EP3803379A1 - Hochaufgelöste flüssigchromatographie basierend auf einem sägezahngradienten - Google Patents

Hochaufgelöste flüssigchromatographie basierend auf einem sägezahngradienten

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EP3803379A1
EP3803379A1 EP18733192.1A EP18733192A EP3803379A1 EP 3803379 A1 EP3803379 A1 EP 3803379A1 EP 18733192 A EP18733192 A EP 18733192A EP 3803379 A1 EP3803379 A1 EP 3803379A1
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EP
European Patent Office
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solvent
vol
mobile phase
polymer
gradient
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18733192.1A
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English (en)
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Inventor
Bernhard DURNER
Thomas Ehmann
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Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
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    • G01N2030/885—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds involving polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method of analyzing a polymer sample, the method comprising performing a liquid chromatography analysis on a chromatography column having a mobile phase containing a mixture of at least one non-solvent (S1) and at least one solvent (S2) for the polymer sample characterized in that the volume fraction of S2 in the mobile phase during the elution process is varied stepwise and the steps alternately ascend and descend.
  • S1 non-solvent
  • S2 solvent
  • Chromatography is a physical separation method in which the components to be separated are distributed between two phases, one stationary (stationary phase) and the other (mobile) moving in a defined direction.”
  • Liquid chromatography is a separation method in which the mobile phase is a liquid. Liquid chromatography can be carried out in a column or on a plate. "Liquid chromatography includes separation methods such as SEC (size exclusion chromatography), HPLC (high pressure liquid chromatography) and IC (ion chromatography).
  • the liquid chromatography can be divided once again on the basis of the composition of the mobile phase in isocratic analysis and gradient analysis.
  • the composition of the mobile phase remains constant throughout the elution process, whereas in the gradient analysis the composition is varied continuously or stepwise.
  • Polymers are macromolecules composed of monomers. As a result of the sequential structure or the individual repeat units and the corresponding reaction regime, this results in macromolecules which have distributions with respect to different substance sizes. Depending on the chemical composition, distributions can occur with regard to the chemical functionality, the molar mass or in the structure.
  • the polydispersity indicates, for example, how narrow or wide the molecular weight distribution is.
  • HPLC analysis methods for polymers by means of gradient analysis are known from the prior art.
  • W.J. Staal (Dissertation, University of Eindhoven, 1996) provides a good overview of the genesis and development of gradient elution chromatography (GPEC).
  • GPEC gradient elution chromatography
  • EP3170836A1 discloses a step-gradient RP-HPLC (reverse phase) analysis method, however, which is applicable to complex polypeptide mixtures such as glatiramer acetate or similar mixtures is described. Here is a gradual change in the solvent -
  • Non-solvent mixture used over time.
  • the less polar solvent is increased by 2-4 vol% every 4 to 6 minutes.
  • the profile resembles a staircase function.
  • Kajdan et al. J. Chromatogr. A 1189 (2008) 183-195 disclose a two-dimensional gradient method with a spike gradient for analyzing polypeptides, in which method the composition of the mobile phase is maintained for a defined time before returning however, this gradient is used for cation exchange in the first dimension, whereas in the RP-LC (reversed-phase LC) an ordinary linear gradient is used in the second dimension.
  • RP-LC reversed-phase LC
  • Spranger et al. disclose a two-dimensional analysis method for atmospheric HULIS (humic-like substances) that combines SEC (size-exclusion chromatography) in one dimension and RP-HPLC in the other dimension ,
  • SEC size-exclusion chromatography
  • RP-HPLC a novel spike gradient is used in which the organic solvent content of the mobile phase regularly increases, decreases, and remains constant.
  • the object is achieved by a method for analyzing a polymer sample, the method comprising carrying out a liquid chromatography analysis on a chromatography column having a mobile phase comprising a mixture of at least one non-solvent (S1) and at least one solvent (S2) for the polymer sample, characterized in that the volume fraction of S2 in the mobile phase is varied stepwise during the elution process and the steps alternately ascend and descend.
  • a method for analyzing a polymer sample comprising carrying out a liquid chromatography analysis on a chromatography column having a mobile phase comprising a mixture of at least one non-solvent (S1) and at least one solvent (S2) for the polymer sample, characterized in that the volume fraction of S2 in the mobile phase is varied stepwise during the elution process and the steps alternately ascend and descend.
  • S1 non-solvent
  • S2 solvent
  • Figures 1A-C show the schematic structure of a 2-dimensional step gradient ("Säge leopardgradient") in
  • Figure 2A shows a chromatogram of PVC measured with a linear gradient
  • Figure 2B shows a chromatogram of PVC measured with a step gradient
  • Figure 2C shows a chromatogram of PVC measured with a sawtooth gradient in trapezoidal shape (see Example 1).
  • Figure 3A shows a chromatogram of PMMA measured with a linear gradient
  • Figure 3B shows a chromatogram of PMMA measured with a sawtooth gradient in trapezoidal shape (see Example 3).
  • Figure 4A shows a chromatogram of PPG measured with a linear gradient
  • Figure 4B shows a chromatogram of PPG measured with a sawtooth gradient in trapezoidal shape (see Example 3).
  • Figure 5A shows a chromatogram of PDMS measured with a linear gradient
  • Figure 5B shows a chromatogram of PDMS measured with a sawtooth gradient in trapezoidal shape (see Example 3).
  • Figure 6A shows a chromatogram of PMMA 690,000 measured as a 2-dimensional sawtooth gradient in trapezoidal shape
  • Figure 6B shows a chromatogram of PMMA 690,000 measured as a 3-dimensional sawtooth in trapezoidal shape (see Example 4).
  • FIG. 7 shows a chromatogram of a mixture of PDMS, PMMA and PPG of similar average molar mass measured with a sawtooth gradient in trapezoidal shape (see Example 5).
  • the present invention relates to a method for analyzing a polymer sample, the method comprising performing a liquid chromatography analysis on a chromatography column with a mobile phase containing a mixture of at least one non-solvent (Sl) and at least one solvent (S2) for the polymer sample, characterized in that the volume fraction of S2 in the mobile phase is varied stepwise during the elution process and the steps alternately ascend and descend.
  • a polymer sample in the sense of the present invention may be a polymer or a polymer mixture.
  • a polymer is to be understood as meaning a chemical substance which is of constitutional origin Repeating units and has an average molar mass in the range of a few thousand to several million g / mol, this includes both homopolymers and copolymers.
  • polymers examples include organic synthetic polymers such as polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, polycarbonate, poly (meth) crylates, polystyrene, polyacrylonitrile, polyvinylidene chloride, polyvinyl fluoride, polyvinylidene fluoride, polyvinylidene cyanide, polybutadiene, polyisoprene, polyethers, polyesters, polyamide, polyimide, polysiloxanes , Polysilanes, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide, polyethylene glycol and their derivatives and copolymers, and natural polymers such as cellulose, starch, casein and natural rubber, and semi-synthetic high molecular weight compounds such as cellulose derivatives, eg. Methylcellulose, hydroxymethylcellulose and carboxymethylcellulose.
