EP3914352A1 - Verwendung von oligonukleotiden für die behandlung von tumoren - Google Patents

Verwendung von oligonukleotiden für die behandlung von tumoren

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Publication number
EP3914352A1
EP3914352A1 EP20703149.3A EP20703149A EP3914352A1 EP 3914352 A1 EP3914352 A1 EP 3914352A1 EP 20703149 A EP20703149 A EP 20703149A EP 3914352 A1 EP3914352 A1 EP 3914352A1
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EP
European Patent Office
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oligonucleotides
tumor
oligonucleotide
micrograms
carrier
Prior art date
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Pending
Application number
EP20703149.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Heinrich Maria SCHULTE
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Haemes GmbH
Original Assignee
Haemes GmbH
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to the use of oligonucleotides for the specific therapy of tumor diseases at various stages directly during the surgical procedure.
  • oligonucleotides Short single- or double-stranded oligonucleotides that can be synthesized in a chemical process established in the prior art are referred to as oligonucleotides (Herdewijn 2005, Surhone et al. 2010).
  • DNA oligonucleotides up to a length of about 200 bases or base pairs can be synthesized efficiently.
  • DNA can be synthesized more easily and in longer fragments compared to RNA. Longer syntheses are technically possible, but the enzymatic production or the production in vivo are then simpler and more efficient. However, it is expected that in the future longer and longer oligonucleotides will also be produced synthetically. Automata are now used in the syntheses, which automatically carry out the repetitive steps of the synthesis.
  • Modifications can be, for example, unnatural nucleotide building blocks such as inosine or natural modifications such as the methylation of the cytosine.
  • Nucleotides can also be modified on the base residue, on the sugar residue or on the phosphate residue and act in embodiments of the present invention.
  • the modifications include, for example, substitutions with alkyl, alkoxy, amino, Deaza, halogen, hydroxyl, thiol groups or combinations thereof.
  • Nucleotides can also be replaced with analogues of higher stability, for example a ribonucleotide by a deoxyribonucleotide or the 2 'OH group of its sugar residue by 2' amino groups, 2 'O-methyl groups, 2' methoxyethyl groups or a 2'-0, 4'- C methylene bridge to be replaced.
  • Examples of a purine or pyrimidine analog of nucleotides are xanthine, hypoxanthine, azapurine, methylnthioadenine, 7-deaza-adenosine and 0 or N-modified nucleotides.
  • the phosphate residue of the nucleotide can be modified by replacing one or more oxygen atoms of the phosphate group with nitrogen or with sulfur (phosphorothioates). Further modifications are Locked Nucleic Acids LNA (W09914226 A2), Unlocked Nucleic Acids UNA, 2'OMe-methoxy and 2 * F fluoro modifications.
  • Locked Nucleic Acids LNA W09914226 A2
  • Unlocked Nucleic Acids UNA 2'OMe-methoxy
  • 2 * F fluoro modifications The 3 'and 5' ends of a single strand also allow others add molecular residues such as simple or glycosylated peptides and proteins as well as lipids, chitosan and other chitosan derivatives, polymers or dyes.
  • Modifications of this type can be linked to the oligonucleotides directly or via spacers, for example one or more glycine residues. These modifications are developed with a variety of objectives, for example to influence the stability of the oligonucleotides, the melting temperature of a double strand, the affinity for other molecules or surfaces, or their bioavailability or activity in vivo. Modifications also serve, for example, to improve the function of the oligonucleotide, its stability or its transfer properties, or to control its localization or targeting. In the following, all these modifications are included under oligonucleotides.
  • oligonucleotides naturally occur in, or are derived from, humans, animals or generally in living beings or viruses. They have very different functions such as the regulation of the expression of proteins, the interference with the expression or the communication between cells. They can be in the form of a double strand, a double strand with single-strand overhangs, hairpin, cyclically or as a single strand.
  • naturally occurring oligonucleotides are microRNA miRNA or long noncoding RNA inRNA
  • examples of naturally derived or artificial oligonucleotides are short interfering RNA siRNA, short activating RNA saRNA, CRISPR-Cas oligonucleotides or antisense-DNA, some of which are therapeutic Active substances are suitable.
  • Antisense DNA (Mipomersen TM, Kastle Theraputics, Inc., Chicago, II., USA) for the therapy of homozygous, hereditary hypercholesterolemia and siRNA (Patisaran TM, Alnylam, Inc., Cambridge, MA., USA) are approved for the first applications. for the treatment of polyneuropathy in hereditary, transthyretin-related amyloids. Both drugs are systemically injected.
  • Tumors in the narrower sense are benign (benign) or malignant (malignant) new growths (neoplasia) of body tissues that result from an incorrect regulation of cell growth (DocCheck, https://flexikon.doccheck.com/de/Tumor).
  • Malignant tumors are colloquially referred to as cancer. Many forms of malignant, especially solid tumors cannot be cured to this day.
  • the tumors with very short survival times after diagnosis for example, those of the pancreas, the Enumerate adrenals, the mesothelium, the brain and the lungs, although great efforts have been made in recent decades to improve or develop diagnoses, individual therapies and treatment methods for these tumors. Examples include the surgical removal of the tumor, drug treatment or radiation, in various combinations.
  • the newer or experimental methods include specific gene therapy methods or cell therapies, including in particular chimeric antigen receptor-bearing T cells (CAR-T).
  • CAR-T chimeric antigen receptor-bearing T cells
  • Tumor resection is often associated with adjuvant or neoadjuvant therapy. Medications and radiation are then used neoadjuvantly, ie before the operation, if the tumor mass of the primary tumor is to be reduced and the risk of surgery in the case of large tumors or tumors that are difficult to reach, for example, is to be reduced.
  • Adjuvant i.e. After the operation, the medication and radiation are intended to prevent the occurrence of recurrences and to act on distant metastases that are not accessible for surgery or whose existence is only suspected.
  • the mostly postoperative radiation is mainly used to prevent relapse or to treat locally known metastases, because today it is used almost exclusively locally. Medicines are mostly used systemically, especially if metastases are suspected but cannot be detected.
  • drugs can be chemotherapies that have a cytotoxic effect predominantly on proliferating cells, or targeted therapies such as antibodies or antibodies loaded with cytotoxins that attack tumor cells via tumor-specific receptors. Since the receptor equipment is often not known for metastases, targeted therapies are rarely used as adjuvants.
  • Chemotherapy is used, which is inserted into the surgical cavity after the operation. Local therapy also applies to glioblastoma because many drugs do not cross the blood-brain barrier - even if the blood-brain barrier may not be completely intact in a glioblastoma.
  • polymeric carriers are also used, which are intended to enable easier application and, as a depot with a slow release of the medication stored therein, longer availability and significantly higher dosage of the medication without toxic systemic effects occurring.
  • Gliadel TM is an example of a disc-shaped carrier with a diameter of 14 mm and a thickness, which was approved in the USA in 1999, biodegradable and provided with 7.7 mg of the cytostatic carmustine (also bis-chloroethyl-nitroso-urea, abbreviated BCNU) of 1 mm, of which up to eight specimens are inserted into the patient's operating cavity by the surgeon towards the end of the operation after removal of the tumor tissue.
  • BCNU bis-chloroethyl-nitroso-urea
  • nanoparticles have been developed that expand at acidic pH ( ⁇ 5). They are supposed to release their substances in the acidic environment of the endosome. These expansile particles were also provided with Paditaxel for use in lung cancer (Griset et al
  • Chitosan-based hydrogels Chitosan is obtained by deacetylating chitin, the material from which insect and crustacean shells are essentially made. Because of its good biodegradability, it has found its way into biomedical applications for some time, for example as wound healing material (Kim IY et al, 2008). Paclitaxel-loaded, chitosan-based hydrogels have been proposed to treat wound healing margins after tumor resection. The combination was therefore injected in vivo a few days after tumor inoculation to simulate this situation (Ruel-Gariäpy et al, 2004). Campthotecin was used in another study, but without the aim of application during resection (Berrada M et al 2005).
  • microsticks provided with doxorobizine were injected adjuvantly.
  • ablation recurrences are most frequently found at the edge of the treatment zone and around blood vessels.
  • the rods were injected after ablation of the liver (Qian et al 2003) and into a pre-punctured xenograft liver tumor (Weinberg et al, 2007).
  • the formation of a fibrotic capsule around the stick was reduced by the simultaneous administration of dexomethasone, which was complexed with hydroxypropyl ß-cydodextrin (Blanco et al, 2006).
  • 5-FU was applied to the rods (Haaga et al, 2005).
  • Flexible films are another possible carrier that adapt better to the surface of the wound edges than rigid carriers, so that the substances can diffuse into the tissue through a larger area.
  • Poly (glycerol monostearate co-epsilon-caprolactone) films with paclitaxel were implanted after resection in a lung cancer model (Liu et al 2010), with hydroxycamptothecin in a similar model (Wolinski et al -2, 2010) and again with paclitaxel in a sarcoma -Model (Liu et al, 2012).
  • hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) (Glehen et al 2008), in which a high local concentration of cytostatics in the peritoneum and an absorption of the substance in the upper cell layers with reduced systemic toxicity are to be achieved.
  • the additional hyperthermia is said to increase the therapeutic potential of the cytostatics used through the improved tissue penetration.
  • hyperthermia also creates its own direct cytotoxic effect (Ceelen et al 2010).
  • HIPEC For the application of the HIPEC, several drains are placed in different areas of the abdomen at the end of the operation. A roller pump system with a heat exchanger is used and the temperature curve is checked. The target temperature is 42-43 e C, the perfusion time depending on the protocol used between 30 and 120 minutes. The most frequently used cytostatic drug so far is mitomycin C.
  • the standard medications oxaliplatin and irinotecan used in systemic therapy are increasingly being used by HIPEC (Piso et al 2011).
  • PIPAC Pressure IntraPeritoneal Aerosol Chemotherapy
  • PIPAC Pressure IntraPeritoneal Aerosol Chemotherapy
  • Medications such as cisplatin, doxorubicin, oxaliplatin, paclitaxel
  • PIPAC Pressure aerosol chemotherapy
  • Local administration directly at the tumor site means that the otherwise existing pharmacological limitations of intraperitoneal chemotherapy, such as poor distribution within the body cavity and low diffusion into the tissue, are eliminated.
  • the local dose of the cytostatics can be reduced by a factor of 10 without losing tumor efficacy.
  • the dose-dependent local toxicity of intraperitoneal chemotherapy is thus better controlled, the organ toxicity and the systemic side effects of the therapy are significantly reduced.
  • a capnoperitoneum In the PIPAC with a 12 mmHg C02 a capnoperitoneum, ie an overpressure is made and two balloon trocars inserted through the abdominal wall. Then a micropump inserted into the abdomen and connected to a high-pressure contrast medium injector.
  • doxorubicin 1.5 mg / m2 body surface area in 50 ml 0.9% NaCI solution
  • cisplatin 7.5 mg / m2 KOF in 150 ml 0.9% NaCI solution
  • Injection parameters are set at a flow rate of 30 ml / min and a maximum inlet pressure of 200 psi.
  • the micropump generates a polydisperse aerosol with a droplet size between 6-11 pm. This small size ensures that the dispersed droplets remain in the gas for a longer period of time, for example over 30 minutes.
  • the therapeutic capnoperitoneum is kept at a temperature of 37 “Celsius for 30 minutes.
  • the chemotherapy aerosol is then excreted into the air disposal system via a closed line. Finally, the trocars are pulled (Reymond et al 2014).
  • Gene therapy is also proposed for mesothelioma and ovarian cancer (WO 2015/002861 A1), in which an adenovirus loaded with a gene for human interferon alpha 2b is used.
  • the adjuvant application is not explicitly intended.
  • antibodies were also used adjuvantly in tumor therapy, in the form of multiple injections systemically after resection of the tumor.
  • adjuvant chemotherapy after surgery has become state of the art and is often used in medical practice.
  • 5-FU and oxaliplatin are used.
  • the angiogenesis-inhibiting monoclonal antibody Avastin TM (bevacizumab) was systemically administered postoperatively. This antibody binds to the vascular endothelial growth factor VEGF ⁇ and prevents the angiogenesis signal. After 36 months, there was no improvement in the relapse risk in the adjuvant antibody arm of the study in this study. With cetuximab, an EGFR-binding antibody used in breast cancer therapy.
  • this antibody was added to the standard for adjuvant chemotherapy.
  • the relapse risk for the antibody arm hardly changed; on the contrary, the relapse risk even increased for some patient groups (De Gramont et al 2011, Oyan B 2012).
  • the antibodies are believed to accelerate resistance to chemotherapy. It is also known from preclinical studies that their adjuvant use promotes the formation of metastases. Furthermore, it cannot be excluded that new pro-survival paths are stimulated act to build resistance. It also appears that combined therapies can also interfere with the mechanisms of action (Huang et al 2017)
  • Immune check point-targeted monoclonal antibodies for example PD-1 antibodies, were administered intratumorally in the first clinical tests. Resistance to ICT mAbs towards systemic use seems to be reduced (Maraballe et al. 2017).
  • oligonucleotides have already been developed for the treatment of tumors. They are usually directed against specific cellular targets, such as cell cycle proteins such as kinesin spindle protein KSP, polo-like kinase 1 PLK, protein kinase N3 PKN3, ribonucleotide reductase RRM2, or tenasion-2.
  • cell cycle proteins such as kinesin spindle protein KSP, polo-like kinase 1 PLK, protein kinase N3 PKN3, ribonucleotide reductase RRM2, or tenasion-2.
  • the prodrug from WO 2010/102615 is also included, in which a conjugated protease substrate inhibits the effectiveness of the siRNA until a protease cleaves the substrate.
  • siRNA can also be applied, for example, "naked” in saline, or complexed with polycations, cationic lipid / lipid transfection reagents or cationic peptides, as components of defined molecular conjugates (eg cholesterol-modified siRNA, TAT-DRBD / siRNA complexes), or as components of Liposomes.
  • defined molecular conjugates eg cholesterol-modified siRNA, TAT-DRBD / siRNA complexes
  • oligonucleotides have been and are still being developed for a variety of tumor therapeutic approaches as intratumoral injection.
  • Han et al. chitosan particles formulated siRNA to reduce the expression of transglutaminase in vivo in breast cancer and melanoma (Hat et al, 2012).
  • Hydrogels with a gel temperature of 40 S C in combination with gold-containing nanoshells were injected intratumorally to produce a local effect of siRNA using optical radiation (Strang et al, 2014).
  • Polyethyleneimide-conjugated organophosphazene also exhibits a thermal reaction and was injected intratumorally with siRNA against VEGF and Cyclin Bl (Kim et al 2012).
