EP3793720A1 - Mikroarray-transformer - Google Patents

Mikroarray-transformer

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EP3793720A1
EP3793720A1 EP19724814.9A EP19724814A EP3793720A1 EP 3793720 A1 EP3793720 A1 EP 3793720A1 EP 19724814 A EP19724814 A EP 19724814A EP 3793720 A1 EP3793720 A1 EP 3793720A1
Authority
EP
European Patent Office
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array
dna
molecules
template
spots
Prior art date
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Pending
Application number
EP19724814.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Günter Roth
Stefan Daniel KRÄMER
Johannes Wöhrle
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biocopy GmbH
Original Assignee
Biocopy GmbH
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
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Definitions

  • the invention relates to a method for microarray transformation in which, by using a transformation matrix cavity chip, a template array can be copied onto a planar support and the information or spatial arrangement is thereby changed so that a transformed second array results.
  • the invention also relates to a device for carrying out such a method.
  • DNA microarrays are an accumulation of many different, small dots (spots) with DNA on a solid substrate.
  • spots small dots
  • a relatively novel method for the production of DNA microarrays is to synthesize the DNA on the surface by means of a polymerase using a DNA template (W02009034181A2, W02010100265A1). This is a fixed
  • primers synthesis starting points for the DNA polymerase.
  • a mix consisting of the individual synthesis building blocks, the DNA polymerase and the template is added to this very surface.
  • the synthesis is highly parallel up to several thousand points.
  • the reaction space of each of these points was physically separated to ensure an independent synthesis reaction. This can represent a spatial separation over microcavities to the limitation of the diffusion.
  • complementary DNA strands from DNA pools are hybridized to an existing DNA microarray.
  • the complementary DNA molecules each have a reactive group with which it is possible to attach them to a second substrate in which both are brought into contact.
  • This substrate now contains the complementary DNA molecules of the original DNA microarray and has the same local resolution.
  • a copy produced in this way is comparable to the negative of an analogous photograph ([4], [5], [6], [1 1], [12], US20060141245A1),
  • hybridized DNA molecules are significantly shorter than the DNA molecules of the DNA microarray to be amplified.
  • the hybridized DNA molecules in this case serve as primers for a DNA extension reaction using DNA polymerase.
  • the polymerase is an enzyme that can extend a DNA strand based on a template accordingly.
  • a master cavity chip has DNA primers on its surface that are complementary to the DNA of an existing DNA microarray. This chip is filled with PCR mix and placed on the DNA microarray to be replicated. By means of a PCR, the information of the DNA of the DNA microarray is transferred into the master cavity chip and stored. In a second step, the cavity chip is filled again with PCR mix and closed with an empty microarray. Subsequently, another PCR is performed to transfer the DNA molecules from the master cavity chip to the new surface. This thus represents an exact replica of the original DNA microarray. (W02010100265A1)
  • Output array always determines the shape of the spots and determined. Besides, they are
  • an array is basically printed by a printer during a copying process.
  • a single DNA sample must be used, which requires a lengthy preparation. This makes the process time consuming and costly.
  • lengthy washing between printing operations is necessary to prevent and reduce contamination between spots.
  • the spacing of the spots is chosen to be sufficiently large to prevent running into one another and contamination.
  • Another disadvantage of the prior art methods is that the shape of the spots is very limited and only near-round spots are possible.
  • the drying of the liquid spots has an effect on the homogeneity of the spots, so that there is a difference in the result between the edge area and the center of the spot.
  • Each step of the synthesis requires a single mask and extends the DNA strand by only one base. There is a certain percentage of errors per step. As a result, the length of the DNA strand affects the quality of the result. After each step of the synthesis, a washing step must be performed and the mask replaced, making the method time-consuming and costly.
  • the design of an array can only be costly and costly
  • DNA is distributed digitally and randomized in a glass cavity chip and amplified by PCR.
  • the production of the glass cavity chips is very complicated, and the patterns and spot shapes are limited to round and hexagonal arrangements. Furthermore, several different cavity shapes on an array are not possible. Operations such as zooming in and out are not possible with this method. It is also not possible to move spots or spot merging. A transformation of arrays is therefore excluded.
  • the challenge or the task here is to get the information of the original one
  • Microarrays of the prior art can not be changed after their production, except possibly extend or shorten. However, this is often only possible to a limited extent due to the poor quality of the primary DNA. Furthermore, existing formats of microarrays can not be "reformatted” purely physical, i. you always have to adapt the experiments and devices to the existing microarrays or do without experiments if suitable microarrays are not available. In addition, two microarrays can not be "put together" into one after their production.
  • the invention relates to a method of microarray transformation comprising the following steps a) providing a template array, wherein the template array comprises a plurality of spots with template molecules and wherein the template molecules are preferably oligonucleotides, b) providing a cavity chip comprising a transfer matrix, c) providing a reaction mixture in the cavity chip, d) placing the precursor array on the cavity chip, e) copying process, wherein the oligonucleotides of the spots of the precursor array are copied onto the cavity chip f) providing an array surface.
  • the invention thus provides a microarray which, in comparison to a
  • Transfer matrix is the arrangement of the cavities and their design as well as their properties.
  • reaction mixture and / or other reaction components are precoated in the cavity chip.
  • Special cavity chips can be generated with any shape. These include small cavities with a specific shape in which the template molecules of the original microarray can be stored.
  • RNA to cDNA wherein the sequence information is retained. It is also possible that the original template molecules or a part thereof are transferred to the cavity chip.
  • an original oligonucleotide microarray (particularly preferably a DNA microarray) having a geometry 1, is transferred into a cavity chip with a geometry 2.
  • the transmission can preferably take place by means of a PCR. But here are others too Methods with which biomolecules, such as DNA can be amplified, for example, isothermal DNA amplification, HDA, RPA or LAMP possible.
  • the choice of primers during this transfer reaction which is also referred to as copying process in the context of the invention, also determines which spots of the original arrays are transmitted.
  • the geometry 2 of the cavity chip can be transferred to a planar support, also referred to as an array surface, whereby a second-order microarray is formed.
  • another transformation step can be carried out, into a cavity chip of geometry 3, whereby a 3rd order array is created. In principle, it is possible to reorder the original microarray in any order step by step.
  • copying means both the 1: 1 copy (that is, for example DNA to DNA) and also other methods in which the information is copied, but the product differs from the starting molecule, e.g. DNA to protein, RNA to cDNA, RNA to protein or DNA to RNA.
  • a product molecule different from the parent molecule is also called a derivative. All derivatives and derivatives of the starting molecules are possible and the person skilled in the art knows how to prepare the respective product molecules.
  • RNA polymerase is used for the conversion of DNA to RNA.
  • a reverse transcriptase is preferably used for the conversion of RNA into cDNA.
  • DNA and / or RNA into proteins are preferably cell-free in vitro
  • Transcriptional and / or translational mixes used. If DNA is to be copied to DNA, polymerases, RPA (Replication Protein A) or a system for helicase-dependent amplification (HDA) can be used.
  • RPA Replication Protein A
  • HDA system for helicase-dependent amplification
  • a typical transformation process is preferably as follows:
  • reaction mix e.g. PCR mix or cell-free expression system
  • the optional steps can be combined as desired.
  • the resulting shape of the resulting transformed spot is given here by the shape of the cavity of the cavity chip.
  • the above-described process can also be used repeatedly and also again on already transformed arrays.
  • the spatial arrangement e.g. the resulting pattern is preferably defined by the first copying step in the cavity chip.
  • a modification of the molecules can also take place after that, so that a transformation of the information can take place at several points in time.
  • sequence information e.g. a sequence information is retained.
  • this also includes the translation of DNA or RNA into peptide sequences.
  • steps a) to e) be repeated at least once, wherein the same cavity chip but another template array or the same template array is used in another or the same orientation.
  • the template array and cavity chip are in a different orientation with respect to the repetitions. This can e.g. done by rotation of the cavity chip.
  • the orientation may also be consistent, e.g. to get synergistic effects.
  • the copying step comprises an amplification step.
  • the amplification can be a PCR, an isothermal amplification or an RT-PCT.
  • the amplification step may also describe a transcription or protein expression.
  • reaction mix is a PCR mix, an isothermal amplification mix, a reverse transcription mix, a transcription mix, or a cell-free expression mix. It is also preferred that a protein synthesis takes place so that, for example, in the reaction mixture, enzymes are contained which transcribe DNA into RNA and translate RNA into protein.
  • the template molecules are oligonucleotides, preferably DNA molecules or RNA molecules.
  • a plurality of spots of the template array are combined in the cavity chip and / or further array, so as to produce a mixture of template molecules or the molecules derived therefrom and / or to generate a DNA or RNA which contains a plurality of partial sequences or Derivatives of these partial sequences of the template molecules from the respective spots comprises.
  • spots from at least two template arrays in the further array are merged so as to create a mixture of copies and / or to produce a copy comprising a plurality of subsequences of these partial sequences
  • Template molecules from the respective spots comprises.
  • the invention relates to the method, wherein a spot of the template array in the further array is subdivided into a plurality of spots.
  • DNA molecules be added in solution such that the molecules (template molecules or product molecules or an intermediate) are extended around this DNA sequence.
  • the template molecules are DNA molecules that have all or part of short, identical DNA sequences of preferably 10-30 base pairs.
  • the primers preferably carry an additional DNA sequence at the 3 'end or at the 5' end.
  • the method wherein the additional sequences as a barcode for a
  • Location information can be used and / or the primer can contain a sequence for T ranskription and / or cell-free synthesis It is preferred that the transformation is spatially and / or temporally limited.
  • the spatial boundary is preferably given by the edge of the cavities.
  • the time limit can be realized by different factors. Time-limited reaction conditions can be, for example, a temperature which is exceeded or fallen below, a pH which changes over time, the irradiation of light or electric fields.
  • the invention makes it possible to change existing microarrays in terms of their spatial structure.
  • spot shape, spot size and spot location It is possible to change the shape of the spots as you like, but also their position (up to the deletion of spots). This can find different applications depending on the geometry: a) In a transformation without relevant size changes, a spot is converted into a spot with approximately the same size, but the shape of the spot can be changed arbitrarily. Due to the transformation process extremely sharp edges are created and spots with previously impossible geometry can be created. b) When transforming into smaller sizes, a spot can turn into several small spots
  • the DNA can be imaged in parallel or sequentially on the target spot. That the DNA may then end up being a mixture at the surface (several sequences side by side on the surface), or else a combination construct with one sequence attached to the other, thus also producing complete gene products.
