EP3639024A1 - Verfahren zum nachweis von extrazellulären vesikeln in einer probe - Google Patents

Verfahren zum nachweis von extrazellulären vesikeln in einer probe

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EP3639024A1
EP3639024A1 EP18729021.8A EP18729021A EP3639024A1 EP 3639024 A1 EP3639024 A1 EP 3639024A1 EP 18729021 A EP18729021 A EP 18729021A EP 3639024 A1 EP3639024 A1 EP 3639024A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
extracellular vesicles
dad
probes
substrate
net
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18729021.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christian ZAFIU
Dieter Willbold
Andreas KUWALIK
Oliver BANNACH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP3639024A1 publication Critical patent/EP3639024A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
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    • G01N33/552—Glass or silica

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting extracellular vesicles in a sample.
  • Extracellular vesicles are membrane particles that can be sequestered by almost any cell and resumed by a variety of cells. These vesicles can transmit information from one cell to another. A distinction is made between three classes of extracellular vesicles: exosomes with a diameter smaller than 100 nm, which originate from endosomes of the cell interior. Larger microparticles (100-1000 nm), which separate directly from the cell membrane. The third class of extracellular vesicles are vesicles that arise during apoptosis. The vesicles can be generated by different factors, such as extracellular stimuli, microbial infections and other stress factors. Extracellular vesicles consist of a lipid bilayer in which membrane proteins are integrated and a solution in the interior.
  • proteins DNA and / or RNA, which is referred to as cargo.
  • a few proteins are found in all extracellular vesicles and are secreted independently of the cell type [1]. These include proteins that are found in the cell interior, such as
  • extracellular vesicles are released by cells into the surrounding medium and are also excreted renally, they are found in body fluids such as blood, cerebrospinal fluid, as well as in urine, in which they are detected and can provide information about a disease even without biopsy [3, 7 ].
  • Another field of application is the use of extracellular vesicles which have been secreted by cancer cells. These could be used as a vaccine [8]. This allows immunization of high-risk patients on the one hand and on the other hand, one can biopharmaceutical agents, eg. As antibodies, produce and use for therapeutic purposes. The direct use of exosomes for therapeutic purposes is also considered [7].
  • the gold standard in the detection and characterization of extracellular vesicles are electron microscopic techniques, of which cryo-transmission electron microscopy is the most sensitive technique.
  • This method provides the highest resolution and the most accurate size distribution of extracellular vesicles, and it is also possible to characterize extracellular vesicles with immunostaining.
  • the disadvantage is the sample preparation difficult, the measurement extremely tedious and the method very expensive overall. It also requires well-trained staff, which makes it neither suitable for absolute quantification nor for routine diagnostics [9].
  • FCM flow cytometer
  • the flow cytometer sorts and counts the light scattering based on the refractive index.
  • the scattering intensity can also provide information on the size of individual particles, the lower detection limit is disadvantageously about 400 nm.
  • extracellular vesicles are additionally labeled with a fluorescence-labeled antibody and, in addition to light scattering, also evaluates the fluorescence signal. The advantage is that extracellular vesicles can be characterized and the size resolution limit drops to about 100 nm.
  • the fluorescence signal is recorded with a camera and different wavelengths are excited, with the possibility of detecting different types of extracellular vesicles.
  • Disadvantages of the technique lie in the fact that only one property can be assigned to a particular vesicle in the flow, so that the method also detects residues from the medium unless they have been laboriously removed.
  • the lower resolution limit is 100 nm for image-guided flow cytometers [9].
  • the sample solution flows through a pore between two electrodes to which a voltage is applied. Passing particles increase the electrical resistance between the electrodes, allowing particles to be counted.
  • the achievable lower detection limit of such methods is 40 nm and depends on the hole diameter.
  • the disadvantage is that the pore can clog up and that it can be difficult to find the optimal settings to count all particles in samples with heterogeneous size distributions.
  • the method does not characterize extracellular vesicles [10].
  • DLS Dynamic light scattering
  • Nanoparticle Tracking Analysis uses light scattering to track particle motion and record it with a camera. From the data obtained, conclusions can be drawn about the size distribution and its concentration. Some devices are equipped with a fluorescence detection system that allows to track labeled extracellular vesicles as well. In heterogeneous size distributions but samples must be measured in different dilutions. The lower detection limit is 50 nm [9].
  • the object of the invention is therefore a method for detecting extracellular vesicles in any samples, for.
  • body fluids such as blood plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid but also cell culture supernatants to provide.
  • Another object of the invention is to provide a kit for carrying out the detection.
  • the object is achieved by a method for detecting extracellular vesicles in a sample, comprising the following steps: a) application of the sample to a substrate, b) addition of probes suitable for the detection, which mark these by specific binding to the extracellular vesicles and c ) Detection of the extracellular vesicles by measuring a specific signal of the probe, wherein step b) before step a) can be performed.
  • the object of the invention is achieved.
  • the method is characterized in that, prior to step a), immobilization of capture molecules for the extracellular vesicles on the substrate takes place.
  • non-specifically bound molecules and particles are removed by washing after bringing the extracellular vesicles into contact with the probes. It can be advantageously selected probes which bind to the extracellular vesicles, wherein the probes z. B. also after binding are able to emit a specific signal.
  • the contacting of the extracellular vesicles with the capture molecules and the probes can occur simultaneously.
  • the contacting of the extracellular vesicles with the probes may also be done prior to contacting the capture molecules.
  • the method advantageously permits determination of the size distribution of the extracellular vesicles, especially in the size range of 10-100 nm for exosomes and for 100-1000 nm for microparticles, as shown below.
  • the method succeeds in detecting the extracellular vesicles in any
  • the method may advantageously allow qualitative detection of extracellular vesicles, as well as quantification and characterization in any samples.
  • a direct and absolute quantification of the number of extracellular vesicles and, on the other hand, a characterization of the size distribution of extracellular vesicles are advantageously ensured.
  • the characterization can also be carried out by quantification and identification of proteins, DNA and RNA in the interior of the vesicle and / or by membrane proteins.
  • any sample is meant also buffers with different additives or culture media, and the sample may be taken ex vivo from body fluids, or may be samples from the environment, such as aquatic, plant and soil samples, as well as food are directly examined, and the extracellular vesicles are detected.
  • a specific variant of the method according to the invention is the quantitative and / or qualitative determination of extracellular vesicles which contain at least one binding site for a capture molecule and at least one binding site for a probe.
  • This procedure comprises the following steps:
  • Method for the quantitative and / or qualitative determination of extracellular vesicles containing at least one binding site for a capture molecule and at least one binding site for a probe comprising the following steps: a) immobilizing catcher molecules on a substrate, b) bringing the extracellular vesicle into contact with the capture molecules, c Immobilizing the extracellular vesicles on the substrate by binding to capture molecules, d) contacting the extracellular vesicles with the probes, and e) removing non-specifically bound molecules and particles e.g. F) binding the probes to the extracellular vesicles, which probes are capable of emitting a specific signal and steps b) and d) may be concurrent or d) prior to b).
  • the steps c) and f) can thus advantageously be carried out simultaneously.
  • an immobilization of probe-labeled extracellular vesicles on the substrate thus takes place.
  • the probes are bound to the extracellular vesicles before the extracellular vesicles are contacted with the capture molecules and immobilized to the substrate.
  • the sample is chemically fixed after contacting the extracellular vesicles with the probes, e.g. By formaldehyde.
  • the probe may be supplemented with DNA and RNA binding probes after or during or prior to binding of the probes to the extracellular vesicles.
  • a detergent is used to make the membrane of the extracellular vesicle permeable and, for.
  • a detergent is used to make the membrane of the extracellular vesicle permeable and, for.
  • probes to the extracellular vesicle probes may penetrate into the interior of the extracellular vesicles.
  • the "quantitative determination” means first of all the determination of the concentration of the extracellular vesicles, and therefore also the determination of their presence and / or absence.
  • the quantitative determination also means the selective quantification of certain types of extracellular vesicles. Such quantification can be detected via the corresponding specific probes.
  • the "qualitative determination” means the characterization of the extracellular vesicles.
  • the extracellular vesicles are labeled with one or more probes useful for detection and / or specific probes.
  • the probes contain an affine molecule that recognizes and binds to a binding site of the extracellular vesicle.