  • Plasmids and oligonucleotides have also already been applied locally to promote wound healing, for example the plasmids for platelet-derived growth factor pPDGF or vascular-endothelial growth factor pVEGF in poly (lactic-co-glycolic acid) PLGA nanoparticles (Tokatiian et al 2014) or also prolyl hydroxylase domain 2 PHD2-siRNA in acellular dermal matrix as an implant (Vandegrift et al 2015), or p53 (Nguyen et al 2010).
  • the focus is on wound healing after an injury without a tumor connection.
  • a potential risk of these approaches is that the target genes addressed for wound healing mean an increased risk of tumor formation. This prevents the use of these local approaches in tumor therapies.
  • cytostatics in particular are used as adjuvants after tumor resection.
  • cytostatics with this local mode of application offer many advantages over their systemic application: - The often hydrophobic substances reach the intended site of action in the vicinity of the resected tumor mass much more directly
  • Macromolecules are usually readily soluble anyway and are excreted more slowly than small molecules.
  • the achievable concentration gain is lower with the local application of macromolecules than with small molecules.
  • the diffusion paths of the macromolecules are also shorter than that of the small molecules, i.e. they do not penetrate far into the tumor bed and its surroundings. The depth of penetration becomes particularly small if a fibrotic capsule is formed around the wearer during the healing process of the operating cavity.
  • Macromolecules are therefore used for tumor resections for other purposes.
  • An elaborate approach was followed with Sitimagene ceradenovec, which works by converting a prodrug systemically injected after surgery, which in turn is a small molecule.
  • the conversion only occurs locally in cells that were previously transfected during the operation with a gene for herpes simplex thymidine kinase that is several hundred nucleotides in length.
  • the gene is packaged in a non-replicable adenovirus with which the cells are infected.
  • the gene is expressed after transfection of the cells and causes the enzyme Herplex simplex thymidine kinase to be produced, which in turn turns the Ganciclovir TM prodrug into the active form converts.
  • the use of the small molecule Gangciclovir TM enables a high local concentration to be achieved.
  • Antibodies are used in the area of the operation, however, primarily because of the possibility of using them fluorescence-labeled as a marker in the operation. Antibodies are often used, which are otherwise used systemically as tumor therapeutics. Their ability to bind to tumor-specific receptors enables them to be labeled with tumor cells. When the fluorescence is excited, the marked tumor cells light up and provide the surgeon with information about the extent of the tumor. Antibodies are injected intratumorally locally for therapy, i.e. without tumor resection. Adjuvants for tumor resection are only applied systemically.
  • the invention is therefore based on the object of providing a simple adjuvant form of therapy which is applied locally in the operating cavity and which comprises the tumor cells remaining after at least partial tumor resection and the tumor cells which arise after the resection in the tumor bed and in its vicinity or drip metastases in the vicinity or surroundings of the primary tumor destroyed.
  • the oligonucleotides are preferably applied with resorbable, gel-like or elastic carriers or solid carriers such as gauze material or particles.
  • a liquid formulation can also be preferred if the operating cavity is too complex for other forms of application to reach all potential locations where tumor cells can be located.
  • the liquid form can in turn contain particulate or gel-like particulate carriers.
  • the applied volume is a liquid
  • the formulation is preferably chosen so that it fills the operating cavity more than half and in particular completely. If there is drainage after the operation, the liquid application form can also be applied continuously as a perfusion several times or for a longer period of time.
  • an aerosol-shaped application form can also be preferred, in which the formulated or non-formulated oligonucleotides are atomized from a liquid solution and introduced into the operating cavity.
  • oligonucleotides are expected to be less suitable for this application than other classes of molecules, in particular as small molecules, because of their charge, size, lability and the low rate of uptake in the cells and because of their rapid degradation. Formulated oligonucleotides are sometimes significantly larger and diffuse even more slowly, which would be expected to make them even less suitable for this use.
  • Small molecules are expected to reach not only the top layer of a cell layer but also deeper layers of the adjacent tissue after local application. This deep-reaching effect is preferred because tumor cells are also expected there.
  • a simple form of therapy in the sense of the invention is characterized by the use of at least one type of oligonucleotide as an active ingredient component, which already achieves an antitumor effect individually. This simple form of therapy is preferred in order to keep the risk of undesirable effects low.
  • a form of therapy with only one application is preferred, since access to the operating cavity is limited in time in view of the rapid development of the laparoscopic surgical techniques used in tumor resections and, ideally, currently does not last longer than 30 minutes. Each subsequent opening of the operating cavity would also increase the risk of bursting tumor cells.
  • pleiotropic oligonucleotides are preferably used in order to act on as many tumor cells as possible regardless of the phase of the cell cycle in which the cell is currently located, particularly in the case of a single application.
  • pleiotropic are oligonucleotides which act simultaneously in a cell against at least two targets, for example against two mRNA with the same target sequence, which code for different proteins.
  • An example of a pleiotropic oligonucleotide are prodrugs according to W02010102615, in which preferred embodiments in tumor cells can act in parallel against several physiological targets (W02012098234).
  • biodegradable carrier materials with low immunogenicity which have hydrogel-like or elastic properties, and elute oligonucleotides by diffusion or during degradation in vivo or by changes in environmental parameters such as the pH.
  • Carriers containing medically proven materials such as collagen, atelocol, gelatin, fibrin, chitosan or hyaluronic acid, their synthetic or recombinant variants and their synthetic modifications are used with particular preference.
  • temporarily connected means that the carrier can be firm, elastic or even deformable, but remains as a unit over several hours or days.
  • Biodegradable carriers which become smaller as a result of the breakdown process in the body and disintegrate into smaller units after hours or days, are degraded by a carrier like a gauze, or which undergo a transformation into a liquid phase.
  • oligonucleotides in large amounts per application is particularly preferred.
  • the total amount of oligonucleotides used depends on the surgical cavity and the structure of the surrounding tissue. For the connected carriers, this relationship is described as the loading density. It is preferred to use oligonucleotides in carriers with loading densities of more than 3 micrograms of oligonucleotide per milliliter of carrier volume, particularly preferably more than 12, 50, 250, 1000 or 5000 micrograms per milliliter in each case.
  • Carriers that are absorbed by the body are particularly advantageous.
  • Carriers that enable simple laparoscopic handling, such as flexible foils or rods, are particularly advantageous. Oligonucleotides and smaller particulate carriers can be applied in nets, such as nets made of gauze material, or in a hydrogel. It is preferred to use carriers which have an initial elution rate of more than 1 microgram / square centimeter and day, in particular more than 2, 5, 10, 25 or 100 microgram / square centimeter and day each.
  • the oligonucleotides are used locally after the tumor resection in order to prevent recurrence or metastasis.
  • they are applied to the resulting surgical margins and the surrounding tissue during the operation, for example, after the primary tumor has been completely or partially removed.
  • This also includes surrounding connective tissue and fatty tissue.
  • gel-like formulations are advantageous, which can be distributed or sprayed onto the tissue with a brush or similar tool.
  • Collagen which can be provided with gel-like or elastic properties, is also suitable as a carrier material when using the oligonucleotides. Collagen is absorbed by the body and has low immunogenicity.
  • oligonucleotides in liquid formulation according to the invention is advantageous if the oligonucleotides can be distributed in the operating cavity with a syringe.
  • An advantage of this form of application is given for complex forms of operating cavities because it distributes itself in the operating cavity and can flow out of its openings, as drip metastases would probably also do.
  • Complex in the sense of the invention means that the operating cavity is open to cavities such as the peritoneum, as a result of which tumor cells can get into remote edges of the peritoneum.
  • a particularly good distribution is ensured by the use of liquid volumes that are of similar size, particularly preferably the same or even 1, 2, 5 times as large as the volume of the operating cavity alone or with the inclusion of connected cavities. For example, when an adrenal gland is removed, an operating cavity of approximately 25 ml is created, which, however, is connected to the much larger retroperitoneal space. Perfusions can also be carried out with large volumes of liquid, so that tumor-effective oligonucleotides are continuously supplied to the operating cavity and high local concentrations of oligonucleotides are present everywhere in the cavity.
  • oligonucleotides as aerosol according to the invention is also preferred.
  • an overpressure is created in the operating room or in the adjoining rooms.
  • the aerosol is introduced through a trocar, tube or similar tool or even generated with an inserted aerosol generator.
  • the aerosol is distributed almost uniformly in the cavity, so that even remote angles of the cavity can be reached.
  • the cavity is maintained for more than two hours, especially longer than an hour or a half.
  • the use of the oligonucleotides in aerosol form according to the invention can also be repeated several times if access to the cave is continuous or can be quickly and easily re-established.
  • oligonucleotides in aerosols in amounts of more than 1 microgram / square centimeter of void volume, and particularly preferably of more than 2.5, 10, 25, 100 micrograms.
  • oligonucleotides according to the invention includes the combinations with methods and therapies from the prior art. This includes, for example, the simultaneous use of medications such as cytostatics and oligonucleotides as well as, for example, radiotherapy carried out in parallel.
  • Carcinomas of the adrenal cortex rarely occur and are today usually treated with laparoscopic adrenalectomy, i.e. a complete minimally invasive surgical removal of the adrenal gland.
  • laparoscopic adrenalectomy i.e. a complete minimally invasive surgical removal of the adrenal gland.
  • the prognosis for the patients treated in this way is nevertheless poor, especially with late-identified primary tumors, recurrences or metastases are very likely to occur and usually lead to the patient's death within a few months.
  • Laparoscopic adrenalectomy is performed using either an abdominal / transperitoneal or retroperitoneal approach.
  • the renal fascia is pierced and an operating cavity is created, which is pressurized with 20 - 30 mm Hg overpressure for stabilization.
  • the excess pressure also reduces or prevents bleeding into the operating cavity after any injury to blood vessels.
  • further cuts are used to mobilize the surrounding organs, to cut the arteries and veins that supply the adrenal gland, and to expose the adrenal gland.
  • the adrenal gland as a whole is prepared with the surrounding adipose tissue, transferred to a retrieval pouch, which in turn is pulled out of the patient through one of the trocars.
  • a lymphadenectomy can also be performed.
  • the surgical cavity is rinsed with pure water and antibiotics and, in the simple case, closed without drainage.
  • tumor cells may have been transported from the actual adrenal gland into the environment. This includes draining metastases that occur in body cavities due to the caudal migration of detached tumor cells with the force of gravity on other organs or parts of organs. These processes are facilitated by the fact that the fascia sac that surrounds the kidney opens medially and caudally into the retroperitoneal space.
  • the oligonucleotides are used locally after the tumor resection in order to prevent the formation of recurrence or metastases and to combat remaining tumor cells or metastases.
  • they are applied to the resulting surgical margins and the surrounding tissue, for example during the operation after removal of the adrenal gland.
  • This also includes surrounding connective and fatty tissue, especially the renal fascia.
  • Gel-like formulations are particularly suitable for this, which are applied laparoscopically to the wound edges using an instrument such as a brush.
  • wound margins with a surface area of about 50 square centimeters develop. Gels are applied with a layer thickness of 0.2 to 1 mm, which corresponds to a gel volume of 1 to 5 ml.
  • This gel volume preferably contains 70 micrograms of oligonucleotide and particularly preferably more than 250 or 1000 Micrograms, 5, 25 or 100 milligrams. The gel is broken down within a few weeks and the oligonucleotides are continuously released.
  • elastic carriers made of, for example, (collagen) are used, which are introduced into the operating cavity.
  • highly elastic carriers they are introduced into the capsule through the aperture of a trocar into the operating cavity.
  • the carrier takes on size and shape, that of the resected organ of about 4 * 3 * 2 cm and a volume of less than 25 ml or a part of this volume carries oligonucleotides in amounts of preferably more than 70 micrograms, and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms , 5, 25 or 100 milligrams The body is broken down within a few weeks and the oligonucleotides are continuously released.
  • the degradation rate of the gel and the elastic carrier can be controlled by manufacturing parameters, in the case of collagen, for example, by the degree of cross-linking of the collagen. Preference in v / Vo half-lives of more than 1 week, particularly preferably of 2 weeks, 4 weeks and 3 months.
  • a liquid formulation for the oligonucleotides is used.
  • the oligonucleotides are distributed, for example, with a syringe in the operating cavity.
  • An advantage of this form of application is that it distributes itself in the operating cavity and can flow out of its openings, as drip metastases would probably also do.
  • adrenal cortex carcinoma with the aforementioned expansion of the fascia sac
  • liquid application forms reach its outlets better than solid application forms.
  • the injected volume in this example is 20 ml, in which there are preferably more than 70 micrograms, and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams of oligonucleotide.
  • the oligonucleotides can be packed in particles or liposomes so that they are only released slowly when the carriers are broken down or absorbed by the cells.
  • the rate of degradation of the particles can be influenced by manufacturing parameters such as the degree of crosslinking.
  • the half-lives in vivo are preferably more than 1 week, particularly preferably 2 weeks, 4 weeks and 3 months. It can also be advantageous to use supports with a simpler geometry from which the oligonucleotides elute over a longer period, in particular over several days. Carriers that are absorbed by the body are particularly advantageous. Carriers that enable simple laparoscopic handling, such as flexible foils or rods, are particularly advantageous. Smaller particulate carriers can be applied in nets, such as gauze nets, or in a hydrogel.
  • the use of the oligonucleotides as an aerosol may be preferred, in particular at amounts of 70 micrograms, and particularly preferably of more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams of oligonucleotide.
  • the combination of the adjuvant use of the oligonucleotides with adjuvant therapies such as mitotans and the combination with a radio may be preferred.
  • Ovarian cancer is currently the sixth most common malignant disease in women (Guideline Ovarian Cancer 2013).
  • the surgical removal of an ovary is an essential part of the therapy.
  • the result of the diagnosis has a strong influence on the extent to which tissue is removed.
  • the fallopian tube (tube) and lymph nodes, and in later stages also other organs, particularly those that reach or adjoin the peritoneum, can be affected.
  • the tumor resection is then carried out as far as possible, but complete removal is often not possible in these cases because the surrounding tissue is often already affected. In contrast to adrenal carcinoma, it is recommended not to perform the operation laparoscopically.
  • Adjuvant chemotherapy is recommended in most cases, with the exception of this recommendation only cases with very early stages at the time of the operation.
  • Systemic carboplatin a low molecular weight cytostatic, is recommended, which often has significant side effects such as changes in blood count, liver and nerve dysfunction as well as cardiovascular disorders.
  • paditaxel and bevacizumab a monoclonal antibody against VEGF, are also recommended for systemic therapy. Relapses nevertheless occur frequently.
