KR100573743B1

KR100573743B1 - 국부적인 약물 방출이 가능한 항암주사제 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100573743B1
Application number: KR1020040036546A
Authority: KR
Inventors: 신병철; 김승수; 한희동; 남다은; 박윤정
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2004-05-21
Filing date: 2004-05-21
Publication date: 2006-04-25
Also published as: KR20050111301A

Abstract

본 발명은 국부적인 약물 방출이 가능한 항암주사제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 약물의 방출 온도범위가 체온에 의해 조절되는 온도민감성-음이온성 리포솜과 양이온성 키토산을 결합시켜 약물전달체를 제조함으로써, 이 약물전달체를 환부에 직접 주사하여 체온에 의해 주사부위에서만 굳어진 키토산 젤 내부에 리포솜이 고정된 상태로 리포솜으로부터 약물이 서서히 방출되어 정상조직에는 전혀 영향을 미치지 않고 치료하고자하는 환부부위에서만 약효가 발휘됨으로써 주사의 부작용으로부터 안전하게 국부적인 환부에만 약물을 방출시킬 수 있는 항암주사제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

온도민감성-음이온성 리포솜, 키토산 젤, 약물전달체

Description

국부적인 약물 방출이 가능한 항암주사제 및 이의 제조방법{Localizable tumor targeting by drug release from anionic temperature-sensitive liposome in chitosan gel}

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 온도민감성-음이온성 리포솜에서 온도의 변화에 따른 항암약물의 방출을 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 키토산 젤의 형성을 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 실시예 3에 따른 키토산 젤 내부의 온도민감성-음이온성 리포솜으로부터 온도에 대한 약물의 방출을 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 실시예 3에 따른 키토산 젤 내부의 온도민감성-음이온성 리포솜으로부터 시간에 대한 약물의 방출을 나타내는 그래프이다.

일반적으로 온도민감성 리포솜은 생체적합성이 우수하고 효율적인 약물의 이동을 수행 할 수 있는 약물전달체로서 많이 응용되고 있다. 특히 온도에 민감 할 수 있도록 리포솜의 지질성분을 변조할 수 있다는 장점이 있는데, 미합중국 특허 제 6,200,598호에 상기 온도민감성 리포솜이 개시되어 있다.

또한, 인체 내에 직접 주사시에 지질의 성분과 비율을 조절하여 외부의 온도에 의하여 리포솜의 약물방출전이온도를 변화시키는 것에 관한 연구결과가 개발되어[J.C. Kim, S.K. Bae, J.D. Kim, J. Biochem., 121, 15(1997)], 상기 종래 기술들에 의하여 온도민감성 리포솜의 제조와 리포솜의 안정성을 향상시킬 수는 있었지만, 이를 주사제로 활용할 경우 건강한 조직으로 순환되는 약물의 부작용이 심각한 문제가 되고 있다. 그러므로 이러한 부작용을 방지하기 위해서는 약물이 건강한 조직으로 순환되는 것을 방지하여야 하며, 환부부위에서만 약물이 방출되어야 하는 개선점이 요구되고 있다.

한편, 키토산은 키틴으로부터 탈아세틸화 공정을 거쳐 획득할 수 있는 천연 고분자소재로서 생체적합성이 우수하기 때문에 생체재료로서 범용적으로 이용되어지고 있는 고분자소재로서 키토산을 젤화하여 체내에 이용하는 기술들이 개발되어있다[G. Molinaro, J. Leroux, J. Damas, A. Adam, Biomaterials, 23, 2717(2002), A. Chenite, M. Buschmann, D. Wang, C. Chaput, N. Kandani, Carbohydrate Polymers, 46, 39(2001)]. 상기한 종래 기술 이외에도 젤 내부에 항암약물을 함유하는 나노입자 또는 약물만을 젤 내에 로딩시키는 방법들이 알려져 있다[E. Ruel-Gariepy, M. Shive, A. Bichara, M. Berrada, D. Garrec, A. Chenite, J. Leroux, European J. Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 57, 53(2004), A. Chenite, C. Chaput, D. Wang, C. Combes, M.D. Buschmann, C.D. Hoemann, J.C. Leroux, B.L. Atkinson, F. Binette, A. Selmani, Biomaterals, 21, 2155(2000), 미합중국 특허 제 6,432,449 B1호]. 하지만, 상기 방법 또한 약물의 방출을 효과적으로 제어하기 위한 작용에 대한 문제점을 해결할 수 없었다.

