CN101374554A - 胶凝疏水性可注射聚合物组合物 - Google Patents

胶凝疏水性可注射聚合物组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN101374554A
CN101374554A CNA2006800443821A CN200680044382A CN101374554A CN 101374554 A CN101374554 A CN 101374554A CN A2006800443821 A CNA2006800443821 A CN A2006800443821A CN 200680044382 A CN200680044382 A CN 200680044382A CN 101374554 A CN101374554 A CN 101374554A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polymer
acid
compositions
paclitaxel
medicine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800443821A
Other languages
English (en)
Inventor
A·J·多姆布
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Efrat Biopolymers Ltd
Original Assignee
Efrat Biopolymers Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Efrat Biopolymers Ltd filed Critical Efrat Biopolymers Ltd
Publication of CN101374554A publication Critical patent/CN101374554A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Abstract

本文描述由蓖麻油酸低聚酯和脂族分子合成的生物可降解的载体及其制备方法和使用方法，该脂族分子具有至少一个羧酸和至少一个羟基或羧酸基团，在低于37℃时为液体或糊状物。本文描述的聚合物在浸入水性介质时其粘度显著增加。这些聚合物可用作疏水性生物医学密封剂、预防粘连如器官与器官粘连的临时隔离剂、细胞支持物、药物释放的载体和可植入医疗装置如支架上的涂层。与由蓖麻油酸单体制备的相似组成和分子量的聚合物相比，由蓖麻油酸低聚酯制备的聚合物粘度更低，更容易注射，与由蓖麻油酸单体合成的聚合物相比，具有更高的分子量，将结合的药物保持更长的时间，以更慢的速率降解成软的降解产物。可不使用有机溶剂而将药物活性剂掺入液体或糊状物中。

Description

胶凝疏水性可注射聚合物组合物
本申请要求2005年9月27日提交的美国临时申请第60/720,840号的权益。
发明领域
本发明总体属于用于控制释放药物活性剂的胶凝疏水性聚合物的组合物的领域。
发明背景
用于胃肠外控制药物释放的原位储库形成系统典型为具有宽范围粘度的液体或糊状物形式。这样的系统通常包含分散于或溶解于溶剂/助溶剂系统中的生物可降解载体，而药物分散于或溶解于释药系统的液相中。在皮下注射或肌内注射后，在注射部位形成固体储库。这样的系统的给药远比常需要植入的外科手术更小侵入性损伤和更便宜。最近已综述了不同的原位储库形成系统，并依据储库形成的机制将其分成不同的种类(Hatefi等，J.Control.Release 80(1-3)：9-28(2002))。
用丙交酯-乙交酯共聚物(＂PLGA＂)形成的原位沉淀系统在近年来已得到极大的关注，因为法规批准了具体产品如
Figure A200680044382D00041
该产品将
Figure A200680044382D00042
技术用于醋酸亮丙瑞林的长期释放。由Atrix Lab(现在的QLT)上市。N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)是用于该特殊制剂的有机溶剂。也已评价其它的有机溶剂如丙二醇、二甲基亚砜、四氢呋喃、乙酸甘油酯和苯甲酸乙酯对初始药物突释的影响。这些有机溶剂的生物相容性和全身毒性已是主要关注的问题。PLGA的原位储库形成系统也已由Alza开发，它使用更亲脂的溶剂如苯甲酸苄酯(
Figure A200680044382D00044
)，声称为更小的刺激并减少初始药物突释。
Figure A200680044382D00051
系统(Durect)由溶于乙醇、苯甲醇或其它水互溶性溶剂中的蔗糖乙酸酯异丁酸酯(SAIB)组成。由于低溶液粘度，易用小号针给药是超过PLGA系统的明显的优势。SABER-布比卡因的长效制剂已在临床试验中，用于外科疼痛后的处理。通过重组人生长素(＂rh-GH＂)在大鼠中从包含不溶性的rh-GH粉末和溶于液相中的PLGA的SABER混悬液中持续释放7天，已证明了SABER系统用于肽和蛋白质释放的应用潜力。热敏的生物可降解的三嵌段共聚物已由MacroMed开发，作为用于胃肠外药物释放的持续释放系统。共聚物由疏水性PLGA嵌段(A)和亲水性PEG嵌段(B)组成，具有两个不同的嵌段构型：ABA和BAB。
Figure A200680044382D00052
是可溶于水的ABA型三嵌段共聚物。
Figure A200680044382D00053
的水溶液是在15℃时自由流动的液体，当注射时在体温下转化成凝胶。通过改变疏水性/亲水性含量、聚合物的浓度、三嵌段共聚物的分子量和/或多分散性，调节药物释放的速率。药物可溶于、悬浮于或乳化于
Figure A200680044382D00054
中。
Figure A200680044382D00055
是含紫杉醇的产品，将紫杉醇掺入
Figure A200680044382D00056
中，用于实体瘤的局部治疗。紫杉醇在凝胶的疏水区域内被溶解和捕获，当凝胶经过降解/侵蚀时，紫杉醇的释放持续6周。在ReGel中的紫杉醇在血管周围的持续释放也已显示在狗的血管移植中有效地抑制新生内膜增生。因为
Figure A200680044382D00057
的含水性，可能难于达到延长水溶性药物的持续释放(例如大于1个月)。不可避免进一步的药物高初始突释。
泊洛沙
Figure A200680044382D00058
407为由聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)单元组成的ABA三嵌段共聚物。它是水溶性的非离子型表面活性剂，形成具有逆热性凝胶化性质的水溶液。大于20％的聚合物溶液在低温下展示低粘性，但在体温下迅速形成刚性的半固体凝胶网络。然而，泊洛沙
Figure A200680044382D00059
的生物降解能力的缺乏和考虑到在高浓度聚合物时的细胞毒性，已限制了它的胃肠外应用。在腹膜内注射聚合物之后，在大鼠血浆中胆固醇和二缩三丙三醇水平的升高也可是个问题。
也已报导沿聚合物主链含多个巯基(-SH)的聚(乙二醇)-基共聚物的制备。当该共聚物的水溶液与溶于中性磷酸盐缓冲液中的交联剂α，ω-二乙烯基砜-聚(乙二醇)(分子量2KD)混合时，形成水凝胶。当形成水凝胶时，水溶性药物可溶于任一溶液中，药物在物理上被捕获。在大鼠和兔中的初步生物相容性评价表明对原位交联凝胶的轻度不良组织反应。
Figure A200680044382D00061
(DelSite Biotech有限公司)聚合物为从芦荟植物中提取和纯化的天然酸性多糖。当皮下或肌内注射时，在存在钙时聚合物的水溶液形成凝胶；因此在溶液中捕获水溶性药物(即蛋白质)，并提供持续释放。该结合提供对药物释放的额外控制，而不干扰蛋白质的生物功能。
这些系统基于聚合物载体的水、NMP、聚乙二醇和/或其它二醇的亲水性溶液，其中在浸入水中时，当聚合物沉淀时亲水性溶剂被浸出至外围组织中。这样的系统的局限性包括注射需要大量的聚合物载体和溶剂；由于亲水性溶剂的快速浸出使掺入聚合物溶液中的药物突释；毒性有机溶剂如N-甲基吡咯烷酮(NMP)的应用；减慢聚合物的降解时间如数月至数年。
药物治疗的目的是使药物的治疗效应最大化，同时使不良作用最小化。药物全身释放至局部肿瘤具有在增殖的细胞边界提供相对低的药物浓度的缺点，药物的全身释放可能远离在肿瘤中的异常毛细血管网络。为了延长直接进入肿瘤或肿瘤切除部位的时间，基于聚合物的负载抗癌药的植入物提供释放高、局部剂量药物的机会。因此，正在开发可注射的原位放置的半固体药物储库，作为可选择的释放系统。这些植入系统由生物可降解的产品制备，可经过注射器注入体内，一旦注入就胶凝形成半固体储库。生物可降解的聚酐和聚酯是对控制药物释放有用的材料。
已在Domb的美国专利申请公布号2004/0161464、2004/0161464中，描述了用作药物载体的含蓖麻油酸的聚酯和聚酐。然而，这些聚合物由蓖麻油酸单体制备，这导致在30个单体单元范围内的低聚合度，和需要高的蓖麻油酸含量以获得糊状的聚合物。并且，当这些先前描述的聚合物置于水性介质中时不胶凝。
虽然先前描述了药物释放系统，但还需要可注入体内的可靠的聚合物组合物，该组合物在体内形成原位植入物，用于药物的控制释放或用作临时的外科植入物。
因此本发明的目的为提供在37℃以下为液体或糊状、在浸入水性介质或组织中时胶凝的生物可降解的聚酯和聚酯-酐，及其制备方法和使用方法。本发明的还一个目的为通过掺入相对少量的蓖麻油酸低聚物，将常用的固体多羟基链烷酸酯的均聚和共聚酯转化成液体或糊状物，该多羟基链烷酸酯由乳酸、羟基乙酸和羟基己酸制备。
本发明的还一个目的为通过将蓖麻油酸低聚物结合至聚合物的主链中，将常用的固体烷烃二羧酸的均聚和共聚酐转化成液体或糊状物。
本发明的还一个目的为提供持续释放药物活性剂至少1周，优选至少4周的生物可降解聚酯和/或聚酐，该聚酯和/或聚酐在37℃以下为液体或糊状物。
本发明的还一个目的为提供在37℃以下为液体或糊状物的生物可降解的聚酯和聚酯-酐，其在浸入水性介质或组织中时胶凝，在约12周内彻底降解。
本发明的还一个目的为提供可用作密封剂的糊状生物可降解组合物和用于预防内脏粘连的临时屏蔽。
本发明的还一个目的为提供得自粗蓖麻油酸或蓖麻油的低成本纯蓖麻油酸。
发明概述
本文描述由蓖麻油酸低聚酯和脂族分子合成的生物可降解的载体及其制备方法和使用方法，该脂族分子具有至少一个羧酸和至少一个羟基或羧酸基团，该载体在低于37℃时为液体或糊状物。本文描述的聚合物在浸入水性介质时其粘度显著增加。这些聚合物可用作疏水性生物医学密封剂、预防粘连的临时隔离剂、细胞支持物、药物释放的载体和可植入医疗装置如支架上的涂层。与由蓖麻油酸单体制备的相似组成和分子量的聚合物相比，由蓖麻油酸低聚酯制备的聚合物粘性更低，更容易注射，与由蓖麻油酸单体合成的聚合物相比，具有更高的分子量，将结合的药物保持更长的时间，以更慢的速率降解成软的降解产物。可不使用有机溶剂而将药物活性剂掺入液体或糊状物中。
将组合物浸入水性介质如体液中，增加组合物的粘度，导致半固体材料的形成。在一个实施方案中，聚合物材料为聚酯或聚(酯-酐)，该聚酯或聚(酯-酐)由蓖麻油酸低聚物和具有至少一个羧酸和至少一个羟基或羧酸基团的脂族分子组成。
附图简述
图1为显示在不同切变率(应用的切变率显示于括号内)下，P(SA:RA)3:7的粘度-温度(℃)的函数图。实线显示在暴露于磷酸盐缓冲液中之前的聚合物，阴影线显示在暴露于磷酸盐缓冲液中(pH7.4、0.1M、37℃持续24小时)之后的聚合物。
图2为在不同切变率(应用的切变率显示于括号内)下，癸二酸-蓖麻油酸共聚物(P(SA:RA))(2:8)的粘度-温度(℃)的函数图。实线显示在暴露于磷酸盐缓冲液中之前的聚合物，阴影线显示在暴露于磷酸盐缓冲液中(pH7.4、0.1M、37℃持续24小时)之后的聚合物。
图3为在不同切变率(应用的切变率显示于括号内)下，聚蓖麻油酸(PRA)的粘度-温度(℃)的函数图。实线显示在暴露于磷酸盐缓冲液中之前的聚合物，阴影线显示在暴露于磷酸盐缓冲液中(pH74、0.1M、37℃持续24小时)之后的聚合物。
图4为显示在P(SA:RA)(3:4)暴露于磷酸盐缓冲液中之前和之后，切变率(秒-1)和剪切应力(达因/厘米2)之间关系的曲线图。在23℃时进行测量。实线显示在暴露于磷酸盐缓冲液中之前的聚合物，阴影线显示在暴露于磷酸盐缓冲液中之后的聚合物。
图5显示紫杉醇从负载5％ w/w紫杉醇和10％ w/w紫杉醇的P(SA：RA)(2：8)中的体外累积释放。每个点表示均值±STD(n＝3)。在37℃，pH7.4，在0.1M磷酸盐缓冲液中进行释放。通过HPLC测定紫杉醇的浓度。
图6显示体外水解降解和负载和未负载的P(SA:RA)(2:8)。图6a显示空白的、负载5％ w/w紫杉醇的和负载10％ w/w紫杉醇的P(SA:RA)(2:8)的体外水解降解，该降解由降解样品的失重来监测。图6b显示在体外水解降解(由NP HPLC测定)期间，样品中的紫杉醇累积。在37℃，以恒速转动(100RPM)，在磷酸盐缓冲溶液(50毫升，0.1M，pH7.4)中进行体外水解降解。
图7显示皮下注射的空白聚合物和紫杉醇制剂(5％和10％)在C3H健康小鼠体内的降解。在每个时间点(第1、7、21和70天)，处死小鼠(n＝4)，检测聚合物的植入物的Mw、重量和紫杉醇含量。
图8显示在C3H小鼠中，紫杉醇制剂对MBT异养型的体内抗肿瘤效应。在肿瘤细胞接种后的第8天开始治疗。时间零表示治疗的开始。每个点表示均值±STD(n＝10)。
图9显示在具有B16F1的C57B1/6大鼠的接种之后和在用负载不同浓度紫杉醇的P(SA:RA)(2:8)治疗之后，存活率的演变。
图10显示在具有B16F1的C57B1/6大鼠的接种之后和在用负载不同浓度紫杉醇的P(SA:RA)(2:8)治疗之后，肿瘤质量的演变。
图11显示在实验期间，在所有治疗组中，大鼠平均重量的演变。用误差线来显示标准差。
图12显示不同治疗组在死时肿瘤体积的演变。
图13显示牛血清白蛋白(＂BSA＂)、胰岛素、干扰素-α(＂INF-α＂)和白介素从P(SA:RA)(20:80)和P(SA:RA)(30:70)w/w中的体外释放百分比为时间(小时)的函数。在37℃在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中进行肽的释放。通过Lowry蛋白分析测定在释放介质中的药物含量。
图14显示从不同分子量的P(SA:RA)(3:7)中的体外释放百分比为时间(天)的函数。
图15为显示3种不同稀释度的细菌浓度(光密度)对时间(天)的曲线图。
图16显示在4℃和-17℃贮藏8周后，庆大霉素的释放为时间(天)的函数。图16a显示庆大霉素从在4℃贮藏8周的制剂中的释放。图16b显示庆大霉素从在-17℃贮藏8周的制剂中的释放。
发明详述
I、组合物
A、聚合物
本文描述由蓖麻油酸低聚酯和脂族分子合成的生物可降解的载体，该脂族分子具有至少一个羧酸和至少一个羟基或羧酸基团，该载体在37℃以下为液体或糊状物，在浸入水性介质时其粘度显著增加。聚合物的分子量为至少3,000道尔顿，优选为至少7,000道尔顿，更优选为至少10,000道尔顿。聚合物可具有不同的聚合度。在一个实施方案中，聚合物的聚合度为至少40。
蓖麻油酸(顺-12-羟基十八碳-9-烯酸)是在第9位置具有顺式构型的双键及在第12位置具有羟基的C18脂肪酸。可购买或由蓖麻油的水解制备粗蓖麻油酸。蓖麻油是天然的甘油三酸酯，每分子含平均约3个羟基。蓖麻油由蓖麻籽典型地通过挤压提取，为约90％的蓖麻油酸酯(12-羟基油酸酯)。
蓖麻油酸可与一个或多个聚酐反应，以产生蓖麻油酸低聚酯的预聚物，将该预聚物进一步聚合，以产生最终的聚合物。可通过脂族和/或芳族二羧酸的聚合来制备合适的聚酐。合适的二羧酸包括但不限于：丙二酸、琥珀酸、戊二酸、已二酸、癸二酸、庚二酸、辛二酸和壬二酸。合适的不饱和二酸包括：富马酸、衣康酸和马来酸。也可使用具有多于10个、多于15个、多于20个和多于25个碳原子的长链二酸如二聚物油酸和二聚物芥酸，和聚羧酸如三聚物芥酸或三聚物油酸、聚丙烯酸衍生物和柠檬酸。二羧酸也可包含活性官能团如氨基和/或羟基。
蓖麻油酸也可与羟基链烷酸共聚，以制备含蓖麻油酸酯单体单元的聚酯。合适的羟基链烷酸包括但不限于：乳酸；羟基乙酸；羟基己酸；3羟基链烷酸、4羟基链烷酸、5羟基链烷酸及其混合物。
本文描述的聚合物为生物可降解的和生物相容的。在一个实施方案中，聚合物在约12周内彻底降解。
B、活性剂
本文所描述的聚合物的组合物可用于释放治疗药物、诊断药物和/或预防药物。
可用于形成本文所述组合物的示范性药物包括但不限于：兴奋药、止痛药、麻醉药、平喘药、抗风湿药、抗癌药、抗胆碱能药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗糖尿病药、止泻药、止吐药、驱虫药、抗组胺药、抗高血脂药、抗高血压药、抗感染药、消炎药、抗偏头痛药、抗肿瘤药、抗帕金森病药、止痒药、安定药、解热药、解痉药、抗结核药、抗溃疡药、抗病毒药、抗焦虑药、食欲抑制药(减食欲药)、注意力缺陷障碍和注意力缺陷性多动症药、心血管药包括钙通道阻滞剂、抗心绞痛药、中枢神经系统(“CNS”)药、β-受体阻断剂和抗心率失常药、中枢神经系统兴奋药、利尿药、遗传物质、内分泌阻滞药、安眠药、降血糖药、免疫抑制药、肌松药、麻醉拮抗剂、烟碱、营养剂、副交感神经阻滞药、肽类药、精神兴奋药、镇静药、催涎药、类固醇、戒烟药、拟交感神经药、镇定药、血管扩张药、β-受体激动剂、抑制分娩药及其混合物。在一个实施方案中，活性剂是抗癌药如紫杉醇或甲氨蝶呤。在另一个实施方案中，活性剂为抗生素如庆大霉素。在还另一个实施方案中，活性剂为肽或蛋白质。
本领域的普通技术人员可确定这些药物的有效量。决定治疗有效量要考虑的因素包括被治疗者的年龄、体重和身体状况；所用药物的类型、所用聚合物的类型和所需的释放速率。典型地，以组合物的重量计，活性剂的浓度为约1％至约90％，优选以组合物的重量计为5％至约60％，更优选以组合物的重量计为约5％至约20％。
C、载体、添加剂和赋形剂
使用药学上可接受的＂载体＂制备制剂，该载体由认为是安全和有效的、可给予个体而不引起不良的生物学副作用或不需要的相互作用的材料组成。＂载体＂是存在于药剂中的除一种或多种活性成分之外的所有组分。术语＂载体＂包括但不限于：表面活性剂、稀释剂、缓冲剂、盐和防腐剂或稳定剂。稳定剂用于抑制或延迟药物的分解反应，包括例如氧化反应。
II、制备方法
可用本领域已知的许多种方法制备本文描述的聚合物。可用熔融缩聚法制备聚(蓖麻油酸-酐)共聚物。在一个实施方案中，脂族或芳族二羧酸与乙酸酐反应，以生成聚酐预聚物。将预聚物在高真空下加热，以形成聚酐。可通过聚酐与蓖麻油酸的酯化，来制备低分子量聚(蓖麻油酸-酐)共聚物。
或者，可通过聚酐与蓖麻油酸的低聚物在惰性气氛、环境压力下的酯化，来制备较高分子量的聚(蓖麻油酸-酐)共聚物。当聚合物的分子量达到1000道尔顿时终止反应。将乙酸酐加入至聚合物中，将溶液加热30分钟。去除过量的乙酸酐，形成油状预聚物。在高真空下加热聚合预聚物，以形成最终的聚合物。最终聚合物的分子量取决于反应时间以及蓖麻油酸的纯度。例如，用纯蓖麻油酸单体制得的聚合物的最大分子量为8,000。相反，用粗蓖麻油酸(85％蓖麻油酸含量)制得的聚合物的最大分子量为3,500道尔顿。
可通过在H3PO4催化剂的存在下，羟基链烷酸如L-乳酸、D，L-乳酸、羟基乙酸、羟基己酸及其混合物与蓖麻油反应，来制备包含蓖麻油酸单体单元的聚酯。
可通过无需加热和/或溶剂而直接将聚合物和药物混合，使聚合物负载一种或多种治疗药物、诊断药物和/或预防药物。将聚合物和药物混合直至形成光滑的糊。可将一种或多种添加剂加入到载药的聚合物中，以降低制剂的粘度和/或改善制剂的注射能力。合适的添加剂的实例包括但不限于：蓖麻油酸、磷脂、PEG 400和PEG 2000。假如使用添加剂，典型地首先将药物与添加剂混合，然后将药物-添加剂的混合物掺入聚合物中。并且，可将添加剂与药物和聚合物直接混合，而无需加热和/或溶剂。
III、使用方法
本文所描述的聚合物的组合物可用作可降解的载体，用于治疗局部疾病如癌症、细菌和真菌局部感染和疼痛。定位化学疗法在疾病部位提供延时的高药物浓度，是在感染区域如实体瘤的切除之后治疗残余的受感染细胞的有效方法。典型地通过肌内、皮下、腹膜内和/或瘤内(在肿瘤切除之前、期间或之后)注射和/或植入，给予制剂。聚合物在室温下为液体或糊状物，因此可无需添加剂而将它们注射或植入。然而，可按需要加入添加剂，以降低组合物的粘度和/或改善组合物的注射能力。
特别重要的是这些聚合物用于实体瘤治疗的定位化学疗法的应用，该实体瘤包括头颈部的鳞状上皮细胞癌(SCC)、前列腺癌和肉瘤，用于瘤内注射或插入。在美国，头颈部的癌症数量为每年约40,000新病例，为美国新癌症病例总数的约5％。不像其它的实体瘤，最常见的头颈部癌症复发是区域性的，那就是在颈部的复发。基于本发明的聚合物的预期装置为糊状或液体聚合物的植入物，由负载抗癌药物的生物可降解的聚合物骨架构成。将抗癌药如甲氨蝶呤或紫杉醇均匀地分散入聚合物骨架中。当被放置与体液接触时，活性药物以可控的方式释放至周围组织，同时聚合物载体通过缓慢降解来消除。
在肿瘤切除的手术操作期间，将可注射的液体或糊状物形式的植入物注入肿瘤内或插入肿瘤部位。植入物可在肿瘤部位提供延时典型地数天、数周或数月的高剂量抗癌药物，具有最低的全身药物分布，因此提供残留肿瘤细胞的局部治疗，作为对外科手术的补充的药物治疗。
药物长期释放至特定病体部位的相同概念也应用于其它实体瘤、局部感染如骨髓炎骨感染、癌症或爱滋病患者的局部麻醉药释放和控制组织生长的药物如用于治疗再狭窄和瘢痕瘤的肝素和类固醇。
聚合物也可用作在可植入医疗装置如支架上的涂层、用作手术密封剂或用作减少器官与器官粘连的隔离剂。
实施例
材料和仪器
从Fluka，Buch，瑞士获得纯度为85％的蓖麻油酸(RA)，纯化至由色谱法测定的97％。从Sigma-Aldrich(以色列)获得99％的癸二酸(SA)、己二酸、富马酸、马来酸酐和琥珀酸酐。所有溶剂为分析纯，得自BioLab(耶路撒冷，以色列)或Frutarom(海法，以色列)，不经进一步纯化而使用。
在由带Waters 2410折光率(RI)检测器的Waters 1515等度HPLC泵、带20微升环(Waters Ma)的Rheodyne(Coatati，CA)进样阀组成的凝胶渗透色谱(GPC)系统评估聚(酯-酐)的分子量。用氯仿以1毫升/分钟的流速通过线性柱洗脱样品。相对于聚苯乙烯标准品((Polyscience，Warrington，PA)测定分子量。
对从二氯甲烷溶液流延到NaCl板上的预聚物、聚合物样品和水解样品进行红外(IR)光谱测定(Perkin Elmer，2000FTIR)。
在Mettler TA 4000-DSC差示扫描热量计上，用锌(＂Zn＂)和铟(＂In＂)标准品校准，以10℃/分钟的加热速率(平均样品重量10毫克)，和在Stuart Scientific SMP1熔点加热器上，测定热分析。
使用Quanta 2000 SEM(30kV)进行冷冻扫描电子显微镜检查(Cryo-SEM)。
通过在装有数字照相机Cooplix 990(尼康，日本)的立体显微镜Stemi SV11(蔡斯，德国)下，进行光学显微镜的样品微观观察。
使用旋转法(Brookfield可编程流变计，LV-DV-III)测定聚合物的粘度。使用圆柱形轴LV4。
实施例1：聚(蓖麻油酸-癸二酸)共聚物的制备
纯蓖麻油酸的制备
在室温下连续搅拌几小时，将蓖麻油溶于2体积的2N KOH乙醇溶液中。将在乙醇中的产生的蓖麻油酸钾沉淀物与异丙醚混合，以较好地分离沉淀，该混合物可以分离。将沉淀浆状物离心，以分离固体，将溶剂轻轻倒出。将蓖麻油酸的钾盐分散于冰冻的1N HCl溶液中，用乙酸乙酯萃取。在溶剂蒸发之后，获得含100％脂肪酸的淡黄色油，其中至少95％为蓖麻油酸，如用气相色谱法所测定。
聚合物的合成
通过熔融缩聚制备PSA(聚(癸二酸))。将癸二酸在乙酸酐中沸腾20分钟。将乙酸酐蒸发至干燥，以获得灰白色的癸二酸预聚物。为了制备PSA，在高真空(1.3×10-1毫巴)下将癸二酸预聚物加热至140℃维持3小时，以获得Mw>30000道尔顿的聚(癸二酸)。通过PSA与蓖麻油酸(RA，Mw 298道尔顿)的酯化，制备低分子量的(AS3-102、AS3-101、AS3-92)癸二酸-蓖麻油酸共聚物(P(SA:RA))。通过PSA与RA低聚物(Mw～2100-3500道尔顿)的酯化，制备更高分子量的(P(SA:RA))共聚物(AS3-114、AS3-104)。对于P(SA:RA)(3:7)(AS3-101、AS3-102、AS3-114)以3:7w/w的比率，对于P(SA:RA)(2:8)(AS3-92、AS3-104)以2:8的比率进行酯交换。在氮气氛下、在120℃，在干燥的烧瓶中批量反应3-4小时。当达到1000道尔顿的分子量时终止反应。然后，加入乙酸酐(1/1w/w)。将溶液在140℃回流30分钟，将过量的乙酸酐和乙酸蒸发至干，以产生粘稠的黄色的油。在0.19-0.32毫米汞柱的真空下将油状预聚物在140℃聚合4-8小时，聚合时间取决于期望的分子量。对于由蓖麻油酸低聚物制备的聚合物，反应时间越长，产生的聚合物的分子量就越高。对于用蓖麻油酸单体制备的聚合物，达到的最高Mw为Mw＝8,000。对于由蓖麻油酸含量为85％的粗蓖麻油酸制备的聚合物，获得最高达3,500的分子量。
结果与讨论
下面的表格提供聚合物的分子量。如上所述制备聚合物。
表1：P(SA:RA)3:7的重均分子量和数均分子量
 