  • the oligonucleotides are used locally after the tumor resection in order to prevent the formation of recurrence or metastases and to combat remaining tumor cells or metastases. For this purpose, they are applied to the resulting surgical margins and the surrounding tissue, for example, during the operation after removal of the ovary and other tissue. This also includes surrounding connective and fatty tissue, especially parts of the peritoneum.
  • the size of an ovary in an adult is about 3.5 * 2 * 1 cm, its volume is about 3 - 6 ml. Similar to adrenal carcinoma, various formulations are suitable, including a gel-like formulation. In spite of the smaller organ volume compared to the adrenal cortex, volumes of 1 - 5 ml are preferred because tissue around the ovary should be coated to a greater extent.
  • the gel volume preferably contains 70 micrograms and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams. The gel is broken down within a few weeks and the oligonucleotides are continuously released. The oligonucleotides can be packed in particles or liposomes so that they are only released slowly when the carriers are broken down or absorbed by the cells.
  • the rate of degradation of the particles can be influenced by manufacturing parameters such as the degree of crosslinking.
  • the half-lives in vivo are preferably more than 1 week, particularly preferably 2 weeks, 4 weeks and 3 months.
  • elastic supports made of, for example, collagen are used, which are introduced into the operating cavity and completely or partially fill the volume of an ovary.
  • a carrier carries oligonucleotides in amounts of preferably more than 70 micrograms, and particularly preferably of more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams. The carrier is broken down by the body within a few weeks, the oligonucleotides being continuously released.
  • the degradation rate of the gel can be controlled by manufacturing parameters, in the case of collagen, for example, by the degree of cross-linking of the collagen. In vivo half-lives of more than 1 week are preferred, particularly preferably 2 weeks, 4 weeks and 3 months.
  • a liquid formulation for the oligonucleotides can also have advantages in ovarian cancer, since the peritoneum that surrounds the ovaries extends widely.
  • the injected volume for ovarian cancer in this example is 20 ml, in which there are preferably more than 70 micrograms, and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams of oligonucleotide.
  • the oligonucleotides can be in
  • Particles or liposomes must be packaged so that they are released only slowly when the carriers are broken down or absorbed by the cells.
  • the rate of degradation of the particles can be influenced by manufacturing parameters such as the degree of crosslinking.
  • the half-lives in vivo are preferably more than 1 week, particularly preferably 2 weeks, 4 weeks and 3 months.
  • the use of the oligonucleotides as an aerosol can be preferred, in particular in amounts of 20 or 70 micrograms, and particularly preferably of more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams of oligonucleotide
  • oligonucleotides with adjuvant cytostatics such as carboplatin, cisplatin, paclitaxel and bevacizumab, and the combination with radiation can be preferred.
  • adjuvant cytostatics such as carboplatin, cisplatin, paclitaxel and bevacizumab
  • Malignant diffuse mesothelioma is a tumor that originates from the mesothelial or submesothelial cells of the pleura, peritoneum or pericardium.
  • the prognosis for patients with malignant pleural mesothelioma is poor with median survival times of 4 to 12 months. Curative treatment is currently not available.
  • mesotheliomas originate from the pleura. Malignant mesotheliomas are comparatively rare. Most often they occur as signal tumors previous exposure to asbestos (Neumann et al 2013). It is also expected that the number of mesothelioma cases, for example after the attack on the World Trade Center in New York on September 11, 2001, will increase significantly in the next 15 years among those exposed at that time (Povtak 2016). Depending on the mesothelioma subtype, tumor cells are released into the pleural effusion in more than 50% of pleural mesothelioma diseases.
  • a liquid formulation is suitable for obtaining the affected lung, preferably concentrations of more than 15 or 70 micrograms and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams per milliliter.
  • elastic supports with a total volume of the resected organs are no longer useful. Instead, better flat supports such as membranes, foils or gauze are used, which carry oligonucleotides directly, packaged in particles such as liposomes, conjugated or formulated as a gel.
  • Loading densities of 10 micrograms per square centimeter are preferred, particularly preferred as 50 or 200 micrograms, 1, 5 or 20 milligrams of oligonucleotide per square centimeter. It is preferred to apply oligonucleotides to implants, such as those used in the resection of the diaphragm, with the same oligonucleotide density.
  • the use of the oligonucleotides as an aerosol can be preferred, in particular in amounts of 70 micrograms, and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25, 100 or 1000 milligrams of oligonucleotide
  • oligonucleotides with other adjuvant therapies such as carboplatin and pemetrexed, and the combination with radiation may be preferred.
  • Glioblastomas belong to the diffusely infiltrating, highly malignant gliomas and, with a share of 16%, are the most common brain neoplasms. According to the WHO classification, they are classified as grade IV tumors and are associated with a poor prognosis. Since glioblastomas show markedly infiltrative growth, healing by resection of the tumor is not possible. The goal is to largely reduce the tumor mass surgically.
  • Adjuvant therapy which combines radiotherapy with chemotherapy, is therefore recommended according to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (EORTC-NCIC) protocol (Javamanne et al 2018). However, it only starts four weeks after the operation when the The surgical wound healing process has progressed.
  • Temozolomide is currently the treatment standard (Davis 2016), an oral alkylating chemotherapy drug that is genotoxic and teratogenic, however.
  • the adjuvant deposition of Gliadel TM wafers described during the operation is a therapy variant that is not part of the standard of treatment, but is also carried out together with a temozolomide treatment.
  • the simultaneous use of temozolomide and bevavizumab is not recommended (Holdhoff et al 2011).
  • a newer therapy option in development includes DCVax, a procedure in which monocytes are removed from the patient and differentiated extracorporeally into dendritic cells, associated with tumor antigens and then transferred back to the patient.
  • glioblastoma In glioblastoma, the size and shape of the operating cavity are different. However, the size of the operating cavity is also a few milliliters, making it comparable to that of adrenal carcinoma and ovarian cancer. However, the shape is different and as individual as the size. In addition, partial resections can be performed almost exclusively with glioblastoma.
  • Gel-like formulations which are applied to the wound edges with an instrument such as a brush, are also particularly suitable for the use according to the invention in the case of glioblastoma.
  • the gel volume of 1 to 5 milliliters preferably contains 70 micrograms and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams.
  • the gel is broken down within a few weeks and the oligonucleotides are continuously released.
  • the oligonucleotides can be packed in particles or liposomes so that they are only released slowly when the carriers are broken down or absorbed by the cells.
  • the rate of degradation of the particles can be influenced by manufacturing parameters such as the degree of crosslinking.
  • the half-lives in vivo are preferably more than 1 week, particularly preferably 2 weeks, 4 weeks 3 months or even more than a whole year.
  • elastic supports made of, for example, collagen are used, which are introduced into the operating cavity and completely or partially fill the volume of the operating cavity.
  • One or the bearers Oligonucleotides in amounts totaling preferably more than 70 micrograms, and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams. The carrier or carriers are broken down by the body within a few weeks, the oligonucleotides being released continuously in the process.
  • the degradation rate of the gel can be controlled by manufacturing parameters, in the case of collagen, for example, by the degree of cross-linking of the collagen. In vivo half-lives of more than 1 week are preferred, particularly preferably 2 weeks, 4 weeks and 3 months.
  • a liquid formulation for the oligonucleotides can also have advantages in the case of glioblastoma, since it is not known whether the glioblastoma also spreads in a manner other than infiltrating.
  • the injected volume in the case of glioblastoma is, for example, 20 ml, in which there are preferably more than 70 micrograms, and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams of oligonucleotide.
  • the oligonucleotides can be packed in particles or liposomes so that they are only released slowly when the carriers are broken down or absorbed by the cells. The rate of degradation of the particles can be influenced by manufacturing parameters such as the degree of crosslinking.
  • the half-lives in vivo are preferably more than 1 week, particularly preferably 2 weeks, 4 weeks and 3 months.
  • the use of the oligonucleotides as an aerosol can be preferred, in particular in amounts of 25 or 70 micrograms, and particularly preferably of more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams of oligonucleotide
  • Peritoneal carcinosis refers to the infestation of the peritoneum with multiple malignant tumor cells.
  • the cause of peritoneal cancer is usually not a tumor of the peritoneum itself, but a malignant tumor of another organ located in the abdomen. This is usually an advanced metastatic tumor of the gastrointestinal tract, pancreas or ovaries, as described above. In some cases it is not possible to identify a primary tumor. (https://flexikon.doccheck.com/de/Peritonealkarzinose),
  • peritoneal carcinosis occurs rarely, but with an increasing tendency, in Germany around 35,000 new cases per year (Glockzin et al 2007).
  • the prognosis of peritoneal cancer is on average about 6 months after diagnosis.
  • peritoneal cancer is increasingly being treated with multimodal therapy, which combines surgical cytoreduction with intraoperative, hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (Piso et al 2011).
  • PIPAC intraperitoneal chemotherapy
  • a gel can nevertheless be used advantageously in these volumes and applied with tools such as brushes; concentrations of more than 15 or 70 micrograms and particularly preferably more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25 or 100 milligrams per milliliter of gel are preferred.
  • Peritoneal carcinosis may also be preferred to use supports with a simpler geometry, in particular if the oligonucleotides elute from these supports over a longer period of time, in particular over several days.
  • Carriers that are absorbed by the body such as flexible foils or rods, are particularly advantageous. Smaller particulate carriers can be applied in nets, such as gauze nets, or in a hydrogel.
  • the use of the oligonucleotides as an aerosol can be preferred, in particular at amounts of 70 micrograms, and particularly preferably of more than 250 or 1000 micrograms, 5, 25, 100 or 1000 milligrams of oligonucleotide or a combination of the adjuvant use of the oligonucleotides with further adjuvants Therapies such as carboplatin and pemetrexed, and the combination with radiotherapy may be preferred.
  • thermosensitive chitosan-based hydrogel for the local
  • RNA Small Interfering RNA, Nucleoside, Nucleic Acid, Nudeotide, Phosphoramidite, Sense ", Betascript Publishing, 2010, ISBN 6130300298,

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines tumorwirksamen Oligonukleotid bei Tumorpatienten nach vollständiger oder teilweiser Resektion oder Ablation eines soliden Tumors dieses Patienten, indem es in einer bei der Resektion oder Ablation entstandenen Körperhöhle appliziert wird, um bei der Operation oder Ablation im Tumorbett und dessen Umgebung verbliebene Tumorzellen oder Metastasen zu bekämpfen und in diesem Bereich der Bildung von Rezidiven oder neuen Metastasen entgegenzuwirken. Aufgabe war es, eine einfache, lokal in der Operationshöhle applizierbare, adjuvante Therapieform bereitzustellen, welche nach einer Tumorresektion verbliebene sowie nach der Resektion entstehende Tumorzellen im Tumorbett und in dessen Nähe oder Abtropfmetastasen in der Nähe oder Umgebung des Primärtumors zerstört. Erfindungsgemäß werden Oligonukleotide in der Operationshöhle adjuvant und in hoher Konzentration verwendet. Die Beladung von Trägern mit Oligonukleotiden ermöglicht eine Elution über längere Zeit und so eine lange, kontinuierliche Wirkung auf Tumorzellen in der Nähe der Operationshöhle.

Description

Verwendung von Oligonukleotiden für die Behandlung von Tumoren
Oie Erfindung betrifft die Verwendung von Oligonukleotiden zur spezifischen Therapie von Tumorerkrankungen bei verschiedenen Stadien direkt während des chirurgischen Eingriffs.
Als Oligonukleotide werden kurze ein- oder doppelsträngige Oligonukleotide bezeichnet, die sich in einem im Stand der Technik etablierten chemischen Prozess synthetisch hersteilen lassen (Herdewijn 2005, Surhone et al. 2010). Gegenwärtig lassen sich DNA-Oligonukleotide bis zu einer Länge von etwa 200 Basen oder Basenpaaren effizient synthetisieren, dabei lässt sich DNA im Vergleich zu RNA aus vielen technischen Gründen einfacher und in längeren Fragmenten synthetisch hersteilen. Längere Synthesen sind technisch möglich, die enzymatische Herstellung oder die Herstellung in vivo sind dann aber einfacher und effizienter. Es wird jedoch erwartet, dass zukünftig immer längere Oligonukleotide auch synthetisch hergestellt werden. Bei den Synthesen kommen mittlerweile Automaten zum Einsatz, welche die repetitiven Schritte der Synthese automatisch durchführen.
Ein Vorteil von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden besteht in ihrer Modifikationsvielfalt. Modifikationen können beispielsweise unnatürliche Nukleotidbausteine wie beispielsweise Inosin oder natürliche Modifikationen wie die Methylierung des Cytosins sein. Nukleotide können ferner am Basenrest, am Zuckerrest oder am Phosphatrest modifiziert werden und wirken in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Zu den Modifikationen gehören beispielsweise Substitutionen mit Alkyl-, Alkoxy-, Amino-, Deaza-, Halogen-, Hydroxyl-, Thiolgruppen oder deren Kombinationen. Nukleotide können auch mit Analoga höherer Stabilität ersetzt werden, beispielsweise kann ein Ribonukleotid durch ein Desoxyribonukleotid oder die 2' OH-Gruppe seines Zuckerrests durch 2' Aminogruppen, 2' O- Methylgruppen, 2' Methoxyethylgruppen oder eine 2'-0, 4'-C Methylenbrücke ersetzt werden. Beispiele für ein Purin- oder Pyrimidinanalogon von Nukleotiden sind Xanthin, Hypoxanthin, Azapurin, Methylnthioadenin, 7-Deaza-adenosin und 0- oder N-modifizierte Nukleotide. Der Phosphatrest des Nukleotids kann modifiziert werden, indem ein oder mehrere Sauerstoffatome der Phosphatgruppe durch Stickstoff oder durch Schwefel (Phosphorothioate) ersetzt werden. Weitere Modifikationen sind Locked Nucleic Acids LNA (W09914226 A2), Unlocked Nucleic Acids UNA, 2'OMe-methoxy- und 2*F fluoro- Modifikationen. Das 3'- und 5'-Ende eines Einzelstrangs ermöglichen ebenfalls, weitere molekulare Reste wie beispielsweise einfache oder glykosylierte Peptide und Proteine sowie Lipide, Chitosan und andere Chitosanderivate, Polymere oder Farbstoffe anzufügen. Modifikationen dieser Art können direkt oder über Spacer, beispielsweise einem oder mehrere Glycin-Resten mit den Oligonukleotiden verbunden sein. Diese Modifikationen werden mit vielfältiger Zielstellung entwickelt, beispielsweise um die Stabilität der Oligonukleotide zu beeinflussen, die Schmelztemperatur eines Doppelstrangs, die Affinität zu anderen Molekülen oder Oberflächen zu ändern oder ihre biologische Verfügbarkeit oder Aktivität in vivo. Modifikationen dienen zudem beispielsweise der Verbesserung von Funktion des Oligonukleotids, ihrer Stabilität oder ihrer Transfereigenschaften, oder um ihre Lokalisierung oder Targeting zu steuern. Im Folgenden werden unter Oligonukleotiden all diese Modifikationen einbezogen.
