MX2008004094A - Composiciones de polimero inyectables hidrofobicas, gelificantes. - Google Patents

Abstract

Se describen en la presente portadores biodegradables sintetizados de oligoésteres de ácido ricinoleico y moléculas alifáticas que tienen por lo menos un ácido carboxílico y por lo menos un grupo hidroxi o ácido carboxílico que son líquidos o pastas a temperaturas por debajo de 370ºC y métodos para hacerlos y usarlos. Los polímeros descritos en la presente significativamente incrementan su viscosidad en la inmersión en medio acuoso. Estos polímeros se pueden usar como sellante biomédicos hidrofóbicos, barreras temporales para prevenir adhesiones, tal como la adhesión de órgano a órgano, soportes de células, portadores para suministro de fármaco, y recubrimiento sobre dispositivos médicos implantables, tales como stents. Los polímeros hechos de oligoésteres de ácido ricinoleico son menos viscosos y más fáciles de inyectar comparados con los polímeros de composición y peso molecular similares preparadps de monómeros de ácido ricinoleico, poseen un peso molecular más alto, retienen un fármaco incorporado por períodos más largos y se degradan en productos de degradación blando en una proporción más lenta comparados con los polímeros sintetizados de monómeros de ácido ricinoleico. Los agentes farmacéuticamente activos se pueden incorporar en el líquido o pastas sin el uso de solventes orgánicos.

Description

COMPOSICIONES DE POLÍMERO INYECTABLES HIDROFOBICAS, GELIFICANTES CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está generalmente en el campo de composiciones de polímero hidrofóbicas gelificantes para la liberación controlada de agentes farmacéuticamente activos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Sistemas de formación de depósito in situ para el suministro de fármaco parenteral controlado están típicamente en la forma de líquidos o pastas que tienen una amplia gama de viscosidades. Tales sistemas contienen usualmente una barrera biodegradable disuelta o dispersada en un sistema de solvente/cosolvente, mientras que el fármaco es ya sea dispersado o disuelto en la fase líquida del sistema de suministro. En la inyección subcutánea o intramuscular, se forma un depósito sólido en el sitio de la inyección. La administración de tal sistema es mucho menos invasivo y costoso que los procedimientos quirúrgicos que son requeridos frecuentemente para implantación. Diferentes sistemas de formación de depósito in situ han sido revisados recientemente y clasificados en diferentes categorías de acuerdo al mecanismo de formación de depósito ( (Hatefi y colaboradores, J. Control. Reléase 80(1-3) : 9-28 (2002)). Los sistemas de precipitación in situ formados con copolímeros de polilacturo-co-glicoluro ("PLGA") han ganado la mayor atención en años recientes debido a la aprobación reguladora de productos específicos, tal como Eligard®, que utiliza la tecnología Atrigel® para el suministro a largo plazo de acetato de leuprolide." Eligard® es comercializado por Atrix Lab (ahora QLT) . N-metil-2-pirrolidona (NMP) es el solvente orgánico utilizado en esta formulación particular. Otros solventes orgánicos tales como propilenglicol , sulfóxido de dimetilo, tetrahidrofurano , triacetina y benzoato de etilo también han sido evaluados por su impacto sobre la ruptura del fármaco inicial. La biocompatibilidad y toxicidad sistémica de estos solventes orgánicos han sido un problema mayor. Los sistemas de formación de depósito in situ de PLGA también han sido desarrollados por Alza con el uso de solventes más lipofílicos tal como benzoato de bencilo (Alzamer®) , que se reclama por ser menos irritante y que reduce la ruptura del fármaco inicial. El sistema SABER® (Durect) consiste de acetato isobutirato de sacarosa (SAIB) disuelto en etanol, alcohol bencílico u otros solventes miscibles en agua. Debido a la viscosidad de solución baja, la facilidad de administración con agujas de calibre pequeño es una ventaja obvia sobre los sistemas de PLGA. Una formulación de acción prolongada de SABER-bupivacaína ha sido en experimentos clínicos para el manejo del dolor posquirúrgico . La aplicación potencial del sistema SABER para el suministro de péptidos y proteínas también ha sido demostrado por la liberación sostenida de siete días de la hormona de crecimiento humana recombinante ("rh-GH") en ratas de una suspensión de- SABER que contiene polvo de rh-GH insoluble y PLGA disueltos en la fase liquida. Los copolimeros tribloque biodegradables termosensibles se han desarrollado por MacroMed como sistemas de liberación sostenida para el suministro de fármaco parenteral. El copolimero es comprendido de bloques de PLGA hidrofobicos (A) y bloques de PEG hidrofilicos (B) con dos configuraciones de bloque distintas: ABA y BAB . ReGel ® es un copolimero tribloque de tipo de ABA que es soluble en agua. Una solución acuosa de ReGel® es un liquido de flujo libre a 15 °C, que se transforma en un gel a temperatura corporal cuando se inyecta. La velocidad de liberación del fármaco se ajusta al cambiar el contenido hidrofóbico/hidrofilico , concentración de polímero, peso molecular y/o polidispersidad del copolimero tribloque. Los fármacos se disuelven, suspenden o emulsifican en ReGel®. OncoGel® es un producto que contiene paclitaxel incorporado en el ReGel® para el tratamiento local de tumores sólidos. El paclitaxel se solubiliza y se atrapa dentro del dominio hidrofóbico del gel y su liberación es sostenida durante seis semanas ya que el gel se somete a la degradación/erosión. El suministro sostenido perivascular del paclitaxel en ReGel también ha mostrado que inhibe efectivamente la hiperplasia neoíntima en injertos vasculares en perros. Debido a la naturaleza acuosa del ReGel®, la liberación sostenida prolongada (por ejemplo mayor de 1 mes) para un fármaco soluble en agua puede ser difícil de lograr. Las roturas iniciales altas adicionales del fármaco no se pueden evitar. Poloxamer® 407 es un copolímero tribloque de ABA que consiste de unidades de poli (oxietileno) y poli (oxipropileno) . Es un surfactante no iónico soluble en agua que forma una solución acuosa con propiedades de gelificación térmica inversa. Una solución con más de 20% del polímero exhibe una viscosidad baja a bajas temperaturas pero forma rápidamente una red de gel semisólida rígida a temperatura corporal. Sin embargo, la aplicación parenteral del Poloxamer® se ha limitado por su falta de biodegradabilidad y problemas de citotoxicidad en alta concentración de polímero. El incremento en el colesterol de plasma y los niveles de glicerol en ratas después de la inyección intraperitoneal del polímero también pueden ser problemáticos . La preparación de un copolímero basado en poli (etilenglicol) que contiene múltiples grupos tiol (-SH) a lo largo de la cadena principal del polímero también ha sido reportado. Cuando una. solución acuosa de este copolímero se mezcló con un agente de reticulación, a, ?-divinilsulfon-poli (etilenglicol) (MW 2KD) disuelto en solución reguladora de fosfato neutro, se formó un hidrogel. Un fármaco soluble en agua se puede disolver en cualquier solución y el fármaco llega a ser atrapado físicamente cuando el hidrogel se forma. Preliminarmente la evaluación de la biocompatibilidad en ratas y conejos indicó reacciones de tejido adversas leves a los geles reticulados in situ. El polímero GelSite® (DelSite Biotech, Inc.) es un polisacárido acídico natural extraído y purificado de la planta de aloe. El polímero, en solución acuosa, forma un gel en la presencia de calcio cuando se inyecta subcutáneamente o intramuscularmente ; de esta manera atrapando un fármaco soluble en agua (es decir una proteína) en la solución y proporcionando liberación sostenida . Este enlace proporciona control adicional sobre la liberación del fármaco sin interferir con las funciones biológicas de las proteínas. Estos sistemas están basados sobre soluciones hidrofílicas del portador de polímero en ya sea agua, NMP, polietilenglicol y/u otros dioles en los cuales en la inmersión en agua, el solvente hidrofílico se lixivia al tejido circundante mientras que el polímero se precipita. Las limitaciones de tales sistemas incluyen los volúmenes grandes de portador de polímero y el solvente requerido para la inyección; liberación por rotura de fármacos incorporados en la solución de polímero debido a la lixiviación rápida del solvente hidrofílico ; uso de solventes orgánicos tóxicos, tal como N-metilpirrolidona (NMP) ; y tiempos de degradación lentos de los polímeros, por ejemplo meses a años. El objetivo de la terapia con fármacos es maximizar el efecto terapéutico del fármaco mientras que minimiza los efectos adversos. El suministro sistémico de fármacos a tumores localizados tiene la desventaja de proporcionar concentraciones relativamente bajas del fármaco en los límites celulares de proliferación que se pueden localizar lejos de las redes capilares anormales en el tumor. Los implantes cargados con fármaco anticáncer basados en polímero proporcionan una oportunidad para suministrar dosis localizadas altas de fármaco por un períodos prolongado directamente en un tumor o en el sitio de la recepción del tumor. Así, los depósitos de fármaco semisólido ajustado in situ inyectable están siendo desarrollados como sistemas de suministro alternativos. Estos sistemas de implantación se hacen de productos biodegradables, que se pueden inyectar por la vía de una jeringa en el cuerpo y una vez inyectado, el gel forma un depósito semisólido. Polianhídridos y poliésteres biodegradables son materiales útiles para el suministro de fármaco controlado. Los poliésteres y polianhídridos que contienen ácidos ricinoleico para el uso como ' portadores de . fármaco se han descrito en las publicaciones de solicitudes de patentes norteamericanas Nos. 2004/0161464, y 2004/0161464 de Domb.

Sin embargo, estos polímeros se prepararon a partir de monomeros de ácido ricinoleico que dieron por resultado un grado bajo de polimerización, en el intervalo de 30 unidades de monómero, y requirieron un contenido de ácido ricinoleico grande para obtener un polímero en pasta. También, estos polímeros previamente descritos no se gelificaron cuando se colocaron en un medio acuoso. A pesar de los sistemas de suministro de fármaco previamente descritos, todavía existe una necesidad por una composición de polímero confiable que se pueda inyectar en el cuerpo donde forme un implante in situ para la liberación controlada de fármacos o sirva como un implante quirúrgico temporal . Es por lo tanto un objetivo de la invención proporcionar poliésteres y poliéster-anhídridos biodegradables que son líquidos o pastas a temperaturas por debajo de 37 °C, que se gelifican en la inmersión en medios acuosos o tejidos o métodos para hacerlos y usarlos. Es adicionalmente el objetivo de la invención convertir homo y copoliésteres sólidos comúnmente utilizados de ésteres polihidroxialcanoicos hechos de ácido láctico, glicólico e hidroxil capróico en un líquido o pasta mediante la incorporación de una cantidad relativamente pequeña de oligómeros de ácido ricinoleico. Es adicionalmente el objetivo de esta invención convertir homo y copolianhidridos sólidos comúnmente utilizados de ácidos alcano dicarboxilicos en un liquido o pasta mediante la incorporación de oligómeros de ácido ricinoleico en la cadena principal del polímero. Es adicionalmente el objetivo de esta invención proporcionar liberación sostenida de un agente farmacéuticamente activo para por lo menos una semana, preferiblemente para por lo menos cuatro semanas de poliésteres y/o polianhídridos biodegradables que son líquidos o pastas por debajo de 37 °C. Es adicionalmente un objetivo de la invención proporcionar poliésteres y poliéster-anhídridos biodegradables que son líquidos o pastas a temperaturas por debajo de 37 °C, que se gelifican en la inmersión en medios acuosos o tejidos que se degradan completamente en aproximadamente 12 semanas. Es adicionalmente el objetivo de esta invención proporcionar composiciones biodegradables en pastas que pueden servir como sellantes y cubiertas temporales para la- prevención de adhesión de órganos internos. Es adicionalmente el objetivo de esta invención proporcionar ácido ricinoleico puro de bajo costo a partir de ácido ricinoleico crudo o aceite de ricino. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente portadores biodegradables sintetizados de oligoésteres de ácido ricinoleico y moléculas alifáticas que tienen por lo menos un ácido carboxilico y por lo menos un grupo hidroxi o ácido carboxilico que son líquidos o pastas a temperaturas por debajo de 37 °C y métodos para hacerlos y usarlos. Los polímeros descritos en la presente incrementan significantemente su viscosidad en la inmersión en un medio acuoso. Estos polímeros se pueden utilizar como sellantes biomédicos hidrofóbicos , barreras temporales para prevenir adhesiones, soportes de células, portadores para el suministro de fármaco, y recubrimientos sobre dispositivos médicos implantables , tales como stents. Los polímeros hechos de oligoésteres de ácido ricinoleico son menos viscosos y más fáciles de inyectar comparados a los polímeros de composición y peso molecular similares preparados de monómeros de ácido ricinoleico, poseen un peso molecular más alto, retienen un fármaco incorporado durante períodos más largos, y se degradan en productos de degradación blandos a una velocidad más lenta comparada con los polímeros sintetizados de monómeros de ácido ricinoleico. Agentes farmacéuticamente activos se pueden incorporar en el líquido o pastas sin el uso de solventes orgánicos. La inmersión de las composiciones en medio acuoso, tal como fluidos corporales, incrementa la viscosidad de la composición que da por resultado la formación de un material semisólido. En una modalidad, el material polimérico es un poliéster, o un poli ( éster-anhídrido ) , compuesto de oligómero de ácido ricinoleico y moléculas alifáticas que tienen por lo menos un ácido carboxílico y por lo menos ya sea grupos hidroxilo o ácido carboxílico. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que muestra las viscosidades de p(SA:RA) 3:7 como una función de la temperatura (°C) en proporciones de esfuerzo cortante diferentes (la proporción de esfuerzo cortante aplicada se muestra en corchetes) . La línea sólida muestra los polímeros antes de la exposición a una solución reguladora de fosfato y la línea de rayas muestra el polímero después de la exposición a una solución reguladora de fosfato (pH 7.4, 0.1 M, 37°C durante 24 horas).. La Figura 2 es una gráfica de las viscosidades de poli (ácido sebácico-co-ácido ricinoleico) (p(SA:RA)) (2:8) como una función de temperatura (°C) en proporciones de esfuerzo cortante diferentes (la proporción de esfuerzo cortante aplicada se muestra en corchetes) . La línea sólida muestra los polímeros antes de la exposición a una solución reguladora de fosfato y la línea en rayas muestra el polímero después de la exposición a una solución reguladora de fosfato ( (pH 7.4, 0.1 M, 37 °C durante 24 horas) . La Figura 3 es una gráfica de las viscosidades del ácido poliricinoleico (PRA) como una función de temperatura (°C) en proporciones de esfuerzo cortante diferentes (la proporción de esfuerzo cortante aplicada se muestra en corchetes) . La linea sólida muestra los polímeros antes de la exposición a una solución reguladora de fosfato y la línea en rayas muestra el polímero después de la exposición a una solución reguladora de fosfato (pl-J 7.4, 0.1 M 37 °C durante 24 horas) . La Figura 4 es una gráfica que muestra la relación de la proporción de esfuerzo cortante (seg-1) y la tensión de esfuerzo cortante (dinas/cm2) antes y después de la exposición de p(SA:RA) (3:4) a una solución reguladora de fosfato. Las mediciones se realizaron a 23°C. La línea sólida muestra los polímeros antes de la exposición a una solución reguladora de fosfato y la línea en rayas muestra el polímero después de la exposición a una solución reguladora de fosfato . La Figura 5 muestra la liberación acumulativa in vi tro del paclitaxel de P(SA:RA) (2:8) cargado con 5% p/p y 10% p/p de paclitaxel. Cada punto representa el valor promedio ± STD(n=3) . La liberación se condujo en solución reguladora de fosfato 0.1M, pl-l 7.4, a 37 °C. Las concentraciones de paclitaxel se determinaron por la HPLC. La Figura 6 muestra la degradación hidrolítica in vitro y P ( SA : RA) (2:8) cargado y descargado. La Figura 6a muestra la degradación hidrolítica in vitro del blanco de P(SA:RA) (2:8) y cargado con paclitaxel al 5% p/p y 10% p/p monitoreado por la pérdida de peso de la muestra de degradación. La Figura 6b muestra la acumulación de paclitaxel en la muestra durante la degradación hidrolítica in vitro (determinada por la HPLC) . La degradación hidrolítica in vitro se condujo en solución reguladora de fosfato (50 mi, 0.1 M, pH 7.4 ) a 37°C con agitación constante (100 RP ) . La Figura 7 muestra la degradación in vivo del polímero puro y formulaciones de paclitaxel (5% y 10%) inyectados subcutáneamente en ratones saludables C3H. En cada punto de tiempo (días 1, 7, 21 y 70), los ratones (n=4) se sacrificaron y el implantación de polímero se examinó para Mw, peso y contenido de paclitaxel. La Figura 8 muestra el efecto antitumor in vivo de las formulaciones de paclitaxel contra el modelo heterotrófico BT en ratones C3H. El tratamiento comenzó ocho días después de la inoculación de células tumorales. El tiempo cero representa la iniciación del tratamiento. Cada punto representa promedio ± STD (n=10) . La Figura 9 muestra la evolución de sobrevivencia después de la inoculación de las ratas C57B1/6 con B16F1 y tratadas con P(SA:RA) (2:8) cargado con concentraciones diferentes de paclitaxel.

La Figura 10 muestra la evolución de la masa de tumor después de la inoculación de las ratas C57B1/6 con B16F1 y tratadas con P ( S : RA) (2:8) cargado con concentraciones diferentes de paclitaxel. La Figura 11 muestra la evolución del peso promedio de las ratas en todos los grupos de tratamiento durante el experimento. La desviación estándar se muestra por las barras de error. La Figura 12 muestra la evolución de volumen de tumor en la muerte para los grupos de tratamiento diferentes. La Figura 13 muestra el por- ciento de liberación in vitro de albúmina de suero bovino ("BSA"), insulina, interferón-alfa ("INF-alfa") e interleucina de p(SA:RA) (20:80) y p(SA:RA) (30:70) p/p como una función del tiempo (horas) . La liberación de los péptidos se condujo en solución reguladora de fosfato 0.1 M (pH 7.4) a 37 °C. El contenido de fármaco en el medio de liberación se determinó por el ensayo de proteína Lowry. La Figura 14 muestra el por ciento de liberación in vitro de gentamicina de p(SA: RA) (3:7) de pesos moleculares diferentes como una función del tiempo (días) . La Figura 15 es una gráfica que muestra la concentración bacteriana (densidad óptica) contra, el tiempo (días) para tres diluciones diferentes. La Figura 16 muestra la liberación de gentamicina después del almacenamiento a 4°C y - 17 °C durante ocho semanas como una función del tiempo (días) . La Figura 16a muestra la liberación de gentamicína de una formulación almacenada a 4°C durante 8 semanas. La Figura 16b muestra la liberación de gentamicína de una formulación almacenada a -17 °C durante 8 semanas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Composiciones A. Polímeros Se describen en la presente portadores biodegradables sintetizados de oligoésteres de ácido ricinoleico y moléculas alifáticas que tienen por lo menos un ácido carboxílico y por lo menos un grupo hidroxi o ácido carboxílico que son líquidos o pastas a temperaturas por debajo de 37 °C y que incrementan significantemente su viscosidad en la inmersión en medio acuoso. Los polímeros tienen un peso molecular de por lo menos 3,000 Daltons, preferiblemente por lo menos 7,000 Daltons, más preferiblemente, por lo menos 10,000 Daltons. El polímero puede tener grados variantes de polimerización. En una modalidad, el polímero tiene un grado de polimerización de por lo menos 40. Ácido ricinoleico (ácido cis-12-hidroxioctadeca-9-enoico) es un ácido graso de Cía con un enlace doble configurado cis en la 9- posición y un grupo hidroxilo en la 12- posición. El ácido ricinoleico crudo se puede adquirir comercialmente o preparar mediante la hidrólisis de aceite de ricino. El aceite de ricino es un triglicérido natural que contiene en promedio aproximadamente 3 grupos de hidroxilo por molécula. El aceite de ricino se extrae de semillas de ricino, típicamente al prensarlas, y es aproximadamente 90% de ricinoleato ( 12-hidroxioleato ) . El ácido ricinoleico se puede hacer reaccionar con uno o más polianhídridos para producir polímeros de oligoéster de ácido ricinoleico, que se polimerizan adicionalmente para producir el polímero final. Polianhídridos adecuados se pueden preparar mediante la polimerización de ácidos alifáticos y/o dicarboxílieos aromáticos. Los ácidos dicarboxílieos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido malónico, succínico, glutárico, adípico, sebácico, pimélico, subérico y azeláico. Diácidos insaturados adecuados incluyen ácido fumárico, ácido itacónico, y ácido maleico. Los diácidos de cadena larga tienen más 10, más de 15, más de 20, y más de 25 átomos de carbono tal como dímero de ácido oleico y dímero de ácido erúcico y ácidos policarboxílieos tales como trímero de ácidos erúcicos o trímeros de ácidos oleicos, derivados de ácido poliacrílico y ácido cítrico también se pueden utilizar. Los ácidos dicarboxílieos también pueden contener grupos funcionales reactivos, tales como grupos amino y/o hidroxilo . El ácido ricinoleico también se puede copolimerizar con un ácido hidroxialcanoico para producir . poliésteres que contienen unidades de monómero de ricinolato. Los ácidos hidroxialcanoicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido láctico; ácido glicólico; ácido hidroxicapróico; ácidos 3, 4, y 5 hidroxialcanoicos y mezclas de los mismos. Los polímeros descritos en la presente son biodegradables y biocompatibles . En una modalidad, los polímeros se degradan completamente en aproximadamente 12 semanas . B . Agentes Activos Las composiciones de polímeros descritas en la presente se pueden utilizar para suministrar agentes terapéuticos, de diagnóstico y/o profilácticos. Agentes de fármaco ejemplares útiles para formar la composición descrita en la presente incluyen, pero- no se limitan a, agentes analépticos; agentes analgésicos; agentes anestésicos; agentes antiasmáticos; agentes antiartríticos; agentes anticáncer; agentes anticolinérgicos ; agentes anticonvulsivos; agentes antidepresivos; agentes antidiabéticos; agentes antidiarreicos ; agentes antieméticos; agentes antihelmínticos; antihistaminas ; agentes antihiperlipidémicos ; agentes antihipertensivos ; agentes anti infectivos; agentes anti inflamatorios; agentes antimigraña; agentes antineoplásicos ; fármacos antiparquinsonianos ; agentes antipruríticos ; agentes antipsicóticos ; agentes antipiréticos; agentes antiespasmódicos ; agentes antituberculares; agentes antiúlcera; agentes antiviral; agentes anxioliticos ; supresores de apetito (agentes anoréxicos); fármacos de desorden de déficit de atención y desorden de hiperactividad de déficit de atención; agentes cardiovascular que incluyen bloqueadores de canal de calcio, agentes antianginales , agentes del sistema nervioso central ("CNS") , agentes bloqueadores de beta y antiarrítmicos; estimulantes del sistema nervioso central; diuréticos; materiales genéticos; hormonolíticos ; hipnóticos; agentes hipoglicémicos agentes; inmunosupresores ; relajantes de músculos; antagonistas de narcótico; nicotina; agentes nu ricionales ; parasimpatolíticos ; fármacos de péptido; psicoestimulantes; sedantes; sialagogues, esferoides; agentes para dejar de fumar; simpatomiméticos ; tranquilizantes; vasodilatadores; agonistas beta; agentes tocolíticos y mezclas de los mismos. En una modalidad, el agente activo es un agente anticáncer, tal como paclitaxel o metotrexato. En otra modalidad, el agente activo es un antibiótico, tal como gentamicina. En todavía otra modalidad, el agente activo es un péptido o proteína. Una cantidad efectiva de estos agentes se puede determinar por uno de habilidad ordinaria en la técnica.