名称 组分A 组分B Mw，Mn
12 PSAPSA 蓖麻油酸(RA)95％纯蓖麻油酸85％纯 Mw 6400Mn 4000Mw 3400Mn 2300
3 PSA 蓖麻油酸99％纯 Mw 7000Mn 5000
45 PSAPSA RA低聚物(Mw2100)RA低聚物(Mw600) Mw 68600Mn 49000Mw 18000Mn 12000
PSA-聚(癸二酸酐)，Mw＝38,000；Mn＝22,000，使用乙酸酐作为脱水剂，通过癸二酸的熔融缩聚制备。
表2：P(SA:RA)2:8的重均分子量和数均分子量
 
名称 组分A 组分B Mw，Mn(Da)
67 PSAPSA RA  95％纯RA  85％纯 Mw 3700Mn 3200Mw 2100Mn 1400
8 PSA RA低聚物(Mw 3500) Mw 18200Mn 13400
9 PSA RA低聚物(Mw 1200) Mw 16500Mn 11300
PSA-聚(癸二酸酐)，Mw＝38,000；Mn＝22,000，使用乙酸酐作为脱水剂，通过癸二酸的熔融缩聚制备。
表3：由其它二酸制备的聚合物
 
名称 组分A 组分B 37℃时的分子状态
1011 PAAPAzA 蓖麻油酸(RA)95％纯蓖麻油酸95％纯 Mw 3400    ILMn 2300Mw 5000    IPMn 3200
12 PFA 蓖麻油酸95％纯 Mw 3000    IPMn 2000
1314 PAzAPSubA RA低聚物(Mw 2100)RA低聚物(Mw 2100) Mw 42000  IPMn 28000Mw 35000  IPMn 17000
PAA-聚(己二酸酐)，Mn＝38,000；PFA-聚(富马酸酐)，Mn＝14,000；PAzA-聚(壬二酸酐)，Mn＝32,000；PSubA-聚(辛二酸酐)，Mn＝27,000；IL-注射液；IP-可注射糊剂
实施例2：基于蓖麻油酸和各种脂肪二酸的液体聚(酯-酐)
合成
3:7 w/w比率的富马酸-蓖麻油酸-酯-酐共聚物
将20克的富马酸(FA)在乙酸酐中回流2小时。将乙酸酐蒸发，在170℃时将残渣聚合4小时，以获得分子量为20,000的聚(富马酸)(PFA)。加入50克的蓖麻油酸(RA)低聚物(Mw＝700)，在120℃时酯交换4小时之后，聚合物的分子量下降至1200道尔顿。通过乙酸酐活化低聚物，再次聚合。产生的聚合物的Mw为15000，Mn为8000。DSC Mp峰在34℃。IR：1732cm-1和1819cm-1
2:8 w/w比率的己二酸-蓖麻油酸-酯-酐共聚物
将20克的己二酸(AA)在乙酸酐中回流30分钟。将乙酸酐蒸发，在170℃时将己二酸预聚物聚合4小时，以产生分子量为27000道尔顿的聚合物。加入50克的RA，在120℃时酯交换4小时之后，聚合物的分子量下降至900。用乙酸酐活化低聚物，再次聚合。产生的聚合物的Mn为4000，Mw为6000。聚合物的熔点为10℃。IR:1732cm-1和1819cm-1。NMR：5.3ppm和5.4ppm(CH＝CH)、4.8 ppm(CH-O-CO)、1.6ppm(CH2-CH2-CH2己二酸)。类似地，由Mw＝2200的蓖麻油酸低聚物制备聚合物，产生Mw＝15,000的液体聚合物。
1:1 m/m比率的琥珀酸-蓖麻油酸-酯-酐共聚物
将36克(0.12摩尔)的RA和琥珀酸酐(24克，0.24摩尔)在甲苯中回流过夜。将溶剂蒸发，将产物溶于二氯甲烷，过滤，用双蒸馏水(DDW)洗涤4次，以溶解未反应的琥珀酸酐。产率为67％。NMR证实了酯的形成-4.8ppm(CH-O-CO)。将产物在乙酸酐(1：10w/v)中回流30分钟，蒸发直至干燥。通过酐缩聚法将预聚物聚合。在4小时之后，Mn＝4200，Mw＝6200。聚合物的熔点为-2℃。IR：1732cm-1和1819cm-1。NMR：5.3ppm和5.4ppm(CH＝CH)、4.8 ppm(CH-O-CO)、2.6ppm(CO-CH2-CH2-CO琥珀酸酯)，由Mw＝2200的蓖麻油酸低聚物制备聚合物，以产生Mw＝20,000的液体聚合物。
1:1 m/m比率的马来酸-蓖麻油酸-酯-酐共聚物
将36克(0.12摩尔)的RA和马来酸酐(24克，0.24摩尔)在甲苯中回流过夜。将溶剂蒸发，将产物溶于二氯甲烷中，过滤，用DDW洗涤4次，以溶解未反应的马来酸酐。产率为72％。NMR证实了酯的形成-4.8ppm(CH-O-CO)。将产物在乙酸酐(1:10重量/体积)中回流30分钟，蒸发直至干燥。通过酐缩聚法将预聚物聚合。在4小时之后，Mn＝4700，Mw＝7000。聚合物的熔点为-8℃。在24小时以后，Mn＝11000，Mw＝14000(恒定)。IR：1732cm-1和1819cm-1。NMR：5.3ppm和5.4ppm(CH＝CH)、4.8ppm(CH-O-CO)、6.8ppm和6.2ppm(CO-CH2＝CH2-CO马来酸酯)。类似地，由Mw＝2200的蓖麻油酸低聚物制备聚合物，以产生Mw大于15,000的液体聚合物。
1:1 m/m比率的琥珀酸-低聚蓖麻油酸-酯-酐共聚物
通过在120℃时将RA批量酯化7小时来制备RA的低聚物。获得的分子量为：300、900、1200和2100(1、3、4和7个重复单元)，平均分子量为Mn～950。
将40克(0.04摩尔)的RA低聚物和琥珀酸酐(8.4克，0.08摩尔)在甲苯中回流过夜。将溶剂蒸发，将产物溶于二氯甲烷，过滤，用DDW洗涤4次，以溶解未反应的琥珀酸酐。将产物在乙酸酐(1:10重量/体积)中回流30分钟，蒸发直至干燥。通过酐缩聚法将预聚物聚合，以产生高分子量的聚合物。IR：1732cm-1和1819cm-1。NMR：5.3ppm和5.4ppm(CH＝CH)、4.8ppm(CH-O-CO)、2.6(CO-CH2-CH2-CO琥珀酸酯)。用马来酸酐代替琥珀酸酐，由马来酸酐制备相似的聚合物。NMR：5.3ppm和5.4ppm(CH＝CH)、4.8 ppm(CH-O-CO蓖麻油酸酯)、4.9ppm(CH-O-CO蓖麻油酰基马来酸酯)、6.8ppm和6.2ppm(CO-CH2＝CH2-CO马来酸酯)。
实施例3：由蓖麻油酸制备的聚(酯酐)聚合物的胶凝行为和体内评价
使用热分析、光学显微镜检查、冷冻扫描电子显微镜检查和粘度测量评价聚合物的胶凝行为。
光学显微镜检查
通过在装有用于图像记录的数字照相机(Cooplix 990，尼康，日本)的立体显微镜Stemi SV11(蔡斯，德国)下微观观察样品，检验在暴露于缓冲液之前和之后的聚合物之间的差异。应用不同的显微镜变焦放大倍数以及调节至最佳视觉分辨率的数字照相机的变焦，在标准质量模式中进行图像记录。用KL 1500电子照明系统(蔡斯，德国)提供的反射光进行照明。
当聚合物与水性介质接触时，可见聚合物样品中的变化。在暴露于缓冲液之前，聚合物(干燥的聚合物)是透明的，但在胶凝过程发生之后(在缓冲液中8小时)，聚合物是不透明的。当切割聚合物时，发现两个不同的区域：为凝胶的外部区域(1)和表现为软骨架的芯(2)。
冷冻扫描电子显微镜检查(Cryo-SEM)
将湿润的聚合物样品和干燥的聚合物样品固定于短管上，在高真空下用液氮冷冻，然后使用Polarone E5100涂覆黄金。为制备用于Cryo-SEM的聚合物样品，将聚合物注入缓冲溶液(0.1M，pH7.4)中。在24小时之后拉出样品，放在短管上而不干燥。在高真空下用液氮冷冻样品。使用Polarone E5100使冷冻样品涂覆黄金。
从暴露的聚合物中去除吸附水(通过干燥或冷冻脱水)，将聚合物转化为具有与聚合物暴露于水之前相同的特性的油。冷冻显微镜检查法允许冷冻样品，虽然它还含有吸附水，因此当聚合物受水性介质影响时，可以目测观察聚合物。在暴露于缓冲液之前，聚合物(干燥的聚合物)具有同质的表面，当聚合物样品暴露于水时，在接近水性介质的外层显示确定的结构。暴露至水中的聚合物链穿过注入水中的聚合物样品的液滴，形成一种刚性的网络。该网络使得聚合物液滴在水性介质中保持它的形状。聚合物液滴的横截面显示聚合物内部保持完整，与暴露至水相中之前的聚合物相似。这些发现显示聚合物的胶凝仅发生在与水性介质接触的表面上。
水的吸收
将聚合物样品(P(SA:RA)(3:7)和P(SA:RA)(2:8)放入磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M，37℃)中，在暴露于缓冲液中0、4、12、26和40小时之后进行KF滴定。在每个时间点制备分离的聚合物样品。在每个时间点，将聚合物从缓冲液中取出，在吸水纸上吸干，称重，溶解于1毫升二氯甲烷中。将聚合物溶液放入滴定罐中。使用常规的KF试剂在甲醇中进行直接滴定。类似地制备样品内芯的样品。
差示扫描热量法
获得P(SA:RA)(3:7)暴露于缓冲液中不同持续时间的吸热图谱。在聚合物暴露于缓冲液中之前，有一个在35℃峰值的跃迁。在缓冲液中3小时之后峰在38.3℃，在缓冲液中12小时之后跃迁变为45℃。24小时之后在61℃时出现另外的跃迁，该跃迁可表明降解过程的开始即癸二酸的形成。对于P(SA:RA)(2:8)发现相似的结果，在聚合物暴露于缓冲液之前，有一个在约32℃峰值的跃迁。在缓冲液中12和24小时之后跃迁温度分别变为42℃和50℃。
在保持于缓冲液中的聚合物上进行的另一观察为聚合物的膨胀度。发现在缓冲液中第一个24小时期间P(SA:RA)(2:8)和P(SA:RA)(3:7)的体积增加15％。
粘度的测定
使用圆柱形轴。在聚合物暴露于水性介质之前和在37℃恒速转动(100RPM)的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)中温育12小时之后，测定聚合物的粘度。为了获得足够大的样品以进行粘度测量，将聚合物散布在大的表面上，放入缓冲液中。在暴露于水性介质之后，收集聚合物样品，放入玻璃容器中。通过应用恒定转速，从40℃开始降至室温(22℃)，进行温度灵敏度试验。通过测定在不同切变率时的剪切应力和/或粘度，进行流变学行为的检测，切变率从较粘稠的聚合物0.209秒-1开始，直至较不粘稠的聚合物36秒-1。一式三份进行所有实验。
图1显示在三个不同的切变率(8.4、12.5和21秒-1)时聚合物P(SA:RA)(3:7)的粘度。从43℃开始至可能测定的最低温度(在P(SA:RA)(3:7)的情况为25℃)测量粘度。因为非恒定切变率/剪切应力的关系，P(SA:RA)(3:7)在较低温度(<30℃)时显示非牛顿流体的性质，聚合物可归类为假塑性剪切稀化材料，该材料显示随切变率的增加而降低粘度。该性能对于聚合物的注射能力是重要的：当施加压力时，聚合物糊剂变得更软，通过针泵出。在较高温度(>30℃)时，P(SA:RA)(3:7)表现为牛顿流体，它的粘度不受应用的切变率的影响。最重要的是温度为室温(约22-25℃，优选25℃)，因为这是注射聚合物时的温度，和体温(37℃)，因为这是在聚合物注射至身体之后聚合物暴露的温度。当在室温下应用8.4秒-1和12.5秒-1的切变率时，在暴露于水性介质中之前，P(SA:RA)(3:7)的粘度为8600-9000cP，当暴露于水中之后，粘度太高而不能在室温下在那些切变率下测量。在37℃时暴露于水性介质之后，聚合物粘度的增加取决于切变率：对于8.4秒-1的切变率，在暴露于缓冲液之后，粘度从4200cP增至8940cP；在12.5秒-1的切变率时，粘度从4360cP增至6770cP；在21秒-1时粘度从4115cP增至5765cP。在暴露于水性介质之后，聚合物显示假塑性性能。这可通过暴露于缓冲液中诱导的聚合物链的重构来解释，在旋转轴时该重构被破坏。轴旋转越快(切变率越高)，结构破坏越多，一起滑动的结构分子越少，粘度将越低。
图2显示在三个不同的切变率(12.5、21和31秒-1)时，聚合物P(SA:RA)(25:75)的粘度。从43℃开始至室温测量粘度。P(SA:RA)(25:75)具有比P(SA:RA)(3:7)更低的粘度，因为它的较高的蓖麻油酸含量促进聚合物的流动性。在该温度范围内，P(SA:RA)(25:75)表现为牛顿流体，它的粘度不受应用的切变率的影响。因为聚合物的粘度较低，所以在较高切变率时测量粘度。在室温下在所应用的所有切变率(12.5、21和31秒-1)时，在暴露于水性介质中之前，P(SA:RA)(25:75)的粘度为约2900cP，当暴露之后，粘度在12.5秒-1时为8570cP、在21秒-1时为5000cP、在31秒-1时太高而不能测量。当在37℃测量时，在暴露于水性介质中之后，P(SA:RA)(25:75)的粘度显示牛顿流体的性能，但聚合物粘度还增加2200cP(在暴露于缓冲液中之前为1150cP，之后为3200cP)。在P(SA:RA)(25:75)的情况，仅当在室温而不是37℃测量粘度时，聚合物显示假塑性性能。
在两个不同的切变率(21秒-1和31秒-1)时，测量P(SA:RA)(2:8)的粘度。P(SA:RA)(2:8)因其较高的蓖麻油酸含量(80％)而显示比P(SA:RA)(25:75)更低的粘度。在该温度范围内，P(SA:RA)(2:8)表现为牛顿流体，它的粘度不受应用的切变率的影响。因为聚合物的粘度较低，所以在较高切变率时测量粘度。在室温下所应用的两种切变率(21和31秒-1)时，在暴露于水性介质中之前，P(SA:RA)(2:8)的粘度为约900cP，当暴露之后，粘度在21秒-1时为1800cP和在31秒-1时为1900cP。当在37℃测量时，在暴露于水性介质中之后，P(SA:RA)(2:8)的粘度也显示牛顿流体的性能。
图3显示在三个不同的切变率(12.5、21和31秒-1)时，聚合物聚(蓖麻油酸)(PRA)的粘度。PRA具有与P(SA:RA)(2:8)相似的粘度，但该聚合物甚至在4℃时仍为液体，在与水性介质接触之后无变化，表现得更像油。在该温度范围内，PRA表现为牛顿流体，它的粘度不受应用的切变率的影响。
剪切应力(F)和切变率(dv/dr)之间的关系在数学上以牛顿方程表达：
F＝ηdv/dr
其中比例常数η为粘滞系数。
图4显示以下聚合物的切变率和剪切应力之间的关系：在暴露于水性介质中之前和之后的P(SA:RA)(25:75)、P(SA:RA)(2:8)和PRA。对应于在水性介质中胶凝的P(SA:RA)(25:75)(图6a)的曲线斜率是暴露于水相之前的23倍。关于PRA，当暴露于水性介质时，聚合物的粘度无变化。
制剂的体内评价
在整个实验过程中，将近亲繁殖的8-10周大的、重约20g的雌性C3H小鼠(Harlan实验室，以色列)保持在没有特异性病原体(SPF)的条件下，让C3H小鼠自由进食经辐照的无菌食品和酸化水。通过22G针将不同体积的P(SA:RA)聚合物(0.05、0.1和0.15毫升)皮下注射至背部空间。在注射之后8和24小时，通过颈脱位法处死小鼠。提起动物的皮肤，暴露聚合物的植入物并拍照。在耶路撒冷的希伯来大学伦理委员会(NIH批准号：OPRR-A01-5011)已审查了该动物研究的申请，发现它符合实验动物的护理和使用标准(伦理委员会-调查号：MD-80.04-3)。
分别在处死之前(12a)和在处死之后的8小时和24小时(图5b和5c)给小鼠注射3个不同体积的P(SA:RA)(3:7)(0.05、0.1和0.15毫升)。在两个时间点，注射的植入物维持它们的形状，保持在注射部位，如当将油注入皮下空间时所发生的。这些体内实验证明：聚合物与组织接触时转化成凝胶。
此外，持续6周时间观察大鼠中P(SA:RA)(3:7)植入物的全身效应和局部效应。通过熔融缩聚法合成P(SA:RA)，重均分子量为11,600。从Harlan实验室(耶路撒冷，以色列)获得雌性Spraque-Dawley(SD)大鼠。植入时大鼠的重量为210±15.0克。将大鼠放入动物设施的SPF单元，允许其自由进食食物和水。将大鼠随机分配至两组中的一组(n＝4)：对照组，A组，由大鼠组成，该大鼠在相同的注射植入部位接受生理盐水，按与接受聚合物植入的组一样的方法麻醉，和B组，由植入聚合物骨架的大鼠组成。
将每只大鼠从各自的笼子中取出，使用等渗的5％水合氯醛溶液(0.64毫升/100克)经腹膜内途径给药麻醉。已使用动物剪毛器修剪每只大鼠的背侧和大腿区域。然后使用70％乙醇给动物消毒。通过22G针将聚合物的植入物注入每只动物两侧的皮下和两侧股肌的肌内。在将它们返还至它们的笼子之前，允许大鼠在操作室中醒来。
在植入前5天和植入当天从尾静脉抽取血样，用于测定每只大鼠的基线参数。在植入后3、7、21和42天将大鼠麻醉，通过心脏穿刺抽取血样。然后分析(AML Herzliya Pituah，以色列)每只大鼠的样品的临床化学参数和血液学参数。将接受聚合物植入物的大鼠分成两组。
第一组由接受四次聚合物空白注射的SD大鼠组成。两次注射，每次200微升，每次在背侧对面的皮下注射。其它两次，每次50微升，在每条腿的股肌内进行肌内注射。一个植入用于生物降解评价，第二个植入用于组织病理学评价。随机选择大鼠的器官，用于全身毒性评价。
第二组由接受10微升的聚合物空白颅内注射的Wistar大鼠组成。通过头盖骨中穿过左边顶骨区域的孔注射聚合物，该孔的中心在冠状结构后面5.5毫米处，在矢状结构侧面3.5毫米处。用25微升注射器进行注射，插针的深度为距离冠状面的4毫米。
在植入后的第3、7、21和42天，如上所述将大鼠麻醉，称重，记录每只大鼠的重量。然后通过心脏穿刺处死大鼠，尸体解剖。在尸体解剖时大体观察各种器官和植入部位。然后去除这些器官，称重，固定于4％甲醛缓冲液中(Biolab，耶路撒冷，以色列)。收集的组织包括：心脏、脑、肝脏、脾脏、肺脏、胸腺和肾脏。另外，去除局部的植入部位，固定于4％甲醛缓冲液中。切开所有的组织，用苏木紫和曙红染色，用显微镜检查。
在尸体解剖期间，去除聚合物的植入物，溶于氯仿中，用无水硫酸镁干燥，过滤，蒸发有机溶剂。称重分离的残渣，用IR检验酐和酯的含量，用GPC测定分子量，用NMR测定RA与SA的比率。用1N KOH水溶液将降解的聚合物骨架的等分试样水解，用浓HCl酸化，用乙酸乙酯萃取释放出的油残渣。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，将溶剂蒸发至干。使用HPLC检验聚合物水解产物的蓖麻油酸和癸二酸的含量。
从极耐受到不耐受，将每个组织的生物相容性分为如下的5级：
极耐受(没有或最小的炎性反应)
良好耐受(最小的不良反应，最小的炎症)
中等耐受(中等程度的炎症)
不良的耐受(不良反应，炎性反应)
不耐受(严重的坏死和炎性反应)
所有动物都是健康的，重量与对照动物相似。在植入部位没有观察到不良反应或肿胀，而当触摸该部位时，感觉到注射的聚合物为固体。从本研究的动物分离的所有器官均是正常的，在对照组和聚合物组之间没有发现差异。在第3天时间点，注射/植入物部位组织的组织病理学表明急性炎症和一些坏死，而不良反应局限于注射部位的顶部、从聚合物起毫米范围内的组织。在第7天，所有的植入物部位显示比第3天的部位显著改善的最小炎症至中等炎症。在第21天和第42天，检测到极好的耐受性。这些组织病理学结果类似于先前报导的临床使用的生物可降解聚酯和聚酐的相容性的结果。
