EP3765635A1 - Procede d'extraction d'acides nucleiques - Google Patents

Procede d'extraction d'acides nucleiques

Info

Publication number
EP3765635A1
EP3765635A1 EP19717541.7A EP19717541A EP3765635A1 EP 3765635 A1 EP3765635 A1 EP 3765635A1 EP 19717541 A EP19717541 A EP 19717541A EP 3765635 A1 EP3765635 A1 EP 3765635A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acids
sample
masking
proteins
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19717541.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Alain Laurent
Arnaud Burr
Ali Laayoun
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP3765635A1 publication Critical patent/EP3765635A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting nucleic acids using a suitable solid support, for example, based on silica.
  • the method comprises a nucleic acid capture step by contacting the sample with a suitable solid support, characterized in that, prior to the capture step, said method comprises a sample treatment step with at least one reagent for masking the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides of the sample.
  • nucleic acids from complex biological samples (blood, tumor, food, etc.) which consists of a chemical or mechanical lysis of the cells in order to release the contents and particularly the nucleic acids. The latter are then purified selectively and then amplified if their quantity is not sufficient for direct detection.
  • nucleic acid extraction techniques use solid phases where the cells are lysed under specific reaction conditions and the released nucleic acids bind to the solid phase. It is well known in the state of the art that current nucleic acid extraction techniques very often implement solid phases which are, for example, particles coated with silica. Silica has the property of reversibly adsorbing nucleic acids under certain salt concentration and pH conditions, making it a very suitable material for this purpose. These techniques are described for example in "Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Boom, Journal of Clinical Microbiology, 1990 p495 or in US Pat. No. 5,234,809 by the same author.
  • the present disclosure is directed to providing methods for extracting nucleic acids that meet one or more of the following criteria:
  • the present disclosure relates to a method of extracting nucleic acids from a sample comprising proteins and / or polysaccharides, said method comprising a step of capturing nucleic acids by contacting the sample with a suitable solid support , characterized in that, prior to the capture step, said method comprises a step of treating the sample with at least one reagent for masking the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides of the sample .
  • the function masking reagent amines is selected from acylating or alkylating agents.
  • the masking reagent is chosen from the acylating agents of formula (I) below:
  • R is an organyl, organyloxy or organylamino group
  • LG is a leaving group selected from the group consisting of halogens, organyloxy groups and organylamino groups.
  • the masking reagent may be an acylating agent selected from the group consisting of activated esters, acid halides, chloroformates, anhydrides, activated carbonate esters, and carbonyl diimidazole.
  • the masking reagent is an anhydride selected from acetic anhydride, propanoic anhydride, isobutyric anhydride, butanoic anhydride or benzoic anhydride.
  • the masking reagent is an alkylating agent selected from the group consisting of alkyl halides, diazo compounds, and aldehydes.
  • the masking reagent is selected from amines, alcohols and thiols for masking the carboxylic acid functions of the proteins, in combination with a coupling agent.
  • a coupling agent for example R1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), di-isopropylcarbodiimide (DIC) or dicyclohexylcarbodiimide (DCC).
  • the method for extracting nucleic acids from a biological sample comprises the following steps: a. lysis of the cells, for example by bringing the biological sample into contact with a lysis buffer,
  • washing the support with a washing buffer d. where appropriate, washing the support with a washing buffer and,
  • the solid support may consist of silica particles, in particular magnetic silica particles.
  • the biological sample is a sample of blood, plasma or serum.
  • the capture step is performed in the presence of chaotropic agents.
  • the extraction method does not include the use of proteases for protein removal.
  • no organic solvent is added before or during the nucleic acid capture step.
  • less than 50 ⁇ l, preferably less than 10 ⁇ l, and even more preferably less than 1 ⁇ l of organic solvent is added, before or during the nucleic acid capture step, per 100 ⁇ l of sample.
  • the method comprises an additional step of detecting nucleic acids of interest, in particular by amplification of the extracted nucleic acids.
  • nucleic acid extraction kits comprising at least i. a reagent for masking the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides as defined above,
  • a suitable solid support for example based on silica, for the extraction of the nucleic acids, iii. if necessary, a catalyst of the reaction for masking the amine and / or carboxylic acid functions using the reagent,
  • the present disclosure also relates to the use of a reagent for masking the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides as defined above, for the inhibition of nuclease.
  • the nuclease to be inhibited is included in a lysate obtained by lysis of a biological sample, for example, for amplification or detection of a nucleic acid in the sample.
  • extraction is meant a technique for isolating nucleic acids from any sample, for example, isolation of DNA and / or RNA from eukaryotic cells, prokaryotic, human animal, microorganism or tissue.
  • the extraction from biological sample within the meaning of the invention generally includes lysis of cells and purification of nucleic acids from the lysate.
  • the purification itself comprises the capture of the nucleic acids on a suitable solid support, preferably based on silica, the washing optionally followed by the elution of the nucleic acids.
  • the capture consists of adsorbing the nucleic acids on the solid support and the elution, when it takes place, consists of the desorption or release of the latter from the solid support.
  • sample any type of sample comprising at least nucleic acids, and agents inhibiting the extraction of nucleic acids, such as proteins and / or polysaccharides.
  • the sample may have various origins such as food, environmental, human, veterinary or cosmetic samples. All these samples, if they are not liquid, are previously treated to be in liquid form. The sample used in the extraction process is therefore in liquid form. Preferably, the sample used in the extraction process is an unbound sample.
  • Non-fixed sample means a sample that has not been processed to be preserved in its original state. Fixing a sample is a a technique well known to those skilled in the art, which may for example be carried out with an aldehyde, such as formaldehyde or glutaraldehyde.
  • Examples of food-based samples include, but are not limited to, a sample of milk products (yogurts, cheeses, etc.), meat, fish, eggs, fruit, vegetables, and beverages. (milk, fruit juice, soda, etc.). Of course, these food-based samples may also come from sauces or more elaborate dishes or unprocessed or partially processed raw materials.
  • a food sample may also be derived from a feed intended for animals, such as cakes, animal meal.
  • the sample may be of environmental origin and may consist of, for example, surface sampling, water, etc.
  • the sample may also consist of a biological sample, of human or animal origin, which may correspond to samples of biological fluid (urine, whole blood or derivatives such as serum or plasma, sputum or saliva, pus, cerebrospinal fluid, etc.), stool (eg cholera diarrhea), nose, throat, skin, wounds, organs, isolated tissues or cells, swab specimens, broncho specimens or washes -Alveolar, biopsies. This list is obviously not exhaustive.
  • biological fluid urine, whole blood or derivatives such as serum or plasma, sputum or saliva, pus, cerebrospinal fluid, etc.
  • stool eg cholera diarrhea
  • nose, throat skin, wounds, organs, isolated tissues or cells
  • swab specimens broncho specimens or washes -Alveolar, biopsies.
  • sample generally refers to a part or quantity, more particularly a small part or a small quantity, taken from one or more entities for analysis. This sample may possibly have undergone prior treatment, involving for example mixing, dilution or grinding steps, in particular if the starting entity is in the solid state.
  • the sample analyzed is, in general, capable of - or suspected of - containing at least nucleic acids representative of the presence of microorganisms, a patient's condition (for example immunosuppression, pregnancy %) or a disease to detect, characterize or follow.
  • the sample comprises isoelectric point proteins less than 8, or even less than 7.
  • the sample comprises at least one of the following proteins: human serum albumin (HSA), fibrinogen, immunoglobulins, especially IgG, and hemoglobin.
  • micro-organism By a “micro-organism” is meant all or part of a bacterium, a fungus, a yeast, a protozoan or a virus.
  • nucleic acids DNA or RNA of all types: genomic DNA, complementary DNA, messenger RNA, complementary RNA, transfer RNA, mitochondrial RNA, chloroplast DNA, ribosomal RNA, plasmid DNA, Viral DNA or RNA, microRNA, snoRNA, siRNA, RNAi, single-stranded or double-stranded form.
  • proteins any molecule comprising at least one polypeptide chain, characterized by a sequence of amino acid residues linked together by peptide bonds. This includes, in particular, peptides and polypeptides and any modified polypeptide or its derivatives resulting from post-translational or other modifications, their degradation products, in particular by enzymatic degradation, lipoproteins, etc.
  • appropriate solid support is meant any support capable of participating in the extraction of nucleic acids from a biological sample.
  • it is a support comprising or consisting of silica or one of these derivatives (silicate, glass, silica modified with organic groups, etc.), magnetic or otherwise, and capable of participating in the process.
  • extraction of nucleic acids from a biological sample may also be a carrier based on paper, cellulose, or pure magnetite, or other polymers known for their uses in the extraction of nucleic acids. It can be at least a plane support, a hollow support, a slab, a needle, a membrane, a plate, a sheet, a cone, a tube, fibers, a marble or a particle.
  • Solid support is preferably a ball or particle or membrane.
  • the solid support is preferably magnetic.
  • the method comprises the following steps: a) lysis of the cells, for example by bringing the biological sample into contact with a lysis buffer,
  • step b) is directly followed by step c), that is to say that there is no intermediate step, for example no step of deprotection of the masked functions between steps b) and c).
  • the nucleic acid extraction process does not include a deprotection step of the amine and / or masked carboxylic acid functions.
  • the present disclosure also relates to the use of a reagent for masking the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides in a method for extracting nucleic acids from a biological sample using a solid support. appropriate.
  • the lysis step involves breaking the sample cells (cell walls and membranes) to release the nucleic acids.
  • the cells are chemically lysed by contacting the sample with a lysis buffer.
  • the lysis buffer must be both effective in breaking the cell membranes and soft enough not to degrade the nucleic acids.
  • the lysis buffer may comprise, for example, a detergent and optionally a chelating agent.
  • the pH is generally maintained between 4 and 8, for example between 6 and 8, using a suitable buffer, for example Tris HCl, optionally in concentrations of between 10 and 100 mM.
  • the detergent may be selected from Tween, Newts, SDS and other detergents commonly used at concentrations of between 0.05 and 20%.
  • the lysis buffer contains reagents for the inactivation of nucleases, and / or the removal of proteins, for example proteases such as proteinase K.
  • Other enzymes can also be used as lytic enzymes (hydrolase, zymolase %) to digest the wall of yeasts and fungi.
  • the lysis buffer does not include reagents for the removal of proteins and especially proteases.
  • the masking reagent of the amine and / or carboxylic functions used in the extraction process according to the present disclosure advantageously also allows an inhibition of the enzyme activity of the nucleases possibly released into the lysate.
  • the lysis buffer also comprises chaotropic agents.
  • Chaotropic agents interfere with weak (non-covalent) intramolecular interactions, such as hydrogen bonds, van der Waals forces, and hydrophobic forces.
  • chaotropic agents mention may be made of urea, guanidine salts such as guanidinium chloride or thiocyanate and lithium perchlorate. They are generally used in concentrations ranging from 1 to 6 M, in particular for GuSCN and GuHCl.
  • the lysis buffer does not include chaotropic agents.
  • Chelating agents such as EDTA or similar compounds, for example between 5 and 50 mM and / or reducing compounds such as DTT (dithioerythritol) or TCEP (tri carboxyethylphosphine), or beta-mercaptoethanol at concentrations of, for example, 0.5 to 100 mM.
  • the lysis buffer can also comprise organic solvents such as alcohols (ethanol, isopropanol, etc.). In a preferred embodiment however, the lysis buffer does not include organic solvents.
  • the chemical characteristics of a sample must be taken into account when optimizing the lysis buffer.
  • the acidity of a sample eg, some soil samples
  • the sample is contacted with the lysis buffer for a time sufficient to allow lysis of the cells without degrading the nucleic acids, for example between 0 and 15 min.
  • An essential characteristic of the nucleic acid extraction process concerns the step of treating the lysate using a reagent for masking the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides of the lysate. 'sample.
  • This treatment step can be carried out by adding the masking reagent to the lysate after the lysis step.
  • the masking reagent is included directly in the lysis buffer, the lysis and treatment of the sample being concomitant.
  • the objective is to neutralize the charged functions of the proteins and / or polysaccharides that may affect the extraction yield using a solid support, preferably based on silica.
  • the inventors have demonstrated the impact of bio-molecules on the extraction yield, and in particular proteins and / or polysaccharides of biological samples in extraction processes using supports.
  • solids such as particles coated with silica.
  • the proteins and / or polysaccharides may in particular interact with the silica beads and / or the nucleic acids via their charged functions, and in particular their amine and / or carboxylic acid functions.
  • masking reagent any chemical compound capable of reacting (preferably irreversibly) with at least certain amine and / or acid functional groups.
  • carboxylic proteins and / or polysaccharides present in a lysate of a biological sample so as to change the properties of polarity, isoelectric point, and / or charge of these proteins and / or polysaccharides.
  • the masking reagent makes it possible to mask the charged functions, and especially the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides.
  • the nucleic acids are not modified by the masking reagent.
  • the reaction conditions, and in particular the concentration of masking reagent can be chosen so that the nucleic acids are not modified during the masking step.
  • the concentration of masking reagent or coupling agent, when present is between 0.01 M and 1.8 M, for example between 0.1 M and 1.0 M for example between 0.2 and 0.6 M.
  • the masked amine and / or carboxylic acid functions of the modified proteins and / or polysaccharides remain masked throughout the duration of the nucleic acid extraction process according to the present disclosure.
  • the nucleic acid extraction process does not include a deprotection step of the amine and / or masked carboxylic acid functions.
  • the masking reagent is chosen from acylating or alkylating agents, making it possible to mask the amine functions of the proteins or polysaccharides.
  • the acylating or alkylating agent must be able to mask the amine functions of the proteins or polysaccharides in an aqueous medium.
  • an acylating agent that can be used as a masking reagent in the nucleic acid extraction process has the following formula (I):
  • R is an organyl, organyloxy or organylamino group
  • LG is a departing group.
  • LG is meant an atom or a group which, during the acylation reaction, detaches from the carbon atom to which it is attached.
  • LG is a leaving group selected from the group consisting of halogens, organyloxy and organylamino groups.
  • the masking reagent may be an acylating agent selected from the group consisting of activated esters, acid halides, chloroformates, anhydrides, activated carbonate esters and carbonyl diimidazole.