  • a microarray By performing multiple transformations, a microarray can theoretically be reformatted, spots removed or added from other arrays, or DNA or other biomolecules shortened or lengthened.
  • An advantage of the invention is that it is thereby possible to construct or reformulate gene constructs or gene libraries combinatorially.
  • first-order transformation (carrying out a first transformation) are versatile.
  • a microarray in the desired spot shape be multiplied.
  • Previous arrays are production-related "round".
  • any structures are possible.
  • an array of hexagons could be created in the first order (see also Fig. 1) and then converted back into circles in successive transformations. The same could also be shown the other way around.
  • classically produced microarrays are always inhomogeneous within the single spot due to the manufacturing process.
  • the transformation process of the invention is homogeneous over the entire surface, resulting in very homogeneous spots with very precise and almost arbitrary geometry. An application is therefore in the quality improvement of arrays.
  • Another advantage is that multiple spots can be fused together to produce either a mixture of biomolecules such as DNA (2 or more species per spot) or a construct (e.g., fusion DNA) on the spot.
  • a mixture of biomolecules such as DNA (2 or more species per spot) or a construct (e.g., fusion DNA) on the spot.
  • a construct e.g., fusion DNA
  • Another advantage is that a spot can be split into several small spots. This allows more accurate measurements, higher homogeneity, better binding kinetics (according to Ekins, Ambient Analyte Theory) and thus a higher signal yield.
  • the transformation process requires only one cavity chip in addition to the output array, some reaction mix, e.g. PCR mix (usually between 5 and 10 pl) and a copy surface on which the 1st order array is applied. This makes the production more unique
  • the device comprises a set of transformation matrices in the form of cavity chips, which depending on the order of their application, an affine
  • This set of transformation matrices is then a set of individual operations that can replace each other.
  • mathematical affine mapping that is, a point mirroring can also be done as a reflection followed by a 180 ° rotation.
  • transformation method be used to produce DNA, RNA or proteins. It is preferably possible to generate new DNA combinations.
  • the invention relates to a device for carrying out a transformation according to the invention, comprising
  • a cavity chip comprising a transfer matrix
  • the transfer matrix spatially limits the reaction. This is done in particular by the cavities and their borders.
  • the invention relates to a cavity chip for carrying out a transformation process of the invention.
  • the cavities of the cavity chip comprise a volume of less than 100 nl. Particularly preferred are volumes of less than 50 nl, most preferably less than 20 nl. It was surprising that particularly good results could also be achieved with volumes in the picoliter range.
  • the shape of the cavities can be chosen arbitrarily. Round, hexagonal or triangular shapes are possible. In principle, however, any desired shape can be used.
  • Example 1 Sequence, shape and / or space transformation a) ST Addition of different information per spot
  • Step 1
  • Two primary arrays form the initial position. Both arrays may have the same or different spot sizes, symmetries and spacings. The orientation of the DNA Molecules on the surface as well as the length of the DNA does not matter. The only common feature of both arrays is that all DNA molecules must have a similar, short homologous DNA sequence of about 10-30 base pairs, a so-called.
  • a scan of one of the primary arrays is made by PCR using a transmitter chip and a conventional PCR mix. After completion of the PCR, the same DNA species are present in the transmitter chip, which are also present on the starting DNA microarray. Their spatial arrangement has also been preserved. As a result, both the spatial, as well as the content information of the primary array was thus transferred to the Mattermikchip.
  • This transmitter chip is then placed on the second primary array. Again, a scan is performed using a standard PCR mix. Due to the homologous sequences of both original DNA microarrays, two scenarios are conceivable. If a DNA spot of the second microarray encounters an empty cavity, the DNA molecules are readily transferred into this cavity as in the first scan. However, if the DNA spot hits a cavity in which the DNA of the first starting array already exists, then both DNA strands are fused together on the cavity surface. New DNA molecules are created that carry both the information from the first and the second original DNA microarray.
  • the stored information in the form of fused DNA molecules or original DNA molecules of the transmitter chip can be copied by PCR and a standard PCR mix to a new, empty, specially functionalized surface. b) ST Addition of the same information per spot
  • planar introduction can be done by an array which has significantly larger structures than the transfer matrix, or over the entire transfer matrix, when the DNA is coated around the e.g. is to be extended, brings directly into solution.
  • Step 1
  • a primary array which contains a certain number of different DNA molecules.
  • the spot size, symmetry, distances, and quantity does not matter, as well as the Orientation of the DNA molecules on the surface.
  • an additional DNA sequence can be introduced by adding it in solution, so that the entire transfer area is extended or changed by this DNA sequence.
  • a scan of one of the primary arrays is made by PCR using a transmitter chip and a conventional PCR mix. After completion of the PCR, the same DNA species are present in the transmitter chip, which are also present on the starting DNA microarray. Their spatial arrangement has also been preserved. As a result, both the spatial, as well as the content information of the primary array was thus transferred to the Mattermikchip.
  • the transmitter chip is now filled with fresh DNA mix and a template, which has homologous sequences to the already existing DNA molecules. This template is added in abundance, so that it can not impoverish in the subsequent fusion PCR.
  • the cavity chip is now sealed with a non-functionalized surface and then a standard PCR is performed.
  • the stored information in the form of DNA molecules of the transmitter chip can be copied to a new, empty, specially functionalized surface by means of PCR and a standard PCR mix.
  • Step 1
  • Step 2 It is used primary array, which contains a certain number of different DNA molecules.
  • the spot size, symmetry, spacings and quantity are irrelevant, as well as the orientation of the DNA molecules on the surface.
  • a scan of one of the primary arrays is made by PCR using a transmitter chip and a conventional PCR mix.
  • the DNA of the primary array can be transferred by PCR into the transmitter chip by selecting the primer used in full length or partial length. The spatial information is completely preserved.
  • the stored information in the form of DNA molecules of the transmitter chip can be copied by PCR and a standard PCR mix to a new, empty, specially functionalized surface. d) RT Zoom
  • Step 1
  • the spot size, symmetry, distances, and quantity are irrelevant, as well as the orientation of the DNA molecules on the surface.
  • a scan of one of the primary arrays is made by PCR using a transmitter chip and a conventional PCR mix.
  • the geometry and arrangement of the transmitter chip is chosen so that it is equal to that of the output microarray.
  • the cavity diameter is chosen so that the cavity is either larger or smaller than the DNA spot of the primary array.
  • the stored information in the form of DNA molecules of the transmitter chip can be copied to a new, empty, specially functionalized surface by means of PCR and a standard PCR mix. e) RT rotation
  • Step 1
  • Step 2 It is used primary array, which contains a certain number of different DNA molecules.
  • the spot size, symmetry, spacings and quantity are irrelevant, as well as the orientation of the DNA molecules on the surface.
  • a scan of one of the primary arrays is made by PCR using a transmitter chip and a conventional PCR mix. After completion of the PCR, the same DNA species are present in the transmitter chip, which are also present on the starting DNA microarray. Their spatial arrangement has also been preserved. As a result, both the spatial, as well as the content information of the primary array was thus transferred to the Mattermikchip.
  • Step 4 The transmitter chip is rotated by a certain angle and by a certain point.
  • the stored information in the form of DNA molecules of the transmitter chip can be copied to a new, empty, specially functionalized surface by means of PCR and a standard PCR mix.
  • Step 1
  • the spot size, symmetry, spacings and quantity are irrelevant, as well as the orientation of the DNA molecules on the surface.
  • a scan of one of the primary arrays is made by PCR using a transmitter chip and a conventional PCR mix. After completion of the PCR, the same DNA species are present in the transmitter chip, which are also present on the output DNA microarray. Their spatial arrangement has also been preserved. As a result, both the spatial, as well as the content information of the primary array was thus transferred to the Mattermikchip.
  • the transmitter chip is shifted by a certain length in the x or y direction.
  • the stored information in the form of DNA molecules of the transmitter chip can be copied by PCR and a standard PCR mix to a new, empty, specially functionalized surface.
  • Step 1
  • the spot size, symmetry, distances, and quantity are irrelevant, as well as the orientation of the DNA molecules on the surface.
  • a scan of one of the primary arrays is made by PCR using a transmitter chip and a conventional PCR mix.
  • the structure of the transmitter chip is chosen so that any number of points of the primary array is transferred to the same structure of the transmitter chip.
  • the biomolecules are not fused thereby, but merely mixed in the same structure.
  • the stored information in the form of DNA molecules of the transmitter chip can be copied by PCR and a standard PCR mix to a new, empty, specially functionalized surface.
  • the resulting secondary array now consists of mixed spots. Individual monoclonal spots may also be present depending on the choice of the structure of the transmitter chip. h) RT resolution
  • Step 1
  • the spot size, symmetry, distances, and quantity are irrelevant, as well as the orientation of the DNA molecules on the surface.
  • a scan of one of the primary arrays is made by means of a transmitter chip and a conventional PCR mix by means of PCR.
  • the structure of the transmitter chip is chosen so that either more or fewer structures compared to the primary array are available.
  • the stored information in the form of DNA molecules of the transmitter chip can be copied by PCR and a standard PCR mix to a new, empty, specially functionalized surface.
  • the resulting secondary array now consists of more or fewer spots compared to the primary array.
  • Step 1
  • the spot size, symmetry, distances, and quantity are irrelevant, as well as the orientation of the DNA molecules on the surface.
  • a scan of one of the primary arrays is made by PCR using a transmitter chip and a conventional PCR mix.
  • the structure of the transmitter chip is chosen to have a different shape than the spots of the primary array (e.g., stars or elongated spots).
  • Transmitter chip which are also present on the initial DNA microarray. Their spatial arrangement has also been preserved. As a result, both the spatial, as well as the content information of the primary array was thus transferred to the thesisakachip.
  • the stored information in the form of DNA molecules of the transmitter chip can be copied by PCR and a standard PCR mix to a new, empty, specially functionalized surface.
  • the resulting secondary array now consists of spots of different shape compared to the primary array.
  • FIG. 1 Regressive transformation (big to small). An array of hexagons has been transformed into smaller circles. The illustration shows a section of 2 hexagons.
  • FIG. 1 Progressive transform (small to large) The array on the left was transformed into a large spot array (right) with much larger cavities. Depending on the exact location of the original spots different products can be produced.
  • the lower red dot (A) was transformed into a red circle (A) with a much larger diameter.