关于脑相容性，在所有时间点包括第3天时间点的所有动物，呈现极好的生物相容性。从载荷紫杉醇的聚合物获得相似的结果。
在将样品干燥之后，用重力法测定从植入物部位回收的聚合物的量。发现聚合物的含量逐渐减少，到第42天时间点几乎全部消除。
结论
该研究的结果证明在该实验中描述的癸二酸-蓖麻油酸共聚物在与水介质相互作用时胶凝，因此具有原位形成聚合物的植入物或用作生物可降解密封剂或隔离剂以防止组织粘连的用途。这些聚合物为原位形成有机凝胶的不含溶剂的净材料。有机凝胶由不溶于水的两亲性脂质组成，在水中膨胀，形成各种类型的溶致液晶。形成的液晶相的性质取决于脂质的结构性能、温度和系统中的水量。迄今为止研究的用于药物释放的两亲脂质主要为脂肪酸的甘油酯，如在室温下为蜡状的甘油单油酸酯、单棕榈酸硬脂酸酯和单亚油酸酯。当注入水性介质时这些化合物形成立方液晶相。该液晶结构为像凝胶状的和高粘性的。P(SA：RA)共聚物为不溶于水的共聚物，该共聚物在暴露于水性介质时表现出粘性和熔点的变化。由三维网络的形成引起流变学的变化，使用SEM获得的图象显示在暴露于缓冲液时出现的可逆的独特的物理结构。可用羧基和周围的水分子之间的氢键来解释该三维结构。对通过有机凝胶中的氢键桥接的卵磷脂提出了相似的机制，其中脂质官能团展现对溶剂的亲合力和它们如何结合起来(Shchipunov YA，Shumilina EV.通过有机凝胶中的氢键桥接的卵磷脂.Mater.Sci.Eng.C-Biomimetic Mater.Sens.Syst.1995；3(1)：43-50)。
实施例4、在小鼠膀胱瘤(MBT)中紫杉醇从癸二酸-蓖麻油酸共聚物的体外和体内释放
研究基于癸二酸-蓖麻油酸共聚物和紫杉醇的可注射聚合物制剂对异向瘤模型的有效性。
方法与材料
如上所论述合成癸二酸-蓖麻油酸酯酐共聚物2:8。使用紫杉醇GMP级(BioxelPharma，QC，加拿大)、乙酸酐(Merck，达姆施塔特，德国)和Lutrol F68(Sigma，以色列)。所有的溶剂为得自BioLab(耶路撒冷，以色列)或Frutarom(海法，以色列)的分析纯溶剂，不经进一步纯化而使用。MBT(小鼠膀胱瘤)细胞为Hadassah Ein-Karem医院(耶路撒冷，以色列)的Ofer Gofrit医生的慷慨赠品。细胞培养基和胎牛血清(FCS)得自Beit-Haemek(以色列)。
在凝胶渗透色谱(GPC)系统上评估聚(酯-酐)的分子量，该凝胶渗透色谱系统由具有Waters 2410折光率(RI)检测器的Waters 1515等度HPLC泵、具有20微升环(Waters Ma)的Rheodyne(Coatati，CA)进样阀组成。用氯仿以1毫升/分钟的流速通过线性Ultrastyrogel柱(Waters；500孔径)洗脱样品。使用Breeze计算机程序，与分子量范围为500-10000的聚苯乙烯标准品(Polyscience，Warrington，PA)相比较，测定分子量。使用C18反相柱(LicliroCart R250-4，Lichrospher R100，5微米)，用高效液相色谱(HPLC[Hewlett Packard，Waldbronn，德国])系统测定缓冲溶液中的紫杉醇浓度，该HPLC系统由HP1100泵、HP1050紫外检测器和HP ChemStation数据分析程序组成。按流速1毫升/分钟使用65％乙腈：35％水的混合物作为洗脱剂，在230纳米处进行紫外检测。在室温(25+10℃)下用正相HPLC系统与STAR硅保护柱(4×4毫米，粒度5微米)(Merck，达姆施塔特，德国)一起测定聚合物骨架中的紫杉醇含量，该正相HPLC系统由
Figure A200680044382D00272
STAR硅分析HPLC柱(250×4毫米，粒度5微米)组成。流动相由不同比率(1％-2.5％体积/体积)的二氯甲烷(DCM)和甲醇(MeOH)组成。以1毫升/分钟的流速使用等度模式的洗脱。在两个波长240纳米和254纳米处进行紫外检测(Vaisman等，2005年)。
制剂的制备和体外药物释放
通过在室温下将聚合物和药物直接混合，来制备负载紫杉醇(5％和10％w/w)的聚合物制剂。将组合物混合直至形成光滑的糊。在室温下不加热将所有制剂装入注射器中。获得的制剂在室温下为可注射的半固体糊。通过在37℃和恒速转动(100RPM)时将10毫克的糊剂样品注入50毫升磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)中，进行体外药物释放研究。在加入至缓冲液之后不久，糊硬化为柔软的固体。定时地用新鲜缓冲溶液替换释放介质，用HPLC测定溶液中的紫杉醇浓度。所有实验均一式三份进行。
体外水解降解
通过在37℃和恒速转动(100RPM)时将25毫克的空白聚合物P(SA：RA)(2：8)或含紫杉醇(5％和10％，w/w)的制剂注入磷酸盐缓冲液(50毫升，0.1M，pH7.4)中，来评价体外水解。定时地用新鲜缓冲溶液替换介质。在每个时间点，从缓冲液中取出聚合物样品，称量湿重和在冻干之后称量干重。通过在残留的聚合物制剂中的(1)分子量减少和(2)紫杉醇含量监测聚合物的水解。在每个时间点，用NP HPLC检验制剂的降解样品中的紫杉醇含量。
制剂的体内降解
在整个实验过程中，将近亲繁殖的8-10周大的、重约20克的雌性C3H小鼠(Harlan实验室，以色列)保持在没有特异性病原体(SPF)的条件下，让C3H小鼠自由进食经辐照的无菌食品和酸化水。通过23G针，将空白聚合物和含紫杉醇(5％和10％w/w)的糊剂皮下注入每组4只、共12组C3H小鼠的背部空间。观察动物的局部毒性和全身毒性的体征和失重。在第1、7、21和70天之后，通过颈脱位法处死小鼠。将聚合物植入物取出，在冻干前后称重，检验在残留的制剂中的紫杉醇含量。位于耶路撒冷的希伯来大学伦理委员会(NIH批准号：OPRR-A01-5011)已审查了该动物研究的申请，发现它符合实验动物的护理和使用标准(伦理委员会-调查号：MD-80.04-3)。
体内抗肿瘤活性
MBT细胞的接种
在整个实验过程中，将近亲繁殖的8-10周大的、重约20g的雌性C3H小鼠(Harlan实验室，以色列)保持在没有特异性病原体(SPF)的条件下，让C3H小鼠自由进食经辐照的食品和酸化水。通过27号针将悬浮于0.1毫升RPMI培养基中的1×106MBT细胞经皮下注入小鼠的腰窝后侧。每隔1天使用卡尺测量肿瘤，使用以下公式计算它们的体积，在文献中描述了该公式：
长×宽×高×0.523
治疗方案
在MBT模型中，在接种之后的第8天，当肿瘤可触及和达到0.5厘米3时开始治疗。将小鼠随机分配至3个治疗组中的1个组(在每组中n＝10)中。2个对照组(在每组中n＝10)接受瘤内注射0.1毫升的空白聚合物或根本不治疗。第1治疗组瘤内注射0.1毫升的含5％紫杉醇的制剂(相当于250毫克/千克)，第2治疗组接受0.15毫升的该制剂(相当于375毫克/千克)，第三组接受0.15毫升的含10％紫杉醇的制剂(相当于750毫克/千克)。在实验期间只给小鼠注射1次。当肿瘤变得溃烂或当肿瘤引起无法接受的不适的时候，处死动物。
结果和讨论
紫杉醇的体外释放
通过如上所论述的熔融缩聚法，由纯度为98％的纯化的RA和纯度为99％的SA，制备Mw＝4000、Mn＝3500的聚合物载体-无规聚(SA:RA)2:8。聚合物的结构显示如下。
Figure A200680044382D00291
将紫杉醇加入聚合物(5％和10％ w/w)中而不影响聚合物的分子量或不与聚合物发生化学相互作用，如GPC和1H-NMR所证实。图5显示5％和10％紫杉醇从P(SA:RA)2:8释放的曲线。含5％紫杉醇的制剂在20天内释放20±1.4％的掺入的药物，而含10％的制剂释放8±0.8％。监测释放曲线60天。在该期间含5％紫杉醇的制剂释放40±0.5％的掺入的药物，而含10％的制剂释放其含量的16±0.3％。在释放研究期间保持渗透条件，释放介质中的紫杉醇浓度不高于其在缓冲液中最大溶解度(在缓冲液中的溶解度为约5μg/毫升)的10％。因为紫杉醇的疏水性，它从聚合物中的释放速率为聚合物负载的药量的函数：紫杉醇的负载越高，它的释放速率越慢。
体外水解降解
我们通过监测分子量和样品重量的减少，研究聚合物的水解。结果显示于图6。不含紫杉醇的聚合物的降解速率最快。在第1周，空白聚合物失去其初始重量的33±2％，然后逐渐降解，在40天之后它失去其初始重量的90.7±6.8％。负载紫杉醇的聚合物的降解速率较慢。含5％紫杉醇的制剂在第1周降解18±5％，在40天之后它失去78±4％，在80天之后只剩下制剂的6％。含10％紫杉醇的制剂在第1周降解13±5％，在40天之后它失去65±8％，在80天之后只剩下制剂的19％。空白聚合物和含紫杉醇的聚合物的分子量(Mw)减少是相似的。在将样品浸入缓冲液之后，在第1个3天期间它们的Mw从3900道尔顿降至1200道尔顿。在紧接着的25天期间，空白聚合物的分子量降至670道尔顿，而含紫杉醇的制剂的Mw保持在1070道尔顿，这主要是紫杉醇的贡献。含紫杉醇的聚合物的较慢的降解速率支持我们的早期的发现：紫杉醇保护聚合物，不允许水渗入、溶解药物和聚合物的降解产物。在另一方面，制剂的Mw减至几乎与空白聚合物的Mw一样。这表示：水仍可渗入聚合物骨架内，引起聚合物的水解。
含紫杉醇的制剂的失重比紫杉醇的释放速率快。在40天之后含5％紫杉醇的制剂失去其初始重量的78％(图6a)，而掺入的药物只释放35％(图6b)。发现10％制剂同样不成比例：在20天之后制剂失去其初始重量的27％(图6a)，而掺入的药物只释放8％(图6b)。这些结果与在降解的制剂中的紫杉醇累积相关(图6b)。在7天之后在降解介质中制剂的紫杉醇含量升高15±3.5％，在15天之后升高52±13％，在40天之后紫杉醇的含量几乎为其初始值的两倍(升高98±15％)。如前所述：较高的紫杉醇含量引起较慢的紫杉醇释放，但聚合物的骨架仍可被降解。
制剂的体内降解
通过失重评估注射制剂的体内降解程度(图7)。在体内1天之后，空白聚合物失去其初始重量的40±7％，负载5％紫杉醇的P(SA:RA)(2:8)失去31±5％，负载10％紫杉醇的P(SA:RA)(2:8)失去15±8％。注射之后7天空白聚合物完全降解，而到那时含紫杉醇的制剂失去其初始重量的一半(在含5％或10％紫杉醇的制剂之间没有见到显著的差异)，在70天之后它们从注射部位全部消除。没注意到在含紫杉醇的制剂的注射部位有任何活性炎症反应或组织刺激的证据。
体内抗肿瘤活性
用小鼠膀胱瘤(MBT)异养模型研究瘤内释放的紫杉醇的效力。在肿瘤细胞接种之后第8天开始治疗。在接种之后25天，处死未治疗的小鼠和注射空白聚合物的小鼠，因为肿瘤的体积超过17厘米3。然而，空白注射组的肿瘤体积较小(11厘米3对对照未处理组的17厘米3)(图8)。理论上说：将空白聚合物注入肿瘤，破坏它的结构，延缓它的发展。
存活和肿瘤尺寸的最好结果见于用0.15毫升的含5％紫杉醇的制剂治疗的组(100％存活，在肿瘤细胞接种之后30天所有小鼠均活着)和用0.15毫升的含10％紫杉醇的制剂治疗的组(75％存活)。用0.1毫升的含5％和10％紫杉醇的制剂治疗的组分别存活60％和50％。
在小鼠中的肿瘤生长进展见于图8。在所有治疗组(0.1毫升、0.15毫升的含5％紫杉醇的制剂，和0.15毫升的含10％紫杉醇的制剂)中，肿瘤尺寸是用空白聚合物治疗的组的1/4，是未治疗的组的1/5。该差异在统计上为显著的(p<0.001，t-Student检验)。通过目测检查未治疗小鼠和在肿瘤接种之后治疗20天的小鼠证实了这一点。
用于该研究的癸二酸-蓖麻油酸共聚物(2:8)为疏水性聚合物，由天然脂肪酸构成，可用于疏水性药物和亲水性药物的释放。该研究的目的为评估在小鼠异养模型中瘤内注射的紫杉醇-聚合物制剂的效应。在室温下，含紫杉醇的聚合物糊剂为粘稠的液体，该糊剂可通过23号针注射，它在与体液接触时胶凝。该制剂在原位形成半固体植入物，该植入物在注射部位局部释放药物。
对于所有制剂，体内降解和体内释放比体外快很多，因为在体内脂肪的降解产物从注射部位有效地消除，而在体外条件下，脂肪的降解产物保留，阻碍降解过程和药物释放。
实施例5、在黑素瘤中紫杉醇从癸二酸-蓖麻油酸共聚物的体外释放和体内释放
使用C57BL/6小鼠的黑素瘤异向模型，研究紫杉醇从瘤内注射的制剂的局部释放。在77天的时期内观察肿瘤发展的变化、存活时间和体重，以测定局部紫杉醇治疗的有效性。给有肿瘤的动物瘤内注射不同体积的含5％、10％、15％和20％紫杉醇的制剂。
用比率为20:80的生物可降解的聚合物癸二酸-蓖麻油酸共聚物(P(SA：RA))制备控释制剂。将聚合物P(SA:RA)20:80与5％、10％、15％和20％w/w负载的紫杉醇(Bioxel Pharma，Sainte-Foy，加拿大)混合。通过研磨在室温下制备混合物，然后汲入1毫升Luer lock注射器中，用23G针封闭，在-200℃下贮存直至使用。也将对照的聚合物(不含药物)装入1毫升的Luer lock注射器中。通过将100毫克紫杉醇与200毫克泊洛沙姆F-68(以1:2的比率)混合和加入700微升生理盐水，来制备用于瘤内注射的紫杉醇悬浮液。
从加拿大Charles River，St-Constant，Qc获得雌性C57BL/6小鼠(20-21g)。批号为1511548 p32(CRL-6223)的B16F1鼠细胞为Michel Page博士的慷慨赠品。最初从美国典型培养物保藏中心获得细胞。位于G1K7P4，加拿大(魁北克)，Sainte-Foy，1040区，Pavillon Agathe Lacerte，拉瓦勒大学的动物保护(de protection des animaux)区的秘书处同意了研究方案#2004-070。根据加拿大动物护理委员会(CCAC)提供的指南个别地检查请求。
B16F1细胞的接种
一旦动物适应了它们的环境，在肿瘤移植之前，将小鼠分成8组，通常每组十(10)只小鼠(在#8对照组中，11只小鼠)，其中小鼠的组间平均体重尽可能相等。给小鼠在肩胛骨水平皮下注射悬浮于100微升DMEM中的200,000个B16F1肿瘤细胞。早晨和晚上，每天两次，观察小鼠；每天称重小鼠，每天测量肿瘤，因为它们迅速地生长。在可检测到黑素瘤时，开始测量它们。根据标准公式评估肿瘤的体积：肿瘤体积(毫米3)＝(w2×1)/2，其中w＝肿瘤的宽度、1＝肿瘤的长度，单位为毫米。继续实验，当肿瘤重量达到体重的10％时或如伦理协议所述的，当不适变得不可接受时，处死小鼠。用CO2处死达到安乐死标准的小鼠。在安乐死之后，回收肺，目测肺转移的数目。进行简要的尸体解剖，以确定存在转移。
治疗方案
在肿瘤移植之后两天，小鼠接受治疗。两个阴性对照组(在每组中n＝10)瘤内注射0.1毫升的不含紫杉醇的聚合物P(SA:RA)(20:80)(#1组)，#8组完全不接受治疗。给第2-第5治疗组瘤内注射负载5％、10％、15％和20％紫杉醇的聚合物P(SA:RA)(20:80)(对于5％和10％负载，注射0.2毫升，对于15％和20％负载，注射0.1毫升)。给第6治疗组瘤内注射负载10％紫杉醇的紫杉醇悬浮液(0.1毫升)。在实验期间，小鼠仅注射1次。第7治疗组在第1、4、7和10天用腹膜内注射紫杉醇/Chremophor溶液的传统全身疗法治疗。当肿瘤变得溃烂，当它引起不可接受的不适或当肿瘤大小达到动物重量的10％时，处死动物。
统计分析
使用S-PLUS进行所有的统计分析。记录每只小鼠的存活时间，单位为天。考虑到右删失情况(用于研究结束之后的活的动物)，使用Kaplan-Meier方法获得治疗组的非参数性存活曲线。为了试验接受紫杉醇凝胶治疗的动物的存活时间是否具有统计上的显著差异，使用对数-秩(log-rank)检验比较各存活曲线。存活的相关的量度为两种治疗之间的危害比。危害提供在小单位的时间期间的死亡率，或提供在紧接着随后的时间间隔内死亡发生率的量度。为了评估治疗剂与安慰剂之间的危害比，用半参数Cox比率危害回归模型拟合数据。为量化紫杉醇剂量浓度在危害比上的效果和考虑在5个凝胶治疗内增加紫杉醇的浓度水平，用Cox比率危害模型拟合5个凝胶治疗。具体地说，我们希望模拟剂量作为连续变量对危害比的影响。此外，为解释在剂量与危害比之间的关系中的任何曲率，在模型中也包括剂量的平方术语。更确切地说，拟合模型为：
应为二次项       Log(危害比)＝a×剂量+b×剂量2
在模型中表现为统计上的显著性。如果最小值存在，可通过寻找曲线的最小值，确定提供最小危害比的在0％和20％之间的最佳剂量浓度。
对于所有统计检验，假定全局显著性水平α＝5％。对每个统计检验，每当发现整体治疗效果时，使用多重比较方法鉴定哪对治疗是统计上差异的。为解释多重检验，使用Tukey方法应用多重比较修正，以维持全局α水平为5％。考虑右删失情况(具有稳定的0肿瘤体积的动物)，使用Kaplan-Meier方法获得治疗组直至可检测肿瘤体积的时间的非参数性存活曲线。
结果与讨论
如上述，在治疗当天的各组平均重量值为20克。在治疗后的第1个10天期间，组间平均重量分布很窄。在实验的第1个10天之后，各组的重量增加是相对类似的，显示与治疗的类型不相关，因为具有显著肿瘤重量的小鼠的安乐死与剩余肿瘤的重量增加＂平衡＂。
0.8993的p值表明在α水平为0.05时，在相对体重上接受的治疗没有统计上的显著意义。这提供了正式的证据，以支持由描述的统计进行的观察，该观察提出相对体重不受所接受的治疗影响。
时间的效果单独对体重有在统计上显著的影响，其p值低于0.0001。这与图表一致，其中我们看到体重随时间而增加。
然而，更重要的为评估体重随时间的变化是否依赖所接受的治疗。换句话说，治疗与天数的相互作用是否显著。从ANCOVA表，我们看到未发现相互作用为在统计上不显著的，p值为0.4151。这表示时间对相对体重的影响不因治疗组而改变。
动物的存活率
各组的存活率见于图9。在#8组还有#1组中，存活最低，#8组为对照组，不接受任何形式的治疗，#1组仅接受不含紫杉醇的聚合物P(SA:RA)(20:80)。对于两组动物，在第13天开始死亡，在第20天小鼠全部死亡，平均存活时间(MST)为16天。在其治疗中接受紫杉醇的所有小鼠均表现出高于对照组的MST，说明治疗没有急性毒性。
用聚合物P(SA:RA)(20:80)治疗的组，MST分别为16、22、35、18和20.5，紫杉醇的浓度分别为0％、5％、10％、15％和20％。最后，用紫杉醇/泊洛沙姆F68悬浮液和市售的紫杉醇(在生理盐水中)经IP给药治疗的小鼠，MST分别为18天和19天。重要的是，#6组(紫杉醇/泊洛沙姆F68悬浮液)表现出＂双峰的＂死亡曲线。的确，首先该组的6只小鼠快速死亡，而剩余的4只具有显著增加的存活期。表4概括了所有组的治疗和相应的MST。
表4：在小鼠存活上的治疗效果的总结
 