  • activated esters mention may be made of tetra or pentafluorophenyl acetate, nitrophenyl acetate, pentafluorophenyl trifluoroacetate, and N-hydroxysuccinimide esters, such as N-hydroxysuccinimide acetate.
  • acid chlorides such as acetic acid, propanoic acid, isobutyric acid, butanoic acid or benzoic acid chloride.
  • chloroformates mention may be made of 9-fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc-Cl).
  • anhydrides mention may be made of acetic, propanoic, isobutyric, butanoic, benzoic, maleic, succinic or phthalic anhydride.
  • activated carbonate esters mention may be made of di-tert-butyl dicarbonate (Boc 2 0).
  • the masking reagent is acetic anhydride or its dry form, N-hydroxy-succinimide acetate.
  • an alkylating agent may be selected from the group consisting of alkyl halides, aryl sulfates, aryl diazo methyls, triazenes and aldehydes.
  • alkyl halides mention may be made of methyl iodide, ethyl or propyl, or methyl bromide.
  • aryl diazomethyl compounds mention may be made of methyl diazopyridine (WO2010012949A1).
  • aldehydes mention may be made of formaldehyde and acetaldehyde.
  • the acylating or alkylating reagent is used in combination with a catalyst known to those skilled in the art.
  • a catalyst known to those skilled in the art.
  • acylation with acetic anhydride for example 4-dimethylaminopyridine (DMAP) can be used as a catalyst.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • the reagent used is chosen from amines, alcohols and thiols, for the masking of the carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides, in combination with a coupling agent.
  • the coupling agent is used to activate the carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides by forming activated esters. These activated esters will then react with a nucleophile selected from amines, alcohols and thiols.
  • the nucleophile may be present on the protein and / or the polysaccharide (amine, alcohol or thiol of an amino acid of the protein and / or polysaccharide) or in the medium, as in the case of a nucleophilic buffer, for example the Tris.
  • the coupling agent may for example be chosen from carbodiimides, among which mention may be made of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), di-isopropylcarbodiimide (DIC) and dicyclohexylcarbodiimide (DCC). ).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • DIC di-isopropylcarbodiimide
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • the carbodiimides may be used in combination with other reagents such as N-hydroxysuccinimide and triazoles, among which may be mentioned 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) and 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt).
  • the masking reagent may also be bi-functionalized or multifunctionalized in order to establish bridges between the reactive residues of the proteins (bridging compounds such as bisaldehyde, N-hydroxysuccinimide bis ester, acid bis boron chloride and their derivatives). bridging compounds such as bisaldehyde, N-hydroxysuccinimide bis ester, acid bis boron chloride and their derivatives).
  • an acylating agent such as acetic anhydride may be used in concentrations of between 0.01 M and 1.8 M, for example between 0.1 M and 1.0 M, for example between 0.2 and
  • concentration of the masking reagent used for the treatment of the sample may be adjusted according to the concentration of proteins and / or polysaccharides in the sample, the masking reagent used, the source of the sample. sample and lysis conditions used.
  • concentration of acylating agent may be chosen to react with the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides, without reacting with the nucleic acids.
  • the incubation time of the lysate, or the sample being lysed when the lysis and treatment step are concomitant, in the presence of the masking reagent is generally between 1 second and 30 minutes, but preferably less than 10. minutes.
  • a step is performed to control the acidity of the treated lysate, for example with sodium hydroxide (NaOH), in particular in order to obtain a pH of the treated lysate of preferably between 5 and 7.
  • NaOH sodium hydroxide
  • the amount of sodium hydroxide added during this step is low, this step therefore only makes it possible to control the pH before the capture step, it is not a step of deprotection of the amine functions and / or masked carboxylic acids of the proteins and / or polysaccharides.
  • This step of controlling the acidity of the treated lysate is optional, in a particular embodiment, this step is not present.
  • a treated lysate comprising modified proteins and / or polysaccharides.
  • at least part of the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides are masked after treatment, preferably the nucleic acids are not modified by the masking reagent.
  • the capture step consists of placing the treated lysate in the presence of a solid support, for example a silica-based solid support, under conditions permitting the adsorption of the nucleic acids (solid phase extraction of the nucleic acids).
  • a solid support for example a silica-based solid support
  • the silica-based support for example silica beads or particles, makes it possible to separate the nucleic acids, retained by adsorption on the silica, from other cellular contaminants (membranes, proteins treated with the masking reagent, etc.). .
  • no antibody is used during the capture step.
  • the capture step takes place directly after the step of treating the sample or lysate with the masking reagent.
  • the sample comprises modified proteins and / or polysaccharides (i.e. masked by the masking reagent) and non-nucleic acids. modified (that is, not masked by the masking reagent).
  • a sufficient amount of silica beads or particles is added to the treated lysate.
  • the conditions for the adsorption of nucleic acids include the presence of chaotropic agents, such as guanidinium chloride or thiocyanate.
  • guanidinium in a buffered medium between pH 4 and pH 8, for example with the aid of organic compounds such as the salts of TRIS (Tri (hydroxyethyl) amino methane), the salts of acetate, of phosphate, of citrate, or of MES ("morpholino ethane sulfonic acid").
  • a detergent preferably the triton XI 00 or one of these analogs (Tergitol, Tween, Bridj, Nonidet, Ecosurf, etc.).
  • said detergent is contained in the lysis buffer.
  • the silica-based support is preferably negatively charged between pH 5.0 and pH 8.0.
  • chaotropic agents or alcohols are not used during the adsorption capture step on the solid support.
  • An appropriate support will then be used, in particular an amine support.
  • beads or particles of silicas that can be used for the capture step, mention may be made of the particles included in the following kits: NucliSENS easyMAG Magnetic Silica (BioMerieux), Film Array (BioMérieux / Biofire Diagnostic), kits Qiasymphony (Qiagen) and Magnapure Kit (Roche).
  • the silica-based solid support is an extraction column with a silica membrane.
  • a silica membrane By way of example, mention may be made of the kits sold under the names Purelink Genomic DNA Extraction Kit (Invitrogen), DNeasy Blood and Tissue Kit (Quiagen).
  • the treated lysate is deposited on the silica membrane column, centrifuged to pass the lysate through the column. Nucleic acids are retained on the column and proteins, polysaccharides and other cellular debris pass through the column.
  • silica-based carriers and their uses for the extraction of nucleic acids are described in particular in the following articles: Cady, et al. Nucleic acid purification using micro fabricated Silicon structures. Biosensors and Bioelectronics 19, 59-66 (2003); A. Melzak, CS Sherwood, RFB Tumer, CA Haynes. Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions. J Colloid and Interface Science 181, 635-64 (1996); Tian, et al. Evaluation of Silica Resins for Direct and Efficient Extraction of DNA from Complex Biological Matrices in a Miniaturized Format, Analytical Biochemistry 283, 175-191 (2000); Wolfe, et al. Toward has a microchip-based solid-phase extraction method for isolation of nucleic acids. Electrophoresis 23, 727-733 (2002).
  • magnetic silica particles are used.
  • the magnetic silica particles may be held by a magnet during the washing and, where appropriate, elution steps following capture. This embodiment is particularly preferred for automation of the extraction process.
  • magnetic particles which may be used include the kit sold under the name NucliSENS easy M AG Magnetic Silica (BioMérieux).
  • the process for extracting nucleic acids from an unbound sample comprising proteins and / or polysaccharides comprises a step of capturing the nucleic acids by contacting the unfixed sample. with a suitable solid support, characterized in that, prior to the capture step, said method comprises a step of treating the sample with at least one reagent for masking the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides of the sample, and in that the capture step takes place directly after the step of treating the sample with the masking reagent.
  • washing steps can be carried out in the presence of a washing buffer, allowing the removal of contaminating elements without detaching the nucleic acids from the support.
  • the washing step may for example comprise a washing step in a suitable washing buffer, for example a weakly salt solution optionally containing an alcohol and / or a washing step in the presence of an alcohol in order to eliminate the salts.
  • at least one washing step is performed.
  • the elution step consists in releasing the nucleic acids retained on the solid support.
  • a buffer of basic pH for example a pH of between 8 and 10, and of low ionic strength, such as Tris or borate buffer, is used.
  • the detection or amplification step is carried out directly on the appropriate solid support having captured the purified nucleic acids without prior elution step. Preferably, this is done on a ball or a particle or a membrane and more preferably still on a magnetic particle or not.
  • nucleic acids thus purified by the method described above can be used in particular for amplification and in vitro detection applications.
  • the invention is particularly suitable for the preparation of nucleic acids for the detection of nucleic acids of interest in a sample (in vitro detection test), especially following the amplification of a nucleic acid of interest.
  • the invention therefore relates to a method for detecting a nucleic acid sequence of interest in a biological sample, said method comprising:
  • the detection step (ii) comprises a step of amplification of the nucleic acid sequence of interest.
  • the invention also provides a method of amplifying a nucleic acid comprising (i) carrying out a method for extracting nucleic acid on a suitable support as described above, and (ii) ) a nucleic acid amplification step using a DNA polymerase.
  • the amplification step can take place just after the capture step. Since the nucleic acids are not modified by the masking reagent, it is not necessary to unprotect them before proceeding with the amplification.
  • the amplification process is carried out using a DNA polymerase, such as Taq polymerase, Pfu polymerase or T7. polymerase, the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase. coli and / or reverse transcriptase, or any other polymerase.
  • a DNA polymerase such as Taq polymerase, Pfu polymerase or T7. polymerase, the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase. coli and / or reverse transcriptase, or any other polymerase.
  • the amplification method is a polymerase chain reaction (PCR) reaction, well known to those skilled in the art.
  • the PCR protocol comprises, for example, 20 to 40 cycles, each cycle comprising at least (i) a denaturation phase of the DNA to be amplified at a temperature generally of between 90 ° C. and 95 ° C., (ii) a phase of hybridization of the primers with the DNA to be amplified at a temperature generally between 55 ° C and 65 ° C and (iii) an extension phase at a temperature generally between 68 ° C and 75 ° C.
  • PCR nucleic amplification methods can also be implemented.
  • nested PCR nested PCR
  • quantitative or qPCR
  • semi-quantitative or real-time PCRs error-prone PCRs
  • reverse transcription PCR RT-PCR
  • LAMP LAMP
  • NASBA TMA
  • RP A LCR
  • RCR RCR
  • SR SR
  • RCA reverse transcription PCR
  • the invention also provides nucleic acid extraction kits or kits comprising at least i. a reagent for masking the amine and / or carboxylic acid functions of the proteins and / or polysaccharides as described in the preceding paragraphs, for example an acylating agent and preferably, acetic anhydride or its dry form, N-Hydroxy acetate succinimide
  • a solid support suitable for the extraction of nucleic acids iii. if appropriate, a catalyst of the reaction for masking the amine and / or carboxylic acid functions using the reagent, and / or
  • the extraction kit may further include buffers, controls and / or instructions for use.
  • the extraction kit does not include a deprotection reagent for amine functions and / or masked carboxylic acids.
  • the extraction kit does not include an organic solvent.
  • the kit may comprise in particular the following elements: i. a coupling agent, for example, EDC,
  • a suitable solid support based on silica for the extraction of nucleic acids, for example silica beads, and in particular magnetic silica beads, and at least one of the following optional elements:
  • a lysis buffer comprising Tris or another nucleophilic buffer, iv. one or more wash buffers, and / or,
  • the kit comprises a column with a silica membrane as a solid support based on silica.
  • Figure 1 Inhibition of the capture of DNA on solid support by certain proteins in chaotropic conditions
  • FIG. 2 Inhibition of the capture of the DNA on a solid support by certain polysaccharides under chaotropic conditions
  • Figure 3 Inhibition of the capture of DNA on solid support by model mono-functional polymers.
  • Figure 4 A. Extraction of the nucleic acids contained in a blood sample using the easyMAG extraction kit (BioMérieux) and pretreatment of the lysate with acetic anhydride (Ac20) or acetic acid (AcOH) (capture in 3M GuHCl + 1% Triton and ethanol washes). B. Measurement of the amount of nucleic acids by chromatographic analysis.
  • FIG. 5 HPLC analysis of extraction eluates of a mixture of DNA and RNA that is or is not subjected to acetic anhydride. Top: Eluate from the extraction of a mixture of 10 ⁇ g of DNA and RNA and 5.2 mg of protein in the presence of acetic anhydride. Bottom: Eluate obtained from the extraction of a mixture of 10 ⁇ g of DNA and RNA.
  • FIG. 6 Fluorescence detection curve (RFU) of the real-time amplification of CMV virus nucleic acids in the blood by PCR.
  • the curves of FIG. 6 correspond respectively to the control amplification carried out after extraction without a biological matrix (triangles), with a biological matrix without treatment with acetic anhydride (cross) and with a biological matrix with acetic anhydride treatment (round). .
  • Figure 7 Sensitivity of the detection of CMV virus in the blood, without or with treatment with Ac 2 anhydride prior to extraction (Ct): Left: 10 e 4 copies of CMV in Tris HCl, In the center : lO e 4 copies of CMV in the blood, right: lO e 4 copies of CMV in the blood + AC20.
  • Figure 8 Extraction of DNA in the presence of a mixture of hemoglobin and human serum albumin on a column with silica membrane with and without treatment with Ac20. Left (dark gray): without Ac20 treatment, right (light gray): with Ac20 treatment
  • the LC-MS analyzes were carried out with a WATERS Alliance 2795 HPLC chain equipped with a PDA 996 diode array detector (Waters ), a ZQ 2000 mass spectrometry detector (Waters), an Empower version 2 software.
  • the ZQ 2000 mass spectrometer has an Electrospray ionization source. Ionizations were performed in positive mode with a cone voltage of 20V and a voltage at the level of the capillary of 3.5kV.
  • Example la Demonstration of the Inhibitory Effect of Protein Compounds of the Blood for the Capture of Nucleic Acids on a Solid Support (Magnetic Silica Particles Used at pH 7)
  • the inventors have assumed that the first step was to attempt to increase the performance of the capture step.