  • a polymer mixture preferably contains at least two polymers of this group.
  • poly (meth) acrylates are to be understood as meaning both polyacrylates and polymethacrylates and also polyalkyl acrylates and polyalkyl methacrylates, where alkyl is preferably a linear or branched C 1 -C 20 hydrocarbon radical.
  • alkyl is preferably a linear or branched C 1 -C 20 hydrocarbon radical.
  • poly (meth) acrylates are polymethyl (meth) acrylates, polyethyl (meth) acrylates,
  • polysiloxanes are compounds of the general formula (I)
  • R x is independently hydrogen, straight, branched, acyclic or cyclic, saturated or mono- or polyunsaturated C 1 -C 20 - hydrocarbon radical, hydroxy radical, vinyl radical, alkoxy group, amino group, halogen or silyloxy group of the general formula (II)
  • R y are independently hydrogen, halogen, an unbranched , branched, linear, acyclic or cyclic, saturated or poly-saturated C 1 -C 20 -hydrocarbon radical, it being possible for individual carbon atoms to be replaced by oxygen, halogen, nitrogen or sulfur,
  • radicals R x and R y are the radicals hydrogen, methyl, ethyl, propyl, phenyl and chlorine, with methyl being the most preferred.
  • examples of polysiloxanes are polydimethylsiloxane and aminopolydimethylsiloxane.
  • the polymers are usually used with an average molar mass in the range of 1,000-2,000,000 g / ol.
  • Polyvinyl chloride is usually used with an average molar mass in the range of 20,000-1,000,000 g / mol
  • Pol (meth) acrylates are usually used with an average molar mass in the range of 15,000 to 2,000,000 g / mol
  • polysiloxanes and polysilanes Usually used with an average molar mass in the range of 1,000-500,000 g / mol
  • polystyrene is usually used with a medium
  • Polypropylene glycol is usually used with an average molar mass in the range of 4,000-30,000 g / mol
  • polyvinyl alcohol and polyvinyl acetate are usually used with an average molar mass in a range of 1,000 -100,000 g / mol used.
  • Chromatography columns generally have no limitations. As chromatographic columns, it is possible to use all the columns known to the person skilled in the art for liquid chromatography, in particular commercially available columns, ie SEC columns, HPLC columns and IC columns. Preferred are SEC columns and HPLC columns, with HPLC columns being particularly preferred.
  • the mobile phase used for the liquid chromatography analysis contains a mixture of at least one solvent (S2) and at least one non-solvent (S1) for the polymer sample.
  • non-solvents are meant all liquids in which the solubility of a polymer sample is lower than in the solvent. From the literature (e.g., Polymer Data Handbook, 2nd edition, 2009, Oxford University Press), those skilled in the art can see which liquids for which polymer or polymer blend can be used as solvents or non-solvents, respectively.
  • solvents and non-solvents may be independently selected from the group consisting of tetrahydrofuran (THF), toluene, cyclohexane, diethyl ether, carbon tetrachloride, dichloromethane, chloroform, 1,4-dioxane, N, -dimethylacetamide, N, -dimethylformamide, benzyl alcohol, methyl ethyl ketone , Ethyl acetate, acetone, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, hexafluoroisopropanol, 2- Propanol, methanol, water and mixtures thereof.
  • solvents and non-solvents are independently selected from the group consisting of THF, hexafluoroisopropanol, methanol, acetone, water and mixtures thereof.
  • Non-solvent and S2 denotes the solvent.
  • SA start share
  • the analysis method according to the invention can be carried out in a multi-dimensional manner and can therefore be termed n-dimensional, the number of dimensions referring to the number of liquid components of the mobile phase used.
  • the variation of the volume fraction of S2 takes place in stages, with the steps alternately ascending and descending (cf. FIG. 1).
  • the shape of the steps can be chosen arbitrarily by the person skilled in the art by changing various parameters described below.
  • a time interval t is calculated over the column volume t '(formulas 1 and 2), which is the basis of the gradient.
  • t ' is freely selectable in a range from 0.1 mL to 1.2 mL.
  • the mobile phase consists of a non-solvent S1 and a solvent S2, and the composition of the mobile phase is varied over time as follows,
  • composition of the mobile phase is calculated by the following formulas (3-5), the 2-dimensional Describe sawtooth gradients (see Figure 1 and Table 2):
  • the proportion of S2 is reduced by the proportion A (e.g., 6 vol%)
  • the starting fraction is increased by the proportion B (e.g., 0.2 vol%), and thus is (SA + x * B).
  • B e.g. 0. vol%
  • SA + x * B the proportion of S1 is in each case (100 - S2)% by volume.
  • negative values for the S2 fraction are initially calculated because of the descending levels. However, these negative values are mathematically nonsensical and are therefore equated with the starting fraction of S2 until a positive value for S2 is calculated.
  • the number of stages required can be calculated using formula 4.
  • the liquid components are preferably THF and methanol.
  • the process is repeated at least once in each case with a different mobile phase, in each case the previous solvent serves as a non-solvent and a new solvent is selected.
  • the non-solvent is chosen such that it is suitable as solvent for at least some of the polymers in the polymer mixture.
  • a separation of the polymer mixture into the individual polymers is achieved via the different solubility of the polymers in the various mobile phases.
  • methanol is used as the non-solvent in the first pass and acetone as the solvent, in the second pass acetone is used as the nonsolvent and THF as the solvent.
  • This method is a special case of the 2-dimensional gradient.
  • the mobile phase consists of two non-solvents S1 and Sl 'and a solvent (S2), and the composition of the mobile phase is varied over time as follows,
  • the change in the composition of the mobile phase is calculated from the following formulas (6) and (7), which describe the 3-dimensional sawtooth gradient (cf. Table 4): 0.01 + t + E t (6)
  • the starting fraction of S2 is increased by the fraction B (eg, 0.2 vol%) (SA + x * B).
  • the proportion of Sl ' is now (100 - S2) vol .-% and the proportion of Sl is still 0 vol .-%.
  • negative values for the S2 fraction are initially calculated because of the descending levels. However, these negative values are mathematically nonsensical and are therefore equated with the starting component SA at S2 until a positive value for S2 is calculated.
  • Table 4 shows these changes in the composition once more mathematically as an example for the first two stages. This calculation continues accordingly until the last stage, in which a share of S2 of 100 vol .-% is reached.
  • the number of stages required can be calculated using formula 7.
  • the parameters A, B, C, D and E can generally be freely selected from the following ranges
  • the values C, D and E are greater than 0.
  • the parameters A, B, C, D and E are selected from the following ranges
  • the parameters A, B, C, D and E have the following values: A: 6.0% by volume and B: 0.2% by volume. and C: 1.0 and D: 3.0 and E: 2.0.