Factores para considerar en determinar una cantidad terapéuticamente efectiva incluyen edad, peso y condición física de de la persona a ser tratada; tipo de agente utilizado, tipo de polímero utilizado; y velocidad de liberación deseada. Típicamente, la concentración del agente activo es de 1% a aproximadamente 90% en peso de las composiciones, preferiblemente de 5% a. aproximadamente 60% en peso de las composiciones, más preferiblemente de aproximadamente 5% a aproximadamente 20% en peso de la composición. C . Portadores , Aditivos y Excipientes Las formulaciones se preparan utilizando un "portador" farmacéuticamente aceptable compuesto de materiales que se consideran seguros y efectivos y se puede administrar a un individuo sin causar efectos secundarios biológicos indeseables o interacciones no deseadas. El "portador" es todos los componentes presentes en la formulación farmacéutica diferente al ingrediente o ingredientes activos. El término "portador" incluye, pero no se limita a, surfactantes , diluyentes, soluciones reguladoras, sales, y conservadores o estabilizantes. Los estabilizantes utilizan para inhibir o retardar las reacciones de descomposición del fármaco que incluyen, pero a manera de ejemplo, reacciones oxidantes. II. Métodos de Elaboración Los polímeros descritos en la presente se pueden preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Los copolímeros de poli (ácido ricinoleico-anhídrido) se pueden preparar mediante condensación por fusión. En una modalidad, un ácido alifático o dicarboxílico aromático se hace reaccionar con anhídrido acético para formar un prepolime.ro de polianhídrido . El polímero se calienta bajo vacío alto para formar un polianhídrido . Los copolímeros de poli (ácido ricinoleico-anhídrido) de peso molecular bajo se puede preparar mediante la esterificación de un polianhídrido con ácido ricinoleico. Alternativamente, los copolímeros de poli (ácido ricinoleico-anhídrido) de peso molecular más alto se pueden preparar mediante la esterificación de un polianhídrido con oligómero de ácido ricinoleico a presión ambiente bajo una atmósfera inerte. La reacción se termina cuando el peso molecular del polímero es 1000 Daltons. En anhídrido acético se adiciona al polímero y la solución se calienta durante 30 minutos. En anhídrido acético en exceso se remueve dando por resultado un prepolime.ro aceitosa. El prepolímero se polimeriza con calor bajo vacío alto para formar el polímero final. El peso molecular del polímero final es dependiente de tiempo de reacción así como también la pureza del ácido ricinoleico. Por ejemplo, los polímeros preparados con monómero de ácido ricinoleico puro tuvieron un peso molecular máximo de 8,000. En contraste, los polímeros preparados de ácido ricinoleico crudo (contenido de ácido ricinoleico al 85%) tuvieron un peso molecular máximo de 3,500 Daltons. Los poliésteres que contienen unidades de monómero de ácido ricinoleico se pueden preparar al hacer reaccionar un ácido hidroxialcanoico , tal como ácido L-láctico, ácido D,L-láctico, ácido glicólico, ácido hidroxicapróico, y mezclas de los mismos con aceite de ricino en la presencia de H3PO4 como un catalizador. Los polímeros se pueden cargar con uno o más agentes terapéuticos, de diagnostico y/o profilácticos mediante mezclado directo de polímero y agente sin la necesidad por calor y/o solventes. El polímero y el fármaco se mezclan asta que una pasta blanda se forma. Uno o más aditivos se pueden adicionar a los polímeros cargados con fármaco para reducir la viscosidad y/o mejorar la inyectabilidad de las formulaciones. Ejemplos de aditivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido ricinoleico, fosfolípidos, PEG 400, y PEG 2000. Si se utilizan aditivos, típicamente, el fármaco primero se mezcla con el aditivo (s) y luego la mezcla de fármaco-aditivo ( s ) se incorpora en el polímero. Nuevamente, los aditivos se pueden mezclar con el fármaco y los polímeros directamente, sin la necesidad por calor y/o solventes. III . Métodos de Uso Las composiciones poliméricas descritas en la presente se pueden utilizar como portadores degradables para tratar enfermedades locales tales como cáncer, infecciones locales bacterianas y de hongos y dolor. La quimioterapia especifica de sitio se proporcionan las concentraciones de fármaco altas para un periodo de tiempo prolongado en el sitio de enfermedad es una manera efectiva para tratar células afectadas permanentes después de la recepción del área infectada tal como tumores sólidos. Típicamente la formulación administra mediante inyección y/o implantación, intramuscularmente , subcutáneamente, intraperitonealmente, y/o intratumor (antes, o después de la recepción del tumor). Los polímeros son líquidos o pastas a temperaturas ambientes tal que se pueden inyectar o implantar sin la necesidad por aditivos. Sin embargo, los aditivos se pueden adicionar para reducir la viscosidad y/o mejorar la inyectabilidad de las composiciones como se necesite. De interés específico es la aplicación de estos polímeros para la quimioterapia específica de sitio para el tratamiento de tumores sólidos incluyen: carcinoma de célula escamosa (SCC) de la cabeza y & cuello, cáncer de próstata, y sarcomas para la inyección o inserción intratumoral . El cáncer de la cabeza y cuello toma en cuenta aproximadamente 40, 000 casos cada año en- los Estados Unidos, aproximadamente 5% de cáncer nuevos en los Estados Unidos. Diferentes a otros tumores sólidos, la manifestación mucho más común de recurrencia de cáncer de cabeza y cuello es regional, esto es, recurrencia en el cuello. Un dispositivo prospectivo basado sobre los polímeros de esta invención es un implante polimérico en pasta o líquido, hecho de una matriz de polímero biodegradable cargada con un agente anticáncer. El agente anticáncer, tal como Metotrexato o Paclitaxel, se dispersa homogéneamente en la matriz de polímero. El fármaco activo se libera de una manera controlada al tejido circundarte, cuando se coloca en contacto con los fluidos corporales, mientras que exportador de polímero esta eliminando mediante la degradación lenta. El implante, en una forma de un líquido o pasta inyectable, se inyecta en el tumor o se inserta en el sitio del tumor durante el procedimiento quirúrgico de la remoción del tumor. El implante proporciona una dosis alta de fármaco anticáncer durante un periodo de tiempo prolongado, típicamente días, semanas o meses, en el sitio del tumor, con distribución de fármaco sistémica mínima, de esta manera, proporcionando un tratamiento localizado de las células tumorales residuales como una terapia con fármaco implementaría a la cirugía. El mismo concepto de suministro de fármaco a largo plazo a los sitios corporales enfermos específicos aplica también a otros tumores sólidos, infecciones locales tales como infección de osteomielitis-hueso, suministro anestésico local para pacientes con cáncer o sida y fármacos que controlan el crecimiento del tejido tal como heparina y esferoides para tratar restenosis y queloides. Los polímeros también se pueden utilizar como recubrimientos sobre dispositivos médicos implantables , tales como stents, como sellantes quirúrgicos o como barreras para la reducción de la adhesión de órgano a órgano. Ejemplos Materiales e Instrumentación Ácido ricinoleico (RA) 85% puro se obtuvo de Fluka, Buch, Suiza y se purificó a 97% determinado por cromatografía. El ácido sebácico (SA) 99%, ácido Adípico, ácido fumárico, anhídrido maleico, y anhídrido succínico se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Israel). Todos los solventes fueron de grado analítico de BioLab (Jerusalén, Israel) o F'rutarom (Haifa, Israel) y se utilizaron sin purificación adicional . Los pesos moleculares de los poli ( éster-anhídridos ) se estimaron sobre un sistema de cromatografía de permeación en gel (GPC) que consiste de una bomba de HPLC isocrática Waters 1515 con detector de índice refractivos (RI) Waters 2410, una válvula de inyección Reodine (Coatati, CA) con un serpentín de 20- L (Waters Ma). Las muestras se eluyeron con cloroformo a través de una columna lineal a una velocidad de flujo de 1 mL./min. Los pesos moleculares se determinaron relativos a los estándares del poliestireno ( Polyscience, Warrington, PA) . La espectroscopia infrarroja (IR) (Perkin Elmer, 2000 FTIR) se realizó sobre prepolímeros , muestras de polímeros y sobre muestras hidrolizadas vaciadas sobre placas de NaCl de solución de diclorometano . El análisis térmico se determinó sobre un calorímetro de exploración diferencial Mettler TA 4000-DSC, calibrados con estándares de zinc ("Zn") e indio ("In"), a una velocidad de calentamiento de 10°C/min (peso de la muestra promedio 10 mg) y sobre un calentador de punto de fusión SMP1 Stuart Scientific. La microscopía de electrones de Crioexploración (Cryo-SEM) se condujo utilizando Quanta 2000 SEM (30kV) . La microscopía de luz se condujo mediante las observaciones microscópicas de las muestras bajo el estereomicroscopio Stemi SVl 1 (Zeiss, Alemania) equipado con cámara Digital Cooplix 990 (Nikon, Japón) . La viscosidad de los polímeros se determinó utilizando el método rotacional (reómetro programable Brookfield, LV-DV-III) . Se utilizó el hhusillo cilindrico LV4. Ejemplo 1: Preparación de los copolimeros de poli (ácido ricinoleico-ácido sebácico) . Preparación de ácido ricinoleico puro Se disolvió aceite de ricino en 2 volumen de KOH 2N en etanol a temperatura ambiente durante pocas horas con agitación continua. El precipitado de ricino.!.eato de potasio resultante en etanol se mezcló con éter isopropilico para separa mejor el precipitado, y la mezcla se dejó separar. La suspensión de precipitado se centrifugó para separa los sólidos y el solvente de decanto. La sal de potasio de ácido ricinoleico se dispersó en solución de HC1 1N helada y se extrajo con acetato de etilo. Después de la valoración del solvente, se obtuvo un aceite ligeramente amarillo que contuvo 100% de ácidos grasos de los cuales por lo menos 95% fue ácido ricinoleico como es determinado por la cromatografía de gas. Síntesis del polímero PSA (poli (ácido sebácico) ) se preparó mediante la condensación por fusión. El ácido sebácico se hirvió en anhídrido acético durante 20 minutos. El anhídrido acético se evaporó a sequedad para obtener un prepolímero blancuzco de ácido sebácico. Para preparar el PSA, el prepolímero de ácido sebácico se calentó a 140°C bajo vacío alto (1.3X10"1 mbar) durante 3 horas para obtener el poli (ácido sebácico) que tiene un Mw > 30000Da. Los copolímeros de poli (ácido sebácico-co-ácido ricinoleico) (AS3-102, AS3-101, AS3-92) (p(SA:RA)) de peso molecular bajo se prepararon mediante la esterificación de PSA con ácido ricinoleico (RA, Mw 298 Da) .