组 制剂混合物 紫杉醇(％) 平均存活时间(天)
1 P(SA:RA)(20:80) 0 16
2 P(SA:RA)(20:80) 5 22
3 P(SA:RA)(20:80) 10 35
4 P(SA:RA)(20:80) 15 18
5 P(SA:RA)(20:80)0 20 20.5
 
6 *紫杉醇/泊洛沙姆F68 10毫克/0.1毫升 18
7 (乙醇49.7％-Chremophor EL)用生理盐水稀释 *在D1、D4、D7和D10的紫杉醇(给予20毫克/千克，0.4毫升的溶液) 19
8 无 不给予药物 16
不能清楚地确定紫杉醇的注射量和存活之间的相互关系。然而，在聚合物P(SA:RA)(2:8)中负载和释放的紫杉醇对存活的效力是显著的。的确，在未治疗组中没有小鼠存活(最大存活时间为23天)，而在治疗组中在77天之后5组中有很健康的小鼠(#3组＝3只小鼠；#4组＝1只小鼠；#5组＝1只小鼠)。
对所有治疗组进行对数-秩检验，以确定治疗对存活时间是否有整体效果。统计检验显示治疗对存活时间有高度显著的效果，卡方值为32，p值为0.00004。
为确定哪对治疗为在统计上差异的，在所有的治疗对组合上，进行对数-秩检验。对多重比较应用Tukey(真正地显著差异)调节，以确保维持全局α水平5％。在该方法下，每个比较的修正的α水平为0.002或0.2％。
表3报导对数-秩检验的p值。用星形标记的粗体的值，其中p值低于0.002，表明发现治疗组对具有统计上差异的存活分布。在4种负载紫杉醇的聚合物治疗中，只有5％和10％浓度被认为具有对安慰剂统计上差异的存活曲线。此外，10％和20％剂量浓度与0％浓度显著差异，0％浓度治疗组与安慰剂对照组最相似。在5％至20％活性紫杉醇凝胶治疗内，没有检测到存活差异。总之，只在活性剂治疗(10％、20％凝胶治疗)和无活性剂治疗(0％凝胶治疗和安慰剂)之间发现统计上显著的差异。
肿瘤生长
在治疗之后的每组的肿瘤生长速率见于图10。最高肿瘤大小报导于在其治疗方案中不接受紫杉醇的对照组。在#8组(不治疗)中在第20天肿瘤大小为3.6克，在#1组(不含紫杉醇的P(SA:RA)(20:80))中肿瘤大小为2.5克。在用负载紫杉醇的聚合物治疗的所有组中，肿瘤大小比空白聚合物或非治疗组的小很多，范围为1.3-0.3克(图11)。
从该数据，我们可观察：
·活性剂治疗呈现比安慰剂或0％紫杉醇治疗长的潜伏期，即在肿瘤大小开始增加之前的时间
·5％、10％、15％和20％紫杉醇-聚合物治疗的肿瘤体积增长率似乎比其它治疗更慢
·对于5％、10％、15％和20％紫杉醇聚合物的治疗以及紫杉醇/泊洛沙姆F68的治疗，观察到不可检测的小鼠肿瘤生长
在可检测的肿瘤体积之前的时间(单位为天)内的描述统计显示：
·在10％紫杉醇凝胶治疗组中，出现大部分的小鼠具有连续不可检测的肿瘤体积
·最高时间中值即26.5天，也发生于10％剂量
·在安慰剂和0％剂量组中的变异系数(CV)比活性剂治疗的变异系数更低。
·这可通过以下事实解释：活性剂治疗组内的动物趋向于不同地反应；但是在对照组中的行为更一致
与存活曲线一致，10％紫杉醇凝胶治疗看来在提供最长存活时间上胜过其它的治疗。此外，安慰剂对照和0％紫杉醇凝胶治疗对应于最陡的存活曲线，意味着在整个时间内零级肿瘤生长的可能性相当迅速。
为了比较治疗，拟合了Cox危害比模型，以检验对危害的处理效果。参考安慰剂对照，将估计的危害比呈现于下面的输出中。从输出中，我们发现每个治疗和安慰剂之间的危害比为统计上显著的(p值<0.05)。当与其它结果一致时，表现最高的危害减少的治疗为10％紫杉醇凝胶治疗，其危害为安慰剂的0.0338倍。此外，在发展可检测的肿瘤体积的危害中，5％和15％紫杉醇凝胶治疗提供相似的减少，危害比为安慰剂的0.0933倍和0.0907倍。
1个组也没有显示在治疗之后的体重减轻。这是治疗的低毒性的重要指征，显示可注射至少100微升的20％紫杉醇制剂(组5，20毫克紫杉醇)。在治疗时动物是健康的，如在治疗后的10天中体重的恒定增加所表明的。在治疗之后在所有组中体重保持稳定地增加。然而，用含紫杉醇的凝胶治疗的小鼠皮肤的溃疡清楚地证明显著的局部毒性。该毒性可与聚合物在周围组织产生的压力相关，该周围组织变得更少由血管灌注，因此增加药物的局部毒性水平。
尽管含紫杉醇的凝胶遭遇溃疡问题，很明显药剂对小鼠的存活具有显著有益的效果，例如在用含10％紫杉醇的聚合物P(SA:RA)(20:80)治疗的#3组中的30％的小鼠，在77天之后仍然存活，而在对照组中没有1只存活超过23天。重要的是，没有观察到全身毒性。存活和药物浓度的相互关系不如预期的美好，但可能必须考虑在用凝胶制剂治疗的小鼠中观察到的局部毒性。在治疗组中存活和剂量之间缺乏相互关系的另一原因可与以下事实有关：与制剂的缓慢药物释放相比，所选择的用于研究的肿瘤模型为相对快速生长的肿瘤。较慢生长的肿瘤模型可能更好地代表临床治疗。
聚合物的外观
重要的是，在第1个尸体解剖时观察到：在肿瘤附近的聚合物具有与注射的聚合物很相似的外观。然而，在几天以后聚合物似乎变硬，质量减少。另外，组织周围的负载紫杉醇的聚合物正在转化、降解。
实施例6、在前列腺腺癌中紫杉醇从癸二酸-蓖麻油酸共聚物的体外释放和体内释放
该研究的目的为：评估含紫杉醇的可注射聚合物糊剂对抗在大鼠中的原位前列腺肿瘤的效力。在室温下，将负载紫杉醇的聚合物注入接种肿瘤细胞之后3天的大鼠有肿瘤的前列腺中。Dunning　R-3327大鼠前列腺腺癌是用于研究肿瘤进展的人相应物的相应实验肿瘤模型。在我们的研究中，我们使用MatLyLu亚系，它具有最大的局部侵害性潜力和转移性潜力。
如前所述合成癸二酸-蓖麻油酸酯酐共聚物(2:8)。使用紫杉醇GMP级(Bioxel Pharma，QC，加拿大)、乙酸酐(Merck，达姆施塔特，德国)、Lutrol　F68(Sigma，以色列)和Chremophor EL　50％(Sigma，以色列)。所有溶剂为分析纯，得自BioLab(耶路撒冷，以色列)或Frutarom(海法，以色列)，不经进一步纯化而使用。
在注射当天，用胰蛋白酶/EDTA从组织培养瓶中转移肿瘤细胞(Dunning肿瘤、MatLyLu亚系)。在细胞的胰蛋白酶化(1分钟)之后，加入4毫升RPMI 1640。将肿瘤细胞离心，在PBS中洗两次，计数，以3个最终浓度再悬浮于RPMI 1640培养基中而不补充：1×105、3×105和5×105活肿瘤细胞/毫升。
在整个实验过程中，将初始体重为220-240克的雄性哥本哈根大鼠(n＝12)(Harlan实验室，以色列)保持在无特异性病原体(SPF)的条件下，让哥本哈根大鼠自由进食经辐照的无菌食品和酸化水。为建立原位模型，将哥本哈根大鼠分成3组，麻醉(氯胺酮/甲苯噻嗪，IP)。将下腹部剃毛，在耻骨上方做横切口。分开腹肌，提起肠，暴露膀胱下方的前列腺腹叶。如下使用1毫升胰岛素注射器和26G针，将悬浮于50微升中的不同数量的MatLyLu细胞注入腹叶：
·组1：悬浮于50微升RPMI 1640培养基中的8×103个细胞；
·组2：悬浮于50微升RPMI 1640培养基中的1.5×104个细胞；
·组3：悬浮于50微升RPMI 1640培养基中的2.5×104个细胞；
用3/0薇乔(vicryl)缝合线缝合腹肌，用3/0丝缝合皮肤。3天后(从初步研究获得)处死大鼠。进行其前列腺、肝和肺的组织病理学评价，以确定肿瘤发展的存在和程度。
制剂的制备
通过在室温下将聚合物和药物直接混合，制备负载10％ w/w紫杉醇的聚合物制剂。将组合物混合直至形成光滑的糊。在室温下不加热将所有制剂装入注射器中。获得的聚合物制剂在室温下为可注射的糊。
通过以1:2的比率将紫杉醇和泊洛沙姆F68混合，制备紫杉醇的悬浮液，然后将混合物分散于生理盐水中，以获得7.5％重量/体积的紫杉醇浓度。泊洛沙姆F68是用于悬浮低水溶性药物如紫杉醇的悬浮剂。给每只大鼠瘤内注射250微升的悬浮液。
为了制备紫杉醇的肠胃外溶液，将药物溶于50％乙醇/50％Chremophor EL中，以获得6毫克/毫升的紫杉醇浓度。然后用生理盐水稀释溶液，以获得1.2毫克/毫升的紫杉醇溶液。每只大鼠IP注射4毫升的稀释溶液。
肿瘤的接种与治疗
在整个实验过程中，将初始体重为220-240g的雄性哥本哈根大鼠(n＝26)(Harlan实验室，以色列)保持在无特异性病原体(SPF)的条件下，让哥本哈根大鼠自由进食经辐照的无菌食品和酸化水。为了建立原位模型，将哥本哈根大鼠分成5组，麻醉(氯胺酮/甲苯噻嗪，IP)，如上所述操作。如下使用胰岛素注射器和26G针将肿瘤细胞(悬浮于50微升的8×103个MatLyLu细胞)注入腹叶。用3/0薇乔缝合线缝合腹肌，用3/0丝缝合皮肤。每2天监测动物的体重。在肿瘤细胞注射之后3天开始治疗。将负载药物的聚合物和紫杉醇悬浮液注入在前列腺腹叶中的生长的肿瘤中。每3天IP注射肠胃外紫杉醇治疗各组大鼠。表5描述实验的时间表，表6描述治疗组。
表5.实验时间表的总结
 
天 治疗 备注
0(D0) Mat-Lylu肿瘤细胞的植入(8×103/50微升) 用(氯胺酮/甲苯噻嗪，IP)麻醉大鼠，将悬浮于50微升培养基中的肿瘤细胞注入前列腺中
3(D3) 给予各种治疗
4(D4-D35) 每天观察大鼠 每天称重大鼠
表6.治疗组的总结
 
组 大鼠数目 制剂 每只大鼠的注射体积/紫杉醇量 备注
1 5 未治疗 -
2 5 *紫杉醇/泊洛沙姆F68 250微升/20毫克 瘤内，1次治疗
3 5 P(SA:RA)2:8+10％紫杉醇 200微升/20毫克 瘤内，1次治疗
4 4 **紫杉醇/乙醇50％-生理盐水稀释的Chremophor EL 50％ 4毫升/4.8毫克(约20毫克/千克) IP，每3天3次治疗
观察动物的全身毒性和失重的体征。在耶路撒冷的希伯来大学伦理委员会(NIH批准号：OPRR-A01-5011)已审查了该研究，发现它与实验动物的护理和使用标准(伦理委员会-调查号：MD-80.04-3)相一致。
宏观的肿瘤计算
在从动物收获之后，切除肿瘤，使用如下所示的公式进行肿瘤体积的宏观计算
V＝(长度×高度×宽度)×π/6。
组织学分析
切除所有动物的肿瘤，测量，固定于4％甲醛溶液中。为了组织学评价，将组织切片处理入石蜡中，用苏木紫与曙红将3微米切片染色。检验参数为坏死总面积、包膜形成、炎性细胞浸润和瘤内血管的含量。
统计分析
通过Kaplan-Meier方法计算存活分布和存活期中值，使用对数-秩检验比较。对于所有试验，认为P值低于0.01为显著的。
结果与讨论
很好地耐受外科手术和肿瘤细胞注射，在两个手术：肿瘤细胞接种和3天后给予的治疗之后，唤醒所有的大鼠。通过肿瘤细胞注射，在所有的大鼠中成功地植入原位肿瘤，如组织学检查所证实。应注意：许多亚系可引起不同生长率、分化、激素响应和转移能力的DunningR-3327大鼠前列腺腺癌。在我们的研究中，我们使用MatLyLu亚系，它具有最大的局部侵害性潜力和转移性潜力。
动物模型校准
将递增浓度的肿瘤细胞注入3组大鼠的前列腺中。因为MatLylu亚系的侵害性，选择最佳的最少量的细胞，该细胞导致稳定的但还可治疗的肿瘤。如先前报道，在所有的前列腺内注射的动物中，形成肿瘤的MatLyLu细胞的最少量为5×103个细胞。在这些结果之后，我们使用相似浓度的细胞，以确信肿瘤确实在注射的前列腺中生长。另一方面，当给大鼠前列腺内注射2×105(数据未显示)时，获得的肿瘤是巨大的、不可治疗的，在接种细胞后2周内，所有的大鼠均死亡。
在接种肿瘤细胞之后3天处死大鼠。分离前列腺、肺和肝，送至组织病理学评价。在接种肿瘤细胞之后3天，在前列腺中有明显的肿瘤；然而，在所有组中通过宏观观察没有发现转移。在注射之后3天的大鼠的前列腺中，前列腺癌的组织病理学显示前列腺癌的多发病灶。在组织学评价期间，在肝和肺中没有发现转移。因为在3天之后，肿瘤细胞的所有注射量(8×103、1.5×104和2.5×104)成功地引起肿瘤，所以决定注射8×103个肿瘤细胞，3天后治疗动物。
存活与体重减轻
在癌细胞的前列腺内滴注中，肿瘤形成很快，在所有的大鼠中均为致命的。大鼠的存活见于表7。
表7
 