  • HPLC 1) ThermoFisher Scientific Ultimate 3000 with binary
  • Diode array detector HL detection wavelength 215 nm
  • Tetrahydrofuran (not stabilized, HPLC grade, Merck Darmstadt), methanol (HPLC grade, Merck Darmstadt) and ultrapure water (conductivity 18.5 Mohrrucm, TOC value ⁇ 4 ppb).
  • the target quantities were (1) the number of separated peaks, (2) the resolution, (3) the asymmetry and (4) the peak width in half height optimized.
  • the variation of the parameters can be seen in Table 2.
  • the test series was carried out on five different commercially available Ghromatographiekla.
  • the parameter B is mainly responsible for the number of peaks and therefore the quality of the polymer dissolution.
  • the other targets showed a smaller impact by comparison.
  • the effective step height B is also crucial. The more steps that are taken, the better the resolution, but the longer the total measurement time. If the measurement time is to be shortened with the smallest effective step height, the effective step length must be considered. The fact that this size is composed of the individual firmly defined sub-steps, which due to the accuracy of the gradient mixer of the pump used, can not be further shortened, another possibility must be found. Another crucial parameter that is included in the calculation of the effective step length is the LC flow.
  • the resolving power of the sawtooth gradient is significantly improved as compared to the other analysis techniques the increased number of peaks can be clearly seen (see Figure 2).
  • Examples 1-5 show that the process according to the invention can be applied to a large number of polymers, including very large mean molar masses, and also to a large number of polymers
  • Chromatography columns can be used. The only prerequisite for the suitability is that a fundamental retention of the analyte to be examined is ensured at the column. However, this is part of the general expertise of the skilled person.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Polymerprobe, wobei das Verfahren die Durchführung einer Flüssigchromatographie-Analyse an einer Chromatographiesäule mit einer mobilen Phase enthaltend eine Mischung aus mindestens einem Nichtlösungsmittel (S1) und mindestens einem Lösungsmittel (S2) für die Polymerprobe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenanteil an S2 in der mobilen Phase während des Elutionsprozesses stufenweise variiert wird und die Stufen abwechselnd auf- und absteigen.

Description

Hochaufgelöste Flüssigchromatographie basierend auf einem Sägezahngradienten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Polymerprobe , wobei das Verfahren die Durchführung einer Flüssigchromatographie-Analyse an einer Chromatographiesäule mit einer mobilen Phase enthaltend eine Mischung aus mindestens einem Nichtlösungsmittel (Sl) und mindestens einem Lösungsmittel (S2) für die Polymerprobe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenanteil an S2 in der mobilen Phase während des Elutionsprozesses stufenweise variiert wird und die Stufen abwechselnd auf- und absteigen.
Laut IUPAC wird Chromatographie folgendermaßen definiert: „Chromatographie ist eine physikalische Trennmethode in welcher die zu trennenden Komponenten sich zwischen zwei Phasen verteilen, wobei die eine Phase stationär ist (stationäre Phase) und die andere (mobile Phase) sich in eine definierte Richtung bewegt."
Zur Flüssigchromatographie (= liquid chromatography, LC) sagt die IUPAC: „Flüssigchromatographie ist eine Trennmethode, bei der die mobile Phase eine Flüssigkeit ist. Flüssigchromatographie kann in einer Säule oder auf einer Platte durchgeführt werden." Zur Flüssigchromatographie zählen Trennmethoden wie SEC (size exclusion chromatography) , HPLC (high pressure liquid chromatography) und IC (Ionenchromatographie) .
Die Flüssigchromatographie kann noch einmal anhand der Zusammensetzung der mobilen Phase unterteilt werden in isokratische Analyse und Gradientenanalyse.
Bei der isokratischen Analyse bleibt die Zusammensetzung der mobilen Phase über den gesamten Elutionsprozess konstant, wohingegen bei der Gradientenanalyse die Zusammensetzung kontinuierlich oder stufenweise variiert wird.
Polymere sind Makromoleküle die aus Monomeren aufgebaut sind. Durch den sequentiellen Aufbau bzw. die einzelnen Wiederholeinheiten und die entsprechende Reaktionsführung entstehen so Makromoleküle, die in Bezug auf verschiedene Stoffgroßen Verteilungen aufweisen. Je nach chemischer Zusammensetzung können Verteilungen bezüglich der chemischen Funktionalität, der molaren Masse oder in der Struktur auftreten. Die Polydispersität gibt zum Beispiel an, wie eng oder breit die Molmassenverteilung ausfällt.
Da Polymere, insbesondere Copolymere, modifizierte Polymere oder Polymermischungen industriell eine große Bedeutung haben, ist eine effiziente Trennmethode aufgrund der chemischen Struktur von höchstem Interesse. Bisherige Methoden liefern häufig nur Durchschnittswerte (z.B. Größenausschlusschromatographie, SEC) , aus diesem Grund wird gerade an der Polymer-HPLC basierend auf einer Gradientenelution intensiv geforscht.
Aus dem Stand der Technik sind HPLC-Analyseverfahren für Polymere mittels Gradientenanalyse bekannt. Insbesondere W.J. Staal (Dissertation, Universität Eindhoven, 1996) liefert einen guten Überblick über die Entstehung und Entwicklung der Gradientenelutionschromatographie (GPEC) . Eine weitere Übersicht ist in „Gradient HPLC of Copolymers and Chromatographie Cross-Fractionation" von Gottfried Glöckner (Springer Verlag, 1991) zu finden.
EP3170836A1 offenbart eine RP-HPLC (reverse phase) Analysemethode mit einem Stufengradienten, die allerdings für komplexe Polypeptidmischungen wie Glatirameracetat oder ähnliche Mischungen beschrieben wird. Hier wird eine stufenweise Veränderung des Lösungsmittel -
/Nichtlösungsmittelgemisches über die Zeit eingesetzt. In einer besonderen Ausführungsform wird das weniger polare Lösungsmittel alle 4 bis 6 Minuten um 2-4 Vol.-% erhöht. Das Profil gleicht hier also einer Treppenfunktion.
Kajdan et al . (J. Chromatogr . A 1189 (2008) 183-195) offenbaren eine zweidimensionale Gradientenmethode mit einem zackenförmigen Gradienten („spike" gradient) zur Analyse von Polypeptiden. Bei dieser Methode wird die Zusammensetzung der mobilen Phase für eine definierte Zeit beibehalten, bevor wieder die Ursprungszusammensetzung (100% mobile Phase A) hergestellt wird. Dieser Gradient wird jedoch zum Kationenaustausch in der ersten Dimension eingesetzt, wohingegen bei der RP-LC (reversed-phase LC) in der zweiten Dimension ein gewöhnlicher Lineargradient angewendet wird.