  • the red dot (A) above was fused with the overlying green dot (C) to a yellow circle (B).
  • a green spot Small on the left, large on the right
  • 2 green (C) and 2 red spots (A) (left) were converted to a traffic light (red (A), yellow (B), green (C) (right)).
  • FIG. 3 Allocation of the transformation The data from FIG. 2 were superimposed here in order to render the transformation clearer. One sees very well, which small spots as germs of the have contributed to larger spots. Some of the small red spots did not produce any signal in this experiment. For the green points, there is a much clearer allocation.
  • FIGS 4 to 17 show particularly preferred embodiments of the invention.
  • Microarrays are printed, i. tiny drops come to a surface and are then different in size (A), not exactly in position (B) or inhomogeneous or have an irregular shape (C), etc. Automated capture of spots is difficult.
  • FIG. 5 structure optimization
  • Microarrays are printed, i. the drops usually have roundish to oval shapes, now any structures can be created
  • FIG. 6 Reduction 1
  • the format of arrays is determined by the printing process, i.
  • the size of the spots is limited by the minimum delivery amount down, as well as their distance to avoid bleeding the spots
  • the format of arrays is determined by the printing process, i.
  • the size of the spots is limited by the minimum delivery amount down, as well as their distance to avoid bleeding the spots
  • FIG. 9 Enlargement 1
  • the format of arrays is determined by the printing process, i. the size of the spots is limited by the maximum delivery amount and concentration upwards.
  • Figures 10, 11 and 12 magnification 2a, 2b and 2c
  • the DNA of individual spots can not be subsequently fused or mixed to allow for additive effects (for example, when two DNAs together first interact with a protein), or allosteric effects (when a DNA is needed to activate or activate a protein) which then binds to another DNA, eg, initiation sequences or the lac promoter or lac repressor).
  • Two or more spots can be fused and the DNA mixed either side by side, or linearly one after the other.
  • FIG. 16 Splitting
  • the DNA is first taken from a template 1, then from a template 2, to then produce as a result a combinatorial mixture. It is thus possible to generate a total of n * m combinatorial mixtures with n and m spots on the original arrays.
  • FIG. 23 shows a schematic representation of a typical transformation process.
  • Cavity chips with a reaction mix e.g. PCR mix or cell-free expression system and placement of the original array on the cavity chip
  • b Performing a copying reaction, e.g. a PCR.
  • c opening, washing and blocking of the chip
  • d filling of the cavity chip with reaction mix and sealing it with an empty array surface.
  • e performing a copying reaction, e.g. a PCR.
  • f washing and blocking of the newly formed array (transformed array) and the cavity chip.
  • Figure 24 shows another example of a possible application.
  • Transmitter chip Also called cavity chip; Device used for local
  • Microarray which serves as Ausganslage and was produced according to the current state of the art; preferably DNA or RNA array
  • Transformation is made. It represents the end result of the array transformation.
  • RT space transformation changing the information of the location and / or the geometry compared to the primary array
  • RT resolution space transformation resolution change increase or
  • Each cavity of the transmitter chip hits one or more points of the primary array. No points are left out.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mikroarraytransformation bei dem durch die Verwendung eines Kavitätenchips mit Transformationsmatrix ein Vorlagenarray auf einen planaren Träger kopiert werden kann und die Information oder räumliche Anordnung dabei verändert wird, sodass ein transformiertes zweites Array entsteht. Die Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens.

Description

Mikroarray-T ransformer
Zusammenfassung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mikroarraytransformation bei dem durch die Verwendung eines Kavitätenchips mit Transformationsmatrix ein Vorlagenarray auf einen planaren Träger kopiert werden kann und die Information oder räumliche Anordnung dabei verändert wird, sodass ein transformiertes zweites Array entsteht. Die Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens.
Stand der Technik
Unter DNA Mikroarrays versteht sich eine Ansammlung vieler unterschiedlicher, kleiner Punkte (Spots) mit DNA auf einem festen Substrat. Bei der Herstellung von DNA Mikroarrays wird grundsätzlich zwischen drei verschiedenen Herstellungsarten unterschieden:
1. Gespottete DNA Mikroarrays a. Mikroarray Spotter [8]
2. In-situ synthetisierte DNA Mikroarrays a. Spot synthesis; Inkjet printing [2], [3] b. Photolithography mittels Photomasken [10] c. Photolithography mittels Micromirrors [9]
3. Synthese mittels DNA Polymerase
Eine relative neuartige Methode zur Herstellung von DNA Mikroarrays besteht darin, die DNA an der Oberfläche mittels einer Polymerase anhand eines DNA Templates auf zu synthetisieren (W02009034181A2, W02010100265A1 ). Hierbei wird eine feste
Oberfläche mit so genannten Primern (Synthesestartpunkte für die DNA Polymerase) versehen. Anschließend wird ein Mix bestehend aus den einzelnen Synthesebausteinen, der DNA-Polymerase und dem Template auf eben diese Oberfläche gegeben. Die Synthese verläuft hierbei hochparallel an bis zu mehreren tausend Punkten. Der Reaktionsraum jeder dieser Punkte wurde physikalisch voneinander getrennt, um eine unabhängige Synthesereaktion zu gewährleisten. Dies kann eine räumliche Trennung über Mikrokavitäten bis hin zur Limitierung der Diffusion darstellen.
Der grundlegende Unterschied der Herstellungsarten besteht darin, dass die DNA Moleküle für (1 ) im Vorfeld und für (2 und 3) während der Erstellung des DNA Mikroarrays hergestellt werden. Bei all den oben genannten Fertigungstechniken für DNA Mikroarrays werden die einzelnen Arrays jeweils neu, d.h. komplett von vorne, hergestellt. Aus diesem Grund gibt es einige Ansätze, deren Ziel es ist, bereits vorhandene DNA Mikroarrays zu replizieren:
Die Vervielfältigung von DNA Mikroarrays mittels Hybridisierung:
Hier werden komplementäre DNA Stränge aus DNA Pools an ein bestehendes DNA Mikroarray hybridisiert. Die komplementären DNA Moleküle besitzen jeweils eine reaktive Gruppe, mit der es möglich ist, sie an einem zweiten Substrat zu befestigen in dem beides in Kontakt gebracht wird. Dieses Substrat enthält nun die komplementären DNA Moleküle des originalen DNA Mikroarrays und weist die gleiche örtliche Auflösung auf. Eine derart hergestellte Kopie ist vergleichbar mit dem Negativ eines analogen Fotos ([4], [5], [6], [1 1 ], [12], US20060141245A1 ,
W020061 12815A2).
Die Vervielfältigung von DNA Mikroarrays mittels Hybridisierung und Verlängerung mittels DNA Polymerase:
Diese Methode ist sehr ähnlich zu der zuvor beschriebenen Methode. Allerdings sind die hybridisierten DNA Moleküle bedeutend kürzer als die DNA Moleküle des zu vervielfältigenden DNA Mikroarrays. Die hybridisierten DNA Moleküle dienen in diesem Fall als Primer für eine DNA Verlängerungsreaktion mittels DNA Polymerase. Die Polymerase ist ein Enzym, welches einen DNA Strang anhand einer Vorlage entsprechend verlängern kann. Mittels dieser Methode ist es im Prinzip möglich, DNA Mikroarrays mit langen DNA Molekülen zu vervielfältigen. Eine derart hergestellte Kopie ist Vergleichbar mit dem Negativ eines analogen Fotos ([6],
US20100256017A1 , W02008022332A2).
Vervielfältigung mittels eines Master-Kavitätenchips und einer anschließenden PCR
Ein Master-Kavitätenchip besitzt DNA Primer an seiner Oberfläche, die komplementär zur DNA eines bereits existierenden DNA Mikroarrays sind. Dieser Chip wird mit PCR-Mix befüllt und auf dem zu replizierenden DNA Mikroarray platziert. Mittels einer PCR wird die Information der DNA des DNA Mikroarrays in den Master-Kavitätenchip transferiert und gespeichert. In einem zweiten Schritt wird der Kavitätenchip abermals mit PCR-Mix befüllt und mit einem leeren Mikroarray verschlossen. Anschließend wird abermals eine PCR durchgeführt, um die DNA Moleküle vom Master Kavitätenchip auf die neue Oberfläche zu transferieren. Diese stellt somit ein exaktes Abbild des originalen DNA Mikroarrays dar. (W02010100265A1 )
Im Stand der Technik existiert keine Methode, mit der man sowohl vorhandene DNA Mikroarrays replizieren als auch nach Belieben abändern (transformieren) kann.
Die unterschiedlichen Methoden aus dem Stand der Technik weisen verschiedene Nachteile auf:
Klassische Herstellungsarten (Array production): Hierbei ist keine Replikation von DNA Mikroarrays möglich. Erstellte, generierte Mikroarrays lassen sich mit diesen Methoden nicht mehr abändern / transformieren. Sie müssten von Grund auf neu generiert werden. Eine nachträgliche Transformation ist also nicht möglich. Spotgröße und -form wird von der jeweiligen Herstellungsart bestimmt und kann nicht beliebig gewählt werden. Die Anordnung der Spots ist außerdem limitiert durch die Herstellungsart. Mit keiner der zuvor genannten Methoden ist eine Transformation eines DNA Mikroarrays möglich.
Bestehende Methoden zur Replikation von bereits existierenden DNA Mikroarrays:
Eine Änderung der Spotgrößen bzw. deren spezifischer Orte ist nicht möglich (keine
Raumtransformationen). Ebenso sind keine Formtransformationen möglich, da das
Ausgangsarray stets die Form der Spots vorgibt und bestimmt. Außerdem sind
Sequenztransformationen nur möglich in Form von Verlängerung oder Verkürzung der vorhandenen DNA. Weiterführende Transformationen wurden nicht beschrieben.
Sequenztransformationen in Form von Merging oder Kombinatorik sind mit den vorhandenen Methoden nicht möglich.
Im Stand der Technik wird ein Array während eines Kopierprozesses im Grunde genommen von einem Drucker gedruckt. Für jeden unterschiedlichen DNA Spot muss eine einzelne DNA Probe verwendet werden, was eine langwierige Vorbereitung verlangt. Dadurch wird der Prozess zeit- und kostenintensiv. Außerdem ist langwieriges Waschen zwischen den Printvorgängen notwendig um Kontamination zwischen Spots zu verhindern und zu vermindern. Des Weiteren ist es notwendig, dass der Abstand der Spots ausreichend groß gewählt ist, um ein ineinander Laufen und Kontamination zu verhindern.
