EP3887825A2 - Verfahren, oberfläche, partikel und kit zum nachweis von glyphosat in proben - Google Patents

Verfahren, oberfläche, partikel und kit zum nachweis von glyphosat in proben

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Publication number
EP3887825A2
EP3887825A2 EP19806172.3A EP19806172A EP3887825A2 EP 3887825 A2 EP3887825 A2 EP 3887825A2 EP 19806172 A EP19806172 A EP 19806172A EP 3887825 A2 EP3887825 A2 EP 3887825A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
binding partner
analyte binding
particle
analyte
immobilized
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19806172.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard RÖDEL
Kai Ostermann
Julia Döring
Christian Dahmann
Tilo Pompe
David Rettke
Steve Martin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Dresden
Universitaet Leipzig
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
Universitaet Leipzig
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Dresden, Universitaet Leipzig filed Critical Technische Universitaet Dresden
Publication of EP3887825A2 publication Critical patent/EP3887825A2/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01019—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
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    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes
    • G01N2430/20—Herbicides, e.g. DDT

Definitions

  • the invention relates to a method, a surface, a particle and a kit for the detection of low molecular weight analytes, such as crop protection agents, in samples.
  • the invention relates to a method for the detection of glyphosate by protein-functionalized surfaces and functionalized particles by means of reflection interference contrast microscopy (RICM).
  • RCM reflection interference contrast microscopy
  • the detection of contaminants with pesticides in food is carried out according to the multi-method DFG S19, whereby various extraction steps are carried out for sample preparation and subsequently the laboratory analysis is carried out using LC-MS or GC-MS.
  • analyte is immobilized on hydrogel particles, which subsequently interact with a ligand immobilized on a surface. Depending on the degree of interaction, the hydrogel particles are deformed by attachment to the surface, so that the deformation is carried out by means of reflection interference contrast microscopy. This enables the analyte to be detected or characterized.
  • US 2014/0255916 A1 discloses a method and a kit for measuring the ability of a test sample to inhibit the binding of a pathogen receptor, preferably a sialic acid receptor, to a host cell ligand of the pathogen.
  • the method comprises an immobilized receptor which is contacted with a test sample and a particle reagent containing the ligand, preferably sialic acid, the particle reagent being a biological reagent selected from erythrocytes, erythrocyte vesicles, erythrocyte ghost cells, membrane fragments, membrane vesicles, proteins and combinations, in particular in the form of colloids, beads or combinations thereof; wherein the particle can be coated and / or magnetic, electrically conductive and / or semiconducting. The amount of the particle reagent bound to the surface is then measured.
  • CN 102207495 A discloses a method for determining the glyphosate content in soil samples by means of HPLC.
  • WO 00/14538 discloses a linker-assisted immunoassay for glyphosate and a method for the production of glyphosate antibodies comprising the production of glyphosate conjugates with a carrier molecule, preferably porcine thyroglobulin, bovine serum albumin, human serum albumin, ovalbumin or slit-screw hemocyanin; and immunizing a host with the conjugate.
  • a carrier molecule preferably porcine thyroglobulin, bovine serum albumin, human serum albumin, ovalbumin or slit-screw hemocyanin
  • the linker-assisted immunoassay for the detection of the analyte in a test sample comprises the production of a linker-analyte conjugate by means of a test sample, contacting with a glyphosate antibody and contacting the test sample with a solid phase with an immobilized second carrier molecule which is covalent to glyphosate, a glyphosate derivative or a glyphosate salt.
  • the second carrier molecule is selected from porcine thyroglobulin, bovine serum albumin, human serum albumin, ovalbumin or slit-screw hemocyanin, but differs from the first carrier molecule which is used to produce the glyphosate antibody.
  • the amount of bound antibody is then determined on the solid phase, which is indirectly proportional to the amount of glyphosate in the test sample.
  • Detection is preferably carried out by means of enzymatic detection, the antibody being conjugated to biotin and a labeled enzyme which binds biotin being added.
  • the enzyme is preferably alkaline phosphatase or horseradish peroxidase.
  • WO 20081 18899 A1 also discloses a method for the detection of glyphosate by means of LC / GC coupled MS. Alternatively, detection methods using bioluminescence (WO2010104861 A1) and ELISA (W02000014538A1) are also described.
  • WO 2018057647 A1 describes an assay for a biochip in which pesticides can be detected on a sensor platform. The detection is based on the amplification of corresponding nucleic acids, which leads to significantly long analysis times in the range of several hours.
  • US 2005/01 18665 A1 discloses a method for determining an enzymatic reaction, wherein at least one protein and at least one substance on a solid support at a distance sufficient for an enzymatic reaction by covalent binding or by using a fusion protein, preferably with a His tag and a nickel-coated surface; be immobilized and under conditions for an enzymatic reaction be incubated.
  • the substance is preferably a known substrate for an investigated enzymatic reaction and the protein is examined for an enzymatic activity.
  • the enzyme is preferably an oxidoreductase, a transferase, a hydrolase, a lyase, an isomerase or a ligase.
  • DE 10 201 1 089 241 B3 describes a method for coating a substrate with a hydrophobin balance and a substrate with a hydrophobin balance coating. Furthermore, DE 10 201 1 089 241 B3 discloses a substrate coated with a hydrophobin fusion protein.
  • the hydrophobin fusion protein preferably comprises a functional domain, wherein the functional domain can be a protein domain with enzyme activity.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for the detection of an analyte which overcomes the disadvantages in the prior art.
  • analyte is glyphosate
  • analyte binding partner has the active center of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) as the analyte binding site, and
  • EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
  • the particle being deformable.
  • Low molecular weight analytes are understood to mean substances or molecules with a molecular weight of ⁇ 800 g / mol.
  • the analyte binding partner is contacted with the analyte before contacting the particle for a period of 1 min to 30 min, preferably 1 min to 20 min, particularly preferably 1 min to 10 min, very particularly preferably 1 min to 7 min.
  • the analyte binding partner is simultaneously contacted with the analyte and the particle.
  • the particle is a functionalized particle, the surface of the particle having a functionalization.
  • the functionalization serves to connect the competitor.
  • the functionalization can be carried out by chemical groups.
  • the particle is a hydrogel particle.
  • the particle has a diameter of 10 pm to 100 pm, particularly preferably a diameter of around 25 pm.
  • the particle has a modulus of elasticity in the range from 10 kPa to 100 kPa, particularly preferably in the range from 15 kPa to 50 kPa. This advantageously ensures high sensitivity. At the same time, an uneven deformation of the particles is excluded.
  • the embodiments in diameter and modulus of elasticity (here Young's modulus of elasticity) of the particles determine, among other things, the sensitivity and reliability of the analysis method, the diameter being able to be determined by optical bright field microscopy and the modulus of elasticity from force-distance curves of atomic force spectroscopy.
  • the particle has a carboxy functionalization.
  • the synthesis and carboxy functionalization of the particles, in particular the hydrogel microparticles, was carried out according to the method described by Pussak et al. (Pussak, et al., 2012) described method via emulsion and radical precipitation polymerization of polyethylene glycol diacrylamide or polyethylene glycol diacrylate with subsequent radical grafting of acrylic acid monomers, crotonic acid monomers or other alkene derivatives with functional groups such as amines for introducing the carboxyl, amino or other functional groups.
  • the synthesis and carboxy functionalization of the particles takes place microfluidically by means of photo-initiated radical crosslinking of polyethylene glycol diacrylamide or polyethylene glycol diacrylate (preferred molecular weight in the range from 500 Da to 8,000 Da, particularly preferably around 4,000 Da) with subsequent photoinitiative radical grafting of acrylic acid monomers to introduce the carboxyl groups, monodisperse particles having a diameter in the range from 10 pm to 100 pm, particularly preferably around 25 pm.
  • the competitor is immobilized on the particle via a linker.
  • the linker is attached to the functionalized particle surface.
  • the respective linker molecule allows the competitor to be suitably immobilized via the carboxyl or the secondary amino group, the coupling group influencing the functionality and sensitivity of the process. Furthermore, the resulting affinity of the immobilized competitor can be varied over the length or degree of polymerization of the linker, and thus the working range of the method can be set.
  • the linker is selected from the groups of the homo- and heterobifunctional linkers and includes, for example, ethylenediamine, oligo- and polyethylene glycol bisamines, peptides such as pentaglycine and amino acids or a bifunctional linker with further groups such as thiols or azides.
  • the linker has a contour length (L) and a degree of polymerization (PG). In embodiments of the invention, the linker has a contour length (L) in the range from 5 ⁇ to 200 ⁇ , preferably in the range from 10 ⁇ to 50 ⁇ .
  • the linker has a degree of polymerization in the range from 1 to 70, preferably in the range from 3 to 20.
  • the linkers contain protective groups.
  • the protective group is selected from fluorenylmethoxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl or tert-butyl protective groups. This advantageously ensures that no undesired polymerization of the linker molecules or crosslinking of the particles occurs.
  • the competitor is designed to interact with the analyte binding partner, the competitor and the analyte competing for the interaction with the analyte binding partner.
  • the competitor is identical to the analyte.
  • the competitor is selected from phosphoenolpyruvate, phosametin (Huangcaoling), substrate analogs of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) or glyphosate.
  • Glyphosate (N- (phosphonomethyl) glycine) is a non-selective leaf herbicide (broad spectrum or total herbicide) with a systemic effect that is absorbed by any green part of the plant. Glyphosate is used in agriculture against single and double germ weeds in arable, wine and fruit growing, in the cultivation of ornamental plants, on meadows, pastures and lawns as well as in the forest. The leaves absorb glyphosate by diffusion and in the plant glyphosate is distributed over the phloem.
  • Glyphosate works by blocking the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), which is required for the synthesis of the aromatic amino acids phenylalanine, tryptophan and tyrosine via the shikimate route in plants, as well as in some microorganisms.
  • EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
  • substrate analogs is understood to mean compounds which bind to the analyte binding partner, in particular the active center of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS).
  • substrate analogs include substrates, particularly shikimate-3-phosphate (S3P) or phosphoenolpyruvate (PEP); functional substrate analogs, especially phosametine; and competitive inhibitors, especially glyphosate.
  • both competitor and analyte are glyphosate.
  • the analyte binding partner is designed as a fusion protein.
  • the fusion protein has, for example, different protein domains which have different functionalities.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain, which has an analyte binding site.
  • the analyte binding site serves to connect the analyte to the analyte binding partner.
  • the analyte binding site is designed as a binding pocket of an enzyme or an allosteric binding site for the analyte.