Los copolímeros de (p(SA:RA)) de peso molecular más alto se prepararon (AS3-114, AS3-104) mediante la esterificación del PSA con oligómero de RA (Mw - 2100-3500Da) . La transesterificación se hace en relación de 3:7 p/p para P(SA:RA) (3:7) (AS3-101, AS3-102, AS3-114) y en relación de 2:8 para P ( SA : RA) ( 2 : 8 ) (AS 3 -92, AS3-104) . La reacción se hizo en un matraz seco en volumen bajo una atmósfera de nitrógeno a 120°C durante 3-4 horas. La reacción termino cuando un peso molecular de 1000 Daltons se logro. Después de eso, el anhídrido acético se adicionó (1/1 p/p) - La solución-se refundió durante 30 minutos a 140°C y el anhídrido acético y ácido acético en exceso se evaporó a sequedad para producir un aceite amarillo viscoso. El polímero aceitoso se polimerizó a 140°C bajo un vacío de 0.19-0.32 mm Hg durante 4 a 8 horas, dependiendo del peso molecular deseado. Para los polímeros preparados de oligómero de ácido de ricinoleico, mientras más largo es el tiempo de' reacción más alto es peso molecular resultante del polímero. Para los polímeros preparados con monómero de ácido ricinoleico, el MW más alto alcanzado fue Mw=8,000. Para los polímeros preparados de ácido ricinoleico, 85% de contenido de ácido ricinoleico, se obtuvo un peso molecular de hasta 3,500. Resultados y Discusión Las tablas enseguida proporcionan el peso molecular de los polímeros. Los polímeros se prepararon como se describe en lo anterior. Tabla 1: Pesos moleculares promedio en peso y promedio en número del P(SA:RA)3: 7 PSA - poli (anhidrido-sebácico) , Mw=38,000; Mn=22,000 preparados mediante condensación por fusión de ácido sebácico utilizando anhídrido acético como agente deshidratante. Tabla 2 : Pesos moleculares promedio en peso y promedio en número del P(SA:RA)2:8 Nombre Componente A Componente B Mw, Mn (Da) 6 PSA RA 95% puro Mw 3700 Mn 3200 ' 7 PSA RA 85% puro M 21.00 Mn 1400 8 PSA Oligómero RA Mw 18200 (Mw 3500) Mn 13400 9 PSA Oligómero RA Mw 16500 (Mw 1200) Mn 1 1300 PSA - poli (anhídrido-sebácico) , Mw=38,000; Mn=22,000 preparados mediante condensación por fusión de ácido sebácico utilizando anhídrido acético como agente deshidratante. Tabla 3: polímeros preparados de otros diácidos PAA - poli (anhídrido adípico) , Mn=38,000; PFA- poli ( anhídrido fumárico) , Mn=14, 000; PAzA - poli (anhídrido azeláico), Mn-32,000; PSubA-poli (anhídrido subérico) Mn=27,000, IL - líquido inyectable; pasta inyectable de IP. Ejemplo 2: Poli (éster-anhidridos) s líquido-basado sobre Ácido Ricinoleico y Varios Diácidos Grasos . Síntesis Poli (fumárico-co-ricinoleico-éster-anhídrido) relación 3:7 p/p 20 gramos de ácido fumárico (FA) se reflujaron en anhídrido acético durante 2 horas. El anhídrido acético se evaporó y el residuo se polimerizó a 170°C durante 4 horas para obtener el poli (ácido fumárico) (PFA) que tiene un peso molecular de 20,000. 50 gramos de oligómeros de ácido ricinoleico (RA) (Mw=700) se adicionaron y después de 4 horas de transesterificación a 120°C, el peso molecular del polímero cayó a 1200 Daltons. Los oligómeros se activaron mediante anhídrido acético y se repolimerizaron . El polímero resultante tuvo un Mw de 15000 y un Mn de 8000. Pico de DSC MP a 34°C. IR: 1732 cm'1 y 1819 cm"1 Po1i (adípi co-co-ri cino1eico-éster-anhídrido) relación de 2:8 p/p 20 gramos de ácido adípico (AA) se reflujaron en anhídrido acético durante 30 minutos. El anhídrido acético se evaporó el prepolirae.ro de ácido adípico se polimerizó a 170 °C durante 4 horas para producir un polímero que tiene un peso molecular de 27000 Daltons. 50 gramos de RA se adicionaron y después de 4 horas de transesterificación a 120°C, el peso molecular del polímero cayó a 900. Los oligómeros se activaron mediante anhídrido acético y se repolimerizaron. El polímero resultante tuvo un Mn de 4000 y un Mw de 6000. El .punto de fusión del polímero fue de 10°C. IR: 1732 cm-1 y 1819 cm"1. NMR: 5.3 ppm y 5.4 ppm (CH=CH) , 4.8 ppm (CH-O-CO) , 1.6 ppm (ácido adípico CH2-CH2-CH2) . Similarmente , los polímeros se prepararon de oligómeros de ácido ricinoleico de Mw=2200 para producir un polímero líquido de Mw= 15,000. Poli (succínico-co-ricinoleico-éster-anhidrido) relación de 1:1 m/m 36 gramos (0.12 mol) de RA y anhídrido succínico (24 gramos, 0.24 mol) se reflujaron en tolueno durante la noche. El solvente se evaporó y el producto se disolvió en diclorometano , se filtró y se lavó 4. veces con agua doblemente destilada (DDW) par disolver el anhídrido succínico no reaccionado. El rendimiento fue de 67%. El NMR reconfirmó la formación de éster - 4.8 ppm (CH-O-CO) . El producto se refundió en anhídrido acético (1:10 w/v) durante 30 minutos y se evaporo hasta sequedad. El prepolímero se polimerizó mediante la condensación de anhídrido. Después de 4 horas, Mn=4200 y Mw=6200. El punto de fusión del polímero fue de -2°C. IR: 1732 cm"1 y 1819 cnf1. NMR: 5.3 ppm y 5.4 ppm (CH=CH) , 4.8 ppm (CH-O-CO), 2.6 ppm (succinato de CO-CH2-CH2-CO) . Los polímeros se prepararon de oligómeros de ácido ricinoleico de Mw=2200 para producir un polímero líquido de Mw=20,000. Poli (maleico-co-riciñoleico-éste -anhídrido) relación de 1:1 m/m 36 gramos (0.12 mol) de RA y anhídrido maleico (24 gramos, 0.24 mol) se reflujaron en tolueno durante la noche. El solvente se evaporó y el producto se disolvió en diclorometano, se filtro y se lavó 4 veces con DDW para disolver en anhídrido maleico no reaccionado. El rendimiento fue de 72%. El N R confirmó la formación de éster - 4.8 ppm (CH-O-CO) . El producto se refundió en anhídrido acético (1:10 /v) durante 30 minutos y se evaporó hasta sequedad. El prepolímero se polimerizó mediante la condensación de anhídrido. Después de 4 horas, el Mn=4700 y el w=7000. El punto de fusión del polímero fue -8°C. Después de 24 horas, Mn=11000 y el Mw=14000 (constante) . IR: 1732 cm"1 y 1819 era"1. NMR: 5.3 ppm y 5.4 ppm (CH=CH) , 4.8 ppm (CH-O-CO), 6.8 ppm y 6.2 ppm (maleato de CO- CH2=CH2-CO) . Similarmente, los polímeros se prepararon de oligómeros de ácido ricinoleico de Mw=2200 para producir un polímero líquido de Mw mayor que 15, 000. Poli (succínico-co-oligoricinoleico-éster-anhidrido) relación de 1:1 m/m Oligómeros de RA se prepararon en esterificación de RA en volumen a 120°C durante 7 horas. Los pesos moleculares obtenidos fueron: 300, 900, 1200, y 2100 (1, 3, 4, y 7 unidades de repetición), peso molecular promedio fue Mn~950. 40 gramos (0.04 mol) de oligómero de RA y anhídrido succínico (8.4 gramos, 0.08 mol) se reflujaron en tolueno durante la noche. El solvente se evaporó y el producto se disolvió en diclorometano, se filtró y se lavó 4 veces con DDW para disolver el anhídrido succínico no reaccionado. El producto se refundió en anhídrido acético (1:10 w/v) durante 30 minutos y se evaporó hasta sequedad. El prepolímero se polimerizó mediante la condensación de anhídrido para producir los polímeros de peso molecular altos. IR: 1732 cm"1 y 1819 cm"1 NMR: 5.3 ppm y 5.4 ppm (CH=CH) , 4.8 ppm (CH-O-CO) , 2.6 (succinato de CO-CH2-CH2-CO) . Los polímeros similares se prepararon de anhídrido maleico al remplazar en anhídrido succínico con anhídrido maleico. NMR: 5.3 ppm y 5.4 ppm (CH=CH) , 4.8 ppm (éster de ácido ricinoleico de CH-O-CO), 4.9 ppm (éster de maleato de ricinoleico de CH-O-CO), 6.8 ppm y 6.2 ppm (maleato de CO-CH2=CH2-CO) . Ejemplo 3: Comportamiento Significante y Evaluación In vivo de los polímeros de Poli (éster anhídrido) preparados de Ácido Ricinoleico El comportamiento de la gelificación de los polímeros se evaluó utilizando análisis térmicos, microscopía de luz, microscopía de electrones de crió exploración inhibiciones de viscosidad. Microscopía de Luz Las diferencias entre el polímero antes y después de la exposición a la solución reguladora se examinaron mediante observaciones microscópicas de las muestras bajo el estereomicroscopio Stemi SV 11 (Zeiss, Alemania) equipado con una cámara Digital (Cooplix 990, Nikon, Japón) para el registro de imagen. El registro de imagen se realizó en modo de calidad normal aplicando aumentos de zoom de microscopio diferentes con untamente con el zoom de la cámara digital ajustados a la mejor resolución visual. La iluminación se realizó mediante luz reflejada, suministrada por sistemas de iluminación electrónicos KL 1500 (Zeiss, Alemania). En el contacto de los polímeros con un medio acuoso, los cambios en la muestra de polímero fueron visibles. El polímero antes de la exposición a la solución reguladora (polímero seco) fue transparente mientras, después el proceso de gelificación tomo lugar (8 horas en la solución reguladora), el polímero fue opaco. Cuando el polímero se corto, se encontraron dos regiones distintas: una región exterior que fue un gel (1) y el núcleo (2) que se presento como una matriz blanda. Microscopía de electrones de crio-exploración (Crio-SEM) Muestras de polímero húmedas y secas se fijaron sobre un extremo corto, se congelaron con nitrógeno líquido bajo vacío alto, y luego se recubrieron con poro utilizando un Polarone E5100. Para preparar las muestras de polímero para la Crio-SEM, los polímeros se inyectaron en una solución reguladora (0.1 M, pH 7.4) . Después de 24 horas las muestras se retiraron y se colocaron sobre un talón sin el secado. La muestra se congelo con nitrógeno líquido bajo vacío alto. La muestra congelada se recubrió con oro utilizando Polarone E5100. La remoción del agua absorbida del polímero expuesto (mediante el secado o liofilización) convirtió al polímero a un aceite con las mismas características como antes de que el polímero se expusiera al agua. La Crio microscopía permitió el congelamiento de la muestra mientras que todavía contuvo el agua absorbida y así posible al suavizar el polímero cuando se afecto por el medio acuoso. El polímero antes de la exposición a la solución reguladora (polímero seco) tuvo una superficie homogénea, mientras que la muestra al polímero expuesta al agua mostró una estructura definida en la capa exterior que estuvo cerca al medio acuoso. Las cadenas del polímero, expuestas al agua, formaron una clase de una red rígida a través de la gota de la muestra de polímero inyectada al agua. Esta red causo que la gota de polímero que mantuviera su forma en el medio acuoso. Una extracción transversal de la gotita de polímero mostró que interior del polímero permaneció intacto, similar al polímero antes de ,1a exposición a la fase acuosa. Estos hallazgos muestran que la gelificación de polímero ocurrió solo sobre la superficie que entubo en contacto con el medio acuoso. Absorción de agua Muestras de polímero (P(SA:RA) (3:7) y P(SA:RA) (2:8) se colocaron en una solución reguladora de fosfato (pH 7.4, 0,1 M, 37°C) y la titulación de^KF se realizó después de O, 4, 12, 26, y 40 horas de exposición en la solución reguladora. Una muestra de polímero separada se preparó para cada punto de tiempo. En cada punto de tiempo, el polímero se tomo de la solución reguladora, se mancho sobre papel absorbente, se peso, y se disolvió en 1 mi de diclorometano . La solución de polímero se colocó en una vasija de titulación. La titulación directa se realizó en metanol utilizando reactivos KF regulares. La muestra del núcleo interior del espécimen se preparó similarmente . Calorimetría de Exploración Diferenciada Se tomaron las endotermas de P(SA:RA) (3:7) en duraciones diferentes de exposición a la solución reguladora. Antes de la exposición del polímero a la solución reguladora existe una transición que maximiza a 35°C. Después de 3 horas en solución reguladora el pico fue a 38.3°C, y a 12 horas en solución reguladora la transición llego hacer 45°C. A 24 horas la transición adicional se presentó a 61°C que puede indicar el comienzo de proceso de degradación, es decir formación de ácido sebácico. Resultados similares se encontraron para P(SA:RA) (2:8), antes de la exposición del polímero la solución reguladora hay una transición que maximiza a aproximadamente 32 °C. Después de 12 horas y 24 horas en solución reguladora la temperatura de transición llego a ser de 42°C y 50°C, respecti amente. Otra observación hecha sobre los polímeros mantenidos en la solución reguladora es la capacidad de hinchamiento del polímero. Se encontró que P(SA:RA) (2:8) y P(SA:RA) (3:7) incrementaron en su volumen por 15% durante las primeras 24 horas en solución reguladora. Medición de viscosidad Se utilizaron hhusillos cilindricos. La viscosidad de los polímeros se midió antes de que los polímeros se expusieran al medio acuoso y después de la incubación durante 12 horas en solución reguladora de fosfato (0.1 M, pH 7.4) a 37 °C con agitación constante (100 RPM) . ? fin de obtener una muestra suficientemente grande para realizar la medición de viscosidad los polímeros se extendieron sobre una superficie grande y se colocaron en la solución reguladora. Después de la exposición al medio acuoso la mezcla de polímero se recolectó y se colocó en el contenedor de vidrio. La prueba de sensibilidad de temperatura se realizó comenzando a temperatura de 40°C y bajando a temperatura ambiente (22°C) al aplicar velocidad rotacional constante. La detección del comportamiento reológico se realizó al medir la tensión de esfuerzo cortante y/o viscosidad en proporciones de esfuerzo cortante diferentes, comenzando a 0.209 seg"1, para polímeros más viscosos y hasta 36 seg-1 para un polímero menos viscoso. Todos los experimentos se realizaron en triplicados. La Figura 1 muestra la viscosidades del polímero P(SA:RA) (3:7) en tres proporciones de esfuerzo cortante diferentes (8.4, 12.5 y 21 seg"" ) . La viscosidad se midió comenzando a 43°C a ' la temperatura más baja que fue posible medir (25°C en el caso de P ( SA : RA) ( 3 : 7 ) . P ( SA : RA) (3:7) muestra propiedades de fluido no Newtoniano en temperaturas más bajas (<30°C) , debido a una relación de proporción de esfuerzo cortante/tensión de esfuerzo cortante no constante y el polímero se puede clasificar como un material de adelgazamiento por esfuerzo cortante pseudoplástico que exhibe disminución de viscosidad con incremento de proporción de esfuerzo cortante. Este compartimiento es importante para la inyectabilidad del polímero: conforme la presión se aplica, la pasta de polímero llega hacer más blanda y se bombea a través de la aguja. A temperaturas más altas (>30°C), P(SA:RA) (3:7) actúa como un fluido newtoniano y su viscosidad se afecta por la proporción de esfuerzo cortante aplicada. Las temperaturas de interés más grandes son temperatura ambiente (aproximadamente 22-25°C, preferiblemente 25°C) debido a que es la temperatura en la cual el polímero se inyecta, y la temperatura corporal (37°C), porque esta es la temperatura en la cual el polímero se expone después de la inyección al cuerpo. Cuando las proporcione de esfuerzo cortante de 8.4 seg-1 y 12.5 seg-1 se aplicaron a temperatura ambiente la viscosidad de P(SA:RA) (3:7) previo a la exposición al medio acuoso fue 8600-9000 cP, mientras que después de la exposición al agua, la viscosidad fue muy alta para ser medida a temperatura ambiente en aquellas proporciones de esfuerzo cortante. El incremento en la viscosidad del polímero después de la exposición a medio acuoso a 37°C fue dependiente sobre la proporción de esfuerzo cortante: para una proporción de esfuerzo cortante de 8.4 seg"1, la viscosidad se incrementó de 4200 cP a 8940 cP después de la exposición a la solución reguladora; en una proporción de esfuerzo cortante de 12.5 seg-1, la viscosidad se incrementó de 4360 cP a 6770 cP; y a 21 seg"1 la viscosidad se incrementó de 4115 cP 5765 cP. Después de la exposición al medio acuoso, el polímero muestra un comportamiento pseudoplástico . Esto se puede explicar mediante la reorganización de las cadenas de polímero inducidas por al exposición a la solución reguladora, que se destruye en el momento de girar el husillo. Mientras más rápida es la rotación del husillo (proporción de esfuerzo cortante más alta), más es la estructura que se destruye y mientras menos son la moléculas de estructura que se deslizan con untamente, más baja será la viscosidad. La Figura 2 muestra las viscosidades del polímero P(SA:RA) (25:75) en tres proporciones de esfuerzo cortante diferentes (12.5, 21 y 31 seg"1) . La viscosidad se midió comenzando a 43°C a temperatura ambiente. El P (SA: RA) (25 : 75) tuvo una viscosidad más baja que P(SA:RA)3:7, debido a su contenido más alto de ácido ricinoleico que contribuye a la liquidez del polímero. El P(SA:RA) (25:75) actúa como un fluido Newtoniano y su viscosidad no se afecta por la proporción de esfuerzo cortante aplicada en este intervalo de temperaturas. Debido a que la viscosidad más baja del polímero se midió a proporciones de esfuerzo cortante más altas. A temperatura ambiente todas las proporciones de esfuerzo cortante aplicada (12.5, 21 y 31 seg"1) , la viscosidad de P(SA:RA) (25:75) previo a la exposición al medio acuoso fue de aproximadamente 2900 cP, mientras que después de la exposición las viscosidades fueron 8570 cP a 12.5 seg-1, 5000 el? a 21 seg-1 y muy alta para ser medida a 31 seg"1. La viscosidad de P(SA:RA) (25:75) después de la exposición al medio acuoso cuando se midió a 37 °C mostró comportamiento de fluido Newtoniano, pero todavía hubo un incremento en la viscosidad de polímero por 2200 cP (1150 cP antes de la exposición a la solución reguladora y 3200 cP después) . En el caso de P(SA:RA) (25:75), el polímero mostró comportamiento pseudoplásticos solo cuando la viscosidad se midió a temperatura ambiente, pero no a 37 °C. Las viscosidades de P(SA:RA) (2:8) se midieron en dos proporciones de esfuerzo cortante diferentes (21 y 31 seg-1). El P(SA:RA) (2:8) mostró viscosidad más baja que aquella de P(SA:RA) (25:75), debido a su contenido más alto de ácido ricinoleico (80%). El P (SA: RA) (2 : 8 ) actúa como un fluido Newtoniano y su viscosidad no se afecta por la proporción de esfuerzo cortante aplicada en este intervalo de temperaturas. Debido a la. viscosidad más baja del polímero se midió en proporciones de esfuerzo cortante más altas. A temperatura ambiente en ambas proporciones de esfuerzo cortante aplicada (21 y 31 seg-1) , la viscosidad de P(SA:RA) (2:8) previo a la exposición al medio acuoso fue de aproximadamente 900 cP, mientras que después de la exposición, las viscosidades fueron de 1800' cP a 21 seg-1 y 1900 cP a 31 seg-1. La viscosidad de P ( SA : RA) (2:8) después de la exposición al medio acuoso cuando se midió a 37 °C también mostró comportamiento de fluido Newtoniano. La Figura 3 muestra las viscosidades de polímero de poli (ácido ricinoleico) (PRA) en tres proporciones de esfuerzo cortante diferentes (12.5, 21 y 31 seg-1) . El PRA tiene viscosidad similar a P(SA:RA) (2:8), pero este polímero es líquido aun a 4°C, no cambia después del contacto con el medio acuoso y actúa más similar a un aceite. El PRA actúa como un fluido Newtoniano y su viscosidad no se afecta por la proporción de esfuerzo cortante aplicada en este intervalo de temperaturas. La relación entre la tensión de esfuerzo cortante (F) y la. proporción de esfuerzo cortante (dv/dr) se expresa matemáticamente en la ecuación de Newton: F = '? dv/dr donde la constante de proporcionalidad, ?, es el coeficiente de viscosidad. La Figura 4 muestra la relación entre la proporción de esfuerzo cortante y la tensión de esfuerzo cortante de los siguientes: P ( SA : RA) (25:75) , P ( SA : RA) (2:8) y PRA antes y después de la exposición al medio acuoso. La pendiente de la curva que corresponde con P(SA:RA) (25:75) (Figura 6a) aquella gelificada en el medio acuoso es de 23 veces más alta que antes de la exposición a la fase acuosa . Con respecto a PRA, no hubo cambio en la viscosidad del polímero en la exposición al medio acuoso. Evaluación in Vivo de las formulaciones Ratones C3H hembras de 8-10 semanas de edad endógamas, pesando aproximadamente 20 g (Harían Laboratories, Israel) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF) y se les dio libre acceso para alimento estéril irradiado y agua acidificada por todo el experimento. Volúmenes diferentes de polímeros P(SA:RA) (0.05.0.1 y 0.15 mi) se inyectaron subcutáneamente a.l espacio de la espalda por la vía de una aguja de 22G. 8 y 24 horas después de la inyección, los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical. La piel del animal se elevó y el implantación de polímero se expuso y se fotografió. F.l comité de ética en la Universidad Hebrea en Jerusalén (número de aprobación NIH: OPRR-A01-5011 ) ha revisado la solicitud para el estudio en animales y la encontró compatible con los estándares para el cuidado y uso de animales de laboratorio (número de búsqueda de comité de ética: MD-80.04 -3 ) . Los ratones inyectados con tres volúmenes diferentes de P ( SA : RA) (3:7) (0.05.0.1 y 0.15 mi) antes (12a) y después (Figs. 5b y 5c) se sacrificaron en 8 y 24 horas, respectivamente. En ambos puntos de tiempo, los implantes inyectados mantuvieron su forma y permanecieron en el sitio de inyección, como pasa cuando el aceite se inyecta en el espacio subcutáneo. Estos experimentos in vivo probaron que el polímero se volvió en gel al contacto con el tejido. Adicionalmente , el efecto sistémico y local de los implantes de p(SA:RA) (3:7) en ratas se observó durante un período de 6 semanas. El p(SA:RA) se sintetizó mediante la condensación por fusión y un peso molecular promedio en peso de 11,600. Las ratas Spraque-Dawley hembras (SD) se obtuvieron de Harían Lab. (Jerusalén, Israel). El peso de las ratas en el implantación fue de 210 ± 15.0 g. Las ratas se alojaron en la unidad de SPF de la instalación animal y se les permitió libre el acceso a alimento y agua. Las ratas se asignaron aleatoriamente a uno de dos grupos (n=4) : un grupo de control, Grupo A, que consiste de ratas que recibieron solución salina en los mismos sitios de la inyección-implantación y se anestesiaron de la misma manera como el grupo que recibe los implantes de polímero, y el Grupo B, que consiste de ratas implantadas con matrices de polímero.

Cada rata se removió de su jaula respectiva y se anestesió utilizando solución de hidrato de cloral al 5% isotónico (0.64 ml/100 g) administrado a través de la ruta intraperitoneal . Cada rata habla sido afeitada utilizando una esquiladora para animal sobre ambos lados del dorso y las áreas femorales. Luego los animales se prepararon asépticamente utilizando alcohol al 70%. Los implantes de polímero se inyectaron a través de aguja de 22 G subcutáneamente en ambos lados de cada animal e intramuscularmente en el músculo femoral sobre ambos lados. Las ratas se les permitió despertar en la habitación de operación antes de que se regresaran a sus jaulas. A 5 días de la pre-implantación y el día de la implantación se extrajeron muestras de sangre de la vena de la cola para la determinación de los parámetros de la linea base parapara cada rata. ? 3, 7, 21 y 42 días del posimplantación las ratas se anestesiaron y se extrajeron muestras de sangre mediante punción cardiaca. Las muestras luego se analizaron (A L, Herzliya Pituah, Israel) para la química clínica y para parámetros hematológicos para cada rata. Las ratas que recibieron el implante de polímero se dividieron en dos grupos . El primer grupo consistió de ratas SD que recibieron cuatro inyecciones de polímero puro. Dos inyecciones, de 200 µ? cada una, fueron subcutáneas sobre los lados dorsales opuestos cada una. Las otras dos, de 50 µ? cada una, se hicieron intramuscularmente en el músculo femoral de cada pata. Una implantación se utilizó para la estimación de biodegradación , un segundo . implantación para la evaluación histopatológica . Los órganos de las ratas se seleccionaron aleatoriamente para la evaluación de toxicidad sistémica . El segundo grupo consistió de ratas Wistar recibieron 10 . µ? de polímero puro intracranealmente . El polímero se inyectó a través de un agujero en el cráneo hecho sobre la región parietal izquierda con su centro de 5.5 mm detrás de la estructura coronal y 3.5 mm lateral a la estructura sagital. Las inyecciones se realizaron con jeringa de 25 µ? y la profundidad de la inserción de la aguja fue de 4 mm desde la superficie coronal. En los días 3, 7, 21 y 42 post-implantación, las ratas se anestesiaron como se describe en lo anterior, se pesaron y el peso de cada rata se registró. Las ratas luego se sacrificaron mediante punción cardiaca y se les practicó la autopsia. La observación total de varios órganos y sitios de implantación se hicieron en el tiempo de la autopsia. Estos órganos luego se removieron, se pesaron, y se fijaron en formaldehído regulado al 4% (Biolab, Jerusalén, Israel). Los tejidos recolectados incluyeron: corazón, cerebro, hígado, baso, pulmones, timo y riñon. Además, los sitios de implantación locales, se removieron y se fijaron en formaldehido regulado al 4%. Todos los tejidos se seccionaron y se mancharon con hematoxilina y eosina y se examinaron microscópicamente . Durante la autopsia, el implante de polímero se removió, se disolvió en cloroformo, se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el solvente orgánico se evaporó. El residuo aislado se pesó y se examinó mediante IR para contenido de anhídrido y éster, GPC para la determinación de peso molecular y N R para la relación de RA a SA. Las alícuotas de la matriz de polímero degradado se hidrol.iza.ron con KOH acuoso 1 N, se acidificaron con HC1 concentrado y el residuo de aceite liberados se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el solvente se evaporó a sequedad. Los productos de la hidrólisis del polímero se examinaron para el contenido de ácido ricinoleico y ácido sebácico utilizando HPLC. La biocompatibilidad de cada tejido se degradó por 5 grados de tolerancia excelente a intolerancia como sigue: Tolerancia excelente (reacción inflamatoria nada o mínima ) Buena tolerancia (reacción adversa mínima, inflamación mínima) Tolerancia moderada (grado moderado de inflamación) Tolerancia no buena (reacción adversa, reacción inflamatoria ) Intolerancia (necrosis severa y reacción inflamatoria ) Todos los animales fueron saludables y ganaron peso similar a los animales de control. Ningún afecto adverso o hinchamiento se observó en los sitios de implantación, mientras que el polímero inyectado se sintió sólido cuando se tocó el sitio. Todos los órganos separados de los animales del estudio fueron normales y no se encontró diferencia entre el control y los grupos de polímero. La histopatología de los tejidos de sitio de inyección/implantación indicaron una inflamación aguda y alguna necrosis a los 3 días de punto de tiempo con la reacción adversa confinada en la parte superior del sitio de inyección y los tejidos que están dentro de mm del polímero. En el días 7, todos los sitios de implantación mostraron inflamación mínima a moderada con mejora significante comparada a los sitios del día 3. En el día 21 y 42, se detectó tolerabilidad excelente. Estos resultados de histopatología son similares a los resultados previamente reportados para la compatibilidad de los poliésteres y polianhídridos biodegradables clínicamente utilizados. Con respecto a la compatibilidad del cerebro, todos los animales en todos los puntos de tiempo, que incluyen el punto de tiempo del día 3, presentaron biocompatibilidad excelente. Se obtuvieron resultados similares del polímero cargado con paclitaxel . La cantidad de polímero recuperado del sitio de implantación se determinó mediante la medición gravimétrica después del secado de las muestras. Una reducción gradual en el contenido de polímero se encontró con casi la eliminación total por el punto de tiempo del día 42. Conclusión Los resultados de este estudio prueban que el poli (ácido sebácico-co-ricinoleico) descrito en este experimento se gelifica en la interacción con el medio de agua y así tiene un uso en la formación in situ del implantación de polímero o uso como sellante biodegradable o barrera para prevenir la adhesión del tejido. Estos polímeros son materiales netos con nada de solvente que forma in situ un organogel. Los organogeles se componen de lípidos ampifílicos insolubles en agua, que se hinchan en agua y forman varios tipos de cristales líquidos liotrópicos. La naturaleza de la fase cristalina líquida formada depende de las propiedades estructurales del lípido, temperatura y cantidad de agua en el sistema. Los lípidos ampifílicos examinados a la fecha para el suministro de fármacos son principalmente ásteres de glicerol de ácidos grasos, tal como monoleato de glicerol, monopalmitoestearato y monolinoleato que son ceras a temperatura ambiente. Estos compuestos forman una fase de cristal liquida cúbica en la inyección en un medio acuoso. La estructura cristalina liquida fue similar a un gel y altamente viscosa. Los copolimeros de P(SA:RA) son copolimeros insoluoles en agua que exhiben viscosidad y punto de fusión cambian en la exposición a un medio acuoso. Los cambios reológicos son causados para la formación de una red tridimensional, y las imágenes obtenidas utilizando el SEM mostraron una estructura física única reversible que se presentó en la exposición a la solución reguladora. Esta estructura tridimensional se puede explicar mediante el enlace de hidrógeno entre los grupos carboxílico y las moléculas de agua circundantes. El mecanismo similar se sugirió para la lecitina que se conecta por los enlaces de hidrógeno en el organogel, donde los grupos funcionales de lípido exhiben afinidad para los solventes y como se enlaza a ellos (Shchipunov YA, Shumilina E . Lecithin Bridging by Hydrogen-Bonds in the Organogel. Mater. Sci . Eng . C-Biomimetic Mater. Sens . Syst. 1995 ; 3 ( 1 ) : 43-50) . E emplo 4. Liberación in vitro e in vivo del paclitaxel de los polímeros de poli (ácido sebácico-co-ácido ricinoleico) en Tumores de Vejiga de Ratón (MBTs) . Se estudió la efectividad de una formulación polimérica inyectable, basada sobre poli (ácido sebácico-co-ácido ricinoleico) y paclitaxel contra un modelo de tumor heterotrópico .