  • the inhibitory effect seems to be partly related to the isoelectric point of the proteins, with, respectively, in order of inhibition, the human serum albumin (HSA) which has an isoelectric point of 4.8, the fibrinogen of 5.8, the hemoglobin and immunoglobulin 7, and lysozyme of 11.3.
  • HSA human serum albumin
  • This example thus demonstrates the inhibitory effect of the compounds of the blood on the extraction yield of the nucleic acids, and more particularly the compounds proteins that are negatively and positively charged. It is found that the compounds among the most competitive are those present in large quantities in the blood (human serum albumin, fibrinogen, immunoglobulins and hemoglobin).
  • a blood sample could contain between 200 and 500 mg / ml of proteins.
  • the sample could comprise at least 40 to 100 mg of "inhibitor" nucleic acid capture compounds.
  • Example 3 Inhibitory effect of high protein concentration for nucleic acid extraction, DNA elution efficiency and purity of the extracted DNA (magnetic silica particles used at pH 7)
  • the lysis solution corresponds respectively to 23 ⁇ g of DNA in 200 ⁇ l of GuHCl or 3 M GuSCN, 50 mM Tris pH 7, 1% Triton XI 00, or easyMAG lysis buffer (bioMérieux, Marcy l'étoile, France). diluted to 3M.
  • Table 1 Extraction yield of 23 ⁇ g of DNA in the presence or absence of protein inhibitors. Figures in parentheses indicate the 260/280 nm ratio of the eluate. As in the previous examples, a sharp drop in the extraction yield is observed. Whatever the lysis conditions, we go from a DNA extraction yield (capture, washing, elution) of about 60%, to less than 6% when we add proteins in the medium.
  • the purity of the extracted nucleic acids is also greatly affected since the presence of proteins lowers the 260/280 representative ratio of protein contamination in the final eluate from 2 to less than 1.6 on average (see Table 1). This therefore reflects a very high protein concentration in the eluate.
  • EXAMPLE 4 Increase of the extraction yield of the DNA by the use of a reagent for masking the amine and / or carboxylic acid functions in the presence of a high concentration of proteins (use of magnetic particles at pH 7)
  • the inventors have performed the same experiment as that described in Example 3 above but this time adding a treatment with acetic anhydride or EDC prior to contact with the magnetic silica particles.
  • the total extraction yield is calculated relative to the initial 23 ⁇ g of DNA and the amount of nucleic acids obtained in the eluate.
  • the assay is performed by UV spectrophotometry at 260 nm.
  • GuHSCN which has a higher denaturing power than GuHCl, allows a better yield of DNA capture in the presence of proteins.
  • the presence of EDTA in the LB decreases the 260/280 ratio, while the Triton X-100 also present in the LB has a very beneficial effect.
  • Table 2 Extraction yield of 23 ⁇ g of DNA in the presence or absence of protein inhibitors and with or without acetic anhydride (Ac20) or EDC, and under different lysis conditions. Numbers in parentheses indicate the 260/280 nm ratio of the eluate.
  • Example 5 Improvement of the efficiency of the extraction of nucleic acids in the blood (extraction with magnetic particles at pH 7)
  • the blood sample was subjected during the lysis step to treatment with 0.3 M acetic anhydride or 0.3M acetic acid for 5 min, before being neutralized by adding a few m ⁇ of sodium hydroxide. (in comparison with an untreated reference sample).
  • the magnetic particles were added and the lysate put on the easyMAG following the extraction protocol of the supplier (bioMérieux).
  • the amount of nucleic acids present in the blood is measured by UV spectrophotometry (Nanodrop, Thermofischer). It is noted in a remarkable way in FIG.
  • the hydrolysates were analyzed by HPLC so as not to be impeded by the proteins and the area corresponding to the nucleosides (DNA and RNA) was measured on the chromatograms by integration of the masses corresponding to the nucleosides.
  • the results obtained show that the sample of blood previously treated with acetic anhydride contains 12 times more nucleic acids than the untreated sample or treated with acetic acid (which is non-acylating) (FIG. 4B).
  • a l33pL a blood solution are added 237 pL lysis buffer (6M GuHCl, 15% Triton, NaOAc, pH 5.5) and 6PL, 12m1 or 24 pL of Ac 2 0.
  • the medium is incubated with stirring for 3 to 5 min at the thermomixer at 25 ° C and 500 rpm before rectifying the pH to 5.5 if necessary by adding a few m ⁇ of 10M NaOH.
  • 3 ⁇ L, 4.5 and 6.8 ⁇ L of NaOH are added for 6 ⁇ L, 12 ⁇ L and 24 ⁇ L of Ac 2 O, respectively.
  • the lysate is added to the magnetic silica particles in order to extract the nucleic acids.
  • wash solutions (3 times 70 ml Wash Buffer IX) precede the elution step which takes place in a solution of 70 ⁇ l of Tris HCl with stirring at 1400 rpm, at 70 ° C. in 5 minutes.
  • the lysates are subjected to nucleic acid hydrolysis enzymes as described in Example 5 to determine the amount of nucleic acid extracted.
  • the results obtained show that the addition of the masking reagent (acetic anhydride) in the presence of blood makes it possible to double the quantity of nucleic acids extracted.
  • Example 7 Treatment of DNA with acetic anhydride under the conditions of the process according to the present disclosure does not alter the chemical structure of the nucleosides
  • Example 8 Demonstration that the structure of DNA and RNA is not affected during treatment with acetic anhydride under nucleic acid extraction conditions
  • Example 7 The same demonstration as in Example 7 was carried out using this time a mixture of DNA and RNA which was brought into the presence or absence of acetic anhydride and then extracted with magnetic silica particles. Enzymatic hydrolysis of these eluates has unambiguously confirmed that there are no chemical modifications of the nucleosides following the action of acetic anhydride (see Figure 5). Thus, it can be concluded that the nucleic acids thus extracted should be amplifiable by PCR or by any other enzymatic amplification reaction of genetic material.
  • Example 9 Acetic anhydride treatment of a blood sample makes it possible to detect the CMV virus more sensitively
  • a 200 ml sample of blood containing CMV virus (Cytomegalovirus in culture) with 10 copies is added to 800 ml of lysis buffer (6M GuHCl, 15% Triton, AcONa, pH 5.5) to which 9 ml of pure acetic anhydride and, optionally Im ⁇ 10M NaOH, after a few minutes of reaction.
  • a control is carried out with blood where there is no prior treatment with acetic anhydride, and another without blood sample, corresponding to 63 ml of Tris HCL pH7 containing 104 copies of CMV and then mixed with 237 ml of buffer. lysis.
  • the nucleic acids contained in the lysate are then extracted and purified as described in Example 6.
  • the eluate is then subjected to real-time PCR amplification using a RGene CMV kit (kit CMV 69-003B: lot 1005408010, BioMérieux, Marcy L'Etoile, France) and a thermocycler (CFX96 TouchTM BioRad) to determine the detection sensitivity of extracted nucleic acids expressed in number of PCR cycle (Ct).
  • This number is a function of the concentration of nucleic acids, the lower it is and the easier it is to detect the nucleic acids of the pathogen because the initial concentration of nucleic acids is high.
  • There is a scaling factor of 10 between each Ct logarithmic scale).
  • the curves of FIG. 6 correspond respectively to the control amplification carried out after extraction without a biological matrix (triangles), with a biological matrix without treatment with acetic anhydride (cross) and with a biological matrix with acetic anhydride treatment (round). .
  • the number of PCR cycles is therefore at 34 Ct when the CMV virus has been extracted without a biological matrix, then goes to 38 Ct when the same amount of nucleic acids is extracted from a sample containing blood. This shows that the inhibitors contained in the biological matrix are responsible for the loss of more than 99.9% of the initial nucleic acids.
  • the number of Ct returns to 34 is equivalent to a sample without matrix when the sample previously treated with acetic anhydride.
  • Figure 7 is another representation of Figure 6 with the accuracy on Ct.
  • the inventors have used a nucleic acid extraction medium different from magnetic silica particles, in order to demonstrate that acetic anhydride is also of interest in other extraction technologies such as extraction columns.
  • Silica membrane base Silica membrane base.
  • 10 ⁇ g of salmon sperm DNA (20 kB) are mixed with 300 ml of a solution of 3M GuHCl, 50 mM AcO-Na pH 5.5 and 30% ethanol with increasing concentrations of a mixture of hemoglobin and human serum albumin at a level of 0.300, 600, 1200, 1800 and 2400 ⁇ g (with a hemoglobin / HSA ratio of 3/1).
  • This mixture is treated or not with 6m1 of acetic anhydride for a few minutes (10) with thermomixer stirring.
  • the mixture is neutralized with 1 ml of 5M NaOH to restore the pH to 5.5.
  • the mixture is deposited on a QiaQuick column (Qiagen, Heiden, Germany) and centrifuged for 6 minutes at 13,200 rpm.
  • the column is washed 3 times with 200 ⁇ l of MES 50 mM pH 5.5 / 80% ethanol by centrifuging at 13,200 rpm for 3 minutes.
  • the immobilized nucleic acids are then eluted with 200 ml of borate buffer pH 8.5 at 3 mM for the first time, then this solution is ironed in order to elute all the nucleic acids.
  • the eluate is subjected to enzymatic hydrolysis and the extracted nucleic acids are quantified by chromatographic analysis.
  • Figure 8 shows a significant improvement in the amount of DNA extracted when the sample was subjected to acetic anhydride.
  • Example 11 Demonstration that the use of acetic anhydride according to the invention also allows the inhibition of nucleases
  • a model oligonucleotide of 60 bases (1 nmol) is brought into contact with 0.01 unit of nuclease P1 in 48 ml of water and 2 ml of 500 mM MES pH 4.7 by adding or not adding 6 ml of pure acetic anhydride.
  • the results are shown in FIG. 9.
  • chromatogram A Compared to the control oligonucleotide which has undergone no treatment (chromatogram A), in the case where there is no acetic anhydride, the oligonucleotide is immediately hydrolyzed by nuclease (chromatogram B).
  • chromatogram C On the other hand, in the case where acetic anhydride has been added, there is very little degradation of the oligonucleotide (chromatogram C). This therefore demonstrates that acetic anhydride allows the inactivation of nuclease by alkylating it.
  • Example 12 Demonstration that the reagent can react selectively on proteins under chaotropic conditions (case of acetic anhydride)
  • Figures 10 and 11 show the monitoring by HPLC (Conditions B) of the acetylation of HSA or hemoglobin at 25 mg / ml with acetic anhydride between 0 and 1.8 M under lysis conditions (GuHCl 3M or GuSCN 3M, 50 mM Tris HCl pH 7).
  • acetic anhydride between 0 and 1.8 M under lysis conditions
  • the concentration of acetic anhydride that the solid corresponding to the protein widens and moves to the right, meaning that the protein becomes more hydrophobic which is the result of its acylation.
  • the retention time no longer changes, which means that all the nucleophilic groups of the protein have reacted.
  • the hemoglobin acetylation monitoring chromatograms that the heme is not modified by acetylation and does not undergo any change in its retention time.
  • acetic anhydride can react rapidly and efficiently on proteins under lysis conditions and in the presence of nucleophilic compounds such as Tris.
  • acetic anhydride can acetylate a protein in an aqueous medium while being selective is really a surprise since the majority of the reactions with acetic anhydride are described in an organic solvent. Due to the presence of water, tris and guanidine which are susceptible to the hydrolyzer, it was not obvious that the acetic anhydride can react at low concentration with a protein.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'extraction d'acides nucléiques à l'aide de supports solides appropriés, par exemple, à base de silice. En particulier, le procédé comprend une étape de capture des acides nucléiques par mise en contact de l'échantillon avec un support solide approprié, caractérisé en ce que, avant l'étape de capture, ledit procédé comprend une étape de traitement de l'échantillon avec au moins un réactif pour le masquage des fonctions amines ou acides carboxylique des protéines et/ou polysaccharides de l'échantillon.

Description

PROCEDE D’EXTRACTION D’ACIDES NUCLEIQUES
La présente invention concerne un procédé d’extraction d’acides nucléiques à l’aide de support solide approprié, par exemple, à base de silice. En particulier, le procédé comprend une étape de capture des acides nucléiques par mise en contact de l’échantillon avec un support solide approprié, caractérisé en ce que, avant l’étape de capture, ledit procédé comprend une étape de traitement de l’échantillon avec au moins un réactif pour le masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l’échantillon.
ETAT DE LA TECHNIQUE
L’essor de la biologie moléculaire a permis de faire d’immenses progrès dans le diagnostic. Ainsi, à partir d’un échantillon à tester, il est possible d’extraire et de détecter des acides nucléiques appartenant à l’hôte ou aux micro-organismes infectieux contenus dans l’échantillon. La détection, voire la quantification de ce matériel génétique permet d’établir un diagnostic par rapport à une infection microbienne ou à une présence d’oncogènes. Ceci se fait généralement en trois étapes décrites ci-dessous:
1) L’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons biologiques complexes (sang, tumeur, aliments, etc..) qui consiste à une lyse chimique ou mécanique des cellules afin d’en libérer le contenu et particulièrement les acides nucléiques. Ces derniers sont alors purifiés de manière sélective pour être ensuite amplifiés si leur quantité n’est pas suffisante pour une détection directe.
2) L’amplification des acides nucléiques purifiés par des techniques d’amplification de matériel génétique : NASBA, RT PCR, PCR... Cette étape est nécessaire quand la quantité d’acides nucléiques recueillie à partir d’un échantillon biologique est très faible ou que le test n’est pas suffisamment sensible pour une détection directe.
3) La détection des acides nucléiques amplifiés par des techniques dites en point final, en temps réel, par séquençage etc... Selon la technique de détection utilisée, cette étape peut permettre une quantification sélective des acides nucléiques cibles recherchés. Pour une détection sensible et spécifique des acides nucléiques et en particulier, afin de réaliser un diagnostic le plus juste possible, il apparaît essentiel d’extraire et/ou isoler de façon efficace les acides nucléiques (ADN et ARN) des cellules. Cette étape d’extraction et/ou de purification est généralement critique car, de cette première étape, va découler toute la qualité d’une série d’évènements menant au résultat final du test de diagnostic. Il est par conséquent nécessaire d’avoir une extraction des acides nucléiques aussi spécifique et efficace (en quantité, en pureté et en temps) que possible afin de ne pas perdre de l’information, ce qui peut mener à un diagnostic erroné et peut être fatal pour un patient.