  • the probes contain at least one detection molecule or part of the molecule which is attached to the extracellular vesicle-affine molecule or part of the molecule is covalently bound and can be detected and measured by means of chemical or physical methods.
  • the probes can have identical affine molecules or parts of molecules with different detection molecules (or parts).
  • different affine molecules or molecular moieties may be combined with different detection molecules or moieties, or alternatively, different affine molecules or moieties may be combined with identical detection moieties or moieties.
  • a spatially resolved determination of the probe signal ie a spatially resolved detection of the signal emitted by the probe. Accordingly, in this embodiment of the invention, methods based on a non-spatially resolved signal, such as ELISA or sandwich ELISA, are excluded.
  • a high spatial resolution is advantageous.
  • so many data points are collected that the detection of an extracellular vesicle before a background signal, which z. B. by device-specific noise, other non-specific signals or nonspecifically bound probes is made possible. In this way, so many values are read out (read-out values), such as spatially resolved events such. As pixels are present.
  • the spatial resolution determines each event against the respective background and thus represents an advantage over ELISA methods without spatially resolved signal.
  • the spatially resolved determination of the probe signal is based on total internal reflection fluorescence microscopy (tirfm) and the study of a small volume element compared to the volume of the sample, in the range of Femtolitern below a Femtoliters, or a volume range above the contact surface of the capture molecules with a height of 500 nm, preferably 300 nm, more preferably 250 nm, in particular 200 nm.
  • extracellular vesicles are detected which are selected from the group consisting of or consisting of exosomes and / or microparticles.
  • the material of the substrate is selected from the group consisting of or consisting of plastic, silicon and silicon dioxide.
  • glass is used as the substrate.
  • the capture molecules are covalently bound to the substrate.
  • a substrate which has a hydrophilic surface.
  • this is achieved by applying a hydrophilic layer, before step a), to the substrate.
  • the capture molecules bind, in particular covalently, to the substrate or to the hydrophilic layer with which the substrate is loaded.
  • the hydrophilic layer is a biomolecule-repellent layer, so that the non-specific binding of biomolecules to the substrate is advantageously minimized.
  • the catcher molecules preferably covalently immobilized. These are affinitive to a feature of extracellular vesicles.
  • the catcher molecules can all be identical, or mixtures of different catcher molecules can be present.
  • the same molecules are used as catcher molecules and probes.
  • the capture molecules do not comprise a detection molecule or moieties that are suitable for detection.
  • the hydrophilic layer is selected from the group consisting of or consisting of polyethylene glycol, poly-lysine, preferably poly-D-lysine, and dextran or derivatives thereof, preferably carboxymethyl-dextran (CMD).
  • CMD carboxymethyl-dextran
  • the surface of the substrate is first hydroxylated before application of the hydrophilic layer and then activated with amino groups. This activation with amino groups takes place in an alternative by contacting the substrate with APTES (3-aminopropyltrietoxysilane) or with ethanolamine.
  • the contacting of the substrate with APTES occurs in the gas phase; the optionally pretreated substrate is thus vapor-coated with APTES.
  • the substrate For the coating with dextran, preferably carboxymethyl-dextran (CMD), the substrate with an aqueous solution of CMD in a concentration of 10 mg / ml or 20 mg / ml and optionally N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) Car - Bodiimid (EDC), (200 mM) and N-hydroxysuccinimide (NHS), (50 mM) were incubated and then washed.
  • CMD carboxymethyl-dextran
  • the carboxymethyl-dextran is covalently bonded to the glass surface, which was first hydroxylated and then functionalized with amino groups.
  • Microtiter plates preferably with a glass bottom, can also be used as the substrate. Since the use of concentrated sulfuric acid is not possible when using polystyrene frames, the activation of the glass surface in one embodiment of the invention takes place analogously.
  • Covalent, preferably covalent, catcher molecules are immobilized on this hydrophilic layer which are affine towards a feature of the extracellular vesicle to be detected. This feature can be a protein.
  • the capture molecules may all be identical or mixtures of different capture molecules.
  • the capture molecules are immobilized on the substrate, optionally after activation of the CMD-coated support by a mixture of EDC / NHS (200 or 50 mM).
  • Remaining carboxylate end groups to which no capture molecules have been bound can be deactivated.
  • Ethanolamine is used to deactivate these carboxylate end groups on the CMD spacer.
  • the substrates or carriers are optionally rinsed with buffer.
  • the sample to be measured is brought into contact with the substrate thus prepared and optionally incubated.
  • the sample to be examined may be endogenous fluids or tissues.
  • the sample is selected from CSF, blood, plasma and
  • Urine The samples may undergo different processing steps known to those skilled in the art.
  • the application of the sample is carried out directly on the substrate, for. B. the uncoated substrate, optionally by covalent bonding.
  • the binding is to an activated surface of the substrate.
  • a pretreatment of the sample takes place according to one or more of the following method steps:
  • enzymes for example proteases, nuclease, lipases,
  • the sample is preferably brought into contact with the substrate immediately and / or without pretreatment. Unspecific bound substances can be removed by washing steps.
  • the immobilized extracellular vesicles are labeled with one or more probes useful for further detection.
  • the individual steps can also be carried out in a different order according to the invention. Suitable washing steps remove excess probes that are not bound to extracellular vesicles.
  • these excess probes are not removed. This eliminates a washing step and there is no equilibrium shift in the direction of dissociation of the extracellular vesicle-probe complexes or compounds. Due to the spatially resolved detection, the excess probes are not detected during the evaluation.
  • the extracellular vesicle binding sites are epitopes and the capture molecules and probes are antibodies and / or antibody moieties and / or fragments thereof.
  • the capture molecules and the probes can be identical.
  • the capture molecules and the probes differ. So z. B. different antibodies and / or antibody parts and / or fragments can be used as catcher molecules and as probes. In a further embodiment of the present invention capture molecules and probes are used, which are identical to each other with the exception of the eventual (dye) label.
  • At least two or more different capture molecules and / or probes are used which z. B. contain different antibodies and optionally also carry different dye label.
  • the probes are characterized in that they emit an optically detectable signal selected from the group consisting of fluorescence, bioluminescence and chemiluminescence emission as well as absorption.
  • the probes are thus labeled with fluorescent dyes.
  • fluorescent dye the dyes known to those skilled in the art can be used.
  • GFP Green Fluorescence Protein
  • conjugates and / or fusion proteins thereof, as well as quantum dots can be used.
  • quantum dots For quality control of the surface, for example, in demonstrating the uniformity of the coating with capture molecules, catcher molecules can be used labeled with fluorescent dyes.
  • a dye is preferably used which does not interfere with the detection of the fluorescent dye of the probe on the extracellular vesicle.
  • the detection of the immobilized and labeled extracellular vesicles by means of imaging of the surface, z. B. with laser scanning microscopy.
  • the highest possible spatial resolution determines a high number of pixels, whereby the sensitivity as well as the selectivity of the method can be increased, as structural
  • the detection is carried out, for example, preferably with spatially resolving fluorescence microscopy through a TIRF microscope, and the corresponding super-resolution variants thereof, such as STORM, dSTORM.
  • a laser focus as z.
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy System
  • the probes may be selected such that the presence of single extracellular vesicle features, such as e.g. B. single membrane proteins that do not affect the measurement result.
  • the probes can be selected such that extracellular vesicle species (phenotypes) can be determined for each individual extracellular vesicle.
  • Additional probes may be selected to allow differentiation between DNA / RNA-containing extracellular vesicles and thus information about the interior of the extracellular vesicles.
  • DNA / RNA-binding fluorophores such as DAPI from Hoechst can be used for this purpose.
  • the spatially resolved information z.
  • fluorescence intensity all used and detected probes used to z.
  • image analysis options include z.
  • the search for local intensity maxima in order to obtain from the image information the number of detected extracellular vesicles and also to be able to determine the particle sizes.
  • the present invention also provides nanoparticle standards which have a defined size and preferably covalently carry the surface characteristics of the extracellular vesicles to be examined.
  • the standards are preferably silica nanoparticles, but nylon nanoparticles are also possible.
  • the present invention also provides a kit comprising one or more of the following components:
  • Substrate optionally with a hydrophilic surface
  • kits may be packaged in containers, optionally with / in buffers and / or solution.
  • some components may be packaged in the same container.
  • one or more of the components could be attached to a solid support, such as a solid support.
  • kit may include instructions for using the kit for any of the embodiments.