  • the analyte binding partner has the active center of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) as the analyte binding site.
  • EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
  • the distance from the binding pocket to the protein surface in the EPSPS is approximately 10 ⁇ in a closed conformation.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain selected from hydrophobins, ECM proteins, S-layer proteins, peptide linkers, and protein tags. This enables directional immobilization to the surface, at least one protein domain mediating the linkage and a further protein domain having further functionality.
  • the analyte binding partner preferably has a hydrophobin domain. Hydrophobins advantageously immobilize themselves on various material surfaces and geometries.
  • the analyte binding partner has a hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N.) crassa.
  • the analyte binding partner preferably has the SEQ. ID. No. 5 on.
  • the analyte binding partner is a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain.
  • the hydrophobin domain enables the analyte binding partner to be immobilized on the surface.
  • the fusion protein has SEQ ID No. 6 on.
  • the analyte binding partner is immobilized on the surface in a mixture with hydrophobins, the mixture of the analyte binding partner with the hydrophobin in the range from 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1 : 5 lies.
  • the mixing ratios given relate to the molar mass. With mixing ratios in the range from 1: 3 to 1: 8, particularly homogeneous and less rough surfaces are advantageously obtained, as a result of which the particle attachment to the surfaces is improved.
  • a mixture of the fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain (SEQ ID No. 6) and the hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N. ) crassa (SEQ ID No. 5) in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5, very particularly preferably 1: 5.
  • the ratio to glyphosate can additionally be set in a very targeted manner and thus enables detection of glyphosate over a wide concentration range.
  • the surface is essentially planar.
  • the surface can be a molded glass body or a molded plastic body, e.g. B. a slide, coverslip, silicon wafer or the like.
  • the surface is preferably a shaped glass body.
  • the surface is transparent, semi-transparent or opaque.
  • the surface is preferably transparent, at least in the wavelength range from 400 nm to 600 nm.
  • the detection is carried out by means of quartz crystal microbalance (QCM), surface plasmon spectroscopy (SPR), atomic force spectroscopy or impedance spectroscopy.
  • the detection is carried out using reflection interference contrast microscopy (RICM).
  • R M reflection interference contrast microscopy
  • the contact radii a of particles and surface and the particle radii R HGS are determined automatically using specially developed software. According to the Johnson-Kendall-Roberts model [2], these quantities are related to the adhesion energy W adh as follows:
  • the determined adhesion energy corresponds to the binding density of the particle-bound competitors to the analyte binding partner and allows the amount of analyte in the sample to be determined.
  • the invention also relates to a surface having the analyte binding partner according to the invention, the analyte binding partner comprising a fusion protein having a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain, the surface being transparent at least in the wavelength range from 400 nm to 600 nm is trained.
  • the analyte binding partner is designed as a fusion protein.
  • the fusion protein has, for example, different protein domains which have different functionalities.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain, having an analyte binding site.
  • the analyte binding site serves to connect the analyte to the analyte binding partner.
  • the analyte binding site is designed as a binding pocket of an enzyme or an allosteric binding site for the analyte.
  • the analyte binding partner preferably has the active center of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) as the analyte binding site.
  • EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
  • the distance of the Binding pocket to protein surface in the EPSPs is approximately 10 ⁇ in a closed conformation.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain selected from hydrophobins, ECM proteins, S-layer proteins, peptide linkers, and protein tags. This enables directional immobilization to the surface, at least one protein domain mediating the linkage and a further protein domain having further functionality.
  • the analyte binding partner preferably has a hydrophobin domain.
  • the analyte binding partner has a hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N.) crassa.
  • the analyte binding partner preferably has the SEQ. ID. No. 5 on.
  • the analyte binding partner is a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain.
  • the hydrophobin domain enables the analyte binding partner to be immobilized on the surface.
  • the fusion protein has SEQ ID No. 6 on.
  • a fusion protein having a hydrophobin domain advantageously results in a directed and controlled assembly of the hydrophobin or fusion protein on the surface and the EPSPS domain has no direct contact with the surface material, as a result of which the enzymatic activity is largely retained.
  • the analyte binding partner is immobilized on the surface in a mixture with hydrophobins, the mixture of the analyte binding partner with the hydrophobin in the range from 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5 lies.
  • the use of the mixing ratios of the analyte binding partner with hydrophobin advantageously minimizes steric hindrance of the analyte binding partner, in particular the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain, by immobilization on the surface and modulates the responsiveness and sensitivity of the surface or the assay.
  • a mixture of the fusion protein comprising a hydrophobin is used to immobilize the analyte binding partner.
  • Domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain (SEQ ID No. 6) and the hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) in a ratio of 1: 2 to 1:10 , preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5, very particularly preferably 1: 5.
  • the invention also relates to a functionalized particle comprising an immobilized competitor, the competitor being immobilized on the particle via a linker, the particle being designed to be deformable, the competitor being selected from phosphoenolpyruvate, phosametin, substrate analogs of the enzyme 5-enolpyruvylshikimat-3 phosphate synthase or glyphosate, the linker having a contour length in the range from 5 ⁇ to 200 ⁇ , preferably in the range from 10 ⁇ to 50 ⁇ and / or a degree of polymerization in the range from 1 to 70, preferably in the range from 3 to 20 having.
  • the particle has a carboxy functionalization.
  • the synthesis and carboxy functionalization of the particles, in particular the hydrogel microparticles, was carried out according to the method described by Pussak et al. (Pussak, et al., 2012) described method via emulsion and radical precipitation polymerization of polyethylene glycol diacrylamide or polyethylene glycol diacrylate with subsequent radical grafting of acrylic acid monomers, crotonic acid monomers or other alkene derivatives with functional groups such as amines for introducing the carboxyl, amino or other functional groups.
  • the synthesis and carboxy functionalization of the particles takes place microfluidically by means of photo-initiated radical crosslinking of polyethylene glycol diacrylamide or polyethylene glycol diacrylate (preferred molecular weight in the range from 500 Da to 8,000 Da, particularly preferably around 4,000 Da) with subsequent photo-initiated radical grafting of acrylic acid monomers Introduction of the carboxyl groups, monodisperse particles having a diameter of 10 pm to 100 pm, particularly preferably 25 pm, being produced.
  • the particle is a deformable particle.
  • the particle preferably has a modulus of elasticity in the range from 10 kPa to 100 kPa, particularly preferably in the range from 15 kPa to 50 kPa. This advantageously ensures high sensitivity. At the same time, an uneven deformation of the particles is excluded.
  • the particle is a hydrogel particle.
  • the particle has a diameter of 10 pm to 100 pm, particularly preferably a diameter of about 25 pm.
  • the competitor is selected from phosphoenolpyruvate, phosametin (Huangcaoling), substrate analogs of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) or glyphosate.
  • EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
  • the competitor is preferably glyphosate.
  • the competitor is immobilized on the particles via a linker.
  • the linker is attached to the functionalized particle surface.
  • the respective linker molecule allows suitable immobilization of the competitor, for example glyphosate, via the carboxyl or the secondary amino group, the coupling group influencing the functionality and sensitivity of the method. Furthermore, the resulting affinity of the immobilized competitor can be varied over the length or degree of polymerization of the linker, and thus the working range of the method can be set.
  • the linker is selected from the groups of the homo- and heterobifunctional linkers and includes, for example, ethylenediamine, oligo- and polyethylene glycol bisamines, peptides such as pentaglycine and amino acids or a bifunctional linker with further groups such as thiols or azides.
  • the linker has a contour length (L) and a degree of polymerization (PG).
  • the linker has a contour length (L) in the range from 5 ⁇ to 200 ⁇ , preferably in the range from 10 ⁇ to 50 ⁇ .
  • the linker has a degree of polymerization in the range from 1 to 70, preferably in the range from 3 to 20.
  • the linkers contain protective groups.
  • the protective group is selected from fluorenylmethoxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl or tert-butyl protective groups. This advantageously ensures that no undesired polymerization of the linker molecules or crosslinking of the particles occurs.
  • the invention also relates to a kit comprising:
  • analyte binding partner is designed to interact with an analyte and is immobilized on a surface
  • analyte binding partner is a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain, and wherein the surface is transparent at least in the wavelength range from 400 nm to 600 nm;
  • the competitor is immobilized on the particle via a linker, the particle being designed to be deformable.
  • the analyte binding partner contained in the kit and the hydrophobin are advantageously mixed for immobilization in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferably 1: 3 to 1: 8, particularly preferably in a ratio of 1: 5, and immobilized on a surface.
  • the hydrophobin stabilizes the surface while the analyte binding partner is designed to interact with the analyte.
  • the competitor is selected from phosphoenolpyruvate, phosametin (Huangcaoling), substrate analogs of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) or glyphosate.
  • EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
  • the competitor is preferably glyphosate.
  • the particle is a functionalized particle, the surface of the particle having a functionalization.
  • the functionalization serves to connect the competitor.
  • the particle has a carboxy functionalization.
  • the synthesis and carboxy functionalization of the particles, in particular the hydrogel microparticle was carried out according to the method described by Pussak et al. (Pussak, et al., 2012) described method via emulsion and radical precipitation polymerization of polyethylene glycol diacrylamide or polyethylene glycol diacrylate with subsequent radical grafting of acrylic acid monomers, crotonic acid monomers or other alkene derivatives with functional groups such as amines for introducing the carboxyl, amino or other functional groups.
  • the synthesis and carboxy functionalization of the particles takes place microfluidically by means of photo-initiated radical crosslinking of polyethylene glycol diacrylamide or polyethylene glycol diacrylate (preferred molecular weight in the range from 500 Da to 8,000 Da, particularly preferably around 4,000 Da) with subsequent photo-initiated radical grafting of acrylic acid monomers Introduction of the carboxyl groups, monodisperse particles having a diameter of 10 to 100 pm, particularly preferably 25 pm, being produced.
  • the competitor is immobilized on the particles via a linker.
  • the linker is attached to the functionalized particle surface.
  • the respective linker molecule allows suitable immobilization of the competitor, for example glyphosate, via the carboxyl or the secondary amino group, the coupling group influencing the functionality and sensitivity of the method. Furthermore, the resulting affinity of the immobilized competitor can be varied over the length or degree of polymerization of the linker, and thus the working range of the method can be set.
  • the linker is selected from the groups of the homo- and heterobifunctional linkers and includes, for example, ethylenediamine, oligo- and polyethylene glycol bisamines, peptides such as pentaglycine and amino acids or a bifunctional linker with further groups such as thiols or azides.