Spranger et al . (Environ. Sei. Technol . 2017, 51, 5061-5070) offenbaren ein zweidimensionales Analyseverfahren für atmosphärische HULIS (humic-like substances) , dass SEC (size- exclusion chromatography) in der einen Dimension und RP-HPLC in der anderen Dimension kombiniert. Für die RP-HPLC wird ein neuartiger zackenförmiger Gradient („spike" gradient) angewendet, bei dem der Anteil an organischem Lösungsmittel an der mobilen Phase regelmäßig ansteigt, abfällt und konstant bleibt .
Der Stand der Technik weist jedoch folgende Nachteile auf:
- weiterhin ungenügende Auftrennung von Polymeren gerade in
Bezug auf die Oligomerenauflösung
lange Elutionsdauer
- Verfahren nicht auf Polymere angewendet Es bestand somit der Bedarf, ein Verfahren zur Analyse eines Polymers bzw. einer Polymermischung zur Verfügung zu stellen, das diese Nachteile nicht aufweist.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Analyse einer Polymerprobe, wobei das Verfahren die Durchführung einer Flüssigchromatographie-Analyse an einer Chromatographiesäule mit einer mobilen Phase enthaltend eine Mischung aus mindestens einem Nichtlösungsmittel (Sl) und mindestens einem Lösungsmittel (S2) für die Polymerprobe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenanteil an S2 in der mobilen Phase während des Elutionsprozesses stufenweise variiert wird und die Stufen abwechselnd auf- und absteigen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass ein Gradient mit abwechselnd auf- und absteigenden Stufen, ein sogenannter „Sägezahngradient", eine verbesserte Trennwirkung bei Polymeren und Polymermischungen bewirkt und auch hochmolekulare Polymere gut aufgetrennt werden können.
Figuren :
Figuren 1A-C zeigen den schematischen Aufbau eines 2- dimensionalen Stufengradienten („Sägezahngradient" ) in
Trapezform (1A), in Zickzackform (1B) und in Säulenform (IC). Figur 2A zeigt ein Chromatogramm von PVC gemessen mit einem Lineargradienten, Figur 2B zeigt ein Chromatogramm von PVC gemessen mit einem Stufengradienten, Figur 2C zeigt ein Chromatogramm von PVC gemessen mit einem Sägezahngradienten in Trapezform (vgl. Beispiel 1).
Figur 3A zeigt ein Chromatogramm von PMMA gemessen mit einem Lineargradienten, Figur 3B zeigt ein Chromatogramm von PMMA gemessen mit einem Sägezahngradienten in Trapezform (vgl. Beispiel 3 ) .
Figur 4A zeigt ein Chromatogramm von PPG gemessen mit einem Lineargradienten, Figur 4B zeigt ein Chromatogramm von PPG gemessen mit einem Sägezahngradienten in Trapezform (vgl. Beispiel 3 ) .
Figur 5A zeigt ein Chromatogramm von PDMS gemessen mit einem Lineargradienten, Figur 5B zeigt ein Chromatogramm von PDMS gemessen mit einem Sägezahngradienten in Trapezform (vgl. Beispiel 3 ) .
Figur 6A zeigt ein Chromatogramm von PMMA 690.000 gemessen als 2-dimensionaler Sägezahngradient in Trapezform, Figur 6B zeigt ein Chromatogramm von PMMA 690.000 gemessen als 3 -dimensionaler Sägezahngradient in Trapezform (vgl. Beispiel 4).
Figur 7 zeigt ein Chromatogramm einer Mischung von PDMS, PMMA und PPG ähnlicher mittlerer molarer Masse gemessen mit Sägezahngradient in Trapezform (vgl. Beispiel 5).
Def initionen :
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse einer Polymerprobe, wobei das Verfahren die Durchführung einer Flüssigchromatographie-Analyse an einer Chromatographiesäule mit einer mobilen Phase enthaltend eine Mischung aus mindestens einem Nichtlösungsmittel (Sl) und mindestens einem Lösungsmittel (S2) für die Polymerprobe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenanteil an S2 in der mobilen Phase während des Elutionsprozesses stufenweise variiert wird und die Stufen abwechselnd auf- und absteigen.
Eine Polymerprobe im Sinne der vorliegenden Erfindung kann ein Polymer oder eine Polymermischung sein.
Unter einem Polymer im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein chemischer Stoff zu verstehen, der aus konstitutionellen Repetiereinheiten besteht und eine mittlere molare Masse in einem Bereich von einigen Tausend bis zu mehreren Millionen g/mol aufweist, dies umfasst sowohl Homopolymere als auch Copolymere. Beispiele für solche Polymere sind organische synthetische Polymere wie Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylacetat, Polycarbonat, Poly (meth) crylate, Polystyrol, Polyacrylnitril, Polyvinylidenchlorid, Polyvinylfluorid, Polyvinylidenfluorid, Polyvinylidencyanid, Polybutadien, Polyisopren, Polyether, Polyester, Polyamid, Polyimid, Polysiloxane, Polysilane, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Polyethylenglykol sowie deren Derivate und Copolymere, und natürliche Polymere wie Cellulose, Stärke, Casein und natürliches Gummi, sowie halbsynthetische hochmolekulare Verbindungen wie Cellulosederivate, z. B. Methylcellulose, Hydroxymethylcellulose und Carboxymethylcellulose . Eine Polymermischung enthält vorzugsweise mindestens zwei Polymere dieser Gruppe.
Unter Poly (meth) acrylaten im Sinne der vorliegenden Erfindung sind sowohl Polyacrylate und Polymethacrylate als auch Polyalkylacrylate und Polyalkylmethacrylate zu verstehen, wobei Alkyl bevorzugt ein linearer oder verzweigter Ci-C2o- Kohlenwasserstoffrest ist. Beispiele für Poly (meth) acrylate sind Polymethyl (meth) acrylate , Polyethyl (meth) acrylate ,
Polybutyl (meth) acrylate, Polyisobutyl (meth) acrylate .
Unter Polysiloxanen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zu verstehen
( Si04 /2 ) a (RxSi03 /2 ) b (Rx 2 Si02 /2 ) c ( Rx 3S i01/2 ) d (I) , wobei Rx unabhängig voneinander Wasserstoff, unverzweigter, verzweigter, acyclischer oder cyclischer, gesättigter oder einfach oder mehrfach ungesättigter C1-C20- Kohlenwasserstoffrest , Hydroxyrest, Vinylrest, Alkoxyrest, Aminogruppe, Halogen oder Silyloxyrest der allgemeinen Formel (II )
(Si04/2)e(RySi03/2)f (Ry 2Si02/a)g(Ry 3Si0i/2)h (II) , in der Ry unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, unverzweigter, verzweigter, linearer, acyclischer oder cyclischer, gesättigter oder mehrfach gesättigter Ci-C20- Kohlenwasserstoffrest bedeuten, wobei einzelne Kohlenstoffatome durch Sauerstoff, Halogen, Stickstoff oder Schwefel ersetzt sein können,
bedeuten, und a, b, c , d, e, f, g und h j eweils unabhängig voneinander ganzzahlige Werte im Bereich von 0 bis 100.000 bedeuten, wobei die Summe aus a, b, c, und d bzw. e, f, g und h jeweils mindestens den Wert 1 annimmt. Bevorzugte Reste Rx bzw. Ry sind die Reste Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, Phenyl und Chlor, wobei Methyl am meisten bevorzugt ist. Beispiele für Polysiloxane sind Polydimethylsiloxan und Aminopolydimethylsiloxan .
