EP3638762A1 - Pseudomonas stutzeri lipase und ihre verwendung - Google Patents

Pseudomonas stutzeri lipase und ihre verwendung

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Publication number
EP3638762A1
EP3638762A1 EP18730707.9A EP18730707A EP3638762A1 EP 3638762 A1 EP3638762 A1 EP 3638762A1 EP 18730707 A EP18730707 A EP 18730707A EP 3638762 A1 EP3638762 A1 EP 3638762A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lipase
agent
amino acid
enzymes
cleaning
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP18730707.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Daniela HERBST
Nina Mussmann
Susanne Wieland
Claudia LINDNER
Skander ELLEUCHE
Philip BUSCH
Ute LORENZ
Garabed Antranikian
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP3638762A1 publication Critical patent/EP3638762A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/0005—Other compounding ingredients characterised by their effect
    • C11D3/0026—Low foaming or foam regulating compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/0005—Other compounding ingredients characterised by their effect
    • C11D3/0047—Other compounding ingredients characterised by their effect pH regulated compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/39—Organic or inorganic per-compounds
    • C11D3/3902—Organic or inorganic per-compounds combined with specific additives
    • C11D3/3905—Bleach activators or bleach catalysts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/40—Dyes ; Pigments
    • C11D3/42—Brightening agents ; Blueing agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Definitions

  • the present invention is in the field of enzyme technology, in particular the lipolytic action of enzymes on fats and oils, as used, for example, in detergents or cleaners.
  • the invention relates to an agent, in particular washing or cleaning agent, which contains a lipase as defined herein.
  • the present invention relates to a method for cleaning textiles and the use of the
  • Lipases are among the most technically important enzymes of all. Their use in detergents and cleaning agents is industrially established and they are contained in virtually all modern, powerful detergents and cleaners. Lipases are enzymes that promote the hydrolysis of
  • Lipases are typically enzymes that have a variety of
  • Substrates can be cleaved, for example, aliphatic, alicyclic, bicyclic and aromatic esters, thioesters and activated amines. Lipases are used to remove fatty acids, for example, aliphatic, alicyclic, bicyclic and aromatic esters, thioesters and activated amines. Lipases are used to remove fatty acids, for example, aliphatic, alicyclic, bicyclic and aromatic esters, thioesters and activated amines. Lipases are used to remove fatty acids, for example, aliphatic, alicyclic, bicyclic and aromatic esters, thioesters and activated amines. Lipases are used to remove fatty acids, for example, aliphatic, alicyclic, bicyclic and aromatic esters, thioesters and activated amines. Lipases are used to remove fatty acids, for example, aliphatic, alicyclic, bicyclic and aromatic esters, thi
  • Lipases with broad substrate spectra are used in particular where inhomogeneous raw materials or substrate mixtures have to be reacted, that is to say, for example, in detergents
  • Lipases are usually of microbial origin and are usually derived from bacteria or fungi, such as the genera Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus, Humicola, Trichoderma or Trichosporon. Lipases are usually prepared by biotechnological methods known per se by suitable bacteria or fungi, such as the genera Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus, Humicola, Trichoderma or Trichosporon. Lipases are usually prepared by biotechnological methods known per se by suitable
  • Japanese Patent Application JP 1225490 discloses a Rhizopus oryzae lipase.
  • only selected lipases are suitable for use in liquid surfactant-containing preparations.
  • Many lipases do not show sufficient catalytic performance or stability in such formulations.
  • washing processes which are generally carried out at temperatures higher than 20 ° C, many lipases show thermal instability, which in turn leads to insufficient catalytic activity during the process
  • lipase and surfactant-containing liquid formulations of the prior art have the disadvantage that they often do not have satisfactory lipolytic activity in the temperature ranges required by a washing process and therefore are not optimal
  • a Pseudomonas based lipase as described herein is active under washing process conditions and has good lipolytic properties.