De nombreuses techniques ont été développées pour tenter d’extraire les acides nucléiques à partir de différents échantillons biologiques. Les méthodes les plus anciennes mettent en œuvre une multitude d’étapes consistant généralement à enrichir les cellules contenant les acides nucléiques, à lyser ces cellules, à séparer et éliminer les protéines, les membranes et autres constituants cellulaires, à purifier les acides nucléiques restants par précipitation dans des solvants organiques. Ces techniques sont coûteuses, demandent beaucoup de temps et elles sont souvent impossibles à automatiser. Elles ne sont donc plus adaptées aux pratiques actuelles où l’automatisation est nécessaire notamment pour obtenir les résultats rapidement et éviter les problèmes de contamination et d’erreurs humaines, particulièrement dans les cas de sepsis « infection du sang » où le pronostic vital d’un patient est engagé.
Les techniques les plus récentes d’extraction d’acides nucléiques utilisent des phases solides où les cellules sont lysées dans des conditions de réactions spécifiques et les acides nucléiques libérés se lient à la phase solide. Il est bien connu dans l’état de l’art que les techniques actuelles d’extraction des acides nucléiques mettent très souvent en œuvre des phases solides qui sont par exemple des particules enrobées de silice. La silice a la propriété d’adsorber les acides nucléiques, de façon réversible, dans certaines conditions de concentration en sels et de pH, ce qui en fait un matériau très adapté à cet usage. Ces techniques sont décrites par exemple dans « Rapid and simple method for purification of nucleic acids. », Boom, Journal of Clinical Microbiology, 1990 p495 ou encore dans le brevet US 5 234 809 du même auteur.
Il est également connu d’utiliser des particules magnétiques enrobées de silice. La partie magnétique des particules sert le plus souvent à faciliter et à automatiser les étapes de capture, de lavage et d’élution des acides nucléiques car un simple aimant permet le déplacement des particules dans le tube et le prélèvement des surnageants pour des étapes de lavage. Les rendements d’extraction des acides nucléiques en sont nettement améliorés. Ces techniques sont bien décrites dans “ Magnetic partiales for the séparation and purification of Nucleic acids”, S. Berensmeier, Applied Microbial Biotechnology 2006 73 495-504;“The use of magnetic nanoparticles in the development of new molecular détection Systems”, I. J. Bruce, Journal of Nanosciences and nanotechnology (2006), 6 (8). pp. 2302-2311 et dans“ Optimization of influencing factors of nucleic acid adsorption onto silica-coated magnetic particles: Application to viral nucleic acid extraction from sérum”, Ning Sun and al., Journal of Chromatography A, 2014, 1325, 31- 39.
La présente divulgation vise à fournir des procédés d’extraction d’acides nucléiques qui répondent à un ou plusieurs des critères suivants :
1) Une simplicité de mise en œuvre,
2) Une mise en œuvre possible sur différentes sources d’échantillons biologiques,
3) Une mise en œuvre du procédé en milieu essentiellement aqueux,
4) Un bon rendement d’extraction,
5) Un niveau de pureté de l’acide nucléique après extraction élevé,
6) Une possibilité d’automatisation,
7) Une qualité d’ADN suffisante pour une étape d’amplification et/ou de détection d’une séquence d’intérêt, notamment dans le cadre d’un test in vitro de diagnostic, et/ou
8) Une meilleure sensibilité de détection avec un résultat plus fiable.
RESUME
La présente divulgation concerne un procédé d’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon comprenant des protéines et/ou polysaccharides, ledit procédé comprenant une étape de capture des acides nucléiques par mise en contact de l’échantillon avec un support solide approprié, caractérisé en ce que, avant l’étape de capture, ledit procédé comprend une étape de traitement de l’échantillon avec au moins un réactif pour le masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l’échantillon. Dans un mode de réalisation spécifique, le réactif de masquage des fonctions amines est choisi parmi des agents acylants ou alkylants. Par exemple, le réactif de masquage est choisi parmi les agents acylants de formule (I) suivante :
où R est un groupe organyle, organyloxy, ou organylamino
LG est un groupe partant choisi dans le groupe constitué par les halogènes, les groupes organyloxy et organylamino.
Plus spécifiquement encore, le réactif de masquage peut être un agent acylant choisi dans le groupe constitué par les esters activés, les halogénures d’acide, les chloroformiates, les anhydrides, les esters de carbonate activés, et le carbonyl diimidazole. Dans un autre mode de réalisation, le réactif de masquage est un anhydride choisi parmi l’anhydride acétique, l’anhydride propanoïque, l’anhydride isobutyrique, l’anhydride butanoïque ou l’anhydride benzoïque.
Dans un autre mode de réalisation, le réactif de masquage est un agent alkylant choisi dans le groupe constitué par les halogénures d’alkyles, les composés diazoïques, et les aldéhydes.
Dans un autre mode de réalisation, le réactif de masquage est choisi parmi les amines, les alcools et les thiols pour le masquage des fonctions acides carboxyliques des protéines, en combinaison avec un agent de couplage. A titre d’exemples d’agent de couplage, on peut citer les carbodiimides, par exemple rl-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC), le di-iso-propylcarbodiimide (DIC) ou encore le dicyclohexylcarbodiimide (DCC).
Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, le procédé pour l’extraction d’acides nucléiques d’un échantillon biologique comprend les étapes suivantes : a. la lyse des cellules, par exemple par mise en contact de l’échantillon biologique avec un tampon de lyse,
b. le traitement du lysat avec le réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l’échantillon, c. la capture des acides nucléiques par mise en contact du lysat traité avec un support solide approprié, par exemple un support à base de silice,
d. le cas échéant, le lavage du support avec un tampon de lavage et,
e. le cas échéant, l’élution des acides nucléiques. Typiquement, dans le procédé défini plus haut, le support solide peut être constitué de particules de silice, notamment des particules de silice magnétique.
Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, l’échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma ou de sérum.
Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, l’étape de capture est effectuée en présence d’agents chaotropiques.
Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, le procédé d’extraction ne comprend pas l’utilisation de protéases pour l’élimination des protéines.
Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, aucun solvant organique n’est ajouté avant ou pendant l’étape de capture des acides nucléiques. Avantageusement, moins de 50 pL, de préférence moins de 10 pL, et encore plus préférentiellement moins de 1 pL de solvant organique est ajouté, avant ou pendant l’étape de capture des acides nucléiques, par 100 pL d’échantillon.
Dans un mode de réalisation particulier, qui peut être combiné avec les modes précédents, le procédé comprend une étape supplémentaire de détection d’acides nucléiques d’intérêt, notamment par amplification des acides nucléiques extraits.
La présente divulgation vise également des kits d’extraction d’acides nucléiques comprenant au moins i. un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que défini ci-dessus,
ii. un support solide approprié, par exemple à base de silice, pour l’extraction des acides nucléiques, iii. le cas échéant, un catalyseur de la réaction de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques à l’aide du réactif,
iv. le cas échéant, un agent de couplage.
La présente divulgation concerne en outre l’utilisation d’un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que défini plus haut, pour l’inhibition de nucléase. Par exemple, la nucléase à inhiber est comprise dans un lysat obtenu par lyse d’un échantillon biologique, par exemple, en vue d’une amplification ou détection d’un acide nucléique dans l’échantillon.
DEFINITIONS Par « extraction », on entend une technique permettant d'isoler des acides nucléiques à partir d’un échantillon quel qu’il soit, par exemple, l’isolement d’ADN et/ou d’ARN à partir de cellules eucaryotes, procaryotes, animales humaines, de micro-organismes ou d’un tissu. Ainsi, l’extraction à partir d’échantillon biologique au sens de l’invention inclut en général, la lyse des cellules et la purification des acides nucléiques à partir du lysat. La purification comprend elle-même la capture des acides nucléiques sur un support solide approprié, de préférence à base de silice, le lavage suivi éventuellement de l’élution des acides nucléiques. La capture consiste à adsorber les acides nucléiques sur le support solide et l’élution, lorsqu’elle a lieu, consiste à la désorption ou libération de ces derniers du support solide. Par « échantillon », on entend tout type d’échantillon comprenant au moins des acides nucléiques, et des agents inhibiteurs de l’extraction des acides nucléiques, tels que des protéines et/ou polysaccharides. L’échantillon peut avoir diverses origines comme les échantillons d’origine alimentaire, environnementale, humaine, vétérinaire ou cosmétique. Tous ces échantillons, s’ils ne sont pas liquides, sont préalablement traités pour être sous forme liquide. L’échantillon mis en œuvre dans le procédé d’extraction est donc sous forme liquide. De préférence, l’échantillon mis en œuvre dans le procédé d’extraction est un échantillon non fixé. Par « échantillon non fixé », on entend un échantillon qui n’a pas été traité pour être préservé dans son état initial. La fixation d’un échantillon est une technique bien connue de l’homme du métier, qui peut par exemple être réalisée avec un aldéhyde, comme le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde.
Parmi les échantillons d’origine alimentaire, on peut citer, de façon non-exhaustive, un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages, etc.), de viande, de poisson, d’œuf, de fruit, de légume, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc.). Bien évidemment, ces échantillons d’origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats plus élaborés ou des matières premières non transformées ou partiellement transformées. Un échantillon alimentaire peut également être issu d’une alimentation destinée aux animaux, telle que des tourteaux, des farines animales.
Tel qu’indiqué précédemment, l’échantillon peut être d’origine environnementale et peut consister, par exemple, en un prélèvement de surface, d’eau, etc.
L’échantillon peut également consister en un échantillon biologique, d’origine humaine ou animale, pouvant correspondre à des prélèvements de fluide biologique (urine, sang total ou dérivés tels que sérum ou plasma, crachat ou salive, pus, liquide céphalo-rachidien, etc.), de selles (par exemple diarrhées cholériques), de prélèvements de nez, de gorge, de peau, de plaies, d’organes, de tissus ou de cellules isolées, d’échantillons d'écouvillonnage, des prélèvements ou lavages broncho-alvéolaires, des biopsies. Cette liste n’est évidemment pas exhaustive.
Le terme « échantillon » se réfère en général à une partie ou à une quantité, plus particulièrement une petite partie ou une petite quantité, prélevée à partir d’une ou plusieurs entités aux fins d’analyse. Cet échantillon peut éventuellement avoir subi un traitement préalable, impliquant par exemple des étapes de mélange, de dilution ou encore de broyage, en particulier si l’entité de départ est à l’état solide.
L’échantillon analysé est, en général, susceptible de - ou suspecté de - contenir au moins des acides nucléiques représentatifs de la présence de microorganismes, d’un état du patient (par exemple immunosuppression, grossesse...) ou d’une maladie à détecter, caractériser ou suivre.
Dans un mode de réalisation particulier, l’échantillon comprend des protéines de point isoélectrique inférieur à 8, voire inférieur à 7. En particulier, dans un mode de réalisation plus particulièrement spécifique, l’échantillon comprend au moins l’une des protéines suivantes : l’albumine sérique humaine (HSA), le fibrinogène, les immunoglobulines, notamment les IgG, et l’hémoglobine.
Par un « micro -organisme », on entend tout ou partie d’une bactérie, d’un champignon, d’une levure, d’un protozoaire ou d’un virus.
Par « acides nucléiques », on entend de l’ADN ou de l’ARN de tous types : ADN génomique, ADN complémentaire, ARN messager, ARN complémentaire, ARN de transfert, ARN mitochondrial, ADN de chloroplaste, ARN ribosomal, ADN plasmidique, ADN ou ARN viral, microARN, snoARN, siARN, ARNi, sous forme monocaténaire ou bicaténaire.
Par « protéines », on entend toute molécule comprenant au moins une chaîne polypeptidique, caractérisé par un enchaînement de résidus d’acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Cela inclut en particulier, les peptides et les polypeptides et tout polypeptide modifié ou ses dérivés issus de modifications post-traductionnelles ou autres, leurs produits de dégradation, notamment par dégradation enzymatique, les lipoprotéines, etc.
Par « support solide approprié », on entend tout support à même de participer à l’extraction des acides nucléiques à partir d’un échantillon biologique. Dans un mode préféré, il s’agit de support comprenant ou constitué de silice ou d’un de ces dérivés (silicate, verre, silice modifiée avec des groupements organiques...), magnétique ou non, et à même de participer à l’extraction des acides nucléiques à partir d’un échantillon biologique. Il peut s’agir également de support à base de papier, de cellulose, ou de magnétite pure, ou autres polymères connus pour leurs utilisations dans l’extraction des acides nucléiques. Il peut s’agir d’au moins un support plan, un support creux, une galette, une aiguille, une membrane, une plaque, une feuille, un cône, un tube, des fibres, une bille, une particule... Le support solide est de préférence une bille ou une particule ou une membrane. Le support solide est de préférence magnétique.
Dans un mode de réalisation du procédé d’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon biologique, le procédé comprend les étapes suivantes : a) la lyse des cellules, par exemple par mise en contact de l’échantillon biologique avec un tampon de lyse,
b) le traitement du lysat avec un réactif de masquage des fonctions amines et/ou
acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides du lysat,
c) la capture des acides nucléiques par mise en contact du lysat traité sur un support solide approprié,
d) le cas échéant, le lavage du support avec un tampon de lavage et l’élution des
acides nucléiques.
Avantageusement, l’étape b) est directement suivie de l’étape c), c’est-à-dire qu’il n’y a pas d’étape intermédiaire, par exemple pas d’étape de déprotection des fonctions masquées, entre les étapes b) et c). Dans un mode de réalisation spécifique, le procédé d’extraction d’acides nucléiques ne comprend pas d’étape de déprotection des fonctions amines et/ou acides carboxyliques masquées.
La présente divulgation vise également l’utilisation d’un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides dans un procédé d’extraction d’acides nucléiques d’un échantillon biologique à l’aide de support solide approprié.
Les étapes de ce procédé sont décrites plus en détail ci-après.
