. 40 Milligramm pro
Milliliter Stärke und 2 Milligramm pro Milliliter Iod (D) jeweils in PBS-Puffer pH 7,4 über eine Dauer von 75 Minuten behandelt. Eine geeignete Iodlösung in einer Konzentration von 2 Milligramm pro Milliliter lässt sich z. B. aus neun Teilen
Wasser und einem Teil 2% Lugol'sche Lösung (2 Gramm Natriumiodid und 1 Gramm Iod in 50 Milliliter Wasser; Sigma-Aldrich,
Deutschland) hersteilen. Eine zur Verdünnung geeignete
Iodstärke-Lösung mit 40 Milligramm pro Milliliter Stärke und 2 Milligramm pro Milliliter Iod ist aus neun Teilen Stärkelösung mit 4 Gewichtsprozent löslicher Stärke nach Zulkowsky (Sigma- Aldrich, Deutschland) in Wasser und einem Teil 2% Lugol'sche Lösung herstellbar.
Die Ergebnisse dieses Versuches sind wiederum in Figur 1 dargestellt. Das Diagramm zeigt die Veränderung des
Kontaktwinkels (y-Achse) als Maß der Oberflächenenergie bzw. Hydrophilie der behandelten Oberfläche über der Behandlungszeit in Minuten (x-Achse) in Abhängigkeit vom jeweiligen
Oxidationsmittel. Die alleinige Behandlung mit Iod (A) führt aufgrund der Oxidation energiereicher Phenolgruppen zu
energieärmeren Chinongruppen zu einer Abnahme der
Oberflächenenergie, die sich in einem entsprechenden Anstieg des Kontaktwinkels über den der unbehandelten Polyphenolschicht manifestiert. Die Behandlung mit den niedrigkonzentrierten
Iodstärke-Lösungen (B, C) führt insgesamt nur zu einer
geringfügigen Abnahme der Oberflächenenergie. Bei der höchsten Konzentration der Iodstärke-Lösung (D) sinkt der Kontaktwinkel dagegen deutlich unter den Kontaktwinkel der unbehandelten
Polyphenoloberfläche aufgrund eines Anstiegs der
Oberflächenenergie, der vermutlich durch eine verstärkte
Anbindung von hydrophilen Stärkemolekülen an die oxidierte
Polyphenolschicht bewirkt wird. In einem weiteren Versuch wurde darüber hinaus der zusätzliche Einfluss eines 60-minütigen Blockier- und Quervernetzungsschrit tes mit einer l%igen (w/v) Perfect Block Lösung (MoBiTec GmbH, Deutschland) in PBS-Puffer auf die Oberflächenenergie
untersucht. Figur 2 zeigt die Ergebnisse dieses Versuches, wobei das Diagramm erneut die Veränderung des Kontaktwinkels (y-Achse) als Maß der Oberflächenenergie bzw. Hydrophilie der behandelten Oberfläche über der Behandlungszeit in Minuten (x-Achse) in Abhängigkeit vom jeweiligen Oxidationsmittel zeigt. Perfect Block senkt den Kontaktwinkel einer unbehandelten Referenz- Polystyroloberfläche (PS+PB) von 90° auf etwa 60°. Der Blockier- und Quervernetzungsschritt senkt den Kontaktwinkel der
Tanninsäure-Schichten dagegen auf 35°. Die zusätzliche
Behandlung mit elementarem Iod (A) oder verdünnter lodstärke (B) hat in diesem Fall nur noch wenig Effekt auf den Kontaktwinkel und die Oberflächenenergie. Lediglich konzentrierte 4%ige lodstärke senkt in diesem Fall den Kontaktwinkel noch
geringfügig (C) .