  • the above-described catcher molecules are already immobilized on the substrate.
  • the kit may contain solutions and / or buffers. To protect the coating and / or the catcher molecules immobilized thereon, they may be overcoated with a solution or a buffer.
  • Another object of the present invention is the use of the method according to the invention for the detection of extracellular vesicles in any samples for the quantification and thus titer determination of extracellular vesicles.
  • the method thus also the detection of a disease such.
  • a disease such as cardiovascular, kidney and cancer
  • the detection of an immune response can be used in drug development, the direct and absolute quantification of extracellular vesicles, targeting therapy, differential diagnosis, protein-protein interaction detection and / or extracellular vesicle typing.
  • Another object of the present invention is the use of the method according to the invention for monitoring therapies with extracellular vesicles and for monitoring and / or checking the effectiveness of active ingredients and / or healing methods.
  • the method can therefore be used in clinical trials, studies and in therapy monitoring. For this purpose, samples are measured according to the method according to the invention and the results compared.
  • Another object of the present invention is the implementation of the method of the invention for determining the effectiveness of drugs against diseased cells.
  • the results are compared using the characterization of extracellular vesicles in samples.
  • the samples are corresponding to body fluids taken before or after, or at different times after administration of the active ingredients or implementation of the healing process.
  • the results are compared with a control which has not been subjected to the active ingredient and / or healing process.
  • active substances and / or healing methods are selected.
  • Another object of the present invention is the implementation of the method according to the invention for determining whether a person is taken in a clinical study.
  • samples according to the invention are taken according to the invention.
  • A) shows emissions at 705 nm (EM) and excitation at 633 nm (EX). This channel represents APC dyes.
  • Sample 1 are cell culture supernatants from HEK cells that do not express NEF-mCherry and were treated with anti-MHC1 antibodies with PE stain.
  • Sample 2 is equivalent to Sample 1, except that MHC1 antibodies carry an APC dye.
  • Sample 3 contains cell culture supernatants from HEK cells expressing a NEF-mCherry fusion protein and labeled with anti MHC1 antibody-PE.
  • Sample 4 is equivalent to Sample 3, except that the anti-MHC1 antibody was labeled with APC instead of PE.
  • sample 5 cell culture supernatants from NEF-mCherry expressing cells were not labeled with antibodies.
  • sample 1 and 3 differ significantly from the other samples. These samples were treated with anti-MHC1 antibodies bearing an APC dye. Extracellular vesicles carrying an MHC1 protein could thus be detected in these samples.
  • sample 1 has a lower number of pixels than the remaining samples. In this fluorescence channel PE dyes and mCherry were excited and therefore no APC. This figure shows that it is possible to quantify PE (sample 2) and mCherry (sample 5), which is expressed in the cells and packaged in extracellular vesicles. The combination (samples 3 and 4) also provides signals that are suitable for quantification.
  • NEF is the Negative Regulatory Factor, a protein found in exosomes.
  • mCherry we mean a fluorescent protein with an absorption maximum at 558 nm and an emission maximum at 583 nm. Construction of the Assay:
  • microtiter plates (Greiner Bio-one, Sensopiate Plus) with 384 reaction chambers (RK) and glass bottom were used.
  • RK reaction chambers
  • the surface of the microtiter plate was built up.
  • the plate was placed in a desiccator containing a dish of 5% APTES in toluene.
  • the desiccator was flooded with argon and incubated for one hour. Thereafter, the tray was removed and the plate dried for 2 hours in vacuo. 20 ⁇ of a 2 mM solution of SC-PEG-CM (MW 3400, Layman Bio) in deionized H 2 O was introduced into the RK of the dry plate and incubated for 4 hours.
  • the RK was washed three times with water and then each with 20 ⁇ of an aqueous 200 mM EDC solution (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimides, Sigma) and with 50 mM NHS (N- Hydroxysuccinimide, Sigma) for 30 minutes. The plate was again washed three times with deionized water.
  • the RK were coated with anti-CD63 antibodies and anti-MHCI antibodies as catcher molecule (20 ⁇ , per antibody 5 g ml -1 in PBS, 1 hour), followed by RK with the wash program consisting of three washes and one wash Empty eyes were treated with TBS containing 0.1% Tween-20 and TBS
  • the detection antibodies used were anti-MHC1 antibodies which had been previously labeled with the fluorescent dyes PE (phycoeritrin) or with APC (allophycocyanin) .
  • the detection antibodies used
  • the maximum laser power (100%), an exposure time of 500 ms and a gain value of 800 were selected.
  • the image data was evaluated afterwards.
  • Intensity thresholds were set for each channel at approximately 25% gray levels in total intensity.
  • the intensity threshold was first applied for each image in each channel, and then images of the same position were compared in both values. Only those pixels per image were counted, where in both channels the pixel is at the exact same position above the intensity threshold of the channel. Finally, the number of pixels over all images in each RK is averaged, then the mean values of the average pixel numbers of the replicate values are determined and the standard deviation is specified.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis Extrazellulärer Vesikel in einer Probe, umfassend folgende Schritte: a) Aufbringen der Probe auf ein Substrat, b) Hinzufügen von für den Nachweis geeigneten Sonden, die durch spezifische Bindung an die Extrazellulären Vesikel diese markieren und c) Nachweis der Extrazellulären Vesikel durch Messen eines spezifischen Signals der Sonde, wobei Schritt b) vor Schritt a) durchgeführt werden kann. Kit zur Durchführung des Substrats ist offenbart.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zum Nachweis von Extrazellulären Vesikeln in einer Probe
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von extrazellulären Vesikeln in einer Probe.
Stand der Technik
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Membranpartikel, die von nahezu jeder Zelle sezer- niert und von einer Vielzahl an Zellen wieder aufgenommen werden können. Diese Vesikel können Informationen von einer Zelle zu anderen Zellen übertragen. Man unterscheidet dabei drei Klassen von Extrazelluläre Vesikel: Exosomen, mit einem Durchmesser kleiner als 100 nm, welche von Endosomen aus dem Zellinneren stammen. Größere Mikropartikel (100 - 1000 nm), welche sich direkt von der Zellmembran abtrennen. Bei der dritten Klasse von Extrazellulären Vesikeln handelt es sich um Vesikel, welche während der Apoptose entstehen. Die Vesikel können durch unterschiedliche Faktoren generiert werden, wie zum Beispiel extrazelluläre Stimuli, mikrobielle Infektionen und andere Stressfaktoren. Extrazelluläre Vesikel bestehen aus einer Lipiddoppelschicht, in der Membranproteine integriert sind und einer Lösung im Inneren.
Im Inneren der Extrazelluläre Vesikel können sich z. B. Proteine, DNA und/oder RNA befinden, welche man als Cargo bezeichnet. Einige wenige Proteine finden sich in allen Extrazellulären Vesikeln wieder und werden unabhängig vom Zelltyp sezerniert [1 ]. Zu diesen zählen Proteine, welche man im Zellinneren findet, wie zum Beispiel
Actin und Tubulin, aber auch Membranproteine wie die Tetraspanine CD9, CD63 und CD81 sowie der Histokompatibilitäts Komplex der Klasse I (MHC I) [1 , 2]. Andere Proteine, DNA- und/oder RNA- Fragmente finden sich bei ganz bestimmten Zelltypen wieder [3]. Die biologische Rolle von Extrazellulären Vesikeln ist vielschichtig und noch nicht vollständig geklärt. Gegenwärtig weiß man, dass Extrazelluläre Vesikel unter anderem unerwünschte Proteine aus Zellen ausschleusen, aber auch eine Rolle in der Zell-Zell Kommunikation spielen können, wie zum Beispiel bei der Stimulation des Immunsystems [1]. Diese Vesikel spielen auch eine fundamentale Rolle in einigen lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Kardiovaskulären-, Nieren- und bei vielen Krebserkrankungen und können einen direkten Hinweis auf eine spezifische Erkrankung geben [3-6]. Da Extrazelluläre Vesikel von Zellen in das umliegende Medium abgegeben und auch renal ausgeschieden werden, findet man diese in Körperflüssigkeiten wie Blut, cerebrospinal Flüssigkeit, sowie im Urin, in denen sie detektiert werden und Aufschluss über eine Krankheit auch ohne Biopsie geben können [3, 7].