따라서, 인체 내에서 안정성을 향상시킬 수 있으며, 목적하는 부위에서만 우수한 약물의 효과를 극대화시키기 위하여, 리포솜을 치료부위에 고정시키며 목적하는 부위로만 약물의 방출을 유도하는 약물 치료법의 필요성이 부각되고 있으며 환부부위에서만 약물 방출을 유도할 수 있는 기술의 개발이 시급한 실정이다. 특히, 항암약물의 경우 정상 조직을 면역력을 떨어뜨리는 등의 부작용이 심각한 문제도 대두되고 있어 상기와 같이 원하는 환부에서만 약물 방출이 가능한 약물전달체의 개발이 더욱 시급하다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 37 ∼ 40 ℃에서 약물 방출이 가능한 음이온성 리포솜을 이용하였으며, 약물이 환부 이외의 건강한 정상 조직에 피해를 끼치지 않게 하기 위하여 환부에 직접 투여할 수 있는 방법으로서 상기 리포솜을 고정화시키기 위해 약 37 ℃에서 젤이 형성되는 키토산을 사용하였다. 이와 같이 키토산 수용액에 온도민감성-음이온성 리포솜을 담지하면 37 ℃(체온)에서 키토산 젤이 형성되는 것을 확인하였으며 키토산 젤 내부에서 리포솜으로부터 약물의 방출을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 환부부위에서만 국부적으로 잔류하며 항암약물을 방출할 수 있는 온도민감성-음이온성 리포솜을 이용한 항암주사제 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 37 ∼ 40 ℃ 범위에서 녹으며, 표면전하가 음이온인 지질막 내부에 항암약물이 내포되어 있는 리포솜과, 상기 리포솜의 외표면에 결합된 양이온성 키토산이 포함되어 국부적인 약물 방출이 가능한 항암주사제를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은

1) 37 ∼ 40 ℃ 범위에서 녹으며, 표면전하가 음이온인 지질막에 항암약물을 함입시켜 온도민감성-음이온성 리포솜을 제조하는 단계; 및

2) 상기 리포솜과 키토산 수용액을 혼합하고 pH가 7.0∼7.4가 되도록 하는 단계

를 포함한 국부적인 약물방출이 가능한 항암주사제의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.

이하, 본 발명은 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 약물의 방출 온도범위가 체온에 의해 조절되는 온도민감성-음이온성 리포솜과 양이온성 키토산을 결합시켜 약물전달체를 제조함으로써, 이 약물전달체를 환부에 직접 주사하여 체온에 의해 주사부위에서만 굳어진 키토산 젤 내부에 리포솜이 고정된 상태로 리포솜으로부터 약물이 서서히 방출되어 정상조직에는 전혀 영향을 미치지 않고 치료하고자하는 환부부위에서만 약효가 발휘됨으로써 주사의 부작용으로부터 안전하게 국부적인 환부에만 약물을 방출시킬 수 있는 항암주사제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 약물전달체는 37 ∼ 40 ℃ 범위에서 녹으며, 표면전하가 음이온인 지질막 내부에 유효약물이 내포되어 있는 리포솜 외표면을 양이온성 키토산이 결합되어 있어 이를 환부에 직접 주입시키면 체온으로 인하여 키토산 젤이 형성되어 약물이 내포된 리포솜이 환부에 고정화되어 원하는 환부부위에서만 약물이 방출된다.

이와 같은 본 발명의 약물전달체를 제조하는 방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

1) 단계는 37 ∼ 40 ℃에서 녹는 음이온성 리포솜을 제조하는 단계로서, 먼저 리포솜의 지질막을 형성시키기 위하여 본 발명에서는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DPPA), L-a-포 스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHOL), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-PEG-2000)의 지질성분을 일정량 혼합하여 사용한다. 특히, 상기 지질성분을 특정비로, 바람직하게는 DPPC : DPPA : HSPC : CHOL : DSPE-PEG-2000 이 70 ∼ 90: 30 ∼ 10 : 50 : 30 : 6의 몰비로 혼합한다. 이때, DPPC는 리포솜의 온도민감성에 기여하고, DPPA는 리포솜의 표면 전하가 음의 값을 지니는데 기여한다. 상기 지질성분을 유기용매, 바람직하게는 클로로포름과 에탄올 혼합액으로 용해시킨 후, 증발응축기를 이용하여 용매를 증류시켜 제거하고 얇은 지질막을 형성시킨다. 그리고 이와 별도로 약물을 트리스 완충용액에 혼합한 후, 이 용액을 지질막과 수화시켜 37 ∼ 40 ℃에서 약물 방출이 가능한 음이온성 리포솜을 제조한다. 이때, DPPC의 녹는점이 41 ℃이므로 그 이하의 유리전이온도에서부터 약물의 방출이 일어나게 되기 때문에 약물의 방출 온도 상한치를 40 ℃로 한정하였고, 그 이상의 온도가 되면 외부에서 고온을 사람에게 쬐어주어야 하는 문제점이 있습니다.