Beispiel 3: Vergleich der aktiven Antikörpermenge einer
erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche und einer
herkömmlich funktionalisierten Oberfläche
Ein zentrales Anwendungsfeld funktionalisierter Oberflächen ist die Herstellung von Festphasenreagenzien für analytische bzw. diagnostische Nachweisverfahren. Eines der verbreitetsten
Formate ist der sogenannte Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und hier insbesondere der Sandwich-ELISA. In diesem Format wird ein Antikörper an die Oberfläche einer festen Phase, meist die Polystyroloberfläche einer Mikrotiterplatte mit 96 separaten Näpfchen, den sogenannten „Wells", gebunden. Die Probe mit dem nachzuweisenden Antigen wird in die Wells gegeben und inkubiert. Während dieser Phase bindet der an die Platte gebundene Antikörper das in der Probe vorhandene Antigen, welches dann in weiteren Schritten detektiert bzw. quantifiziert werden kann. Das Messsignal ist beim Sandwich-ELISA direkt proportional zur Menge des Antikörpers, der in funktioneller bzw. aktiver Form auf der Oberfläche immobilisiert vorliegt, d. h. derjenigen Antikörpermenge, welche nicht durch die
Oberflächenbindung denaturiert wurde. Aus diesem Grund gibt die Signalhöhe bzw. die dynamische Sensitivität des Sandwich-ELISA direkten Aufschluss darüber, wie sich die Mengen von aktivem oberflächengebundenem Antikörper bei verschiedenen
Funktionalisierungsverfahren voneinander unterscheiden.
Ziel dieses Versuches war es, die aktive Antikörpermenge einer Mikrotiterplatte, welche in industriell üblicher Weise durch direkte Adsorption von Antikörper an die Polystyroloberfläche funktionalisiert wurde, mit derjenigen aktiven Antikörpermenge zu vergleichen, welche bei einer Mikrotiterplatte mit
erfindungsgemäß funktionalisierter Polystyroloberfläche erreicht wird .
Für die Referenz-Funktionalisierung (A) wurden jeweils 0,3 Mikrogramm pro Milliliter eines monoklonalen anti-Myoglobin Antikörpers (HyTest Ltd., Finnland) in 50 Mikroliter PBS-Puffer für 15 Minuten in den Wells der Mikrotiterplatte (Sarstedt AG, Deutschland) unter Schütteln inkubiert. Nach Entfernen der
Antikörperlösung wurde die Oberfläche der Wells mit jeweils 100 Mikroliter einer l%igen (w/v) Perfect Block Lösung (MoBiTec GmbH, Deutschland) in PBS-Puffer für 60 Minuten inkubiert.
Für die erfindungsgemäße Funktionalisierung (B) wurde in den Wells der Mikrotiterplatte zunächst eine Tanninsäure-Schicht analog zu Beispiel 1 erzeugt. Danach wurde der Antikörper unter denselben Bedingungen wie vorstehend unter (A) beschrieben an die Tanninsäure-Schicht gebunden. Nach Entfernen der
Antikörperlösung erfolgte im nächsten Schritt die Behandlung mit Oxidationsmittel, wobei 100 Mikroliter einer Iodstärke-Lösung (40 Milligramm pro Milliliter Stärke, 2 Milligramm pro
Milliliter Iod) in PBS-Puffer pH 7,4 für 1 Minute mit der
Oberfläche inkubiert wurden. Anschließend wurde die Iodstärke- Lösung entfernt und die Oberfläche wie unter (A) mit Perfect Block behandelt.
Für den nachfolgenden Myoglobin-Test wurde zunächst eine
Konzentrationsreihe von Myoglobin (humanes Myoglobin; Applichem GmbH, Deutschland) in PBS-Puffer pH 7,4 mit 0, 0,3, 1, 3, 10,
30, 100 und 300 Nanogramm pro Milliliter Myoglobin hergestellt. Von jeder Konzentration wurden in drei verschiedene Wells der funktionalisierten Mikrotiterplatten je 50 Mikroliter überführt und für 15 Minuten ohne Schütteln inkubiert. Nach Entfernen der Myoglobin-Lösung wurde jedes Well viermal mit je 150 Mikroliter PBST (PBS-Puffer pH 7,4 + 0,05% (v/v) Tween 20) gewaschen und im nächsten Schritt mit je 50 Mikroliter einer Lösung mit 0,23 Mikrogramm pro Milliliter polyklonalem anti-Myoglobin
Antikörper-HRP Konjugat (HyTest Ltd., Finnland) in PBS-Puffer pH 7,4 für 15 Minuten ohne Schütteln inkubiert.