组 制剂 存活期中值 肺转移 肝转移
 
[天](范围)
1 未治疗 24(21-25) 4/4 4/4
2 紫杉醇/泊洛沙姆F68 25 4/4 4/4
3 P(SA:RA)2:8+10％紫杉醇 32.2(21-35) 0/5 0/5
4 紫杉醇/乙醇50％-生理盐水稀释的ChremophorEL 50％ 17(9-25) 2/4 2/4
大鼠的最短存活期是在用紫杉醇的肠胃外制剂治疗的组中-在第2次剂量之后、在接种肿瘤细胞后9天，50％的接受治疗的动物死亡。在实验期间这些大鼠也减轻体重(图11)，这意味着药剂的全身毒性引起它们的死亡和发病。最长存活期是在用200微升的负载10％w/w紫杉醇的聚合物进行瘤内治疗的组中。仅1只大鼠在接种肿瘤细胞之后3周死亡，而所有其它的大鼠存活至研究结束-接种肿瘤细胞之后35天。在非治疗组中，1只大鼠在接种肿瘤细胞之后3周死亡，所有其它的大鼠在3天后(在接种肿瘤细胞之后第25天)死亡。紫杉醇/泊洛沙姆悬浮液的瘤内注射不引起全身毒性，因为在瘤内注射之后紫杉醇聚集在注射部位。另一方面，该制剂没有延长大鼠的寿命-所有大鼠在接种肿瘤细胞后25天死亡。
在尸体解剖时，具有大肿瘤(直径>3厘米)的所有动物显示显著的内部出血，由于肿瘤侵入主要的血管，或由于高度血管化的原发瘤的破裂。另一方面，聚合物/紫杉醇治疗组的大鼠比其它大鼠晚10天死亡，同时具有相对小的肿瘤。我们相信输尿管梗阻引起它们的死亡，因为在尸体解剖时，既没有见到转移也没有见到内部出血。从失重曲线知道，显然在第1个5天内所有的大鼠减轻其体重(图12)。该重量减轻可能由大鼠遭受的手术和外伤引起。从第5天开始，除了用紫杉醇IP肠胃外治疗之外的所有治疗组的大鼠，开始增加其重量，在这些组之间无统计上的差异。仅全身治疗引起统计上显著的重量减轻-从231g至203g和50％＂太早的＂死亡病例。
淋巴结、肺和肝转移
在尸体解剖时，在有肿瘤的动物中，淋巴结转移是明显的和可见的(表8)。
表8存活率中值和肺转移、肝转移的总结
 