Ein weiterer Nachteil der Methoden aus dem Stand der Technik ist, dass die Form der Spots sehr beschränkt ist und nur nahezu runde Spots möglich sind.
Das Eintrocknen der flüssigen Spots wirkt sich auf die Homogenität der Spots aus, sodass ein Unterschied im Ergebnis zwischen Randbereich und Mitte des Spots entsteht.
Lichtsynthese
Ein Array wird mittels Photolithographie hergestellt. Daraus ergeben sich folgende Probleme.
Jeder Syntheseschritt benötigt eine einzelne Maske und verlängert den DNA Strang nur um eine Base. Pro Schritt gibt es einen gewissen Prozentsatz an Fehlern. Dadurch wirkt sich die Länge des DNA Strangs auf die Güte des Ergebnisses aus. Nach jedem Syntheseschritt muss ein Waschschritt durchgeführt werden und die Maske getauscht werden, wodurch die Methode zeit- und kostenaufwendig wird. Das Design eines Arrays kann nur mit großem Kosten- und
Zeitaufwand geändert werde. Maskenlose Lithographie mit Mikrospiegeln wie bei einem Projektor/Beamer macht zwar die Verwendung von unterschiedlichen Masken obsolet aber dadurch ist die Form der Spots auf rechteckige oder quadratische Formen beschränkt
Solid Phase PCR
DNA wird Digital und randomisiert in einem Glas-Kavitätenchip verteilt und mittels PCR vervielfältigt. Die Herstellung der Glas-Kavitätenchips ist sehr aufwendig, außerdem sind die Muster und Spotformen durch die Herstellung auf runde und hexagonale Anordnungen beschränkt. Des Weiteren sind mehrere unterschiedliche Kavitätenformen auf einem Array nicht möglich. Operationen wie Vergrößern und Verkleinern sind mit dieser Methode nicht möglich. Auch das Verschieben von Spots oder Spot Merging sind nicht möglich. Eine Transformation von Arrays ist daher ausgeschlossen.
Bisher ist im Stand der Technik kein Verfahren bekannt oder beschrieben, mit dessen Hilfe DNA Mikorarrays transformiert werden können. Lediglich Arten der Replikation wurden beschrieben. Jedoch eröffnet die Transformation von Mikroarrays ungeahnte und unerwartete Möglichkeiten wie z.B. die Herstellung völlig neuer DNA Arrays.
Die Herausforderung bzw. die Aufgabe hierbei ist es, die Informationen des originalen
Mikroarrays zu speichern und abzuändern. Während die Speicherung meist gut zu
bewerkstelligen ist, stellt die begleitende Transformation eine große Aufgabe dar.
Mikroarrays aus dem Stand der Technik lassen sich nach ihrer Herstellung nicht mehr ändern, außer ggf. verlängern oder verkürzen. Dies ist aber oft aufgrund der schlechten Qualität der primären DNA auch nur eingeschränkt möglich. Weiterhin lassen sich bestehende Formate von Mikroarrays rein physikalische nicht„umformatieren“ d.h. man muss stets die Experimente und Geräte an die bestehenden Mikroarrays anpassen bzw. auf Experimente verzichten, wenn passende Mikroarrays nicht vorhanden sind. Zudem lassen sich zwei Mikroarrays nicht zu einem nach deren Herstellung„zusammenfügen“.
Beschreibung der Erfindung
Gelöst wird die Aufgabe durch die unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Ausführungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren der Mikroarray- Transformation umfassend die folgenden Schritte a) Bereitstellung eines Vorlagenarrays, wobei das Vorlagenarray mehrere Spots mit Vorlagenmolekülen umfasst und wobei die Vorlagenmoleküle bevorzugt Oligonukleotide sind, b) Bereitstellung eines Kavitätenchips umfassend eine Transfermatrix, c) Bereitstellung eines Reaktionsmixes im Kavitätenchip, d) Platzierung des Vorlangenarrays auf dem Kavitätenchip, e) Kopierprozess, wobei die Oligonukleotide der Spots des Vorlangenarrays auf den Kavitätenchip kopiert werden f) Bereitstellung einer Arrayoberfläche. g) Bereitstellung eines Reaktionsmixes im Kavitätenchip, h) Platzierung der Arrayoberfläche auf dem Kavitätenchip, i) Kopierprozess, wobei die Oligonukleotide der Spots des Kavitätenchips auf die Arrayoberfläche als DNA, RNA oder Protein kopiert werden und wobei dieses neu entstandene weitere Array sich hinsichtlich Spotform, Spotgröße, Spotlage und/oder hinsichtlich der enthaltenden Information vom Vorlagenarray unterscheidet.
Durch die Erfindung wird also ein Mikroarray hergestellt, das im Vergleich zu einem
Ausgangsarray transformiert ist.
Unter Transfermatrix ist die Anordnung der Kavitäten und deren Gestaltung sowie deren Eigenschaften zu verstehen.
Es kann bevorzugt sein, dass der Reaktionsmix und/oder andere Reaktionskomponenten im Kavitätenchip vorgelagert werden.
Um DNA-Mikroarrays zu transformieren, wurde somit eine spezielle Methode entwickelt, bei der die Replikation und Transformation in einem oder auch mehreren Schritten ablaufen kann.
Spezielle Kavitätenchips können mit beliebiger Form generiert werden. Diese umfassen kleine Kavitäten mit einer spezifischen Form, in denen die Vorlagemoleküle des originalen Mikroarrays gespeichert werden können.
„Gespeichert“ bedeutet in diesem Sinne, dass die Information der Vorlagenmoleküle dauerhaft übertragen wurde. Dies kann in Form von 1 :1 Kopien der Vorlagemoleküle erfolgen. Aber auch Abwandlungen sind möglich, beispielsweise RNA zu cDNA, wobei die Sequenzinformation erhalten bleibt. Es ist auch möglich, dass die original Vorlagemoleküle oder ein Teil davon auf den Kavitätenchip übertragen werden.
Es ist bevorzugt, dass ein ursprüngliches Oligonukleotid Mikroarray (besonders bevorzugt ein DNA-Mikroarray) mit einer Geometrie 1 , in einen Kavitätenchip mit einer Geometrie 2 übertragen wird. Die Übertragung kann bevorzugt mittels einer PCR stattfinden. Hier sind aber auch anderer Verfahren mit denen Biomoleküle, wie z.B. DNA amplifiziert werden können, z.B. isothermale DNA-Amplifikation, HDA, RPA oder LAMP möglich. Die Wahl der Primer während dieser Übertragungsreaktion, die im Sinne der Erfindung auch als Kopierprozess bezeichnet wird, bestimmt zudem welche Spots der ursprünglichen Arrays übertragen werden. Danach kann die Geometrie 2 des Kavitätenchips auf einen planaren Träger, auch als Arrayoberfläche bezeichnet, überführt werden, wodurch ein Mikroarray 2. Ordnung entsteht. Es kann nun ein weiterer Transformationsschritt durchgeführt werden, in einen Kavitätenchip der Geometrie 3, wodurch dann ein Array der 3. Ordnung entsteht. Grundsätzlich ist es so möglich Schritt für Schritt das ursprüngliche Mikroarray in beliebiger Ordnung neu umzusortieren.
„Kopieren“ bedeute im Sinne der Erfindung sowohl die 1 :1 Kopie (also z.B. DNA zu DNA) aber auch andere Verfahren, bei denen die Information kopiert wird, das Produkt sich aber vom Ausgangsmolekül unterscheidet, also z.B. DNA zu Protein, RNA zu cDNA, RNA zu Protein oder DNA zu RNA. Ein Produktmolekül, das sich vom Ausgangsmolekül unterscheidet, wird auch als Derivat bezeichnet. Sämtliche Derivate und Ableitungen der Ausgangsmoleküle sind möglich und der Fachmann weiß, wie er die jeweiligen Produktmoleküle herstellt.
Die Kopierschritte werden in bevorzugter Weise mit bekannten Mitteln aus dem Stand der Technik durchgeführt, aber können auch durch alternative Verfahren ersetzt werden, welche dieselbe oder eine ähnliche biochemische Reaktion oder Amplifikation erzeugen. Es ist bevorzugt, dass eine RNA Polymerase für die Umwandlung von DNA zu RNA verwendet wird. Eine reverse Transkriptase wird bevorzugt für die Umwandlung von RNA in cDNA verwendet. Für die Umwandlung von DNA und/oder RNA in Proteine werden bevorzugt zellfreie in vitro
Transkriptions und/oder Translationsmixe verwendet. Soll DNA zu DNA kopiert werden, können Polymerasen, RPA (Replication Protein A) oder ein System zu Helikase-abhängige Amplifikation (HDA) zum Einsatz kommen.
Ein typischer Transformationsprozess läuft bevorzugt folgendermaßen ab:
1. Befüllen des Kavitätenchips mit einem Reaktionsmix, z.B. PCR-Mix oder zellfreiem Expressionssystem
2. Platzierung des originalen Arrays auf dem Kavitätenchip
3. Durchführung einer Kopierreaktion, z.B. einer PCR
4. Waschen und blocken
5. Optional: Modifikation der Vorlagemoleküle in den Kavitäten
6. Optional: Wiederholung der schritte 1-4 mit dem selben Kavitätenchip aber einem anderen originalen Mikroarrays 7. Befüllen des Kavitätenchips mit Reaktionsmix und Verschließung dessen mit einer leeren Array-Oberfläche
8. Durchführung einer Kopierreaktion, z.B. einer PCR
9. Waschen und Blocken des neu entstandenen Arrays und des Kavitätenchips
Im Speziellen können die optionalen Schritte beliebig miteinander kombiniert werden. Die entstehende Form des resultierenden transformierten Spots ist hierbei durch die Form der Kavität des Kavitätenchips gegeben. Insbesondere kann der oben geschilderte Prozess auch mehrfach und auch abermals auf bereits transformierte Arrays angewendet werden.
Die räumliche Anordnung, also z.B. das resultierende Muster wird bevorzugt durch den ersten Kopierschritt in den Kavitätenchip definiert. Eine Modifikation der Moleküle kann aber auch noch danach erfolgen, sodass eine Transformation der Information zu mehreren Zeitpunkten erfolgen kann.