Ein weiteres Anwendungsgebiet ist der Einsatz von Extrazellulären Vesikeln, welche von Krebszellen sezerniert wurden. Diese könnten als Vakzin eingesetzt werden [8]. Damit ermöglicht man eine Immunisierung von Risikopatienten einerseits und andererseits kann man damit biopharmazeutische Wirkstoffe, z. B. Antikörper, herstellen und für Therapiezwecke einsetzen. Auch der direkte Einsatz von Exosomen zu Therapiezwecken wird erwogen [7].
Der Goldstandard in der Detektion und Charakterisierung von Extrazellulären Vesikeln sind Elektronenmikroskopische Techniken, von denen die Kryo-Transmission Elektronen Mikroskopie die empfindlichste Technik darstellt. Diese Methode liefert die höchste Auflösung und die genauesten Aussagen zur Größenverteilung der Extrazellulären Vesikeln, und es ist auch möglich mit Immunfärbung Extrazelluläre Vesikel zu charakterisieren. Nachteilig ist die Probenvorbereitung schwierig, die Messung äußerst langwierig und die Methode insgesamt sehr teuer. Sie benötigt zudem gut ausgebildetes Personal, womit sie sich weder für eine absolute Quantifizierung eig- net noch für eine Routinediagnostik [9].
Die am weitesten verbreitete Methode zur Analyse von Extrazellulären Vesikeln ist das Durchflusszytometer (FCM), das aus meist verdünnten Proben einzelne Vesikel und Zellen anhand einer optischen Eigenschaft beim Vorbeifließen an einen Detektor erkennt und zählt. In seiner Standardausführung sortiert und zählt das Durchflusszy- tometer anhand des Brechungsindex über die Lichtstreuung. Zwar kann die Streuintensität auch Aufschluss über die Größe einzelner Partikel geben, doch liegt das untere Detektionslimit nachteilig bei etwa 400 nm. In einer verbesserten Version markiert man Extrazelluläre Vesikel zusätzlich mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper und wertet zusätzlich zur Lichtstreuung auch das Fluoreszenzsignal aus. Der Vorteil liegt darin, dass Extrazelluläre Vesikel charakterisiert werden können, und das Größenauflösungslimit auf etwa 100 nm sinkt. In den neuesten Durchflusszytometern wird das Fluoreszenzsignal mit einer Kamera aufgezeichnet, und es können ver- schiedene Wellenlängen angeregt werden, womit die Möglichkeit besteht, verschiedene Typen von Extrazellulären Vesikeln zu detektieren. Nachteile der Technik liegen allerdings darin, dass im Durchfluss immer nur eine Eigenschaft einem bestimmten Vesikel zugeordnet werden kann, sodass die Methode auch Überreste aus dem Medium mitdetektiert sofern diese nicht aufwändig entfernt wurden. Außerdem liegt die untere Auflösungsgrenze auch bei bildgestützten Durchflusszytometern bei 100 nm [9].
Bei Resistiven Puls Methoden (RPS) in Kombination mit FCM fließt die Probenlösung durch ein Pore zwischen zwei Elektroden an die eine Spannung angelegt wird. Pas- sierende Partikel erhöhen den elektrischen Widerstand zwischen den Elektroden, wodurch Partikel gezählt werden können. Die erreichbare untere Detektionsgrenze solcher Methoden liegt bei 40 nm und ist vom Lochdurchmesser abhängig. Nachteilig wirkt, dass die Pore verstopfen kann, und dass es schwierig sein kann, die optimalen Einstellungen zu finden, um alle Partikel in Proben mit heterogenen Größenverteilun- gen zu zählen. Außerdem lassen sich mit dem Verfahren Extrazelluläre Vesikel nicht charakterisieren [10].
Auch die dynamische Lichtstreuung (DLS) kommt zum Einsatz. Sie ist zwar einfach zu bedienen und weist ein unteres Detektionslimit von bis zu 5-10 nm aus, doch eignet sich das Verfahren nicht zur Quantifizierung von Extrazellulären Vesikeln. Auch können Artefakte stören [9],
Bei der Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) werden über Lichtstreuung die Partikelbewegungen verfolgt und mit einer Kamera aufgezeichnet. Aus den gewonnenen Daten lassen sich Rückschlüsse über die Größenverteilung und deren Konzentration erhalten. Manche Geräte sind mit einem Fluoreszenz Detektionssystem ausgestattet, welche es erlauben, markierte Extrazelluläre Vesikel auch nachzu verfolgen. Bei heterogenen Größenverteilungen müssen aber Proben in verschiedenen Verdünnungen gemessen werden. Die untere Detektionsgrenze liegt bei 50 nm [9].
Manche der Verfahren im Stand der Technik sind nicht in der Lage den gesamten, bzw. den entscheidenden (30-100 nm) Größenbereich für Exosome abzudecken, wodurch die tatsächliche Anzahl an Extrazellulären Vesikeln unterschätzt wird und wichtige Informationen verloren gehen. Der entscheidende Nachteil der Verfahren nach dem Stand der Technik liegt darin begründet, dass die Proben aufwändig gereinigt werden müssen, um eine Detektion durchführen zu können. Mit den Verfahren kann auch nicht eindeutig unterschieden werden, ob es sich bei den gemessenen Partikeln um Exosome, Mikropartikel bzw. Mikrovesikel oder um sonstige Vesikel oder Partikel aus der Probenmatrix handelt [1 1 ].
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es daher ein Verfahren zum Nachweis für Extrazelluläre Vesikel in beliebigen Proben, z. B. Körperflüssigkeiten wie Blutplasma, Serum, Urin, cerebrospinal Flüssigkeit aber auch Zellkulturüberständen bereit zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Kit zur Durchführung des Nachweises bereit zu stellen.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst mit dem Verfahren des Hauptanspruchs und dem Kit nach dem Nebenanspruch. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis Extrazellulärer Vesikel in einer Probe, umfassend folgende Schritte: a) Aufbringen der Probe auf ein Substrat, b) Hinzufügen von für den Nachweis geeigneten Sonden, die durch spezifische Bindung an die Extrazellulären Vesikel diese markieren und c) Nachweis der Extrazellulären Vesikel durch Messen eines spezifischen Signals der Sonde, wobei Schritt b) vor Schritt a) durchgeführt werden kann.
Damit ist die Aufgabe der Erfindung gelöst. In einer Ausgestaltung der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt a) eine Immobilisierung von Fängermolekülen für die Extrazelluläre Vesikel auf dem Substrat erfolgt.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung und des erfindungsgemäßen Verfah- rens werden durch in Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Fängermolekülen diese auf dem Substrat durch Bindung an die Fängermoleküle immobilisiert.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung und des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nach dem in Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Sonden nicht spezifisch gebundene Moleküle und Partikel durch Waschen entfernt. Es können vorteilhaft Sonden gewählt werden, welche an die Extrazellulären Vesikel binden, wobei die Sonden z. B. auch erst nach der Bindung in der Lage sind, ein spezifisches Signal zu emittieren.
Das in Kontaktbringen der Extrazellulären Vesikel mit den Fängermolekülen und den Sonden kann gleichzeitig erfolgen. Das in Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Sonden kann auch vor dem in Kontakt bringen mit den Fängermolekülen erfolgen.
Das Verfahren ermöglicht vorteilhaft eine Bestimmung der Größenverteilung der Extrazellulären Vesikel, speziell im Größenbereich von 10-100 nm für Exosome und für 100-1000 nm für Mikropartikel, wie unten gezeigt wird. Mit dem Verfahren gelingt der Nachweis der Extrazellulären Vesikel in beliebigen
Proben und in geringer Anzahl Extrazellulärer Vesikel. Es kann mithin auch ein Einzelnachweis erfolgen, ohne die Probe aufwändig reinigen zu müssen.
Außerdem kann das Verfahren vorteilhaft einen qualitativen Nachweis Extrazellulärer Vesikel ermöglichen, und auch eine Quantifizierung und Charakterisierung in beliebi- gen Proben. Dadurch wird einerseits eine direkte und absolute Quantifizierung der Anzahl an Extrazellulären Vesikel und andererseits eine Charakterisierung der Größenverteilung von Extrazellulären Vesikeln vorteilhaft gewährleistet. Die Charakterisierung kann auch anhand der Quantifizierung und Identifizierung von Proteinen, DNA und RNA im inneren des Vesikels erfolgen und/oder anhand von Membranproteinen.