  • the linkers contain protective groups.
  • the protective group is selected from fluorenylmethoxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl or tert-butyl protective groups. This advantageously ensures that no undesired polymerization of the linker molecules or crosslinking of the particles occurs.
  • the linker has a contour length (L) and a degree of polymerization (PG). In embodiments of the kit according to the invention the linker has a contour length (L) in the range from 5 ⁇ to 200 ⁇ , preferably in the range from 10 ⁇ to 50 ⁇ .
  • the linker has a degree of polymerization in the range from 1 to 70, preferably in the range from 3 to 20.
  • the particle is a hydrogel particle.
  • the particle size is a diameter in the range from 10 pm to 100 pm, particularly preferably around 25 pm.
  • the particle has a modulus of elasticity in the range from 5 kPa to 100 kPa, particularly preferably in the range from 15 kPa to 50 kPa. This advantageously ensures high sensitivity. At the same time, an uneven deformation of the particles is excluded.
  • the surface is essentially planar.
  • the surface can be a shaped glass body, e.g. B. a slide, coverslip, silicon wafer or the like.
  • the surface is transparent, semi-transparent or opaque.
  • the analyte binding partner is designed as a fusion protein.
  • the fusion protein has, for example, different protein domains which have different functionalities.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain, having an analyte binding site.
  • the analyte binding site serves to connect the analyte to the analyte binding partner.
  • the analyte binding site is designed as a binding pocket of an enzyme or an allosteric binding site for the analyte.
  • the analyte binding partner preferably has the active center of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) as the analyte binding site.
  • EPSPS 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
  • the distance from the binding pocket to the protein surface in the EPSPs is approximately 10 ⁇ in a closed conformation.
  • the analyte binding partner comprises a protein domain selected from hydrophobins, ECM proteins, S-layer proteins, peptide linkers, and protein tags. This enables directional immobilization to the surface, at least one protein domain mediating the linkage and a further protein domain having further functionality.
  • the analyte binding partner preferably has a hydrophobin domain.
  • the analyte binding partner has a hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N.) crassa.
  • the analyte binding partner preferably has the SEQ. ID. No. 5 on.
  • the analyte binding partner is a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain.
  • the hydrophobin domain enables the analyte binding partner to be immobilized on the surface.
  • the fusion protein has SEQ ID No. 6 on.
  • the analyte binding partner is immobilized on the surface in a mixture with hydrophobins, the mixture of the analyte binding partner with the hydrophobin in the range from 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5 lies.
  • a mixture of the fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain (SEQ ID No. 6) and the hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N. .) crassa (SEQ ID No. 5) in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5, very particularly preferably 1: 5.
  • the invention also relates to the use of the method according to the invention, the surface according to the invention, the particle according to the invention and the kit according to the invention for detecting analytes in samples, such as water, food, soil, drinking and waste water samples, preferably in aqueous solutions.
  • Fig. 2 The dependence of the adhesion energy between particles and surface on the
  • the principle of the detection method is shown in Fig. 1.
  • the immobilized enzymes on the surface interact attractively with the particle-bound competitor, which results in a characteristic contact surface between the surface and the particle.
  • the dissolved analyte competes with the competitor for the binding sites on the surface.
  • the contact area is reduced. Above a certain concentration, the particles do not adhere to the surface.
  • the determination of the contact and particle radius for the determination of the adhesion energy takes place by means of reflection interference contrast microscopy.
  • Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6) coated.
  • the surfaces were then incubated with either 10 mM glyphosate or glufosinate solutions and then with linker-functionalized particles with or without a glyphosate coating.
  • the adhesion energies resulting from the respective conditions were presented using a representative data set.
  • RCA-cleaned glass surfaces were first coated with a suitable mixture of the hydrophobin Ccg2 and its fusion protein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6). The surfaces were then incubated with glyphosate solutions of different concentrations and then with glyphosate-coated particles with ethylenediamine or pentaglycine linkers. The resulting from the respective conditions
  • Adhesion energies were presented using a representative data set.
  • Embodiment 1 Quantification of glyphosate by means of competitive binding
  • Protein expression was increased by adding 1 mM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG). co // ' cells, which were in the exponential growth phase, started. After induction, the cells were incubated for an additional 4 hours at 30 ° C and 180 revolutions per minute. The cells were then pelleted and washed so that they could then be used for protein purification. The cleaning method used depends on the solubility of the proteins.
  • the soluble fusion proteins (SEQ ID No. 6) were purified by nickel affinity chromatography under native conditions according to the manufacturer's instructions, while the insoluble hydrophobins were purified by denaturing nickel affinity chromatography according to the manufacturer's instructions.
  • the hydrophobins were concentrated by ultrafiltration before dialysis; this was not necessary for the fusion proteins. After the purification, the hydrophobins were reduced against a redox refolding buffer (10 mM glutathione, 1 mM glutathione oxidized; pH 5.4) and the fusion proteins against the Monsanto dialysis buffer (10 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 5% (v / v) 99.9% glycerol, 1 mM DTT, pH 7) dialyzed, then stored in the refrigerator and used for the functionalization of glass surfaces.
  • a redox refolding buffer (10 mM glutathione, 1 mM glutathione oxidized; pH 5.4
  • Monsanto dialysis buffer 10 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 5% (v / v) 99.9% glycerol, 1 mM DTT, pH 7
  • the glass surfaces were functionalized by slowly pipetting on the protein solution and then incubating at room temperature for 30 minutes. The surfaces were then washed thoroughly with distilled water and dried at RT for 30 minutes. Before the functionalization, the glass surfaces were cleaned with an RCA solution (50 ml 25% aqueous NH3 solution, 50 ml 35% H2O2, 250 ml deionized water).
  • an RCA solution 50 ml 25% aqueous NH3 solution, 50 ml 35% H2O2, 250 ml deionized water.
  • the two protein variants were needed to find an optimal relationship between fusion protein (can bind glyphosate) and hydrophobin (to stabilize the surface).
  • the proteins were mixed in different ratios and the functionality of the EcEPSPS on the surface is determined by detecting inorganic phosphate.
  • Inorganic phosphate is one of the reaction products in the reaction of EPSPS with its substrates phosphoenolpyruvate (PEP) and shikimate-3-phosphate (S3P) and can therefore be used for the detection of enzyme activity.
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • S3P shikimate-3-phosphate
  • the ratio of Ccg2 SEQ ID No. 5
  • Ccg2_GS_EcEPSPS influences the sensitivity and signal strength of the assay.
  • a surface with a high concentration of fusion protein is less sensitive than one with a low concentration of fusion protein.
  • too low a concentration of the fusion protein leads to a low signal-to-noise ratio.
  • different occupancy ratios were tested, and a ratio of 1 mM Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID NO. 6) to 5mM Ccg2 (SEQ ID No. 5) turned out to be well suited for the application.
  • the microparticles were coated with glyphosate to allow for an interaction between the surface and the hydrogel particles or also hydrogel probes (HGS) that could be modulated by the presence of the analyte.
  • HGS hydrogel probes
  • various linkers were coupled to the particles based on the carboxyl-functionalized HGS.
  • the respective linker molecule allows the appropriate immobilization of the glyphosate via the carboxyl or the secondary amino group, the coupling group influencing the functionality and sensitivity of the sensor.
  • the resulting affinity of the immobilized competitor for the enzyme (EPSPS) can be varied via the length or degree of polymerization of the linker, and thus the working range of the sensor can be set.
  • ethylenediamine served as a short linker variant, which was coupled to the microparticles by means of benzotriazole-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt).
  • PyBOP benzotriazole-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • the particles were suspended and water was replaced by dimethylformamide (DMF) in several washing steps.
  • DMF dimethylformamide
  • the particles were functionalized with a pentaglycine linker.
  • 10 ml (143 pmol) of mercaptoethanol were added to inactivate the excess EDC and the suspension was left at room temperature for a further 15 min.
  • CS16-CultureWell TM a 16-well carrier
  • the radial intensity profiles of the HGS were recorded on the functionalized surface using the reflection interference contrast method using an inverted microscope system (Olympus IX 73) with a 60 x immersion objective (Olympus UPlanSAPO 60x Oil Microscope Objective). From the recorded profiles, contact radii a of the particle and surface as well as the particle radii R HGS could then be determined automatically using specially developed software. According to the Johnson-Kendall-Roberts model [2], these quantities are related to the adhesion energy W adh as follows:
  • the results of the measurements are shown by way of example in FIG. 2.
  • the pentaglycine-functionalized particles (negative control) show only weak non-specific interactions with the surface, whereas glyphosate-coated HGS strongly adhere.
  • the value is in the range of the negative control. This is due to the competition for EcEPSPS binding sites on the surface between free glyphosate in the analyte solution and glyphosate bound to the HGS.
  • the negligible influence of structurally similar compounds such as glufosinate on the adhesion energy illustrates the selectivity of the method towards glyphosate.
  • FIG. 3 shows an example of the resulting adhesion energies of glyphosate-coated particles of the linker variants ethylenediamine and pentaglycine at different concentrations of soluble glyphosate.
  • this is 10 mM for ethylenediamine-glyphosate-coated HGS, for pentaglycin-glyphosate-coated HGS the detection limit is below 1 mM, the sensor system offering further options for setting the working range.
  • the results prove that specific detection and precise quantification of glyphosate are possible with the aid of the invention.
  • Embodiment 2 Determination of the sensitivity and specificity of the quantification of glyphosate
  • the concentration dependence of the glyphosate binding is shown in FIG. 4.
  • RCA-cleaned glass surfaces were first coated with a suitable mixture of the hydrophobin Ccg2 and its fusion protein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6). The surfaces were then incubated with glyphosate solutions of different concentrations and then with glyphosate-coated particles with pentaglycine linker.
  • the concentration range examined covers a range from 10 11 M to 10 8 M. This sensitivity range reaches the threshold value of 0.1 pg / ml for pesticide contamination in German tap water.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Oberfläche, einen Partikel sowie ein Kit zum Nachweis von niedermolekularen Analyten, wie etwa Pflanzenschutzmitteln in Proben. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Glyphosat durch protein-funktionalisierte Oberflächen und funktionalisierten Partikeln mittels Reflexionsinterferenzkontrast-Mikroskopie (RICM).

Description

Verfahren, Oberfläche, Partikel und Kit zum Nachweis von Analyten in Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Oberfläche, einen Partikel sowie einen Kit zum Nachweis von niedermolekularen Analyten, wie etwa Pflanzenschutzmitteln, in Proben. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Glyphosat durch protein-funktionalisierte Oberflächen und funktionalisierte Partikel mittels Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie (RICM).