Die Polymere werden üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 1.000-2.000.000 g/ ol eingesetzt. Polyvinylchlorid wird üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 20.000-1.000.000 g/mol eingesetzt, Pol (meth) acrylate werden üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 15.000-2.000.000 g/mol eingesetzt, Polysiloxane und Polysilane werden üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 1.000-500.000 g/mol eingesetzt, Polystyrol wird üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse im Bereich von 8.000-2.000.000 g/mol eingesetzt, Polypropylenglykol wird üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse in einem Bereich von 4.000-30.000 g/mol eingesetzt, Polyvinylalkohol und Polyvinylacetat werden üblicherweise mit einer mittleren molaren Masse in einem Bereich von 1.000-100.000 g/mol eingesetzt.
Bei den Chromatographiesäulen gibt es im Allgemeinen keine Einschränkungen. Als Chromatographiesäulen können alle dem Fachmann für die Flüssigchromatographie bekannten Säulen, insbesondere handelsübliche Säulen, eingesetzt werden, also SEC-Säulen, HPLC-Säulen und IC-Säulen. Bevorzugt sind SEC- Säulen und HPLC-Säulen, wobei HPLC-Säulen besonders bevorzugt sind .
Die mobile Phase, die für die Flüssigchromatographie-Analyse eingesetzt wird, enthält eine Mischung aus mindestens einem Lösungsmittel (S2) und mindestens einem Nichtlösungsmittel (Sl) für die Polymerprobe. Unter Nichtlösungsmittel sind dabei alle Flüssigkeiten zu verstehen, in denen die Löslichkeit einer Polymerprobe geringer ist als im Lösungsmittel. Aus der Fachliteratur (z.B. Polymer Data Handbook, 2. Auflage, 2009, Oxford University Press) kann der Fachmann entnehmen, welche Flüssigkeiten für welches Polymer oder welche Polymermischung jeweils als Lösungsmittel oder Nichtlösungsmittel eingesetzt werden können.
Lösungsmittel und Nichtlösungsmittel können beispielsweise unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Tetrahydrofuran (THF) , Toluol, Cyclohexan, Diethylether , Tetrachlormethan, Dichlormethan, Chloroform, 1,4- Dioxan, N, -Dimethylacetamid, N, -Dimethylformamid , Benzylalkohol, Methylethylketon, Ethylacetat, Aceton, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Hexafluorisopropanol , 2- Propanol, Methanol, Wasser und Mischungen derselben. Bevorzugt werden Lösungsmittel und Nichtlösungsmittel unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus THF, Hexafluorisopropanol , Methanol, Aceton, Wasser und Mischungen derselben .
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird mit S1 das
Nichtlösungsmittel und mit S2 das Lösungsmittel bezeichnet. Zu Beginn der Elution wird eine Mischung eingesetzt, bei der S2 einen bestimmten Anteil in Volumen-% aufweist, dieser Anteil wird Startanteil (SA) genannt. Üblicherweise wird zu Beginn der Elution eine Mischung von S1 : S2 = 100 : 0 Vol.-% eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Analyseverfahren kann mehrdimensional durchgeführt werden und kann daher als n-dimensional bezeichnet werden, wobei sich die Anzahl der Dimensionen auf die Anzahl der eingesetzten flüssigen Komponenten der mobilen Phase bezieht .
Die Variation des Volumenanteils an S2 erfolgt stufenweise, wobei die Stufen abwechselnd auf- und absteigen (vergleiche Fig. 1) . Die Form der Stufen kann vom Fachmann beliebig gewählt werden, indem verschiedene der nachfolgend beschriebenen Parameter verändert werden.
Um die Stufen zu beschreiben, wird über das Säulenvolumen t' ein Zeitabschnitt t berechnet (Formeln 1 und 2), der dem Gradienten zugrunde liegt. Im Allgemeinen ist t' frei wählbar in einem Bereich von 0,1 mL bis 1,2 mL .
t = - (2)
F Tabelle 1: Definition der Parameter
Über die Parameter A, B, C, D und E ist es möglich, Stufen in Säulenform, in Trapezform, in Zick- Zack oder „Sägezahnform" zu definieren (vergleiche Fig. 1A-C) .
In einer besonderen Ausführungsform (2 -dimensional ) besteht die mobile Phase aus einem Nichtlösungsmittel S1 und einem Lösungsmittel S2 und die Zusammensetzung der mobilen Phase wird über die Zeit folgendermaßen variiert,
wobei die Parameter A, B, C, D und E frei aus den folgenden Bereichen ausgewählt werden A: 0,01 - 100 Vol.-% S2 und B: 0,01 - 100 Vol . - % S2 und C: 0 - 100 und D: 0 - 100 und E: 0 - 100.
Die Zusammensetzung der mobilen Phase berechnet sich anhand der nachfolgenden Formeln (3-5), die den 2 -dimensionalen Sägezahngradienten beschreiben (vergleiche Fig. 1 und Tabelle 2) :
L = t + C - t + D - t + E - t (3)
H— A + B ( 5 )
Jede Stufe x beginnt mit einem Zeitabschnitt t, für dessen Dauer der Anteil an S2 auf dem „Startanteil" (SAn) für die jeweilige Stufe gehalten wird, SAn = SA + (x-l)*B.
Während des anschließenden Zeitabschnitts C-t wird der Anteil an S2 um den Anteil A (z.B. 6 Vol.-%) verringert, er beträgt
(SA + (x-1) *B - A) .
Während des anschließenden Zeitabschnitts D-t werden diese Anteile konstant gehalten.
Während des anschließenden Zeitabschnitts E-t wird für S2 der Startanteil um den Anteil B (z.B. 0,2 Vol.-%) erhöht und beträgt somit (SA + x*B) . Diese Anteile entsprechen den Endwerten der jeweiligen Stufe und gleichzeitig dem Startanteil für die nächste Stufe. Anschließend beginnt die nächste Stufe. Der Anteil an S1 beträgt jeweils (100 - S2) Vol.-%.
Mehrere Stufen lang werden am Anfang wegen der absteigenden Stufen negative Werte für den Anteil S2 berechnet. Diese negativen Werte sind allerdings mathematisch unsinnig und werden daher mit dem Startanteil an S2 gleichgesetzt bis ein positiver Wert für S2 berechnet wird.