Etape de Lyse L’étape de lyse consiste à casser les cellules de l’échantillon (parois et membranes de la cellule) afin de libérer les acides nucléiques. Il existe plusieurs méthodes de lyse : On peut citer notamment, la lyse mécanique (par exemple avec des billes et/ou un matériau abrasif), chimique, enzymatique ou par choc thermique.
Dans un mode de réalisation spécifique, on lyse les cellules par voie chimique par mise en contact de l’échantillon avec un tampon de lyse. Le tampon de lyse doit être à la fois efficace pour casser les membranes des cellules et suffisamment doux pour ne pas dégrader les acides nucléiques. Le tampon de lyse peut comprendre par exemple un détergent et le cas échéant un agent de chélation. Le pH est généralement maintenu entre 4 et 8, par exemple entre 6 et 8, à l’aide d’un tampon approprié, par exemple le Tris HCl, éventuellement dans des concentrations comprises entre 10 et 100 mM.
Le détergent peut être choisi parmi les Tween, les tritons, le SDS et autres détergents communément utilisés à des concentrations comprises entre 0,05 et 20%.
Eventuellement, le tampon de lyse contient des réactifs pour l’inactivation des nucléases, et/ou l’élimination des protéines, par exemple des protéases telles que la protéinase K. D’autres enzymes peuvent également être utilisées comme les enzymes lytiques (hydrolase, zymolase ...) pour digérer la paroi des levures et des champignons.
Dans un mode de réalisation spécifique, le tampon de lyse ne comprend pas de réactifs pour l’élimination des protéines et notamment, des protéases. En effet, les inventeurs ont montré que le réactif de masquage des fonctions amines et/ou carboxyliques utilisé dans le procédé d’extraction selon la présente divulgation permet avantageusement également une inhibition de l’activité enzymatique des nucléases éventuellement libérées dans le lysat.
Dans un mode de réalisation spécifique, le tampon de lyse comprend également des agents chaotropiques. Les agents chaotropiques interfèrent avec les interactions intramoléculaires faibles (non-covalentes), comme les liaisons hydrogène, les forces de van der Waals et les forces hydrophobes. Parmi les agents chaotropiques, on peut citer l'urée, les sels de guanidine comme le chlorure ou le thiocyanate de guanidinium et le perchlorate de lithium. Ils sont généralement utilisés en concentration allant de 1 à 6 M, en particulier pour le GuSCN et le GuHCl.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, le tampon de lyse ne comprend pas d’agents chaotropiques.
On peut aussi ajouter des agents de chélation tels que l’EDTA ou des composés similaires, par exemple entre 5 et 50 mM et/ou des composés réducteurs tels que le DTT (dithio- érytréitol) ou du TCEP (Tri carboxy éthyle phosphine) ou du bêta-mercaptoéthanol à des concentrations comprises par exemple entre 0,5 et 100 mM. Le tampon de lyse peut comprendre en outre des solvants organiques tels que des alcools (éthanol, isopropanol ...). Dans un mode de réalisation préféré cependant, le tampon de lyse ne comprend pas de solvants organiques.
Les caractéristiques chimiques d’un échantillon doivent être prises en compte lors de l’optimisation du tampon de lyse. Par exemple, l’acidité d’un échantillon (ex. certains échantillons de sol) peut endommager les acides nucléiques et peut donc être neutralisée pour garantir un rendement correct en acides nucléiques. L’échantillon est mis en contact avec le tampon de lyse pendant un temps suffisant pour permettre la lyse des cellules sans dégrader les acides nucléiques, par exemple entre 0 et 15 min.
Le traitement de l’échantillon ou du lysat avec le réactif de masquage
Une caractéristique essentielle du procédé d’extraction d’acides nucléiques selon la présente divulgation concerne l’étape de traitement du lysat à l’aide d’un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l’échantillon. Cette étape de traitement peut être réalisée par ajout du réactif de masquage dans le lysat, après l’étape de lyse. Alternativement, le réactif de masquage est compris directement dans le tampon de lyse, l’étape de lyse et de traitement de l’échantillon étant concomitantes. L’objectif est de neutraliser les fonctions chargées des protéines et/ou polysaccharides susceptibles d’affecter le rendement d’extraction à l’aide de support solide, de préférence à base de silice. En effet, dans les exemples qui suivent, les inventeurs ont démontré l’impact des bio molécules sur le rendement d’extraction, et notamment des protéines et/ou polysaccharides d’échantillons biologiques dans des procédés d’extraction à l’aide de supports solides, tels que des particules enrobées de silice. Les protéines et/ou polysaccharides peuvent notamment interagir avec les billes de silice et/ou les acides nucléiques via leurs fonctions chargées, et notamment leurs fonctions amines et/ou acides carboxyliques.
Les inventeurs ont alors eu l’idée d’utiliser des réactifs de masquage de ces fonctions chargées, et notamment des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides afin de bloquer cet effet inhibiteur des biomolécules. Par « réactif de masquage », on entend par conséquent tout composé chimique à même de réagir (de préférence de façon irréversible) avec au moins certaines fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides présents dans un lysat d’un échantillon biologique de façon à modifier ainsi les propriétés de polarité, de point isoélectrique, et/ou de charge de ces protéines et/ou polysaccharides. Le traitement avec le réactif de masquage permet de masquer les fonctions chargées, et notamment des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides. Cependant, dans un mode de réalisation spécifique, les acides nucléiques ne sont pas modifiés par le réactif de masquage. Les conditions de réactions, et notamment la concentration en réactif de masquage, peuvent être choisies pour que les acides nucléiques ne soient pas modifiés lors de l’étape de masquage. Dans un mode de réalisation spécifique, la concentration en réactif de masquage ou en agent de couplage, lorsqu’il est présent, est comprise entre 0,01 M et 1,8 M, par exemple entre 0,1 M et 1,0 M, par exemple entre 0,2 et 0,6 M.
Dans un mode de réalisation spécifique, les fonctions amines et/ou acides carboxyliques masquées des protéines et/ou polysaccharides modifié(e)s restent masquées durant toute la durée du procédé d’extraction d’acides nucléiques selon la présente divulgation. Dans ce cas, le procédé d’extraction d’acides nucléiques ne comprend pas d’étape de déprotection des fonctions amines et/ou acides carboxyliques masquées.
Dans un mode de réalisation spécifique, le réactif de masquage est choisi parmi des agents acylants ou alkylants, permettant de masquer les fonctions amines des protéines ou polysaccharides. De préférence, l’agent acylant ou alkylant doit pouvoir masquer les fonctions amines des protéines ou polysaccharides en milieu aqueux.
Typiquement, un agent acylant utilisable comme réactif de masquage dans le procédé d’extraction d’acides nucléiques est de formule (I) suivante :
où
R est un groupe organyl, organyloxy ou organylamino;
LG est un groupe partant.
Par « groupe partant », on entend un atome ou un groupe qui, au cours de la réaction d’acylation, se détache de l’atome de carbone auquel il est lié. Dans un mode de réalisation, LG est un groupe partant choisi dans le groupe constitué par les halogènes, les groupes organyloxy et organylamino.
Dans un mode de réalisation particulier, le réactif de masquage peut être un agent acylant choisi dans le groupe constitué par les esters activés, les halogénures d’acide, les chloroformiates, les anhydrides, les esters de carbonate activés et le carbonyl diimidazole. Parmi les esters activés, on peut citer l’acétate de tétra ou pentafluorophényle, l’acétate de nitrophényle, le trifluoroacetate de pentafluorophényle, et les esters de N- hydroxysuccinimide tel que l’acétate de N-hydroxysuccinimide. Parmi les halogénures d’acide, on peut citer les chlorures d’acide tels que le chlorure d’acide acétique, propanoïque, isobutyrique, butanoïque ou benzoïque. Parmi les chloroformiates, on peut citer le chloroformiate de 9-fluorénylméthyle (Fmoc-Cl). Parmi les anhydrides, on peut citer l’anhydride acétique, propanoïque, isobutyrique, butanoïque, benzoïque, maléique, succinique ou phtalique. Parmi les esters de carbonate activés, on peut citer le dicarbonate de di-tert-butyle (Boc20).
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le réactif de masquage est l’anhydride acétique ou sa forme sèche, l’acétate de N-Hydroxy succinimide.
Dans un autre mode de réalisation spécifique, on peut choisir un agent alkylant dans le groupe constitué par les halogénures d’alkyles, les sulfates d’aryle, les aryl diazo méthyle, les triazènes et les aldéhydes. Parmi les halogénures d’alkyles, on peut citer l’iodure de méthyle, d’éthyle ou de propyle, ou encore le bromure de méthyle. Parmi les composés aryl diazométhyle, on peut citer la méthyl diazopyridine (W02010012949A1). Parmi les aldéhydes, on peut citer le formol et l’acétaldéhyde.
Dans un mode de réalisation, le réactif acylant ou alkylant est utilisé en combinaison avec un catalyseur connu de l’homme du métier. Dans le cas d’une acylation avec l’anhydride acétique, on peut par exemple utiliser la 4-Diméthylaminopyridine (DMAP) comme catalyseur.
Dans un autre mode de réalisation, le réactif utilisé est choisi parmi les amines, les alcools et les thiols, pour le masquage des fonctions acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides, en combinaison avec un agent de couplage. L’agent de couplage est utilisé pour activer les fonctions acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides en formant des esters activés. Ces esters activés réagiront ensuite avec un nucléophile choisi parmi les amines, les alcools et les thiols. Le nucléophile peut être présent sur la protéine et/ou le polysaccharide (amine, alcool ou thiol d’un acide aminé de la protéine et/ou du polysaccharide) ou dans le milieu, comme dans le cas d’un tampon nucléophile, par exemple le Tris.
L’agent de couplage peut par exemple être choisi parmi les carbodiimides, parmi lesquels on peut citer le l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC), le di-iso- propylcarbodiimide (DIC) et le dicyclohexylcarbodiimide (DCC). Les carbodiimides peuvent être utilisés en combinaison avec d’autres réactifs tels que le N- hydroxysuccinimide et les triazoles, parmi lesquels on peut citer le l-hydroxy- benzotriazole (HOBt) et le l-Hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt).
Le réactif de masquage peut aussi être bi-fonctionnalisé ou multifonctionnalisé afin d’établir des ponts entre les résidus réactifs des protéines (composés pontants tels que les bis aldéhyde, les bis ester N-Hydroxysuccinimide, les bis chlorure d’acides et leurs dérivés).
Par exemple, un agent acylant tel que l’anhydride acétique peut être utilisé dans des concentrations comprises entre 0,01 M et 1,8 M, par exemple entre 0,1 M et 1,0 M, par exemple entre 0,2 et 0,6 M. La concentration du réactif de masquage utilisée pour le traitement de l’échantillon pourra être ajustée en fonction de la concentration en protéines et/ou polysaccharides de l’échantillon, du réactif de masquage utilisé, de la source de l’échantillon et des conditions de lyse utilisées. La concentration en agent acylant peut être choisie pour réagir avec les fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides, sans réagir avec les acides nucléiques.
Le temps d’incubation du lysat, ou de l’échantillon en cours de lyse lorsque l’étape de lyse et de traitement sont concomitantes, en présence du réactif de masquage est généralement compris entre 1 seconde et 30 minutes, mais préférentiellement inférieur à 10 minutes.
Dans un mode de réalisation, on procède à une étape de contrôle de l’acidité du lysat traité, par exemple avec de la soude (NaOH), en particulier afin d’obtenir un pH du lysat traité de préférence compris entre 5 et 7. La quantité de soude ajoutée lors de cette étape est faible, cette étape permet donc uniquement de contrôler le pH avant l’étape de capture, il ne s’agit pas d’une étape de déprotection des fonctions amines et/ou acides carboxyliques masquées des protéines et/ou polysaccharides. Cette étape de contrôle de l’acidité du lysat traité est facultative, dans un mode de réalisation particulier, cette étape n’est pas présente.
On obtient à l’issue de l’étape de traitement un lysat traité comprenant des protéines et/ou polysaccharides modifïé(e)s. En particulier, une partie au moins des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides est masquée après traitement, de préférence, les acides nucléiques ne sont pas modifiés pas le réactif de masquage.
La capture
L’étape de capture consiste à mettre le lysat traité en présence de support solide, par exemple un support solide à base de silice, dans des conditions permettant l’adsorption des acides nucléiques (extraction en phase solide des acides nucléiques). Le support à base de silice, par exemple, des billes ou particules de silice, permet de séparer les acides nucléiques, retenus par adsorption sur la silice, des autres contaminants cellulaires (membranes, protéines traitées par le réactif de masquage, ...). Avantageusement, pendant l’étape de capture, aucun anticorps n’est utilisé.
Dans un mode de réalisation spécifique, l’étape de capture a lieu directement après l’étape de traitement de l’échantillon ou du lysat avec le réactif de masquage. Dans ce cas, il n’y a pas d’étape intermédiaire entre l’étape de masquage et l’étape de capture. En particulier, il n’y a pas d’étape de déprotection des fonctions amines et/ou acides carboxyliques masquées entre l’étape de masquage et l’étape de capture, ou pendant l’étape de capture. De préférence, lors de l’étape de capture, l’échantillon comprend des protéines et/ou polysaccharides modifïé(e)s (c’est-à-dire masqué(e)s grâce au réactif de masquage) et des acides nucléiques non modifiés (c’est-à-dire non masqués par la réactif de masquage).
Dans un mode de réalisation spécifique, on ajoute au lysat traité une quantité suffisante de billes ou particules de silice. De préférence dans ce mode de réalisation avec billes de silice, les conditions permettant l’adsorption des acides nucléiques comprennent la présence d’agents chaotropiques, tels que le chlorure de guanidinium ou du thiocyanate de guanidinium en milieu tamponné entre pH 4 et pH 8, par exemple à l’aide de composés organiques comme les sels de TRIS (Tri (hydroxy éthyle) amino méthane)), les sels d’acétate, de phosphate, de citrate, ou de MES (« morpholino éthane sulfonic acid »).