Viele Arten von Oligonukleotiden kommen natürlich im Menschen, Tieren oder allgemein in Lebewesen oder Viren vor oder sind davon abgeleitet. Sie haben sehr unterschiedliche Funktion wie etwa die Regulation der Expression von Proteinen, die Interferenz mit der Expression oder auch die Kommunikation zwischen Zellen. Sie können als Doppelstrang, Doppelstrang mit einzelsträngigen Überhängen, Hairpin, zyklisch oder als Einzelstrang vorliegen. Beispiele für natürlich vorkommende Oligonukleotide sind MicroRNA miRNA oder long noncoding RNA InRNA, Beispiele für aus der Natur abgeleitete oder künstliche Oligonukleotide sind short interfering RNA siRNA, short activating RNA saRNA, CRISPR-Cas Oligonukleotide oder antisense-DNA, von denen sich einige Klassen als therapeutische Wirkstoffe eignen. Für erste Anwendungen zugelassen sind Antisense-DNA (Mipomersen™, Kastle Theraputics, Inc., Chicago, II., USA) zur Therapie von homozygoter, erblicher Hypercholesterinämie und siRNA (Patisaran™, Alnylam, Inc., Cambridge, MA., USA) zur Behandlung von Polyneuropathie bei erblicher, Transthyretin-bedingter Amyloide. Beide Medikamente werden jeweils systemisch injiziert.
Unter Tumoren im engeren Sinn versteht man benigne (gutartige) oder maligne (bösartige) Neubildung (Neoplasie) von Körpergewebe, die durch eine Fehlregulation des Zellwachstums entsteht (DocCheck, https://flexikon.doccheck.com/de/Tumor). Bösartige Tumoren werden umgangssprachlich auch als Krebs bezeichnet. Viele Formen von malignen, insbesondere soliden Tumoren lassen sich bis heute nicht heilen. Unter den Tumoren mit nur sehr kurzen Überlebenszeiten nach Diagnose lassen sich beispielsweise die des Pankreas, der Nebennieren, des Mesothels, des Gehirns und der Lunge aufzählen, obwohl in den letzten Jahrzehnten große Anstrengungen unternommen wurden, Diagnosen, individuelle Therapien und Behandlungsmethoden für diese Tumore zu verbessern oder neu zu entwickeln. Beispiele umfassen die chirurgische Entfernung des Tumors, medikamentöse Behandlung oder Bestrahlung, dabei auch in unterschiedlichen Kombinationen. Unter den neueren oder experimentellen Verfahren befinden sich spezifische gentherapeutische Verfahren oder Zelltherapien, darunter insbesondere Chimäre Antigen-Rezeptor-tragende T-Zellen (CAR-T).
Trotz der besseren Diagnosetechnologien und der enormen therapeutischen Anstrengungen und für die frühzeitige Erkennung von Tumoren sind die bisher erzielten Verbesserungen in der Behandlung und der Überlebenszeit sehr begrenzt. Bei vielen dieser Tumore werden die Patienten nur in Ausnahmefällen geheilt. Viele Therapien verlangsamen jedoch zumindest das Fortschreiten der Krankheit und verlängern das Leben der Patienten. Je nach Art des Tumors beträgt die mittlere gewonnene Lebenszeit zwischen Jahren und nur wenigen Monaten. Es besteht ein erheblicher Bedarf an neuen Therapien, insbesondere für die Tumore, bei denen die Patienten unter Behandlung bisher kaum Lebenszeit gewinnen.
Viele solide Tumore werden frühzeitig und zuerst mit einem chirurgischen Eingriff behandelt. Die vollständige Entfernung des Primärtumors ist aber nicht immer möglich. Auch wenn die Tumormasse komplett entfernt scheint, sind mit großer Wahrscheinlichkeit immer noch Tumorzellen im Tumorbett oder den Rändern der Operationshöhle vorhanden, aus denen ein Rezidiv hervorgehen kann. Diese sind selbst mit sensiblen pathologischen Verfahren nicht nachweisbar. Auch sind Metastasen in geringer Entfernung zum Primärtumor wahrscheinlich (umgangssprachlich Abtropfmetastasen). Bei einigen Tumorarten ist die vollständige Entfernung sogar fast ausgeschlossen, wie beispielsweise bei fortgeschrittenen Glioblastomen. Glioblastome wachsen infiltrierend und betreffen dann oft unverzichtbare Hirnregionen. Bei einigen Tumorarten wird sogar das gesamte betroffene Organ operativ entfernt, so beispielsweise die Nebenniere beim Nebennierenrindenkarzinom. In diesem Fall ist eine medikamentöse Substitution der Organfunktion notwendig und möglich. Auch bei radikaler Resektion sind bei diesem Tumor Rezidive häufig und fast immer letal. Trotz dieser Einschränkungen ist die chirurgische Entfernung des Tumors oft die wesentliche Komponente einer effizienten Behandlung, für die es keinen Ersatz gibt. Die Tumorresektion geht oft mit einer adjuvanten oder neoadjuvanten Therapie einher. Medikamente und Bestrahlungen werden dann neoadjuvant, d.h. vor der Operation eingesetzt, wenn die Tumormasse des Primärtumors reduziert werden und so das Operationsrisiko bei beispielsweise großen oder chirurgisch schlecht erreichbaren Tumoren zu reduziert werden soll.
Adjuvant, d.h. nach der Operation, sollen die Medikamente und Bestrahlungen die Entstehung von Rezidiven verhindern und auf Fernmetastasen wirken, die operativ nicht zugänglich sind oder deren Existenz nur vermutet wird. Die meist postoperativ angewendete Bestrahlung dient vor allem der Verhinderung der Rezidivbildung oder der Behandlung lokal bekannter Metastasen, weil sie heute fast nur noch lokal fokussiert eingesetzt wird. Medikamente werden meist systemisch eingesetzt, vor allem wenn Metastasen vermutet werden, aber nicht detektiert werden können.
Medikamente können in den genannten Anwendungsfällen Chemotherapien sein, die eine zytotoxische Wirkung vorwiegend auf proliferierende Zellen haben, oder zielgerichtete Therapien wie beispielsweise Antikörper oder mit Zytotoxinen beladene Antikörper sein, die Tumorzellen über tumorspezifische Rezeptoren angreifen. Da bei Metastasen die Rezeptorausstattung oft nicht bekannt ist, werden zielgerichtete Therapien seltener adjuvant eingesetzt.
Für nicht operable Tumore stehen nur die Strahlentherapie und Medikamente zur Verfügung. Um unerwünschte Wirkungen der medikamentösen Therapien zu vermindern, werden sie mittlerweile auch lokal appliziert. Dies geschieht oft über eine Injektion direkt in den Tumor oder in umliegendes Gewebe, wenn eine angenommene Verschleppung von Tumorzellen bei der direkten Injektion vermieden werden soll.
Seltener werden Medikamente bereits während der Operation lokal verabreicht. Es wird angenommen, dass Fernmetastasen so nicht besser erreicht werden als mit adjuvant systemischen Applikationen. Für das häufig nur teilweise resezierbare Glioblastom werden solche Behandlungsstrategien jedoch häufiger und mit dem Ziel verfolgt, die nicht resezierbare Tumormasse damit anzugreifen.
Dabei kommen Chemotherapien zum Einsatz, die nach der Operation in die entstandene Operationshöhle eingebracht werden. Eine lokale Therapie liegt beim Glioblastom auch deswegen nahe, weil viele Medikamente die Bluthirnschranke nicht passieren - auch wenn die Blut-Hirnschranke bei einem Glioblastom nicht mehr vollständig intakt sein mag. Dabei kommen auch polymere Träger zum Einsatz, die eine einfachere Applikation und als Depot mit einer langsamen Freigabe des darin gespeicherten Medikaments eine längere Verfügbarkeit und deutlich höhere Dosierung des Medikaments ermöglichen sollen, ohne dass toxische systemische Wirkungen auftreten.
Gliadel™ ist ein Beispiel für einen 1999 in den U.S.A. zugelassenen, biologisch abbaubaren und mit 7,7 mg des Zytostatikums Carmustin (auch Bis-Chlorethyl-Nitroso-Urea, abgekürzt BCNU) versehenen, scheibenförmigen Träger mit einem Durchmesser von 14 mm und einer Dicke von 1 mm, von dem gegen Ende der Operation nach Entfernung des Tumorgewebes bis zu acht Exemplare vom Chirurgen in die Operationshöhle des Patienten eingesetzt werden. Klinische Studien zeigten eine Verlängerung der mittleren Lebensdauer um ca. 2 Monate sowohl bei erstdiagnostizierten Patienten wie auch bei Patienten mit Rezidiven (Hart et al.
2008), die Aussagekraft der Studien wird aber angezweifelt (Chowdhary et al 2015). Die Wafer sind bis zu 232 Tage nach der Operation nachweisbar und damit länger vorhanden als die angenommenen Proliferationszyklen der Tumorzellen.
Die Gliadel™-Träger sind jedoch groß und spröde. Der Kontakt zwischen Träger und Operationshöhle ist daher begrenzt. Die Anwendungsbeschreibung sieht jedoch nicht vor, die Träger in kleinere Bruchstücke zu zerteilen, weil ein erhöhtes Operationsrisiko befürchtet wird. Es sind daher eine ganze Reihe weiterer Trägerprinzipien entwickelt worden, die einen unterschiedlichen klinischen Entwicklungsstand aufweisen, unter anderem Microbeads (Paclimer™ Guildford Pharmaceuticals) mit einem Durchmesser von 53 miti, die mit Paditaxel (Taxol) versehen für intraperitoneale Verabreichung beim rezidiven Ovarialkarzinom entwickelt wurden. Sie wurden jedoch in modifizierter Form auch für die Behandlung des Glioms eingesetzt (Li et al 2003).
Eine andere Form von Nanopartikel wurde entwickelt, die sich bei saurem pH (<5) ausdehnen. Sie sollen im sauren Milieu des Endosoms ihre Substanzen abgeben. Diese expansilen Partikel wurden ebenfalls mit Paditaxel versehen für die Anwendung bei Lungenkrebs (Griset et al
2009), beim Mesotheliom (Schulz et al 2011) und der peritonealen Carcinomatose (Colson et al 2011). Die Partikel wurden intravenös oder intraperitoneal nach Resektion des Primärtumors im Mausmodel verabreicht. Klinisch wurden diese Partikel bisher offenbar noch nicht getestet.
Hydrogele auf Chitosan-Basis: Chitosan wird durch Deazetylierung von Chitin, dem Material aus dem die Panzer von Insekten und Krustentieren im Wesentlichen bestehen, gewonnen. Wegen seiner guten biologischen Abbaubarkeit hat es seit einiger Zeit Eingang in biomedizinischen Anwendungen gefunden, beispielsweise als Wundheilungsmaterial (Kim IY et al, 2008). Paclitaxel-beladene, Chitosan-basierte Hydrogele wurden vorgeschlagen, um Wundheilungsränder nach Tumorresektion zu behandeln. In vivo wurde daher die Kombination bereits wenige Tage nach der Tumorinokulation injiziert, um diese Situation zu simulieren (Ruel-Gariäpy et al, 2004). In einer weiteren Studie wurde Campthotecin verwendet, jedoch ohne das Ziel der Applikation während der Resektion (Berrada M et al 2005).
Bei Radiofrequenz- oder Thermoablation wurden mit Doxorobizin versehene Mikrostäbchen adjuvant injiziert. Bei Ablationen sind Rezidive am Rand der Behandlungszone und um Blutgefäße herum am häufigsten zu finden. In einem Tierversuch wurden die Stäbchen nach Ablation der Leber injiziert (Qian et al 2003) sowie in einen präpunktierten Xenograft- Lebertumor (Weinberg et al, 2007). Dabei wurde die Entstehung einer fibrotischen Kapsel um das Stäbchen durch die gleichzeitige Gabe von Dexomethason reduziert, das mit Hydroxypropyl ß-Cydodextrin komplexiert war (Blanco et al, 2006). In einem weiteren Versuch wurden Stäbchen mit 5-FU versehen (Haaga et al, 2005).
Flexible Folien sind ein weiterer, möglicher Träger, die sich besser an die Oberfläche der Wundränder anpassen als starre Träger, so dass die Substanzen durch eine größere Fläche ins Gewebe diffundieren können. Mit Paclitaxel versehene Folien aus Poly(Glycerolmonostearat co-epsilon-Caprolacton) wurden nach Resektion in einem Lungenkrebsmodell implantiert (Liu et al 2010), mit Hydroxycamptothecin in einem ähnlichen Modell (Wolinski et al -2, 2010) und wiederum mit Paclitaxel in einem Sarkom-Model (Liu et al, 2012).
Die teils begrenzten Erfolge dieser Strategien führten zu weiteren Verfeinerungen der lokalen Verabreichung, beispielsweise die Verwendung von Liposomen für Zytostatika (Yang et al 2016), die Kopplung von Targeting-Molekülen an Nanopartikel oder kontrollierte Freisetzung des Medikaments durch verschiedene externe Stimuli wie Magnetfelder oder Licht (Rosenblum et al, 2018).
Eine neue intraoperative Applikationsform ist die hypertherme intraperitoneale Chemotherapie (HIPEC) (Glehen et al 2008), bei der eine hohe lokale Konzentration von Zytostatika im Peritoneum und eine Aufnahme der Substanz in die oberen Zellschichten bei reduzierter systemischer Toxizität erreicht werden soll. Die zusätzliche Hyperthermie soll das therapeutische Potenzial der verwendeten Zytostatika durch die verbesserte Gewebepenetration erhöhen. Die Hyperthermie erzeugt jedoch zusätzlich einen eigenen, direkten zytotoxischen Effekt (Ceelen et al 2010).
Zur Applikation der HIPEC werden am Ende der Operation mehrere Drainagen in verschiedenen Bereichen des Abdomens platziert. Ein Rollerpumpensystem mit Wärmetauscher wird verwendet und der Temperaturverlauf kontrolliert. Die Zieltemperatur liegt bei 42-43eC, die Perfusionsdauer in Abhängigkeit vom verwendeten Protokoll zwischen 30 und 120 Minuten. Das bisher meistverwendete Zytostatikum ist Mitomycin C. Die in der systemischen Therapie verwendeten Standardmedikamente Oxaliplatin und Irinotecan werden zunehmend bei der HIPEC eingesetzt (Piso et al 2011).