Der Nachweis erfolgt daher mit einfachen Schritten unmittelbar an beliebigen Proben. Mit dem Begriff„beliebiger Probe" sind auch Puffer mit unterschiedlichen Zusätzen oder Kulturmedien gemeint. Außerdem kann die Probe ex vivo aus Körperflüssigkeiten entnommen sein bzw. eine solche sein. Es können Proben aus der Umwelt, wie z. B. Wasser-, Pflanzen- und Bodenproben, sowie Lebensmittel direkt untersucht werden, und die Extrazelluläre Vesikel nachgewiesen werden.
Eine spezifische Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die quantitative und/oder qualitative Bestimmung von Extrazellulären Vesikeln, die mindestens eine Bindungsstelle für ein Fängermolekül und mindestens eine Bindungsstelle für eine Sonde enthalten. Dieses Verfahren umfasst folgende Schritte:
Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung Extrazellulärer Vesikel enthaltend mindestens eine Bindungsstelle für ein Fängermolekül und mindestens eine Bindungsstelle für eine Sonde umfassend folgende Schritte: a) Immobilisieren von Fängermolekülen auf einem Substrat, b) in Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Fängermolekülen, c) Immobilisieren der Extrazellulären Vesikel auf dem Substrat durch Bindung an Fängermoleküle, d) In Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Sonden und e) Entfernen von nicht spezifisch gebundenen Molekülen und Partikeln z. B. durch Waschen, f) Binden der Sonden an die Extrazellulären Vesikel, wobei die Sonden in der Lage sind, ein spezifisches Signal zu emittieren und die Schritte b) und d) gleichzeitig oder d) vor b) erfolgen können.
Auch die Schritte c) und f) können somit vorteilhaft gleichzeitig durchgeführt werden. In der weiteren Variante des Verfahrens, in welchem die Extrazellulären Vesikel mit den Sonden in Kontakt gebracht werden bevor diese mit den Fängermolekülen in Kontakt gebracht werden, erfolgt somit eine Immobilisierung von mit Sonden markierten Extrazellulären Vesikeln auf dem Substrat. Mithin werden die Sonden an die Extrazellulären Vesikel gebunden bevor die Extrazellulären Vesikel mit den Fängermolekülen in Kontakt gebracht werden und an das Substrat immobilisiert werden.
In einer weiteren Variante des Verfahrens, wird die Probe nach dem in Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Sonden chemisch fixiert, z. B. durch Formal- dehyd.
Optional kann die Probe nach oder während oder vor dem Binden der Sonden an die Extrazellulären Vesikel zusätzlich mit DNA und RNA bindenden Sonden versetzt werden.
In einer Ausgestaltung der Erfindung wird nach der chemischen Fixierung ein Deter- genz eingesetzt, um die Membran des Extrazellulären Vesikels durchlässig zu machen und z. B. während des Bindens der Sonden an die Extrazellulären Vesikel Sonden ins Innere der Extrazellulären Vesikel vordringen können.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die„quantitative Bestimmung" zunächst die Bestimmung der Konzentration der Extrazellulären Vesikel, mithin also auch die Bestimmung ihrer An- und oder -Abwesenheit.
Bevorzugt bedeutet die quantitative Bestimmung auch die selektive Quantifizierung bestimmter Typen von Extrazellulären Vesikeln. Eine solche Quantifizierung kann über die entsprechenden spezifischen Sonden nachgewiesen werden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die„qualitative Bestimmung" die Cha- rakterisierung der Extrazellulären Vesikel.
Die Extrazellulären Vesikel werden mit einer oder mehreren für die Detektion dienlichen und/oder spezifischen Sonden markiert. Die Sonden enthalten ein affines Molekül, welches eine Bindungsstelle des Extrazellulären Vesikels erkennt und daran bindet. Außerdem enthalten die Sonden mindestens ein Detektionsmolekül oder ein Molekülteil, welches an das für Extrazelluläre Vesikel affine Molekül oder Molekülteil kovalent gebunden ist und mittels chemischer oder physikalischer Verfahren detek- tierbar und messbar ist.
Die Sonden können in einer Ausgestaltung der Erfindung identische affine Moleküle oder Molekülteile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen (oder Teile) aufweisen. In einer weiteren Alternative können unterschiedliche affine Moleküle oder Molekülteile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein, oder alternativ, unterschiedliche affine Moleküle oder Teile mit identischen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein.
Es können auch Mischungen verschiedener Sonden eingesetzt werden. Der Einsatz mehrerer unterschiedlicher Sonden, die an unterschiedliche Detektions- moleküle oder Molekülteile gekoppelt sind, erhöht zum einen die Spezifität des Signals (Korrelationssignals), zum anderen ermöglicht dies die Identifikation von Extrazellulären Vesikel, die sich in einem oder mehreren Merkmalen unterscheiden. Dies ermöglicht eine selektive Quantifizierung und Charakterisierung der Extrazellulären Vesikel.
In einer Ausführung erfolgt eine ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals, also eine ortsaufgelöste Detektion des Signals, welches von der Sonde emittiert wird. Demgemäß sind in dieser Ausführung der Erfindung Verfahren, die auf einem nicht- ortsaufgelösten Signal beruhen, wie ELISA oder Sandwich-ELISA, ausgeschlossen. Bei der Detektion ist eine hohe Ortsauflösung vorteilhaft. In einer Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei so viele Datenpunkte gesammelt, dass die Detektion eines Extrazellulären Vesikels vor einem Hintergrundsignal, welches z. B. durch gerätespezifisches Rauschen, andere unspezifische Signale oder unspezifisch gebundene Sonden verursacht wird, ermöglicht. Auf diese Weise werden so viele Werte ausgelesen (Read-out- Werte), wie ortsaufgelöste Ereignisse, wie z. B. Pixel, vorhanden sind. Durch die Ortsauflösung wird jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt und stellt so einen Vorteil gegenüber ELISA-Verfahren ohne ortsaufgelöstem Signal dar.
In einer Ausführung beruht die ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals auf total intern reflection fluorescence microscopy (tirfm) und der Untersuchung eines kleinen Volumenelements im Vergleich zum Volumen der Probe, im Bereich von wenigen Femtolitern bis unterhalb eines Femtoliters, oder eines Volumenbereichs oberhalb der Kontaktoberfläche der Fängermoleküle mit einer Höhe von 500 nm, bevorzugt 300 nm, besonders bevorzugt 250 nm, insbesondere 200 nm.
Im Sinne der Erfindung werden Extrazelluläre Vesikel nachgewiesen, welche ausge- wählt sind aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Exosomen und/oder Mik- ropartikel.
In einer Ausführung wird das Material des Substrats ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Kunststoff, Silizium und Siliziumdioxid. In einer bevorzugten Alternative wird als Substrat Glas eingesetzt. In einer weiteren Ausführung der Erfindung sind die Fängermoleküle kovalent an das Substrat gebunden.
Hierzu wird in einer Alternative ein Substrat eingesetzt, das eine hydrophile Oberfläche aufweist. In einer Alternative wird dies durch das Auftragen einer hydrophilen Schicht, noch vor Schritt a), auf das Substrat erreicht. Mithin binden die Fängermole- küle, insbesondere kovalent an das Substrat bzw. an die hydrophile Schicht, mit welchen das Substrat beladen ist.
Die hydrophile Schicht ist eine Biomoleküle abweisende Schicht, so dass die unspezifische Bindung von Biomolekülen an das Substrat vorteilhaft minimiert wird. Auf diese Schicht werden die Fängermoleküle, bevorzugt kovalent immobilisiert. Diese sind affin gegenüber einem Merkmal der Extrazellulären Vesikel. Die Fängermoleküle können alle identisch sein, oder es können Mischungen unterschiedlicher Fängermoleküle vorliegen.
In einer Alternative werden als Fängermoleküle und Sonden dieselben Moleküle eingesetzt. Bevorzugt umfassen die Fängermoleküle kein Detektionsmolekül bzw. Molekülteile, die zur Detektion geeignet sind.