组 制剂 存活期中值[天](范围) 肺转移 肝转移
1 未治疗 24(21-25) 4/4 4/4
2 紫杉醇/泊洛沙姆F68 25 4/4 4/4
3 P(SA:RA)2:8+10％紫杉醇 32.2(21-35) 0/5 0/5
4 紫杉醇/乙醇50％-生理盐水稀释的Chremophor EL 50％ 17(9-25) 2/4 2/4
大鼠具有粗大的骨盆淋巴结和腹膜后淋巴结连累，淋巴结尺寸最高至0.6厘米。如表8所示，所有未治疗动物和瘤内注射紫杉醇悬浮液的动物均显示在肺和肝中的转移。用紫杉醇肠胃外制剂治疗和接种肿瘤细胞后9天死亡的大鼠没有发展转移(可能因为它们死亡得太早)，但其它两组大鼠发展了在肺和肝中的转移。在用200微升的聚合物/紫杉醇制剂瘤内治疗的大鼠中没有发现转移。
肿瘤体积
图12显示在不同的治疗组中有肿瘤的前列腺的体积。在未治疗组中，1只大鼠在接种肿瘤细胞之后21天死亡，前列腺的体积为11.83厘米3，其它的大鼠在第25天死亡，前列腺的体积为14.8±1.08厘米3。在用肠胃外紫杉醇治疗的组中，死亡为双峰的：一半的大鼠在9天之后死亡，前列腺体积为14.18厘米3，其它的大鼠在25天之后死亡，前列腺体积为13.65±0.26厘米3。较好的结果在紫杉醇悬浮液瘤内注射治疗的组中：所有大鼠在25天之后死亡，前列腺体积为6.6±0.7厘米3。由聚合物/紫杉醇治疗获得最好的结果，其中1只大鼠在21天之后死亡，前列腺体积为0.845厘米3，其它的大鼠存活最长的时间，在35天之后死亡，前列腺体积为0.862±0.16厘米3，而注射了200微升聚合物的健康前列腺的体积为约0.4厘米3。
对聚合物/紫杉醇组第35天和所有其它组第25天的前列腺进行比较，清楚地显示在组之间的宏观差异。
组织病理学评价
虽然评估了所有上述参数，但证明组间差异的唯一参数为瘤内坏死。所有其它评估的参数没有显示组间的任何差异，因此没有提供该数据。在未治疗组中，全部瘤内坏死的百分比很低(10-20％)。在用紫杉醇悬浮液治疗的组中，全部瘤内坏死的百分比是相似的(10-15％)，只有1个肿瘤显示较高的坏死-50％。在用紫杉醇悬浮液的肠胃外制剂治疗的组中，没有发现瘤内坏死，而在用负载10％紫杉醇的聚合物治疗的组中，发现全部瘤内坏死中的最高百分比(25-70％)。此外，在接种肿瘤细胞后10天，处死聚合物/紫杉醇组的3只大鼠，将它们的前列腺送至组织病理学评价。观察到多个区域的间质性坏死和腺内坏死以及急性炎症。然而，没有前列腺癌的明显存在。
在所有未治疗的大鼠中(4组中的#1、4组)、在用紫杉醇悬浮液瘤内治疗的所有大鼠中(4组中的第2、4组)、在用肠胃外制剂治疗的所有大鼠中，在肝和肺中发现了转移，在用200微升的聚合物/紫杉醇制剂治疗的大鼠中，没有发现转移。
应强调：我们的发现(即在组间瘤内坏死数量的显著差异)与文献报道的相一致，该文献用暴露于雌氮芥和依托泊苷的相同模型。
先前我们已描述生物相容的、生物可降解的和可注射的聚合物凝胶的有效应用，该聚合物凝胶剂用于部位直接释放抗肿瘤药如紫杉醇。用于该研究的聚合物凝胶剂在室温下为粘稠的糊，可通过小号针(23G)注射，它在体内1小时凝固。该凝胶形成在注射部位局部释放药物的控释植入物。体内研究显示紫杉醇释放超过3-4周，在这期间植入物全部降解。
Dunning大鼠MatLyLu前列腺癌在许多方面类似于抗激素的、转移的人前列腺癌。虽然实验操作容易接近在异位引起的肿瘤，但这样的肿瘤与它们的解剖起源不相配。已知癌细胞在它们的天然环境之外与它们在其起源器官之中的行为表现相当不同。
在该研究中我们在Dunning模型中评估含紫杉醇的聚合物瘤内注射的效力。原位模型使我们能象癌症在真实生活中发生一样，在癌症自己的环境中治疗癌症。该动物模型可反映复发性前列腺癌患者的潜在治疗方法。由于在体外和体内被证明的MatLyLu肿瘤细胞凋亡的诱导，而产生紫杉醇/聚合物制剂的治疗效果。我们使用MatLyLu亚系，该亚系为在Dunning前列腺癌模型中最具侵害性和高度转移性的亚系。在校准该模型之后，我们发现肿瘤细胞的最佳数量，以产生可治疗的原位肿瘤的同质生长。我们的结果显示：与对照组或全身治疗相比，200微升聚合物/紫杉醇制剂的一种瘤内给药，能够以显著的方式，减少哥本哈根大鼠的MatLyLu细胞Dunning前列腺癌的肿瘤生长。用紫杉醇悬浮液瘤内治疗也稍微减小肿瘤体积，但不如聚合物/紫杉醇制剂那样好，不延长动物的寿命。在瘤内注射悬浮液之后，水消除，仅紫杉醇粉末留在注射部位。该粉末形成饼(如在大鼠的尸体解剖时所见到的)。当许多紫杉醇从该饼溶解时，足以在周围引起一些坏死，但不足以防止所有肿瘤的进展和转移。另一方面，当将相同体积的含10％w/w紫杉醇的聚合物制剂注入肿瘤时，聚合物在注射部位驻留数周。制剂降解，从相当大的植入物表面释放紫杉醇。当所有前列腺充满制剂时，停止肿瘤的进展和转移的形成。因此，最好的治疗为瘤内注射200微升的聚合物/紫杉醇制剂。该治疗将大鼠的寿命延长10天，肿瘤体积是其它的1/18，肿瘤组织的坏死率显著较高，没有发现转移。
在无辅助全身治疗的晚期人前列腺癌中，假如有延长生存的任何办法，则很少做去除前列腺的手术。当前缺乏有效的辅助治疗，强调用新的实验治疗方式，增强手术的必要性。使用局部释放抗癌药物的可注射的生物可降解糊，可解决该问题。
实施例5：添加剂对药物释放的影响
这项研究的目的是通过将蓖麻油酸、磷脂、PEG 400和PEG 2000掺入聚合物-药物制剂中而不影响紫杉醇从制剂中释放，而进一步降低粘度，并改善聚(SA:RA)(3:7)-紫杉醇制剂的注射能力。通过在室温下直接混合所有组分，来制备制剂，三个步骤进行：a)通过研磨，将紫杉醇(5％和10％ w/w)与添加剂(PEG或磷脂)混合；b)将蓖麻油酸(20％w/w)加入到混合物中；c)通过研磨，将混合物掺入P(SA:RA)(30:70)聚合物糊中。将组合物混合，直到形成光滑的糊。从第2步开始用同样的方案制备不含紫杉醇的制剂。制备以下制剂：a)含紫杉醇(5％和10％ w/w)或不含紫杉醇的P(SA:RA)3:7+20％蓖麻油酸(RA)；b)含紫杉醇(5％和10％ w/w)或不含紫杉醇的P(SA:RA)(3:7)+20％蓖麻油酸(RA)+5％磷酯(PL)；c)含紫杉醇(5％和10％ w/w)或不含紫杉醇的P(SA:RA)3:7+20％蓖麻油酸(RA)+5％聚(乙二醇)400(PEG 400)；d)含紫杉醇(5％和10％ w/w)或不含紫杉醇的P(SA:RA)3:7+20％蓖麻油酸(RA)+5％聚(乙二醇)2000(PEG 2000)；以及作为对照品的含紫杉醇(5％和10％ w/w)或不含药物的不含添加剂的P(SA:RA)3:7。在室温下不进一步加热，制备所有的制剂，并将所有的制剂填充于注射器中。所得制剂在室温下为半固体糊，可注射。通过将10毫克的糊剂样品注入50毫升的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)中，在37℃下恒速搅拌(100RPM)，进行体外药物释放研究。加入缓冲液中不久之后，硬的糊变成软的固体。定期用新鲜的缓冲溶液替换释放介质，用HPLC测量溶液中的药物浓度。所有实验一式三份进行。
体外水解降解
通过将25毫克空白聚合物或具有含紫杉醇(5％和10％，w/w)的添加剂的糊剂注入磷酸盐缓冲液(50毫升，0.1M，pH7.4)中，在37℃下、以恒速搅拌(100RPM)，评价体外水解。定期用新鲜的缓冲液替换介质。在每个时间点，从缓冲液中取出聚合物样品，称量湿重和冻干后的干重。用样品的失重来监测聚合物的水解。
结果
加入到聚合物P(SA:RA)(3:7)中的选择的添加剂是蓖麻油酸、卵磷脂、PEG 400和PEG 2000。通过22G针而不加热，可轻易地注射与聚合物均匀共混的这些添加剂和具有负载紫杉醇(5％和10％ w/w)的添加剂的制剂。
凝胶渗透色谱(GPC)用于测量加入20％ w/w蓖麻油酸之前和之后的P(SA:RA)(3:7)的分子量。在将20％ w/w蓖麻油酸加入至聚合物之后，聚合物的分子量保持不变，在8分钟之后看见与它的分子量(300克/摩尔)相对应的蓖麻油酸峰。IR光谱显示：在加入添加剂和/或紫杉醇之后，对应于酐健(1817cm-1)的峰没有改变。
将20％蓖麻油酸加入至聚合物P(SA:RA)(3:7)中，引起制剂变得更软，允许在室温下不用额外加热，通过22G针注射含5％和10％紫杉醇的制剂。将紫杉醇分散在聚合物中，以得到均匀的制剂。
实施例7：肽和蛋白质的释放
众多的肽和蛋白质治疗剂已被批准或处于临床测试的后期阶段。已对用于肽和蛋白质控释系统的聚合物进行了广泛的研究。该工作的大部分已集中于PLGA。不幸地是，PLGA的本体降解造成了酸性芯，可破坏pH敏感的药物如肽和蛋白质。侵蚀表面的聚合物如聚酐，通过增加远离粒子的可溶性片段的扩散速率，来减轻酸性累积的影响。本文描述的液体和糊状聚合物用于肽和蛋白质的释放。使用糊状药物释放系统的优势为：通过在室温下，在没有任何有机溶剂、加热或剪切力时，通过在聚合物糊中药物粉末的简单混合，容易地掺入药物。
下列的肽和蛋白质用于该研究：使用亮丙瑞林(1270道尔顿)、奥曲肽(1019道尔顿)、牛血清白蛋白(BSA)(68000道尔顿)、胰岛素(5860道尔顿)、白介素(53000道尔顿)和干扰素α-2a(IFN-α)(19000道尔顿)。得自以下商业来源的肽：亮丙瑞林和奥曲肽(Novetide有限公司)、胰岛素(Protein Delivery有限公司)、牛血清白蛋白(Intergen公司)、干扰素a-2a(Roferon 
Figure A200680044382D00491
F.Hoffmann-La Roche有限公司，巴塞尔，瑞士)、白介素(Chiron B.V.，阿姆斯特丹，Niderlands)和Folin-Ciocalteu氏苯酚试剂(Sigma-Aldrich)用于该研究。
用HPLC(Hewlett Packard，德国，瓦尔特布隆)系统测量缓冲溶液中的LHRH和奥曲肽的浓度，该HPLC系统由HP1100泵、HP1050紫外检测器和HP ChemStation数据分析程序组成，使用C18反相柱(Lichro
Figure A200680044382D00493
 250-4，
Figure A200680044382D00494
 100，5微米)。用乙腈：TEAP缓冲液(pH3，0.01M)3:7体积/体积洗脱LHRH，在λ＝278纳米处检测。用乙腈：PBS(pH7.4，0.02M)洗脱奥曲肽，在λ＝218纳米检测。用Lowry蛋白质分析法测定缓冲溶液中的BSA、胰岛素、IFN-α和干扰素的浓度。
在室温下，在研钵中将肽和蛋白质分别磨成细粉末。将药物粉末与P(SA:RA)2:8或3:7混合，直至达到均匀的糊。为了研究肽从聚合物中的释放，制备20毫克的负载10％ w/w亮丙瑞林和奥曲肽的P(SA:RA)(2:8)样品，相同重量的空白聚合物样品。在37℃下，用轨道式摇床(100RPM)，在15毫升pH7.4、0.1M的磷酸盐缓冲溶液中温育样品。取出2毫升的样品，用HPLC分析。每隔48小时替换缓冲溶液，以避免肽饱和和溶液的混浊。在生理条件下的聚合物降解40天之后，进行失重测定和GPC分析。
蛋白质从以下聚合物中释放：制备50毫克的负载10％ w/w BSA的P(SA:RA)(2:8)样品和50毫克负载5％w/w胰岛素的P(SA:RA)(3:7)样品，在20毫升的缓冲液中温育；制备20毫克负载5％白介素的P(SA:RA)(3:7)样品和20毫克负载5％ IFN-α的P(SA:RA)(3:7)样品，在10毫升的缓冲液中温育。每隔48小时从介质中取出0.2毫升的样品，依照Lowry分析法用Folin-Ciocalteu氏试剂温育，用紫外分光光度计分析。每隔48小时替换缓冲溶液，以避免蛋白质饱和和溶液的混浊。结果显示于图13中。
选择用于该研究的聚合物是P(SA:RA)，比率分别为2:8和3:7w/w，平均分子量分别为12000和18000。聚合物在1732cm-1和1817cm-1处有出两个IR酐峰。在1732cm-1的峰也可能涉及酯键。在1700cm-1(C＝O)和3500cm-1(O-H)处没有出现游离酸的峰。通过在3.613ppm处CH-OH峰的消失和在4.853ppm处CH-O-CO峰的出现，NMR光谱证实所有RA均插入PSA链中。
通过失重和分子量的改变来研究负载10％ LHRH和奥曲肽的P(SA:RA)(2:8)的水解降解。在空白和肽聚合物之间的分子量减小方面无显著差异。LHRH和奥曲肽不断地从胶凝化的聚合物中释放，持续超过40天，HPLC监测。
实施例8：用于布比卡因局部麻醉药释放的液体聚合物
手术后的疼痛被认为是患者和手术后愈合过程的主要问题。目前的方法包括多次注射短效局部麻醉药溶液，该方法耗时，需要昂贵的设备和密切的监测。较少侵入的方法一般有效性较低。在该领域中，对手术后的疼痛有效治疗的缺乏突出了对新的治疗法的迫切需要。可选择的方法是通过控释的可注射的植入物，局部给予高剂量的局部麻醉药剂，它可以延长局部麻醉药剂的作用数天或甚至数周。这种定点药物释放系统可提供药物的有效剂量，可避免与全身制剂的重复使用相关的全身毒性。
植入物的制备和体外药物释放
通过在40℃下将药物粉末混合入聚合物中，将布比卡因游离碱(5％、7％、10％ w/w)掺入液体聚合物中，并用该制剂填充1毫升注射器。该制剂在室温下是半固体，在体温下是液体。通过将100毫克的半固体制剂注入50毫升的分散介质(磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)中，在37℃和恒速转动(100RPM)下，进行体外药物释放的研究。为了模拟体内的漏槽状态，使用了大体积的分散介质，因此布比卡因的浓度从未超过其最大溶解度的10％。定期用新鲜的缓冲溶液替换释放介质，并用HPLC测量溶液中的药物浓度。所有实验均一式三份进行。类似地，用类似的方法将盐酸布比卡因掺入聚合物中。布比卡因游离碱在聚合物中形成澄清溶液，而盐酸盐是细粉分散体。
动物
使用重量为40g的雌性ICR小鼠。每10只小鼠养在1个笼子里，自由进食食物和水。动物房周期性照明(12小时照明，12小时黑暗)，温度为22℃。在坐骨神经的鉴定和制剂的注射期间，用氟烷(1.5-2％)麻醉动物。用神经刺激器(StimuplexR 22G直径，B.Braun Melsungen AG，德国)鉴定神经。每个动物的一边接受含布比卡因(10％w/w)聚合物的单次注射(0.1毫升)，对侧的一边接受相应的空白聚合物或盐水溶液。
聚合物制剂的毒性和消除
对主要器官的炎症、感染和坏死，以及使用聚合物药物治疗的坐骨神经和对照进行了死后的组织学评价。在完成了布比卡因效力的实验后，用4％的水合氯酸(0.2毫升)将动物麻醉，从心脏中抽取血液，在通过肺部刺穿将动物处死后，切离主要的器官(心脏、肺、肝脏、脾、脑、左坐骨神经和右坐骨神经)，放置于10％的甲醛溶液以固定。然后，将组织埋入石蜡中，用苏木精-曙红染色。在希伯来大学哈达撒医院动物房，在病理学者的辅助下，使用光学显微镜进行组织学评价。依照已知的方法测定小鼠血液中的布比卡因浓度。简而言之，使用1.5毫升的庚烷-醋酸乙酯(9：1，体积/体积)提取0.5毫升的小鼠血浆，震荡2分钟。在1200g离心10分钟之后，将有机相转移入圆锥管中。在加入100微升的0.05M硫酸和震荡2分钟之后，进行第二步提取。在1200g离心5分钟后，丢弃有机相，将100微升的DDW加入到50微升的酸碱水溶液中。将100微升等分试样注入色谱仪中。色谱系统由HP1100泵、HP1050紫外检测器、HP ChemStation数据分析程序组成，装备有C18反相柱(LichroCartR 250-4，LichrospherR 100，5微米)。流动相为乙腈和0.01M磷酸二氢钠的pH2.1的混合物。流速为1毫升/分钟，在205纳米处紫外检测(注射体积100微升，运行时间12分钟)。
体内效力研究
运动神经阻断
依照4分制来评估小鼠的运动神经阻断：1-正常，2-当举起尾巴时，脚部的无损伤背屈，伴有脚趾张开能力的减弱，3-脚趾和脚部弯曲，伴有无张开能力，4-背屈能力丧失，脚趾弯曲，以及步态损伤。
Hargreaves热板感觉试验
该模型能够进行独立的运动神经和感觉试验。将小鼠放置，站在平板上。在仪器平稳之后，将红外线光束(标准加热温度50-52℃)直接射至受试的后脚爪上。通过在板测量之间替换脚爪和允许至少15秒的恢复期，记录从热板缩回后爪的潜伏期。因为腿缩回的肌肉是大腿内收肌(大腿无坐骨神经)，尽管全部的坐骨神经阻断(水平4)，小鼠仍可缩回脚爪。另外，对足部施用针刺，记录反应(有反应＝1，或无反应＝0)。
统计分析
使用方差的混合模型分析法分析Hargreves得分(事件的时间)。目的主要问题是药物是否会影响Hargreves得分。进行了两个实验，在不同的时间使用不同的动物。认为药物、实验和时间是固定的影响因素，认为动物(与实验和时间相匹配的)是随机的影响因素。用SAS ProcMixed(版本8.02)进行分析。
结果
体外药物释放