Métodos y Materiales Poli (ácido sebácico-co-anhídrido de éster de ácido ricinoleico) 2:8 se sintetizó como se discute en lo anterior. El paclitaxel de grado GMP (BioxelPharma , QC, Canadá) , anhídrido acético (Merck, Darmstadt, Alemania), y Lutrol F68 (Sigma, Israel) se utilizaron. Todos los solventes fueron de grado analítico de BioLAB (Jerusalén, Israel) o de Frutarom (Haifa, Israel) y se utilizaron sin purificación adicional. Las células de MBT (tumor de vejiga de ratón) fueron un regalo generoso del Dr. Ofer Gofrit de Hadassah Ein-Karem Hospital (Jerusalén, Israel). El medio de cultivo celular y el suero de becerro fetal (FCS) se obtuvieron de Beit-Haemek ( Israel ) . El peso molecular del poli (éster-anhídrido) se estimó sobre un sistema de cromatografía de permeacion en gel (GPC) que consiste de una bomba de HPLC isocrática. Waters 1515 con detector de índice refractivo (RI) Waters 2410, una válvula de inyección Rheodyne (Coatati, CA) con serpentín de 20-ocL (Waters Ma) . Las muestras se eluyeron con cloroformo a través de una columna Ultrastyrogel lineal (Waters; tamaño de poro 500 Á) a una velocidad de flujo de 1 mL/min. Los pesos moleculares se determinaron relativos a los estándares de poliestireno ( Polyscience, Warrington, PA) con intervalo de peso molecular de 500-10000 utilizando un programa de computadora Breeze. Las concentraciones de paclitaxel en soluciones reguladoras se determinaron mediante el sistema de cromatografía de líquidos de alto desempeño (HPLC [Hewlett Packard, Waldbronn, Alemania] ) compuesto de una bomba HP 1100, un detector de UV HP 1050, y un programa de análisis de datos HP ChemStation utilizando una columna de fase inversa C18 '(LicliroCartR 250-4, LichrospnerR 100, 5 µp?) . Una mezcla de acetonitrilo de 65%: agua al 35% en una velocidad de flujo de 1 ml/min se utilizó como eluyente y la detección de UV se realizó a 230 nm. El contenido de paclitaxel en la matriz de polímero se determinó mediante un sistema de HPLC de fase normal compuesto de una columna de HPLC analítica Si Purospher® STAR (250 x 4 mm, tamaño de partícula 5 µta) se utilizó con una columna Purospher® STAR Si guard (4 x 4 mm, tamaño de partícula 5 µp?) (Merck, Darmstadt, Alemania) a temperatura ambiente (25 + 10°C) . la fase móvil consistió de diclorometano (DCM) y metanol ( MeOH ) en relaciones diferentes (1% - 2.5% v/v) . Un modo isocrático de elución se utilizó con una velocidad de flujo con A 1 ml/min. Se realizó al detección de UV en dos longitudes de onda, 240 nm y 254 nm (Vaisman y colaboradores, 2005) . Preparación de las formulaciones y la liberación del fármaco in vitro Las formulaciones de polímero cargadas con paclitaxel (5% y 10% p/p) se prepararon al mezclar mediante el mezclado directo del polímero con el fármaco a temperatura ambiente. La composición se mezcló hasta que una pasta blanda se formó. Todas las formulaciones se llenaron en jeringas a temperatura ambiente sin calentamiento. Las formulaciones obtenidas fueron pastas semisólidas inyectables a temperatura ambiente. Los estudios de liberación de fármaco in vitro se condujeron al inyectar 10 mg de la muestra de formulación en pasta en una solución reguladora de fosfato de 50 mi (0.1 M, pH 7.4) a 37 °C con agitación constante (100 RPM) . La pasta se endureció a un sólido blando poco después de la adición a la solución reguladora. El medio de liberación se reemplazó periódicamente con solución reguladora fresca y la concentración de paclitaxel en la solución se determinó mediante HPLC. Todos los experimentos se realizaron en triplicado. Degradación hidrolitica in vitro La hidrólisis in vitro se evaluó al inyectar 25 mg de polímero puro P(SA:RA) (2:8) o la formulación que contiene paclitaxel (5 y 10%, p/p) en solución reguladora de fosfato (50 mi, 0.1 M, pH 7.4) a 37°C con agitación constante. (100 PvPM) . El medio se reemplazó periódicamente con solución reguladora fresca. En cada punto de tiempo, la muestra de polímero se tomó de la solución reguladora, se pesó en húmedo y en seco después de la liofilización . La hidrólisis del polímero se monitoreó por (1) disminución de peso molecular y (2) contenido de paclitaxel en la formulación de polímero restante. En cada punto de tiempo la formulación se examinó para el contenido de paclitaxel en la muestra degradada mediante la NP HPLC. Degradación In Vivo de las Formulaciones Ratones C3H hembras de 8-10 semanas de edad endógamas, pesando aproximadamente 20 g (Harían Laboratories, Israel) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicas (SPF) y se les dio libre acceso a alimento estéril irradiado y agua acidificada por todo el experimento. El polímero puro y las formulaciones en pastas que contienen paclitaxel (5% y 10% p/p) se inyectaron subcutáneamente al espacio de la espalda por la vía de una aguja de 23 G en 12 grupos de cuatro ratones C3H en cada grupo. Los animales se observaron para signos de toxicidad local y sistémica y para pérdida de peso. Después de 1, 7, 21 y 70 días, Los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical. El implante de polímero se retiró, se pesó antes y después de la liofilización y se examinó para el contenido de paclitaxel en la formulación restante. El comité de ética en la Universidad Hebrea en Jerusalén (número de aprobación NIH: OPRR-A01-5011 ) revisó este estudio y lo encontró compatible con los estándares para el cuidado y uso de animales de laboratorio (comité de éticas-búsqueda número: MD-80.04-3) . Actividad ant i-tumor in vivo Inoculación de las células MBT Ratones C3H hembras de 8-10 semanas de edad endógamas, pesando aproximadamente 20 g (Harían Laboratories, Israel) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos especificas (SPF) y se les dio libre acceso a alimento irradiado y agua acidificada por todo el experimento. Los ratones se inyectaron subcutáneamente por la vía de una aguja de calibre 27 en el flanco posterior lateral con células 1*106 MBT suspendidas en medio RPMI de 0.1 mi. Los tumores se midieron utilizando un calibrador cada día y sus volúmenes se calcularon utilizando la siguiente fórmula, que se describe en la literatura: Longitud x ancho x altura x 0.523 Protocolos de tratamiento En el modelo MBT, el tratamiento se inició 8 días después de la inoculación, cuando el tumor fue palpable y alcanzó 0.5 cm3. Los ratones se asignaron aleatoriamente a uno de los tres grupos de tratamiento (n=10 en cada grupo) . Los dos grupos de control (n=10 en cada grupo) recibieron inyección intratumoral de 0.1 mi de polímero puro o nada de tratamiento en lo absoluto. El primer grupo de tratamiento se inyectó con 0.1 mi de una formulación que contiene 5% de paclitaxel (equivalente a 250 mg/kg) intratumoralmente, el segundo grupo de tratamiento recibió 0.15 mi de esta formulación (equivalente a 375 mg/kg) y el tercer grupo recibió 0.15 mi de una formulación que contiene 10% de paclitaxel (equivalente a 750 mg/kg) . Los ratones se inyectaron solo una vez durante el experimento. Los animales se sacrificaron cuando el tumor llegó a ser ulcerado cuando causó incomodidad aceptable. Resultados y Discusiones Liberación del paclitaxel in vitro El portador de polímero Poli ( SA: RA) 2 : 8 aleatorio de Mw=4000 y Mn=3500 se preparó de RA purificado, 98% puro y SA 99% puro mediante la condensación por fusión como se discute en lo anterior. La estructura del polímero se muestra, enseguida .

El paclitaxel se incorporó en el polímero (5% y 10% p/p) sin afectar el peso molecular del polímero o interactuar químicamente con el polímero, como se confirma por el GPC y 1H-N R. La Figura 5 muestra el perfil de liberación de paclitaxel al 5% y 10% de P(SA:RA)2:8. La formulación que contuvo 5% de paclitaxel liberó 20±1.4% del fármaco incorporado durante 20 días, mientras que la formulación que contiene 10% liberó 8±0.8%. El perfil de liberación se monitoreó durante 60 días. Durante este período la formulación que contuvo 5% de paclitaxel liberó 40±0.5% del fármaco incorporado, mientras que la formulación que contiene 10% liberó 16±0.3% de su contenido. Las condiciones de sitio se mantuvieron durante el estudio de liberación y la concentración de paclitaxel en el medio de liberación no fue más alto que 10% de su solubilidad máxima en la solución reguladora (solubilidad en la solución reguladora es aproximadamente 5 µg/ml) . Debido a la naturaleza hidrofóbica del paclitaxel, su velocidad de liberación del polímero es una función de la cantidad de fármaco cargado en el polímero: mientras más alta es la carga de paclitaxel, más baja es la solubilidad de su liberación. Degradación hidrolítica in vibro Los inventores estudiaron la hidrólisis del polímero al monitorear el peso molecular y la disminución en el peso de la muestra. Los resultados se muestran en la Figura 6. El polímero sin el paclitaxel tuvo la velocidad más rápida de la degradación. En la primera semana el polímero puro perdió 33±2% de su peso inicial, cuando se degradó gradualmente y después de 40 días perdió 90.7±6.8% de su peso inicial. La velocidad de degradación del polímero cargado con paclitaxel fue más lenta. La formulación que contiene 5% de paclitaxel se degradó durante la primera semana por 18±5%, después de 40 días perdió 78±4% y después de 80 días solo 6% de la formulación quedó. La formulación que contiene 10% de paclitaxel se degradó durante la primera semana por 13±5%, después de 40 días perdió 65±8% y después de 80 días 19% de la formulación quedó. La disminución de peso molecular (Mw) del polímero puro y el polímero que contiene paclitaxel fue similar. Después las muestras se sumergieron en solución reguladora Mw cayó de 3900 Da a 1200 Da durante los primeros tres días. Durante los siguientes 25 días el peso molecular del polímero puro cayó a 670 Da, mientras que las formulaciones con paclitaxel mantuvieron su Mw a 1070 Da, lo cual es principalmente la contribución de paclitaxel. La velocidad de degradación más lenta del polímero que contiene paclitaxel suportan el hallazgo temprano de los inventores de que el paclitaxel protege el polímero y no permite al agua penetrar, disolver el fármaco y los productos de degradación de polímero. Por otra parte el Mw de la formulación disminuye casi como la Mw del polímero puro. Esto significa que el agua todavía puede penetrar dentro de la matriz de polímero y causar hidrólisis del polímero. La pérdida de peso de las formulaciones que contienen paclitaxel es más rápida que la velocidad de liberación de paclitaxel. La formulación que contiene 5% de paclitaxel pierde 78% de su peso inicial después de 40 días (Figura 6a), al liberar solo 35% del fármaco incorporado (Figura 6b) . La misma desproporción se encontró para la formulación al 10%: después de 20 días pierde 27% de su peso inicial (Figura 6a), mientras que solo 8% del fármaco incorporado se liberó (Figura 6b) . Estos resultados se correlacionan con la acumulación de paclitaxel en la degradación de la formulación (Figura 6b). Después de 7 días en medio de degradación el contenido de paclitaxel en las formulaciones se elevó por 15±3.5%, después de 15 días por 52113% y después de 40 días el contenido de paclitaxel casi fue dos veces su valor inicial (elevado por copiar. 98+15%). Como se establece en lo anterior: el contenido de paclitaxel más alto causó liberación de paclitaxel más lenta, pero la matriz de polímero todavía podría ser degradada. Degradación de las formulaciones in vivo El grado de la degradación in vivo de las formulaciones inyectadas se valuó por la pérdida de peso (Figura 7). El polímero puro perdió 40±7% de su peso inicial después de un día in vivo, l?(S7-\:RA) (2:8) cargado con 5% paclitaxel perdió 31±5% y P(SA:RA) (2:8) cargado con 10% de paclitaxel perdió 15+8%. El polímero puro se degradó completamente siete días por la inyección, mientras que las formulaciones con paclitaxel perdieron la mitad de su peso inicial por aquel tiempo (ninguna diferencia significante se observó entre las formulaciones que contienen 5% o 10% de paclitaxel) y se eliminaron totalmente del sitio de la inyección después de 70 días. Ninguna evidencia de cualquier reacción inflamatoria activa o irritación de tejido en el sitio de la inyección de la formulación que contiene paclitaxel se notó. Actividad anti-tumor in vivo La eficacia del paclitaxel suministrado intratumoralmente se investigó en el modelo heterotrófico de tumor de vejiga de ratón (MBT) . El tratamiento se inició en el octavo dia después de la inoculación de la células tumorales. Los ratones que no se trataron y los ratones inyectados con el polímero puro se sacrificaron 25 días después de la inoculación debido a que el tamaño de tumor excedió 17 era3. Sin embargo, las dimensiones del tumor fueron más pequeñas en el grupo inyectado con el polímero puro (11 contra 17 cm3 del grupo no tratado de control) (Figura 8) . Se teoriza que la inyección de polímero puro en el tumor daño su estructura y retardó su desarrollo. Los mejores resultados para la supervivencia y tamaño de tumor se observaron en el grupo tratado con el 0.15 mi de formulación que contiene paclitaxel al 5% (100% de supervivencia, todos los ratones estuvieron vivos 30 días pos la inoculación de células tumorales) y en el grupo tratado con 0.15 mi de formulación que contiene 10% de paclitaxel (75% de supervivencia) . La supervivencia de 60% y 50% estuvo en el grupo tratado 'con 0.1 mi de formulaciones que contienen 5% y 10% de paclitaxel, respectivamente.