Nach erneutem viermaligem Waschen mit je 150 Mikroliter PBST wurde in jedes Well 50 Mikroliter Lumineszenz-Substrat für ELISA (SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo
Fisher, Deutschland) nach Herstellerprotokoll zugegeben und die Lumineszenzentwicklung unverzüglich über 15 Minuten
kontinuierlich in einem Lumineszenz-Lesegerät (BMG Omega,
Deutschland) aufgezeichnet . Für die nachfolgende Auswertung wurde von jeder gemessenen Myoglobin-Konzentration jeweils das Lumineszenz-Signal nach 6 Minuten zugrunde gelegt. Figur 3 zeigt das Ergebnis dieses Versuches anhand der ermittelten Dosis-Effektkurven für die herkömmlich funktionali- sierte Mikrotiterplatte (A) und die erfindungsgemäß modifizierte Mikrotiterplatte (B) . Es ist unmittelbar ersichtlich, dass die erfindungsgemäße Oberflächenfunktionalisierung bei allen
getesteten Konzentrationen zu einem deutlich höheren Messsignal führt, welches im linearen Messbereich etwa 4400% über
demjenigen der herkömmlich funktionalisierten Oberfläche liegt. Aus dieser Abschätzung ergibt sich, dass sich mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei gleicher Antikörpermenge und Kontaktzeit von 15 Minuten, etwa 44-mal mehr aktiver Antikörper an die Polystyroloberfläche binden lässt als mit dem industriell üblichen Verfahren.
Im Ergebnis bedeutet dies, dass sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei der Herstellung von Immunoassay-Festphasenreagen zien eine bisher nicht für möglich gehaltene Ersparnis beim Antikörpereinsatz von mindestens 50% und bis zu 95% gegenüber herkömmlichen, auf direkter Adsorption des Antikörpers
basierenden Verfahren erzielen lässt.
Diese besondere Wirkung der Kombination aus hydrophiler, biokompatibler Polyphenolbeschichtung und der kovalenten
Anbindung des Funktionsmoleküls an die Polyphenolschicht
mithilfe der Behandlung durch ein Oxidationsmittel und der damit verbundene Mehrwert der Erfindung für die Leistungsfähigkeit und Wirtschaftlichkeit von funktionalisierten Oberflächen ist aus fachmännischer Sicht nicht zu erwarten gewesen.
Beispiel 4: Vergleich von Beladung und Stabilität von
erfindungsgemäß funktionalisierten Oberflächen und herkömmlich funktionalisierten Oberflächen WO 2014/116812 A2 beschreibt die Beschichtung von technischen Oberflächen mit Polyphenolschichten, an welche anschließend z.
B. ein Polymer oder ein Protein adsorbiert werden kann. Die technisch bedeutende Adsorption von Proteinen findet nur am Beispiel von Lysozym Erwähnung. Lysozym gilt als eines der
Proteine mit der stärksten Tendenz, an Oberflächen zu
absorbieren, d. h. vom Verhalten von Lysozym kann nicht auf das Adsorptionsverhalten anderer Proteine wie z. B. Antikörper an solche Polyphenolschichten geschlussfolgert werden. WO
2014/116812 A2 macht darüber hinaus keine Angaben zur Stabilität bzw. Umkehrbarkeit der Bindung des Proteins an die
Polyphenoloberfläche in Anwesenheit anderer Proteine und
Reagenzien oder dazu, wie sich proteinabstoßende Eigenschaften der Polyphenoloberfläche erzielen lassen.
Ziel dieses Versuches war daher ein direkter Vergleich von
Beladung und Stabilität von Oberflächen, die entweder mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens oder in herkömmlicher Weise, d. h. ohne Behandlung der Polyphenolschicht mit einem
Oxidationsmittel, mit einem Protein funktionalisiert wurden.