In einer Ausführung wird die hydrophile Schicht ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Polyethylenglykol, Poly-Lysin, bevorzugt Poly-D-Lysin, und Dextran oder Derivate davon, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD). Derivate im Sinne der Erfindung sind Verbindungen, die sich in einigen Substituenten von den Stammverbindungen unterscheiden, wobei die Substituenten gegenüber dem erfindungsgemäßen Verfahren inert sind. In einer Ausführung der Erfindung wird die Oberfläche des Substrats vor Auftrag der hydrophilen Schicht zunächst hydroxyliert und anschließend mit Aminogruppen aktiviert. Diese Aktivierung mit Aminogruppen erfolgt in einer Alternative durch in Kontaktbringen des Substrats mit APTES (3-Aminopropyltrietoxysilan) oder mit Etha- nolamin.
Zur Vorbereitung des Substrats auf die Beschichtung werden ein oder mehrere der folgenden Schritte durchgeführt:
• Waschen eines Substrats aus Glas bzw. eines Glasträgers im Ultraschallbad oder Plasma-cleaner, alternativ dazu in 5 M NaOH mindestens 3 Stunden inkubieren,
• Spülen mit Wasser und anschließendem Trocknen unter Stickstoff,
• Eintauchen in eine Lösung aus konzentrierter Schwefelsäure und
Wasserstoffperoxid im Verhältnis 3:1 für die Aktivierung der Hydroxylgruppen,
• Spülen mit Wasser bis zu einem neutralen pH, anschließend mit Ethanol und Trocknen unter Stickstoffatmosphäre,
• Eintauchen in eine Lösung mit 3-Aminopropyltrietoxysilan (APTES) (1 - 7 %), bevorzugt in trockenem Toluol, oder einer Lösung von Ethanolamin,
• Spülen mit Aceton oder DMSO und Wasser und Trocknen unter
Stickstoffatmosphäre. In einer Alternative erfolgt das in Kontaktbringen des Substrats mit APTES in der Gasphase; das gegebenenfalls vorbehandelte Substrat wird mithin mit APTES bedampft.
Für die Beschichtung mit Dextran, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD), wird das Substrat mit einer wässrigen Lösung von CMD in einer Konzentration von 10 mg/ml oder 20 mg/ml und gegebenenfalls N-Ethyl-N-(3-Dimethylaminpropyl) Car- bodiimid (EDC), (200 mM) und N-Hydroxysuccinimid (NHS), (50 mM) inkubiert und anschließend gewaschen.
Das Carboxymethyl-Dextran ist in einer Variante kovalent an die Glasoberfläche gebunden, die zunächst hydroxyliert und anschließend mit Aminogruppen funktiona- lisiert wurde. Als Substrat können auch Mikrotiterplatten, bevorzugt mit Glasboden, eingesetzt werden. Da bei der Verwendung von Polystryrolrahmen der Einsatz von konzentrierter Schwefelsäure nicht möglich ist, erfolgt die Aktivierung der Glasoberfläche in einer Ausführungsvariante der Erfindung analog. Auf diese hydrophile Schicht werden, bevorzugt kovalent, Fängermoleküle immobilisiert, welche affin gegenüber einem Merkmal des zu detektierenden Extrazellulären Vesikel sind. Dieses Merkmal kann ein Protein sein. Die Fängermoleküle können alle identisch sein oder Mischungen verschiedener Fängermoleküle sein.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden die Fängermoleküle, bevor- zugt Antikörper, gegebenenfalls nach einer Aktivierung des mit CMD beschichteten Trägers durch eine Mischung aus EDC/NHS (200 bzw. 50 mM), auf dem Substrat immobilisiert.
Verbleibende Carboxylat-Endgruppen, an die keine Fängermoleküle gebunden wurden, können deaktiviert werden. Zur Deaktivierung dieser Carboxylat-Endgruppen auf dem CMD-Spacer wird Ethanolamin verwendet. Vor dem Auftrag der Proben werden die Substrate bzw. Träger gegebenenfalls mit Puffer gespült.
Die zu vermessende Probe wird mit dem so präparierten Substrat in Kontakt gebracht und gegebenenfalls inkubiert. Als zu untersuchende Probe können körpereigene Flüssigkeiten oder Gewebe eingesetzt werden. In einer Ausführung der vorlie- genden Erfindung wird die Probe ausgewählt aus Liquor (CSF), Blut, Plasma und
Urin. Die Proben können unterschiedliche, dem Fachmann bekannte, Aufbereitungsschritte durchlaufen.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung erfolgt das Auftragen der Probe unmittelbar auf dem Substrat, z. B. dem nicht beschichteten Substrat, gegebenenfalls durch kovalente Bindung. Gegebenenfalls erfolgt die Bindung an eine aktivierte Oberfläche des Substrats.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt eine Vorbehandlung der Probe nach einem oder mehreren der folgenden Verfahrensschritte:
• Verdünnen mit Wasser oder Puffer,
· Behandlung mit Enzymen, zum Beispiel Proteasen, Nuklease, Lipasen,
• Zentrifugieren, • Präzipitation,
• Kompetition mit Sonden, um eventuell vorhandene Antikörper zu verdrängen.
Bevorzugt wird die Probe unmittelbar und/oder ohne Vorbehandlung mit dem Substrat in Kontakt gebracht. Unspezifisch gebundene Substanzen können durch Waschschritte entfernt werden.
In einem weiteren Schritt werden die immobilisierten Extrazellulären Vesikel mit einer oder mehreren für die weitere Detektion dienlichen Sonden markiert. Wie oben beschrieben können die einzelnen Schritte auch in einer anderen Reihenfolge erfindungsgemäß durchgeführt werden. Durch geeignete Waschschritte werden überschüssige Sonden, die nicht an Extrazelluläre Vesikel gebunden sind, entfernt.
In einer Alternative des Verfahrens werden diese überschüssigen Sonden nicht entfernt. Dadurch entfällt ein Waschschritt und es findet auch keine Gleichgewichtsverschiebung in Richtung der Dissoziation der Extrazelluläre Vesikel-Sonden-Komplexe oder -Verbindungen statt. Durch die ortsaufgelöste Detektion werden die überschüssigen Sonden bei der Auswertung nicht erfasst.
In einer Ausführung sind die Bindungsstellen der Extrazellulären Vesikel Epitope und die Fängermoleküle und Sonden sind Antikörper und/oder Antikörperteile und/oder Fragmente hiervon. In einer Variante der vorliegenden Erfindung können die Fän- germoleküle und die Sonden identisch sein.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich die Fängermoleküle und die Sonden. So können z. B. unterschiedliche Antikörper und/oder Antikörperteile und/oder Fragmente als Fängermoleküle und als Sonden eingesetzt werden. In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung werden Fängermoleküle und Sonden eingesetzt, die mit Ausnahme der eventuellen (Farbstoff-) Markierung identisch zueinander sind.
In einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Sonden gleichzeitig eingesetzt.
In einer weiteren Alternative der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei oder mehrere unterschiedliche Fängermoleküle und/oder Sonden eingesetzt, die z. B. unterschiedliche Antikörper enthalten und gegebenenfalls auch unterschiedliche Farbstoffmarkierung tragen.
Zur Detektion sind die Sonden so gekennzeichnet, dass sie ein optisch detektierba- res Signal aussenden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz-, Biolumineszenz- und Chemolumineszenz-Emission sowie Absorption.
In einer Alternative sind die Sonden somit mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Als Fluoreszenzfarbstoff können die dem Fachmann bekannten Farbstoffe eingesetzt werden. Alternativ können GFP (Green Fluorescence Protein), Konjugate und/oder Fusionsproteine davon, sowie Quantendots verwendet werden. Zur Qualitätskontrolle der Oberfläche, zum Beispiel beim Nachweis der Gleichmäßigkeit der Beschichtung mit Fängermolekülen, können Fängermoleküle gekennzeichnet mit Fluoreszensfarbstoffen eingesetzt werden.
Hierzu wird bevorzugt ein Farbstoff verwendet, der nicht mit dem Nachweis des Fluoreszenzfarbstoffs der Sonde am Extrazellulären Vesikel interferiert. Dadurch wird eine nachträgliche Kontrolle des Aufbaus möglich sowie eine Normierung der Messergebnisse.
Die Detektion der immobilisierten und markierten Extrazellulären Vesikel erfolgt mittels Abbildung der Oberfläche, z. B. mit Laser Scanning Mikroskopie. Eine möglichst hohe Ortsauflösung ermittelt eine hohen Anzahl an Bildpunkten, wodurch die Sensiti- vität sowie die Selektivität des Verfahrens erhöht werden können, da strukturelle
Merkmale mit abgebildet und analysiert werden können. Somit erhöht sich das spezifische Signal vor dem Hintergrundsignal (z. B. unspezifisch gebundener Sonden).