In Tabelle 2 ist diese Veränderung der Zusammensetzung noch einmal mathematisch exemplarisch für die ersten zwei Stufen wiedergegeben. Diese Berechnung setzt sich entsprechend weiter fort bis zur letzten Stufe, bei der ein Anteil an S2 von 100 Vol.-% erreicht ist.
Die Anzahl der notwendigen Stufen kann über Formel 4 berechnet werden .
Tabelle 2 : Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase über die Zeit für den 2 -dimensionalen Sägezahngradienten
Tabelle 3 : Beispielrechnung des Anteils an S2 für A = 6 Vol . -%, B = 0,2 Vol . - %, C = 1, D = 3, E = 1
Bei Verwendung eines 2 -dimensionalen Sägezahngradienten sind die flüssigen Komponenten vorzugsweise THF und Methanol.
In einer weiteren Ausgestaltung dieser Ausführungsform wird das Verfahren mindestens einmal jeweils mit einer anderen mobilen Phase wiederholt, indem jeweils das vorherige Lösungsmittel als Nichtlösungsmittel dient und ein neues Lösungsmittel gewählt wird .
Dieses spezielle Verfahren eignet sich besonders für die Analyse von Polymermischungen. Dabei wird das Nichtlösungsmittel jeweils so gewählt, dass es zumindest für einen Teil der Polymere in der Polymermischung als Lösungsmittel geeignet ist. Auf diese Weise wird über die unterschiedliche Löslichkeit der Polymere in den verschiedenen mobilen Phasen eine Auftrennung der Polymermischung in die einzelnen Polymere erreicht. So wird beispielsweise im ersten Durchgang Methanol als Nichtlösungsmittel eingesetzt und Aceton als Lösungsmittel, im zweiten Durchgang wird Aceton als Nichtlösungsmittel eingesetzt und THF als Lösungsmittel. Dieses Verfahren ist ein Spezialfall des 2 -dimensionalen Gradienten.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform ( 3 -dimensional) besteht die mobile Phase aus zwei Nichtlösungsmitteln S1 und Sl' und einem Lösungsmittel (S2), und die Zusammensetzung der mobilen Phase wird über die Zeit folgendermaßen variiert,
wobei die Parameter A, B, C, D und E frei aus den folgenden Bereichen ausgewählt werden A: 0,01 - 100 Vol.-% S2 und B: 0,01 - 100 Vol . - % S2 und C: 0 - 100 und D: 0 - 100 und E: 0 -
100.
Die Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase berechnet sich anhand der nachfolgenden Formeln (6) und (7), die den 3- di ensionalen Sägezahngradienten beschreiben (vergleiche Tabelle 4 ) : 0,01 + t + E t (6)
100 % S2
Lges ~ ^ (7)
B
Jede Stufe x beginnt mit einem Zeitabschnitt t, für dessen Dauer der Anteil an Sl, S2 und S1 ' auf dem „Startanteil" (SAn) für die jeweilige Stufe gehalten wird, SAn = SA + (x-l)*B, Bei Stufe 1 entspricht der Anteil an S2 dem Startanteil SA.
Während des anschließenden Zeitabschnitts C-t wird der Anteil an S2 um A verringert auf (SA + (x-l)*B - A) . Der Anteil an Sl beträgt (100 - S2) Vol-%. Der Anteil an Komponente Sl' beträgt 0 Vol
Während des anschließenden Zeitabschnitts D-t werden die vorherigen Anteile an Sl, S2 und Sl' konstant gehalten.
Während des anschließenden Zeitabschnitts wird 0,01 Sekunden lang S2 weiterhin konstant gehalten. Der Anteil an Sl' beträgt nun jedoch (100 - S2) Vol.-% und der Anteil an Sl beträgt 0 Vol. -%.
Während des anschließenden Zeitabschnitts t werden die vorherigen Anteile an Sl, S2 und Sl ' konstant gehalten.
Während des anschließenden Zeitabschnitts E-t wird der Startanteil an S2 um den Anteil B (z.B. 0,2 Vol.-%) erhöht auf (SA + x*B) . Der Anteil an Sl' beträgt nun (100 - S2) Vol.-% und der Anteil an Sl beträgt weiterhin 0 Vol.-%.
Diese Anteile entsprechen den Endwerten der jeweiligen Stufe und gleichzeitig dem „Startanteil" für die nächste Stufe.
Anschließend beginnt die nächste Stufe.
Mehrere Stufen lang werden am Anfang wegen der absteigenden Stufen negative Werte für den Anteil S2 berechnet. Diese negativen Werte sind allerdings mathematisch unsinnig und werden daher solange mit dem Startanteil SA an S2 gleichgesetzt bis ein positiver Wert für S2 berechnet wird.
In Tabelle 4 sind diese Veränderungen der Zusammenset ung noch einmal mathematisch exemplarisch für die ersten zwei Stufen wiedergegeben. Diese Berechnung setzt sich entsprechend weiter fort bis zur letzten Stufe, bei der ein Anteil an S2 von 100 Vol.-% erreicht ist.
Die Anzahl der notwendigen Stufen kann über Formel 7 berechnet werden .
Tabelle 4: Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase über die Zeit für den 3 -dimensionalen Sägezahngradienten
Die Parameter A, B, C, D und E können im Allgemeinen frei aus den folgenden Bereichen ausgewählt werden
A: 0,01 - 100 Vol. -% S2
und B: 0,01 - 100 Vol.-% S2
und C: 0 - 100
und D : 0 - 100
und E : 0 - 100.
Die einzige Beschränkung stellen hier möglicherweise die technischen Details des LC-Gerätes sowie der Pumpe dar. Bevorzugt sind die Werte C, D und E größer als 0.
Bevorzugt werden die Parameter A, B, C, D und E aus den folgenden Bereichen ausgewählt
A: 3,0 - 12,0 Vol . -% S2
und B: 0,2 - 1,0 Vol. -% S2
und C : 0,5 - 3,0
und D : 0,5 - 3,0
und E : 0,1 - 2,0.
Besonders bevorzugt weisen die Parameter A, B, C, D und E die folgenden Werte auf: A: 6,0 Vol.-% und B : 0,2 Vol . und C : 1,0 und D : 3,0 und E : 2,0.
Beispiele
Verwendete Materialien:
HPLC : 1) ThermoFisher Scientific Ultimate 3000 mit binärer
Pumpe
2) ThermoFisher Scientific Ultimate 3000 mit quaternärer Pumpe
3) ThermoFisher Scientific Vanquish UHPLC mit
Diodenarray Detektor HL (Detektionswellenlänge 215 nm)
Detektor : Agilent 385 ELSD
Säule 1: Poroshell C18 , 50 x 4,6 mm, 2,7 pm (Agilent)
Säule 2 : Poroshell C18, 100 x 4,6 mm, 2,7 pm (Agilent)
Säule 3 : Hypersil BDS C18, 100 x 4,6 mm, 2 , 4 pm (ThermoFisher) Säule 4 : Luna C18 , 100 x 4,6 mm, 5 pm (Phenomenex)
Säule 5: Hypersil Gold C18 aQ, 100 x 10 mm, 5 pm
(ThermoFisher)
Säule 6 : Accucore C18, 50 x 4,6 mm, 2,6 pm (ThermoFisher) Säule 7 : Poroshell HILIC, 50 x 4.6 mm, 2.7 pm (Agilent)
Für die mobile Phase wurden verwendet:
Tetrahydrofuran (nicht stabilisiert, HPLC grade, Merck Darmstadt) , Methanol (HPLC grade, Merck Darmstadt) und Reinstwasser (Leitfähigkeit 18.5 MOhrrucm, TOC-Wert <4 ppb) .