La progresión de crecimiento de tumor en los ratones se muestra en la Figura 8. Todos los grupos de tratamiento (0.1 mi, 0.15 mi de formulación que contiene 5% de paclitaxel y 0.15 mi de formulación que contiene 10% de paclitaxel) el tamaño de tumor fue 4 veces más pequeño que aquel en el grupo tratado con el polímero puro y 5 veces más pequeño que aquel en el grupo sin tratamiento. Esa diferencia es estadísticamente significante (p<0.001, prueba t del estudiante) . Esto se confirmó al inspeccionar visualmente el ratón no tratado y el ratón que se trató 20 días pos la inoculación del tumor. El poli (ácido sebácico-co-ricinoleico) (2:8) utilizado en este estudio es un polímero hidrofóbico, construido de ácidos grasos naturales, que se puede utilizar para la liberación de tanto, fármacos hidrofóbicos como hidrofílieos . El propósito de este estudio fue evaluar el efecto de la formulación de paclitaxel-polímero inyectada intratumoralmente en modelo heterotrófico en ratones. La formulación de pasta polimérica con paclitaxel es un líquido viscoso a temperatura ambiente, que se puede inyectar a través de una aguja de calibre 23 y se gelifica en contacto con fluidos corporales. Esta examinación formó un implante semisólido in situ que liberó el fármaco localmente en el sitio de inyección. Para todas las formulaciones, la degradación y liberación in vivo fueron mucho más rápidas que in vitro, debido a que in vivo existe una eliminación eficiente de productos de degradación grasos del sitio de inyección mientras que bajo condiciones in vitro, los productos de degradación grasos permanecen y bloquean el proceso de degradación y la liberación del fármaco. Ejemplo 5. Liberación in vitro e in vivo de paclitaxel de polimeros de poli (ácido sebácico-co-ácido ricinoleico) en Melanomas . El suministro local de paclitaxel de las formulaciones inyectadas intratumoralmente se investigó utilizando un modelo heterotrópico de melanoma en ratones C57BL/6. Los cambios en la progresión del tumor, tiempo de supervivencia y peso corporal se observaron durante un periodo de 77 días para determinar la efectividad del tratamiento con paclitaxel local. Los animales que llevan tumor se inyectaron intratumoralmente con volúmenes diferentes de formulación que contiene 1 5%, 10%, 15% y 20% de paclitaxel. La formulación de liberación controlada se preparó con un polímero biodegradable a biodegradable poli (ácido sebácico-co-ácido ricinoleico) (p(SA:RA)) en relación de 20:80. El polímero P(SA:RA) 20:80 se mezcló con paclitaxel (Bioxel Pharma, Sainte-F'oy, Canadá) a 5%, 10%, 15% y 20% de carga p/p- La mezcla se preparó a temperatura ambiente mediante trituración y luego se retiró en jeringas de 1 mi Luer lock, finalizadas con agujas de 23G y se almacenaron a -200 °C hasta el uso. Los polímeros de control' (sin el fármaco) también se cargaron en las jeringas de 1 mi Luer lock. La suspensión de paclitaxel para la inyección intratumoral se preparó al mezclar 100 mg de paclitaxel con 200 mg de Pluronic F-68 (en una relación de 1 : 2 ) y al adicionar 700 µ? de solución salina. Ratones C57BL/6 hembra (20-21g) se obtuvieron de Charles River Canadá, St-Constant, lote de células de murino Qc. B 16F15 no. 1511548 p32 (CRL-6223) fueron un regalo generoso de Dr. Michel Page. Las células se obtuvieron originalmente de la Recolección de Cultivo de Tipo Americano. El protocolo de búsqueda #2004-070 se aceptó por the Secretariat local de protection des animaux se localiza en University Laval, Pavilion Agathe Lacerte, local 1040, Sainte-Foy, (Québec) Canadá, G1 7P4. Los requerimientos se examinan individualmente basados sobre las guias proporcionadas por el consejo Canadiense sobre el Cuidado de Animales (CCAC) . Inoculación de las células B16F1 Una vez que los animales se aclimataron a su medio ambiente y antes del injerto de los tumores los ratones se separaron en 8 grupos de (10) ratones (11 ratones en el grupo de control #8) donde el peso corporal promedio de los intergrupos de ratones fue tan equivalente como sea posible. Los ratones se inyectaron subcutáneamente en el nivel del omoplato con 200 000 de tumor B 16F1 en suspensión en 100 µ?, de DMEM. Los ratones se observaron dos veces al día, en la mañana y en la tarde; se pesaron diariamente y los tumores se midieron cada día puesto que estuvieron creciendo rápidamente. En el momento donde los tumores de melanoma fueron detectables su medición se inició. El volumen de tumor fue la estimación se basó sobre la fórmula estándar: Volumen de tumor (m.m3) = (w2 x l)/2 donde w = ancho y 1 = longitud en mm del tumor. El experimento se confirmó y los ratones se sacrificaron cuando el peso del tumor había alcanzado 10% del peso corporal o cuando la incomodidad, como se describe en el protocolo de éticas, llegó a ser inaceptable. Los ratones que cumplen los criterios para la eutanasia se sacrificaron utilizando CO2. Después de la eutanasia, los pulmones se recuperaron y el número de metástasis de pulmón se determinó visualmente. Una breve autopsia se llevó a cabo para determinar la presencia de metástasis. Protocolos de Tratamiento Dos días después del injerto de tumor los ratones recibieron sus tratamientos. Los dos grupos de control negativos (n=10 en cada grupo) se inyectaron intratumoralmente con 0.1 mí de polímero P(SA:RA) (20:80) sin paclitaxel (grupo #1) y grupo #8 no recibieron tratamiento en lo absoluto. Los grupos de tratamiento 2-5 se inyectaron intratumoralmente con polímero P(SA:RA) (20:80) cargado con 5%, 10%, 15% y 20% de paclitaxel (0.2 mi para 5% y 10% de carga y 0.1 mi para 15% y 20% de carga) . El grupo de tratamiento 6 se inyectó intratumoralmente con suspensión de paclitaxel cargada, con 10% de paclitaxel (0.1 mi). Los ratones se inyectaron solo una vez durante el experimento. El grupo de tratamiento 7 se trató con el tratamiento sistémico tradicional de solución de paclitaxel/Chremophor inyectada intraperitoneaimente en los días 1, 4, 7 y 10. Los animales se sacrificaron cuando el tumor llegó a ser ulcerado, cuando causó incomodidad inaceptable o cuando el tamaño de tumor había alcanzado 10% del peso del animal . Análisis Estadísticos Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando S-PLUS. El tiempo de supervivencia, en días, se registró para cada ratón. Las curvas de supervivencia no paramétricas por el grupo de tratamiento se obtuvieron utilizando el método Kaplan-Meier , tomando en cuenta los casos bien censurados (para animales que viven más allá del final del estudio. Para probar si existe una diferencia estadísticamente significante en el tiempo de supervivencia para los animales que reciben los tratamientos con gel de Paclitaxel, las curvas de supervivencia se compararon utilizando una prueba de log-rango. Una medida relacionada de supervivencia es la relación de riesgo entre dos tratamientos. El riesgo proporciona la proporción de muerte durante una unidad pequeña de tiempo o una medida de la proporción de incidencia de secado durante el siguiente intervalo de tiempo subsecuente. Para estimar las relaciones de riesgo entre los tratamientos contra el placebo, se ajustó un modelo de regresión de riesgos proporcional Cox semiparamétrico a los datos. Para cuantificar el efecto de la concentración de dosis de Paclitaxel sobre la relación de riesgo y tomar en cuenta el nivel de concentración de incremento del Paclitaxel dentro de los cinco tratamientos con gel, un modelo de riesgos proporcional Cox se ajustó para los cinco tratamientos con gel'. Específicamente, los inventores desean modelar el efecto de la dosis, como una variable continua, sobre la relación de riesgo. Por otra parte, tomar en cuenta cualquier curvatura en la relación entre la dosis y la relación de riesgo, un término cuadrado para la dosis también se incluyó en el modelo. Más precisamente, el modelo ajustado fue : Si término cuadrático Log (Relación de Riesgo) = Dosis a* -i- Dosis b*A2 aparece estadísticamente significante en el modelo, la concentración de dosis óptima entre 0% y 20% que proporciona la relación de riesgo más pequeña se puede determinar al encontrar el mínimo de la curva, si un mínimo existe. Un nivel de importancia global de a = 5% se asumió para todas las pruebas estadísticas. Para cada prueba estadística, cualquier efecto de tratamiento total se encontró, se utilizaron múltiples métodos de comparación para calificar que pares de tratamientos son estadísticamente diferentes. Para explicar la múltiple de prueba, una corrección de múltiples comparaciones se aplicó utilizando el método Tukey para mantener el nivel a global a 5%. Las curvas de supervivencia no paramétricas para, el tiempo hasta que el volumen de tumor detectable por el grupo de tratamiento se obtuvo utilizando el método Kaplan-Meier , tomando en cuenta los casos bien censurados (animales con volúmenes de tumor consistentes de 0) . Resultados y Discusión Como se mencionó en lo anterior, el peso promedio de cada grupo en el día del tratamiento varió de 20 gramos. La distribución de pesos promedio de intergrupos fue muy reducido durante los primero diez (10) días pos tratamiento. Después de los primeros diez (10) días del experimento, el incremento de peso fue relativamente similar para cada grupo y no mostró correlación con el tipo de tratamiento puesto que la eutanasia, de los ratones que tienen peso de tumor significante "equilibrado" para el incremento del peso de los tumores restantes.

El valor p de 0.8993 indica que no existe estadísticamente significante el tratamiento recibido en el peso corporal relativo, un nivel a de 0.05. Esto proporciona evidencia formal para soportar las observaciones hechas de las estadísticas descriptivas presentadas de que el peso corporal relativo no se afecta por el tratamiento recibido. El efecto del tiempo solo tuvo una influencia estadísticamente significante en el peso corporal con un valor p menor que 0.0001. Esto es consistente con las gráficas, donde se observó un incremento en el peso corporal a través del tiempo. Más importantemente, sin embargo, es estimar si el cambio en el peso corporal a través del tiempo depende del tratamiento recibido. En otras palabras, si la interacción, Día de Tratamiento *, es significante. De la tabla ANCOVA, se observó que la interacción no se encontró para ser estadísticamente significante, con un valor p de 0.4151. Esto implica que el efecto de tiempo sobre el peso corporal relativo no varía por el grupo de tratamiento . Proporción de supervivencia, de los animales La proporción de supervivencia para cada grupo se muestra en la Figura 9. La supervivencia fue la más baja entre el grupo #8, que fue el grupo de control, que no recibió ninguna forma de tratamiento y también en el grupo #1 que recibió en el polímero P(SA:RA) (20:80) solo sin paclitaxel. Para ambos grupos la muerte del animal comenzó en el día 13 y los ratones todos murieron en el día 20 con un tiempo de supervivencia medio (MST) de 16 días. Todos los ratones que habían recibido paclitaxel en su tratamiento exhibieron MST más alto que los controles que ilustran la toxicidad no aguda de los tratamientos. Los grupos tratados con un polímero P(SA:RA) (20:80) el MST fue 16, 22, 35, 18. y 20.5, respectivamente para la concentración de paclitaxel de 0, 5, 10, 15 y 20%, respectivamente. Finalmente, los ratones tratado con suspensión de paclitaxel/Pluronic F68 y el paclitaxel comercialmente disponible (en solución salina) para la administración IP el MST fue 18 y 19 días respectivamente. Interesantemente, el grupo #6 (suspensión de paclitaxel/Pluronic F68) exhibió una curva de muerte "bimodal". En realidad, los primeros 6 ratones del grupo murieron rápidamente mientras que los cuatro restantes tuvieron una supervivencia significantemente incrementada. La Tabla 4 resume los tratamientos y el MST correspondiente para todos los grupos. Tabla 4 : Resumen del efecto de los tratamientos en la supervivencia de los ratones Una correlación entre la cantidad de paclitaxel inyectado y la supervivencia podrían no ser establecidos no claramente. Sin embargo la eficacia del paclitaxel cargado y suministrado en el polímero P(SA:RA) (2:8) en la supervivencia es visible. En realidad, en los grupos no tratados ninguno de los ratones sobrevivieron (tiempo de supervivencia máxima fue de 23 días) mientras que en los grupos tratados y después de 77 días existen ratones muy saludables en 5 grupos (grupo #3 = 3 ratones; grupo #4 = 1 ratón; grupo #5 = 1 ratón) . Una prueba de log-rango se realizó a través de todos los grupos de tratamiento para determinar si hubo un efecto total de tratamiento sobre el tiempo de supervivencia. La prueba estadística reveló un efecto altamente significante de tratamiento sobre el tiempo de supervivencia con un valor chi-cuadrado de 32 y un valor p de 0.00004. Para determinar que pares de tratamiento fueron estadísticamente diferentes, se realizaron pruebas de log-rango sobre todas las combinaciones de pares del tratamiento. Un ajuste Tukey (Diferencia Significante de Honestidad) se aplicó para la múltiples comparaciones para asegurar un nivel alfa global de 5% se mantuvo. Bajo este método, en nivel a corregido para cada comparación fue de 0.002, o 0.2%. La Tabla 3 reporta los valores p de las prueba de log-rango. Los valores en negritas marcados por una estrella, donde el valor p es menor que 0.002, indican pares de tratamientos encontrados que tienen una distribución de supervivencia estadísticamente diferente. De los cuatro tratamientos con paclitaxel cargados con polímero, solo el 5% y 10% de concentraciones se estimaron que tiene curvas de supervivencia estadísticamente diferentes del placebo. Por otra parte, las concentraciones de dosis de 10% y 20% difieren significantemente de la concentración de 0%, el grupo de tratamiento debe parecerse al grupo de control de placebo. Dentro de los tratamientos con gel de Paclitaxel activo del 5% al 20%, ningunas diferencias en la supervivencia se detectaron. En resumen, las diferencias estadísticamente significantes se encontraron solamente entre los tratamientos activos (tratamientos con gel al 10%, 20%) y tratamientos no activos (tratamiento con gel al 0% y placebo) . Crecimiento del Tumor La proporción del crecimiento del tumor para cada grupo después del tratamiento se muestra en la Figura 10. El tamaño de tumo más alto se reporta para los grupos de control que no recibieron paclitaxel en su régimen de tratamiento. En el grupo #8 (no de tratamiento) el tamaño de tumor fue de 3.6 g en el día 20, en el grupo #1 (P(SA:RA) (20:80) sin paclitaxel) el tamaño de tumor fue de 2.5 g. En todos los grupos tratados con el polímero cargado con paclitaxel el tamaño de tumor fue mucho más pequeño que aquel en el polímero puro o los grupos de no tratamiento y variaron de 1.3 g a 0.3 g (Figura 11). ? partir de estos datos, los inventores pueden observar que Los tratamientos activos exhibieron períodos de latencia más largos que el placebo o los tratamientos con Paclitaxel al 0%, esto es, el tiempo antes del tamaño de tumor comienza a incrementarse. Los tratamientos con Paclitaxel - polímero a 5%, %, 15% y 20% parece que tienen una proporción más lenta de incremento en el volumen de tumor que los otros tratamientos. Los ratones con crecimiento de tumor no detectables se observan para los tratamientos con polímero de Paclitaxel a 5%, 10%, 15% y 20% así como el tratamiento con Paclitaxel /Pluronic F68. Las estadísticas descriptivas en el tiempo (en días) antes de un volumen de tumor detectable muestra que: • La mayoría de ratones con volúmenes de tumor continuamente no detectables ocurrieron en el grupo de tratamiento con gel de Paclitaxel al 10%. El tiempo promedio más alto, es decir 26.5 días, ocurrió con la dosis al 10% también. El coeficiente de variación (CV) es más bajo en el placebo y 0% de grupos de dosis que en los tratamientos activos . Esto se puede explicar por el hecho de que los animales tienden a reaccionar diferentemente dentro de los grupos del tratamiento activos, mientras que el comportamiento en los grupos de control es más consistente. Consistentes con las curvas de supervivencia el tratamiento con gel de paclitaxel al 10% parece que supera los otros tratamientos al proporcionar el tiempo de supervivencia más prolongado. Nuevamente, el control de placebo y el tratamiento con gel de Paclitaxel al 0% corresponde a las curvas de supervivencia elevadas, que implican un descenso rápido en la probabilidad de crecimiento de tumor cero a través del tiempo. Para comparar los tratamientos, un modelo de riesgos proporcionales Cox se ajustó para probar el efecto del tratamiento en el riesgo. Las relaciones de riesgo estimadas se presentan en el resultado enseguida con referencia al control del placebo. A partir del resultado, los inventores encuentran que la relación de riesgo entre cada tratamiento y el placebo es estadísticamente significante (valores p < 0.05) . Como es consistente con otros resultados, el tratamiento que exhibe la reducción más alta en el riesgo es el tratamiento con gel de Paclitaxel al 10% con un riesgo de 0.0338 veces que el del placebo. Por otra parte, los tratamientos con gel paclitaxel al 5% y 15% proporcionan una reducción similar en el riesgo de desarrollar un volumen de tumor detectadle, con relaciones de riesgo de 0.0933 y 0.0907 veces que del placebo. La pérdida de peso corporal después del tratamiento se mostró en ninguno de los grupos. Esto es una indicación importante de la toxicidad baja del tratamiento y muestra que por lo menos tiene microlitros de una formulación con paclitaxel al 20% (grupo 2, 20 mg de paclitaxel), se puede inyectar, Los animales fueron saludables en el tiempo de tratamiento como se indica por un incremento constante en los pesos corporales en los 10 días después del tratamiento. Los pesos corporales se mantuvieron incrementadamente de manera permanente en todos los grupos después del tratamiento. Sin embargo, la ulceración de la piel de los ratones tratados con el gel que contiene paclitaxel demostró claramente una toxicidad local significante. La toxicidad puede ser asociada a la presión ejercida por el polímero sobre los tejidos circundantes, que llegan a ser menos irrigados con los vasos sanguíneos, por lo tanto incrementando en el nivel de toxicidad el fármaco localmente. A pesar del problema de ulceración encontrado con los que contienen paclitaxel es claro que la formulación farmacéutica tuvo un efecto benéfico significante sobre la supervivencia de los ratones, por ejemplo 30% de los ratones de grupos #3 tratados mediante paclitaxel al 10% en polímero P(SA:R7A) (20:80) todavía sobreviven después de 77 días mientras que ninguno sobrevivió más de 23 días en los grupos de control. Interesantemente, no se observó toxicidad sistémica.. La correlación de la concentración de supervivencia y fármaco no es tan buena como se esperaba pero la toxicidad local observada en los ratones tratados mediante la formulación con que podría tener que ser tomada en cuenta. Otra razón par la falta de correlación entre la supervivencia y la dosificación en los grupos tratados podría ser relacionada, al hecho de que el modelo de tumor seleccionado utilizado en el estudio es un tumor que crece relativamente rápido como es comparado a la liberación de fármaco lenta por la formulación. Un modelo de tumor que crece más lento puede ser una representación mejor de tratamiento único. Apariencia del polímero Interesantemente, se observó en un momento de la primera necropsia que el polímero en la vecindad del tumor tuvo apariencia muy similar que aquel eyectado. Sin embargo, a pocos días después del polímero pareció que se endurece y las masas estuvieron encogiéndose. Además, los tejidos que circundan el polímero cargado con paclitaxel estuvieron transformándose, se degradaron. Ejemplo 6. Liberación in vitro e in vivo de paclitaxel de los polímeros poli (ácido-sebácico-co-ácido ricinoleico) en el Adenocarcinoma de Próstata. El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia de una formulación de pasta polimérica inyectable con paclitaxel contra el tumor de próstata ortotópico en ratas. El polímero cargado con paclitaxel se inyectó a temperatura ambiente en las glándulas de próstatas que llevan tumor de las ratas tres días después de la inoculación de la células tumorales. El adenocarcinoma de próstata de rata Dunning. R-3327 es el modelo de tumor experimental correspondiente en su contra parte humana utilizado para estudiar la progresión del tumor. En el estudio de los inventores utilizaron la sublínea MatLyLu, que tiene el potencial local y metastático más agresivo . El poli (ácido sebásico-co-anhídrido de éster de ácido ricinoleico) (2:8) se sintetizó como se describe previamente. El paclitaxel de grado GMP (BioxelPharma, QC, Canadá), anhídrido acético (Merck, Darmstadt, Alemania), y Lutrol F68 (Sigma, Israel), y Chremophor EL a 50% (Sigma, Israel) se utilizaron. Todos los solventes fueron de grado analítico obtenidos de BioLAB (Jerusalén, Israel) o Frutarom (Haifa, Israel) y se utilizaron sin purificación adicional. En el día de la inyección, las células tumorales (Dunning tumor, sublínea MatLyLu) se removieron de matraces de cultivo de tejido con tripsina/EDTA . Después de la tripsinación de las células (1 min) , se adicionaron 4 mi de RPMI 1640. Las células tumorales se centrifugaron, se lavaron dos veces en PBS, se contaron y se resuspendieron en medio de RPMI 1640 sin suplementos en las tres concentraciones finales: células tumorales viables/ml 1x105, 3x105 y 5x105. Ratas Copenhague machos (n=12) con un peso corporal de partida de 220-240g (Harían Laboratories, Israel) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicas (SPF) y se les dio libre acceso para alimento estéril y radiado y agua acidificada por todo el experimento. Para la creación de modelo ortotópico las ratas Copenhague se dividieron en tres grupos y se anestesiaron (cetamina/xilasina, IP) . Se les afeitó el abdomen inferior, y se hizo una incisión transversal arriba de los huesos púbicos. Los músculos abdominales se dividieron, el intestino se levantó y el lóbulo ventral de la próstata se expuso inferior a la vejiga. Diferentes números de células MatLyLu suspendidas en 50µ1 se inyectaron en el óvulo ventral utilizando una jeringa de insulina de 1 mi y una aguja de 26G como sigue: • Grupo 1: 8x103 células suspendidas en 50µ1 de medio de RPMI 1640; • Grupo 2: 1.5x104 células suspendidas en 50µ1 de medio de RPMI 1640; • Grupo 3: 2.5x104 células suspendidas en 50µ1 de medio de RPMI 16 0; Los músculos abdominales se cerraron con sutura de vicrilo 3/0, y la piel con seda de 3/0. Tres días después (como es obtenido de los estudios preliminares) las ratas se sacrificaron. La evaluación de histopatologia de su próstata, hígado y pulmones se hizo para determinar la presencia y el grado del desarrollo del tumor. Preparación de la formula_cián Las formulaciones del polímero cargado con paclitaxel a 10% p/p se prepararon mediante de mezclado directo del polímero con el fármaco a temperatura ambiente. La composición se mezcló hasta que una pasta blanda se formo.