Der Nachweis von niedermolekularen Analyten ist aktuell sehr aufwändig. Insbesondere der Nachweis von Pflanzenschutzmitteln in Trinkwasser, Nahrungsmitteln und Bodenproben und deren gesundheitliche Auswirkungen sind aktuell von hohem Interesse. Problematisch erscheint dabei vor allem die Verunreinigung von Nahrungsmitteln inklusive Trinkwasser mit Glyphosat.
Die Detektion von Verunreinigungen mit Pflanzenschutzmitteln in Lebensmitteln erfolgt nach der Multimethode DFG S19, wobei zur Probenvorbereitung verschiedene Extraktionsschritte erfolgen und nachfolgend die labortechnische Analyse mittels LC-MS oder GC-MS erfolgt.
Weiterhin ist aus der EP2 752 664 A1 ein Verfahren zur Detektion von Analyten bekannt. Dabei erfolgt die Immobilisierung eines Analyten an Hydrogelpartikel, welche nachfolgend mit einem auf einer Oberfläche immobilisierten Liganden interagieren. Abhängig vom Grad der Interaktion erfolgt eine Deformierung der Hydrogelpartikel durch Anlagerung an die Oberfläche, sodass die Deformierung mittels Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie erfolgt. Dadurch kann eine Detektion bzw. Charakterisierung des Analyten erfolgen.
US 2014/0255916 A1 offenbart ein Verfahren und einen Kit zur Messung der Fähigkeit einer Test probe, die Bindung eines Pathogen-Rezeptors, bevorzugt ein Sialinsäurerezeptor, zu einem Wirtszellliganden des Pathogens zu inhibieren. Das Verfahren umfasst einen immobilisierten Rezeptor, welcher mit einer Testprobe und einem Partikelreagenz enthaltend den Liganden, bevorzugt Sialinsäure, kontaktiert wird, wobei das Partikelreagenz ein biologisches Reagenz, ausgewählt aus Erythrozyten, Erythrozytenvesikeln, Erythrozytengeisterzellen, Membranfragmenten, Membranvesikeln, Proteinen und Kombinationen, insbesondere in Form von Kolloiden, Beads oder Kombinationen daraus sein kann; wobei der Partikel beschichtet und/oder magnetisch, elektrisch leitfähig und/oder halbleitend sein kann. Anschließend erfolgt die Messung der Menge des an der Oberfläche gebundenen Partikelreagenzes.
Im Stand der Technik sind zudem verschiedene Verfahren zur Bestimmung von Glyphosat bekannt. So offenbart die CN 102207495 A ein Verfahren zur Bestimmung des Glyphosat-Gehalts in Bodenproben mittels HPLC.
WO 00/14538 offenbart einen Linker-unterstützten Immunoassay für Glyphosat sowie ein Verfahren zur Herstellung von Glyphosat-Antikörpern umfassend die Herstellung von Glyphosat- Konjugaten mit einem Trägermolekül, bevorzugt Schweine-Thyreoglobulin, Rinderserumalbumin, humanes Serumalbumin, Ovalbumin oder Schlitzschnecken-Hämocyanin; und Immunisierung eines Wirts mit dem Konjugat. Der Linker-unterstützte Immunoassay zur Detektion des Analyten in einer Testprobe umfasst die Herstellung eines Linker-Analyt-Konjugats mittels einer Testprobe, das Kontaktieren mit einem Glyphosat-Antikörper und Kontaktieren der Testprobe mit einer Festphase mit einem immobilisierten zweiten Trägermolekül, welches kovalent an Glyphosat, einem Glyphosatderivat oder einem Glyphosatsalz gekoppelt ist. Das zweite Trägermolekül ist aus Schweine-Thyreoglobulin, Rinderserumalbumin, humanen Serumalbumin, Ovalbumin oder Schlitzschnecken-Hämocyanin ausgewählt, aber unterscheidet sich vom ersten Trägermolekül, welches zur Herstellung des Glyphosat-Antikörpers verwendet wird. Anschließend wird auf der Festphase die Menge an gebundenem Antikörper bestimmt, welche indirekt proportional zur Menge an Glyphosat in der Testprobe ist. Bevorzugt erfolgt die Detektion mittels enzymatischem Nachweis, wobei der Antikörper mit Biotin konjugiert ist und ein gelabeltes Enzym dazugegeben wird, welches Biotin bindet. Das Enzym ist bevorzugt alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase.
Auch die WO 20081 18899 A1 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Glyphosat mittels LC/GC gekoppeltem MS. Alternativ werden auch Nachweismethoden mittels Biolumineszenz (WO2010104861 A1 ) und ELISA (W02000014538A1 ) beschrieben.
Die WO 2018057647 A1 beschreibt einen Assay für einen Biochip, bei dem Pestizide auf einer Sensorplattform detektiert werden können. Der Nachweis basiert dabei auf der Amplifikation von korrespondierenden Nukleinsäuren, was zu deutlich langen Analysezeiten im Bereich mehrerer Stunden führt.
US 2005/01 18665 A1 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung einer enzymatischen Reaktion, wobei mindestens ein Protein und mindestens eine Substanz auf einem festen Träger in einem Abstand ausreichend für eine enzymatische Reaktion durch kovalente Bindung oder durch Einsatz eines Fusionsproteins, bevorzugt mit einem His-Tag und einer Nickel-beschichteten Oberfläche; immobilisiert werden und unter Bedingungen für eine enzymatische Reaktion inkubiert werden. Bevorzugt ist die Substanz ein bekanntes Substrat für eine untersuchte enzymatische Reaktion und das Protein wird auf eine enzymatische Aktivität untersucht. Bevorzugt ist das Enzym eine Oxidoreduktase, eine Transferase, eine Hydrolase, eine Lyase, eine Isomerase oder eine Ligase.
DE 10 201 1 089 241 B3 beschreibt ein Verfahren zur Beschichtung eines Substrats mit einer Hydrophobinbilage und ein Substrat mit einer Hydrophobinbilagenbeschichtung. Weiterhin offenbart DE 10 201 1 089 241 B3 ein mit einem Hydrophobinfusionsprotein beschichtetes Substrat. Bevorzugt umfasst das Hydrophobinfusionsprotein eine funktionelle Domäne, wobei die funktionelle Domäne eine Proteindomäne mit Enzymaktivität sein kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten anzugeben, welches die Nachteile im Stand der Technik überwindet.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Nachweis von Analyten vorgeschlagen, umfassend die Schritte:
Bereitstellen einer Oberfläche mit einem immobilisierten Analytbindungspartner,
Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einer Probe enthaltend den Analyten, wobei der Analyt mit dem Analytbindungspartner interagiertT
Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einem Kompetitor, wobei der Kompetitor an einen Partikel immobilisiert ist und mit dem Analytbindungspartner interagiert,
Detektion der an den Analytbindungspartner gebundenen Kompetitoren,
wobei der Analyt Glyphosat ist,
wobei der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum des Enzyms 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) aufweist, und
wobei der Partikel deformierbar ausgebildet ist.
Unter niedermolekularen Analyten werden Stoffe oder Moleküle mit einer Molmasse von <800 g/mol verstanden.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Kontaktierung des Analytbindungspartners mit dem Analyten vor der Kontaktierung mit dem Partikel für einen Zeitraum von 1 min bis 30 min, vorzugsweise 1 min bis 20 min, besonders bevorzugt 1 min bis 10 min, ganz besonders bevorzugt 1 min bis 7 min. In einer alternativen Ausführungsform erfolgt eine gleichzeitige Kontaktierung des Analytbindungspartners mit dem Analyten und dem Partikel.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Partikel ein funktionalisierter Partikel, wobei die Oberfläche des Partikels eine Funktionalisierung aufweist. Die Funktionalisierung dient dabei der Anbindung des Kompetitors. Beispielsweise kann die Funktionalisierung durch chemische Gruppen erfolgen.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Partikel ein Hydrogelpartikel.
In Ausführungsformen der Erfindung hat der Partikel einen Durchmesser von 10 pm bis 100 pm, besonders bevorzugt ein Durchmesser von um 25 pm.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Partikel ein Elastizitätsmodul im Bereich von 10 kPa bis 100 kPa, besonders bevorzugt im Bereich von 15 kPa bis 50 kPa auf. So wird vorteilhaft eine hohe Sensitivität sichergestellt. Gleichzeitig wird so eine ungleichmäßige Deformation der Partikel ausgeschlossen.
Die Ausführungsformen in Durchmesser und Elastizitätsmodul (hier Youngscher Elastizitätsmodul) der Partikel bestimmen unter anderem die Sensitivität und Zuverlässigkeit des Analyseverfahrens, wobei der Durchmesser durch optische Hellfeldmikroskopie und das Elastizitätsmodul aus Kraft-Abstands-Kurven der Rasterkraftspektroskopie bestimmt werden können.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Partikel eine Carboxy-Funktionalisierung auf. Die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel, insbesondere der Hydrogel-Mikropartikel, erfolgte gemäß der von Pussak et al. (Pussak, et al., 2012) beschriebenen Methode via Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat mit anschließender radikalischer Pfropfung von Acrylsäuremonomeren, Crotonsäuremonomeren oder weiteren Alkenderivaten mit funktionellen Gruppen wie etwa Aminen zur Einführung der Carboxyl-, Amino- oder anderen funktionellen Gruppen.
In Ausführungsformen erfolgt die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel mikrofluidisch mittels photoinitiierter radikalischer Vernetzung von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat (bevorzugtes Molekulargewicht im Bereich von 500 Da bis 8.000 Da, besonders bevorzugt um 4.000 Da) mit anschließender photoinitiierter radikalischer Pfropfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen, wobei monodisperse Partikel mit einem Durchmesser im Bereich von 10 pm bis 100 pm, besonders bevorzugt um 25 pm, erzeugt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert. Dabei wird der Linker an die funktionalisierte Partikeloberfläche angebunden.