On peut ajouter également un détergent, de préférence le triton XI 00 ou un de ces analogues (Tergitol, tween, Bridj, Nonidet, Ecosurf ....). Dans un autre mode de réalisation, ledit détergent est contenu dans le tampon de lyse. Le support à base de silice est de préférence chargé négativement entre pH 5.0 et pH 8.0.
Dans un mode de réalisation particulier, on n’utilise pas d’agents chaotropiques ou d’alcools lors de l’étape de capture par adsorption sur le support solide. On utilisera alors un support approprié, en particulier un support aminé.
A titre d’exemples de billes ou particules de silices utilisables pour l’étape de capture, on peut citer les particules comprises dans les kits suivants : NucliSENS easyMAG Magnetic Silica (BioMérieux), le Film Array (BioMérieux/Biofire Diagnostic), des kits Qiasymphony (Qiagen) et des Kit Magnapure (Roche).
Dans un autre mode de réalisation, le support solide à base de silice est une colonne d’extraction avec membrane de silice. A titre d’exemple, on peut citer les kits commercialisés sous les noms Purelink Genomic DNA extraction kit (Invitrogen), DNeasy Blood et Tissue Kit (Quiagen). On dépose le lysat traité sur la colonne avec membrane de silice, on centrifuge pour faire passer le lysat à travers la colonne. Les acides nucléiques sont retenus sur la colonne et les protéines, polysaccharides et autres débris cellulaires passent à travers la colonne.
D’autres supports à base de silice et leurs utilisations pour l’extraction d’acides nucléiques sont décrits notamment dans les articles suivants : Cady, et al. Nucleic acid purification using micro fabricated Silicon structures. Biosensors and Bioelectronics 19, 59-66 (2003) ; A. Melzak, C. S. Sherwood, R. F. B. Tumer, C. A. Haynes. Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions. J Colloid and Interface Science 181, 635- 644 (1996) ; Tian, et al. Evaluation of Silica Resins for Direct and Efficient Extraction of DNA from Complex Biological Matrices in a Miniaturized Format, Analytical Biochemistry 283, 175-191 (2000) ; Wolfe, et al. Toward a microchip-based solid-phase extraction method for isolation of nucleic acids. Electrophoresis 23, 727-733 (2002).
Dans un autre mode de réalisation, on utilise des particules de silice magnétique. Les particules de silice magnétique peuvent être maintenues par un aimant lors des étapes de lavage et, le cas échéant, d’élution suivant la capture. Ce mode de réalisation est particulièrement préféré pour une automatisation du procédé d’extraction. Des exemples de particules magnétiques utilisables sont notamment le kit commercialisé sous le nom NucliSENS easy M AG Magnetic Silica (BioMérieux).
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon non fixé comprenant des protéines et/ou polysaccharides, comprend une étape de capture des acides nucléiques par mise en contact de l’échantillon non fixé avec un support solide approprié, caractérisé en ce que, avant l’étape de capture, ledit procédé comprend une étape de traitement de l’échantillon avec au moins un réactif pour le masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l’échantillon, et en ce que l’étape de capture a lieu directement après l’étape de traitement de l’échantillon avec le réactif de masquage.
Le lavage et l’élution
Après l’étape de capture, on peut procéder à une ou plusieurs étapes de lavage en présence d’un tampon de lavage, permettant l’élimination des éléments contaminants sans détacher les acides nucléiques du support. L’étape de lavage peut par exemple comprendre une étape de lavage dans un tampon de lavage approprié, par exemple une solution faiblement chargée en sel contenant éventuellement un alcool et/ou une étape de lavage en présence d’un alcool afin d’éliminer les sels. Dans un mode préféré de réalisation de l’invention, au moins une étape de lavage est effectuée.
Le cas échéant, on peut procéder ensuite à une étape d’élution. L’étape d’élution consiste à libérer les acides nucléiques retenus sur le support solide. On utilise en général un tampon à pH basique, par exemple un pH compris entre 8 et 10, et de faible force ionique, tel que du tampon Tris ou borate. Alternativement, on procède directement à l’étape de détection ou d’amplification après les étapes de capture et de lavage. Cette détection et/ou amplification est réalisée directement sur le support solide approprié ayant capturé les acides nucléiques purifiés sans étape d’élution préalable. De préférence, ceci se fait sur une bille ou une particule ou une membrane et de façon plus préférentielle encore sur une particule magnétique ou non.
Les acides nucléiques ainsi purifiés par le procédé décrit ci-dessus (avec ou sans étape d’élution) sont utilisables en particulier pour des applications d’amplification et de détection in vitro.
Les étapes supplémentaires d’amplification et/ou de détection
L’invention est particulièrement appropriée pour la préparation des acides nucléiques en vue de la détection d’acides nucléiques d’intérêt dans un échantillon (test de détection in vitro), notamment suite à l’amplification d’un acide nucléique d’intérêt.
L’invention vise donc un procédé de détection d’une séquence d’acides nucléiques d’intérêt dans un échantillon biologique, ledit procédé comprenant :
(i) l’extraction des acides nucléiques d’un échantillon biologique susceptible de contenir une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,
(ii) la détection de la séquence d’acide nucléique dans l’extrait d’acides nucléiques.
Selon un mode particulier, l’étape (ii) de détection comprend une étape d’amplification de la séquence d’acide nucléique d’intérêt.
Par conséquent, l’invention vise également un procédé d’amplification d’un acide nucléique comprenant (i) la mise en œuvre d’un procédé d’extraction d’acide nucléique sur un support approprié tel que décrit plus haut, et (ii) une étape d’amplification d’acide nucléique à l’aide d’une ADN polymérase.
Un des avantages de la présente méthode est que l’étape d’amplification peut avoir lieu juste après l’étape de capture. Les acides nucléiques n’étant pas modifiés par le réactif de masquage, il n’est pas nécessaire de les déprotéger avant de procéder à l’amplification.
Dans un mode de réalisation spécifique, le procédé d’amplification est mis en œuvre à l’aide d’une ADN polymérase, telle que la Taq polymérase, la Pfu polymérase, la T7 polymérase, le fragment Klenow d’ADN polymérase d'E. coli et/ou une transcriptase inverse, ou tout autre polymérase.
Dans un autre mode de réalisation qui peut être combiné avec le précédent, le procédé d’amplification est une réaction d’amplification en chaîne par polymérase (réaction PCR), bien connue de l’homme du métier. Le protocole PCR comprend par exemple, 20 à 40 cycles, chaque cycle comprenant au moins (i) une phase de dénaturation de l’ADN à amplifier à une température généralement comprise entre 90°C et 95°C, (ii) une phase d’hybridation des amorces avec l’ADN à amplifier à une température généralement comprise entre 55°C et 65°C et (iii) une phase d’extension à une température généralement comprise entre 68°C et 75°C.
Des variantes de procédés d’amplification nucléique par PCR peuvent également être mises en oeuvre. On citera en particulier la PCR emboîtée (Nested PCR), les PCR quantitatives (ou qPCR), semi-quantitatives ou temps réel, les PCR « error-prone », ou la PCR après transcription inverse (RT-PCR). Il est également possible de mettre en œuvre d’autres techniques d’amplification telles que LAMP, NASBA, TMA, RP A, LCR, RCR, 3 SR, RCA, SDA ou toutes techniques d’amplification des acides nucléiques connues de l’homme du métier.
Les kits d’extraction d’acides nucléiques
L’invention vise également des kits d’extraction d’acides nucléiques ou trousses comprenant au moins i. un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que décrit aux paragraphes précédents, par exemple un agent acylant et de préférence, l’anhydride acétique ou sa forme sèche, l’acétate de N-Hydroxy succinimide,
ii. un support solide approprié pour l’extraction des acides nucléiques, iii. le cas échéant, un catalyseur de la réaction de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques à l’aide du réactif, et/ou
iv. le cas échéant, un agent de couplage. Le kit d’extraction peut comprendre en outre des tampons, des contrôles et/ou une notice d’instructions de mise en œuvre.
Dans un mode de réalisation spécifique, le kit d’extraction ne comprend pas de réactif de déprotection des fonctions amines et/ou acides carboxyliques masquées.
Dans un mode de réalisation spécifique, le kit d’extraction ne comprend pas de solvant organique.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le kit peut comprendre notamment les éléments suivants : i. un agent de couplage, par exemple, l’EDC,
ii. un support solide approprié, à base de silice pour l’extraction des acides nucléiques, par exemple des billes de silice, et notamment des billes de silice magnétique, et au moins l’un des éléments optionnels suivants :
iii. un tampon de lyse comprenant du Tris ou un autre tampon nucléophile, iv. un ou plusieurs tampons de lavage, et/ou,
v. éventuellement, un tampon d’élution,
vi. éventuellement, un catalyseur.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit comprend une colonne avec membrane de silice comme support solide à base de silice.
Ces kits sont utiles notamment pour la mise en œuvre du procédé d’extraction tel que décrit aux paragraphes précédents. Le procédé selon la présente divulgation sera mieux compris à l’aide des exemples détaillés ci-dessous et au regard des figures annexées.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Inhibition de la capture de l’ADN sur support solide par certaines protéines en conditions chaotropiques
Figure 2: Inhibition de la capture de l’ADN sur support solide par certains polysaccharides en conditions chaotropiques Figure 3: Inhibition de la capture de l’ADN sur support solide par des polymères mono fonctionnels modèles.
Figure 4: A. Extraction des acides nucléiques contenus dans un échantillon de sang en utilisant le kit d’extraction easyMAG (BioMérieux) et un traitement préalable du lysat avec de l’anhydride acétique (Ac20) ou de l’acide acétique (AcOH) (capture dans 3M GuHCl + 1% Triton et lavages à l’éthanol). B. Mesure de la quantité d’acides nucléiques par analyse chromatographique.
Figure 5 : Analyse par HPLC d’éluats d’extraction d’un mélange d’ADN et d’ARN soumis ou non à de l’anhydride acétique. Haut : Eluat issu de l’extraction d’un mélange de 10 qg d’ADN et ARN et de 5,2 mg de protéines en présence d’anhydride acétique. Bas : Eluat issu de l’extraction d’un mélange de 10 qg d’ADN et ARN.
Figure 6: Courbe de détection par fluorescence (RFU) de l’amplification en temps réel des acides nucléiques du virus CMV dans le sang par PCR. Les courbes de la Figure 6 correspondent respectivement à l’amplification témoin réalisée après extraction sans matrice biologique (triangles), avec matrice biologique sans traitement à l’anhydride acétique (croix) et avec matrice biologique avec traitement à l’anhydride acétique (ronds).
Figure 7: Sensibilité de la détection du virus CMV dans le sang, sans ou avec un traitement à l'anhydride acétique Ac20 préalable à l'extraction (Ct) : A gauche : lOe4 copies de CMV dans le Tris HCl, Au centre : lOe4 copies de CMV dans le sang, A droite : lOe4 copies de CMV dans le sang + Ac20.
Figure 8: Extraction d'ADN en présence d’un mélange d’hémoglobine et d’albumine sérique humaine sur colonne avec membrane de silice avec et sans traitement avec Ac20. A gauche (gris foncé) : sans traitement Ac20, à droite (gris clair) : avec traitement Ac20
Figure 9: Chromatogramme correspondant à un oligonucléotide intègre (A), le même oligonucléotide en présence de nucléase Pl et donc dégradé (B) et le même oligonucléotide en présence de nucléase Pl et d’anhydride acétique montrant une bien meilleure stabilité de l’oligonucléotide en raison de l’acylation de la nucléase (C). EXEMPLES Conditions générales
Les conditions générales pour l’analyse des composés utilisés dans les exemples ci-après sont décrites ci-dessous: Les analyses LC-MS ont été effectuées avec une chaîne HPLC WATERS Alliance 2795 équipée d’un détecteur à barrette de diodes PDA 996 (Waters), d’un détecteur par spectrométrie de masse ZQ 2000 (Waters), d’un logiciel Empower version 2. Le spectromètre de masse ZQ 2000 possède une source d’ionisation Electrospray. Les ionisations ont été réalisées en mode positif avec une tension de cône de 20V et une tension au niveau du capillaire de 3,5kV.
Les conditions utilisées pour les analyses HPLC sont les suivantes (conditions A et B):
Exemple la : Démonstration de l’effet inhibiteur des composés protéiques du sang pour la capture des acides nucléiques sur support solide (particules de silice magnétique utilisées à pH 7) Pour tenter d’améliorer les performances de l’extraction des acides nucléiques sur support solide à base de silice, les inventeurs ont supposé qu’il fallait en premier lieu tenter d’augmenter les performances de l’étape de capture.
Pour démontrer l’effet inhibiteur à l’étape de capture des composés les plus représentés dans le sang vis-à-vis de l’extraction des acides nucléiques, une solution de 200m1 contenant 23 pg d’acides nucléiques (ADN de sperme de saumon 20Kb) dans GuHCl 4 M, 50 mM Tris pH 7 est préparée.
Des quantités croissantes de protéines ont été ajoutées à ce mélange (entre 0 et 300pg) afin de simuler un lysat cellulaire en conditions chaotropiques tel qu’il se produit dans des conditions d’extraction des acides nucléiques.
Pour chaque expérience, des particules de silice magnétique (50m1 à 20 mg/ml dans l’eau, 1 mg, easyMAG, bioMérieux, Marcy l’étoile, France) ont été ajoutées et on a mesuré par spectrophotométrie UV à 260 nm la quantité résiduelle d’ADN après 3 min d’agitation. Connaissant la quantité d’acides nucléiques introduite et la quantité adsorbée, on peut alors facilement calculer la quantité d’ADN adsorbée sur les particules et donc le rendement de capture. Un contrôle négatif a été réalisé à chaque fois sur la solution d’ADN et de protéines. Les courbes sont normalisées par rapport à la référence sans inhibiteurs.
On voit sur la Figure 1 que, dès l’ajout de quelques pg de protéines, on réduit de façon drastique la capture de l’ADN jusqu’à l’inhiber totalement dans le cas d’une centaine de pg de HSA (Human Sérum Albumine) par exemple.