2) 단계는 상기 리포솜과 키토산 수용액을 혼합하여 원하는 환부에 주입하여 키토산 젤을 형성시켜 리포솜을 원하는 환부에 고정화시키는 단계로서, 상기 1)의 리포솜과 키토산 수용액을 일정비율로 혼합하고 pH가 7.0 내지 7.4가 되도록 하는데, 그 이유는 생리적인 중성을 맞추는 이유 때문이다. 상기 혼합액을 환부에 직접 주입하면 리포솜 표면의 음전하 값에 의하여 리포솜이 양이온 NH₂기를 갖는 키토산이 이온 결합되어 있는 상태에서 체온에 의해 키토산 젤이 형성된다. 이 때, 상기 키토산 수용액의 농도는 1 ∼ 3 w/v%가 바람직하며, 상기 리포솜과 키토산 수용액을 1 : 1 ∼ 5로 혼합하는 것이 바람직하다. 이 범위를 벗어날 경우에는 키토산이 녹지 않는다. 또한, 본 발명에서는 pH가 7.0 내지 7.4가 되도록 하기 위하여 글리세롤 2-포스페이트 디소디움 솔트 하이드레이트(GP) 수용액을 사용하였으나, 이 외에 일반적으로 사용하는 pH 조절제를 사용할 수 있다.

또한, 수용성 키토산 젤 내부에는 약물 함유 온도민감성-음이온성 리포솜이 포함되어 있으므로, 환부부위에서 키토산 젤이 약물을 함유한 리포솜의 순환과 이동을 억제하여 리포솜의 지지체 역할을 수행하며, 이때 외부 온열(약 40 ℃)에 의하여 약물을 함유하고 있는 리포솜에서 약물이 방출되어 치료하고자하는 환부에서만 약효가 발휘되는 역할을 수행한다.

특히, 상기 약물전달체를 항암제에 적용할 경우에는 종양조직에 국부적으로 약물의 방출을 유발시킬 수 있어 항암주사의 부작용으로부터 안전하게 국부적인 환부(종양)에만 항암제를 방출시킬 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

본 발명에서 외부온열을 이용하여 약물을 방출할 수 있는 온도민감성-음이온성 리포솜 제조 과정 중 항암약물을 함유한 리포솜의 제조는 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

온도민감성과 음이온성이 동시에 나타나게 하기 위하여 지질의 성분과 비율을 조절하였고, 지질은 DPPC, DPPA, HSPC, CHOL, DSPE-PEG-2000을 90:10:50:30:6의 몰비율로 사용하였으며 전체 10 mmol을 기준으로 하였다. 온도민감성, 음이온성을 나타내는 비율로 정량된 지질성분은 클로로포름 : 에탄올 (2:1 v/v)을 이용하여 용해시킨 후, 증발응축기를 이용하여 용매를 증류시켜 제거하고 얇은 지질 막을 형성시켰다. 그리고 이와 별도로 항암제(독소루비신, 1㎎/㎖)를 10 mmol 트리스 완충용액(pH 7.4)에 혼합한 후, 혼합 용액을 지질 막과 수화를 시켜 리포솜을 제조하였다. 수화과정이 끝난 후 리포솜 내에 함유되지 않은 항암약물은 젤 투과 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다.

실시예 2

본 발명에서 체온을 이용하여 젤을 형성하는 키토산 수용액의 제조는 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

키토산을 0.1M 염산용액에 용해시켜 2 w/v%의 키토산 수용액을 제조하였다다.