  • the sequence of the lipase identified herein has no significant sequence homologies to lipases heretofore used in detergents. Therefore, it opens up many possibilities to increase the genetic diversity of commercially used lipases and, if necessary, to change the performance spectrum by mutagenesis.
  • the present invention is directed to an agent, in particular a detergent or cleaning agent, characterized in that it contains a lipase having at least 65% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over its entire length.
  • the present invention is directed to processes for the purification of textiles, characterized in that in at least one process step
  • inventive agent is applied.
  • the present invention is further directed to the use of an agent as described herein, preferably a detergent or cleaning agent, more preferably a liquid detergent, for the removal of (greasy) soils.
  • an agent as described herein preferably a detergent or cleaning agent, more preferably a liquid detergent, for the removal of (greasy) soils.
  • the lipases according to the invention have enzymatic activity, that is, they are capable of hydrolysing fats and oils, in particular in a washing or cleaning agent.
  • a lipase of the invention is therefore an enzyme which catalyzes the hydrolysis of ester bonds in lipid substrates and thereby is able to cleave fats or oils.
  • a lipase according to the invention is preferably a mature lipase, ie the catalytically active molecule without signal and / or propeptide (s). Unless otherwise stated, the sequences given refer to each mature (processed) enzymes.
  • the lipase is a lipase having at least 70% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over its entire length.
  • the lipase contained in the agent according to the invention comprises or essentially consists of or consists of the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1.
  • the invention also encompasses lipases which are derived from the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, for example by means of mutagenesis.
  • the invention also encompasses lipases produced by the expression of a
  • Nucleotide sequence encoding a protein according to SEQ ID NO: 1 are available.
  • the invention also encompasses nucleotide sequences which correspond to the nucleotide sequence which codes for the protein according to SEQ ID NO: 1 over the total length thereof to at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%.
  • the lipase comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over at least 66% of its total length, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%.
  • the means is characterized in that
  • the lipase is obtainable from a lipase as defined above as the parent molecule by single or multiple conservative amino acid substitution; and or
  • the lipase is obtainable from a lipase as defined above as the starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and a
  • the agents according to the invention preferably contain the lipase in an amount of 0.00001-1% by weight, more preferably in an amount of 0.0001-0.5% by weight, particularly preferably in an amount of 0.001-0.1 Wt .-%, each based on the active protein.
  • the identity of nucleic acid or amino acid sequences is determined by a sequence comparison. This sequence comparison is based on the BLAST algorithm established and commonly used in the prior art (see, for example, Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search Biol. 215: 403-410; and Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A.
  • T-Coffee see, for example, Notredame et al (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments, J. Mol. Biol. 302, 205-217 or programs based on these programs or algorithms.
  • alignment comparisons with the computer program Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) with the default parameters whose AlignX module for sequence comparisons is based on ClustalW.
  • Identity and / or homology information can be made about whole polypeptides or genes or only over individual regions. Homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are therefore defined by matches in the sequences. Such areas often have identical functions. They can be small and comprise only a few nucleotides or amino acids. Often, such small regions exert essential functions for the overall activity of the protein. It may therefore be useful to relate sequence matches only to individual, possibly small areas. Unless otherwise indicated, identity or homology information in the present application, however, refers to the total length of the particular nucleic acid or amino acid sequence indicated.
  • the lipase comprises an amino acid sequence that corresponds to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over its total length to at least 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74 %, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91, 5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96, 5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4% or 99.6% homologous.
  • the lipase is characterized in that its lipolytic performance is not significantly reduced compared to that of a lipase comprising an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequences given in SEQ ID NO: 1, i. has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% of the reference benefit.
  • the lipolytic performance can be determined in a washing system containing a detergent in a dosage between 4.5 and 7.0 grams per liter of wash liquor and the lipase, wherein the lipases to be compared are used in the same concentration (based on active protein) and the lipolytic Performance is determined as described herein. For example, the
  • the concentration of the lipase in the detergent intended for this washing system is from 0.00001 to 1% by weight, preferably from 0.0001 to 0.5% by weight, particularly preferably from 0.001 to 0.1% by weight, based on active, purified protein.