L’effet inhibiteur semble être en partie lié au point isoélectrique des protéines, avec respectivement par ordre d’inhibition, l’albumine sérique humaine (HSA) qui a un point isoélectrique de 4,8, le fibrinogène de 5,8, l’hémoglobine et l’immunoglobuline de 7, et le lysozyme de 11,3. Plus les biomolécules sont acides et plus elles entrent en compétition avec la capture de l’ADN. Il est à noter cependant que bien que les groupements acides soient les plus compétiteurs, les groupements amines le sont également (Cf. exemple 2 pour compléments à ce sujet).
Cet exemple met ainsi en évidence l’effet inhibiteur des composés du sang sur le rendement d’extraction des acides nucléiques, et plus particulièrement les composés protéiques qui sont chargés négativement et positivement. On constate que les composés parmi les plus compétiteurs sont ceux présents en grande quantité dans le sang (l’albumine sérique humaine, le fibrinogène, les immunoglobulines et l’hémoglobine).
Exemple lb : Démonstration de l’effet inhibiteur des composés polysaccharides pour la capture des acides nucléiques sur support solide (Particules de silice magnétique utilisées à pH 7)
L’expérience de l’exemple la a été réalisée avec d’autres composés comme des polysaccharides chargés soit positivement soit négativement à la place des protéines. Là encore, on met en évidence un effet inhibiteur des polysaccharides sur le rendement d’extraction des acides nucléiques (voir Figure 2).
Exemple 2 : Rôle de la charge et de la composition chimique des protéines sur l’inhibition de la capture des acides nucléiques sur support solide
Afin de mieux comprendre le phénomène d’inhibition de la capture des acides nucléiques sur support solide, la même expérience que celle décrite dans l’exemple 1 a été réalisée mais en utilisant des composés modèles poly-acides carboxyliques, poly-amines ou poly- alcools au lieu des protéines correspondantes (Figure 3). On y voit très clairement que les poly-acides carboxyliques sont plus inhibants que les poly-amines, elles-même beaucoup plus inhibantes que les poly-alcools ou que les composés neutres.
Il faut quelques dizaine de pg de ces composés pour inhiber à 50% la capture de l’ADN. Ceci est cohérent par rapport à ce qui a été observé précédemment avec les protéines dans l’exemple 1 ou les polysaccharides dans l’exemple lb.
L’effet inhibiteur des fonctions amines et acides carboxyliques des protéines et polysaccharides sur la capture des acides nucléiques dans un échantillon biologique est donc certainement très marqué : A titre d’exemple, un échantillon de sang pourrait contenir entre 200 et 500 mg/ml de protéines. Ainsi, dans les conditions réelles d’une extraction d’acides nucléiques à partir de 200m1 de sang, l’échantillon pourrait comprendre au moins entre 40 et 100 de mg de composés « inhibiteurs » de la capture des acides nucléiques. Exemple 3 : Effet inhibiteur d’une forte concentration en protéines pour l’extraction des acides nucléiques, le rendement d’élution de l’ADN et la pureté de l’ADN extrait (particules de silice magnétique utilisées à pH 7)
Bien que l’effet compétiteur des protéines soit déjà remarquablement négatif dans les conditions de l’exemple précédent, ces conditions sont pourtant bien en deçà de la quantité de protéines qui serait réellement apportée par 200 mΐ de sang (50 mg environ). Afin de de se rapprocher de la réalité, les inventeurs ont réalisé une autre expérience où cette fois, on ajoute ou non, l’équivalent de 5 mg de protéines (mélange d’immunoglobuline, de HSA et d’hémoglobine en concentration similaire à ce que l’on pourrait trouver dans un vrai échantillon de sang) au 200m1 de solution de lyse.
La solution de lyse correspond respectivement à 23 pg d’ADN dans 200m1 de GuHCl ou de GuSCN 3 M, 50 mM Tris pH 7, 1% Triton XI 00, ou au tampon de lyse easyMAG (bioMérieux, Marcy l’étoile, France) dilué à 3M.
A ces solutions, on ajoute 1 mg de particules de silice magnétique (easyMAG, bioMérieux, Marcy l’étoile, France). On mesure le rendement total d’extraction de l’ADN par dosage par spectrophotométrie UV à 260 nm des acides nucléiques contenus dans l’éluat, i.e, après capture sur les particules de silice magnétique, lavage des particules avec le réactif de lavage « Wash buffer 2 » easyMAG, et élution avec le réactif d’élution « Elution buffer 3 » de l’easyMAG, à 70°C pendant 5 min.
Tableau 1: Rendement d’extraction de 23 pg d’ADN en présence ou non d’inhibiteurs protéiques. Les chiffres entre parenthèses indiquent le ratio 260/280 nm de l’éluat. On observe, comme dans les exemples précédents, une chute brutale du rendement d’extraction. Quelles que soient les conditions de lyse, on passe d’un rendement d’extraction de l’ADN (capture, lavage, élution) de 60% environ, à moins de 6% quand on ajoute des protéines dans le milieu.
La pureté des acides nucléiques extraits est également très affectée puisque la présence de protéines abaisse le ratio 260/280 représentatif de la contamination en protéines dans l’éluat final de 2 à moins de 1.6 en moyenne (voir Tableau 1). Ceci traduit donc une très forte concentration en protéines dans l’éluat.
Cette expérience démontre sans ambiguïté que les composés protéiques, et notamment les composés protéiques du sang, utilisés à une concentration similaire à celle rencontrée dans une extraction standard, impactent très fortement la capture des acides nucléiques par effet compétitif. Par voie de conséquence, le rendement d’extraction global et la pureté des acides nucléiques s’en trouvent affectés.
Exemple 4 : Augmentation du rendement d’extraction de l’ADN par l’utilisation d’un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques en présence d’une forte concentration de protéines (utilisation de particules magnétiques à pH 7)
Les inventeurs ont réalisé la même expérience que celle décrite dans l’exemple 3 ci-dessus mais en ajoutant cette fois un traitement à l’anhydride acétique ou à l’EDC préalable à la mise en contact avec les particules de silice magnétique.
Pour cela, on incube 23 pg d’ADN (10 ul d’ADN à 2.3 g/l) avec 5000 pg de protéines (25 pl d’un mélange à 150 g/l de Hb, 50 g/l de HSA et 3 g/l de fibrinogène dans du Tris-HCl 50mM pH7 en concentration similaire à ce que l’on pourrait trouver dans un vrai échantillon de sang) dans une solution de 200pl de GuHCl ou de GuSCN, 50 mM Tris pH 7, 1% Triton XI 00, ou de tampon de lyse easyMAG à des concentrations telles que Ton se retrouve pendant l’extraction à 3M en sels chaotropiques.
On ajoute suffisamment d’anhydride acétique ou d’EDC pour être à 0.3M dans la solution.
On laisse réagir 5 min, on neutralise avec quelques pl de soude 10 M afin de restaurer un pH de 7 (dans le cas de l’anhydride acétique seulement) et on ajoute 1 mg de particules de silice magnétique que l’on incube sous agitation pendant 15 min avant de les laver et d’éluer les acides nucléiques purifiés comme décrit dans l’exemple 3.
Le rendement total d’extraction est calculé par rapport aux 23 pg d’ADN initiaux et à la quantité d’acides nucléiques obtenus dans l’éluat. Le dosage est effectué par spectrophotométrie UV à 260 nm.
On a montré sur le tableau 2 que la présence de protéines pendant l’extraction diminue considérablement le rendement d’extraction de l’ADN ainsi que son ratio 260/280 nm (de 60% à 5% et de 2 à 1,6 environ quelles que soient les conditions). Cependant, une pré- incubation du lysat avec l’anhydride acétique ou l’EDC (respectivement Ac20 ou EDC dans le tableau 2 ci-dessous), avant ajout des particules de silice magnétique, restaure signifîcativement les performances d’extraction de l’ADN à la fois en quantité (à hauteur de 20% environ) mais aussi en pureté (à hauteur de 1,8 environ).
Ceci démontre l’effet bénéfique du masquage préalable des protéines sur l’extraction d’ADN par un support solide dans des conditions similaires à celles que l’on trouverait dans un protocole d’extraction des acides nucléiques type.
De manière générale, le GuHSCN, qui possède un pouvoir dénaturant plus important que le GuHCl, permet un meilleur rendement de capture de l’ADN en présence de protéines. Cependant la présence d’EDTA dans le LB diminue le ratio 260/280, tandis que le Triton X-100 lui aussi présent dans le LB a un effet très bénéfique.
Tableau 2 : Rendement d’extraction de 23 pg d’ADN en présence ou non d’inhibiteurs protéiques et avec ou sans anhydride acétique (Ac20) ou EDC, et dans différentes conditions de lyse. Les chiffres entre parenthèses indiquent le ratio 260/280 nm de l’éluat Exemple 5 : Amélioration de l’efficacité de l’extraction des acides nucléiques dans le sang (extraction avec des particules magnétiques à pH 7)
Afin de démontrer les effets bénéfiques du masquage des protéines par un réactif, avec un vrai échantillon biologique, nous avons extrait les acides nucléiques de 200m1 de sang en utilisant des particules de silice magnétiques (bioMérieux) et un protocole légèrement modifié utilisant du GuHCl 3M, Tris HCl 50 mM pH 7, 1% de triton pour l’étape de lyse, du Tris HCL 50 mM pH 7 à 50% éthanol pour les lavages et le tampon EasyMAG EB3 (bioMérieux) pour l’élution finale.
L’échantillon de sang a été soumis pendant l’étape de lyse à un traitement à l’anhydride acétique 0,3 M ou à l’acide acétique 0,3M pendant 5min, avant d’être neutralisé par adjonction de quelques mΐ de soude (en comparaison avec un échantillon de référence non traité). Suite à ce traitement, les particules magnétiques ont été ajoutées et le lysat mis sur l’easyMAG en suivant le protocole d’extraction du fournisseur (bioMérieux). La quantité d’acides nucléiques présente dans le sang est mesurée par spectrophotométrie UV (Nanodrop, Thermo fischer). On constate de façon remarquable sur la Figure 4 A que le protocole utilisant le réactif de masquage fonctionne également sur un échantillon de sang : Dans les conditions utilisées, l’absence de traitement à l’anhydride acétique ne conduit qu’à 0,7pg d’acides nucléiques (pureté de 0,9) alors que le traitement à l’anhydride acétique conduit à plus de 5pg d’acides nucléique (pour une pureté supérieure à 1.9). En expérience de contrôle, un traitement à l’acide acétique ne démontre aucune amélioration, ce qui montre que l’effet de l’anhydride acétique est lié à son pouvoir acylant. En effet, l’acide acétique n’est pas un agent acylant et ne peut masquer les fonctions réactives des protéines.
Il peut y avoir une multitude de composés co-extraits avec les acides nucléiques qui pourraient fausser le ratio 260/280. Afin de s’affranchir éventuellement des erreurs inhérentes à la mesure de densité optique par spectrophotométrie UV d’un éluat issu de l’extraction d’un échantillon biologique, nous avons soumis ces éluats à une hydrolyse totale avec de la nucléase Pl et de la phosphatase alcaline.
Les hydrolysats ont été analysés par HPLC de façon à ne pas être gênés par les protéines et l’aire correspondant aux nucléosides (DNA et RNA) a été mesurée sur les chromatogrammes par intégration des massifs correspondant aux nucléosides. Les résultats obtenus montrent que l’échantillon de sang traité préalablement avec l’anhydride acétique contient 12 fois plus d’acides nucléiques que l’échantillon non traité ou traité à l’acide acétique (qui est non acylant) (Figure 4B).
Exemple 6 : Amélioration de l’efficacité de l’extraction des acides nucléiques dans le sang (Extraction avec particules magnétiques à base de silice à pH 5.5)
La même expérience que celle décrite dans l’exemple 5 a été réalisée mais en changeant les conditions d’extraction des acides nucléiques (solutions tampons différentes).
A l33pL d’une solution de sang sont ajoutés 237 pL de tampon de lyse (6M GuHCl, 15 % Triton, AcONa, pH 5,5) et 6pL, 12m1 ou 24 pL d’Ac20 . Le milieu est incubé sous agitation pendant 3 à 5 min au au thermomixeur à 25°C et 500 tpm avant de rectifier le pH à 5,5 si nécessaire par adjonction de quelques mΐ de NaOH 10M. Par exemple 3 pL, 4.5 et 6.8 pL de NaOH sont ajoutés respectivement pour 6pL, l2pL et 24pL d’Ac20. Le lysat est additionné aux particules de silice magnétiques afin d’extraire les acides nucléiques. Les solutions de lavages (3 fois 70m1 Wash Buffer IX) précèdent l’étape d’élution qui s’effectue dans une solution de 70pL de Tris HCl sous agitation à 1400 tpm, à 70°C en 5 minutes. Les lysats sont soumis à l’action d’enzymes d’hydrolyse des acides nucléiques comme décrit dans l’exemple 5 afin de déterminer la quantité d’acides nucléiques extrait. Les résultats obtenus montrent que l’ajout du réactif de masquage (anhydride acétique) en présence de sang permet de doubler la quantité d’acides nucléiques extrait.
On observe un optimum dans ces conditions aux alentours de 6m1 d’anhydride acétique pur. A cette concentration et en présence de 15% de Triton dans le tampon de lyse, la quantité d’acide nucléique éluée est globalement multipliée par deux. Le ratio rA/(rA+dA) montre que l’ARN est majoritairement présent dans l’éluat à 70 % contre 10 % sur la nanoparticule, indiquant qu’il est élué préférentiellement.
Exemple 7: Le traitement de l’ADN par l’anhydride acétique dans les conditions du procédé selon la présente divulgation n’altère pas la structure chimique des nucléosides
Afin de démontrer la sélectivité de réaction de l’anhydride acétique vis-à-vis des acides nucléiques, les inventeurs ont réalisé l’expérience suivante :
Après incubation pendant 10 min d’un mélange de 92mg de d’ADN dans 360m1 de GuHCl 3,3M, Tris HCl 50 mM pH 7 en présence d’anhydride acétique à 0.6M (24pl), l’ADN a été purifié par cartouche d’ultrafiltration (Ultracel YM-50) afin d’éliminer l’anhydride acétique qui absorbe partiellement en UV. Cet échantillon a été ensuite soumis à une lyse totale avec un mélange de nuclease Pl et de phosphatase alcaline avant d’être analysé par HPLC (Conditions A). Les résultats obtenus montrent que l’hydrolysat d’ADN en présence d’anhydride acétique ou non, a exactement le même profil. On n’y décèle que les nucléosides attendus et aucun nucléoside acylé. Une recherche de nucléoside acylés par spectrométrie de masse a été également réalisée sans mettre en évidence ces produits. Ces résultats montrent que la réaction d’acylation avec l’anhydride acétique est bien sélective et n’affecte pas les acides nucléiques extraits.