Eine weitere Applikationsform ist die Druck-Aerosolchemotherapie (Pressurized IntraPeritoneal Aerosol Chemotherapy, PIPAC). Die Druckanwendung aerosole Applikationsform bewirkt eine besonders wirksame Verteilung von Medikamenten in Körperhöhlen wie dem Bauchraum oder Brustkorb. Während der PIPAC werden Medikamente (wie z. B. Cisplatin, Doxorubicin, Oxaliplatin, Paclitaxel) eingesetzt. Die lokale Verabreichung direkt am Tumorort bewirkt, dass die sonst bestehenden pharmakologischen Limitationen der intraperitonealen Chemotherapie wie schlechte Verteilung innerhalb der Körperhöhle, geringe Diffusion ins Gewebe aufgehoben werden. Die lokale Dosis der Zytostatika kann um einen Faktor 10 reduziert werden, ohne an Tumorwirksamkeit einzubüßen. Die dosisabhängige lokale Toxizität der intraperitonealen Chemotherapie wird so besser kontrolliert, die Organtoxizität und die systemischen Nebenwirkungen der Therapie deutlich reduziert.
Bei der PIPAC mit ein 12 mmHg C02 ein-Capnoperitoneum, d.h. ein Überdruck hergestellt und zwei Ballon-Sicherheitstrokare durch die Bauchwand eingefügt. Dann wird eine Mikropumpe in den Bauchraum eingeführt und an einen Hochdruck-Kontrastmittelinjektor angeschiossen. Bei einem typischen Protokoll werden nacheinander Doxorubicin (1,5 mg/m2 Körperoberfläche in 50 ml 0,9% NaCI-Lösung) Cisplatin (7,5 mg/m2 KOF in 150 ml 0,9% NaCI- Lösung) über Mikropumpe und Injektor inForm eines Druck-Chemotherapieaerosols appliziert. Einspritzparameter werden bei einer Flussrate von 30 ml/min und einem maximalen Eingangsdruck von 200 psi eingestellt. Die Mikropumpe erzeugt ein polydisperses Aerosol mit einer Tröpfchengröße zwischen 6-11 pm. Diese geringe Größe gewährleistet, dass die dispergierten Tröpfchen für einen längeren Zeitraum, beispielsweise über 30 Minuten im Gas verbleiben. Das therapeutische Capnoperitoneum wird für 30 Minuten bei einer Temperatur von 37“ Celsius gehalten. Dann wird das Chemotherapie-Aerosol über eine geschlossene Linie in das Luftentsorgungssystems ausgeschieden. Schließlich werden die Trokare gezogen (Reymond et al 2014).
Eine adjuvante gentherapeutische Strategie, Sitimagene ceradenovec (Cerepro), wurde publiziert (EP 1 135 513 B2). Dabei wird nach der Tumorresektion in das der Operationshöhle angrenzende Gewebe ein Adenovirus injiziert, das ein funktionales Thymidinkinasegen beispielsweise des Herplex-Simplex-Virus aufweist. Dieses Gen bewirkt in den transfizierten Zellen die Produktion der Thymidinkinase. Wird nach der Operation Ganciclovir appliziert und erreicht die transfizierten Zellen, so wird es bevorzugt in diesen Zellen zu einer aktiven Substanz phosphoryliert, die die Gensynthese stört. Die Wirkung von Ganciclovir wird durch dieses Vorgehen lokal auf den Bereich um die Operationshöhle begrenzt. Die klinischen Testergebnisse führten jedoch nicht zu einer Zulassung dieser Therapie, die Negativempfehlung des Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) auf Basis der Bewertung durch das Committee for Advanced Therapies (CAT) der europäischen Arzneimittelbehörde EMA wurde mit der geringen beobachteten Wirksamkeit und dem deutlichen Risiko von schweren Nebenwirkungen begründet (EMA Webseite für zurückgenommene Zulassungsanträge: Cerepro). Später wurde dieser Ansatz aufgrund einer beobachteten synergistischen Wirkung noch um die zusätzliche Gabe des bei Glioblastomen zur Standardtherapie gehörenden Zytostatikums Temezolomid weiterentwickelt (EP 2 665 489 Bl). Für das Mesotheliom und das Ovarialkarzinom wird ebenfalls eine Gentherapie vorgeschlagen (WO 2015/002861 Al), bei der ein mit einem Gen für humanes Interferon alpha 2b beladener Adenovirus verwendet wird. Die adjuvante Anwendung ist dabei nicht explizit vorgesehen.
Seit kurzem wird versucht, mit Farbstoff- und insbesondere Fluoreszenzfarbstoffen markierte Antikörper bei Tumorresektionen einzusetzen, um tumorpositive Resektionsränder während der Operation sichtbar zu machen. In einem Brustkrebsmodell wurde der Farbstoff IRDye800CW an die Antikörper Bevacizumab, Cetuximab, Panitumumab, Trastuzumab und Tocilizumab (Korb et al 2014) gekoppelt und ihre lokale Verteilung beobachtet. In einer weiteren Studie wurde ein monoklonaler Antikörper gegen PD-1 mit dem gleichen Farbstoff markiert und nach der Operation ohne Farbstoff als Adjuvans intraperitoneal injiziert (Du et al 2017). Zudem wurde vorgeschlagen, Photoimmunotherapien, d.h. antikörperbasierte photodynamische Therapie, intraoperativ während der Tumorresektion im Tumorbett anzuwenden, um verbleibende Tumorzellen gleichzeitig sichtbar zu machen und zu bekämpfen (de Boer 2016).
In Studien wurden Antikörper jedoch auch adjuvant in der Tumortherapie angewendet, und zwar in Form von mehrfachen Injektionen systemisch nach der Resektion des Tumors. Beispielsweise ist bei Darmkrebs eine adjuvante Chemotherapie nach der Operation mittlerweile Stand der Technik und wird in der medizinischen Praxis oft angewendet. Dabei kommen 5-FU und Oxaliplatin zum Einsatz. In Studien wurde stattdessen der Angiogenese- inhibierende monoklonale Antikörper Avastin™ (Bevacizumab) postoperativ systemisch verabreicht. Dieser Antikörper bindet an den Vascular Endothelial Growth Factor VEGF^ und unterbindet das Angiogenese-Signal. Nach 36 Monaten zeigte sich in dieser Studie keine Verbesserung bezüglich des Rückfallrisikos im adjuvanten Antikörper-Arm der Studie. Mit Cetuximab, einem EGFR-bindenden Antikörper, der in der Brustkrebstherapie eingesetzt wird, In einer weiteren Studie wurde dieser Antikörper zusätzlich dem Standard für die adjuvante Chemotherapie hinzugefügt. Im Ergebnis änderte sich das Rückfallrisiko für den Antikörperarm kaum, im Gegenteil erhöhte sich das Rückfallrisiko für einige Patientengruppen sogar (De Gramont et al 2011, Oyan B 2012). Es wird vermutet, dass die Antikörper die Resistenzbildung gegen die Chemotherapien beschleunigen. Aus präklinischen Studien ist zudem bekannt, dass ihre adjuvante Verwendung die Bildung von Metastasen fördert. Ferner kann nicht ausgeschlossen werden, dass neue Pro-Survival-Pfade angeregt werden, die resistenzbildend wirken. Es scheint zudem, dass bei kombinierten Therapien auch eine Interferenz der Wirkmechanismen erfolgen kann (Huang et al 2017)
Immune check point-targeted monoclonal antibodies (ICT mAbs), beispielsweise PD-1 Antikörper, wurden in ersten klinischen Tests intratumoral verabreicht. Dabei scheint die Resistenzbildung gegen ICT mAbs gegenüber systemischer Anwendung reduziert (Maraballe et al. 2017).
Für die Behandlung von Tumoren wurden bereits mehrere Oligonukleotide entwickelt. Sie richten sich meist gegen spezifische zelluläre Targets, etwa Zellzyklus-Proteine wie Kinesin Spindel-Protein KSP, Polo-like-Kinase 1 PLK, Protein Kinase N3 PKN3, Ribonukleotid-Reduktase RRM2, oder Tenasion-2. Ferner zählt das prodrug aus WO 2010/102615 dazu, bei dem ein konjugiertes Proteasesubstrat die Wirksamkeit der siRNA solange inhibiert, bis eine Protease das Substrat abspaltet.
Bei Oligonukleotiden fokussiert die Entwicklung heute jedoch vor allem auf Formulierung und Delivery als Nanopartikel oder Gel (Kim et al 2012), die für die systemische oder intraperitoneale Applikation als Injektion gedacht sind. siRNA können auch beispielsweise "nackt" in Kochsalzlösung appliziert werden, oder mit Polykationen, kationischen Lipid/Lipid- Transfektionsreagenzien oder kationischen Peptiden komplexiert, als Komponenten definierter molekularer Konjugate (z.B. cholesterinmodifizierte siRNA, TAT-DRBD/siRNA- Komplexe), oder als Komponenten von Liposomen. Für Anwendungen in der regenerativen Medizin wurde jedoch die Verwendung einer Matrix als subkutanes Implantat aus porösem Polyesterurethan getestet, das siRNA bindende Nanopartikel aus einem Diblock-Copolymer freisetzt (Nelson et al 2013) und damit zwei Trägersysteme benötigt, was zusätzliche Komplexität bedeutet. Gleichzeitiger Einschluss von Zellen und siRNA in Alginat oder Kollagen wurde ebenfalls beschrieben (Krebs et al 2009) und dabei für Anwendungen vorgeschlagen, bei denen das als Hydrogel vorliegende, beladene Alginat oder Kollagen injiziert werden kann.
Lokale Applikationen von Oligonukleotiden wurden und werden dennoch für eine Vielzahl tumortherapeutischer Ansätze als intratumorale Injektion entwickelt. Han et al. verwendeten Chitosan-Partikel formulierte siRNA, um die Expression von Transglutaminase in vivo bei Brustkrebs und Melanom zu reduzieren (Hat et al, 2012). Hydrogele mit einer Gelierungstemperatur von 40SC in Kombination mit Gold enthaltenden Nanohüllen wurden intratumoral injiziert, um mittels optischer Bestrahlung eine lokale Wirkung von siRNA zu erzeugen (Strang et al, 2014). Poiyethylenimid- konjugiertes Organophosphazen weist ebenfalls eine thermische Reaktion auf und wurde intratumoral mit siRNA gegen VEGF und Cyclin Bl injiziert (Kim et al 2012). Perioperativ oder adjuvant wurden diese Ansätze nicht verwendet; der Fokus liegt einzig auf hoher lokaler Konzentration und damit hoher Effizienz gegen den Primärtumor und der langsameren Geschwindigkeit, mit der Oligonukleotide im Vergleich zu kleinen Molekülen vom Wirkort wegdiffundieren. Das gilt auch für die Studie zum duktalen Pankreas-Adenokarzinom (PDA), bei der die Expression einer mutierten Form des Kirsten RAt Sarcoma virus (KRAS)-Gens reduziert werden soll (Khvalevsky et al 2013). Auch bei diesem Ansatz wird eine Polylactid-co-Glycolid- (PLGA-)Matrix verwendet. Um die Effizienz gegen den Primärtumor durch einen großflächigen Kontakt zu optimieren, wurden Matrixelemente dabei sogar mit dem Tumor vernäht, immunstimulierende RNA (CPG 1826, Coley Pharmaceuticals) wurde adjuvant im Tierversuch intratumoral appliziert, die Mäuse wurden dabei mit Antikörpern gegen 0X40, CTLA4, GITR und FR4 behandelt, aber nicht operiert. Die Autoren berichten von verbesserter Wirkung, klinisch wurde dieser Ansatz jedoch nicht weiterverfolgt (Houot R et al 2009).
Auch Plasmide und Oligonukleotide wurden bereits lokal zur Förderung der Wundheilung appliziert, beispielsweise die Plasmide für Platelet-derived growth factor pPDGF oder Vascular-Endothelial Growth Factor pVEGF in Poly(lactic-co-glycolic acid) PLGA Nanopartiklen (Tokatiian et al 2014) oder auch prolyl hydroxylase domain 2 PHD2-siRNA in azellulärer dermaler Matrix als Implantat (Vandegrift et al 2015), oder p53 (Nguyen et al 2010). Bei diesen Anwendungen steht jedoch die Wundheilung nach einer Verletzung ohne Tumorzusammenhang im Vordergrund. Ein potenzielles Risiko dieser Ansätze besteht darin, dass die für die Wundheilung adressierten Zielgene ein erhöhtes Risiko für eine Tumorbildung bedeuten. Dieser Umstand steht einer Anwendung dieser lokalen Ansätze bei Tumortherapien entgegen.
Im Stand der Technik werden demnach vor allem Zytostatika als Adjuvans nach der Tumorresektion verwendet. Tatsächlich lassen Zytostatika bei dieser lokalen Applikationsweise viele Vorteile gegenüber ihrer systemischen Applikation erwarten: - Die oft hydrophoben Substanzen erreichen wesentlich direkter den vorgesehenen Wirkort in der Nähe der resezierten Tumormasse
- Dem sonst schnellen Abbau der kleinen Zytostatika-Moleküle wirkt die Applikation über Träger entgegen, die die Moleküle über einen längeren Zeitraum eluieren. Dadurch können mehr Zellzyklen der proliferierenden Zellen medikamentös erreicht werden.
- Unerwünschte Wirkungen außerhalb des Tumors, die bei vielen Zytostatika dosislimitierend sind, sind auf das Umfeld der Operationshöhle begrenzt und deutlich geringer.
Die Gründe für den bisher dennoch begrenzten klinischen Erfolg solcher adjuvanten Systeme sind nicht bekannt. Bisher ist Giiadel™ in der Kombination aus makroskopischem Träger und Carmustin als Zytostatikum das einzige in den USA und Europa zugelassene System. Die Zulassung erstreckt sich auf die adjuvante Verwendung beim Glioblastom.
Die für kleine Moleküle erwarteten Vorteile einer lokalen, adjuvanten Applikation werden für Makromoleküle nicht erwartet. Makromoleküle sind ohnehin meist gut löslich und werden langsamer ausgeschieden als kleine Moleküle. Zudem fällt der erreichbare Konzentrationsgewinn bei der lokalen Applikation von Makromolekülen geringer aus als bei kleinen Molekülen. Die Diffusionswege der Makromoleküle sind außerdem kürzer als die der kleinen Moleküle, d.h. sie dringen nicht weit in das Tumorbett und seine Umgebung ein. Die Eindringtiefe wird besonders klein, wenn beim Abheilungsprozess der Operationshöhle eine fibrotische Kapsel um den Träger herum entsteht.