  • a preferred liquid detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in weight percent): anionic surfactant 5-7%, builder (eg citric acid and phosphonates) 0-1%, caustic soda 0-1%, palm kernel oil fatty acid 0-1% , Glycerol 0-1%, sodium chloride 1-3%, boric acid 0-1%, other additives (preservative, defoamer, optical brightener, dye, perfume) 0-1% and the rest demineralized water.
  • the dosage of the liquid detergent is between 4.5 and 6.0 grams per liter of wash liquor, for example, 4.7, 4.9 or 5.9 grams per liter of wash liquor.
  • the determination of the lipolytic performance is carried out at 40 ° C using a liquid detergent as indicated above, wherein the washing process is preferably carried out for 60 minutes.
  • the degree of whiteness ie the brightening of soiling, as a measure of the cleaning performance is determined by optical measuring methods, preferably photometrically.
  • a suitable device for this purpose is for example the spectrometer Minolta CM508d. Usually, those for the measurement previously calibrated with a white standard, preferably a supplied white standard.
  • the activity-like use of the respective lipase ensures that even if the ratio of active substance to total protein (the values of the specific activity) diverge, the respective enzymatic properties, for example the cleaning performance of certain soils, are compared. In general, a low specific activity can be compensated by adding a larger amount of protein.
  • the lipase activity can also be determined in a customary manner, preferably as described in Bruno Stellmach, "Methods of Determining Enzymes for
  • lipase-containing samples are added to an olive oil emulsion in emulsifier-containing water and incubated at 30 ° C and pH 9.0
  • fatty acids are liberated, which are titrated with 0.01 N sodium hydroxide solution over a period of 20 minutes using an autotitrator, so that the pH value remains constant (“pH-stat titration").
  • pH-stat titration Based on the sodium hydroxide consumption, the determination of the lipase activity takes place by reference to a reference lipase sample.
  • An alternative test for determining the lipolytic activity of the lipases according to the invention is an optical measurement method, preferably a photometric method.
  • the appropriate test involves the lipase-dependent cleavage of the substrate para-nitrophenol butyrate (pNP-butyrate). This is cleaved by the lipase into para-nitrophenolate and butyrate.
  • the presence of para-nitrophenolate can be measured using a photometer, e.g. of the Tecan Sunrise device and the XFLUOR software, at 405 nm, thus allowing a conclusion on the enzymatic activity of the lipase.
  • Proteins can be grouped into groups of immunologically related proteins by reaction with an antiserum or antibody.
  • the members of such a group are characterized by having the same antigenic determinant recognized by an antibody. They are therefore structurally so similar to each other that they are recognized by an antiserum or specific antibodies. Another one
  • the subject of the invention is therefore formed by lipases, which are characterized in that they have at least one and increasingly preferably two, three or four identical antigenic determinants with a lipase used in an agent according to the invention.
  • Lipase according to the invention used structurally so similar that it is assumed that a similar function.
  • Further lipases used in the agents according to the invention may have, in comparison to the lipase described in SEQ ID NO: 1, further amino acid changes, in particular amino acid substitutions, insertions or deletions.
  • Such lipases are, for example, further developed by targeted genetic modification, ie by mutagenesis methods, and optimized for specific applications or with regard to specific properties (for example with regard to their catalytic activity, stability, etc.).
  • nucleic acids encoding the lipases used can be incorporated into recombination approaches and thus used to generate completely new lipases or other polypeptides.
  • the goal is to introduce into the known molecules targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions, for example, to improve the cleaning performance of enzymes of the invention.
  • targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions
  • the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and thereby their interactions with the substrate can be changed.