Als Beispiel für ein technisch relevantes Protein wurde für die Funktionalisierung ein Antikörper verwendet, hier Immunglobulin G aus dem Schaf, das mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert wurde (im Folgenden „IgG-Cy5"; Sigma-Aldrich, Deutschland) . IgG- Cy5 kann mittels fluoreszenzbasierter Bildgebungsverfahren direkt an einer technischen Oberfläche sichtbar gemacht und quantifiziert werden. Auf diese Weise lässt sich die
Konzentration an gebundenem IgG-Cy5 auf der jeweiligen
Oberfläche ermitteln.
Zur Durchführung des Versuches wurden 96-Well Mikrotiterplatten aus Polystyrol (Sarstedt AG & Co. KG, Deutschland) je Well mit 150 Mikroliter einer Tanninsäure-Lösung in einer Konzentration von 1 Millimol pro Liter in PBS-Puffer befällt und bei einer Temperatur von 20 °C bis 23 °C für eine Stunde ohne Schütteln inkubiert. Danach wurde die Tanninsäure-Lösung entfernt und jedes Well mit 300 Mikroliter deionisiertem Wasser gewaschen und getrocknet .
Im nächsten Schritt wurden zwei verschiedenen Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt und jeweils mit dem Stand der Technik verglichen.
In einer ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde die Polyphenolschicht bereits vor der Kontaktierung mit IgG-Cy5 mit einem Oxidationsmittel behandelt. Zu diesem Zweck wurde bei einer der mit Tanninsäure beschichteten Mikrotiterplatten je eine Hälfte der Wells mit einer Iodstärke-Lösung oxidiert. Dafür wurden zunächst 1,0 Gramm Iod und 2,0 Gramm Natriumiodid in 50 Milliliter deionisiertem Wasser sowie separat 20,0 Gramm Stärke nach Zulkowsky in 1,5 Liter deionisiertem Wasser gelöst.
Anschließend wurden beide Lösungen zur Herstellung der
Iodstärke-Lösung miteinander vereinigt. Für die
Oxidationsbehandlung wurden die Wells der Mikrotiterplatte mit je 150 Mikroliter der Iodstärke-Lösung befällt und für 5 Minuten bei 20 °C bis 25 °C inkubiert. Die als Vergleich dienenden Wells in der anderen Hälfte der Mikrotiterplatte wurden in dieser Zeit mit PBS-Puffer inkubiert.
Nach Entfernen der Iodstärke-Lösung bzw. des PBS-Puffers wurden die Wells der Mikrotiterplatte mit einer Verdünnungsreihe von IgG-Cy5 in Konzentrationen von 10 Mikrogramm pro Milliliter, 5 Mikrogramm pro Milliliter, 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1,25 Mikrogramm pro Milliliter, 625 Nanogramm pro Milliliter, 313 Nanogramm pro Milliliter, 156 Nanogramm pro Milliliter und 78 Nanogramm pro Milliliter in PBS-Puffer pH 7,4 befüllt und für 16 Stunden bei 23 °C im Dunkeln inkubiert. Nach Entfernung der Antikörperlösung wurde die Konzentration von
oberflächengebundenem IgG-Cy5 in den Wells mit einem
Fluoreszenz-Imager und der ImageQuant TL ArrayVersion 7.0
Analysesoftware (GE Healthcare, Großbritannien) quantifiziert.
Um darüber hinaus die Stabilität der Anbindung von IgG-Cy5 an die erfindungsgemäß funktionalisierte Oberfläche und die
konventionell funktionalisierte Oberfläche zu vergleichen, wurden die Wells in einem weiteren Schritt mit jeweils 250
Mikroliter einer l%igen (w/v) Perfect Block Lösung (MoBiTec GmbH, Deutschland) in PBS-Puffer für die Dauer von 5 Stunden bei 23 °C ohne Schütteln inkubiert. Nach Entfernung der Perfect Block Lösung wurde die Konzentration von oberflächengebundenem IgG-Cy5 in den Wells erneut wie oben beschrieben quantifiziert.