Makromoleküle werden daher bei Tumorresektionen für andere Zwecke eingesetzt. Ein aufwändiger Ansatz wurde mit Sitimagene ceradenovec verfolgt, das über die Umwandlung eines nach der Operation systemisch injizierten Prodrugs wirkt, das wiederum ein kleines Molekül ist. Die Umwandlung geschieht jedoch nur lokal in Zellen, die zuvor während der Operation mit einem Gen für Herpes simplex-Thymidin-Kinase transfiziert wurden, das eine Länge von mehreren hundert Nukleotiden aufweist. Dabei ist das Gen in einem nicht replikationsfähigen Adenovirus verpackt, mit dem die Zellen infiziert werden. Das Gen wird nach der Transfektion der Zellen exprimiert und bewirkt, dass das Enzym Herplex simplex- Thymidin-Kinase produziert wird, die wiederum das Ganciclovir™-Prodrug in die aktive Form umwandelt. Die Verwendung des kleinen Moleküls Gangciclovir™ ermöglicht es, eine hohe lokale Konzentration zu erreichen.
Antikörper werden im Umfeld der Operation hingegen vor allem wegen der Möglichkeit eingesetzt, sie fluoreszenzmarkiert als Marker bei der Operation zu verwenden. Dabei werden oft Antikörper verwendet, die sonst systemisch als Tumortherapeutika Verwendung finden. Ihre Eigenschaft, an tumorspezifischen Rezeptoren zu binden, ermöglicht, Tumorzellenspezifisch mit ihnen zu markieren. Bei Anregung der Fluoreszenz leuchten die so markierten Tumorzellen auf und geben dem Chirurgen Informationen über die Ausdehnung des Tumors. Lokal zur Therapie werden Antikörper nur intratumoral injiziert, d.h. ohne Tumorresektion. Adjuvant zur Tumorresektion werden sie nur systemisch appliziert.
Für die adjuvante, lokale Tumortherapie stehen damit vor allem kleine Moleküle zur Verfügung, die bisher nur begrenzten therapeutischen Erfolg zeigen. Es besteht daher Bedarf an einer besseren adjuvanten Therapie, um die Chancen für eine Heilung nach der Tumorresektion zu verbessern. Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine einfache, lokal in der Operationshöhle applizierte, adjuvante Therapieform bereitzustellen, welche die nach zumindest partieller Tumorresektion verbliebenen und die nach der Resektion entstehenden Tumorzellen im Tumorbett und in dessen Nähe oder Abtropfmetastasen in der Nähe oder Umgebung des Primärtumors zerstört.
Erfindungsgemäße Lösung
Diese Aufgabe wird überraschenderweise durch die Verwendung von tumorwirksamen Oligonukleotiden gelöst, die nach der Tumorresektion direkt in das Tumorbett appliziert werden. Dabei werden die Oligonukleotide bevorzugt mit resorbierbaren, gelartigen oder elastischen Trägern oder festen Trägern wie Gazematerial oder Partikeln appliziert. Es kann auch eine flüssige Formulierung bevorzugt werden, wenn die Operationshöhle für andere Applikationsformen zu komplex aufgebaut ist, um alle potenziellen Orte zu erreichen, an denen sich Tumorzellen befinden können. Die flüssige Form kann wiederum partikuläre oder gelartig partikuläre Träger enthalten. Das applizierte Volumen wird bei einer flüssigen Formulierung bevorzugt so gewählt, dass es die Operationshöhle mehr als zur Hälfte und insbesondere ganz ausfüllt. Liegt nach der Operation eine Drainage, so kann die flüssige Applikationsform auch mehrfach oder längeren Zeitraum kontinuierlich als Perfusion appliziert werden. Weiterhin kann auch eine aerosolförmige Applikationsform bevorzugt sein, bei der die formulierten oder nicht formulierten Oligonukleotide aus einer flüssigen Lösung zerstäubt in die Operationshöhle eingebracht werden.
Diese Wirkung ist überraschend, weil von Oligonukleotiden erwartet wird, dass sie wegen ihrer Ladung, Größe, Labilität und der geringen Aufnahmerate in den Zellen und wegen ihres schnellen Abbaus für diese Anwendung schlechter geeignet sind als andere Molekülklassen, insbesondere als kleine Moleküle. Formulierte Oligonukleotide sind teils noch deutlich größer und diffundieren noch langsamer, wären erwartungsgemäß damit noch schlechter geeignet für diese Verwendung geeignet.
Bei kleinen Molekülen wird dagegen erwartet, dass sie nach lokaler Applikation nicht nur die oberste Lage einer Zellschicht, sondern auch tiefere Schichten der angrenzenden Gewebe erreichen. Diese tief reichende Wirkung ist bevorzugt, weil auch dort Tumorzellen erwartet werden.
Eine einfache Therapieform im Sinne der Erfindung zeichnet sich durch die Verwendung mindestens einer Art Oligonukleotide als aktiver Wirkstoffstoffkomponente, die bereits einzeln eine antitumorale Wirkung erzielt. Diese einfache Therapieform ist bevorzugt, um das Risiko unerwünschter Wirkungen gering zu halten.
Bevorzugte Ausführungsformen
Bevorzugt ist eine Therapieform mit nur einmaliger Applikation, da der Zugang zur Operationshöhle angesichts der schnellen Entwicklung der bei Tumorresektionen eingesetzten laparoskopischen Operationstechniken zeitlich begrenzt ist und im Idealfall derzeit nicht mehr als 30 Minuten lang besteht. Jede nachträgliche, erneute Öffnung der Operationshöhle würde zudem das Risiko erhöhen, Tumorzellen zu versprengen.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden pleiotrope Oligonukleotide verwendet, um insbesondere bei einer einmaligen Applikation auf möglichst viele Tumorzellen unabhängig von der Phase des Zellzyklus zu wirken, in der sich die Zelle zu diesem Zeitpunkt gerade befindet. Als pleiotrop werden erfindungsgemäß Oligonukleotide bezeichnet, die in einer Zelle gegen mindestens zwei Target gleichzeitig wirken, beispielsweise gegen zwei mRNA mit gleicher Zielsequenz, die für verschiedene Proteine kodieren. Ein Beispiel für ein pleiotropes Oligonukleotid sind prodrugs gemäß W02010102615, bei denen bevorzugte Ausführungsformen in Tumorzellen gegen mehrere physiologischen Targets parallel wirksam sein können (W02012098234).
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung biodegradabler Trägermaterialien mit geringer Immunogenität, die hydrogelartige oder elastische Eigenschaften aufweisen, und durch Diffusion oder beim Abbau in vivo oder durch Änderungen von Umgebungsparametern wie dem pH-Wert Oligonukleotide eluieren. Träger, die medizinisch erprobte Materialien wie Collagen, Atelocol lagen, Gelatin, Fibrin, Chitosan oder Hyaluronsäure, deren synthetische oder rekombinante Varianten sowie deren synthetische Modifikationen werden dabei besonders bevorzugt verwendet.
Besonders bevorzugt die erfindungsgemäße Verwendung von Oligonukleotiden in vorübergehend zusammenhängenden Trägern, so dass einen große Menge Oligonukleotid lokal und über längeren Zeitraum zur Verfügung steht. Vorübergehend zusammenhängend heißt erfindungsgemäß, dass der Träger fest, elastisch oder sogar verformbar sein kann, aber als Einheit über mehrere Stunden oder Tage bestehen bleibt. Als vorrübergehend zusammenhängend gelten auch biodegradable Träger, die durch den Abbauprozess im Körper kleiner werden und nach Stunden oder Tagen in kleinere Einheiten zerfallen, von einem Träger wie einer Gaze abgebaut werden, oder die eine Umwandlung in eine flüssige Phase erfahren.
Besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Verwendung der Oligonukleotide in großen Mengen pro Applikation. Dabei ist die Gesamtmenge der verwendeten Oligonukleotide abhängig von der entstandenen Operationshöhle und des Aufbaus des umliegenden Gewebes. Für die zusammenhängenden Träger wird dieser Zusammenhang als Beladungsdichte beschrieben. Bevorzugt ist die Verwendung von Oligonukleotiden in Trägern mit Beladungsdichten von mehr als 3 Mikrogramm Oligonukleotid pro Milliliter Trägervolumen, besonders bevorzugt mehr als jeweils 12, 50, 250, 1000 oder 5000 Mikrogramm pro Milliliter. Vorteilhaft kann auch die Verwendung von Trägern sein, aus denen die Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum, insbesondere über mehrere Tage, eluieren. Besonders vorteilhaft sind dabei Träger, die vom Körper resorbiert werden. Besonders vorteilhaft sind Träger, die eine einfache laparoskopische Handhabung ermöglichen wie etwa flexible Folien oder Stäbchen. Oligonukleotide und kleinere partikuläre Träger können in Netzen, etwa Netzen aus Gazematerial, oder in einem Hydrogel appliziert werden. Bevorzugt ist die Verwendung von Trägern, die eine anfängliche Elutionsrate von mehr als 1 Mikrogramm / Quadratzentimer und Tag aufweisen, inbesondere von mehr als jeweils 2, 5, 10, 25 oder 100 Mikrogramm / Quadratzentimeter und Tag.
Erfindungsgemäß werden die Oligonukleotide lokal nach der Tumorresektion verwendet, um eine Rezidiv- oder Metastasenbildung zu verhindern. Dazu werden sie beispielsweise während der Operation nach der kompletten oder teilweisen Entfernung des Primärtumors auf die entstandenen Operationsränder und das umliegende Gewebe aufgebracht. Dazu gehören auch umliegendes Binde- und Fettgewebe. Für eine mechanisches Aufträgen der Oligonukleotide sind gelartige Formulierungen vorteilhaft, die sich mit einem Pinsel oder ähnlichem Werkzeug auf dem Gewebe verteilen oder aufsprühen lassen.
Als Trägermaterial bei der Verwendung der Oligonukleotide eignet sich auch Kollagen, das mit gelartigen oder elastischen Eigenschaften versehen werden kann. Kollagen wird vom Körper resorbiert und weist geringe Immunogenität auf.
Die erfindungsgemäße Verwendung von Oligonukleotiden in flüssiger Formulierung ist vorteilhaft, wenn die Oligonukleotide mit einer Spritze in der Operationshöhle verteilt werden können. Ein Vorteil dieser Applikationsform ist bei komplexen Formen von Operationshöhlen gegeben, weil sie sich von selbst in der Operationshöhle verteilt und aus ihren Öffnungen abfließen kann, wie es Abtropfmetastasen vermutlich selbst auch tun würden. Komplex im Sinne der Erfindung bedeutet, dass die Operationshöhle gegenüber Hohlräumen wie dem Peritoneum geöffnet ist, wodurch Tumorzellen bis in entlegene Ränder des Peritoneums geraten können.
Eine besonders gute Verteilung gewährleistet die Verwendung von Flüssigkeitsvolumina, die ähnlich groß, besonders bevorzugt gleich oder sogar 1-, 2-, 5-mal so groß wie das Volumen der Operationshöhle allein oder unter Einbeziehung verbundener Hohlräume ist. Beispielsweise entsteht bei der Entfernung einer Nebenniere eine Operationshöhle von etwa 25 ml, die jedoch mit dem viel größeren Retroperitonealraum verbunden ist. Mit großen Flüssigkeitsvolumen lassen sich auch Perfusionen durchführen, so dass der Operationshöhle kontinuierlich tumorwirksame Oligonukleotide zugeführt werden und überall im Hohlraum hohe lokale Konzentrationen an Oligonukleotiden vorliegen.
Bevorzugt ist auch die erfindungsgemäße Verwendung von Oligonukleotiden als Aerosol. Dazu wird in der Operationshöhle oder den anliegenden Räumen ein Überdruck angelegt. Im dadurch entstandenen Hohlraum wird das Aerosol durch einen Trokar, Schlauch oder ähnliches Werkzeug eingeführt oder mit einem eingeführten Aerosolgenerator gar erzeugt. Das Aerosol verteilt sich annähernd gleichförmig im Hohlraum, so dass auch entlegene Winkel des Hohlraums erreicht werden. Der Hohlraum wird für mehr als zwei Stunden aufrechterhalten, insbesondere langer als eine oder eine halbe Stunde. Die erfindungsgemäße Anwendung der Oligonukleotide in Aerosolform kann auch mehrfach wiederholt werden, wenn der Zugang zur Höhle kontinuierlich besteht oder schnell und einfach wiedereingerichtet werden kann.
Bevorzugt ist dabei die Verwendung von Oligonukleotiden in Aerosolen in Mengen von mehr als 1 Mikrogramm / Quadratzentimeter Hohlraumvolumen, und besonders bevorzugt von mehr als 2, 5, 10, 25, 100 Mikrogramm.
Die erfindungsgemäße Verwendung der Oligonukleotide schließt die Kombinationen mit Verfahren und Therapien aus dem Stand der Technik mit ein. Darunter fallen beispielsweise die gleichzeitige Verwendung von Medikamenten wie Zytostatika und Oligonukleotiden als auch beispielhaft die parallel durchgeführte Radiotherapie.
Ausführungsbeispiel Nebennierenrindenkarzinom
Nebennierenrindenkarzinome treten selten auf und werden heute meist mit einer laparoskopischen Adrenalektomie, also einer kompletten minimalinvasiv-chirurgischen Entfernung der Nebenniere behandelt. Die Prognose für die so behandelten Patienten ist dennoch schlecht, vor allem bei spät erkannten Primärtumoren treten Rezidive oder Metastasen mit hoher Wahrscheinlichkeit auf und führen meist innerhalb weniger Monate zum Tod des Patienten. Die laparoskopische Adrenalektomie wird entweder über abdominalen / transperitonealen oder retroperitonealen Zugang durchgeführt. Dabei wird die Fascia renalis durchstoßen und eine Operationshöhle geschaffen, die zur Stabilisierung mit 20 - 30 mm Hg Überdruck beaufschlagt wird. Der Überdruck reduziert oder verhindert auch ein Einbluten in die Operationshöhle nach etwaigen Verletzungen von Blutgefäßen. Im Folgenden dienen weitere Schnitte der Mobilisierung der umliegenden Organe, dem Kappen von Arterien und Venen, die die Nebenniere versorgen, und dem Freilegen der Nebenniere. Im Idealfall wird die Nebenniere als Ganzes mit umliegendem Fettgewebe präpariert, in einen Bergebeutel transferiert, der wiederum durch einen der Trokare aus dem Patienten gezogen wird. Ein Lymphadenektomie kann zusätzlich durchgeführt werden. Die Operationshöhle wird mit reinem Wasser und Antibiotikum gespült und im einfachen Fall ohne Drainage verschlossen.