Tabelle 5: Übersicht der eingesetzten PolymerStandards
Vorversuche Parameteroptimierung
Als Testanalyt wird Polystyrol (Mp = 19.600 g/mol, Polydispersität 1,03 von PSS Polymer Standard Services, Mainz) eingesetzt. Polystyrol wird mit einer Konzentration von c = 25 mg/ml in THF gelöst, das Injektionsvolumen beträgt 5 mΐ . Die Analyse findet an HPLC-Gerät 2 statt.
Die Parameter zur Optimierung des Sägezahngradienten werden basierend auf Taguchis L16 (45) Versuchsplandesign abgewandelt
(„The Taguchi Approach to Parameter Design", 1986, ASQC Conference Proceedings ; „Taguchi 's quality engineering handbook", 2011, John Wiley & Sons), siehe Tabelle 2.
Als Zielgrößen wurden (1) die Anzahl der abgetrennten Peaks, (2) die Auflösung, (3) die Asymmetrie und (4) die Peakbreite in halber Höhe optimiert. Die Variation der Parameter kann Tabelle 2 entnommen werden. Zudem wurde die Versuchsreihe an fünf verschiedenen kommerziell erhältlichen Ghromatographiesäulen durchgeführt .
Es zeigt sich, dass für die Anzahl der Peaks und damit die Qualität der Polymer-Auflösung hauptsächlich der Parameter B verantwortlich ist. Die anderen Zielgrößen zeigten im Vergleich dazu einen geringeren Einfluss.
Die optimierten Parameter können für jede Säule Tabelle 6 entnommen werden. Es zeigt sich, dass die optimalen Werte für die Parameter A-E recht ähnlich sind und somit eher nicht von der Säule abhängig sind. Daher wird ein allgemein anwendbares Optimum angenommen (vgl. letzte Zeile in Tabelle 6) . Tabelle 6 : Parameter zur Optimierung des Sägezahngradienten
Tabelle 7 : Bestätigungsexperimente des Versuchsplans zur
Optimierung
Beispiel 1
In Bezug auf die Gesamtlaufzeit ist ebenfalls die effektive Stufenhöhe B von entscheidender Bedeutung. Je mehr Schritte durchlaufen werden, desto besser wird die Auflösung, desto länger aber auch die Gesamtmesszeit. Soll die Messzeit bei kleinster effektiver Stufenhöhe verkürzt werden, muss die effektive Stufenlänge betrachtet werden. Dadurch, dass diese Größe sich aus den einzelnen fest definierten Teilschritten zusammensetzt, welche auf Grund der Genauigkeit des Gradientenmischers der eingesetzten Pumpe, nicht mehr weiter verkürzt werden können, muss eine andere Möglichkeit gefunden werden. Ein weiterer entscheidender Parameter, der in die Berechnung der effektiven Stufenlänge eingeht, ist der LC- Fluss .
HPLC-Gerät 1 mit Säule 6
Konzentration Polymer: 90 mg/ml PDMS mit Mp = 36500 g/mol
Injektionsvolumen: 5 mΐ
Flussrate: 1 ml/min, 2 ml/min, 3 ml/min t = 0 , 1 min
A = 6 Vol . -%
B = 0,2 Vol . - %
C = 1
D = 3
E 1 L = 0,2 min/ 0 , 3 min / 0,6 min
H = 6 , 2 Vol . -%
Es zeigt sich, dass sich durch eine Erhöhung der Flussrate von 1 mL/min auf 3 mL/min die Messzeit um den Faktor 3 reduzieren lässt, ohne eine Verschlechterung der Auflösung zu erhalten.
Beispiel 2
Es wird ein Vergleich von Lineargradient, Stufengradient mit ausschließlich ansteigenden Stufen und Sägezahngradient durchgeführt, wobei PVC 45.500 als Testanalyt dient (PVC 45.500 g/mol, Polymer Laboratories).
HPLC-Gerät 1 mit Säule 6
Konzentration Polymer: 100 mg/ml
Injektionsvolumen: IpL (Fig. 2A und 2B) , 3 mΐ (Fig. 2C)
Flussrate: 1 ml/min
Startbedingung 0% THF/ 100% Methanol, Endbedingung 100% THF/0% Methanol (für alle Gradienten) t = 0 , 1 min
A = 6 Vol . -%
B = 0,2 Vol.-% (sowohl Stufengradient als auch Sägezahngradient haben eine effektive Stufenhöhe von 0,2 Vol.-%)
C = 1
D = 3
E = 1
L = 1 , 5 min
H = 6 , 2 Vol . - %
Das Auflösungsvermögen des Sägezahngradienten ist im Vergleich zu den anderen Analysetechniken signifikant verbessert, was an der erhöhten Peakanzahl deutlich zu erkennen ist (vergleiche Figur 2 ) .
Beispiel 3
Es wird ein Vergleich von Lineargradient und Sägezahngradient an verschiedenen Polymeren an unterschiedlichen Säulen durchgeführt, die Versuchsbedingungen können Tabelle 8 entnommen werden . HPLC-Gerät 1 mit Säule 6 oder Säule 7
Konzentration Polymer: 15 mg/ml
Injektionsvolumen: 4 mΐ
Flussrate: 1 ml/min t 0,25 min
A = 6 Vol . - %
B = 1 Vol . -%
C = 1
D = 3
E = 1
L = 0 , 6 min
H = 7 Vol . -%
Tabelle 8 : Versuchsbedingungen Beispiel 3
Für alle Polymere zeigt sich eine deutlich verbesserte Auflösung bei Anwendung des Sägezahngradienten, die sich in erhöhter Peakanzahl und verbesserter Peakform äußert . Dies wird exemplarisch an PMMA und PPG auf Säule 6 und an PDMS auf Säule 7 gezeigt (vgl. Figuren 3-5) .
Beispiel 4
Es wird eine HPLC-Analyse mit 3 -dimensionalem Sägezahngradienten zur Trennung von PMMA 690.000 durchgeführt. Die Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase erfolgt wie zuvor für den 3 -dimensionalen Sägezahngradienten beschrieben (Tabelle 4) . Als flüssige Komponenten werden eingesetzt: S2 = THF , S1 = Wasser, Sl' = Methanol. Zum Vergleich wird dieselbe Analyse auch mit 2 -dimensionalem Sägezahngradienten durchgeführt (vgl. Figur 6).