Außerdem bevorzugt ist das Verfahren, wobei eine Modifikation, Verlängerung, Verkürzung, Derivatisierung und/oder Invertierung der Moleküle in den Kavitäten des Kavitätenchips und/oder während der Kopierprozesse erfolgt. Unter Derivatisierung sind Abwandlungen der
Ausgangsmoleküle zu verstehen, wobei die Information z.B. eine Sequenzinformation, erhalten bleibt. Hierunter fällt im Sinne der Erfindung auch die Übersetzung von DNA oder RNA in Peptidsequenzen.
Besonders bevorzugt ist, dass die Schritte a) bis e) mindestens einmal wiederholt werden, wobei derselbe Kavitätenchip aber ein anderes Vorlagenarray oder das gleiche Vorlagenarray in anderer oder der gleichen Orientierung verwendet wird.
Wenn das gleiche Vorlagenarray mehrfach in den gleichen Kavitätenchip kopiert wird, ist es besonders vorteilhaft, dass Vorlagenarray und Kavitätenchip bei den Wiederholungen in einer geänderten Orientierung zueinander stehen. Dies kann z.B. durch Drehung des Kavitätenchips erfolgen. Die Orientierung kann auch gleichbleibend sein, um z.B. synergistische Effekte zu erhalten.
Besonders bevorzugt ist, dass der Kopierschritt einen Amplifikationsschritt umfasst.
Bei der Amplifikation kann es sich um eine PCR, eine isothermale Amplifikation oder eine RT- PCT. Der Amplifikationsschritt kann aber auch eine Transkription oder Proteinexpression beschreiben.
Es ist bevorzugt, dass der Reaktionsmix ein PCR-Mix, ein isothermaler Amplifikationsmix, ein reverser Transkriptionsmix, ein Transkriptionsmix oder ein zellfreier Expressionsmix ist. Es ist außerdem bevorzugt, dass eine Proteinsynthese stattfindet, sodass beispielsweise im Reaktionsmix Enzyme enthalten sind die DNA in RNA transkribieren und RNA in Protein translatieren.
Es ist dabei bevorzugt, dass eine mögliche Proteinsynthese erst im einem Kopierschritt vom Kavitätenchip auf eine leere Arrayoberfläche erfolgt.
Es können auch andere adäquate Mixe verwendet werden, wobei der Fachmann in der Lage ist diese auszuwählen, ohne dabei selbst erfinderisch tätig zu werden.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Vorlagenmolekülen um Oligonukleotide, bevorzugt um DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle.
Außerdem ist bevorzugt, dass mehrere Spots des Vorlagenarrays in dem Kavitätenchip und/oder weiteren Array zusammengeführt werden, um so eine Mischung an Vorlagemolekülen bzw. den daraus abgeleiteten Molekülen zu erzeugen und/oder um eine DNA oder RNA zu erzeugen, die mehrere Teilsequenzen bzw. Ableitungen dieser Teilsequenzen der Vorlagemolekülen aus den jeweiligen Spots umfasst.
Weiterhin bevorzugt ist, dass Spots von mindestens zwei Vorlagenarrays in dem weiteren Array zusammengeführt werden, um so eine Mischung an Kopien zu erzeugen und/oder um eine Kopie zu erzeugen, die mehrere Teilsequenzen bzw. Ableitungen dieser Teilsequenzen der
Vorlagemolekülen aus den jeweiligen Spots umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren, wobei ein Spot des Vorlagenarrays in dem weiteren Array in mehrere Spots unterteilt wird.
Auch bevorzugt ist, dass zusätzliche DNA-Moleküle in Lösung hinzugegeben werden, so dass die Moleküle (Vorlagenmoleküle oder Produktmoleküle oder ein Zwischenprodukt) um diese DNA Sequenz verlängert bzw. verändert werden.
Es ist besonders bevorzugt, dass die Vorlagenmoleküle DNA-Moleküle sind, die alle oder teilweise kurze, gleiche DNA Sequenzen von bevorzugt 10-30 Basenpaare besitzen.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kavitäten des Kavitätenchips mit Primern beschichtet sind.
Bevorzugt tragen die Primer am 3’-Ende oder am 5’ Ende eine zusätzliche DNA-Sequenz.
Bevorzugt ist das Verfahren, wobei die zusätzlichen Sequenzen als Barcode für eine
Ortsinformation verwendet werden können und/oder die Primer eine Sequenz zur T ranskription und/oder der zellfreien Synthese enthalten können Es ist bevorzugt, dass die Transformation räumlich und/oder zeitlich begrenzt ist. Die räumliche Begrenzung ist bevorzugt durch den Rand der Kavitäten gegeben. Die zeitliche Begrenzung kann durch unterschiedliche Faktoren realisiert werden. Zeitlich limitierte Reaktionsbedingungen können z.B. eine Temperatur, die über- oder unterschritten wird, ein pH-Wert der sich im Laufe der Zeit ändert, das Einstrahlen von Licht oder auch elektrische Felder sein.
Die Erfindung erlaubt es bestehende Mikroarrays bezüglich ihrer räumlichen Struktur zu verändern. Insbesondere hinsichtlich der Spotform, Spotgröße und Spotlage. Es ist möglich die Form der Spots beliebig zu verändern, aber auch deren Lage (bis hin zum Löschen von Spots). Dies kann je nach Geometrie unterschiedliche Anwendungen finden: a) Bei einer Transformation ohne relevante Größenänderungen wird ein Spot in einen Spot mit ungefähr der gleichen Größe umgewandelt, aber die Form des Spots kann dabei beliebig verändert werden. Aufgrund des Transformationsprozesses entstehen extrem scharfe Kanten und es können so Spots mit bisher nicht möglicher Geometrie erzeugt werden. b) Bei einer Transformation in kleinere Größen kann ein Spot in mehrere kleine Spots
„zerteilt“ werden, deren Form wiederum beliebig sein kann. c) Bei einer Transformation in größere Größen können zwei oder mehrere Spots bzw. deren DNA fusioniert werden. Die DNA kann dabei je nach Prozesswahl und Primersequenz parallel oder sequenziell auf dem Zielspot abgebildet werden. D.h. die DNA kann dann an der Oberfläche am Ende eine Mischung sein (mehrere Sequenzen nebeneinander auf der Oberfläche) oder aber auch ein Kombinationskonstrukt, bei dem eine Sequenz an der anderen angehängt ist, womit auch komplette Genprodukte erzeugt werden können.
Durch mehrfache Durchführung von Transformationen kann ein Mikroarray theoretisch beliebig umformatiert, Spots entfernt oder aus anderen Arrays hinzugefügt, DNA oder andere Biomoleküle verkürzt oder verlängert werden. Ein Vorteil der Erfindung ist es, dass es dadurch möglich ist, Genkonstrukte oder Genbibliotheken kombinatorisch aufzubauen oder umzuformatieren.
Es war völlig überraschend, dass durch die Erfindung erkannt wurde, dass die statische Form des ursprünglichen Mikroarrays mittels Transformation über einen Kavitätentransfer verändert und reformatiert werden kann. Analog einer Fouriertransformation kann durch die Erfindung grundsätzlich jede beliebige Geometrie erzeugt werden kann. Nun können affine oder teilaffine Abbildungen aus der Mathematik auf die Geometrie eines Arrays und dessen Biomolekülen angewendet werden. Ebenso können Additionen durch DNA oder andere Biomoleküle stattfinden (z.B. mittels einer Ligation oder einer verlängernden Amplifikation) als auch Subtraktionen (z.B. durch eine PCR mit einem Primer, der ein verkürztes DNA-Produkt erzeugt, oder mittels eines Restriktionsenzymes, welches die DNA an einer bestimmten Sequenz abschneidet). Somit wird die abstrakte und theoretische Transformation der Mathematik nun auch für physikalische Mikroarrays auf Basis von DNA oder RNA möglich.
Die Vorteile einer T ransformation 1. Ordnung (Durchführung einer ersten T ransformation) sind vielseitig. So kann z.B. ein Mikroarray in gewünschter Spotform vervielfacht werden. Bisherige Arrays sind herstellungsbedingt„rund“. Durch die Erfindung sind beliebige Strukturen möglich. So konnten beispielsweise in 1. Ordnung ein Array aus Sechsecken erstellt (vgl. auch Fig. 1 ) und dann in sukzessiven Transformationen wieder in Kreise umgewandelt werden. Selbiges konnte auch anders herum gezeigt werden. Weiterhin sind klassisch hergestellte Mikroarrays stets durch den Herstellungsprozess inhomogen innerhalb des einzelnen Spots. Der Transformationsprozess der Erfindung ist hingegen über die gesamte Fläche homogen, wodurch sehr homogene Spots mit sehr genauer und fast beliebiger Geometrie entstehen. Eine Anwendung liegt daher in der Qualitätsverbesserung von Arrays. So können Mikroarrayhersteller einen Masterarray produzieren und dann die Transformation nutzen, um geometrisch hochwertige und homogene Arrays 1 . Ordnung zu erzeugen. Dabei ist die geometrische Qualität des Masterarrays gering, nur die DNA-Güte hoch, was zu Arrays 1 . Ordnung von hoher Güte und Geometrie bzw. Struktur führt.
Ein weiterer Vorteil ist, dass mehrere Spots verschmolzen werden können, um so entweder eine Mischung an Biomolekülen wie DNA (2 oder mehr Spezies pro Spot) oder ein Konstrukt (z.B. Fusions-DNA) auf dem Spot zu erzeugen. Eine entsprechende Darstellung ist in Figur 2 gezeigt.
Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass ein Spot in mehrere kleine Spots zerlegt werden kann. Dies erlaubt genauere Messungen, höhere Homogenität, bessere Bindungskinetik (nach Ekins, Ambient Analyte Theory) und damit eine höhere Signalausbeute.
Der Transformationsprozess benötigt neben dem Ausgangsarray nur einen Kavitätenchip, etwas Reaktionsmix, z.B. PCR-Mix (in der Regel zwischen 5 und 10 pl) und eine Kopieroberfläche auf der das Array 1. Ordnung aufgetragen wird. Dadurch wird die Herstellung einzigartiger
Geometrien (bisher nicht technisch umsetzbar) möglich. Außerdem können Geometrien, die bisher technisch zwar eingeschränkt möglich waren nun wesentlich kostengünstiger hergestellt werden. Auch das Herstellen von einer Vielzahl an Replikationen ist nun problemlos möglich. Die Umformatierung beliebiger Geometrien, welche bisher technisch nicht möglich war, mittels geometrischer T ransformation, die einer affinen Abbildung in der Mathematik entspricht
(Scherung, Streckung, Rotation, Scherstreckung), oder auch nur Anwendung dieser Operationen auf Teilbereiche oder einzelne Punkte, ist ein weiterer Vorteil der Erfindung, der eine Vielzahl an möglichen Anwendungen zulässt.