Die Ergebnisse dieses Versuches sind in Figuren 4 und 5
dargestellt. Figur 4 zeigt die quantitative Auswertung der
Fluoreszenzsignale auf der Oberfläche der Wells als Maß für die Menge an oberflächengebundenem IgG-Cy5 (y-Achse) in Abhängigkeit von der eingesetzten IgG-Cy5-Konzentration während der
Immobilisierung (x-Achse) vor der Behandlung der Oberfläche mit Perfect Block Lösung. Gezeigt sind für jede Konzentration jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei verschiedenen Wells nach konventioneller Funktionalisierung (A) und erfindungsgemäßer Funktionalisierung (B) . Im Durchschnitt lag die Oberflächenbeladung mit IgG-Cy5 bei der erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche (B) demnach um etwa etwa 13% höher als bei der Vergleichsoberfläche (A) , die gemäß dem Stand der Technik nicht mit dem Oxidationsmittel behandelt wurde. Figur 5 zeigt indessen die entsprechende quantitative Auswertung für die Menge an IgG-Cy5, die nach der Behandlung mit Perfekt Block Lösung noch an der erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche (B) und der Vergleichsoberfläche (A) gebunden vorlag. Die Oberflächenkonzentration an IgG-Cy5 war demnach auf der erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche (B) nach dem
Blocken etwa doppelt so hoch wie auf der funktionalisierten Vergleichsoberfläche (A) , die nicht mit dem Oxidationsmittel behandelt wurde. Ohne Beschränkung auf theoretische Überlegungen wird diese signifikant verbesserte Stabilität der
erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche darauf
zurückgeführt, dass ein größerer Teil IgG-Cy5 bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren kovalent an die Polyphenolschicht gebunden wurde und nicht durch das Blockierreagenz verdrängt werden konnte. Im Gegensatz hierzu lag IgG-Cy5 auf der
herkömmlich funktionalisierten Oberfläche überwiegend reversibel adsorbiert vor, sodass sich die Antikörper während der
Behandlung mit Perfekt Block Lösung wieder von der Oberfläche ablösen konnten.
Die signifikant verbesserte Stabilität der erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche ist z. B. für die Herstellung von Festphasenreagenzien für die Diagnostik und insbesondere als Festphase in ELISA-Tests besonders vorteilhaft, da solche
Festphasen auch in konzentrierten biologischen Lösungen wie z.
B. unverdünnten Blutseren eingesetzt werden können. In solchen konzentrierten biologischen Lösungen versagen herkömmlich funktionalisierte Festphasen, die überwiegend reversibel
absorbierte Antikörper enthalten, zumeist. Einer der wichtigsten Versagensmechanismen ist dabei die unspezifische
Proteinadsorption, die zur teilweisen Verdrängung der
oberflächengebundenen Antikörper und damit zu falschen Messergebnissen führt, wie hier anhand der Vergleichsoberfläche demonstriert wurde.
In einer zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde die Polyphenolschicht nicht vor, sondern während der
Kontaktierung mit IgG-Cy5 mit der Iodstärke-Lösung behandelt. Zu diesem Zweck wurde die Hälfte der Wells einer der mit
Tanninsäure beschichteten Mikrotiterplatten zu gleichen Teilen mit Iodstärke-Lösung und einer doppelt konzentrierten IgG-Cy5- Lösung befüllt, sodass die Endkonzentrationen von IgG-Cy5 in den Wells wiederum den oben genannten Konzentrationen der ersten Variante entsprachen. Die als Vergleich dienenden Wells der anderen Hälfte der Mikrotiterplatte wurden zu gleichen Teilen mit der doppelt konzentrierten IgG-Cy5-Lösung und PBS-Puffer statt der Iodstärke-Lösung befüllt. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 15 Minuten auf einem Horizontalschüttler bei 200- 300 rpm im Dunkeln. Nach Entfernung der Antikörperlösung und Waschen der Wells mit PBS-Puffer wurde die Konzentration von oberflächengebundenem IgG-Cy5 in den Wells wie oben beschrieben quantifiziert .