  • the net charge of the enzymes can be changed in order to influence the substrate binding, in particular for use in detergents and cleaners.
  • the stability of the lipase can be further increased by one or more corresponding mutations, thereby improving its cleaning performance.
  • Advantageous properties of individual mutations, e.g. individual substitutions can complement each other.
  • a lipase which has already been optimized with regard to certain properties, for example with respect to its activity, can therefore be further developed within the scope of the invention.
  • Another object of the invention is therefore an agent containing a lipase, which is characterized in that it is obtainable from a lipase as described above as the starting molecule by one or more conservative amino acid substitution.
  • the lipase is characterized in that it is obtainable from a lipase contained in an agent according to the invention as the starting molecule
  • hydrolytic activity i. their hydrolytic activity is at least equal to that of the starting enzyme, i. in a preferred embodiment, the hydrolytic activity is at least 80, preferably at least 90% of the activity of the
  • the lipase in addition to the sequence given in SEQ ID NO: 1, may have one or more further amino acids N- or C-terminal.
  • N-terminal peptides may be the naturally occurring signal peptides for the lipase or even a single methionine residue.
  • An object of the invention is an agent characterized by containing a lipase as defined herein.
  • the agent is preferably a washing or cleaning agent.
  • compositions / agents are made, unless explicitly stated otherwise to wt .-%, each based on the respective mixture / the respective means.
  • fatty acids or fatty alcohols or their derivatives - unless otherwise stated - representative of branched or unbranched carboxylic acids or alcohols or their derivatives having preferably 6 to 22 carbon atoms.
  • the oxo alcohols or their derivatives which are obtainable, for example, by the RoELEN's oxo synthesis, can also be used correspondingly.
  • alkaline earth metals are referred to below as counterions for monovalent anions, this means that the alkaline earth metal is present only in half - as sufficient to charge balance - amount of substance as the anion.
  • This invention includes all conceivable types of detergents or cleaners, both concentrates and undiluted agents, for use on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing. These include, for example
  • washing and cleaning agents for textiles, carpets or natural fibers, for which the term laundry detergent is used.
  • the washing and cleaning agents in the context of the invention also include washing aids, which in manual or machine textile washing to the actual
  • laundry detergents and cleaners in the context of the invention also include textile pre-treatment and post-treatment agents, ie those agents with which the laundry item is brought into contact before the actual laundry, for example to dissolve stubborn soiling, and also agents which are in one of the actual Textile laundry downstream step to give the laundry further desirable properties such as comfortable grip, crease resistance or low static charge.
  • textile pre-treatment and post-treatment agents ie those agents with which the laundry item is brought into contact before the actual laundry, for example to dissolve stubborn soiling
  • agents which are in one of the actual Textile laundry downstream step to give the laundry further desirable properties such as comfortable grip, crease resistance or low static charge i.a. calculated the fabric softener.
  • the washing or cleaning agents according to the invention may contain, in addition to the above-described lipase, all known ingredients customary in such agents, preference being given to at least one further ingredient in the Means is present.
  • the agents according to the invention may in particular contain surfactants, builders, bleaches, in particular peroxygen compounds, or bleach activators.
  • they may contain water-miscible organic solvents, further enzymes, sequestering agents, electrolytes, pH regulators and / or further auxiliaries, such as optical brighteners, graying inhibitors, foam regulators, as well as dyes and fragrances, and combinations thereof.
  • Embodiments has improved cleaning performance by resulting synergisms.
  • a synergism by combining the agent according to the invention with a surfactant and / or a builder (builder) and / or a peroxygen compound and / or a bleach activator, such a synergism can be achieved.
  • Patent Application WO2009 / 121725 beginning on page 5, penultimate paragraph, and ending on page 13 after the second paragraph. This disclosure is incorporated herein by reference and the disclosure is incorporated herein by reference.
  • the agents according to the invention preferably also contain at least one compound from the class of surfactants, in particular selected from anionic and nonionic, but also cationic, zwitterionic or amphoteric surfactants.