如GPC所证实的那样，将布比卡因掺入聚合物中而不影响聚合物的分子量。布比卡因游离碱(BFB)易溶于P(SA-RA)中，最高达15％ w/w的BFB。盐酸盐在聚合物中良好地分散，而不影响聚合物的粘度，至少达到15％ w/w的负载。含5％和7％的布比卡因的P(SA-RA)2:8和3:7制剂以一级曲线稳定释放药物，在7天中，约60％的掺入的药物释放入缓冲液中，而在该期间，含10％布比卡因的制剂释放了其含量的约70％。对于所有的实验，较高Mw(Mw＝18,000)聚合物的药物释放速率较慢，与低Mw(Mw＝5,000)聚合物相比，在每个时间点的释放量少10％-20％。
毒性和组织病理学评价
在注射后3天和在注射后1周处死小鼠，对该小鼠进行坐骨神经、周围组织(脂肪和肌肉)和主要器官的组织学评价。在注射后3天，在3只小鼠中仅1只在坐骨神经周围的脂肪处发现了巨噬细胞浸润。在剩余的2只小鼠中发现左和右神经、周围的肌肉和脂肪都是正常的。在所有的受检小鼠中，发现所有其它的受检器官(肺、肝、心、脑和脾)都是正常的。在注射后1周进行的组织学检查中，在5只小鼠中仅2只在坐骨神经周围的组织中发现了罕见的嗜中性粒细胞和周围神经的淋巴细胞，在所有的受检小鼠中，发现所有的受检器官(肺、肝、心、脑和脾)都是正常的。
在注射10毫克负载药物的聚合物后，研究了血浆中布比卡因的浓度。在24小时后，血浆水平达到75±15纳克/毫升，然后在6天后下降至18±5纳克/毫升，在7-21天后几乎检测不到血浆水平(7±2纳克/毫升)。这些血浆浓度不会引起任何可观察到的全身毒性如抽搐，在研究中接受了10毫克负载布比卡因的聚合物的所有小鼠都存活下来了。
效力
在注射布比卡因制剂4天后进行了Hargreaves热板感觉实验。发现注射制剂后麻醉效应持续3天。在注射后24-36小时，运动神经阻断消失。
结论：
基于这些结果，癸二酸-蓖麻油酸共聚物延迟了布比卡因的释放，延长了麻醉，而无任何不良的病理作用。
实施例9：用于治疗骨质疏松症的庆大霉素控制释放的生物可降解载体癸二酸-蓖麻油酸-酯-酐共聚物
骨髓炎通常是由细菌但有时是由真菌引起的骨感染。有3种引起骨感染的可能途径。可由邻近软组织感染的扩散而引起骨感染，该软组织受到了损害或血液循环差。身体其它部分的感染可以通过血液转运到骨头(造血系统扩散)。骨直接感染可以是穿透伤口或开放性骨折的结果。骨感染的主要治疗方法包括手术清创、切除所有的外来体和抗生素疗法。通常，静脉内抗生素的处方持续3周，随后3周的口服抗生素。然而，在骨头内达到有效治疗药物水平所需的高肠胃外剂量的抗生素以及延长的治疗过程，可导致抗生素的全身毒性。局部释放抗生素至被感染部位是胜过传统静脉内疗法的主要优势。局部药物释放系统可以达到在感染部位的高药物浓度，同时维持低的全身药物水平。可将开发用于局部释放抗生素的药物释放系统分为非生物可降解的载体和生物可降解的载体。在欧洲，含庆大霉素的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠已被批准用于治疗骨髓炎。虽然已证明该产品是有效的，但它的主要缺点为非生物降解的，在完成抗生素释放时，需要随后将珠除去。近年来，已开发和评价了各种生物可降解的释放系统，在骨感染治疗中用于抗生素的局部释放。目前主要通过用长期留置导管静脉内注射、含抗生素的聚甲基丙烯酸甲酯珠或磷酸钙(骨水泥)的局部植入物，将有效的抗生素药物硫酸庆大霉素用于骨髓炎的治疗中。
体外的庆大霉素释放
如实施例1中所述，制备具有不同分子量的P(SA：RA)(3：7)w/w比率的聚合物。在室温下无需任何加热或使用溶剂，将硫酸庆大霉素混合入聚(SA:RA)3:7中，直至得到均匀的混合物。药物载量为10％和20％。通过将200毫克的制剂放置入50毫升磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)中，在37℃下恒速转动(100 RPM)，进行药物释放的研究。为了模拟生物流体的流动，每隔48小时更换缓冲液，保留被更换的溶液，用于庆大霉素的分析。
为了体外释放分析，将25微升的制剂放置入在24孔微量滴定平底板(得自None，哥本哈根，丹麦)中每个孔的底部。加入1毫升的磷酸盐缓冲水溶液(PBS)，然后在37℃在潮湿的室内温育板。在每个时间点上，收集溶出的培养基，用1毫升的PBS冲洗该制剂，将1毫升的新鲜PBS加到孔中。将培养基离心，保留上清液，用于细菌研究和庆大霉素浓度分析。
将收集到的样品稀释100倍，与荧光胺(Sigma，以色列)反应，然后以392纳米的激发波长，480纳米的发射波长，用荧光分光计(Jasco，日本)分析样品，以确定庆大霉素的浓度。
为该研究制备的制剂包含20-40毫克的庆大霉素。通过将药物粉末简单地混合入聚合物糊中，来制备负载庆大霉素的聚合物。观察到药物盐和聚合物之间没有化学的相互作用。在图14中显示了庆大霉素从糊状聚合物释放入磷酸盐缓冲液中的速率。可以看出含20％庆大霉素制剂的释放曲线比含10％庆大霉素制剂的释放曲线更慢。该释放曲线的差异很可能是由于在庆大霉素与聚合物的脂肪降解产物之间形成了盐。在两种情况中，增加聚合物的分子量降低了庆大霉素的释放速率。Mn>10,000道尔顿的负载庆大霉素的聚合物是粘稠的，难以注射。因此选择负载20％庆大霉素的P(SA-RA)3:7(Mn＝4500)，用于进一步的研究。
在第二个体外释放研究中，将庆大霉素释放入24-孔槽板中(1毫升溶液/孔)。用于该研究的制剂包含约5毫克的活性庆大霉素。释放曲线类似于当在大体积水中释放时获得的释放曲线。例如，在8天后，释放了负载的庆大霉素中的9％(约0.45毫克)。全部的结果都表明庆大霉素在延长的时期内(例如超过60天)不断地释放，这是治疗慢性感染或防止复发性感染的优势。通过在TSB中过夜温育金黄色葡萄球菌(S.aureus)，测定细菌的生存能力，证实在缓冲溶液中释放的庆大霉素的抗菌活性。
体外抗菌活性
将从含庆大霉素聚合物的体外释放研究得到的上清液加到金黄色葡萄球菌的培养物中。用PBS将收集到的上清液稀释100倍、1000倍和10000倍，将其加到96孔微量滴定平底板的孔中，该微量滴定平底板在TSB中含106金黄色葡萄球菌。在温度控制的微量板分光光度计(VERSAmax，分子装置公司，加拿大<美国)中温育板24小时。在650纳米处每隔2小时进行光密度(OD)测量，以确定孔中的细菌浓度。发现荧光胺法确定的庆大霉素浓度与细菌体外效应之间的相关性。
庆大霉素对用于该研究的金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2-4μg/毫升。图15总结了VERSAmax分光光度计分析的结果。在6天和8天后，当分别将溶液稀释100倍(4.5×10-3毫克/毫升)和1000倍(4.5×10-4毫克/毫升)(图15中的A和B)时，庆大霉素的浓度足以杀灭金黄色葡萄球菌。在稀释10,000倍(图15中C)的情况，该浓度无抑菌作用。含有空白P(SA-RA)(3:7)w/w(Mn＝4500)的对照孔不影响细菌的生长。发现在OD.为约0.7的这些孔中没有效果。在TSB中仅包含金黄色葡萄球菌的孔中，发现了约0.6的O.D.。考虑到庆大霉素释放的结果(图14)和稀溶液的深度抑菌作用(图15)，在早期，在释放介质中可能有显著的抗菌活性。
体内效力和注射部位的药物浓度
使用负载10％和20％硫酸庆大霉素的可注射癸二酸-蓖麻油酸-酯-酐共聚物3:7和2:8w/w聚合物。用金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染16只邮寄的Wistar大鼠的两个胫骨近端，对该大鼠进行效力研究。对腿部刮毛、脱毛和用醇消毒。为了在手术期间提供无菌条件，将动物放置在无菌布帘中，用无菌布单遮盖其身体。用无菌的切开的箔片分别包住腿。将胫骨近端干骺端(methaphysis)处的皮肤和筋膜切开超过5毫米长。穿过骨密质和骨松质钻孔(钛钻头3毫米)。制备了含有1.0×106菌落形成单位(CFU)/毫升的金黄色葡萄球菌的混悬液。通过50微升的注射器，将10微升的混悬液注入每个伤口部位。动物维持4周，让骨髓炎发展。在该期间之后，拍摄感染肢的放射照片，对大鼠进行治疗。将制剂注入测试组大鼠受感染的骨中。
测试组接受了P(SA:RA)注射。通过23G针，将负载10％庆大霉素的100微升聚合物注入受感染的骨中。对照组不接受任何治疗。
在处死这些动物之后，在腕部和肘部脱落四肢。拍摄了每个样品的放射相片。在1、2、4和8周之后，从植入部位取2毫米的组织样品。将组织在1毫升的标准生理盐水(pH7.4)中匀化并离心。移去上清液，用荧光极化免疫测定法(FPIA)分析，以确定庆大霉素的浓度，该FPIA仪得自Abbott Diagnstics，商品名为TDx。
在所有的动物中，与对照组相比，发现细菌计数WAS的显著减少。在4周后，在分析组织时发现了庆大霉素，在8周后，观察到痕量的庆大霉素。
聚合物-庆大霉素植入物的毒性
在整个实验期间，将10周大的雄性Wistar大鼠(Harlan实验室，耶路撒冷，以色列)保持在无特异病原体的条件下，让这些大鼠自由进食辐照食物和酸化水。耶路撒冷的希伯来大学的伦理委员会(国立卫生研究所批准号：OPRR-A01-5011)已考查了动物研究的申请，发该动物研究符合实验动物的护理和使用标准(伦理委员会调查号：MD-80.04-3)。
经19G针，将200微升的负载庆大霉素的半固体制剂(0％、10％和20％w/w)皮下注射至两组3只Wistar大鼠的前腹部中。在1组大鼠的左边植入包含200微升空白P(SA:RA)(3:7)的制剂，在右边植入负载20％庆大霉素的200微升P(SA:RA)(3:7)。在第2组大鼠的左边植入包含200微升空白P(SA:RA)(3:7)的制剂，在右边植入负载10％庆大霉素的200微升P(SA:RA)(3:7)。观察动物的局部毒性体征和体重减轻。在注射6周后，处死大鼠，取出植入物用于化学分析，在4％中性缓冲的甲醛中固定周围组织，使周围组织受组织病理学检查。
组织病理学评价表明：在从10％或20％庆大霉素制剂被加到聚合物P(SA:RA)(3:7)中的2组取得的样品中，包膜组织反应的程度比得上当空白聚合物单独存在时形成的包膜组织反应程度，提示在联合治疗方法的应用上，无不良反应。形成的包膜主要由成熟的胶原沉着组成，与成纤维细胞、血管和稀疏的组织细胞或其它单核细胞的存在相关。没有证据显示在包膜内或延伸至局部包膜之外有任何活跃的炎症反应或组织刺激。在所有的情况中，包膜的厚度都是相似的。将典型地由薄的封闭的包膜组成的局部组织反应解释为瘢痕化亚慢性炎症反应。没有证据显示有肉芽肿性异物、淋巴样细胞聚集和/或免疫刺激，这表明植入物有很好的耐受性。
通过在大鼠胫骨内钻孔以及将0.2毫升的聚合物或制剂注入骨内，来确定聚合物(P(RA-SA)(70:30)和负载20％庆大霉素的制剂与骨的生物相容性。将5只大鼠/组用于该研究中。用组织病理学分析骨，没有发现归因于聚合物或制剂的毒性的证据。记录的响应聚合物的炎症与经正常机制主动除去材料相一致。在植入8周后，聚合物和制剂完全从骨中消除。
对γ-辐照的稳定性
将含有20％硫酸庆大霉素(GS)的P(SA:RA)(3:7)w/w用于该研究中。在完成聚合之后，在室温下将GS加到糊状聚合物中，用机械混合，直至得到均匀的混合物。将1毫升的混合物装入1毫升锁定的塑料注射器中。也制备了含1毫升空白聚合物的注射器。用60Co放射源(450,000Ci；8小时)、2.5毫拉德的吸收剂量，辐照所有的聚合物。在Sor-VanRadiation有限公司(Kiryat Soreq，Yavne，以色列)进行辐照。
用GPC测量辐照前后负载的聚合物和空白的聚合物的分子量。用DSC测量辐照前后负载的聚合物和空白的聚合物的熔点。用IR和1H-NMR光谱法，测定辐照前后负载的聚合物和空白的聚合物的化学结构。通过在辐照前后将样品溶于二氯甲烷中，用双蒸馏水(DDW)萃取药物3次，来测定庆大霉素的含量。合并萃取液，使用分光荧光计分析。
在辐照之后，制剂分别在37℃、20℃、4℃和-17℃下贮藏。将无辐照的样品用作对照。在不同的时间点上，从辐照制剂和对照制剂中取出样品，然后用上述方法进行分析，结果如表9所示。
表9、贮藏的聚合物的分子量(Mw和Mn)和熔点(m.p.)的变化
Figure A200680044382D00591
a重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)由GPC测定。
b按10℃/分钟，用DSC，仅记录辐照样品的熔点(m.p.)。
为了检测由于贮藏条件引起的药物释放的可能变化，在一些时间点，进行简要的药物释放研究。在4℃和-17℃下贮藏的制剂的释放曲线如图16所示。在这两种制剂中，庆大霉素的释放是相似的。将样品溶于二氯甲烷中，用磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝7.4)萃取三次。图16a显示在4℃下贮藏8周庆大霉素从制剂中的释放。图16b显示在-17℃下贮藏8周庆大霉素从制剂中的释放。经辐照的样品和不经辐照的样品的释放曲线是相似的，这表明辐照不因聚合物的辐照效应而释放药物。在室温下贮藏2周似乎不影响庆大霉素的释放曲线。对于经辐照的制剂和不经辐照的制剂，在其IR光谱之间和在其NMR光谱之间没有差异。可在贮藏期间的降解之后，进行IR光谱测定，监测在1700cm-1处酐峰的消失和酸峰的出现。表明在-17℃下贮藏的制剂没有降解。在4℃贮藏的制剂在6周后出现了酸峰，该酸峰随时间而增大。
实施例9：包含蓖麻油酸低聚物的液体聚酯
将通过蓖麻油酸的直接缩合制备的Mw＝2200和3600的蓖麻油酸低聚物用于该研究中。通过使RA低聚物和环氧乙烷或环氧丙烷反应形成乙二醇酯或丙二醇酯，获得羟基封端的RA低聚物。将羟基封端的RA低聚物用作DL-丙交酯、己内酯和羟基乙酸及其混合物的开环聚合的引发剂。具有B链段的ABA三嵌段共聚物为蓖麻油酸低聚物，通过使用石状(staneous)辛酸酯作为催化剂，使HO封端的RA低聚物与DL-丙交酯开环聚合而获得。RA低聚物与丙交酯之间的摩尔比决定聚合物的分子量和链段的长度。含20％RA低聚物的DL-丙交酯的三嵌段共聚物在室温下是液体，在水中形成凝胶。类似地，由DL-丙交酯与具有1个羟基的RA低聚物的二嵌段共聚物得到糊状聚合物。
由蓖麻油酸低聚物与乳酸、羟基乙酸和羟基丁酸的缩聚作用获得RA低聚物与羟基酸的无规共聚物。在甲苯中，用酸性催化发生聚合。在甲苯蒸发之后，在130℃，1毫米汞柱真空下继续聚合，产生乳酸含量低于10％的糊状聚合物。由羟基酸与其内酯共聚成聚酯，得到各种共聚物。当注入体内时，这些聚合物的粘度增加，主要依赖药物的水溶解性，而持续数周和数月地释放掺入的药物。
实施例10、蓖麻油酸与乳酸和羟基乙酸的聚酯的合成与特征
在使用之前将L-乳酸(50％水溶液)冻干过夜。将w/w比率为1:10、1:5、2:5、3:5(蓖麻油与丙交酯的w/w)的蓖麻油和L-乳酸混合，0.5％w/w H3PO4为催化剂，在干燥的氮气流下加热至170℃，持续1.5小时，以将系统干燥。在1.5小时之后，将反应系统连接至15mBar的真空，继续反应24小时。在聚合3、5和7小时时取样。
在表4中描述了聚合物的外观、重均分子量和数均分子量。也制备了蓖麻油酸和乳酸的聚酯。在表5中描述了这些聚合物的性质。乳酸与蓖麻油酸/蓖麻油的共聚导致具有期望的性质如柔韧性、疏水性和柔软性的聚合物。在聚合物链中存在的蓖麻油酸导致聚合物对制备软的或甚至液体聚合物的空间位阻。当将聚合物浸入水性溶液中时，这些糊状聚合物胶凝成更硬的材料。将这些聚合物糊注入组织内，导致聚合物制剂局限于注射部位。
表11、蓖麻油酸和乳酸的聚酯的性质
Figure A200680044382D00631
由DL-乳酸和羟基乙酸及其混合物合成含30:70比率w/w(30％蓖麻油或蓖麻油酸)的聚合物。所有的聚合物均显示在4000范围内Mn的相似分子量，均为糊状材料。DL-乳酸聚合物比其它聚合物更像液体。当在室温下置于水性介质中1小时，所有的聚合物均改变其粘度并胶凝。
实施例11、紫杉醇和甲氨蝶呤从蓖麻油酸和乳酸聚酯的体外释放
通过将药物与Mn＝3,000和Mw＝7,000的聚(乳酸:蓖麻油)60:40和70:30w/w比率的共聚物混合，制备含10％ w/w紫杉醇和10％ w/w/甲氨蝶呤的制剂。使用研钵和研棒，在室温下将药物与聚合物混合。不使用溶剂或加热。在糊剂中药物粒子的粒度小于100微米，经SEM分析测定。
将药物-聚合物制剂填充入1毫升注射器中，将每份10毫克的样品注入37℃下pH7.4的50毫升磷酸盐缓冲液中。缓冲溶液也包含0.3％重量/体积的十二烷基硫酸钠(SDS)。加入SDS，以增加释放的紫杉醇的溶解度。在第1周每天、以后每3天更换缓冲液。用HPLC检测紫杉醇和甲氨蝶呤的释放。紫杉醇和甲氨蝶呤以恒定速率从聚合物制剂中释放，聚合物保持为均匀的半固体小滴而没有崩解。在约20天内，以恒定速率释放负载的甲氨蝶呤中的25％，而分别在约30天和60天之后，释放负载的紫杉醇中的5％和10％。