Das jeweilige Linkermolekül erlaubt dabei die geeignete Immobilisierung des Kompetitors über die Carboxyl- oder die sekundäre Aminogruppe, wobei die Kopplungsgruppe die Funktionalität und Sensitivität des Verfahrens beeinflusst. Des Weiteren kann über die Länge bzw. den Polymerisationsgrad des Linkers die resultierende Affinität des immobilisierten Kompetitors variiert und somit der Arbeitsbereich des Verfahrens eingestellt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Linker ausgewählt aus den Gruppen der homo- und heterobifunktionalen Linker und umfasst exemplarisch Ethylendiamin, Oligo- und Polyethylenglykolbisamine, Peptide wie Pentaglycin und Aminosäuren oder einen bifunktionalen Linker mit weiteren Gruppen wie etwa Thiolen oder Aziden.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker eine Konturlänge (L) und einen Polymerisationsgrad (PG) auf. In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker eine Konturlänge (L) im Bereich von 5 Ä bis 200 Ä, bevorzugt im Bereich von 10 Ä bis 50 Ä auf.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker einen Polymerisationsgrad im Bereich von 1 bis 70, bevorzugt im Bereich von 3 bis 20 auf.
Beispielhaft geeignete Linker sind Ethylendiamin: L=5,3 Ä; PG = 1 oder Pentaglycin: L=16,3 Ä; PG = 5 oder PEG-Bisamin 3000: L=191 Ä; PG = 68.
In Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Linker Schutzgruppen. In Ausführungsformen der Erfindung ist die Schutzgruppe ausgewählt aus Fluorenylmethoxycarbonyl-, tert- Butyloxycarbonyl- oder tert-Butyl-Schutzgruppen. Auf diese Weise wird vorteilhaft sichergestellt, dass keine unerwünschte Polymerisierung der Linker-Moleküle oder Quervernetzung der Partikel eintritt. Erfindungsgemäß ist der Kompetitor ausgebildet zur Interaktion mit dem Analytbindungspartner, wobei der Kompetitor und der Analyt um die Interaktion mit dem Analytbindungspartner konkurrieren.
Dadurch wird eine Kompetition zwischen dem freien Analyten in einer Probe und dem partikelgebundenen Kompetitor erzeugt, wobei sich ein Gleichgewicht in Abhängigkeit der Analytkonzentration einstellt. Je mehr freier Analyt vorhanden ist, desto geringer ist die Bindung der partikelgebundenen Kompetitoren an den Analytbindungspartner. Im Ergebnis verringert sich die Kontaktfläche zwischen Partikel und Oberfläche. Im umgekehrten Fall, wenn wenig Analyt in der zu untersuchenden Probe vorhanden ist, erfolgt eine erhöhte Bindung der partikelgebundenen Kompetitoren an den Analytbindungspartner, wobei sich die Kontaktfläche zwischen Partikel und Oberfläche vergrößert. In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor mit dem Analyten identisch.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor ausgewählt aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin (Huangcaoling), Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat- Synthase (EPSPS) oder Glyphosat.
Glyphosat (N-(Phosphonomethyl)glycin) ist ein nicht-selektives Blattherbizid (Breitband- oder Totalherbizid) mit systemischer Wirkung, das über jegliche grünen Pflanzenteile aufgenommen wird. Glyphosat wird in der Landwirtschaft gegen einkeim- und zweikeimblättrige Unkräuter im Acker-, Wein- und Obstbau, beim Anbau von Zierpflanzen, auf Wiesen, Weiden und Rasenflächen sowie im Forst verwendet. Die Blätter nehmen Glyphosat durch Diffusion auf und in der Pflanze wird Glyphosat über das Phloem verteilt. Glyphosat wirkt über die Blockade des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), das zur Synthese der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin über den Shikimatweg in Pflanzen, wie auch in einigen Mikroorganismen, benötigt wird. Durch die Ähnlichkeit des Glyphosats mit dem natürlichen Substrat Phosphoenolpyruvat des Enzyms 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) wird dieses Enzym gehemmt.
Unter dem Begriff „Substratanaloga“ werden Verbindungen verstanden, welche an den Analytbindungspartner, insbesondere das aktive Zentrum des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3- phosphat-Synthase (EPSPS), binden. In Ausführungsformen umfassen Substratanaloga Substrate, insbesondere Shikimat-3-phosphat (S3P) oder Phosphoenolpyruvat (PEP); funktionelle Substratanaloga, insbesondere Phosametin; und kompetitive Inhibitoren, insbesondere Glyphosat. Marzabadi et al. und Priestman et al. offenbaren weitere Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), insbesondere (3F?,4S,5F?)-5-Amino-4-hydroxy-3-(phosphonooxy)cyclohex-1 -en-1 -carbonsäure, 1 -Carboxy-1 -(phosphonooxy)-ethan-l -ylium , (3F?,4S,5F?)-5-((S)-1 -Carboxy-1 -phosphonoethoxy)- 4-hydroxy-3-(phosphonooxy)-cyclohex-1-en-1 -carbonsäure, (3F?,4S,5F?)-5-((F?)-1 -Carboxy-1 - phosphonoethoxy)-4-hydroxy-3-(phosphonooxy)-cyclohex-1-en-1 -Carbonsäure, {2R,3aR,7R, 7aS)-2-Methyl-7-(phosphonooxy)-3a,4,7,7a-tetrahydrobenzo[d][1 ,3]-dioxol-2,5-dicarbonsäure, (3F?,4S,5F?)-5-((Carboxymethyl)-(phosphonomethyl)amino)-4-hydroxy-3-(phosphonooxy)-cyclo- hex-1 -en-1 -carbonsäure, (3F?,4S,5F?)-5-((Carboxymethyl)-(phosphonomethyl)amino)-3,4-di- hydroxycyclohex-1 -en-1 -carbonsäure [3,4]
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung sind sowohl Kompetitor als auch Analyt Glyphosat.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen.
Erfindungsgemäß umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine Analytbindungsstelle. Die Analytbindungsstelle dient der Anbindung des Analyten an den Analytbindungspartner.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Analytbindungsstelle als Bindungstasche eines Enzyms ausgebildet oder eine allosterische Bindungsstelle für den Analyten.
Erfindungsgemäß weist der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) auf. Die Distanz der Bindungstasche zu Proteinoberfläche in der EPSPS beträgt ca. 10 Ä in geschlossener Konformation.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer Proteinen, Peptidlinkern, und Protein- Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin- Domäne auf. Vorteilhaft immobilisieren Hydrophobine selbstassemblierend an verschiedenen Materialoberflächen und -geometrien. In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase- Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen der Erfindung weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung wird der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt. Die angegebenen Mischungsverhältnisse beziehen sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf die molare Masse. Vorteilhaft werden mit Mischungsverhältnissen im Bereich von 1 :3 bis 1 :8 besonders homogene und wenig raue Oberflächen erhalten, wodurch die Partikelanbindung an die Oberflächen verbessert wird.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin- Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1 :2 bis 1 : 10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5, ganz besonders bevorzugt 1 :5. Durch Variation des Verhältnisses von Fusionsprotein und Hydrophobin auf der Oberfläche kann zusätzlich die Sensitivität gegenüber Glyphosat sehr gezielt eingestellt werden und ermöglicht damit einen Nachweis von Glyphosat über einen weiten Konzentrationsbereich.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche im Wesentlichen planar ausgebildet. Beispielsweise kann die Oberfläche ein Glasformkörper oder ein Kunststoffformkörper sein z. B. ein Objektträger, Deckgläschen, Siliziumwafer oder ähnliches. Bevorzugt ist die Oberfläche ein Glasformkörper.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche transparent, semitransparent oder opak ausgebildet. Bevorzugt ist die Oberfläche zumindest im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 600 nm transparent ausgebildet. In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Detektion mittels Quarzkristallmikrowaage (QCM), Oberflächen plasmonenspektroskopie (SPR), Rasterkraftspektroskopie oder Impedanzspektroskopie.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Detektion mittels Reflexionsinterferenz kontrastmikroskopie (RICM). Dabei werden die Kontaktradien a von Partikel und Oberfläche sowie die Partikelradien RHGS mittels einer eigens dafür entwickelten Software automatisiert ermittelt. Gemäß Johnson-Kendall-Roberts Modell [2] stehen diese Größen mit der Adhäsionsenergie Wadh in folgendem Zusammenhang:
Die ermittelte Adhäsionsenergie entspricht der Bindungsdichte der partikelgebundenen Kompetitoren an den Analytbindungspartner und erlaubt die Bestimmung der Analytmenge in der Probe.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Oberfläche aufweisend den erfindungsgemäßen Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist, wobei die Oberfläche zumindest im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 600 nm transparent ausgebildet ist.
In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oberfläche ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen.
In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oberfläche umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine Analytbindungsstelle. Die Analytbindungsstelle dient der Anbindung des Analyten an den Analytbindungspartner.
In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oberfläche ist die Analytbindungsstelle als Bindungstasche eines Enzyms ausgebildet oder eine allosterische Bindungsstelle für den Analyten.
Bevorzugt weist der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) auf. Die Distanz der Bindungstasche zu Proteinoberfläche in der EPSPs beträgt ca. 10 Ä in geschlossener Konformation.
In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oberfläche umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer Proteinen, Peptidlinkern, und Protein-Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne auf.
In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oberfläche weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf.
Erfindungsgemäß ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oberfläche weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.
Vorteilhaft erfolgt durch die Verwendung eines Fusionsproteins aufweisend eine Hydrophobin- Domäne eine gerichtete und kontrollierte Assemblierung des Hydrophobins bzw. Fusionsproteins auf der Oberfläche und die EPSPS-Domäne weist keinen direkten Kontakt mit dem Oberflächenmaterial auf, wodurch die enzymatische Aktivität weitestgehend erhalten bleibt.
In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oberfläche ist der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt. Vorteilhaft wird durch die Nutzung der Mischungsverhältnisse des Analytbindungspartner mit Hydrophobin eine sterische Hinderung des Analytbindungspartner, insbesondere der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase- Domäne, durch Immobilisierung an die Oberfläche minimiert und die Ansprechbarkeit sowie Sensitivität der Oberfläche bzw. des Assays moduliert.
In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oberfläche erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin- Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5, ganz besonders bevorzugt 1 :5.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein funktionalisierter Partikel aufweisend einen immobilisierten Kompetitor, wobei der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert ist, wobei der Partikel deformierbar ausgebildet ist, wobei der Kompetitor ausgewählt ist aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin, Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3- phosphat-Synthase oder Glyphosat, wobei der Linker eine Konturlänge im Bereich von 5 Ä bis 200 Ä, bevorzugt im Bereich von 10 Ä bis 50 Ä auf und/oder einen Polymerisationsgrad im Bereich von 1 bis 70, bevorzugt im Bereich von 3 bis 20 aufweist.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Partikel eine Carboxy-Funktionalisierung auf. Die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel, insbesondere der Hydrogel-Mikropartikel, erfolgte gemäß der von Pussak et al. (Pussak, et al. , 2012) beschriebenen Methode via Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat mit anschließender radikalischer Pfropfung von Acrylsäuremonomeren, Crotonsäuremonomeren oder weiteren Alkenderivaten mit funktionellen Gruppen wie etwa Aminen zur Einführung der Carboxyl-, Amino- oder anderen funktionellen Gruppen.