HPLC-Gerät 2 mit Säule 6
Konzentration Polymer: 15 mg/ml
Injektionsvolumen: 4 mΐ
Flussrate: 2 ml/min t = 0,25 min
A = 6 Vol . -%
B = 1 Vol . -%
C = 1
D = 3
E = 1
L = 0,6 min
H = 7 Vol . -%
Beispiel 5
Es wird eine HPLC-Analyse zur Trennung von 3 Polymeren (PMMA 19.700, PPG 18.000, PDMS 20.800) ähnlicher mittlerer molarer Masse durchgeführt (vgl. Fig. 7) . Hierzu wird ein 2- dimensionaler Sägezahngradient zweimal hintereinander mit einer anderen mobilen Phase angewendet. Sägezahngradient 1 läuft von 100 Vol.-% Methanol (0 Vol.-% Aceton) nach 100 Vol.-% Aceton (0 Vol.-% Methanol) in 30 Minuten. Anschließend läuft
Sägezahngradient 2 von 100 Vol.-% Aceton (0 Vol.-% THF) nach 100 Vol.-% THF (0 Vol.-% Aceton) ebenfalls in 30 Minuten.
(Gesamtlaufzeit 60 Min) .
HPLC-Gerät 2 mit Säule 6
Konzentration der Polymere: jeweils 20 mg/mL Injektionsvolumen: 5 pL
Flussrate: 2 mL/min
Parameter :
t = 0,25 min
A = 6 Vol . -%
B = 1 Vol . -%
C = 1
D = 3
E = 1
L = 0 , 6 min
H 7 Vol . -%
Die Beispiele 1-5 zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren auf eine Vielzahl von Polymeren auch mit sehr großen mittleren molaren Massen anwendbar ist und auch eine Vielzahl von
Chromatographiesäulen eingesetzt werden kann. Einzige Voraussetzung für die Eignung ist, dass eine grundsätzliche Retention des zu untersuchenden Analyten an der Säule gewährleistet ist. Dies zählt jedoch zum allgemeinen Fachwissen des Fachmannes.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Analyse einer Polymerprobe, wobei das Verfahren die Durchführung einer Flüssigchromatographie- Analyse an einer Chromatographiesäule mit einer mobilen Phase enthaltend eine Mischung aus mindestens einem Nichtlösungsmittel (Sl) und mindestens einem Lösungsmittel (S2) für die Polymerprobe umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenanteil an S2 in der mobilen Phase während des Elutionsprozesses stufenweise variiert wird und die Stufen abwechselnd auf- und absteigen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufen säulenförmig, trapezförmig, zick- zackförmig oder sägezahnförmig sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Polymerprobe ein Polymer ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Polymerprobe ein
Polymer ist, das aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polypropylen,
Polyvinylacetat, Polycarbonat, Poly (meth) acrylate ,
Polystyrol, Polyacrylnitril, Polyvinylidenchlorid,
Polyvinylfluorid, Polyvinylidenfluorid,
Polyvinylidencyanid, Polybutadien, Polyisopren, Polyether, Polyester, Polyamid, Polyimid, Polysiloxane, Polysilane, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Polyethylenglykol sowie deren Derivate und Copolymere, und natürliche Polymere wie Cellulose, Stärke, Casein und natürliches Gummi, sowie halbsynthetische hochmolekulare Verbindungen wie Cellulosederivate, z. B. Methylcellulose, Hydroxymethylcellulose und Carboxymethylcellulose ausgewählt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Polymerprobe ein Polymergemisch ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Polymerprobe ein
Polymergemisch ist, das mindestens zwei Polymere der Gruppe bestehend aus Polyvinylchlorid, Polyethylen,
Polypropylen, Polyvinylacetat, Polycarbonat,
Poly (meth) acrylate, Polystyrol, Polyacrylnitril,
Polyvinylidenchlorid, Polyvinylfluorid,
Polyvinylidenfluorid, Polyvinylidencyanid, Polybutadien, Polyisopren, Polyether, Polyester, Polyamid, Polyimid,
Polysiloxane, Polysilane, Polyvinylalkohol,
Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Polyethylenglykol sowie deren Derivate und Copolymere, und natürliche Polymere wie Cellulose, Stärke, Casein und natürliches Gummi, sowie halbsynthetische hochmolekulare Verbindungen wie Cellulosederivate, z. B. Methylcellulose,
Hydroxymethylcellulose und Carboxymethylcellulose enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei die mobile Phase aus einem Nichtlösungsmittel S1 und einem Lösungsmittel S2 besteht und die Zusammensetzung der mobilen Phase über die Zeit folgendermaßen variiert wird,
wobei die Parameter A, B, C, D und E frei aus den folgenden Bereichen ausgewählt werden A: 0,01 - 100 Vol.-% S2 und B: 0,01 - 100 Vol.-% S2 und C: 0 - 100 und D: 0 100 und E: 0 - 100.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei die mobile Phase aus zwei Nichtlösungsmitteln S1 und Sl' und einem Lösungsmittel S2 besteht, und die Zusammensetzung der mobilen Phase über die Zeit folgendermaßen variiert wird,
wobei die Parameter A, B, C, D und E frei aus den folgenden Bereichen ausgewählt werden A; 0,01 - 100 Vol.-% S2 und B: 0,01 - 100 Vol.-% S2 und C: 0 - 100 und D: 0 - 100 und E : 0 - 100.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Verfahren mindestens einmal jeweils mit einer anderen mobilen Phase wiederholt wird, indem jeweils das vorherige Lösungsmittel als Nichtlösungsmittel dient und ein neues Lösungsmittel gewählt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei
Lösungsmittel und Nichtlösungsmittel unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus THF, Toluol, Cyclohexan, Diethylether , Tetrachlormethan, Dichlormethan, Chloroform, 1,4-Dioxan, N,N-
Dimethylacetamid, N, -Dimethylformamid, Benzylalkohol, Methylethylketon, Ethylacetat, Aceton, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Hexafluorisopropanol , 2 -Propanol,
Methanol, Wasser und Mischungen derselben.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei Lösungsmittel und Nichtlösungsmittel unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus THF , Hexafluorisopropanol , Methanol, Aceton, Wasser und Mischungen derselben.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7-11, wobei die
Parameter A, B, C, D und E aus den folgenden Bereichen ausgewählt werden
A: 3,0 - 12,0 Vol . -% S2
und B: 0,2 - 1,0 Vol.-% S2
und C : 0,5 - 3,0
und D : 0,5 - 3,0
und E : 0,1 - 2,0.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Parameter A, B, C, D und E die folgenden Werte aufweisen: A: 6,0 Vol.-% und B : 0,2 Vol . - % und C : 1,0 und D : 3,0 und E : 2,0.
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