실시예 3

본 발명의 직접 주사제제를 제조하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 온도민감성-음이온성 리포솜과 상기 실시예 2에서 제조한 2 w/v%의 키토산 수용액을 1 : 3 (중량비)로 혼합하였다. 상기 혼합용액에 10 w/v% GP 용액을 가하여 pH가 7.2로 되도록 제조한 다음, 실험용 누드마우스에 투여함으로써 리포솜을 함유하는 키토산 젤의 형성을 관찰하였다.

실험예 1

본 발명의 온도민감성-음이온성 리포솜의 약물 방출 전이온도를 관찰하기 위하여 상기 실시예 1의 리포솜의 표면 전하와 약물 방출 전이온도를 다음과 같이 조사하였다.

약물의 방출은 상기 실시예 1에서 제조한 온도민감성-음이온성 리포솜 4 ㎖를 여러 가지 온도범위에서 형광분광광도계를 사용하여 측정하였다.

도 1에서 볼 수 있듯이, 음이온성 지질의 첨가 비율을 증가시킬수록 약물의 방출 전이온도는 상승하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 음이온성 지질인 DPPA와 열민감성 지질인 DPPC의 비율을 적절히 조절하여 리포솜의 약물 방출 전이온도를 조절할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2

본 발명의 37 ℃에서 젤이 형성되는 키토산 수용액을 제조하기 위하여 2 w/v % 키토산을 0.1M 염산 용액에 용해한 후 GP 수용액을 첨가하며 pH의 변화와 젤이 되는 온도를 관찰하였다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 2 w/v% 키토산 용액에 GP 용액의 농도가 증가할 수록 pH가 증가하였으며, pH가 7.2일 때 37 ℃에서 젤이 형성됨을 확인하였다.

실험예 3

온도민감성-음이온성 리포솜을 함유하는 키토산 젤 내부의 리포솜으로부터 약물의 방출을 관찰하기 위하여 여러 가지 온도와 시간의 변화에 대하여 약물의 방출을 관찰하였다. 리포솜으로부터 약물의 방출은 형광강도를 이용하여 측정하였다. 형광강도의 측정은 형광분광광도계를 이용하여 측정하였으며 방출파장 595 nm, 흡수파장 487 nm에서 측정하였다. 한편, 온도민감성 리포솜으로부터 약물의 방출은 다음의 수학식 1에 의하여 계산하였다. 이때, F_t는 리포솜의 초기 형광강도이고 F_i는 약물의 방출이 일어나지 않는 범위(19 ℃)에서의 형광강도 이며, F_f는 트리톤 X-100(10% v/v)을 첨가하였을 때의 형광강도이다.

도 3 및 도 4에서 볼 수 있듯이, 키토산 젤 내부의 리포솜으로부터 항암약물의 방출은 온도의 증가에 의하여도 급격히 증가하지 않고 서서히 지속적으로 증가하였으며, 37 ℃에서도 60분 이상 지속적으로 약물이 방출되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에서는 환부에 직접 주입하여 키토산의 작용으로 인해 국부적으로 약물을 일정하게 오랜 시간 방출할 수 있음을 확인하였다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 약물 주사시 심각한 부작용에 대한 약물치료법을 개선하기 위한 국부적인 약물 방출이 가능한 항암주사제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 항암주사제를 환부에 직접 투여함으로써 건강한 조직에 영향을 주지 않으며 약물을 함유한 리포솜이 키토산 젤 내부에 잔류하며 국부적으로 환부부위에만 응집되어 있어 외부온열을 이용하여 환부에서만 약물 방출을 유도하는 특징이 있다. 따라서, 약물의 부작용을 최소한으로 줄일 수 있는 효과가 있다.

Claims

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1) 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트, L-a-포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000]이 70 ～ 90 : 10 ～ 30 : 50 : 30 : 6의 몰비로 혼합하여 이루어져, 37 ～ 40 ℃ 범위에서 녹으며, 표면전하가 음이온인 지질막에 항암약물을 함입시켜 온도민감성-음이온성 리포솜을 제조하는 단계; 및

2) 상기 리포솜과 키토산 수용액을 1 : 1 ～ 5의 중량비로 혼합하고 pH가 7.0 ～ 7.4가 되도록 한 혼합용액을 종양에 주사 후 환부에 키토산 젤을 형성시켜 리포솜을 고정화하는 단계

를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 외부온열에 의해 국부적인 약물방출이 가능한 항암주사제의 제조방법.
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청구항 3의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 외부온열에 의해 국부적인 약물방출이 가능한 항암주사제.