In Ausführungsformen erfolgt die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel mikrofluidisch mittels photoinitiierter radikalischer Vernetzung von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat (bevorzugtes Molekulargewicht im Bereich von 500 Da bis 8.000 Da, besonders bevorzugt um 4.000 Da) mit anschließender photoinitiierter radikalischer Pfropfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen, wobei monodisperse Partikel mit einem Durchmesser von 10 pm bis 100 pm, besonders bevorzugt 25 pm, erzeugt werden.
Erfindungsgemäß ist der Partikel ein deformierbar ausgebildeter Partikel. Der Partikel weist bevorzugt ein Elastizitätsmodul im Bereich von 10 kPa bis 100 kPa auf, besonders bevorzugt im Bereich von 15 kPa bis 50 kPa. So wird vorteilhaft eine hohe Sensitivität sichergestellt. Gleichzeitig wird so eine ungleichmäßige Deformation der Partikel ausgeschlossen.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Partikel ein Hydrogelpartikel. In Ausführungsformen der Erfindung hat der Partikel einen Durchmesser von 10 pm bis 100 pm, besonders bevorzugt einen Durchmesser von etwa 25 pm.
Erfindungsgemäß ist der Kompetitor ausgewählt aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin (Huangcaoling), Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) oder Glyphosat. Bevorzugt ist der Kompetitor Glyphosat.
Erfindungsgemäß ist der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert. Dabei wird der Linker an die funktionalisierte Partikeloberfläche angebunden.
Das jeweilige Linkermolekül erlaubt dabei die geeignete Immobilisierung des Kompetitors, etwa Glyphosat, über die Carboxyl- oder die sekundäre Aminogruppe, wobei die Kopplungsgruppe die Funktionalität und Sensitivität des Verfahrens beeinflusst. Des Weiteren kann über die Länge bzw. den Polymerisationsgrad des Linkers die resultierende Affinität des immobilisierten Kompetitors variiert und somit der Arbeitsbereich des Verfahrens eingestellt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Linker ausgewählt aus den Gruppen der homo- und heterobifunktionalen Linker und umfasst exemplarisch Ethylendiamin, Oligo- und Polyethylenglykolbisamine, Peptide wie Pentaglycin und Aminosäuren oder ein bifunktionaler Linker mit weiteren Gruppen wie etwa Thiolen oder Aziden.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker eine Konturlänge (L) und einen Polymerisationsgrad (PG) auf. Erfindungsgemäß weist der Linker eine Konturlänge (L) im Bereich von 5 Ä bis 200 Ä, bevorzugt im Bereich von 10 Ä bis 50 Ä auf.
Erfindungsgemäß weist der Linker einen Polymerisationsgrad im Bereich von 1 bis 70, bevorzugt im Bereich von 3 bis 20 auf.
Beispielhaft geeignete Linker sind Ethylendiamin: L=5,3 Ä; PG = 1 oder Pentaglycin: L=16,3 Ä; PG = 5 oder PEG-Bisamin 3000: L=191 Ä; PG = 68.
Vorteilhaft kann über die Länge bzw. den Polymerisationsgrad des Linkers die resultierende Affinität des immobilisierten Kompetitors für den Analytbindungspartner variiert und somit der Arbeitsbereich des Sensors eingestellt werden. In Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Linker Schutzgruppen. In Ausführungsformen der Erfindung ist die Schutzgruppe ausgewählt aus Fluorenylmethoxycarbonyl-, tert- Butyloxycarbonyl- oder tert-Butyl-Schutzgruppen. Auf diese Weise wird vorteilhaft sichergestellt, dass keine unerwünschte Polymerisierung der Linker-Moleküle oder Quervernetzung der Partikel eintritt.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit umfassend:
zumindest einen immobilisierten Analytbindungspartner oder
einen Analytbindungspartner und ein Hydrophobin,
wobei der Analytbindungspartner zur Interaktion mit einem Analyten ausgebildet und auf einer Oberfläche immobilisiert ist,
wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin- Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist, und wobei die Oberfläche zumindest im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 600 nm transparent ausgebildet ist;
zumindest einen Partikel, aufweisend einen immobilisierten Kompetitor,
wobei der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert ist, wobei der Partikel deformierbar ausgebildet ist.
In Ausführungsformen werden der im Kit enthaltene Analytbindungspartner sowie das Hydrophobin vorteilhaft zur Immobilisierung im Verhältnis 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt im Verhältnis 1 :5 gemischt und auf einer Oberfläche immobilisiert. Dabei stabilisiert das Hydrophobin die Oberfläche während der Analytbindungspartner zur Interaktion mit dem Analyten ausgebildet ist.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist der Kompetitor ausgewählt aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin (Huangcaoling), Substratanaloga des Enzyms 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) oder Glyphosat. Bevorzugt ist der Kompetitor Glyphosat.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist der Partikel ein funktionalisierter Partikel, wobei die Oberfläche des Partikels eine Funktionalisierung aufweist. Die Funktionalisierung dient dabei der Anbindung des Kompetitors.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits weist der Partikel eine Carboxy- Funktionalisierung auf. Die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel, insbesondere der Hydrogel-Mikropartikel, erfolgte gemäß der von Pussak et al. (Pussak, et al. , 2012) beschriebenen Methode via Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat mit anschließender radikalischer Pfropfung von Acrylsäuremonomeren, Crotonsäuremonomeren oder weiteren Alkenderivaten mit funktionellen Gruppen wie etwa Aminen zur Einführung der Carboxyl-, Amino- oder anderen funktionellen Gruppen.
In Ausführungsformen erfolgt die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel mikrofluidisch mittels photoinitiierter radikalischer Vernetzung von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat (bevorzugtes Molekulargewicht im Bereich von 500 Da bis 8.000 Da, besonders bevorzugt um 4.000 Da) mit anschließender photoinitiierter radikalischer Pfropfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen, wobei monodisperse Partikel mit einem Durchmesser von 10 bis 100 pm, besonders bevorzugt 25 pm, erzeugt werden.
Erfindungsgemäß ist der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert. Dabei wird der Linker an die funktionalisierte Partikeloberfläche angebunden.
Das jeweilige Linkermolekül erlaubt dabei die geeignete Immobilisierung des Kompetitors, etwa Glyphosat, über die Carboxyl- oder die sekundäre Aminogruppe, wobei die Kopplungsgruppe die Funktionalität und Sensitivität des Verfahrens beeinflusst. Des Weiteren kann über die Länge bzw. den Polymerisationsgrad des Linkers die resultierende Affinität des immobilisierten Kompetitors variiert und somit der Arbeitsbereich des Verfahrens eingestellt werden.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist der Linker ausgewählt aus den Gruppen der homo- und heterobifunktionalen Linker und umfasst exemplarisch Ethylendiamin, Oligo- und Polyethylenglykolbisamine, Peptide wie Pentaglycin und Aminosäuren oder ein bifunktionaler Linker mit weiteren Gruppen wie etwa Thiolen oder Aziden.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits enthalten die Linker Schutzgruppen. In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist die Schutzgruppe ausgewählt aus Fluorenylmethoxycarbonyl-, tert-Butyloxycarbonyl- oder tert-Butyl-Schutzgruppen. Auf diese Weise wird vorteilhaft sichergestellt, dass keine unerwünschte Polymerisierung der Linker- Moleküle oder Quervernetzung der Partikel eintritt.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits weist der Linker eine Konturlänge (L) und einen Polymerisationsgrad (PG) auf. In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits weist der Linker eine Konturlänge (L) im Bereich von 5 Ä bis 200 Ä, bevorzugt im Bereich von 10 Ä bis 50 Ä auf.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits weist der Linker einen Polymerisationsgrad im Bereich von 1 bis 70, bevorzugt im Bereich von 3 bis 20 auf.
Beispielhaft geeignete Linker sind Ethylendiamin: L=5,3 A; PG = 1 oder Pentaglycin: L=16,3 Ä; PG = 5 oder PEG-Bisamin 3000: L=191 Ä; PG = 68.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist der Partikel eine Hydrogelpartikel.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist die Partikelgröße ein Durchmesser im Bereich von 10 pm bis 100 pm, besonders bevorzugt um 25 pm.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits weist der Partikel ein Elastizitätsmodul im Bereich von 5 kPa bis 100 kPa, besonders bevorzugt im Bereich von 15 kPa bis 50 kPa auf. So wird vorteilhaft eine hohe Sensitivität sichergestellt. Gleichzeitig wird so eine ungleichmäßige Deformation der Partikel ausgeschlossen.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist die Oberfläche im Wesentlichen planar ausgebildet. Beispielsweise kann die Oberfläche ein Glasformkörper sein z. B. ein Objektträger, Deckgläschen, Siliziumwafer oder ähnliches.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist die Oberfläche transparent, semitransparent oder opak ausgebildet.
Erfindungsgemäß ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen.
Erfindungsgemäßumfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine Analytbindungsstelle. Die Analytbindungsstelle dient der Anbindung des Analyten an den Analytbindungspartner. In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits ist die Analytbindungsstelle als Bindungstasche eines Enzyms ausgebildet oder eine allosterische Bindungsstelle für den Analyten.
Bevorzugt weist der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) auf. Die Distanz der Bindungstasche zu Proteinoberfläche in der EPSPs beträgt ca. 10 Ä in geschlossener Konformation.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer Proteinen, Peptidlinkern, und Protein-Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne auf.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf.
Erfindungsgemäß ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits wird der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin- Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5, ganz besonders bevorzugt 1 :5.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der erfindungsgemäßen Oberfläche, des erfindungsgemäßen Partikels und des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis von Analyten in Proben, wie etwa Gewässer-, Lebensmittel-, Boden-, Trink- und Abwasserproben, bevorzugt in wässrigen Lösungen.
Zur Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen Ausführungs formen und einzelne Merkmale der Ansprüche zu kombinieren.