Bei dieser chirurgischen Handlungsweise wird sorgfältig vermieden, dass die Tumorkapsel beschädigt wird und dass Tumorgewebe im Patienten zurückbleibt. Dennoch entstehen häufig lokale Rezidive unklarer Herkunft. Noch vor der Operation können Tumorzellen aus der eigentlichen Nebenniere in die Umgebung transportiert worden sein. Dazu zählen Abtropfmetastasen, die in Körperhöhlen durch kaudale Wanderung losgelöster Tumorzellen mit der Schwerkraft auf anderen Organen oder Organteilen entstehen. Diese Prozesse werden durch den Umstand erleichtert, dass sich der Fasziensack, der die Niere umgibt, medial und kaudal in den Retroperitonealraum öffnet.
Erfindungsgemäß werden die Oligonukleotide lokal nach der Tumorresektion verwendet, um eine Rezidiv- oder Metastasenbildung zu verhindern und um verbliebene Tumorzellen oder Metastasen zu bekämpfen. Dazu werden sie beispielsweise während der Operation nach der Entfernung der Nebenniere auf die entstandenen Operationsränder und das umliegende Gewebe aufgebracht. Dazu gehören auch umliegendes Binde- und Fettgewebe, insbesondere der renalen Faszien. Dafür eignen sich besonders gelartige Formulierung, die mit einem Instrument wie einem Pinsel laparoskopisch auf die Wundränder aufgetragen werden. In der Operationshöhle eines Nebennierenrindenkarzinoms entstehen Wundränder mit etwa 50 Quadratzentimeter Oberfläche. Gele werden dabei mit einer Schichtdicke von 0,2 bis 1 mm aufgetragen, was einem Gelvolumen von 1 bis 5 ml entspricht. Dieses Gelvolumen enthält bevorzugt 70 Mikrogramm Oligonukleotid und besonders bevorzugt mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm. Das Gel wird innerhalb weniger Wochen abgebaut, die Oligonukleotide dabei stetig freigesetzt.
In einem weiteren Anwendungsbeispiel werden elastische Träger aus beispielsweise (Collagen verwendet, die in die Operationshöhle eingebracht werden. Als hochelastische Träger werden sie in einer Kapsel durch die Apertur eines Trokars in die Operationshöhle eingebracht. Nach Entfernen der Verkapselung nimmt der Träger Größe und Form an, die der des resezierten Organs von etwa 4*3*2 cm und einem Volumen von weniger als 25 ml oder eines Teils dieses Volumens an. Er trägt Oligonukleotide in Mengen von bevorzugt mehr als 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm. Der Träger wird vom Körper innerhalb einiger Wochen abgebaut, die Oligonukleotide dabei stetig freigesetzt.
Die Abbaugeschwindigkeit ist beim Gel wie beim elastischen Träger durch Herstellparameter steuerbar, bei Kollagen etwa durch den Vernetzungsgrad des Kollagens. Bevorzugt sind dabei in v/Vo-Halbwertszeiten von mehr als 1 Woche, besonders bevorzugt von 2 Wochen, 4 Wochen und 3 Monaten.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Anwendungsbeispiel wird eine flüssige Formulierung für die Oligonukleotide verwendet. Die Oligonukleotide werden dabei zum Beispiel mit einer Spritze in der Operationshöhle verteilt. Ein Vorteil dieser Applikationsform ist, dass sie sich von selbst in der Operationshöhle verteilt und aus ihren Öffnungen abfließen kann, wie es Abtropfmetastasen vermutlich selbst auch tun würden. Beim Nebennierenrindenkarzinom mit der erwähnten Ausdehnung des Fasziensacks erreichen flüssige Applikationsform dessen Ausläufer besser als feste Applikationsformen. Das eingespritzte Volumen beträgt in diesem Beispiel 20 ml, in dem sich bevorzugt mehr als 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm Oligonukleotid befinden. Die Oligonukleotide können dabei in Partikeln oder Liposomen verpackt sein, so dass sie nur langsam freigesetzt werden, wenn die Träger abgebaut oder von den Zellen aufgenommen werden. Die Abbaugeschwindigkeit der Partikel kann durch Herstellungsparameter wie den Vernetzungsgrad beeinflusst werden. Bevorzugt betragen die Halbwertszeiten in vivo mehr als 1 Woche, besonders bevorzugt 2 Wochen, 4 Wochen und 3 Monate. Vorteilhaft kann auch die Verwendung von Trägern mit einfacherer Geometrie sein, aus denen die Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum, insbesondere über mehrere Tage eluieren. Besonders vorteilhaft sind dabei Träger, die vom Körper resorbiert werden. Besonders vorteilhaft sind Träger, die eine einfache laparoskopische Handhabung ermöglichen wie etwa flexible Folien oder Stäbchen. Kleinere partikuläre Träger können in Netzen, etwa Gazenetzen, oder in einem Hydrogel appliziert werden.
Beim Nebennierenrindenkarzinom kann die Verwendung der Oligonukleotide als Aerosol bevorzugt sein, insbesondere bei Mengen von 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm Oligonukleotid Die Kombination der adjuvanten Verwendung der Oligonukleotide mit adjuvanten Therapien wie Mitotane und die Kombination mit einer Radiatio kann bevorzugt sein.
Ausführungsbeispiel Ovarialkarzinom
Das Ovarialkarzinom stellt derzeit die sechsthäufigste bösartige Erkrankung der Frau dar (Leitlinie Ovarialkarzinom 2013). Die operative Entfernung eines Ovars stellt dabei einen wesentlichen Teil der Therapie dar. Beim Ovarialkarzinom beeinflusst das Ergebnis der Diagnose sehr stark den Umfang, in dem Gewebe entfernt wird. Neben dem Eierstock (Ovar) selbst können Eileiter (Tube) und Lymphknoten, in späteren Stadien auch weitere, insbesondere in das Peritoneum reichende oder angrenzende Organe betroffen sein. Die Tumorresektion wird dann soweit möglich durchgeführt, eine vollständige Entfernung ist in diesen Fällen aber oft nicht möglich, weil oft umliegendes Gewebe bereits betroffen ist. Im Gegensatz zum Nebennierenrindenkarzinom wird empfohlen, die Operation nicht laparoskopisch durchzuführen.
Eine adjuvante Chemotherapie wird in den meisten Fällen empfohlen, ausgenommen von dieser Empfehlung sind nur Fälle mit zum Zeitpunkt der Operation sehr frühen Stadien. Empfohlen wird systemisch verabreichtes Carboplatin, ein niedermolekulares Zytostatikum, das häufig erhebliche Nebenwirkungen wie Blutbildveränderungen, Leber- und Nervenfunktionsstörungen sowie, Herz-Kreislaufstörungen. Bei höherem Staging-Grad wird zusätzlich Paditaxel und Bevacizumab, ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, für die systemische Therapie empfohlen. Rezidive treten dennoch häufig auf. Erfindungsgemäß werden die Oligonukleotide lokal nach der Tumorresektion verwendet, um eine Rezidiv- oder Metastasenbildung zu verhindern und um verbliebene Tumorzellen oder Metastasen zu bekämpfen. Dazu werden sie beispielsweise während der Operation nach der Entfernung des Ovars und weiteren Gewebes auf die entstandenen Operationsränder und das umliegende Gewebe aufgebracht. Dazu gehören auch umliegendes Binde- und Fettgewebe, insbesondere Teile des Peritoneums.
Die Größe eines Ovars beträgt bei einer Erwachsenen etwa 3,5 *2*1 cm, sein Volumen etwa 3 - 6 ml. Ähnlich wie beim Nebennierenrindenkarzinom eignen sich verschiedene Formulierungen, so auch eine gelartige Formulierung. Trotz des geringeren Organvolumens im Vergleich zur Nebennierenrinde eignen sich bevorzugt Volumen von 1 - 5 ml, weil um das Ovar herum in größerem Ausmaß umgebendes Gewebe mit bestrichen werden soll. Das Gelvolumen enthält bevorzugt 70 Mikrogramm und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm. Das Gel wird innerhalb weniger Wochen abgebaut, die Oligonukleotide dabei stetig freigesetzt. Die Oligonukleotide können dabei in Partikeln oder Liposomen verpackt sein, so dass sie nur langsam freigesetzt werden, wenn die Träger abgebaut oder von den Zellen aufgenommen werden. Die Abbaugeschwindigkeit der Partikel kann durch Herstellungsparameter wie den Vernetzungsgrad beeinflusst werden. Bevorzugt betragen die Halbwertszeiten in vivo mehr als 1 Woche, besonders bevorzugt 2 Wochen, 4 Wochen und 3 Monate. In einem weiteren Anwendungsbeispiel werden elastische Träger aus beispielsweise Kollagen verwendet, die in die Operationshöhle eingebracht werden und das Volumen eines Ovars ganz oder teilweise ausfüllen. Ein Träger trägt Oligonukleotide in Mengen von bevorzugt mehr als 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm. Der Träger wird vom Körper innerhalb einiger Wochen abgebaut, die Oligonukleotide dabei stetig freigesetzt.
Die Abbaugeschwindigkeit ist beim Gel wie beim elastischen Träger durch Herstellparameter steuerbar, bei Kollagen etwa durch den Vernetzungsgrad des Kollagens. Bevorzugt sind dabei in vivo Halbwertszeiten von mehr als 1 Woche, besonders bevorzugt von 2 Wochen, 4 Wochen und 3 Monaten. Auch beim Ovarialkarzinom kann eine flüssige Formulierung für die Oligonukleotide Vorteile aufweisen, da sich das Peritoneum, das die Ovarien umgibt, weit erstreckt. Das eingespritzte Volumen beträgt beim Ovarialkarzinom in diesem Beispiel 20 ml, in dem sich bevorzugt mehr als 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm Oligonukleotid befinden. Die Oligonukleotide können dabei in
Partikeln oder Liposomen verpackt sein, so dass sie nur langsam freigesetzt werden, wenn die Träger abgebaut oder von den Zellen aufgenommen werden. Die Abbaugeschwindigkeit der Partikel kann durch Herstellungsparameter wie den Vernetzungsgrad beeinflusst werden. Bevorzugt betragen die Halbwertszeiten in vivo mehr als 1 Woche, besonders bevorzugt 2 Wochen, 4 Wochen und 3 Monate.
Vorteilhaft kann auch die Verwendung von Trägern mit einfacherer Geometrie sein, aus denen die Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum, insbesondere über mehrere Tage eluieren. Besonders vorteilhaft sind dabei Träger, die vom Körper resorbiert werden, wie etwa flexible Folien oder Stäbchen. Kleinere partikuläre Träger können in Netzen, etwa Gazenetzen, oder in einem Hydrogel appliziert werden.
Beim Ovarialkarzinom kann die Verwendung der Oligonukleotide als Aerosol bevorzugt sein, insbesondere bei Mengen von 20 oder 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm Oligonukleotid
Die Kombination der adjuvanten Verwendung der Oligonukleotide mit adjuvanten Zytostatika wie Carboplatin, Cisplatin, Paclitaxel und Bevacizumab, und die Kombination mit einer Radiatio kann bevorzugt sein.
Ausführungsbeispiel Mesotheliom
Beim malignen diffusen Mesotheliom handelt es sich um einen Tumor, der von den mesothelialen beziehungsweise submesothelialen Zellen der Pleura, des Peritoneums oder des Perikards ausgeht. Die Prognose für Patienten mit malignen Pleuramesotheliomen ist mit medianen Überlebenszeiten von 4 bis 12 Monaten ungünstig. Eine kurative Behandlung ist derzeit nicht verfügbar.
Der überwiegende Anteil (> 80 %) der Mesotheliome hat seinen Ursprung in der Pleura. Maligne Mesotheliome sind vergleichsweise selten. Meist treten sie als Signaltumoren einer zurückliegenden Asbestbelastung auf (Neumann et al 2013). So wird auch erwartet, dass die Zahl der Mesotheliomfälle beispielsweise nach dem Anschlag auf das World Trade Center in New York am 11. September 2001 in den nächsten 15 Jahren unter den damals exponierten Personen deutlich zunehmen wird (Povtak 2016). Je nach Mesotheliomsubtyp werden bei mehr als 50 % der pleuralen Mesotheliomerkrankungen Tumorzellen in den Pleuraerguss abgeben.
Für die Behandlung von Mesotheliomen gibt es keine Standardtherapie. Empfohlene Therapiekonzepte reichen von alleiniger symptomatischer Behandlung bis hin zu einer aggressiven multimodalen Behandlung aus Operation, Chemotherapie und Bestrahlung. Derzeit bestehen zwei nicht-laparoskopische operative Strategien, die Pleurektomie/Dekortikation oder die extrapleurale Pleuropneumektomie, um eine möglichst vollständige makroskopische Tumorentfernung zu erreichen. Diese Resektionen werden nicht laparoskopisch durchgeführt. Wegen des diffusen Wachstums der Mesotheliome ist eine komplette Entfernung des Tumors in der Regel jedoch nicht möglich. Es verbleiben residuale, oft nur mikroskopisch nachweisbare Tumoranteile, deretwegen adjuvante Radiotherapien und Chemotherapien empfohlen werden (Rice 2011). Im Stand der Technik wird eine Kombination aus Carboplatin und Pemetrexed intraperitoneal empfohlen. Jüngst wurden Erfolge bezüglich der Überlebenszeit von Patienten durch den adjuvanten Einsatz von Check Point Inhibitoren verzeichnet (Scherpereel et al 2017). Im Gegensatz zu Nebennierenrinde und Ovar ist die Größe der Operationshöhle individuell sehr verschieden, bei einer Resektion eines Lungenflügels beim Mesotheliom der Pleura kann sie mehrere Liter groß sein und eine Fläche von mehreren hundert Quadratzentimetern aufweisen. Ein Gel kann auch bei diesen Volumina vorteilhaft verwendet und mit Werkzeugen wie Pinseln appliziert werden, bevorzugt sind dabei Konzentrationen von mehr als 15 oder 70 Mikrogramm und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm pro Milliliter Gel.