Die Detektion erfolgt beispielweise bevorzugt mit ortsauflösender Fluoreszenzmikroskopie durch ein TIRF-Mikroskop, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten davon, wie zum Beispiel STORM, dSTORM.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Laserfokus, wie er z. B. in der Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet wird, oder ein FCS (Fluorescence Corre- lation Spectroscopy System) dazu eingesetzt, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten wie zum Beispiel STED, PALM oder SIM. Im Unterschied zu ELISA entstehen durch diese Verfahren so viele Readout-Werte, wie ortsaufgelöste Ereignisse (z. B. Pixel) vorhanden sind. Abhängig von der Anzahl an unterschiedlichen Sonden wird diese Information vorteilhaft vervielfacht. Diese Vervielfachung gilt für jedes Detektionsereignis und führt zu einem Informationsge- winn, da sie weitere Eigenschaften, z. B. ein zweites Merkmal, über Extrazelluläre Vesikel offenbart. Durch so einen Aufbau kann für jedes Ereignis die Spezifität des Signales erhöht werden.
Die Sonden können derart ausgewählt werden, dass die Anwesenheit von einzelnen Extrazellulären Vesikel-Merkmalen, wie z. B. einzelne Membranproteine, das Mess- ergebnis nicht beeinflussen.
Die Sonden können derart ausgewählt werden, dass Extrazelluläre Vesikel Spezies (Phenotypen) für jedes einzelne Extrazelluläre Vesikel bestimmt werden können.
Zusätzliche Sonden können derart ausgewählt werden, dass sie die Unterscheidung zwischen DNA/ RNA-enthaltenden Extrazellulären Vesikeln und damit Aufschluss über das Innere der Extrazellulären Vesikeln geben können. Beispielweise können hierzu DNA/RNA-bindende Fluorophore wie DAPI von Hoechst verwendet werden.
Zur Auswertung werden die ortsaufgelösten Informationen, z. B. die Fluoreszenz- Intensität, aller eingesetzten und detektierten Sonden herangezogen, um z. B. die Anzahl der Extrazellulären Vesikel, deren Größe und deren Merkmale zu bestimmen. Dabei können z. B. auch Algorithmen der Hintergrundminimierung und/oder auch Intensitäts-Schwellenwerte für die weitere Auswertung sowie der Mustererkennung angewandt werden.
Weitere Bildanalyse-Optionen beinhalten z. B. die Suche nach lokalen Intensitätsma- xima, um aus der Bildinformation die Zahl an detektierten Extrazellulären Vesikeln zu erhalten und auch die Partikelgrößen bestimmen zu können.
Um die Testergebnisse miteinander über Entfernungen, Zeiten und Experimentatoren hinweg vergleichbar zu machen, können interne und/oder externe Standards eingesetzt werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Nanopartikel Standards, welche eine definierten Größe besitzen und bevorzugt kovalent die Oberflächenmerkmale der zu Untersuchenden Extrazellulären Vesikel tragen.
Bei den Standards handelt es sich bevorzugt um Silika Nanopartikel, aber auch Na- nopartikel aus Kunststoff sind möglich.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit enthaltend eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
- Substrat, optional mit hydrophiler Oberfläche,
- Fängermolekül, - Sonde,
- Substrat mit Fängermolekül,
- Lösungen,
- Standard,
- Puffer. Die Verbindungen und/oder Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein.
Alternativ können einige Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an einem festen Träger, wie z. B. einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, absorbiert sein. Dann umfasst das Substrat eine solche Mikrotiterplatte.
Ferner kann das Kit Anweisungen für den Gebrauch des Kits für eine beliebige der Ausführungsformen enthalten.
In einer weiteren Variante des Kits sind auf dem Substrat die oben beschriebenen Fängermoleküle bereits immobilisiert. Zusätzlich kann das Kit Lösungen und/oder Puffer enthalten. Zum Schutz der Beschichtung und/oder der darauf immobilisierten Fängermoleküle können diese mit einer Lösung oder einem Puffer überschichtet vorliegen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Extrazellulären Vesikeln in beliebigen Proben zur Quantifizierung und damit Titerbestimmung von Extrazellulären Vesikeln.
Vorteilhaft kann das Verfahren damit auch den Nachweis einer Erkrankung, wie z. B. Kardiovaskulären-, Nieren- und Krebserkrankungen, den Nachweis einer Immunantwort erbringen. Das Verfahren kann in der Wirkstoffentwicklung, der direkten und absoluten Quantifizierung der Extrazellulären Vesikel, bei der Therapie begleitenden Diagnostik (target engagement), der Differentialdiagnostik, dem Nachweis von Protein-Protein-Interaktion und/oder bei der Typisierung von Extrazellulären Vesikeln eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Überwachung von Therapien mit Extrazellulären Vesikeln sowie zur Überwachung und/oder die Überprüfung der Wirksamkeit von Wirkstoffen und/oder Heilverfahren. Das Verfahren kann daher bei klinischen Tests, Studien als auch beim Therapie-Monitoring eingesetzt werden. Hierzu werden Proben gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vermessen und die Ergebnisse verglichen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Wirksamkeit von Wirkstoffen gegen erkrankte Zellen. Dabei werden die Ergebnisse anhand der Charakterisierung von Extrazellulären Vesikeln in Proben miteinander verglichen. Bei den Proben handelt es sich entsprechend um Körperflüssigkeiten, entnommen vor beziehungsweise nach, oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Gabe der Wirkstoffe beziehungsweise Durchführung des Heilverfahrens. Erfindungsgemäß werden die Ergebnisse mit einer Kontrolle verglichen, die nicht dem Wirkstoff und/oder Heilverfahren unterworfen wurde. Anhand der Ergebnisse werden Wirkstoffe und/oder Heilverfahren ausgewählt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung ob eine Person in einer klinischen Stu- die aufgenommen wird. Hierzu werden Proben gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren vermessen und in Bezug auf einen Grenzwert die Entscheidung getroffen. Nachfolgend wird die Erfindung anhand einer Figur und der dazugehörigen Messung als vorteilhaftes Ausführungsbeispiel näher erläutert.
Die Figur 1 zeigt die Ergebnisse einer quantitativen Auswertung von Mikroskopie- Bildern nach einer Mittelung von zwei Proben (Duplikatmessung; 50 Bilder) und An- wendung eines Intensitätsfilters (von 4000 von 16384 Intensitätswerten). A) zeigt die Emissionen bei 705 nm (EM) und Anregung bei 633 nm (EX). Dieser Kanal stellt APC Farbstoffe dar. B) zeigt die ermittelten Bildpunkte (Pixel) bei Ex/Em = 561/600 nm. Dieser Kanal regt PE und mCherry Farbstoffe an und C) für Ex/Em = 488/600. Dieser Kanal regt PE Farbstoffe an. Probe 1 sind Zellkulturüberstände von HEK Zellen die nicht NEF-mCherry exprimieren und mit anti-MHC1 Antikörpern mit PE Farbstoff behandelt wurden. Probe 2 entspricht Probe 1 mit dem Unterschied, dass MHC1 Antikörper einen APC Farbstoff tragen. In Probe 3 befinden sich Zellkulturüberstände von HEK Zellen, die ein NEF-mCherry Fusionsprotein exprimieren und mit anti MHC1-Antikörper-PE markiert wurden. Probe 4 entspricht Probe 3 mit dem Unterschied, dass der anti-MHC1 Antikörper mit APC statt PE markiert wurde. In
Probe 5 wurden Zellkulturüberstände von NEF-mCherry exprimierenden Zellen nicht mit Antikörpern markiert. In A) erkennt man, dass sich Probe 1 und 3 deutlich von den anderen Proben unterscheiden. Diese Proben wurden mit anti-MHC1 Antikörpern behandelt, die einen APC Farbstoff tragen. In diesen Proben konnten somit extrazelluläre Vesikel, die ein MHC1 Protein tragen, nachgewiesen werden. In B) erkennt man, dass Probe 1 eine niedrigere Anzahl an Pixel aufweist als die restlichen Proben. In diesem Fluoreszenz Kanal wurden PE Farbstoffe und mCherry angeregt und kein APC daher. In dieser Abbildung erkennt man, dass es möglich ist, PE (Probe 2) und mCherry (Probe 5), welches in den Zellen exprimiert und in extrazellulären Vesikeln verpackt wird, zu quantifizieren. Auch die Kombination (Probe 3 und 4) liefert Signale, die sich für eine Quantifizierung eignen.