Das Ergebnis dieses Versuchs ist in Figur 6 wiederum anhand der quantitativen Fluoreszenzintensität auf der Oberfläche der Wells als Maß für die Menge an oberflächengebundenem IgG-Cy5 (y-Achse) in Abhängigkeit von der eingesetzten IgG-Cy5-Konzentration während der Immobilisierung (x-Achse) dargestellt. Es zeigte sich, dass nach der 15-minütigen Inkubation mit der
Antikörperlösung auf der erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche (B) etwa 25% höhere Fluoreszenzsignale gemessen wurden als auf der herkömmlich funktionalisierten Oberfläche (A) , die nicht mit dem Oxidationsmittel behandelt wurde. Das bedeutet, dass in der Variante des erfindungsgemäßen
Funktionalisierungsverfahren, bei der die Polyphenolschicht während des Anbindens des Funktionsmoleküls mit dem
Oxidationsmittel behandelt wird, pro Zeiteinheit etwa 25% mehr IgG-Cy5-Moleküle an die Oberfläche gebunden wurden als in dem herkömmlichen Verfahren.
Diese Vergleichsversuche belegen die vorteilhafte Wirkung der oxidativen Behandlung der Polyphenolschicht in dem
erfindungsgemäßen Verfahren im Hinblick auf die Beladung und Stabilität der funktionalisierten Oberflächen und die
dementsprechend günstigen Eigenschaften der auf diese Weise hergestellten Erzeugnisse im Vergleich zum Stand der Technik.
Beispiel 5: Untersuchung des Einflusses des Blockier- und
QuerVernetzungsschrittes
Neben einer hohen aktiven Antikörpermenge auf der Festphase ist es für analytische bzw. diagnostische Nachweisverfahren wie den Sandwich-ELISA wichtig, dass das Messsignal in Abwesenheit der nachzuweisenden Substanz gegen null geht (sogenannte „Zero-Dose Response") . Nur wenn beide Voraussetzungen kombiniert vorliegen, kann ein Nachweisverfahren die Qualitätsmerkmale einer hohen Empfindlichkeit bzw. einer niedrigen Nachweisgrenze und eines großen dynamischen Messbereichs erfüllen. Problematisch ist, dass die unspezifische Bindung von Proteinen, beispielsweise Serumproteinen bei einer Blutanalyse, Störsignale produzieren und zu einer fälschlich erhöhten Zero-Dose Response führen kann.
In diesem Beispiel wurde ausgehend von einer Polystyrol- Mikrotiterplatte mit Polyphenolbeschichtung der Einfluss des Oxidationsschrittes und/oder des Blockier- bzw. Quervernetzungs schrittes auf die aktive Antikörpermenge und die Zero-Dose
Response näher untersucht. Zu diesem Zweck wurde in den Wells der Mikrotiterplatte mit Tanninsäure eine Polyphenolschicht wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt, an welche anschließend monoklonaler anti-Myoglobin Antikörper wie in Beispiel 3 beschrieben gebunden wurde. In einer ersten Variante wurde die so funktionalisierte Oberfläche als Referenz direkt im nachfolgenden Sandwich-ELISA eingesetzt (A) . In einer zweiten Variante wurde die Oberfläche als weitere Referenz zusätzlich lediglich mit Perfect Block behandelt (B) .