Exemple 8 : Démonstration que la structure de l’ADN et de l’ARN n’est pas affectée lors du traitement par l’anhydride acétique dans des conditions d’extraction des acides nucléiques
La même démonstration que dans l’exemple 7 a été réalisée en utilisant cette fois un mélange d’ADN et d’ARN qui a été mis en présence ou non de l’anhydride acétique puis extrait à l’aide de particules de silice magnétique. Une hydrolyse enzymatique de ces éluats a permis de confirmer sans aucune ambiguïté qu’il n’y a pas de modifications chimiques des nucléosides suite à l’action de l’anhydride acétique (voir Figure 5). Ainsi, on peut en conclure que les acides nucléiques ainsi extraits devraient être amplifîables par PCR ou par toute autre réaction d’amplification enzymatique de matériel génétique.
Exemple 9 : Le traitement à l’anhydride acétique d’un échantillon de sang permet de détecter le virus CMV avec plus de sensibilité
Un échantillon de 200m1 de sang contenant du virus CMV (Cytomégalovirus en culture) à hauteur de l0e4 copies est ajouté à 800 mΐ de tampon de lyse (6M GuHCl, 15 % Triton, AcONa, pH 5,5) auquel on ajoute 9m1 d’anhydride acétique pur et, facultativement Imΐ de NaOH 10M, après quelques minutes de réaction.
On réalise un témoin avec du sang où il n’y a pas de traitement préalable à l’anhydride acétique, et un autre sans échantillon sanguin, correspondant à 63 mΐ de Tris HCL pH7 contenant l0e4 copies de CMV puis mélangé à 237 mΐ de tampon de lyse.
Les acides nucléiques contenus dans le lysat sont ensuite extraits et purifiés comme décrit dans l’exemple 6. L’éluat est ensuite soumis à une amplification par PCR en temps réel en utilisant un kit RGene CMV (kit CMV 69-003B : lot 1005408010, BioMérieux, Marcy L’Etoile, France) et un thermocycleur (CFX96 TouchTM de BioRad) permettant de déterminer la sensibilité de détection des acides nucléiques extrait exprimé en nombre de cycle de PCR (Ct). Ce nombre est fonction de la concentration en acides nucléiques, plus il est bas et plus il est facile de détecter les acides nucléiques de l’agent pathogène car la concentration initiale en acides nucléiques est élevée. Il y a un facteur d’échelle de 10 entre chaque Ct (échelle logarithmique).
Les courbes de la Figure 6 correspondent respectivement à l’amplification témoin réalisée après extraction sans matrice biologique (triangles), avec matrice biologique sans traitement à l’anhydride acétique (croix) et avec matrice biologique avec traitement à l’anhydride acétique (ronds). Le nombre de cycles de PCR est donc à 34Ct quand le virus CMV a été extrait sans matrice biologique, puis passe à 38 Ct quand la même quantité d’acides nucléiques est extraite d’un échantillon contenant du sang. Ceci montre que les inhibiteurs contenus dans la matrice biologique sont responsables de la perte de plus de 99,9 % des acides nucléiques initiaux. Le nombre de Ct repasse à 34 soit équivalent à un échantillon sans matrice quand l’échantillon à préalablement été traité avec l’anhydride acétique. Ces données montrent une remarquable amélioration de la sensibilité de la détection en présence d’une matrice biologique.
La Figure 7 est une autre représentation de la Figure 6 avec la précision sur les Ct.
Exemple 10. Amélioration de l’extraction des acides nucléiques en présence d’une forte concentration en protéines par l’utilisation d’anhydride acétique (Utilisation d’une colonne d’extraction avec membrane de silice)
Dans cet exemple, les inventeurs ont utilisé un support d’extraction des acides nucléiques différent des particules de silice magnétique, afin de démontrer que l’anhydride acétique à également un intérêt dans d’autres technologies d’extraction comme les colonnes d’extraction à base de membrane de silice.
10 ug d’ADN de sperme de saumon (20 kB) sont mélangés à 300m1 d’une solution de GuHCl 3M, 50 mM AcO-Na pH 5,5 et 30% d’éthanol avec des concentrations croissantes d’un mélange d’hémoglobine et d’albumine sérique humaine à hauteur de 0,300,600,1200,1800 et 2400 pg (avec un ratio hémoglobine / HSA de 3/1).
Ce mélange est traité ou non avec 6m1 d’anhydride acétique pendant quelques minutes (10) sous agitation au thermomixer.
Le mélange est neutralisé avec 1 mΐ de NaOH 5M afin de rétablir le pH à 5,5. Le mélange est déposé sur une colonne QiaQuick (Qiagen, Heiden, Allemagne) et centrifugée 6 minutes à 13 200 rpm.
La colonne est lavée 3 fois avec 200pL de MES 50 mM pH 5,5 / 80% Ethanol en centrifugeant à l3200rpm pendant 3 minutes
Les acides nucléiques immobilisés sont alors élués avec 200m1 de tampon borate pH 8,5 à 3mM une première fois, puis cette solution est repassée afin d’éluer la totalité des acides nucléiques.
L’éluat est soumis à une hydrolyse enzymatique puis les acides nucléiques extraits sont quantifiés par analyse chromatographique.
On observe sur la Figure 8 une amélioration notable de la quantité d’ADN extraite quand l’échantillon a été soumis à l’anhydride acétique.
Exemple 11 : Démonstration que l’utilisation de l’anhydride acétique selon l’invention permet aussi l’inhibition des nucléases
Un oligonucléotide modèle de 60 bases (1 nmole) est mis en présence de 0,01 unité de nucléase Pl dans 48m1 d’eau et 2m1 de MES 500 mM pH 4.7 en rajoutant ou non 6 mΐ d’anhydride acétique pur. Les résultats sont présentés sur la figure 9. On constate par rapport à l’oligonucléotide de contrôle n’ayant subi aucun traitement (chromatogramme A) que dans le cas où il n’y a pas d’anhydride acétique, l’oligonucléotide est immédiatement hydrolysé par la nucléase (chromatogramme B). En revanche, dans le cas où l’on a rajouté l’anhydride acétique, il n’y a que très peu de dégradation de l’oligonucléotide (chromatogramme C). Ceci démontre donc que l’anhydride acétique permet l’inactivation de la nucléase en alkylant cette dernière.
Exemple 12 : Démonstration que le réactif peut réagir sélectivement sur les protéines dans des conditions chaotropiques (cas de l’anhydride acétique)
Les Figures 10 et 11 montrent le suivi par HPLC (Conditions B) de l’acétylation de la HSA ou de l’hémoglobine à 25 mg/ml par l’anhydride acétique entre 0 et 1,8 M en conditions de lyse (GuHCl 3M ou GuSCN 3M , Tris HCl 50 mM pH 7). On voit après 5 min de réaction et selon la concentration en anhydride acétique que le massif correspondant à la protéine s’élargit et se déplace vers la droite signifiant que la protéine devient plus hydrophobe ce qui est le résultat de son acylation. Dans le cas de la HSA, quand la concentration autour de 1,2 M est atteinte le temps de rétention n’évolue plus ce qui signifie que tous les groupements nucléophiles de la protéine ont réagi. A noter sur les chromatogrammes de suivi de l’acétylation de l’Hémoglobine que l’hème n’est pas modifiée par l’acétylation et ne subit pas de modification de son temps de rétention.
On montre ainsi que l’anhydride acétique peut réagir rapidement et efficacement sur des protéines dans des conditions de lyse et en présence de composés nucléophiles comme le Tris.
Le fait que l’anhydride acétique puisse acétyler une protéine en milieu aqueux tout en étant sélectif constitue réellement une surprise car la majorité des réactions avec l’anhydride acétique sont décrites dans un solvant organique. En raison de la présence d’eau, de Tris et de guanidine qui sont susceptibles de Thydrolyser il n’était pas évident que l’anhydride acétique puisse réagir à faible concentration avec une protéine.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon comprenant des protéines et/ou polysaccharides, ledit procédé comprenant une étape de capture des acides nucléiques par mise en contact de l’échantillon avec un support solide approprié, par exemple un support solide à base de silice, caractérisé en ce que, avant l’étape de capture, ledit procédé comprend une étape de traitement de l’échantillon avec au moins un réactif pour le masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l’échantillon.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif de masquage des fonctions amines est choisi parmi des agents acylants ou alkylants.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le réactif de masquage est choisi parmi les agents acylants de formule (I) suivante :
où R est un groupe organyle, organyloxy, ou organylamino
LG est un groupe partant choisi dans le groupe constitué par les halogènes, les groupes organyloxy et organylamino.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le réactif de masquage est un agent acylant choisi dans le groupe constitué par les esters activés, les halogénures d’acide, les chloroformiates, les anhydrides, les esters de carbonate activés, et le carbonyle diimidazole.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le réactif de masquage est un anhydride choisi parmi l’anhydride acétique, l’anhydride propanoïque, l’anhydride isobutyrique, l’anhydride butanoïque ou l’anhydride benzoïque.
6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le réactif de masquage est un agent alkylant choisi dans le groupe constitué par les halogénures d’alkyles, les composés diazoïques, et les aldéhydes.
7. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le réactif de masquage est choisi parmi les amines, les alcools et les thiols pour le masquage des fonctions acides carboxylique des protéines, en combinaison avec un agent de couplage.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l’agent de couplage peut être choisi parmi les carbodiimides, par exemple l’l-éthyle-3-(3- diméthylaminopropyle)carbodiimide (EDC), le di-iso-propylcarbodiimide (DIC) et le dicyclohexylcarbodiimide (DCC).
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes pour l’extraction d’acides nucléiques d’un échantillon biologique et comprenant les étapes suivantes :
a. la lyse des cellules, par exemple par mise en contact de l’échantillon
biologique avec un tampon de lyse,
b. le traitement du lysat avec le réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides de l’échantillon, c. la capture des acides nucléiques par mise en contact du lysat traité avec un support solide approprié, par exemple un support solide à base de silice, d. le cas échéant, le lavage du support avec un tampon de lavage et, e. le cas échéant, l’élution des acides nucléiques.
10. Procédé selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que le support solide approprié est constitué de particules de silice, notamment des particules de silice magnétique.
11. Procédé selon l’une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma ou de sérum.
12. Procédé selon l’une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que l’étape de capture est effectuée en présence d’agents chaotropiques.
13. Procédé selon l’une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu’il ne comprend pas l’utilisation de protéases pour l’élimination des protéines.
14. Procédé selon l’une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce qu’aucun solvant organique n’est ajouté avant ou pendant l’étape de capture des acides nucléiques.
15. Procédé selon l’une des revendications 9 à 14, caractérisé en ce qu’il comprend une étape supplémentaire de détection d’acides nucléiques d’intérêt, notamment par amplification des acides nucléiques extraits.
16. Kit d’extraction d’acides nucléiques comprenant au moins
i. un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que défini à l’une des revendications 1 à 8,
ii. un support solide approprié pour l’extraction des acides nucléiques, par exemple un support solide à base de silice,
iii. le cas échéant, un catalyseur de la réaction de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques à l’aide du réactif,
iv. le cas échéant, un agent de couplage.
17. Kit d’extraction d’acides nucléiques selon la revendication 16, caractérisé en ce que le réactif de masquage est l’anhydride acétique ou sa forme sèche, l’acétate de N- Hydroxy succinimide,
18. Utilisation d’un réactif de masquage des fonctions amines et/ou acides carboxyliques des protéines et/ou polysaccharides tel que défini à l’une des revendications 1 à 8, pour l’inhibition de nucléase.
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que la nucléase est comprise dans un lysat obtenu par lyse d’un échantillon biologique, par exemple, en vue d’une amplification et/ou détection d’un acide nucléique dans l’échantillon.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019320825B2 (en) 2018-08-17 2025-09-25 Cepheid Methods and compositions for nucleic acid isolation
WO2020037262A1 (fr) * 2018-08-17 2020-02-20 Cepheid Isolement d'acides nucléiques et procédés associés
CN112881680B (zh) * 2021-01-19 2022-11-15 深圳市卓润生物科技有限公司 连接有dsDNA的磁性微粒的制备方法
US20230080090A1 (en) * 2021-08-30 2023-03-16 Abbott Molecular Inc. Selective purification of rna
CN115092938B (zh) * 2022-06-21 2024-02-06 苏州拉索生物芯片科技有限公司 一种氨基改性二氧化硅微球的制备方法及应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
KR100757630B1 (ko) 1997-12-23 2007-09-10 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 신규한 추출 및 단리 방법으로 수득되는 세균성 캡슐형 다당류
EP1177281B1 (fr) * 1999-04-30 2009-01-21 Cyclops Genome Sciences Limited Isolation d'acide nucleique
KR100320753B1 (ko) * 1999-10-23 2002-01-17 박한오 어류의 정원세포로부터 ｄｎａ 추출방법
AU2003245465A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 Medimolecular Pty. Ltd. Method of isolating nucleic acids from stool samples
JP4076812B2 (ja) 2002-07-26 2008-04-16 独立行政法人科学技術振興機構 核酸の分解防止方法、核酸抽出方法、および核酸保存方法
GB0217963D0 (en) * 2002-08-02 2002-09-11 Cyclops Genome Sciences Ltd Purification of nucleic acids
FR2934595B1 (fr) 2008-07-29 2013-04-05 Biomerieux Sa Reactifs de marquage ayant un noyau pyridine portant une fonction diazomethyle, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
JP5826752B2 (ja) * 2009-09-14 2015-12-02 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 細胞学用培地に固定された組織サンプルから核酸またはタンパク質を回収するための組成物および方法
US10761088B2 (en) * 2016-03-14 2020-09-01 University Of Southern California Method for identifying histone tail proteolysis

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