Es kann auch bevorzugt sein, dass die Vorrichtung einen Satz an Transformationsmatrizen in Form von Kavitätenchips umfasst, die je nach Reihenfolge ihrer Anwendung eine affine
Abbildung des Arrays erzeugen. Damit ist z.B. gemeint, dass die Vorrichtung diverse Einzelmatrizen (auf entsprechenden Kavitätenchips) haben kann, wobei eine verschiebt, eine andere vergrößert, die nächste verkleinert. Auch möglich ist, z.B. immer alles auf die gleiche Größe vergrößert/verkleinert wird, danach verschoben und dann wiederum alles auf die alte Größe zurück gebracht wird. Dieser Satz an Transformationsmatrizen ist dann ein Satz an Einzeloperationen, die sich gegenseitig ersetzen können. Wie bei mathematischen affinen Abbildung, sprich eine Punktspiegelung kann man auch als Spiegelung gefolgt von einer 180° Drehung erfolgen.
Es ist außerdem bevorzugt, dass das Transformationsverfahren zur Herstellung von DNA, RNA oder Proteinenl verwendet wird. Bevorzugt ist es möglich neue DNA-Kombinationen zu generieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung einer erfindungsgemäßen Transformation, umfassend
• einen Kavitätenchip umfassend eine Transfermatrix,
• mindestens ein Vorlagenarray und
• mindestens eine Arrayoberfläche.
Es ist dabei bevorzugt, dass die Transfermatrix die Reaktion räumlich begrenzt. Dies erfolgt insbesondere durch die Kavitäten und deren Umrandungen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Kavitätenchip zur Durchführung eines Transformationsverfahrens der Erfindung.
Folgende Spezifikationen sind für die Kavitätenchips besonders geeignet. Diese Ausführungen sind sowohl für das beanspruchten Verfahren als auch die beanspruchte Vorrichtung anwendbar.
Es ist besonders bevorzugt, dass die Kavitäten des Kavitätenchips ein Volumen von unter 100 nl umfassen. Besonders bevorzugt sind Volumina von unter 50 nl, ganz besonders bevorzugt von unter 20 nl. Es war überraschend, dass besonders gute Ergebnisse auch mit Volumina im Pikoliterbereich erzielt werden konnten.
Der Fachmann weiß, dass für bestimmte Anwendungen aber auch größere Kavitäten von Vorteil sein können, wenn z.B. Zellen oder Gewebe als Ausgangsmaterial verwendet werden.
Die Form der Kavitäten kann beliebig gewählt werden. Runde, hexagonale oder dreieckige Formen sind möglich. Grundsätzlich kann aber jede beliebige Form zum Einsatz kommen.
Die Folgenden Spezifikationen haben in Tests besonders gute Ergebnisse erzielt:
4000er
Beispiele und Figuren
Folgenden wird die Erfindung an Hand von Figuren und Beispielen erläutern ohne dabei auf diese beschränkt zu sein.
Beispiel 1 : Sequenz-, Form- und oder Raumtransformation a) ST Addition von unterschiedlichen Informationen pro Spot
Schritt 1 :
Zwei Primärarrays bilden die Ausganslage. Hierbei können beide Arrays gleiche oder auch unterschiedliche Spotgrößen, -Symmetrien und -abstände besitzen. Die Orientierung der DNA- Moleküle an der Oberfläche wie auch die Länge der DNA spielt hierbei keine Rolle. Die einzige Gemeinsamkeit beider Arrays besteht darin, dass alle DNA-Moleküle eine gleiche, kurze homologe DNA Sequenz von ca. 10-30 Basenpaaren besitzen müssen, ein sog.
Überlappungsbereich.
Schritt 2:
Zunächst wird mittels eines Überträgerchips und einem konventionellen PCR-Mix mittels PCR ein Scan von einem der Primärarrays hergestellt. Nach Vollendung der PCR befinden sich die gleichen DNA-Spezies im Überträgerchip, die auch auf dem Ausgangs DNA-Mikroarray vorhanden sind. Ihre räumliche Anordnung ist ebenfalls erhalten geblieben. Hierdurch wurde also sowohl die räumliche, als auch die inhaltliche Information des Primärarrays in den Überträgerchip übertragen.
Schritt 3:
Dieser Überträgerchip wird anschließend auf das zweite Primärarray gelegt. Abermals wird ein Scan mittels eines Standard PCR-Mixes durchgeführt. Aufgrund der homologen Sequenzen beider ursprünglicher DNA Mikroarrays sind nun zwei Szenarien vorstellbar. Trifft ein DNA-Spot des zweiten Mikroarrays auf eine noch leere Kavität, so werden die DNA-Moleküle wie bereits beim ersten Scan ohne weiteres in diese Kavität übertragen. Trifft der DNA Spot allerdings auf eine Kavität, in der bereits die DNA des ersten Ausgangsarrays vorhanden ist, so werden beide DNA-Stränge an der Kavitätenoberfläche miteinander fusioniert. Es entstehen neue DNA- Moleküle, die sowohl die Informationen des ersten, wie auch des zweiten ursprünglichen DNA- Mikroarrays tragen.
Schritt 4:
Die gespeicherte Information in Form von fusionierten DNA-Molekülen oder ursprünglichen DNA- Molekülen des Überträgerchips kann mittels PCR und einem Standard PCR-Mix auf eine neue, leere, speziell funktionalisierte Oberfläche kopiert werden. b) ST Addition von gleicher Information pro Spot
Mit diesem Schritt können flächig oder bei einer Vielzahl von Spots identische DNA-Abschnitte hinzugefügt, oder ggf. weggenommen werden. Das flächige Einbringen kann durch ein Array geschehen, welches deutlich größere Strukturen als die Transfermatrix besitzt, oder über die gesamte Transfermatrix, wenn man die DNA um die z.B. verlängert werden soll, direkt in Lösung einbringt.
Schritt 1 :
Es wird ein Primärarray benutzt, welches eine gewisse Anzahl unterschiedlicher DNA-Moleküle enthält. Die Spotgröße, -Symmetrie, -abstände, -menge spielt hierbei keine Rolle, wie auch die Orientierung der DNA-Moleküle auf der Oberfläche.
Schritt 2:
Um den nachfolgenden Scan durchzuführen, kann zwischen zwei verschiedenen Überträgerchips gewählt werden:
i) Ein Überträgerchip, welcher lediglich mit den für die nachfolgende PCR benötigten Primern beschichtet wurde.
ii) Ein Überträgerchip, bei dem 5’ der Primersequenz eine zusätzliche DNA-Sequenz beliebiger Länge vorhanden ist.
Weiterhin kann eine zusätzliche DNA Sequenz eingebracht werden, indem diese in Lösung hinzugegeben wird, so dass die gesamte Transferfläche um diese DNA Sequenz verlängert bzw. verändert wird.
Zunächst wird mittels eines Überträgerchips und einem konventionellen PCR-Mix mittels PCR ein Scan von einem der Primärarrays hergestellt. Nach Vollendung der PCR befinden sich die gleichen DNA-Spezies im Überträgerchip, die auch auf dem Ausgangs-DNA-Mikroarray vorhanden sind. Ihre räumliche Anordnung ist ebenfalls erhalten geblieben. Hierdurch wurde also sowohl die räumliche, als auch die inhaltliche Information des Primärarrays in den Überträgerchip übertragen.
Schritt 3:
Der Überträgerchip wird nun mit frischem DNA-Mix und einem Template befüllt, welches homologe Sequenzen zu den bereits vorhandenen DNA Molekülen besitzt. Dieses Template wird im Überfluss zugegeben, so dass dieses in der nachfolgenden Fusion-PCR nicht verarmen kann. Der Kavitätenchip wird nun mit einer nicht funktionalisierten Oberfläche verschlossen und anschließend wird eine Standard PCR durchgeführt.
Schritt 4:
Die gespeicherte Information in Form von DNA-Molekülen des Überträgerchips kann mittels PCR und eines Standard PCR-Mix auf eine neue, leere, speziell funktionalisierte Oberfläche kopiert werden. c) ST Subtraktion
Schritt 1 :
Es wird Primärarray benutzt, welches eine gewisse Anzahl unterschiedlicher DNA-Moleküle enthält. Die Spotgröße, -Symmetrie, -abstände, -menge spielt hierbei keine Rolle, wie auch die Orientierung der DNA-Moleküle auf der Oberfläche. Schritt 2:
Zunächst wird mittels eines Überträgerchips und einem konventionellen PCR-Mix mittels PCR ein Scan von einem der Primärarrays hergestellt. Die DNA des Primärarrays kann hierbei mittels PCR durch die Wahl der verwendeten Primer in Volllänge oder Teillänge in den Überträgerchip übertragen werden. Die räumliche Information bleibt vollständig erhalten.
Schritt 3:
Die gespeicherte Information in Form von DNA Molekülen des Überträgerchips kann mittels PCR und eines Standard PCR-Mix auf eine neue, leere, speziell funktionalisierte Oberfläche kopiert werden. d) RT Zoom
Schritt 1 :
Es wird Primärarray benutzt, welches eine gewisse Anzahl unterschiedlicher DNA-Moleküle enthält. Die Spotgröße, -Symmetrie, -abstände, -menge spielt hierbei keine Rolle, wie auch die Orientierung der DNA Moleküle auf der Oberfläche.
Schritt 2:
Zunächst wird mittels eines Überträgerchips und einem konventionellen PCR-Mix mittels PCR ein Scan von einem der Primärarrays hergestellt. Hierbei wird die Geometrie und Anordnung des Überträgerchips so gewählt, dass diese jener des Ausgangs Mikroarray gleich ist. Hierdurch kommt je ein DNA Punkt des Ausgangs Arrays unter einer einzigen Kavität zu liegen. Der Kavitätendurchmesser wird so gewählt, dass die Kavität entweder größer oder kleiner ist als der DNA Spot des Primärarrays. Nach Vollendung der PCR wurde die räumliche und inhaltliche Information des ursprünglichen DNA-Spots in je eine Kavität des Überträgerchips übertragen.