In der erfindungsgemäßen dritten Variante (C) wurde die
Polyphenolschicht durch Behandlung mit Iodstärke-Lösung oxidiert und anschließend mit Perfect Block behandelt. Die jeweiligen Behandlungsschritte und die Durchführung des nachfolgenden
Sandwich-ELISA erfolgten analog zu Beispiel 3.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind anhand der jeweils ermittelten Dosis-Effektkurven des Myoglobin Sandwich- Immunoassays in Figur 7 dargestellt. Die antikörperfunktionali- sierte Polyphenoloberfläche führte ohne zusätzliche Behandlung zu hohen unspezifischen Signalen (A) . Diese ließen sich durch die Behandlung mit Perfect Block zwar deutlich reduzieren (B) , allerdings führte diese Behandlung zu einem erheblichen Verlust an Signalintensität und dynamischer Sensitivität des
Messverfahrens. Dies ist ein Zeichen dafür, dass der lediglich adsorptiv an die Polyphenolschicht gebundene Antikörper zu einem signifikanten Teil durch das Blockierreagenz wieder von der Oberfläche verdrängt wurde. Die erfindungsgemäße oxidative
Behandlung der Polyphenolschicht in Verbindung mit dem
anschließenden Blockier- und Quervernetzungsschritt führte dagegen zu hohen Signalen und einer geringen unspezifischen Proteinbindung (C) . Dabei lag auf der erfindungsgemäß funktio- nalisierten Oberfläche etwa zehnmal mehr aktiver Antikörper vor als auf der nicht-oxidierten Polyphenoloberfläche (A) . Auch wenn die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen in Bezug auf die Herstellung von Festphasenreagenzien für
analytische bzw. diagnostische Nachweisverfahren und
insbesondere Immunoassays erläutert wurde, sind dem Fachmann geeignete Abwandlungen, z. B. im Hinblick auf andere Materialien bzw. Oberflächen und/oder andere Funktionsmoleküle, auf der Grundlage der Beschreibung und der Ausführungsbeispiele ohne Weiteres ersichtlich. Entsprechend ist die Erfindung nicht durch die Beschreibung anhand der Ausführungsbeispiele auf diese beschränkt. Vielmehr umfasst die Erfindung jedes neue Merkmal sowie jede Kombination von Merkmalen, was insbesondere jede Kombination von Merkmalen in den Patentansprüchen beinhaltet, die im tatsächlichen Umfang der Erfindung erhalten enthalten ist, auch wenn dieses Merkmal oder diese Kombination selbst nicht explizit in den
Patentansprüchen oder Ausführungsbeispielen angegeben ist.

Claims

Patentansprüche
1. Ein Verfahren zur Funktionalisierung einer Oberfläche, wobei auf der Oberfläche durch Aufbringen mindestens einer Polyphenolverbindung zumindest abschnittsweise eine
Polyphenolschicht erzeugt und
die Oberfläche anschließend durch Anbinden mindestens eines Funktionsmoleküls an die Polyphenolschicht
funktionalisiert wird,
dadurch gekennzeichnet, dass die Polyphenolschicht vor, während und/oder nach dem Anbinden des Funktionsmoleküls zumindest abschnittsweise mit einem Oxidationsmittel
behandelt wird.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung der Polyphenolschicht mit dem Oxidationsmittel zumindest teilweise während des Anbindens des
Funktionsmoleküls an die Polyphenolschicht durchgeführt wird.
3. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass eine kovalente Bindung zwischen dem Funktionsmolekül und der Polyphenolschicht ausgebildet wird.
4. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, dass die Polyphenolverbindung mindestens eine ortho-Diphenolgruppe aufweist, welche durch die Behandlung mit dem Oxidationsmittel in eine ortho-Chinongruppe
umgewandelt wird.
5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, dass die Polyphenolverbindung ein Tannin, insbesondere ein Gallotannin, und/oder ein Catechin umfasst.
6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyphenolverbindung aus der Gruppe bestehend aus Tanninsäure, Epigallocatechin,
Epicatechingallat, Epigallocatechin-3-gallat, Pyrogallol und beliebigen Kombinationen davon ausgewählt ist.
7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, dass das Oxidationsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffperoxid, Iod, Iodid und beliebigen Kombinationen davon.
8. Das Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Iod und/oder Iodid zumindest teilweise als Iod-Iodid- Stärke-Komplex und/oder Polyiodid-Stärke-Komplex vorliegt.
9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, dass die Polyphenolschicht für mindestens 10 Sekunden, mindestens 30 Sekunden oder mindestens 60 Sekunden mit dem Oxidationsmittel behandelt wird.