Beim Erhalt des betroffenen Lungenflügels eignet sich eine flüssige Formulierung, bevorzugt sind dabei Konzentrationen von mehr als 15 oder 70 Mikrogramm und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm pro Milliliter. Bei großvolumigen Resektionen sind elastische Träger mit einem Gesamtvolumen der resezierten Organe nicht mehr sinnvoll. Stattdessen werden besser flächige Träger wie Membranen, Folien oder Gaze verwendet werden, die Oligonukleotide direkt, in Partikeln wie etwa Liposomen verpackt, konjugiert oder als Gel formuliert tragen. Bevorzugt sind dabei Beladungsdichten von 10 Mikrogramm pro Quadratzentimeter, besonders bevorzugt als 50 oder 200 Mikrogramm, 1, 5 oder 20 Milligramm Oligonukleotid pro Quadratzentimeter. Bevorzugt ist die Aufbringung von Oligonukleotiden auf Implantate, wie sie bei der Resektion des Zwerchfells Verwendung finden, mit der gleichen Oligonukleotid-Dichte.
Auch beim Mesotheliom kann die Verwendung von Trägern mit einfacherer Geometrie bevorzugt sein, insbesondere, wenn aus diesen Trägem die Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum, insbesondere über mehrere Tage eluieren. Besonders vorteilhaft sind dabei Träger, die vom Körper resorbiert werden, wie flexible Folien oder Stäbchen. Kleinere partikuläre Träger können in Netzen, etwa Gazenetzen, oder in einem Hydrogel appliziert werden.
Beim Mesotheliom kann die Verwendung der Oligonukleotide als Aerosol bevorzugt sein, insbesondere bei Mengen von 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25, 100 oder 1000 Milligramm Oligonukleotid
Die Kombination der adjuvanten Verwendung der Oligonukleotide mit weiteren adjuvanten Therapien wie Carboplatin und Pemetrexed, und die Kombination mit einer Radiatio kann bevorzugt sein.
AusfUhrungsbeispiel Glioblastom
Glioblastome gehören zu den diffus infiltrierenden, hochmalignen Gliomen und sind mit 16% Anteil die häufigsten hirneigenen Neoplasien. Sie zählen nach WHO-Klassifikation zu den Grad-IV-Tumoren und gehen mit einer schlechten Prognose einher. Da Glioblastome ein ausgesprochen infiltratives Wachstum zeigen, ist eine Heilung durch Resektion des Tumors nicht möglich. Ziel ist es, die Tumormasse chirurgisch weitgehend zu reduzieren. Eine adjuvante Therapie, bei der Radiotherapie mit einer Chemotherapie kombiniert wird, wird daher nach dem European Organisation for Research and Treatment of Cancer und National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (EORTC-NCIC) Protokoll empfohlen (Javamanne et al 2018). Sie setzt aber erst vier Wochen nach der Operation ein, wenn der Heilungsprozess der Operationswunden fortgeschritten ist. Gegenwärtig ist Temozolomid Behandlungsstandard (Davis 2016), ein orales alkylierendes Chemotherapeutikum, das jedoch genotoxisch wie teratogen ist. Die beschriebene adjuvante Deponierung von Gliadel™- Wafern während der Operation ist eine Therapievariante, die zwar nicht zum Behandlungsstandard gehört, aber durchaus auch gemeinsam mit einer Temozolomidbehandlung durchgeführt wird. Von einer parallelen Verwendung von Temozolomid und Becavizumab wird dagegen abgeraten (Holdhoff et al 2011). Zu einer neueren Therapieoption in Entwicklung gehört DCVax, ein Verfahren, bei dem den Patienten Monozyten entnommen werden und diese extrakorporal zu dendritischen Zellen differenziert, mit Tumorantigenen in Verbindung gebracht und anschließend in den Patienten zurücktransferiert werden.
Beim Glioblastom sind Größe und Form der Operationshöhle individuell verschieden. Die Größe der Operationshöhle beträgt jedoch ebenfalls einige Milliliter und ist so der des Nebennierenrindenkarzinoms und des Ovarialkarzinoms vergleichbar. Die Form ist jedoch verschieden und so individuell wie die Größe. Außerdem können beim Glioblastom fast ausschließlich Teilresektionen durchgeführt werden.
Für die erfindungsgemäße Anwendung eignen sich auch beim Glioblastom insbesondere gelartige Formulierungen, die mit einem Instrument wie einem Pinsel auf die Wundränder aufgetragen werden. Das Gelvolumen von 1 bis 5 Millilitern enthält bevorzugt 70 Mikrogramm und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm. Das Gel wird innerhalb weniger Wochen abgebaut, die Oligonukleotide dabei stetig freigesetzt. Die Oligonukleotide können dabei in Partikeln oder Liposomen verpackt sein, so dass sie nur langsam freigesetzt werden, wenn die Träger abgebaut oder von den Zellen aufgenommen werden. Die Abbaugeschwindigkeit der Partikel kann durch Herstellungsparameter wie den Vernetzungsgrad beeinflusst werden. Bevorzugt betragen die Halbwertszeiten in vivo mehr als 1 Woche, besonders bevorzugt 2 Wochen, 4 Wochen 3 Monate oder gar mehr als ein ganzes Jahr.
In einem weiteren Anwendungsbeispiel werden elastische Träger aus beispielsweise Kollagen verwendet, die in die Operationshöhle eingebracht werden und das Volumen der Operationshöhle ganz oder teilweise ausfüllen. Der eine oder die Träger tragen Oligonukleotide in Mengen von insgesamt bevorzugt mehr als 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm. Der oder die Träger werden vom Körper innerhalb einiger Wochen abgebaut, die Oligonukleotide dabei stetig freigesetzt.
Die Abbaugeschwindigkeit ist beim Gel wie beim elastischen Träger durch Herstellparameter steuerbar, bei Kollagen etwa durch den Vernetzungsgrad des Kollagens. Bevorzugt sind dabei in vivo Halbwertszeiten von mehr als 1 Woche, besonders bevorzugt von 2 Wochen, 4 Wochen und 3 Monaten.
Auch beim Glioblastom kann eine flüssige Formulierung für die Oligonukleotide Vorteile aufweisen, da nicht bekannt ist, ob sich das Glioblastom auch anders als infiltrierend ausbreitet. Das eingespritzte Volumen beträgt beim Glioblastom zum Beispiel 20 ml, in dem sich bevorzugt mehr als 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm Oligonukleotid befinden. Die Oligonukleotide können dabei in Partikeln oder Liposomen verpackt sein, so dass sie nur langsam freigesetzt werden, wenn die Träger abgebaut oder von den Zellen aufgenommen werden. Die Abbaugeschwindigkeit der Partikel kann durch Herstellungsparameter wie den Vernetzungsgrad beeinflusst werden. Bevorzugt betragen die Halbwertszeiten in vivo mehr als 1 Woche, besonders bevorzugt 2 Wochen, 4 Wochen und 3 Monate.
Beim Glioblastom kann die Verwendung der Oligonukleotide als Aerosol bevorzugt sein, insbesondere bei Mengen von 25 oder 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm Oligonukleotid
Vorteilhaft kann auch die Verwendung von Trägern mit einfacherer Geometrie sein, aus denen die Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum, insbesondere über mehrere Tage eluieren. Besonders vorteilhaft sind dabei Träger, die vom Körper resorbiert werden, wie etwa flexible Folien oder Stäbchen. Kleinere partikuläre Träger können in Netzen, etwa Gazenetzen, oder in einem Hydrogel appliziert werden. Ein weiteres Beispiel stellen Wafer dar, wie sie bei Gliadel Verwendung finden.
Die Kombination der adjuvanten Verwendung der Oligonukleotide mit adjuvanten Zytostatika wie Temozolomid, mit zellulären Therapien wie DCVax, und die Kombination mit einer Radiatio kann bevorzugt sein. Anwendungsbeispiel Peritonea Ika rzi nose
Die Peritonealkarzinose bezeichnet den Befall des Bauchfells (Peritoneum) mit multiplen bösartigen Tumorzellen. Ursächlich für eine Peritonealkarzinose ist meist nicht ein Tumor des Peritoneums selbst, sondern ein bösartiger Tumor eines anderen im Bauchraum gelegenen Organs. Hierbei handelt es sich zumeist um einen bereits weit fortgeschrittenen, metastasierenden Tumor des Magen-Darm-Traktes, des Pankreas oder der Ovarien, wie bereits weiter oben beschrieben. In einigen Fällen ist es nicht möglich, einen Primärtumor zu identifizieren. (https://flexikon.doccheck.com/de/Peritonealkarzinose),
Die Peritonealkarzinose tritt mit 15-20 Fällen pro 100.000 Personen selten, aber mit steigender Tendenz auf, in Deutschland etwa 35.000 Neuerkrankungen pro Jahr (Glockzin et al 2007). Die Prognose der Peritonealkarzinose beträgt im Durchschnitt etwa 6 Monate nach Diagnosestellung.
Sofern nicht zu weit fortgeschritten, wird die Peritonealkarzinose zunehmend mit einer multimodalen Therapie behandelt, bei der die chirurgische Zytoreduktion mit einer intraoperativen, hyperthermen intraperitonealen Chemotherapie kombiniert wird (Piso et al 2011). Auch die bereits beschriebene PIPAC findet hier Anwendung.
Im Gegensatz zu Nebennierenrinde und Ovar ist die Größe der Operationshöhle wegen der variierenden Anzahl befallener Organe individuell sehr verschieden. Ein Gel kann dennoch bei diesen Volumina vorteilhaft verwendet und mit Werkzeugen wie Pinseln appliziert werden, bevorzugt sind dabei Konzentrationen von mehr als 15 oder 70 Mikrogramm und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm pro Milliliter Gel.
Bei großvolumigen Resektionen sind elastische Träger mit einem Gesamtvolumen der resezierten Organe nicht mehr sinnvoll. Stattdessen werden besser flächige Träger wie Membranen, Folien oder Gaze verwendet werden, die Oligonukleotide direkt, in Partikeln wie etwa Liposomen verpackt, konjugiert oder als Gel formuliert tragen. Bevorzugt sind dabei Beladungsdichten von 10 Mikrogramm pro Quadratzentimeter, besonders bevorzugt als 50 oder 200 Mikrogramm, 1, 5 oder 20 Milligramm Oligonukleotid pro Quadratzentimeter. Bevorzugt ist die Aufbringung von Oligonukleotiden auf Implantate, wie sie bei der Resektion des Zwerchfells Verwendung finden, mit der gleichen Oligonukletid-Dichte. Auch der Peritonealkarzinose kann die Verwendung von Trägern mit einfacherer Geometrie bevorzugt sein, insbesondere, wenn aus diesen Trägern die Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum, insbesondere über mehrere Tage eluieren. Besonders vorteilhaft sind dabei Träger, die vom Körper resorbiert werden, wie flexible Folien oder Stäbchen. Kleinere partikuläre Träger können in Netzen, etwa Gazenetzen, oder in einem Hydrogel appliziert werden.
Bei der Peritonealkarzinose kann die Verwendung der Oligonukleotide als Aerosol bevorzugt sein, insbesondere bei Mengen von 70 Mikrogramm, und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25, 100 oder 1000 Milligramm Oligonukleotid Oie Kombination der adjuvanten Verwendung der Oligonukleotide mit weiteren adjuvanten Therapien wie Carboplatin und Pemetrexed, und die Kombination mit einer Radiatio kann bevorzugt sein.
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Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines tumorwirksamen Oligonukleotid bei Tumorpatienten nach vollständiger oder teilweiser Resektion oder Ablation eines soliden Tumors dieses Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid in einer bei der Resektion oder Ablation entstandenen Körperhöhle appliziert wird, um bei der Operation oder Ablation im Tumorbett und dessen Umgebung verbliebene Tumorzellen oder Metastasen zu bekämpfen und in diesem Bereich der Bildung von Rezidiven oder neuen Metastasen entgegenzuwirken.
2. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Oligonukleotid in mindestens einer Art von Tumorzellen pleiotrop wirkt.
3. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Gel, in einer Flüssigkeit oder einem elastischen Material appliziert wird.
4. Verwendung eines Oligonukleotids nach den Ansprüchen 1, 2, oder 3 als Beladung eines Trägers in Form von Gel, Flüssigkeit oder eines elastischen Materials, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger Oligonukleotide in einer Konzentration von bevorzugt 15 oder 70 Mikrogramm und besonders bevorzugt von mehr als 250 oder 1000 Mikrogramm, 5, 25 oder 100 Milligramm pro Milliliter enthält.
5. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus resorbierbarem elastischem oder gelartigem Material besteht und die Form des resezierten Organs zumindest teilweise nachbildet.
6. Verwendung eines Oligonukleotids nach den Ansprüchen 1, 2, oder 3 als Beladung eines flächigen Trägers wie Membranen, Folien oder Gaze, wobei die Träger die Oligonukleotide direkt, in Partikeln wie etwa Liposomen verpackt, konjugiert oder als Gel formuliert tragen, dadurch gekennzeichnet, dass die Beladungsdichten mindestens 10 Mikrogramm pro Quadratzentimeter betragen, besonders bevorzugt 50 oder 200 Mikrogramm, 1, 5 oder 20 Milligramm Oligonukleotid pro Quadratzentimeter.
7. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger Materialien mit geringer Immunogenität enthält, insbesondere Collagen, Atelocollagen, Gelatine, Chitosan oder Hyaluronsäure.
8. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger zusätzlich Marker zur spezifischen Detektion aufweist, insbesondere absorptive oder Fluoreszenzfarbstoffe.
9. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Vernetzung oder anderweitige Stabilisierung des Trägers so gestoppt wird, dass das Trägermaterial mit einer bevorzugten Geschwindigkeit im Körper des Patienten abgebaut wird, insbesondere mit einer Halbwertszeit in vivo von mehr als einer Woche und besonders bevorzugt mit einer Halbwertszeit von mehr als 2 Wochen, 4 Wochen und 3 Monaten.
10. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass neben den Oligonukleotiden weitere tumorwirksame Moleküle, insbesondere Zytostatika in therapeutisch relevanten Dosen auf dem Träger aufgebracht sind.
11. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Träger miteinander kombiniert werden, insbesondere Gel oder Gaze in Kombination mit flüssiger Formulierung, um so optimal Tumorzellen zu erreichen, die sich entfernt vom Wundrand befinden.
12. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, das diagnostische Elemente auf dem Träger integriert sind, insbesondere Sensoren für die Herzfrequenz, LDL oder HDL-Konzentrationen.
13. Verwendung der Oligonukleotiden nach Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass Standardtherapien wie Operationen, Nachsorge und adjuvante Chemotherapie parallel dazu oder nahezu gleichzeitig mit der dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden.
14. Verwendung von Oligonukleotiden nach Ansprüchen 1 bis 13 für die adjuvante Therapie von Tumoren, insbesondere des Nebennierenrindenkarzinoms, der Ovarialkarzinoms, des Mesothelioms und des Glioblastoms.
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