Schritt 3:
Die gespeicherte Information in Form von DNA-Molekülen des Überträgerchips kann mittels PCR und eines Standard PCR-Mix auf eine neue, leere, speziell funktionalisierte Oberfläche kopiert werden. e) RT Drehung
Schritt 1 :
Es wird Primärarray benutzt, welches eine gewisse Anzahl unterschiedlicher DNA Moleküle enthält. Die Spotgröße, -Symmetrie, -abstände, -menge spielt hierbei keine Rolle, wie auch die Orientierung der DNA-Moleküle auf der Oberfläche. Schritt 2:
Zunächst wird mittels eines Überträgerchips und einem konventionellen PCR-Mix mittels PCR ein Scan von einem der Primärarrays hergestellt. Nach Vollendung der PCR befinden sich die gleichen DNA-Spezies im Überträgerchip, die auch auf dem Ausgangs DNA-Mikroarray vorhanden sind. Ihre räumliche Anordnung ist ebenfalls erhalten geblieben. Hierdurch wurde also sowohl die räumliche, als auch die inhaltliche Information des Primärarrays in den Überträgerchip übertragen.
Schritt 3:
Der Überträgerchip wird um einen bestimmten Winkel und um einen bestimmten Punkt gedreht. Schritt 4:
Die gespeicherte Information in Form von DNA-Molekülen des Überträgerchips kann mittels PCR und eines Standard PCR-Mix auf eine neue, leere, speziell funktionalisierte Oberfläche kopiert werden.
f) RT Verschiebung
Schritt 1 :
Es wird Primärarray benutzt, welches eine gewisse Anzahl unterschiedlicher DNA-Moleküle enthält. Die Spotgröße, -Symmetrie, -abstände, -menge spielt hierbei keine Rolle, wie auch die Orientierung der DNA-Moleküle auf der Oberfläche.
Schritt 2:
Zunächst wird mittels eines Überträgerchips und einem konventionellen PCR-Mix mittels PCR ein Scan von einem der Primärarrays hergestellt. Nach Vollendung der PCR befinden sich die gleichen DNA-Spezies im Überträgerchip, die auch auf dem ausgangs DNA-Mikroarray vorhanden sind. Ihre räumliche Anordnung ist ebenfalls erhalten geblieben. Hierdurch wurde also sowohl die räumliche, als auch die inhaltliche Information des Primärarrays in den Überträgerchip übertragen.
Schritt 3:
Der Überträgerchip wird um eine bestimmte Länge in x- oder y-Richtung verschoben.
Schritt 4:
Die gespeicherte Information in Form von DNA Molekülen des Überträgerchips kann mittels PCR und eines Standard PCR-Mix auf eine neue, leere, speziell funktionalisierte Oberfläche kopiert werden. g) RT Zusammenführung
Schritt 1 :
Es wird Primärarray benutzt, welches eine gewisse Anzahl unterschiedlicher DNA Moleküle enthält. Die Spotgröße, -Symmetrie, -abstände, -menge spielt hierbei keine Rolle, wie auch die Orientierung der DNA Moleküle auf der Oberfläche.
Schritt 2:
Zunächst wird mittels eines Überträgerchips und einem konventionellen PCR-Mix mittels PCR ein Scan von einem der Primärarrays hergestellt. Hierbei wird die Struktur des Überträgerchips so gewählt, dass eine beliebige Anzahl von Punkten des Primärarrays in die gleiche Struktur des Überträgerchips übertragen wird. Die Biomoleküle werden dadurch nicht fusioniert, sondern lediglich in der gleichen Struktur gemischt. Nach Vollendung der PCR befinden sich die
Mischungen oder auch einzelne DNA-Spezies in den Strukturen des Überträgerchips.
Schritt 3:
Die gespeicherte Information in Form von DNA Molekülen des Überträgerchips kann mittels PCR und eines Standard PCR-Mix auf eine neue, leere, speziell funktionalisierte Oberfläche kopiert werden. Das erhaltene Sekundärarrays besteht nun aus gemischten Spots. Auch einzelne monoklonare Spots können je nach Wahl der Struktur des Überträgerchips noch vorhanden sein. h) RT Auflösung
Schritt 1 :
Es wird Primärarray benutzt, welches eine gewisse Anzahl unterschiedlicher DNA Moleküle enthält. Die Spotgröße, -Symmetrie, -abstände, -menge spielt hierbei keine Rolle, wie auch die Orientierung der DNA Moleküle auf der Oberfläche.
Schritt 2:
Zunächst wird mittels eines Überträgerchips und einem konventionellen PCR-mix mittels PCR ein Scan von einem der Primärarrays hergestellt. Hierbei wird die Struktur des Überträgerchips so gewählt, dass entweder mehr oder weniger Strukturen verglichen zum Primärarray vorhanden sind. Nach Vollendung der PCR wurde dann z.B. ein Spot des Primärarrays in viele kleinere Strukturen des Überträgerchips übertragen (höhere Auflösung), oder es wurden mehrere Spots des Primärarrays in eine größere Struktur des Überträgerchips übertragen (niedrigere Auflösung)
Schritt 3:
Die gespeicherte Information in Form von DNA Molekülen des Überträgerchips kann mittels PCR und eines Standard PCR-Mix auf eine neue, leere, speziell funktionalisierte Oberfläche kopiert werden. Das erhaltene Sekundärarrays besteht nun aus mehr oder weniger Spots verglichen mit dem Primärarray. i) FT
Schritt 1 :
Es wird Primärarray benutzt, welches eine gewisse Anzahl unterschiedlicher DNA Moleküle enthält. Die Spotgröße, -Symmetrie, -abstände, -menge spielt hierbei keine Rolle, wie auch die Orientierung der DNA Moleküle auf der Oberfläche.
Schritt 2:
Zunächst wird mittels eines Überträgerchips und einem konventionellen PCR-Mix mittels PCR ein Scan von einem der Primärarrays hergestellt. Hierbei wird die Struktur des Überträgerchips so gewählt, dass diese eine andere Form als die Spots des Primärarrays besitzen (z.B. Sterne oder längliche Spots). Nach Vollendung der PCR befinden sich die gleichen DNA-Spezies im
Überträgerchip, die auch auf dem Ausgangs DNA-Mikroarray vorhanden sind. Ihre räumliche Anordnung ist ebenfalls erhalten geblieben. Hierdurch wurde also sowohl die räumliche, als auch die inhaltliche Information des Primärarrays in den Überträgerchip übertragen.
Schritt 3:
Die gespeicherte Information in Form von DNA Molekülen des Überträgerchips kann mittels PCR und eines Standard PCR-Mix auf eine neue, leere, speziell funktionalisierte Oberfläche kopiert werden. Das erhaltene Sekundärarrays besteht nun aus Spots anderer Form verglichen mit dem Primärarray.
Figur 1. regressive Transformation (groß zu klein). Ein Array aus Sechsecken, wurde in kleinere Kreise transformiert. Die Abbildung zeigt einen Ausschnitt von 2 Hexagons.
Figur 2. progressive Transform (klein zu groß) Das Array links wurde mit deutlich größeren Kavitäten in ein Array mit großen Spots (rechts) transformiert. Je nach genauer Lage der ursprünglichen Spots können dabei verschiedene Produkte erzeugt werden. Im Beispiel des unteren Kastens wurde der untere rote Punkt (A) in einen roten Kreis (A) mit deutlich größerem Durchmesser transformiert. Der rote Punkt (A) darüber wurde jedoch mit dem darüber liegenden grünen Punkt (C) zu einem gelben Kreis (B) fusioniert. Direkt über diesem Kasten befindet sich ein grüner Spot (links klein, rechts groß), der wiederum in Reinform transformiert wurde. Im Falle des Kastens oben links wurden 2 grüne (C) und 2 rote Spots (A) (links) in eine Ampel (rot (A), gelb (B), grün (C) (rechts)) umgewandelt.
Figur 3. Allokation der Transformation Die Daten aus Figur 2 wurden hier überlagert um die Transformation klarer darzustellen. Man sieht nun sehr gut, welche kleinen Spots als Keime der größeren Spots beigetragen haben. Einige der kleinen roten Spots haben in diesem Experiment kein Signal erzeugt. Für die grünen Punkte gibt es eine deutlich klarere Zuordnung.
Die Figuren 4 bis 17 zeigen besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
Figur 4: Positionsoptimierung
Problem: Mikroarrays werden gedruckt, d.h. winzige Tropfen kommen auf eine Oberfläche und sind danach unterschiedlich groß (A), nicht genau auf Position (B) oder inhomogen bzw. haben eine unregelmäßige Form (C) etc. D.h. die automatisierte Erfassung der Spots ist schwer.
Lösung: es wird eine Transformation durchgeführt, die die optimale Ortsposition enthält.
Figur 5: Strukturoptimierung
Problem: Mikroarrays werden gedruckt, d.h. die Tropfen haben meist rundliche bis ovale Formen, nun lassen sich beliebige Strukturen erzeugen
Lösung: es wird eine Transformation durchgeführt, die jedem Sport eine individuelle Form gibt, auch solche die bisher nicht herstellbar sind.
Figur 6: Verkleinerung 1
Problem: Das Format von Arrays ist durch den Druckprozess festgelegt, d.h. die Größe der Spots ist durch die minimale Abgabemenge nach unten limitiert, ebenso deren Abstand um Verlaufen der Spots zu vermeiden
Lösung: Es können nun kleinere Spots in der Transformation erzeugt werden.
Figur 7 und 8: Verkleinerung 2a und 2b
Problem: Das Format von Arrays ist durch den Druckprozess festgelegt, d.h. die Größe der Spots ist durch die minimale Abgabemenge nach unten limitiert, ebenso deren Abstand um Verlaufen der Spots zu vermeiden
Lösung: Es werden zwei Transformationen durchgeführt, eine die alles„zusammenzieht“ und dann eine die kleinere Spots macht.
Figur 9: Vergrößerung 1
Problem: Das Format von Arrays ist durch den Druckprozess festgelegt, d.h. die Größe der Spots ist durch die maximale Abgabemenge und Konzentration nach oben limitiert.
Lösung: es können nun größere Spots in der Transformation erzeugt werden.
Figur 10, 11 und 12: Vergrößerung 2a, 2b und 2c
Problem: Das Format von Arrays ist durch den Druckprozess festgelegt, d.h. die Größe der Spots ist durch die maximale Abgabemenge und Konzentration nach oben limitiert. Lösung: in einer ersten Transformation werden die Spots auf Abstand gebracht, danach zunächst verkleinert (!), Um Kontaminationen zu vermeiden und dann vergrößert.