10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, dass die Polyphenolschicht für höchstens 75 Minuten, höchstens 30 Minuten oder höchstens 5 Minuten mit dem Oxidationsmittel behandelt wird.
11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass das Anbinden des mindestens einen
Funktionsmoleküls ein Kontaktieren der Polyphenolschicht mit einer Lösung enthaltend mindestens 0,01 Mikrogramm pro
Milliliter, mindestens 0,05 Mikrogramm pro Milliliter oder mindestens 0,1 Mikrogramm pro Milliliter des mindestens einen Funktionsmoleküls umfasst.
12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Anbinden des mindestens einen
Funktionsmoleküls ein Kontaktieren der Polyphenolschicht mit einer Lösung enthaltend höchstens 10 Milligramm pro
Milliliter, höchstens 1 Milligramm pro Milliliter, höchstens 100 Mikrogramm pro Milliliter, höchstens 10 Mikrogramm pro Milliliter, höchstens 3 Mikrogramm pro Milliliter oder höchstens 1 Mikrogramm pro Milliliter des mindestens einen Funktionsmoleküls umfasst.
13. Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch
gekennzeichnet, dass die Lösung mindestens ein weiteres
Funktionsmolekül oder eine Mischung mehrerer verschiedener Funktionsmoleküle enthält.
14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch
gekennzeichnet, dass die Polyphenolschicht mit der Lösung für mindestens 1 Minute, mindestens 2 Minuten, mindestens 3
Minuten oder mindestens 5 Minuten kontaktiert wird.
15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, dass die Polyphenolschicht mit der Lösung für höchstens 120 Minuten, höchstens 60 Minuten oder höchstens 30 Minuten kontaktiert wird.
16. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, dass das Funktionsmolekül ein Biomolekül umfasst .
17. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch
gekennzeichnet, dass das Funktionsmolekül einen Antikörper umfasst .
18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyphenolschicht nach dem Anbinden des Funktionsmoleküls, nach und/oder während der Behandlung mit dem Oxidationsmittel zusätzlich zumindest abschnittsweise mit mindestens einem di- oder multivalenten Nukleophil behandelt wird.
19. Das Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das di- oder multivalente Nukleophil vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Protein, Proteinfragment, Peptid, Polyethylenimin, Poly-L-Lysin, Polyvinylalkohol, Hydroxyethylcellulose, Pektin, Stärke und beliebigen Kombinationen davon.
20. Ein Erzeugnis mit einer Oberfläche, welche nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 19 funktionalisiert wurde.
21. Das Erzeugnis nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche des Erzeugnisses eine Polyphenolschicht mit einem an die Polyphenolschicht angebundenen
Funktionsmolekül angeordnet ist, wobei zwischen der
Polyphenolschicht und dem Funktionsmolekül eine kovalente Bindung ausgebildet ist.
22. Das Erzeugnis nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche eine Kunststoffoberfläche ist.
23. Eine Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19 oder des Erzeugnisses nach einem der Ansprüche 20 bis 22 für technische, biotechnische und/oder medizinische Zwecke.
24. Ein Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der
Ansprüche 1 bis 19 zur Funktionalisierung einer Oberfläche, wobei das Kit mindestens eine Polyphenolverbindung enthält, mit welcher zumindest abschnittsweise eine Polyphenolschicht auf der Oberfläche erzeugbar und anschließend mindestens ein Funktionsmolekül an die Polyphenolschicht anbindbar ist, um die Oberfläche zu funktionalisieren, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit zusätzlich mindestens ein Oxidationsmittel enthält, mit welchem die Polyphenolschicht zumindest
abschnittsweise behandelbar und in eine oxidierte Form umwandelbar ist.
25. Das Kit nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das
Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid, Iod und/oder Iodid umfasst .
26. Das Kit nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das
Iod und/oder Iodid zumindest teilweise als Iod-Iodid-Stärke- Komplex und/oder Polyiodid-Stärke-Komplex vorliegt oder das Kit wasserlösliche Stärke enthält.
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