  • Suitable surfactants are, for example, anionic surfactants of the formula (I)
  • R represents a linear or branched unsubstituted alkylaryl group.
  • Y stands for a monovalent cation or the n-th part of an n-valent cation, the alkali metal ions being preferred, and Na + or K + being preferred, Na + being extremely preferred.
  • Other cations Y + may be selected from NhV, Mn 2+ , and mixtures thereof.
  • Alkylaryl refers to organic radicals consisting of an alkyl radical and an aromatic radical Typical examples of such radicals include but are not limited to alkylbenzene radicals such as benzyl, butylbenzene radicals, nonylbenzene radicals, decylbenzene radicals, undecylbenzene radicals. Dodecylbenzene radicals, tridecylbenzene radicals and the like.
  • such surfactants are selected from linear or branched alkylbenzenesulfonates of the formula A-1
  • the compound of formula (I) is preferably the sodium salt of a linear alkyl benzene sulfonate.
  • the at least one compound from the class of anionic surfactants of the formula (I) is present in an amount of 0.001 to 30% by weight, preferably 0.001 to 10% by weight, more preferably 2 to 6% by weight. even more preferably 3-5% by weight, contained in the washing or cleaning agent, in each case based on the total weight of the cleaning agent.
  • compositions according to the invention preferably contain at least one anionic surfactant of the formula
  • R is a linear or branched, substituted or
  • unsubstituted alkyl, aryl or alkylaryl radical preferably a linear, unsubstituted alkyl radical, more preferably a fatty alcohol radical.
  • Preferred radicals R are selected from decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl,
  • Particularly preferred radicals R are derived from C 12 -C 18 -fatty alcohols, for example from coconut fatty alcohol, tallow fatty alcohol, lauryl, myristyl, cetyl or stearyl alcohol or from C 10 -C 20 oxo alcohols.
  • AO represents an ethylene oxide (EO) or propylene oxide (PO) moiety, preferably an ethylene oxide moiety.
  • the index n stands for an integer from 1 to 50, preferably from 1 to 20 and especially from 2 to 10. Most preferably, n stands for the numbers 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8.
  • X stands for a monovalent cation or the nth part of an n-valent cation, the alkali metal ions are preferred, and Na + or K + including Na, with Na + being extremely preferred is.
  • Other cations X + may be selected from NH 4 + , Vi Zn 2+ , V 2 Mg 2+ , 1 ⁇ Ca 2+ , V 2 Mn 2+ , and mixtures thereof.
  • Particularly preferred representatives are Na-Ci2-14
  • the cleaning agent contains the at least one anionic surfactant of the formula (II) in an amount of 2-10% by weight, preferably 3-8% by weight, based on the total weight of the cleaning agent.
  • anionic surfactants are the alkyl sulfates of the formula
  • R 2 is a linear or branched, substituted or
  • unsubstituted alkyl radical preferably a linear, unsubstituted alkyl radical, more preferably a fatty alcohol radical.
  • Preferred radicals R 2 are selected from decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, eicosyl radicals and mixtures thereof, the representatives having an even number of C Atoms are preferred.
  • radicals R 2 are derived from C 12-18 fatty alcohols, for example coconut oil fatty alcohol, tallow fatty alcohol, lauryl, myristyl, cetyl or stearyl alcohol or C 10 C 20 oxo alcohols.
  • Y stands for a monovalent cation or the nth part of an n-valent cation, the alkali metal ions being preferred, and Na + or K + being preferred, Na + being extremely preferred.
  • Other cations Y + may be selected from NhV,
  • the agent may contain, in addition to the anionic surfactants described above, in particular those of the formulas (I) - (III), or alternatively at least one other surfactant.
  • Suitable alternative or additional surfactants are in particular further anionic surfactants, nonionic surfactants and mixtures thereof, but also cationic, zwitterionic and amphoteric surfactants.