Todas las formulaciones se llenaron en jeringas a temperatura ambiente sin calentamiento. Las formulaciones de polímero obtenidas fueron pastas inyectables a temperatura ambiente. Las suspensiones de paclitaxel se prepararon al mezclar paclitaxel con Pluronic F68 en relación de 1:2 y luego la mezcla se disperse en solución salina para obtener la concentración de paclitaxel de 7.5% p/v. el Pluronic F68 es un agente de suspensión utilizado para suspender agentes de solubilidad en agua baja, similar al paclitaxel. Cada rata se inyectó intratumora Imente con 250 ul de la suspensión. Para la preparación de la solución parenteral de paclitaxel, el fármaco se disolvió en etanol al 50%/Chremophor EL al 50% para obtener la concentración de paclitaxel de 6mg/ml. Luego la solución se diluyó con colusión salina para obtener una solución de 1.2 mg/ml de paclitaxel. Cada rata se inyecto IP con 4 mi de la solución diluida . Inoculación y tratamiento del tumor Ratas Copenhague en machos (n=26) con un peso corporal de partida de 220-240g (Harían Laboratories, Israel) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicas (SPF) y se les dio libre acceso a alimento estéril y radiado y agua acidificada por todo el experimento. Para la creación del modelo ortotópico las ratas Copenhague se dividieron en cinco grupos y se anestesiaron ( cetamina/xilasina , II?) y se operaron como se indica en lo anterior. Las células tumorales (células MatLyLu 8x103 se suspendieron en 50ul) se inyectaron en el lóbulo ventral utilizando una jeringa de insulina y una aguja de 26G como sigue. Los músculos abdominales se cerraron con sutura de vicrilo 3/0, y la piel con seda 3/0. El peso corporal de los animales de monitoreo cada 2 días. La terapia se comenzó tres días después de la inyección de las células tumorales. El polímero cargado con el fármaco y la suspensión de paclitaxel se inyectaron en el tumor creciente en el lóbulo ventral de la próstata. La rata en el grupo tratado con el paclitaxel parenteral se inyectó II? cada tres días. El horario del experimento se describe en Tabla. 5 y los grupos de tratamiento se describen en la Tabla 6. Tabla 5. Resumen de las Tablas de Tiempo del Experimento Día Tratamiento Comentarios 0 (DO) Implantación de las Ratas se células tumorales anestesiaron con Mat-Lylu (cetamina/xilasina , (8*103/50µ1) 11?) y las células tumorales se suspendieron en 50µ1 del medio se inyectaron en la próstata 3 (D3) Administración de varios tratamientos 4 (D4-D35) Ratas son visitadas Ratas se pesaron cada día dia riamenté Tabla 6. Resumen de los Grupos de Tratamiento Los animales se observaron para signos de toxicidad sistémica y para perdida de peso. El comité de ética en la Universidad en Jerusalén (número de aprobación NIH: OPRR-A01 -5011) ha revisado este estudio y ha encontrado que es compatible con los estándares para el cuidado y el uso de animales de laboratorio (números de búsqueda de comité de ética : MD-80.04-3) . Calculación macroscópica del tumor Después de la recolección del animal, el tumor se resectó y una calculación macroscópica del volumen del tumor se condujo utilizando la fórmula mostrada enseguida: V = (longitud x altura x ancho) x p/6. Análisis histológicos Los tumores de todos los animales se resectaron, se midieron y se fijaron en 4% de solución de formaldehido . Los portaobjetos de tejido se procesaron en parafina y 3-µp? de las secciones se mancharon con hematoxilina y eosina para la evaluación histológica. Los parámetros de reexaminación fueron áreas de totales necrosis, formación de la cápsula, infiltración de célula inflamatoria y contenido de vasos sanguíneos intratumorales . Análisis estadísticos Las distribuciones de supervivencia y supervivencia promedio se calcularon por el método Kaplan-Meier, y se compararon utilizando la prueba de rango log . Los valores P menores que 0.01 se consideraron significantes para todas la pruebas . Resultados y Discusión El procedimiento quirúrgico y la inyección de células tumorales fueron bien toleradas y todas las ratas despertaron después de ambas cirugías: la inoculación de células tumorales y el tratamiento se les dio tres días después. En todas las ratas lo tumores ortotópicos se implantaron exitosamente mediante la inyección de células tumorales, como se confirmó por la reexaminación histológica. Se debe notar que el adenocarcinoma de próstata de rata Dunning R-3327 se puede inducir mediante un número de sublineas que difieren proporción de grupo de crecimiento, diferenciación, responsividad de hormona y habilidad metastática. En el estudio de los inventores se utiliza la sublinea MatLyLu, que tiene el potencial local y metastático mucho más agresivo. Calibración del modelo animal Tres grupos de ratas se inyectaron con concentraciones de incremento de las células tumorales en su glándula de la próstata . Debido a la agresividad de la sublinea MatLylu una cantidad mínima óptima de células que invocan tumor estable pero todavía tratable se seleccionó. Como se reporto en lo anterior 18 de la cantidad mínima de las células MatLyLu que formaron tumores en todos los animales inyectados intrapróstata fue célula s 5x103. Después de estos resultados los inventores utilizaron concentraciones similares de células a ser convencidos de que el tumor en realidad creció en la próstata inyectada. Por otra parte cuando las ratas se inyectaron con intrapróstata 2 x 105 (datos no mostrados) los tumores obtenidos fueron enormes, no tratables en todas las ratas murieron dentro de 2 semanas post la inoculación celular. Tres días después de la inoculación de células tumorales las ratas se sacrificaron. La próstata, pulmones e hígado se aislaron y enviaron a una evaluación histopatológica . Tres días después de la inoculación de células tumorales, hubo un tumor obvio en la glándula de la próstata; sin embargo, nada de metástasis se encontró mediante la observación, microscópica en todos los grupos. La histopatología del carcinoma de próstata en la próstata de una rata tres días después de la inyección mostró múltiplex focos de un carcinoma de próstatas. Nada de metástasis se encontró en el hígado y los pulmones durante la evaluación histológica. Puesto que todas la cantidades infectadas de células tumorales (8 x 103, 1.5 x 104 y 2.5 x 104) causó exitosamente tumor después de tres días se decidió inyectar células tumorales 8 x 103 y tratar los animales tres días después . Supervivencia y pérdida de peso En la instilación intraprostática de los tumores de células de cáncer formados muy rápido fueron fatales en todas las ratas. La supervivencia de las ratas se muestra en la Tabla 7. Grupo Formulación Supervivencia Metástasis Metástasis media [días] pulmonar de hígado ( intervalo) 1 Ningún tratamiento 24 (21-25) 4/4 4/4 2 Paclitaxel/Pluronic 25 4/4 4/4 F68 3 P(SA:RA)2:8 + 10% 32.2 (21.35) 0/5 0/5 de paclitaxel 4 Paclitaxel en 17 (9-25) 2/4 2/4 Etanol 50%- Chremophor EL 50% diluido en solución salina supervivencia más corta de la ratas fue grupo tratado por la formulación parenteral de paclitaxel-50% de los animales tratados murieron después de la segunda dosis, nueve días post la inoculación de células tumorales. Estas también perdieron peso durante el experimento (Figura 11) que lo cual implica que su mortalidad y mordida y morbosidad fue causada por la toxicidad sistémica de la formulación de fármaco. La supervivencia más larga fue en el grupo tratado intratumoralmente con 200µ1 del polímero cargado con 10% p/p de paclitaxel. Solo una rata murió tres semanas post la inoculación de células tumorales, mientras que todas las otras ratas sobrevivieron hasta el final del estudio - 35 días post inoculación de células tumorales. En el grupo no de tratamiento, una rata murió tres semanas post inoculación de células tumo ales y todas las otras tres días después (día 25 después de ¦ la inoculación de células tumorales ) . La inyección Intratumoral de la suspensión de paclitaxel/Pluronic no causo toxicidad sistémica, debido a que después de la inyección intratumoral de paclitaxel se agregó en el sitio de inyección. Por otra parte de esta formulación no prolongo el tiempo de vida de las ratas-todas las ratas murieron 25 días por la inoculación de células tumorales . En la autopsia todos los animales que tienen tumores grandes (>3cm en diámetro) mostraron sangrado interno macado ya sea debido a la invasión de tumor en los vasos sanguíneos mayores o a dar ruptura del tumor primario altamente vascularizado . Por otra parte las ratas del grupo de tratamiento de polime.ro/paclitaxel murieron 10 días después que las otras, al tener tumor relativamente pequeño. Los inventores creen que su muerte es causada por la obstrucción uretral, debido a que ni la metástasis, tampoco sangrado interno se observó en la autopsia. 7\ partir de la curva de perdida de peso es obvio que todas las ratas perdieron su peso en los primeros cinco días (Figura 12) . Esta perdida de peso fue probablemente causada por la cirugía y la trama que las ratas se expusieron. En el comienzo del día cinco las ratas de todos los grupos de tratamiento, excepto el tratamiento parenteral con paclitaxel IP, comenzaron a ganar su peso con nada de diferencia estadística entre estos grupos. Solo el tratamiento sistémico causo perdida de peso estadísticamente significante - de 231 gm a 203 gm y 50% de casos de muerte "prematura". Metástasis del nodulo linfático , pulmonar y de hígado En la autopsia, la metástasis de nodulo linfático fue palpable y visible en los animales que llevan tumor (Tabla 8) . Tabla 8. Resumen de la Ratas de Supervivencia Promedio y la Metástasis Pulmonar y de Hígado Las ratas tuvieron complicación pélvica y de nodulo retroperitoneal en total con un tamaño de nodulo de hasta 0.6 cm. Como se muestra en al Tabla 8 todos los animales no tratados y los animales inyectados intratumoralmente con la suspensión de paclitaxel mostraron metástasis en los pulmones y el hígado. Las ratas que se trataron con la formulación pa rentera! de paclitaxel y murieron 9 días post la inoculación de las células tumorales y no desarrollaron metástasis (probablemente debido a que murieron muy rápido) pero las' otras dos ratas desarrollaron metástasis en los pulmones y el hígado. Nada de metástasis se encontró en las ratas tratadas intratumoralmente con 200µ1 de formulación de polímero/paclitaxel . Volúmenes de tumor La Figura 12 muestra el volumen de la próstata con el tumor en diferentes grupos de tratamientos. En el grupo de de no tratamiento 1 rata murió después de 21 días post la inoculación de células tumorales que tienen volumen de próstata de 11.83 cm3 y otras ratas murieron en los días 25 que tienen de próstata de 14.8 ±1.08 cm3. En el grupo tratado con paclitaxel parenteral la muerte fue bimodal: la mitad de las ratas murieron después de 9 días teniendo volumen de próstata de 14.18 cm y otras ratas murieron después de 25 teniendo volumen de próstata de 13.65 ±0.26 cm3. Los mejores resultados estuvieron en el grupo tratado con la suspensión de paclitaxel inyectada intratumoralmente: todas las ratas murieron después de 25 días teniendo volumen próstata de 6.6 ±0.7 cm3. Los mejores resultados se obtuvieron para el tratamiento con polimero/paclitaxel donde 1 rata murió después de 21 día teniendo volumen de próstata de 0.845 cm3 y otras ratas sobrevivieron el periodo de tiempo, más prolongado y murieron despilés 35 días teniendo volumen de próstata de 0.862 ±0.16 cm3, mientras que el volumen de una gandula de próstata saludable inyectada con 200µ1 de polímero es de aproximadamente 0.4 cm3. Una comparación de las glándulas de la próstata tomadas en el día 35 de grupo de polimero/paclitaxel y en el día 25 de todos los otros grupos mostraron claramente las diferencias macroscópicas entre los grupos. Evaluaciones hisi:opa tológica,s Aunque todos los parámetros mencionados en lo anterior se evaluaron, el único parámetro que demostró diferencias entre los grupos fue la necrosis intratumoral, todos los otros parámetros evaluados no mostraron ninguna diferencia entre los grupos, ya que por lo tanto estos datos no se presentan. En el grupo de no tratamiento el por ciento de la necrosis intratumoral total fue baja (10-20%). En el grupo tratado con la suspensión de paclitaxel el por ciento de la necrosis intratumoral total fue similar y solo un tumor mostró necrosis mas alta -50%. En el grupo tratado con la formulación parenteral de suspensión de paclitaxel a la necrosis intratumoral se encontró, mientras que el por ciento más alto de la necrosis intratumoral se encontró en el grupo tratado con el polímero cargado con 10% de paclitaxel (25-70%). Adicionalmente , 3 ratas de grupo de polimero/paclitaxel se sacrificaron 10 días postinoculación de células tumorales y sus glándulas de próstata se unieron a la evaluación histopatológica . Múltiplex áreas de necrosis intersticial y intra-glandular, así como inflamación aguda se observaron. Sin embargo, no hubo presencia aparente de cáncer de próstata . Las Metástasis se encontraron en el hígado y los pulmones en todas las ratas no tratadas (grupo #1, 4 de 4), en todas las ratas tratadas intratumoralmente con suspensión de paclitaxel (grupo 2, 4 de 4), en toda las ratas tratadas con la formulación parenteral y nada de metástasis se encontró en las ratas tratadas con 200µ1 de formulación de polimero/paclitaxel . Debe ser enfatizado que los descubrimientos de los inventores (es decir, diferencias significante en la cantidad de necrosis intratumoral entre los grupos) es consistente con que se reporta en la literatura con el mismo modelo expuesto a la estramustina y etoposido. Los inventores han descrito previamente que el uso efectivo de los geles poliméricos biocompatibles , biodegradables e inyectables para el suministro dirigido de sitio de los fármacos antineoplásicos tales como paclitaxel. La formulación de gel polimérico utilizado con este estudio es una pasta viscosa a temperatura ambiente que se puede inyectar a través de una aguja de calibre pequeño (23G) y se solidifica in vivo en 1 hora. Este gel forma un implante de liberación controlada que libera el fármaco localmente en el sitio de inyección. Los estudios In vivo mostraron que el paclitaxel se libera durante 3-4 semanas y el implantación se degrada totalmente durante este periodo. El carcinoma prostético MatLyLu de rata Dunning es análogo al cáncer de próstata humano metastático, refractario de hormonas en muchas maneras. Auque los tumores inducidos en los sitios ectópicos son fácilmente accesibles para la manipulación experimental, tales tumores que no corresponden con sus orígenes anatómicos. E sabido que las células de cáncer fuera de su ambiente natural se comportan muy diferentemente de hacerlo en su órgano de origen. En este estudio se evalúo la eficacia de la inyección intratumoral del polímero que contiene paclitaxel en el modelo Dunning. El modelo ortotópico permite a los inventores tratar el cáncer en su propio ambiente ya que pasa en la vida real. Este modelo animal puede reflejar un método de tratamiento potencial para paciente con cáncer de próstata recurrente. El efecto terapéutico de la formulación de paclitaxel/polímero resulto de la inducción de la apóptosis en las células tumorales MatLyLu que se documentó in vitro e in vivo. Los inventores utilizaron la sublinea MatLyLu, que es la más agresiva y la sublinea altamente metastática entre los modelos de cáncer de próstata Dunning. Después de la calibración de este modelo los inventores encontraron una cantidad óptima de células tumorales para generar un tumor ortotópico homogéneamente de crecimiento que se puede tratar. Los resultados de los inventores muestran que una administración intratumoral de 200µ1 de formulación de polímero/paclitaxel fue capaz de reducir en crecimiento de tumor del cáncer de próstata Dunning de célula MatLyLu de la rata Copenhague de una manera significante en comparación a loa grupos de control o la terapia sistémica. El tratamiento con suspensión de paclitaxel intratumoralmente también redujo de una manera el volumen de tumor, pero no también como la formulación de polímero/paclitaxel y no prolongo el tiempo de vida de los animales. Después de la inyección intratumoral de la suspensión el agua se elimina y solo paclitaxel el polvo de paclitaxel se deja en el sitio de inyección. Este polvo forma una torta (como se observó en la autopsia de las ratas). Como mucho paclitaxel se disuelve de esta torta es suficiente para causar alguna necrosis en los alrededores, pero no suficiente para prevenir toda la progresión del tumor y la metástasis. Por otra parte, cuando el mismo volumen de la formulación polimérica con 10% p/p de paclitaxel se 9! inyecto en el tumor, el polímero permaneció por semanas en el sitio de inyección. La formulación degrada y libera el paclitaxel de la superficie de implantación que es muy grande. Mientras que toda la glándula de próstata se llena con la formulación la formación de metástasis y progresión del tumor se detiene. Asi, el mejor tratamiento es la inyección intratumoral de 200µ1 de polimero/pacli taxel . Este tratamiento prolongó el tiempo de vida de las ratas por diez, el volumen de tumor fue 18 veces más pequeño que lo otros, la proporción de necrosis en el tejido de tumor fue significantemente más alta y no se encontró de metástasis. En el carcinoma prostético humano avanzado sin terapia sistémica de adyuvante, la cirugía para remover la próstata hace poco en todo caso para prolongar la supervivencia. La falta de corriente de un tratamiento con adyuvante eficiente enfatiza la necesidad de mejorar la cirugía con nuevas modalidades del tratamiento experimentales. El uso de pasta biodegradable inyectable que libera fármaco anticáncer localmente puede resolver este problema. Ejemplo 5: Efecto de Aditivos en la Liberación del Fármaco: El objetivo de este estudio fue reducir adicionalmente la viscosidad y mejorar la inyectabilidad de la formulación de poli (SA: RA) ( 3 : 7 ) -paclitaxel al incorporar ácido ricinoleico, fosfolípido, PEG 400 y PEG 2000 en al formulación de polímero-fármaco sin afectar la liberación de paclitaxel de la formulación. Las formulaciones se prepararon mediante mezclado directo de todos los componentes a temperatura ambiente, que ocurrió en tres etapas: a) Paclitaxel (5 y 10% p/p) se mezcló mediante trituración con el aditivo ( PEG o fosfolipidos) ; b) ácido ricinoleico (20% p/p) se adicionó a la mezcla; c) la mezcla se incorporo en la pasta de polímero p(SA:RA) (30:70) mediante trituración. La composición se mezclo asta que una pasta blanda se formo. La formulación sin paclitaxel se preparó mediante el mismo esquema comenzando en la etapa 2. las siguientes formulaciones se prepararon: a) p ( SA : RA) 3 : 7+20% de ácido ricinoleico (RA) que contiene paclitaxel (5% y 10% p/p) o sin paclitaxel; b) p(SA:RA) (3:7) +20% de ácido ricinoleico (RA) -1-5% de fosfolípido (PL) que contiene paclitaxel (5% y 10% p/p) o sin paclitaxel; c) p ( SA : RA) 3 : 7+20% de ácido ricinoleico (RA) +5% de poli (etilenglicol) 400 (PEG 400) que contiene paclitaxel (5% y 10% p/p) o sin paclitaxel; d) p (SA: RA) 3 : 7+20% de ácido ricinoleico (RA) +5% de poli (etilenglicol) 2000 (PEG 2000) que contiene paclitaxel (5% y 10% p/p) o sin paclitaxel; y como un control p(SA:RA)3:7 sin aditivos que contienen paclitaxel (5% y 10% p/p) o sin el fármaco. Todas las formulaciones se prepararon y se llenaron en jeringas a temperatura ambiente sin calentamiento adicional. A las formulaciones obtenidas fueron pastas semisólidas a temperatura ambiente que se pueden inyectar. Los estudios de liberación de fármaco in vitro se condujeron al inyectar 10 mg de la muestra de formulación en pasta en 50 mi de una solución reguladora de fosfato (0.1 M, pH 7.4) a 37 °C con agitación constante (100 RPM) . La pasta se endurece a sólido blando pocos después de la adición a la solución reguladora. El medio de liberación se remplazó periódicamente con solución reguladora fresca y la concentración de fármaco en al solución se determino por la HPLC. Todos los experimentos se realizaron en triplicado. Degradación Hidrolí tica. In Vi tro La hidrólisis in vitro se evalúa al inyectar 25 mg de polímero puro o formulación en pasta con aditivos que contienen paclitaxel (5 y 10%, p/p) solución reguladora de fosfato (50 mi, 0.1 M, pH 7.4) a 37 °C con agitación constante (100 RPM) . El medio se remplazó periódicamente con solución reguladora fresca. En cada punto de tiempo, la muestra de polímeros se retiró de la solución reguladora, que peso en húmedo y en seco después de la lio ilización . La hidrólisis del polímero se monitoreo por perdida de peso de la muestra. Resultados Los aditivos seleccionados a ser adicionados al polímero P ( SA : RA) (3:7) fueron ácidos ricinoleico, fosfolípidos de huevo, PEG 400 y PEG2000. Estos aditivos se mezclaron homogéneamente con el polímero, y las formulaciones con aditivos se cargaron -con paclitaxel (5% y 10% p/p) podrían ser inyectadas fácilmente por la vía de una aguja de 22G sin calentamiento. La cromatografía de permeación en gel (GPC) se utiliza para determinar los pesos moleculares de P(SA:RA) (3:7) antes y después de la adición de 20% p/p de ácido ricinoleico. Después de la adición de 20% p/p de ácido ricinoleico al polímero, el peso molecular del polímero permaneció sin cambio y e, máximo de ácido ricinoleico se observa después de 8 minutos que corresponden a su peso molecular (300 g/mole) . La espectroscopia de IR no mostró cambio en el máximo que corresponde a un enlace de de anhídrido (1817cm_1) en la adición de los aditivos y/o en paclitaxel . La adición de 20% de ácido ricinoleico al polímero P(SA:RA) (3:7) causó que llegue hacer más blanda y permita la inyección de la formulación que contiene 5% y 10% de paclitaxel por la vía de la aguja de 22G a temperatura ambiente sin calentamiento adicional. El paclitaxel se disperso con el polímero para obtener una formulación homogénea . Ejemplo 7: Liberación de péptidos y proteínas Numerosos tratamientos terapéuticos con péptido y proteínas han sido probados o están en etapas avanzadas de prueba clínica. Investigaciones extensivas se han llevado a cabo sobre polímeros para sistemas de liberación controlada para péptidos y proteínas. La mayoría de este trabajo se ha enfocado sobre el PLGA. Desafortunadamente, la degradación en volumen del PLGA crea núcleo acídicos, que puede dañar los fármacos sensibles al pH tal como péptidos y proteínas. Los polímeros que erosionan la superficie, tal como polianhídridos , reducen el efecto de la acumulación acídica mediante proporciones de difusión incrementadas de fragmento solubles lejos de la partícula. Los polímeros líquidos y en pastas descritos en la presente se utilizaron para el suministro de péptidos y proteínas. La ventaja de utilizar un sistema de suministro de fármaco de estado en pasta es la facilidad en la incorporación del fármaco mediante mezclado-simple del polvo de fármaco en la pasta de polímero a temperatura ambiente sin ningún solvente orgánico, fuerzas térmicas o de esfuerzo cortante. Los siguientes péptidos y proteínas se utilizaron en este estudio: leuproiide (1270 Da), octreotido (1019 Da), albúmina de suero bovino (BSA) (68000 Da), insulina (5860 Da), interleucina (53000 Da) y alfa interferón-2a (IFN-alpha) (19000 Da) se utilizaron. Los péptidos se obtuvieron de Fuentes comerciales: leuproiide y octreotide (Novetide Ltd.), insulina (Protein Delivery Inc.) , albúmina de suero bovina (Intergen company) alfa interferón-2a (Roferon A®, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Suiza) , interleucina (Proleukin®, Chiron B.V., Amsterdam, países bajos) y reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu (Sigma- Aldrich) se utilizaron en este estudio. Las concentraciones de LHRH y octreotide en las soluciones reguladoras se determinaron, mediante un sistema de 1-IPLC (Hewlett Packard, Waldbronn, Alemania) compuesto de una bomba de HP 1100, un detector de UV l-IP 1050 y un programa de análisis de datos HP ChemStation utilizando una columna de fase inversa C18 (LichroCart® 250-4 , Lichrospher® 100, 5 µp?) . El LHRH se eluyó mediante acetonitrilo : solución reguladora TEAP (pH 3, 0.01M) 3:7 v/v y se detecto en ?=278 nm. En octreotide se eluyó por mediante acetonitrilo: PBS (pH 7.4 0.02 M) y detecto a ?=218 nm. Las concentraciones de BSA, insulina, IFN-alfa e interfirieron en soluciones reguladoras se determinaron por el ensayo de proteína Lowry. Los péptidos y las proteínas se molieron separadamente en una mezcla a temperatura ambiente a un polvo fino. El polvo de fármaco se mezclo con p(SA:RA) 2:8 o 3:7 hasta que se logro una fase de pasta homogénea. A fin de estudiar la liberación de péptido de los polímeros, las muestras de 20 mg de p(SA:RA) (2:8) cargadas con 10% p/p leuprolide y octreotide y las muestras de polímero puro del mismo peso se prepararon. Las muestras se incubaron en solución de fosfato reguladora de 15 mi de pl-l 7.4, 0.1 M a 37°C, con agitación orbital (100 RPM) . Las muestras de 2 mi se tomaron y se analizaron entre la HPLC. La solución reguladora se remplazó cada 48 horas para evitar la saturación de péptido y turbiedad de la solución. La degradación de los polímeros bajo condiciones fisiológicas se siguió por la perdida de peso y el análisis GPC durante 40 días . La liberación de la proteína de los polímeros: muestras de 50 mg de p(S7\:RA) (2:8) cargado con 10% p/p de BSA y las muestras de 50 mg de p(SA: R7-V) (3:7) cargadas con 5% p/p de insulina se prepararon y incubaron en 20 mi de solución reguladora; las muestras de 20 mg de p(SA:RA) (3:7) cargadas con 5% de interleucinas y muestras de 20 mg de p(SA:RA) (3:7) cargadas con 5% de IFN-alfa se prepararon y se incubaron en 10 mi de solución reguladora. Las muestra de 0.2 mi se tomaron desde el medio cada 48 horas, y se incubaron con el reactivo de Folin-Ciocalteu de acuerdo al método de ensayo Lowry y se analizaron con un espectrofotómetro de UV . La solución reguladora se remplazó cada 48 horas para evitar la saturación de proteínas y turbiedad de la solución. Los resultados se muestran en la Figura 13. Los polímeros que se eligieron para este estudio fueron p(SA:RA)s con relaciones de 2:8 y 3:7 p/p con un peso molecular promedio de 12,000 y 18,000, respectivamente. Los polímeros representaron dos máximos de anhídridos de IR a 1732 cnf1 y 1817 era"1. En máximo 1732 cm_1 también se puede referenciar a los enlaces de éster. Nada de máximos de ácido libres estuvieron presentes a 1700 crrf1 (C=0) y 3500 cm"1 (0-H) . La espectroscopia de NMR confirmó la inserción de todo el RA en la cadena de PSA mediante la desaparición de máximo sea CH-OH a 3.613 ppm y la apariencia de máximo de CH-O-CO a 4.853 ppm. La degradación hidrolitica de p(SA:RA) (2:8) cargado con 10% de LHRH y octreotido se estudio por la perdida de peso y el cambio en el peso molecular. No hubo diferencias significantes en la perdida de peso molecular entre los polímeros puros y de péptido. El LHRH y el octreotido se liberaron constantemente del polímero calificado durante 40 días como es monitoreado por la HPL. Ejemplo 8: polímero liquido para el suministro de anestésico local de bupivacaina El dolor posoperativo es considerado un problema mayor para el paciente y el proceso de sanación después de la cirugía. Métodos actuales, que incluyen múltiples inyecciones de soluciones anestésicas locales de acción corta, son equipo costoso consumidores de tiempo y de demanda y de monitoreo cercano. Métodos menos invasivos son generalmente menos eficaces. Esta falta de tratamiento eficiente para el dolor posoperativo destaca la necesidad urgente para" nuevos principios terapéuticos en esta área. Un procedimiento alternativo es la administración local de esta dosis de agentes anestésicos locales, que pueden prolongar el efecto de los agentes anestésicos locales durante un periodo de pocos días y aun semanas por la vía de un implante inyectable de liberación controlada. Tal sistema de suministro de fármaco dirigido de sitio puede proporcionar dosis efectiva del fármaco y pueden evitar toxicidades sistémicas asociadas con el uso repetido de las formulaciones sistémicas. Preparación del implante y liberación del fármaco in vitro La base libre de bupivacaina (5,7,10% p/p) se incorporó en los polímeros líquidos al mezclar el polvo de fármaco en el polímero a 40°C y llenar una jeringa de 1 mi con esta formulación. Esta formulación es un semisólido a temperatura ambiente y líquida a temperatura corporal. Estudios de liberación de fármaco in vitro se condujeron al inyectar 100 mg de la formulación semisólida en un medio de disolución de 50 mi (solución reguladora de fosfato (0.1 M, pH 7.4) a 37°C con agitación constante (100 RPM) . A fin de estimular la condición de sitio in vivo un volumen grande de medio de disolución se utilizó de modo que la concentración de bupivacaina nunca alcanzó más de 10% de su solubilidad máxima. El medio de liberación se reemplazó periódicamente con solución reguladora fresca y la concentración de fármaco en la solución se determinó mediante el HPLC. Todos los experimentos se hicieron en triplicados. Similarmente , el clorhidrato de bupivacaína. se incorporó en el polímero utilizando procedimiento similar. La bupivacaína de base libre formó una solución clara e el polímero mientras que la sal de HC1 fue una dispersión fina. Animales Se utilizaron ratones ICR hembras pesando 40 g. Los ratones se alojaron, diez a una jaula con acceso libre a alimento y agua. El cuarto de animales se alternó con luz (12 hr con luz, 12 hr con oscuridad) y la temperatura fue de 22°C. Los animales se anestesiaron con halotano (1.5-2%) durante la identificación del nervio ciático y la inyección de la formulación. El nervio se identificó con un estimulador de nervio (Stimuplex® diámetro de 22G, B. Braun Melsungen AG, Alemania. Cada animal recibió una sola inyección (0.1 mi) de un polímero que contiene bupivacaína (10% p/p) sobre un lado y el polímero puro correspondiente o solución salina sobre el lado contralateral . Toxicidad y eliminación de las formulaciones de polímero Las evaluaciones de histología Pos-mortem para la inflamación, infección y necrosis en el órgano principal, y los nervios ciáticos tratados con polímero-fármaco y los controles se realizaron. Después de la completación de un experimento sobre la eficacia de la bupivacaína el animal se anestesió con hidrato clora! al 4% (0.2 mi), la sangre se extrajo del corazón y después el animal se sacrificó mediante punción pulmonar, los órganos mayores (corazón, pulmones, hígado, vaso, cerebro, y nervio ciático izquierdo y derecho) se excisaron y se colocaron en una solución de formaldehído al 10% para fijación. El tejido luego se incrustó en parafina y se manchó con hematoxilina-eosina . La evaluación histológica se realizó mediante microscopía de luz con la asistencia de patólogos en la casa del animal en el Hospital Hadassah de la Universidad Hebrea. Las concentraciones de bupivacaína en la sangre de los ratones se determinaron de acuerdo a procedimientos conocidos. Brevemente, 0,5 mi de plasma de ratón se extrajo con 1.5 mi de heptano-acetato de etilo (9:1, v/v) y se agitó durante 2 minutos. Después de al centrifugación a 1200 g durante 10 minutos, la fases orgánica se transfirió en un tubo cónico. La segunda etapa de extracción se llevó a cabo después de la adición de 100 µ? de ácido sulfúrico 0.05 M y agitación durante 2 minutos. Después de la centrifugación a 1200 g durante 5 minutos, la fase orgánica se descartó y se adicionó a 50 µ? de la base de ácido acuosa 100 µ? de DDW. Una alícuota de A-100 µ? se inyectó en la cromatografía. El sistema cromatográfico consistió de una bomba HP 1100, un detector de UV HP 1050, y un programa de análisis de datos HP ChemStation equipado con una columna de fase inversa C18 (LichroCart® 250-4, Lichrospher® 100, 5 µ??) . La fase móvil fue una mezcla de pH 2.1 de acetonitrilo y dihidrogenfosfato de sodio 0.01 . La velocidad de flujo fue de 1 ml/min y la detección de UV fue a 205 nm (volumen de inyección de 100 µ?, tiempo de corrida 12 min) . Estudios de eficacia in vivo Bloqueo Motriz Los ratones se estimaron con respecto al bloqueo motriz de acuerdo a una escala de 4 puntos: dorsiflexión 1-normal, 2-intacta del pie con habilidad deteriorada a extender los dedos cuando se eleva por la cola, 3 dedos y la planta del pie flexionados con nada de habilidad de extendimiento, 4 pérdida de dorsiflexión, flexión de los dedos y deterioro del modo de andar. Prueba Sensorial de Placa Caliente Hargreaves Este modelo permite la prueba motriz y sensorial independiente. Los ratones se colocaron parados sobre una placa. Después de la aclimatación al aparto, un haz infrarrojo (temperatura de calor estándar 50-52°C) se dirigió a la parte trasera probada. La latencia al retiro de la pata trasera de la placa caliente se registró al alterar la patas y permitiendo por lo menos la recuperación de 15 seg. Entre las mediciones de la placa. Debido aquel retiro de los músculos para la pata son los aductores de la pierna (nervio no ciático femoral) los ratones pueden retirar una pata a pesar del bloqueo del nervio ciático total (nivel 4) . Además, un pinchazo se aplica a la pata, y una reacción (si = 1, o no = 0) será registrado. Análisis estadístico Los registros de Hargreves (tiempo al evento) se analizaron utilizando un análisis modelo mezclado de variación. La pregunta principal de interés fue si el fármaco afectó el registro Hargreves. Dos experimentos se condujeron, y se sutilizaron animales diferentes en varios tiempos. El fármaco, experimento, y la hora se consideraron como efectos fijos, y el animal (anidado dentro del experimento y hora) se consideró que es un efecto aleatorio. El SAS Proc Mezclado (Versión 8.02) se utilizó para realizar los análisis Resultados Liberación de fármaco in vitro La bupivacaína se incorporó en el polímero sin afectar el peso molecular del polímero, como se confirmó con el GPC. La base libre de bupivacaína (BFB) es fácilmente soluble en P(SA-RA) hasta 15% p/p de BFB. La sal de clorhidrato de dispersó bien en el polímero sin afectar su viscosidad por lo menos hasta 15% p/p de carga. Las formulaciones de P(SA- RA) 2 : 8 y 3:7 que contienen 5% y 7% de bupivacaína liberaron constantemente el fármaco en un primer perfil de orden con aproximadamente 60% del fármaco incorporado que se liberó durante 7 días en solución reguladora, la formulación que contiene 10% liberó aproximadamente 70% de su contenido durante este periodo. Para todos los experimentos, los polímeros de M más alto (Mw=18,000) liberan el fármaco a una velocidad más lenta, entre 10 y 20% menor que la cantidad liberada en cada punto de tiempo, comparada a los polímeros con MW bajo (Mw=5,000). Toxicidad y evaluación histopatologica La evaluación histológica de los nervios ciáticos, los tejidos circundantes (grasa y músculo) y los órganos mayores se realizaron sobre ratones sacrificados tres días y una semana pos la inyección. Tres días pos la inyección solo en los ratones de tres fue la infiltración de macrófago encontrada en la grasa que circunda el nervio ciático. En el orden de los ratones el nervio derecho y el izquierdo, el músculo circundante y la grasa se encontraron normales. Todos los otros órganos examinados (pulmón, hígado, corazón, cerebro y vaso) se encontraron normales en todos los ratones examinados. En la examinación histológica realizada una semana pos la inyección solo en dos ratones de cinco se encontraron neutrófilos y linfocitos perineurales raros en el tejido que circunda el nervio ciático, y todos los órganos examinados (pulmón, hígado, corazón, cerebro y vaso) se encontraron normales en todos los ratones examinados. La concentración de plasma de la bupivacaína después de la inyección de 10 mg del fármaco cargado en el polímero se estudió. Después de 24 horas el nivel de plasma alcanzó 75±15ng/ml y luego cayó a 18±5ng/ml después de 6 días y después de 7 días al día 21 en los niveles de plasma casi fueron indetectables (7±2ng/ml) . Estas concentraciones de plasma no causaron ninguna toxicidad sistémica observada, similar a convulsiones y todos los ratones que recibieron 10 mg de bupivacaina cargada en el polímero sobrevivieron el estudio . Eficacia La prueba sensorial de placa caliente de Hargreaves se realizó durante 4 días pos la inyección de la formulación de bupivacaina. Se encontró que el efecto de anestesia se mantuvo durante 3 días pos la inyección. El bloqueo motriz desapareció 24-36 horas pos la inyección. Conclusiones : Basado en estos resultados el poli (ácido sebácico-co-ricinoleico) retraza la liberación de bupivacaina y prolonga la anestesia sin ningún efecto patológico negativo. Ejemplo 9: Portador de Poli (ácido sebácico-co-ricinoleico-éster-anhidrido) Biodegradable para la Liberación Controlada de Gentamicina para el Tratamiento de Osteoporosis La osteomielitis es una infección de huesos causada usualmente por bacterias pero algunas veces por un hongo. Existen tres maneras posibles mediante el cual el hueso se puede infectar. La infección de hueso se puede causar por la extensión de la infección de tejido blando adyacente que ha sido lesionado o tiene pobre circulación sanguínea. Las infecciones de otras partes del cuerpo se pueden llevar a los huesos a través de la sangre (propagación hematógena) . La infección de huesos directa puede se el resultado de una herida penetrante o fractura abierta. El tratamiento de la infección de huesos involucra principalmente el desbridamiento operativo, remoción de todos los cuerpos extraños y terapia antibiótica. Usualmente, los antibióticos intravenosos se prescriben durante tres semanas, seguido pro tres semanas de antibióticos orales. Sin embargo, la dosis parenteral alta del antibiótico requerido para lograr los niveles de fármaco terapéuticos efectivos en el hueso así como el curso prolongado de tratamiento puede conducir a la toxicidad sistémica del antibiótico. El suministro local de antibióticos al sitio infectado ofrece ventajas mayores sobre la terapia intravenosa tradicional. Un sistema de suministro de fármaco local puede lograr una concentración de fármaco alta en el sitio de infección al mantener niveles de fármacos sistémicos bajos. Los sistemas de suministro de fármaco desarrollados por el suministro local de antibióticos se pueden dividir en barreras no biodegradables y biodegradables . Las cuentas de polimetilmetracrilato (PMMA) que contienen gentamicina se han aprobado para el uso en tratamiento de osteomielitis en Europa. Aunque este producto ha sido probado que es eficaz, sufre de la mayor desventaja de no ser biodegradable y requiere remoción subsecuente de las cuentas en la completación de la liberación del antibiótico. En años recientes, varios sistemas de suministro biodegradables se han desarrollado y evaluado para el suministro local de antibióticos en el tratamiento de infecciones del hueso. El sulfato de gentamicina, un agente antibiótico potente, se utiliza actualmente para el tratamiento de osteomielitis principalmente mediante la inyección intravenosa con un catéter interno a largo plazo, cuentas de polimetilmetacrilato que contienen antibiótico o fosfato de calcio (cementos para hueso) . Liberación de Gentamicina in vitro .Polímeros P(SA:RA) con relación de (3:7) p/p con pesos moleculares diferentes se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. El sulfato de gentamicina se mezcló en poli (SA: RA) 3:7 a temperatura ambiente sin ningún calentamiento o uso de solvente hasta que se obtuvo una mezcla homogénea. Las cargas del fármaco fueron 10% y 20%. Los estudios de liberación de fármacos se condujeron al colocar 200 mg de formulación en 50 mi de solución reguladora de fosfato "(0.1 M, pH 7.4) a 37°C con agitación constante (100 rpm) . Para estimular el flujo de los fluidos biológicos, la solución reguladora se reemplazó cada 48 horas y las soluciones reemplazadas se mantuvieron para el análisis de gentamicina.