Claims (23)

1.一种疏水性聚合物的组合物，所述组合物为在低于37℃时在水溶液中胶凝的液体或糊状物。
2.权利要求1的组合物，所述组合物包含聚酯或聚(酯-酐)，所述聚酯或聚(酯-酐)由蓖麻油酸酯低聚物和脂族分子组成，所述脂族分子具有至少一个羧酸和至少一个羟基或一个另外的羧酸基团，其中所述制剂在低于37℃时为液体或糊状物。
3.权利要求1或2的组合物，所述组合物还包含至少一种活性剂。
4.权利要求3的制剂，所述制剂包含选自治疗药物、诊断药物和预防药物的药物。
5.权利要求2的组合物，其中所述聚(酯-酐)包含烷二酸单体单元，所述烷二酸单体单元具有至少4个碳原子。
6.权利要求5的组合物，其中所述烷二酸单体单元选自HOOC(CH2)xCOOH结构的线性二羧酸、富马酸或马来酸，其中x为2至16之间的整数。
7.权利要求2的组合物，其中所述聚酯或聚(酯-酐)包含一个或多个羟基链烷酸单体单元，所述羟基链烷酸单体单元具有2-6个碳原子。
8.权利要求7的组合物，其中所述羟基链烷酸单体单元选自乳酸、羟基乙酸、4-羟基丁酸和5-羟基戊酸。
9.权利要求2的组合物，所述组合物包含蓖麻油酸酯低聚物，所述蓖麻油酸酯低聚物具有由酯键连接的至少平均为1.5的蓖麻油酸单元。
10.权利要求1的组合物，所述组合物还包含一种或多种赋形剂。
11.权利要求3的组合物，其中所述治疗药物、诊断药物和预防药物选自小分子药物、肽、蛋白质、低聚核苷酸和多聚核苷酸、除草剂和杀虫剂。
12.权利要求3的组合物，其中所述治疗药物、诊断药物和预防药物选自镇痛药、局部麻醉药、抗感染药、抗炎药、抗生素、生长激素、抗癌药及其组合。
13.权利要求1和2的组合物，其中所述聚合物的组合物被用作手术密封剂。
14.权利要求1和2的组合物，其中所述聚合物的组合物被用作用于减少器官与器官粘连的隔离剂。
15.权利要求1和2的组合物，其中所述聚合物的组合物被用作涂层。
16.权利要求1的组合物，其中所述聚合物的重均分子量为10,000或更高。
17.权利要求1的组合物，其中所述聚合物的聚合度为40或更高。
18.权利要求1的组合物，其中所述聚合物在约12周内生物降解。
19.一种制备用于释放选自以下的药物的制剂的方法：生物活性剂、诊断药物和预防药物，所述方法包括将所述药物掺入权利要求1-18中任一项的组合物中。
20.一种释放药物的方法，所述药物选自治疗药物、诊断药物和预防药物，所述方法包括将权利要求1-18中任一项的制剂给予有需要的个体。
21.权利要求20的方法，其中所述制剂通过注射或植入给予。
22.权利要求20的方法，其中所述治疗药物为抗癌药，并给予所述组合物治疗实体瘤。
23.权利要求20的方法，其中所述治疗药物为抗生素，并给予所述组合物治疗骨感染。
CNA2006800443821A 2005-09-27 2006-09-27 胶凝疏水性可注射聚合物组合物 Pending CN101374554A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72084005P 2005-09-27 2005-09-27
US60/720,840 2005-09-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101374554A true CN101374554A (zh) 2009-02-25

Family

ID=38541480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800443821A Pending CN101374554A (zh) 2005-09-27 2006-09-27 胶凝疏水性可注射聚合物组合物

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8575092B2 (zh)
EP (1) EP1931308A2 (zh)
JP (1) JP2009510048A (zh)
CN (1) CN101374554A (zh)
AU (1) AU2006341116C1 (zh)
CA (1) CA2623561C (zh)
IL (1) IL190486A (zh)
MX (1) MX2008004094A (zh)
WO (1) WO2007110694A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113304325A (zh) * 2020-02-27 2021-08-27 四川大学 一种集可注射与抗菌于一体的双功能水凝胶及其制备方法和用途

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2008004094A (es) 2005-09-27 2009-02-27 Efrat Biopolymers Ltd Composiciones de polimero inyectables hidrofobicas, gelificantes.
US8703119B2 (en) 2007-10-05 2014-04-22 Polygene Ltd. Injectable biodegradable polymer compositions for soft tissue repair and augmentation
RU2012134271A (ru) * 2010-01-28 2014-03-10 Ювенис Лтд. Полимерный гелевый состав
KR20130080435A (ko) * 2010-04-01 2013-07-12 파마네스트 아베 국소마취의 생체 점착성 조성물
JP6306349B2 (ja) 2010-04-14 2018-04-04 アルトリア クライアント サービシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 予成形無煙タバコ製品
US10799548B2 (en) 2013-03-15 2020-10-13 Altria Client Services Llc Modifying taste and sensory irritation of smokeless tobacco and non-tobacco products
CA2970617C (en) 2014-12-18 2021-11-23 Dexcel Pharma Technologies Ltd. Alternating and semi-alternating poly(ester-anhydride) copolymers
GB201505527D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Jmedtech Pte Ltd Composition
CA2997130A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusam Ltd. Antibodies specific to human t-cell immunoglobulin and itim domain (tigit)
CN105726464B (zh) * 2016-03-23 2019-10-22 上海和黄药业有限公司 一种麝香保心丸缓释凝胶剂用于药理研究的供试品制备方法
CA3057766A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 Dexcel Pharma Technologies Ltd. Compositions comprising biodegradable copolymers
JP2020536955A (ja) 2017-10-06 2020-12-17 ファウンドリー セラピューティクス， インコーポレイテッド 治療剤の制御放出のための埋込み可能なデポー
EP4069324A4 (en) * 2019-12-06 2024-01-10 Guangzhou Bioseal Biotech Co Ltd FLUID FIBRINOGEN THROMBIN PASTE
CN113827547A (zh) * 2020-06-23 2021-12-24 南京清普生物科技有限公司 一种缓释制剂组合物
US20230285337A1 (en) * 2020-08-07 2023-09-14 Intragel Therapeutics Ltd. Long acting anticancer compositions
CN116419764A (zh) * 2020-08-07 2023-07-11 多基因有限公司 聚酸酐及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6413539B1 (en) * 1996-10-31 2002-07-02 Poly-Med, Inc. Hydrogel-forming, self-solvating absorbable polyester copolymers, and methods for use thereof
US5711958A (en) * 1996-07-11 1998-01-27 Life Medical Sciences, Inc. Methods for reducing or eliminating post-surgical adhesion formation
IL140017A (en) * 2000-11-30 2009-09-22 Abraham J Domb Polyhedra
WO2005079861A2 (en) * 2004-02-13 2005-09-01 Safeway Investments Ltd. Polymeric water soluble prodrugs
MX2008004094A (es) 2005-09-27 2009-02-27 Efrat Biopolymers Ltd Composiciones de polimero inyectables hidrofobicas, gelificantes.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113304325A (zh) * 2020-02-27 2021-08-27 四川大学 一种集可注射与抗菌于一体的双功能水凝胶及其制备方法和用途
CN113304325B (zh) * 2020-02-27 2022-03-11 四川大学 一种集可注射与抗菌于一体的双功能水凝胶及其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
IL190486A0 (en) 2008-12-29
WO2007110694A2 (en) 2007-10-04
CA2623561A1 (en) 2007-10-04
EP1931308A2 (en) 2008-06-18
US8575092B2 (en) 2013-11-05
JP2009510048A (ja) 2009-03-12
AU2006341116A1 (en) 2007-10-04
WO2007110694A3 (en) 2008-08-14
IL190486A (en) 2013-12-31
US20090111732A1 (en) 2009-04-30
MX2008004094A (es) 2009-02-27
AU2006341116C1 (en) 2013-05-23
CA2623561C (en) 2015-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101374554A (zh) 胶凝疏水性可注射聚合物组合物
Chang et al. Fast degradable polycaprolactone for drug delivery
US20220354956A1 (en) Biodegradable drug delivery for hydrophobic compositions
AU2006341116B2 (en) Gelling hydrophobic injectable polymer compositions
Krasko et al. Gentamicin extended release from an injectable polymeric implant
Luong-Van et al. Controlled release of heparin from poly (ε-caprolactone) electrospun fibers
Liu et al. Calcitonin-loaded thermosensitive hydrogel for long-term antiosteopenia therapy
Seo et al. Injectable intratumoral hydrogel as 5-fluorouracil drug depot
DE69735057T2 (de) Wasserlösliche paclitaxel-prodrogen
CN101801415B (zh) 利培酮化合物的持续递送制剂
Shikanov et al. Poly (sebacic acid‐co‐ricinoleic acid) biodegradable carrier for paclitaxel: In vitro release and in vivo toxicity
Xie et al. Release modulation and cytotoxicity of hydroxycamptothecin-loaded electrospun fibers with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inoculations
Arun et al. Biodegradable hydrophobic injectable polymers for drug delivery and regenerative medicine
Jain et al. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update
Wang et al. Development of biodegradable polymeric implants of RGD-modified PEG-PAMAM-DOX conjugates for long-term intratumoral release
CN103446043B (zh) 一种原位凝胶注射植入剂
Yoo et al. A local drug delivery system based on visible light-cured glycol chitosan and doxorubicin⋅ hydrochloride for thyroid cancer treatment in vitro and in vivo
Chu et al. Liver-targeting Resibufogenin-loaded poly (lactic-co-glycolic acid)-D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate nanoparticles for liver cancer therapy
CN107106506A (zh) 用于治疗剂的超局部化释放的可注射微粒
Talimi et al. Sirolimus-exuding core-shell nanofibers as an implantable carrier for breast cancer therapy: preparation, characterization, in vitro cell studies, and in vivo anti-tumor activity
Nasongkla et al. Paclitaxel-loaded polymeric depots as injectable drug delivery system for cancer chemotherapy of hepatocellular carcinoma
Gao et al. Characterization and antitumor efficacy of poly (L-lactid acid)-based etoposide-loaded implants
CN101732345A (zh) 顺铂脊柱肿瘤缓释植入剂及其制备方法
CN100563711C (zh) 一种抗癌缓释注射剂
CN1754535B (zh) 紫杉醇类物质的局部注射用缓释微球、其制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20090225