Ausführungsbeispiele
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden schematischen Zeichnungen und Ausführungsbeispielen, anhand derer die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden soll, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
Dabei zeigt:
Fig. 1 : die schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens beruhend auf der kompetitiven Bindung von Partikel-gebundenem und löslichem Glyphosat an der Protein-funktionalisierten Oberfläche,
Fig. 2: Die Abhängigkeit der Adhäsionsenergie zwischen Partikel und Oberfläche von der
Konzentration an Glyphosat in Lösung sowie löslichem Glufosinat als Negativkontrolle,
Fig. 3: Die Abhängigkeit der Nachweisgrenze und des Arbeitsbereiches des Verfahrens von der Beschichtung der Partikel,
Fig. 4: Die relative Adhäsionsenergie der Partikel beschichtet mit über einen Pentaglycin-
Linker gebundenem Glyphosat in Abhängigkeit von der Glyphosatkonzentration (löslich),
Fig. 5: Der Vergleich der relativen Adhäsionsenergien von mit Pentaglycin-Glyphosat beschichteten Partikeln auf Glyphosat, weiteren Pestiziden sowie Glycin als Strukturelement von Glyphosat, jeweils getestet mit einer Konzentration von 1 mM, bis auf Atrazin (153 mM), Chlorpyrifos (4 mM) und Phosmet (79 pM).
Das Prinzip der Nachweismethode ist in Fig. 1 dargestellt. Die immobilisierten Enzyme der Oberfläche wechselwirken attraktiv mit dem Partikel-gebundenen Kompetitor, in dessen Folge sich eine charakteristische Kontaktfläche zwischen Oberfläche und Partikel ausprägt. Der gelöste Analyt konkurriert mit dem Kompetitor um die Bindungsstellen auf der Oberfläche. In Abhängigkeit der Konzentration des Analyten verringert sich dadurch die Kontaktfläche. Ab einer bestimmten Konzentration adhärieren die Partikel nicht auf der Oberfläche. Die Bestimmung von Kontakt- und Partikelradius zur Ermittlung der Adhäsionsenergie erfolgt mittels Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie.
Zum Nachweis der Spezifität der Methode wurden in Fig. 2 RCA-gereinigte Glasoberflächen mit einer geeigneten Mischung des Hydrophobins Ccg2 und dessen Fusionsprotein
Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6) beschichtet. Anschließend wurden die Oberflächen wahlweise mit 10 mM Glyphosat- oder Glufosinat-Lösungen und danach mit Linker- funktionalisierten Partikeln ohne oder mit Glyphosat-Beschichtung inkubiert. Die aus den jeweiligen Bedingungen resultierenden Adhäsionsenergien wurden anhand eines repräsentativen Datensatzes dargestellt.
In Fig. 3 wurden zunächst RCA-gereinigte Glasoberflächen mit einer geeigneten Mischung des Hydrophobins Ccg2 und dessen Fusionsprotein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6) beschichtet. Anschließend wurden die Oberflächen mit Glyphosat-Lösungen unterschiedlicher Konzentration und danach mit Glyphosat-beschichteten Partikeln mit Ethylendiamin- oder Pentaglycin-Linker inkubiert. Die aus den jeweiligen Bedingungen resultierenden
Adhäsionsenergien wurden anhand eines repräsentativen Datensatzes dargestellt.
Ausführungsbeispiel 1 : Quantifizierung von Glyphosat mittels kompetitiver Bindung
Für die Erzeugung einer funktionalisierten Oberfläche wurden Fusionsproteine aus dem Hydrophobin Ccg2 (SEQ ID No. 5) aus Neurospora (N.) crassa und der 5-Enolpyruvylshikimat-3- phosphatsynthase aus Escherichia (E.) coli (EcEPSPS) (SEQ ID No. 4) benötigt. Hierzu wurden die kodierenden Bereiche der jeweiligen Gene, verbunden über die Sequenz für einen flexiblen Glycin-Serin-Linker, in den Expressionsvektor pET28b (Novagen, Deutschland) übertragen. Hierbei liegt die Sequenz des Hydrophobins (SEQ ID No. 2) 5'-seitig und die der EcEPSPS (SEQ ID No. 1 ) 3'-seitig von der Linkersequenz. Zusätzlich befindet sich 5'-seitig von der Sequenz für das Fusionsprotein die Sequenz für einen (His)6-Tag, welcher für die Detektion und Reinigung des Fusionsproteins erforderlich ist. Weiterhin wurde für die Oberfläche das Hydrophobin ohne EcEPSPS benötigt. Die Gensequenz wurde dementsprechend ohne den Linker und die EcEPSPS-Sequenz in den Vektor pET28b übertragen. Die auf diese Weise modifizierten Vektoren wurden nach vollständiger Sequenzierung der eingebrachten Sequenzen, in den E. coli Expressionsstamm SHuffle T7 Express lysY (New England Biolabs, USA) übertragen. Dieser Expressionsstamm ist vorteilhaft für die Expression der Hydrophobine, da er zusätzlich für eine Disulfidbrückenisomerase kodiert, welche die korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken der Hydrophobine begünstigt. Diese spielen eine wesentliche Rolle für die korrekte Faltung des Proteins.
Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-ß-D-thiogalaktosid (IPTG) zu £. co//'-Zellen, welche sich in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, gestartet. Nach der Induktion wurden die Zellen für 4 weitere Stunden bei 30°C und 180 Umdrehungen in der Minute inkubiert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und gewaschen, um sie dann für die Proteinreinigung weiter verwenden zu können. Die angewendete Reinigungsmethode ist abhängig von der Löslichkeit der Proteine. Die löslichen Fusionsproteine (SEQ ID No. 6) wurden mittels Nickel-Affinitätschromatografie unter nativen Bedingungen nach Herstellerangaben gereinigt, während die unlöslichen Hydrophobine mittels denaturierender Nickel- Affinitätschromatografie nach Herstellerangaben gereinigt wurden. Die Hydrophobine wurden vor der Dialyse durch Ultrafiltration konzentriert, für die Fusionsproteine war dies nicht nötig. Nach der Reinigung wurden die Hydrophobine gegen einen Redox-Rückfaltepuffer (10mM Glutathion reduziert, 1 mM Glutathion oxidiert; pH 5,4) und die Fusionsproteine gegen den Monsanto- Dialysepuffer (10 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 5% (v/v) 99,9% Glycerin, 1 mM DTT, pH 7) dialysiert, anschließend im Kühlschrank gelagert und für die Funktionalisierung von Glasoberflächen eingesetzt.
Die Funktionalisierung der Glasoberflächen erfolgte durch langsames Aufpipettieren der Proteinlösung mit anschließender 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Oberflächen gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen und 30 Minuten bei RT getrocknet. Die Glasoberflächen wurden vor der Funktionalisierung mit Hilfe einer RCA-Lösung (50 ml25 %-ige, wässrige NH3-Lösung , 50 ml 35% H2O2, 250 ml deionisiertes Wasser) gereinigt.
Die beiden Proteinvarianten wurden benötigt, um für das Verfahren ein optimales Verhältnis zwischen Fusionsprotein (kann Glyphosat binden) und Hydrophobin (zur Stabilisierung der Oberfläche) zu finden. Hierfür wurden die Proteine in verschiedenen Verhältnissen gemischt und die Funktionalität der EcEPSPS auf der Oberfläche mittels eines Nachweises von anorganischem Phosphat bestimmt. Anorganisches Phosphat ist eines der Reaktionsprodukte bei der Reaktion der EPSPS mit ihren Substraten Phosphoenolpyruvat (PEP) und Shikimat-3-phosphat (S3P) und kann daher für den Nachweis der Enzymaktivität genutzt werden. Das Verhältnis von Ccg2 (SEQ ID No. 5) zu Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6) beeinflusst die Sensitivität und Signalstärke des Assays. Je mehr Fusionsprotein auf der Oberfläche vorhanden ist, desto mehr Glyphosat wird benötigt, um die Bindestellen zu besetzen und damit die Aktivität der Proteine auf der Oberfläche messbar zu hemmen. Dementsprechend ist eine Oberfläche mit einer hohen Konzentration an Fusionsprotein unempfindlicher als eine mit wenig Fusionsprotein. Jedoch führt eine zu geringe Konzentration des Fusionsproteins zu einem geringen Signal-Rausch-Verhältnis. Aus diesem Grund wurden verschiedene Belegungsverhältnisse getestet, dabei stellte sich ein Verhältnis von 1 mM Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID NO. 6) zu 5mM Ccg2 (SEQ ID No. 5) als für die Anwendung gut geeignet heraus.
Die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Hydrogel-Mikropartikel erfolgte gemäß der von Pussak et al. beschriebenen Methode via Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid mit anschließender radikalischer Pfropfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen [1] Für die nachfolgend erläuterten Methoden wurden Mikropartikel mit Elastizitätsmoduln von 15 kPa und einem mittleren Radius von 20 pm verwendet.
Um eine durch die Anwesenheit des Analyten modulierbare Wechselwirkung zwischen der Oberfläche und den Hydrogelpartikeln oderauch Hydrogelsonden (HGS) zu ermöglichen, wurden die Mikropartikel mit Glyphosat beschichtet. Hierzu wurden, ausgehend von den Carboxyl- funktionalisierten HGS, verschiedene Linker an die Partikel gekoppelt. Das jeweilige Linkermolekül erlaubt dabei die geeignete Immobilisierung des Glyphosats über die Carboxyl- oder die sekundäre Aminogruppe, wobei die Kopplungsgruppe die Funktionalität und Sensitivität des Sensors beeinflusst. Des Weiteren kann über die Länge bzw. den Polymerisationsgrad des Linkers die resultierende Affinität des immobilisierten Kompetitors für das Enzym (EPSPS) variiert und somit der Arbeitsbereich des Sensors eingestellt werden.
Die jeweiligen Kopplungsschritte erfolgten unter Anwendung von Aktivester-Chemie. Exemplarisch diente Ethylendiamin als kurze Linkervariante, welches mittels Benzotriazol-1 -yl- oxytri-pyrrolidinophosphonium-hexafluorophosphat (PyBOP) und 1 -Hydroxybenzotriazol (HOBt) an die Mikropartikel gekoppelt wurde. Hierzu wurden die Partikel suspendiert und Wasser in mehreren Waschschritten durch Dimethylformamid (DMF) ersetzt. Die Partikel wurden in 2 ml DMF belassen. Anschließend wurden 146 mg (280 pmol) PyBOP, 18 mg (140 pmol) HOBt und 39 mI (280 mmol) Triethylamin zur Aktivierung der Carboxylgruppen zugesetzt und die Suspension 1 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Zusatz von 20 mI (300 pmol) Ethylendiamin und dreistündiger Reaktion wurden die Partikel bei 1844 x g für 10 min zentrifugiert und je 3mal mit DMF, einer 1 : 1 Mischung aus DMF und Wasser sowie reinem Wasser gewaschen. Zur weiteren Beschichtung wurden 4 mg (24 pmol) Glyphosat in 2 ml 100 mM Hepes-Puffer (pH = 7,0) im Ultraschallbad gelöst und 46 mg (240 pmol) 1 -Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid- Hydrochlorid (EDO) sowie 52 mg (240 pmol) /V-Hydroxy-sulfosuccinimid-Natriumsalz (s-NHS) zugesetzt und die Carboxylgruppen für 15 min aktiviert. Die Kopplung des Pestizids an die Amin- funktionalisierten Partikel erfolgte durch Vereinigung von Suspension und Lösung und Reaktion über einen Zeitraum von 1 h. Abschließend wurden die Partikel 3-mal mit einer 100 mM Hepes- Pufferlösung (pH = 7,0) gewaschen.