Para el ensayo de liberación in vitro, 25 µ? de la formulación se colocó en el fondo de cada cavidad en una placa de fondo plano de microtitulo de 24 cavidades (disponible de None, Copenhague, Dinamarca) . En mi de solución salina reguladora de fosfato (PBS) se adicionó y la placa se incubó en una cámara húmeda a 37 °C. En cada punto de tiempo, el medio de disolución se recolectó, la formulación se lavó con uno mi de PBS y uno mi fresco de PBS se adicionó a las cavidades. El medio se centrifugó y el sobrenadante se mantuvo para el estudio bacteriano y los análisis de concentración de gentamicina. Las muestras recolectadas se diluyeron 100 veces, se hicieron reaccionar con fluorescamina (Sigma, Israel) y se analizaron mediante un espectrofluorómetro (Jasco, Japón) en una longitud de onda de excitación de 392 nm y una longitud de onda de emisión de 480 nm para determinar la concentración de gentamicina. La formulación preparada para este estudio contuvo 20-40 mg de gentamicina. Los polímeros cargados con gentamicina se prepararon mediante mezclado simple del polvo del fármaco en la pasta de polímero. No se observaron interacciones químicas entre la sal de fármaco y el polímero. La proporción de liberación de gentamicina de los polímeros de pasta en la solución reguladora de fosfato se muestra en la Figura 14. Se puede observar que las formulaciones con 20% de gentamicina tienen perfiles de liberación más lentos que aquellos de las formulaciones con 10% de gentamicina. Esta diferencia en el perfil de liberación es mucho más probablemente debido a la formación de sal entre la gentamicina y los productos de degradación grasos del polímero. En ambos casos, el incremento del peso molecular del polímero disminuye la proporción de liberación de gentamicina. Los polímeros cargados con gentamicina con Mn>10,000 Da fueron viscosos y difíciles de inyectar. Por lo tanto, P(SA-RA) 3:7 (Mn=4500) cargado con 20% de gentamicina se elige para investigación adicional. En un segundo estudio de liberación in vitro, la gentamicina se liberó en una charola de 24 cavidades (1 mi de solución/cavidades). Las formulaciones utilizadas en este estudio contuvieron aproximadamente 5 mg de gentamicina activa. El perfil de liberación fue similar al perfil de liberación obtenido al liberar en un volumen grande agua. Por ejemplo, después de ocho días, 9% (aproximadamente 0.45 mg) de la gentamicina cargada se liberó. Los resultados completos indican ' una liberación constante de gentamicina sobre un período prolongado de tiempo (por ejemplo mayor que 60 días) que es una ventaja para el tratamiento de infecciones crónicas o para la prevención de una infección recurrente. La actividad antimicrobiana de la gentamicina liberada en la solución reguladora se confirmó mediante la incubación durante la noche con S. aureus en TSB y determinar la viabilidad de las bacterias. Actividad antibacteriana in vitro Las soluciones sobrenadantes del estudio de liberación in vitro de los polímeros que contienen gentamicina se adicionó a los cultivos de S. aureus. El sobrenadante recolectado se diluyó 100 veces, 1000 veces y 10000 veces con PBS y se adicionó a las cavidades en una placa de fondo plano de microtítulo de 96 cavidades que contuvo 106 S. aureus en TSB. La placa se incubó dentro de un espectrofotómetro de microplaca controlado de temperatura (VERS Amax, Molecular Devices Corporation, CA<USA) durante 24 horas. Las mediciones de densidad óptica (OD) se realizaron cada dos horas a 650 nm para determinar la concentración bacteriana en. las cavidades. Una correlación se encontró entre la concentración de gentamicina determinada por el método de fluorescamina y el efecto bacteriano in vitro. La concentración inhibidora mínima de la gentamicina para el S. aureus utilizada en este estudio es 2-4 µg/ml. Los resultados del análisis del espectrofotómetro VERS Amax se resumen en la Figura 15. Después de 6 y 8 días la concentración de gentamicina fue suficiente para erradicar el S. aureus cuando las soluciones se diluyeron 100 (4.5x10-3 mg/ml) y 1,000 (4.5x10-4 mg/ml) veces, respectivamente (A y B en la Figura 15). En el caso de la dilución de 10, 000 veces (C en la Figura 15) la concentración no fue inhibidora. Las cavidades de control con el P(SA-RA) (3:7) puro p/p (Mn=4500) no afectaron el crecimiento de las bacterias. Ningún efecto se encontró en estas cavidades: la O.D. fue de aproximadamente 0.7. En las cavidades que contenían el S. aureus en TSB solo, la O.D. de aproximadamente 0.6 se encontró. En vista de los resultados de la liberación de gentamicina (Figura 14) y la inhibición bacteriana profunda por las soluciones diluidas (Figura 15), existe probablemente una actividad antibacteriana significante en el medio de liberación en una etapa temprana. Eficiencia y concentración de fármaco in vivo en el sitio de inyección Polímeros p (ácido sebácico-co-ricinoleico-éster-anhídrido) de 3:7 y 2:8 p/p inyectables cargados con 10 y 20% de sulfato de gentamicina se utilizaron. Se realizaron estudios de eficacia sobre ratas infectadas con Staphylococcus aureus {S. aureus) en tanto la tibia próxima de 16 ratas Wistar machos. 'Las patas se afeitaron, se depilaron y se desinfectaron con alcohol. Para proporcionar condiciones estériles durante la cirugía, lo animales se colocaron sobre paños estériles y los cuerpos se cubrieron con sabanas estériles. Las patas se cubrieron con paño separadamente con una lámina delgada de incisión estéril. La piel y la fascia en la metáfisis tibial próxima se hizo una incisión sobre 5 mm en longitud. Se perforó un agujero (broca de titanio de 3 mm) a través del hueso cortical y poroso. Una suspensión de S aureus que contiene unidades que forman colonias de 1.0x10 (CFUs) por mi se preparó. Diez µ? de la suspensión se inyectó con una jeringa de 50 µ? en cada sitio de herida. El animal se mantuvo durante 4 semanas para permitir la osteomielitis a desarrollarse. Después de este periodo, las radiografías de las extremidades afectadas se hicieron y las ratas se sometieron al. tratamiento. La formulación se inyectó en el hueso infectado de las ratas del grupo de prueba . El grupo de prueba recibió inyecciones de p(SA:RA). 100 µ? del polímero cargado con 10% de gentamicina se inyectó por la vía de una aguja de 23 G en el hueso infectado. El grupo de control no recibió ningún tratamiento. Después del exterminio de los animales, las extremidades se desarticularon en la cadera y el codo. Las radiografías de cada espécimen se tomaron. Dos mm de muestras de tejido se tomaron de los sitios de implantación después de 1, 2, 4, y 8 semanas. El tejido se homogeneizó en 1 mi de solución salina normal (pH 7.4) y se centrifugó. El sobrenadante se removió y se analizó mediante un Inmunoensayo de Polarización de Fluorescencia (FPIA), que es disponible de Abbott Diagnostics bajo el nombre comercial TDx, para determinar la concentración de gentamicina . En todos los animales, una reducción significante en el conteo de bacterias WAS se encontró comparado a los grupos de control. La gentamicina se encontró en los tejidos analizados después de 4 semanas y pequeñísimas cantidades se observaron después 8 semanas. Toxicidad del implante de polimero-gentamicina Ratas Wistar machos, de 10 semanas de edad (Harían laboratories , Jerusalén, Israel) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicas y se les dio libre acceso a alimento irradiado y agua acidificada por todo el experimento. El comité de ética en la Universidad Hebrea de Jerusalén (Institutos Nacionales de Salud número de aprobación: OPRR-AO 1-5011) han revisado la aplicación para el estudio animal y la encontraron compatible con los estándares para el cuidado y uso de los animales de laboratorio (número de búsqueda de comité de ética: MD-80.04-3) . 200 µ? de formulación semisólida cargadas con gentamicina (0%, 10% y 20% p/p) se inyectaron subcutáneamente en la parte frontal del abdomen de dos grupos de tres ratas Wistar por la vía de una aguja de 19G. Un grupo se implantó con una formulación que contiene 200 µ? de p(SA:RA) (3:7) puro sobre el lado izquierdo y 200 µ? de p(SA:RA) (3:7) cargado con 20% de gentamicina sobre el lado derecho. El segundo grupo se implantó con una formulación que contiene 200 µ? de p(SA:RA) (3:7) puro sobre el lado izquierdo y 200 µ? de p(SA:RA) (3:7) cargado con 10% de gentamicina en el lado derecho. Los animales se observaron para signos de toxicidad local y para pérdida de peso. Seis semanas después de la inyección las ratas se sacrificaron, el implantación se removió mediante análisis químico y el tejido circundante se fijó en 4% de formaldehído neutralmente regulado y se sometió a la examinación histopatológica . La evaluación histopatológica indicó que en las muestras tomadas de 2 grupos en los cuales 10% o 20% de la formulación de gentamicina se adicionó al polímero p(SA:RA) (3:7), el grado de reacción de tejido capsular fue comparable a aquel formado cuando el polímero puro solo estuvo presente, sugiriendo ninguna reacción adversa en aplicación de la modalidad terapéutica combinada. La cápsula formada se compuso predominantemente de deposición de colágeno maduro, asociado con la presencia de fibroblastos, vasos sanguíneos e histiocitos escasos u otras células mononucleares . Ninguna evidencia de ninguna reacción inflamatoria activa o irritación de tejido estuvo presente dentro de la cápsula o que se extiende más allá de la cápsula local. En todos los casos el espesor de las cápsulas fue similar. La reacción de tejido local consiste típicamente de una cápsula de envoltura delgada se interpretó como una reacción inflamatoria subcrónica de cicatriz. No se notó evidencia de cuerpo extraño granulomatoso, agregación de célula linfoide, y/o estimulación inmunológicas , indicando que los implantes se toleraron bien. La biocompatibilidad del polímero (poli (RASA) (70:30) y la formulación cargada con gentamicina al 20% con el hueso se determinó al hacer agujeros en la tibia de la rata y al inyectar en el hueso 0.2 mi del polímero o formulación. Grupos de 5 ratas se utilizaron en este estudio. Los huesos se analizaron histopatológicamente y no se encontró evidencia de toxicidad atribuida al políir.ero o formulación. La inflamación notada en respuesta al polímero fue consistente con la remoción activa del material por la vía de mecanismos normales. El polímero y la formulación se eliminaron completamente del hueso de ocho semanas posimplantación. Estabilidad a ?-irradiación P(SA:RA) (3:7) p/p con 20% de sulfato de gentamicina (GS) se utilizó en este estudio. Después de que la polimerización se completó, el GS se adicionó al polímero en pasta a temperatura ambiente y se mezcló mecánicamente hasta que una mezcla homogénea se logró. Uno mi de la mezcla se cargó en jeringas de plástico de cierre de uno mi. Las jeringas que contienen uno mi de polímero puro también se prepararon. Todos los polímeros se irradiaron con una dosis absorbente de 2.5 Mrad por medio de una fuente de 60Co (450000 Ci; 8 h) . La irradiación se condujo en Sor-Van Radiation Ltd. (Kiryat Soreq, Yavne, Israel). Los pesos moleculares de los polímeros cargados y puros antes y después de la irradiación se midieron mediante la GPC. Los puntos de fusión de los polímeros cargados y puros antes y después de la irradiación se midieron por DSC. Las estructuras químicas de los polímeros cargados y puros antes y después de la irradiación se determinaron por la IR y la espectroscopia de 1H-N R. El contenido de gentamicina se determinó al desarrollar muestras antes y después de la irradiación en el diclorometano y extraer el fármaco con agua doblemente destilada (DDW) tres veces. Las extracciones se combinaron y se analizaron utilizando un espectrofluorómetro . Después de la irradiación las formulaciones se almacenaron a 37°C, 20°C, 4°C y -17°C. Ninguna de las muestras irradiadas se utilizó como control. En diferentes puntos de tiempo, las muestras se retiraron de las formulaciones irradiadas y controladas y se analizaron mediante los métodos descritos en lo anterior. Los resultados se muestran en la Tabla 9. Tabla 9. Cambios en los pesos moleculares (Mn y Mw) y puntos de fusión (p.f.) de los polímeros almacenados.