C) Zeigt das konträre Bild zu A) und erlaubt es, anti-MHC1 -Antikörper mit PE Farbstoff alleine zu quantifizieren. Somit ist es auch mit diesen Antikörpern möglich extra- zelluläre Vesikel zu messen. Unter NEF versteht man den Negative Regulatory Factor, ein Protein, das in Exoso- men zu finden ist. Unter mCherry versteht man ein fluoreszentes Protein mit einem Absorptionsmaximum at 558 nm und einem Emissionsmaximum bei 583 nm. Aufbau des Assays:
Für das Experiment wurden kommerzielle Mikrotiter Platten (Greiner Bio-one; Sensopiate Plus) mit 384 Reaktionskammern (RK) und Glasboden verwendet. Zunächst wurde die Oberfläche der Mikrotiterplatte aufgebaut. Hierfür wurde die Platte in einen Exsikkator platziert, in dem sich eine Schale mit 5%igem APTES in Toluol befand. Der Exsikkator wurde mit Argon geflutet und eine Stunde inkubiert. Danach wurde die Schale entfernt und die Platte für 2 Stunden im Vakuum getrocknet. In die RK der trockenen Platte wurden 20 μΙ einer 2 mM Lösung an SC-PEG-CM (MW 3400; Lay- san Bio) in de-ionisiertem H2O eingefüllt und für 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die RK dreimal mit Wasser gewaschen und im Anschluss mit je 20 μΙ einer wässrigen 200 mM EDC-Lösung (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) car- bodiimide; Sigma) und mit 50 mM NHS (N-Hydroxysuccinimide, Sigma) für 30 Minuten inkubiert. Die Platte wurde wieder dreimal mit deionisiertem Waser gewaschen. Danach wurden die RK mit anti-CD63 Antikörpern und anti-MHCI Antikörpern als Fängermolekül beschichtet (20 μΙ; je Antikörper 5 g ml"1 in PBS; 1 Stunde). An- schließend wurde die RK mit dem Waschprogramm bestehend aus jeweils dreimal Waschen und Leersaugen mit TBS mit 0,1 % Tween-20 und TBS behandelt. Im nächsten Schritt wurden die RK mit 50 μΙ Smartblock (Candor Bioscience GmbH) über Nacht bei Raumtemperatur (RT) beschichtet und nach Ablauf der Zeit wieder dreimal mit salinem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TBS; pH = 7,4) gewaschen. Danach wurde in dreifacher Ausführung je 20 μΙ Probe in RK aufgetragen und bei RT für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurden die RK dreimal mit TBS gewaschen und mit 20 μΙ Detektionsantikörpern versetzt. Als Detektionsantikörper wurden anti-MHC1-antikörper eingesetzt welche zuvor mit den Fluoreszenzfarbstoffen PE (Phycoeritrin) oder mit APC (Allophycocyanin) markiert wurden. Die Detektionsanti- körper wurden zusammen in TBS zu einer finalen Konzentration 1 ,25 ng ml"1 für jeden Antikörper verdünnt. Pro RK wurden 20 μΙ Antikörperlösung aufgetragen und für 1 h bei RT inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurde die Platte dreimal mit TBS gewaschen und mit einer Folie versiegelt. Die Messung erfolgte im TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) Mikroskop (Leica) mit einem 100-fach Öl-Immersionsobjektiv. Hierfür wurde der Glasboden der Mikrotiterplatte reichlich mit Immersions-Öl bestrichen und die Platte in die automatisierte Bühne des Mikroskops eingebracht. Danach wurde pro RK an 5 x 5 Positionen in zwei Fluoreszenzkänalen (Ex/Em=633/715 nm, 561/600 nm und 488/600 nm) je ein Bild konsekutiv aufgenommen. Es wurde die maximale Laserleistung (100%), eine Belichtungszeit von 500 ms und ein Verstärkungswert von 800 gewählt. Die Bilddaten wurden danach ausgewertet. Intensitätsschwellenwerte wurden für jeden Kanal bei ca. 25% Graustufen an der Gesamtintensität festgesetzt. Im Auswertungsschritt wurde zunächst für jedes Bild in jedem Kanal der Intensitätsschwellenwert angewandt und anschließend Bilder gleicher Position in beiden Werten miteinander verglichen. Es wurden nur jene Pixel pro Bild gezählt, bei denen in beiden Kanälen der Pixel an der exakt gleichen Position über dem Intensitätsschwellenwert des Kanals liegt. Abschließend wird die Anzahl der Pixel über alle Bilder in jedem RK gemit- telt, danach die Mittelwerte der mittleren Pixelzahlen der Replikatwerte ermittelt und die Standardabweichung angegeben.
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Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zum Nachweis von Extrazellulären Vesikeln in einer Probe,
umfassend folgende Schritte: a) Aufbringen der Probe auf ein Substrat, b) Hinzufügen von für den Nachweis geeigneten Sonden, die durch spezifische Bindung an die Extrazellulären Vesikel diese markieren und c) Nachweis der Extrazellulären Vesikel durch Messen eines spezifischen
Signals der Sonde, wobei Schritt b) vor Schritt a) durchgeführt werden kann.
2. Verfahren nach dem vorherigen Anspruch,
dad u rch geken nzeichnet, dass
vor Schritt a) eine Immobilisierung von Fängermolekülen für die Extrazellulären Vesikel auf dem Substrat erfolgt.
3. Verfahren nach dem vorherigen Anspruch,
dad u rch gekennzeichnet, dass
durch in Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Fängermolekülen diese auf dem Substrat durch Bindung an die Fängermoleküle immobilisiert werden.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch geken nzeich net, dass
nach dem in Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Sonden nicht spezifisch gebundene Moleküle und Partikel durch Waschen entfernt werden.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch geken nzeich net, dass
Sonden gewählt werden, welche an die Extrazellulären Vesikel binden, wobei die Sonden in der Lage sind, ein spezifisches Signal zu emittieren.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch gekennzeichnet, dass das in Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Fängermolekülen und den Sonden gleichzeitig erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch geken nzeichnet, dass
das in Kontakt bringen der Extrazellulären Vesikel mit den Sonden vor dem in Kontakt bringen mit den Fängermolekülen erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch geken nzeichnet, dass
die Probe vor dem Binden der Sonden an die Extrazellulären Vesikel fixiert wird.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch geken nzeichnet, dass
die Probe mit Detergenzien behandelt wird.
10. Verfahren nacheinem der vorherigen Ansprüche,
dad urch gekennzeich net, dass
eine ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals erfolgt.
1 1. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche
dad u rch geken nzeich net, dass
das Substrat Kunststoff, Silizium oder Siliziumdioxid, bevorzugt Glas umfasst.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch geken nzeichnet, dass
das Substrat vor dem Immobilisieren von Fängermolekülen auf dem Substrat eine hydrophile Oberfläche aufweist.
13. Verfahren nach vorherigem Anspruch,
dad u rch gekennzeich net, dass
die hydrophile Schicht ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus PEG, Poly-Lysin und Dextran oder Derivate hiervon.
14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad urch gekennzeich net, dass die Funktionalisierung mit Aminogruppen durch in Kontaktbringen des Substrats mit APTES (3-Aminopropyltrietoxysilan) oder Ethanolamin erfolgt.
15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch gekennzeich net, dass
das in Kontakt bringen des Substrats mit APTES (3-Aminopropyltrietoxysilan) in der Gasphase erfolgt.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche
dad urch geken nzeichnet, dass
die Fängermoleküle kovalent an das Substrat oder an die Beschichtung gebunden sind. 7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche
dad u rch gekennzeich net, dass
die Bindungsstellen der Extrazellulären Vesikel Epitope sind und die Fängermoleküle und Sonden Antikörper oder Teile derselben sind.
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch geken nzeich net, dass
die Sonden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche
dad urch geken nzeich net, dass
die Detektion mittels ortsauflösender Fluoreszenzmikroskopie erfolgt.
20. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorherigen Ansprüche, enthaltend :
- Substrat, optional mit einer hydrophilen Oberfläche und/oder einem immobilisierten Fängermolekül;
- Sonde;
- Optional Lösungen und Puffer.
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