Alternativ dazu wurden die Partikel mit einem Pentaglycin-Linker funktionalisiert. Hierzu wurden die Partikel 3-mal mit 2 ml 100 mM MES-puffer (pH = 5,3) gewaschen und der Überstand nach Zentrifugation (10 min, 1844 x g) verworfen. 23 mg (120 pmol) EDC und 26 mg (120 pmol) s- NHS wurden in 1 ml 100 mM MES-puffer (pH = 5,3) gelöst und die Mikropartikel anschließend in der Lösung suspendiert. Nach einstündiger Aktivierung der Carboxylgruppen unter Schütteln wurden 10 mI (143 pmol) Mercaptoethanol zur Inaktivierung des überschüssigen EDC zugesetzt und die Suspension für weitere 15 min bei Raumtemperatur belassen. Nach Zentrifugation (10 min, 1844 x g) wurde der Überstand verworfen und 0,2 mg (660 nmol) des Peptids gelöst in 1 ml Hepes-Pufferlösung (100 mM) zugesetzt, wobei die Kopplung des Linkers über Nacht erfolgte. Nach weiteren 3 Waschschritten (100 mM Hepes-Puffer) wurden die Carboxylgruppen gemäß der zuvor beschriebenen Prozedur in den s-NHS-Ester überführt, überschüssiges EDC mittels Mercaptoethanol inaktiviert, die Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Nach Zusatz einer 1 mg / ml 100 mM Hepes-gepufferten Glyphosatlösung (6 pmol) wurde das Reaktionsgemisch über Nacht unter Schütteln bei Raumtemperatur belassen. Abschließend wurden die Partikel 3-mal mit einer 100 mM Hepes-Pufferlösung (pH = 7,0) gewaschen.
Nachdem die Oberfläche, beispielsweise eine Glasoberfläche, und die Partikel beschichtet wurden, konnten sie für die Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie (RICM) eingesetzt werden. Hierzu wurden die erfindungsgemäßen Oberflächen an einen 16-Well-Träger (CS16- CultureWell™, Grace Biolabs) mit selbstklebender Unterseite und einem Volumen von 400 mI / Well geklebt. Anschließend wurden je 200 mI / Well Analytlösung (100 mM HEPES-Puffer pH = 7) zugesetzt. Nach 30-minütiger Inkubation der Oberflächen wurden 10 mI / Well der mit Glyphosat funktionalisierten Hydrogelpartikel hinzugefügt und die Oberflächen nach Sedimentation der Hydrogelpartikel mikroskopiert.
Die Aufnahme der radialen Intensitätsprofile der HGS auf der funktionalisierten Oberfläche im Reflexionsinterferenzkontrastverfahren erfolgte mittels Inversmikroskopsystem (Olympus IX 73) mit einem 60 x Immersionsobjektiv (Olympus UPlanSAPO 60x Oil Microscope Objective). Aus den aufgenommenen Profilen konnten anschließend Kontaktradien a von Partikel und Oberfläche sowie die Partikelradien RHGS mittels einer eigens dafür entwickelten Software automatisiert ermittelt werden. Gemäß Johnson-Kendall-Roberts Modell [2] stehen diese Größen mit der Adhäsionsenergie Wadh in folgendem Zusammenhang:
Mit einem Elastizitätsmodul EHGS der Partikel von 15 kPa und einer Poissonzahl v von 0,5 kann somit unter Kenntnis des Partikel- und Kontaktradius die korrespondierende Adhäsionsenergie des Systems bestimmt werden.
Die Ergebnisse der Messungen sind beispielhaft in Fig. 2 gezeigt. Die Pentaglycin- funktionalisierten Partikel (Negativkontrolle) zeigen lediglich schwache unspezifische Wechselwirkungen mit der Oberfläche, wohingegen Glyphosat-beschichtete HGS stark adhärieren. Bei Anwesenheit hoher Konzentrationen des Analyten bewegt sich der Wert im Bereich der Negativkontrolle. Dies ist auf die Kompetition um Bindungsstellen der EcEPSPS auf der Oberfläche zwischen freiem Glyphosat in der Analytlösung und an den HGS gebundenem Glyphosat zurückzuführen. Des Weiteren verdeutlicht der vernachlässigbare Einfluss strukturell ähnlicher Verbindungen wie Glufosinat auf die Adhäsionsenergie die Selektivität der Methode gegenüber Glyphosat.
Fig. 3 zeigt exemplarisch die resultierenden Adhäsionsenergien Glyphosat-beschichteter Partikel der Linkervarianten Ethylendiamin und Pentaglycin bei verschiedenen Konzentrationen an löslichem Glyphosat. Mit steigenden Glyphosatkonzentrationen in der Probe sinkt die Adhäsionsenergie der Glyphosat-beschichteten HGS an der funktionalisierten Chip-Oberfläche. Je mehr Glyphosat sich in der Analytlösung befindet, desto stärker ist die Konkurrenz zu gebundenem Glyphosat. Sind viele Bindestellen mit freiem Glyphosat besetzt, können sich die HGS nicht mehr fest an der Oberfläche anlagern, die Kontaktfläche wird kleiner und dementsprechend nimmt die Adhäsionsenergie ab. Die Nachweisgrenze kann dabei unter anderem über den Linker variiert werden. Diese beträgt im gezeigten Beispiel für Ethylendiamin- Glyphosat-beschichtete HGS 10 mM, für Pentaglycin-Glyphosat-beschichtete HGS liegt die Nachweisgrenze unterhalb 1 mM, wobei das Sensorsystem weitere Möglichkeiten zur Einstellung des Arbeitsbereiches bietet. Die Ergebnisse beweisen, dass ein spezifischer Nachweis sowie eine präzise Quantifizierung von Glyphosat mit Hilfe der Erfindung möglich sind.
Ausführungsbeispiel 2: Bestimmung der Sensitivität und Spezifität der Quantifizierung von Glyphosat
Die Konzentrationsabhängigkeit der Glyphosatbindung ist in Fig. 4 dargestellt. Zur Bestimmung der Sensitivität wurden zunächst RCA-gereinigte Glasoberflächen mit einer geeigneten Mischung des Hydrophobins Ccg2 und dessen Fusionsprotein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6) beschichtet. Anschließend wurden die Oberflächen mit Glyphosat-Lösungen unterschiedlicher Konzentration und danach mit Glyphosat-beschichteten Partikeln mit Pentaglycin-Linker inkubiert. Der untersuchte Konzentrationsbereich umfasst einen Bereich von 10 11 M bis 10 8 M. Dieser Empfindlichkeitsbereich erreicht den Schwellenwert von 0,1 pg/ml für Pestizidverunreinigungen im deutschen Leitungswasser.
Die Spezifität wurde durch die Testung von strukturverwandten Verbindungen und häufig eingesetzten Pestiziden in dem erfindungsgemäßen Assay untersucht (Fig. 5). Keine der getesteten Verbindungen zeigte eine vergleichbare relative Adhäsionsenergie wie Glyphosat, womit ein spezifischer Nachweis von Glyphosat auch in Gegenwart anderer Pestizide sowie in Gegenwart von Verbindungen mit Strukturelementen aus Glyphosat belegt wurde.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Analyten umfassend die Schritte:
Bereitstellen einer Oberfläche mit einem immobilisierten Analytbindungspartner,
Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einer Probe enthaltend den Analyten, wobei der Analyt mit dem Analytbindungspartner interagiert,
Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einem Kompetitor, wobei der Kompetitor an einen Partikel immobilisiert ist und mit dem Analytbindungspartner interagiert,
Detektion der an den Analytbindungspartner gebundenen Kompetitoren,
wobei der Analyt Glyphosat ist,
wobei der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) aufweist, und
wobei der Partikel deformierbar ausgebildet ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Partikel ein Hydrogelpartikel ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Partikel ein Elastizitätsmodul von 5 kPa bis 100 kPa aufweist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kompetitor ausgewählt ist aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin, Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase oder Glyphosat.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 aufweist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert wird, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie erfolgt.
9. Oberfläche aufweisend einen Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist, wobei die Oberfläche zumindest im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 600 nm transparent ausgebildet ist.
10. Oberfläche nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert ist, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt.
1 1. Oberfläche nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein ist, welches die SEQ ID No. 6 aufweist.
12. Partikel aufweisend einen immobilisierten Kompetitor, wobei der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert ist, wobei der Partikel deformierbar ausgebildet ist, wobei der Kompetitor ausgewählt ist aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin, Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase oder Glyphosat,
wobei der Linker eine Konturlänge von 5 - 200 Ä, bevorzugt 10 - 50 Ä auf und/oder einen Polymerisationsgrad von 1 - 70, bevorzugt 3 -20 aufweist.
13. Kit umfassend: zumindest einen immobilisierten Analytbindungspartner oder einen Analytbindungspartner und ein Hydrophobin, wobei der Analytbindungspartner zur Interaktion mit einem Analyten ausgebildet ist und auf einer Oberfläche immobilisiert ist,
wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase- Domäne ist, und wobei die Oberfläche zumindest im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 600 nm transparent ausgebildet ist; und
zumindest einen Partikel, aufweisend einen immobilisierten Kompetitor, wobei der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert ist, wobei der Partikel deformierbar ausgebildet ist.
14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein die SEQ ID No.
6 aufweist.
15. Kit nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert ist, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1 :2 bis 1 :10, bevorzugt zwischen 1 :3 bis 1 :8, besonders bevorzugt um 1 :5 liegt.
16. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, einer Oberfläche nach Anspruch 9 bis 1 1 , eines Partikels nach Anspruch 12 und/oder eines Kits nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zum Nachweis von Analyten in Proben.
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