Condiciones de Muestreo Mn (Da)a m.p. (C)D almacenamiento Formulación formulación 3olímero puro rradiada no irradiada rradiado 37°C O dia 5000 5000 5000 32 1 día 4000 4200 5000 32 3 días 2000 2000 2500 30 7 días 2000 2100 2000 30 10 días 1700 1700 1600 27 14 días 1300 1200 1300 27 20°C 0 día 5000 5000 5000 32 1 día 5000 5000 5000 32 7 días 5000 5000 5000 32 14 días 4000 3900 4100 32 21 clías 4000 4000 4200 32 28 días 3500 3200 3000 31 35 días 2100 2000 2200 31 42 días 1700 1800 1600 29 49 días 1700 1500 1400 28 56 días 1500 1500 1400 28 4°C 0 días 5000 5000 5000 32 28 días 5000 5000 5000 32 56 días 3700 3500 4100 32 100 días 2000 2000 2000 . 29 -17°C Odias 5000 5000 5000 32 56 días 5000 5000 5000 32 lOOdías 5000 5000 5000 32 150 días 5000 5000 5000 32 200 días 5000 5000 5000 32 a El peso molecular promedio en peso (Mw) y el peso molecular en número (Mn) se determinaron mediante la GPC. b Punto de fusión (p.f.) se registró mediante DSC a 10°C/min para las muestras irradiadas solamente. En algunos puntos, un estudio de liberación de fármaco breve se condujo a fin de detectar cambios posibles en la liberación de fármaco debido a las condiciones de almacenamiento. Los perfiles de liberación de las formulaciones almacenadas de 4°C y -17 °C se muestran en la Figura 16. La liberación de la gentamicina fue similar en las dos formulaciones. Las muestras se disolvieron en diclorometano y se extrajeron tres veces con solución reguladora de fosfato (0.1 M, pH = 7.4) . La Figura 16a muestra la liberación de la gentamicina de una formulación almacenada a 4°C durante 8 semanas. La Figura 16b muestra la liberación de la gentamicina de una formulación almacenada a -17°C durante 8 semanas. Los perfiles de liberación de las muestras irradiadas y no irradiadas fueron similares indicando que la irradiación no liberó el. fármaco del efecto del polímero de irradiación. El almacenamiento a temperatura durante dos semanas no pareció que afecta el perfil de liberación de la gentamicina. No hubo diferencia entre los espectros de IR y NMR para las formulaciones irradiadas y no irradiadas. La degradación durante el almacenamiento se puede seguir mediante la espectroscopia de IR al monitorear la desaparición del máximo de anhídrido y la presencia del máximo de ácido a 1700 cnf1. Ninguna degradación se indicó para las formulaciones almacenadas a -17 °C. Las formulaciones que se almacenaron a 4°C desarrollaron un máximo de ácido después de seis semanas el cual se incrementó en el tiempo. Ejemplo 9: Poliésteres Líquidos que contienen oligómeros de ácido ricinoleico Los oligómeros de ácido ricinoleico de Mw = 2200 y 3600 preparados mediante condensación directa de ácido ricinoleico se utilizaron en este estudio. Los oligómeros de RA terminados con' hidroxi se obtuvieron al hacer reaccionar los oligómeros de RA con óxido de etileno u óxido de propileno los cuales formaron el éster de etilenglicol o propilenglicol . Los oligómeros de RA terminados con hidroxilo se utilizaron como iniciadores para la polimerización abierta de anillo de DL-lacturo, caprolactona y ácido glicólico y sus mezclas. Los copolimeros tribloque ABA con segmento B que son oligómero de ácido ricinoleico se obtuvieron mediante la polimerización abierta de anillo de oligómeros de RA terminados con HO con L-lacturo utilizando octoato estañoso como catalizador. La relación molar entre el oligómero RA y el lacturo determinaron el peso molecular del polímero y la longitud del segmento. Los copolimeros tribloque de DL-lacturo que contiene 20% de oligómeros RA fueron líquidos a temperatura ambiente y forman un gel en agua. Similarmente , los polímeros en pastas se obtuvieron de copolimeros dibloque de DL-lacturo y oligómeros de RA que tienen un grupo hidroxilo . Los copolimeros aleatorios de oligómeros de RA y ácidos hidroxilo se obtuvieron mediante la policondensación de oligómeros de ácido ricinoleico con ácido láctico, ácido glicólico y ácido hidroxil butírico. La polimerización está tomando lugar en tolueno con la catálisis acídica. Después de la evaporación del tolueno, la polimerización continúa a 130°C bajo vacío Hg de 1 mm para producir un polímero en pasta en un contenido de ácido láctico menor que 10%. Varios copolímeros se obtuvieron de la copolimerización de los ácidos hidroxilo y sus lactonas en los poliésteres. Estos polímeros se incrementan en viscosidad cuando se inyectan en el cuerpo y liberan un fármaco incorporado durante semanas y meses, dependiendo principalmente sobre la solubilidad del agua del fármaco. Ejemplo 10. Síntesis y Caracterización de Poliésteres de Ácido Ricinoleico con Ácido Láctico y Glicólico El ácido L-láctico (solución al 50% en agua) se liofilizó durante la noche antes del uso. El aceite de ricino y el ácido L-Láctico con relaciones p/p de 1:10, 1:5, 2:5, 3:5 (p/p de aceite de ricino a lacturo) se mezclaron con 0.5% de H3PO4 p/p como catalizador y se calentaron a 170°C bajo una corriente de N2 durante 1.5 horas para secar el sistema. Después de 1.5 horas, la reacción se conectó a un vacío de 15 mBar y la reacción se continuó durante 24 horas. Las muestras se tomaron a 3, 5 y 7 horas de la polimerización. La apariencia y los pesos moleculares promedios en peso y promedio en número de los polímeros se describen en la Tabla 4. Los poliésteres de ácido ricinoleico y ácido láctico también se prepararon. Las propiedades de estos polímeros se describen en la Tabla 5. La copolimerización del ácido láctico con ácido ricinoleico/aceite de ricino dio por resultado polímeros con propiedades deseadas tales como flexibilidad, hidrofobicidad y suavidad. La presencia de ácido ricinoleico en las cadenas de polímero dio por resultado el impedimento estérico del polímero para producir polímeros blandos o aun líquidos. Estos polímeros en pastas se gelificaron a un material más duro cuando se sumerge el polímero en solución acuosa. La inyección de estas pastas poliméricas en el tejido dio por resultado la localización de la formulación de polímero en el sitio de inyección.

Tabla 10. Propiedades de los Poliésteres de Aceite de Ricino y Ácido Láctico Relación 3h 5h 7h 24h p/p de Aceite de Mn/Mw apariencia Mn/Mw apariencia Mn/Mw apariencia Mn/Mw apariencia m.p ricino/ lacturo :90 n=402 Líquida Mn=2877 Líquida Mn=2825 sólida Mn=4301 sólida frágil 1 5°C Mw=1454 Mw=3307 Mw=4267 Mw=6767 20:80 Mn=98l Líquida Mh=3046 Líquida Mn=3756 solida Mn=6944 sólida en pasta 75°C Mw=2004 Mw=3701 Mw=5207 Mw= 13996 30:70 Mn=2294 Líquida Mn=2677 Líquida Mn=3148 en pasta Mn=6567 Líquida Líquida Mw=2534 Mw=3133 Mw=4104 Mw=10558 a R.T.

Tabla 11. Propiedades de los Poliésteres de Ácido Ricinoleico y Ácido Láctico Polímeros que contienen relación de 30:70 p/p de aceite de ricino o ácido ricinoleico) se sintetizaron de DL-ácido Láctico y ácido glicólico y mezclas de los mismos. Todos los polímeros mostraron un peso molecular similar de Mn en el intervalo de 4000 y fueron materiales en pastas. El polímero de DL-ácido láctico fue más similar al líquido que los otros polímeros. Todos los polímeros cambias su viscosidad y gelificación cuando se colocan en medios acuosos durante una hora a temperatura ambiente. Ejemplo 11. Liberación in Vitro de Taxol y Metotrexato de poliésteres de Ácido Ricinoleico y Ácido Láctico Las formulaciones que contienen 10% p/p de taxol y 10% de p/p metotrexato se prepararon al mezclar el fármaco con los copolímeros de poli (ácido láctico : aceite de ricino) con relación de 60:40 y 70:30 p/p que tienen un Mn = 3,000 y Mw = 7,000. El fármaco se mezcló con polímero a temperatura ambiente utilizando un mortero y una mano para moler. Ningunos solventes o calor se utilizaron. El tamaño de partícula de las partículas de fármaco en la formulación en pasta fue menor que 100 mieras como se determina por los análisis SEM. Una jeringa de 1 mL se llenó con la formulación de fármaco-polímero y las muestras de 10 mg cada una se inyectaron en 50 mi de solución reguladora de fosfato que tiene un pH de 7.4 a 37°C. La solución reguladora también contuvo 0.3% p/v de dodecil sulfato de sodio (SDS) . El SDS se adicionó para incrementar la solubilidad del paclitaxel liberado. La solución reguladora se reemplazó diariamente durante la primera semana y cada tres días posteriormente . La liberación del paclitaxel y metotrexato se monitoréó mediante la HPLC. El Taxol y Metotrexato se liberaron a una velocidad constante de la formulación de polímero con el polímero que permanece como gotitas semisólidas uniformes sin desintegración. 25% del metotrexato cargado se liberó a una velocidad constante durante aproximadamente 20 días mientras que 5% y 10% del paclitaxel cargado se liberó después de aproximadamente 30 y 60 días, respectivamente.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición de polímero hidrofóbica, caracterizada porque la composición es un líquido o pasta a una temperatura por debajo de 37 °C que se gelifica en solución acuosa.
2. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende un poliéster o un poli ( éster-anhídrido ) compuesto de oligómero de éster de ácido ricinoleico y moléculas alifáticas que tienen por lo menos un ácido carboxílico y por lo menos un grupo hidroxilo o un grupo de ácido carboxílico adicional en donde la formulación es un líquido o pasta a una temperatura por debajo de 37 °C.
3. 3. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque además comprendé por lo menos un agente activo.
4. 4. La formulación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende un agente seleccionado del grupo que consiste de agentes terapéuticos, de diagnóstico y profilácticos.
5. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el poli (éster-anhídrido) comprende unidades de monómero de ácido alcanodioico que tienen por lo menos 4 átomos de carbono.
6. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porqués las unidades de monómero de ácido alcanodioico se seleccionan del grupo que consiste de ácido dicarboxilico lineal de la estructura HOOC (CH2) xCOOH donde x es un número entero entre 2 y 16, ácido fumárico o ácido maleico.
7. 7. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el poliéster o el poli (éster-anhidrido) comprende una o más unidades de monómero de ácido hidroxialcanoico que tienen de 2-6 átomos de carbono.
8. 8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque las unidades de monómero de ácido hidroxialcanoico se seleccionan del grupo que consiste de ácido láctico, ácido glicólico, ácido 4-hidroxibutanoico y ácido 5-hidroxipentanoico .
9. 9. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende oligómeros de éster de ácido ricinoleico que tienen por lo menos en promedio de 1.5 unidades de ácido ricinoleico enlazadas por un enlace de éster.
10. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende uno o más excipientes.
11. 11. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque los agentes terapéuticos, de diagnóstico y profilácticos se seleccionan del grupo que consiste de moléculas de fármaco pequeñas, péptidos, proteínas, oligo y polinucleótidos , herbicidas y pesticidas .
12. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque los agentes terapéuticos, de diagnóstico y profilácticos se. seleccionan del grupo que consisten de analgésicos, anestésicos locales, anti-infecciosos , agentes antiinflamatorios, antibióticos, hormonas de crecimiento, agentes anticáncer y combinaciones de los mismos.
13. 13. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la composición de polímero se aplica como un sellante quirúrgico.
14. 14. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la composición de polímero se aplica como barrera para la reducción de la adhesión de órgano a órgano.
15. 15. La composición de conformidad cón las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la composición de polímero se utiliza como recubrimiento.
16. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero tiene un peso molecular promedio en peso de 10,000 o más alto.
17. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero tiene un grado de polimerización de 40 o más alto.
18. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero se biodegrada en aproximadamente 12 semanas.
19. 19. Un método para hacer una formulación para suministro de un agente seleccionado del grupo que consiste de agentes bioactivos, agentes de diagnóstico y agentes profilácticos, caracterizado porque comprende incorporar el agente en la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
20. 20. Un método para el suministro de un agente seleccionado del grupo que consiste de agentes terapéuticos, de diagnóstico y profilácticos, caracterizado porque comprende administrar la formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18 a un individuo en necesidad de la misma.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la formulación se administra mediante inyección o implantación. 1
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el agente terapéutico es un agente anticáncer y la composición se administra para tratar tumores sólidos .
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el agente terapéutico es un antibiótico y la composición se administra para tratar una infección de los huesos.