Figur 13 und 14: Positionstausch a und b
Problem: Das Format des Arrays ist nach dem Drucken festgelegt, eine Änderung der Position bedingt automatisch einen Neudruck.
Lösung: In einer ersten Transformation werden die Positionen getauscht und in einer zweiten Transformation dann die Spotgeometrie wiederhergestellt.
Figur 15: Vereinigung
Problem: Die DNA einzelner Spots kann nicht nachträglich fusioniert oder gemischt werden, um damit additive Effekte (wenn z.B. zwei DNAs gemeinsam erst mit einem Protein interagieren), oder allosterische Effekte (wenn eine DNA benötigt wird, um ein Protein zu aktivieren oder von diesem aktiviert wird, das dann an eine andere DNA bindet z.B. Initiationssequenzen oder der Iac--Promotor oder lac-Repressor).
Lösung: Es können zwei oder mehr Spots fusioniert werden und die DNA entweder gemischt nebeneinander, oder linear hintereinander Vorkommen.
Figur 16: Aufspaltung
Problem: Spots können nachträglich nicht nochmals verkleinert werden, damit dann z.B. ein höheres Signal (bei nichtsättigen Bedingungen) oder eine schnellere Kinetik (ambient analyte Theorie) erreicht werden
Lösung: In der Transformation wird der Spot in kleinere Spots zerteilt Figur 17: kombinatorische Mischung
Problem: Das erzeugen vieler DNA Spots, die jedoch identische Teilsequenzen tragen, ist genauso aufwendig, wie das Erzeugen von völlig unzusammenhängenden Sequenzen
Lösung: es wird zunächst von einer Vorlage 1 die DNA entnommen, dann von einer Vorlage 2, um dann als Ergebnis eine kombinatorische Mischung zu erzeugen. So ist es möglich mit n und m Spots auf den Original Arrays insgesamt n*m kombinatorische Mischungen zu erzeugen.
Eine Mischung kann sowohl eine Nebeneinander (mehrere DNA-Sequenzen sind nebeneinander auf der Oberfläche) als auch ein Aneinander (die DNA-Sequenzen sind linear nacheinander aneinander angefügt also verlängert) realisiert werden. Dies kann durch Wahl der Primer und DNA-Sequenzen während des Amplifikationsschrittes der Biochemie realisiert werden (alle Primer identisch = meist nebeneinander und Primer aufeinander abgestimmt = meist aneinander = meist Verlängerungs-PCR).
Figuren 18 bis 22 zeigen besonders bevorzugte Vorrichtungen der Erfindung. Figur 23 zeigt eine schematische Darstellung eines typischen Transformationsprozesses.
Dargestellt ist die Transformation eines kleinen Spots in einen flächenmäßig größeren Spot sowie die Transformation eines flächenmäßig großen Spots in 3 kleiner Spots a: Befüllen des
Kavitätenchips mit einem Reaktionsmix, z.B. PCR-Mix oder zellfreiem Expressionssystem und Platzierung des originalen Arrays auf dem Kavitätenchip b: Durchführung einer Kopierreaktion, z.B. einer PCR. c: Öffnen, waschen und blocken des Chips d: Befüllen des Kavitätenchips mit Reaktionsmix und Verschließung dessen mit einer leeren Array-Oberfläche. e: Durchführung einer Kopierreaktion, z.B. einer PCR. f:Waschen und Blocken des neu entstandenen Arrays (Transformiertes Array) und des Kavitätenchips.
Figur 24 zeigt ein weiteres Beispiel für eine mögliche Anwendung.
Abkürzungen und Erläuterungen:
Überträgerchip Auch Kavitätenchip genannt; Vorrichtung, die zur ortsgebundenen
Abspeicherung von Biomolekülen verwendet werden kann
Primäres Array Auch Vorlagenarray genannt; Mikroarray, welches als Ausganslage dient und nach dem aktuellen Stand der Technik hergestellt wurde; bevorzugt DNA oder RNA Array
Sekundäres Array Mikroarray, welches auf nach einer durchgeführten Array
Transformation hergestellt wird. Es stellt das Endresultat der Array Transformation dar.
RT Raumtransformation - Änderung der Information des Ortes und/oder der Geometrie im Vergleich zum Primärarray
RT Zoom Raumtransformation Zoom - Die Ortsinformation bleibt bestehen; Die
Spots werden aber vergrößert oder verkleinert dargestellt.
RT Drehung Raumtransformation Drehung - Drehung des Primärarrays um
bestimmten Punkt und Winkel (zusätzlich zu Verschiebung)
RT Verschiebung Raumtransformation Verschiebung - Lageveränderung des Arrays im
Vergleich zum Ausgangsarray
RT Streckung Redundanz zu Formtransformation
RT Hinzufügen oder Verbinden von neuen Informationen zur bereits
Zusammenführung vorhandenen Information. Die Beschaffenheit der ursprünglichen
Informationen wird hierbei nicht verändert. RT Auflösung Raumtransformation Auflösungsveränderung Erhöhung oder
Verringerung der Spotanzahl im Vergleich zum Ausgangsarray
FT Formtransformation - Änderung der Ursprünglichen Form der
Arraypunkte des Primärarrays
ST Sequenztransformation - Änderung der Biomoleküle im Vergleich zum
Primärarray
(additive) ST Addition Sequenztransformation, die das Hinzufügen von neuer Information zu der bereits bestehenden Information ermöglicht
(subtraktive) ST Sequenztransformation, die das teilweise oder komplette Entfernen Subtraktion von Information ermöglicht
Entsprechend der Theorie der affinen und teilaffinen Abbildungen aus der Mathematik können sämtliche der verwendeten Transformationen, bijektiv, injektiv und/oder surjektiv sein und darüber hinaus additiv, subtraktiv oder identisch. Dabei bedeutet:
Bijektiv: Jede Kavität des Überträgerchips trifft genau einen Punkt des Primärarrays. Keine Punkte werden ausgelassen.
Injektiv: Die Kavitäten des Überträgerchips treffen jeweils einen Punkt des Primärarrays. Es können Punkte ausgelassen werden
Surjektiv: Jede Kavität des Überträgerchips trifft eine oder mehrere Punkte des Primärarrays. Keine Punkte werden ausgelassen.
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Claims

Ansprüche
1. Verfahren der Mikroarray-T ransformation umfassend die folgenden Schritte a) Bereitstellung eines Vorlagenarrays, wobei das Vorlagenarray mehrere Spots mit Vorlagenmolekülen umfasst und wobei die Vorlagenmoleküle bevorzugt Oligonukleotide sind, b) Bereitstellung eines Kavitätenchips umfassend eine Transfermatrix, c) Bereitstellung eines Reaktionsmixes im Kavitätenchip, d) Platzierung des Vorlangenarrays auf dem Kavitätenchip, e) Kopierprozess, wobei die Oligonukleotide der Spots des Vorlangenarrays auf den Kavitätenchip kopiert werden f) Bereitstellung einer Arrayoberfläche. g) Bereitstellung eines Reaktionsmixes im Kavitätenchip, h) Platzierung der Arrayoberfläche auf dem Kavitätenchip, i) Kopierprozess, wobei die Oligonukleotide der Spots des Kavitätenchips auf die Arrayoberfläche als DNA, RNA oder Protein kopiert werden und wobei dieses neu entstandene weitere Array sich hinsichtlich Spotform, Spotgröße, Spotlage und/oder hinsichtlich der enthaltenden Information vom Vorlagenarray unterscheidet.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei eine Modifikation, Verlängerung, Verkürzung,
Derivatisierung und/oder Invertierung der Moleküle in den Kavitäten des Kavitätenchips und/oder während der Kopierprozesse erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Schritte a) bis e) mindestens einmal wiederholt werden, wobei derselbe Kavitätenchip aber ein anderes Vorlagenarray oder das gleiche Vorlagenarray in anderer oder der gleichen Orientierung verwendet wird.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kopierschritt einen Amplifikationsschritt umfasst.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Reaktionsmix ein PCR-Mix, ein isothermaler Amplifikationsmix, ein reverser Transkriptionsmix, ein
Transkriptionsmix oder ein zellfreier Expressionsmix ist.
6. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorlagenmoleküle Oligonukleotide, bevorzugt DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle sind.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kavitäten des Kavitätenchips mit Primern beschichtet sind.
8. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Primer am 3’-Ende oder am 5’ Ende eine zusätzliche DNA-Sequenz tragen.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mehrere Spots des Vorlagenarrays in dem Kavitätenchip und/oder weiteren Array zusammengeführt werden, um so eine Mischung an Vorlagemolekülen bzw. den daraus abgeleiteten Molekülen zu erzeugen und/oder um eine DNA oder RNA zu erzeugen, die mehrere Teilsequenzen bzw. Ableitungen dieser Teilsequenzen der Vorlagemolekülen aus den jeweiligen Spots umfasst.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Spots von
mindestens zwei Vorlagenarrays in dem weiteren Array zusammengeführt werden, um so eine Mischung an Kopien zu erzeugen und/oder um eine Kopie zu erzeugen, die mehrere Teilsequenzen bzw. Ableitungen dieser Teilsequenzen der Vorlagemolekülen aus den jeweiligen Spots umfasst.
1 1 . Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Spot des Vorlagenarrays in dem weiteren Array in mehrere Spots unterteilt wird.
12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zusätzliche DNA- Moleküle in Lösung hinzugegeben werden, so dass die Moleküle um diese DNA Sequenz verlängert bzw. verändert werden.
13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die
Vorlagenmoleküle DNA-Moleküle sind, die alle oder teilweise kurze, gleiche DNA Sequenzen von bevorzugt 10-30 Basenpaare besitzen. .
14. Verfahren nach Anspruch 8 oder 13, wobei die zusätzlichen Sequenzen als Barcode für eine Ortsinformation verwendet werden können und/oder die Primer eine Sequenz zur
Transkription und/oder der zellfreien Synthese enthalten können
15. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die die
Transformation räumlich und/oder zeitlich begrenzt ist.
16. Kavitätenchip zur Durchführung eines Verfahrens nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine Transfermatrix mit Kavitäten, wobei die Kavitäten so angeordnet sind, dass eine Transformation erfolgen kann.
17. Vorrichtung zur Durchführung einer Transformation nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend
• einen Kavitätenchip nach dem vorhergehenden Anspruch,
• mindestens ein Vorlagenarray und
• mindestens eine Arrayoberfläche.
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