  • the agents comprise at least one nonionic surfactant, in particular at least one fatty alcohol alkoxylate.
  • Suitable nonionic surfactants are those of the formula
  • R 3 is a linear or branched, substituted or unsubstituted alkyl radical
  • AO for an ethylene oxide (EO) or propylene oxide (PO) grouping
  • n stands for integers from 1 to 50.
  • R 3 is a linear or branched, substituted or unsubstituted alkyl radical, preferably a linear, unsubstituted alkyl radical, particularly preferably a fatty alcohol radical.
  • Preferred radicals R 2 are selected from decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl,
  • R 3 are derived from C 12 -C 18 -fatty alcohols, for example from coconut fatty alcohol, tallow fatty alcohol, lauryl, myristyl, cetyl or stearyl alcohol or from C 10 -C 20 oxo alcohols.
  • AO represents an ethylene oxide (EO) or propylene oxide (PO) moiety, preferably an ethylene oxide moiety.
  • EO ethylene oxide
  • PO propylene oxide
  • m is an integer from 1 to 50, preferably from 1 to 20 and especially from 2 to 10. Most preferably, m is the numbers 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8.
  • nonionic surfactants which may be included in the described compositions within the meaning of the present invention include, but are not limited to, alkyl glycosides, alkoxylated fatty acid alkyl esters, amine oxides, fatty acid alkanolamides, hydroxy mixed ethers,
  • Sorbitan fatty acid esters polyhydroxy fatty acid amides and alkoxylated alcohols.
  • Suitable amphoteric surfactants are, for example, betaines of the formula (R 1) XR 1 XR 3 N-chloroCOO- in which R i is an alkyl radical optionally interrupted by hetero atoms or heteroatom groups having 8 to 25, preferably 10 to 21 carbon atoms and R iv and R v are identical or different alkyl radicals 1 to 3 carbon atoms, in particular Cio-Cis-alkyl dimethylcarboxymethylbetain and Cn-Ci7-alkylamidopropyl-dimethylcarboxymethylbetain.
  • Suitable cationic surfactants are i.a. the quaternary ammonium compounds of the formula
  • R VI (R VI ) (R vii ) (R viii ) (R ix ) N + X "
  • R vi to R ix for four identical or different, in particular two long and two short-chain, alkyl radicals and X " for an anion , in particular a halide ion, for example, didecyldimethylammonium chloride, Alkylbenzyldidecylammoniumchlorid and mixtures thereof.
  • Suitable cationic surfactants are the quaternary surface-active compounds, in particular with a sulfonium, phosphonium, iodonium or
  • Arsonium group which are also known as antimicrobial agents.
  • the agent can be designed with an antimicrobial effect or its possibly existing antimicrobial effect due to other ingredients can be improved.
  • the total amount of the surfactants based on the weight of the composition is 2 to 30% by weight, preferably 5 to 25% by weight, more preferably 10 to 20% by weight, most preferably 14 to 18% by weight.
  • the (linear) alkylbenzenesulfonates at most in an amount of 0.001 to 30 wt .-%, preferably 0.001 to 10 wt .-%, more preferably 2 to 6 wt .-%, more preferably 3 - 5 wt .-%, based on the weight of the agent.
  • Detergents or cleaning agents according to the invention may contain other enzymes in addition to the lipase.
  • hydrolytic enzymes may be hydrolytic enzymes or other enzymes in a concentration effective for the effectiveness of the agent.
  • One embodiment of the invention thus represents agents comprising one or more enzymes.
  • Preferred enzymes are all enzymes which can display catalytic activity in the composition according to the invention, in particular a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, xyloglucanase, ⁇ -glucosidase, pectinase, carrageenase, perhydrolase, oxidase , Oxidoreductase, cutinase or other lipases, and mixtures thereof.
  • Enzymes are advantageously contained in the agent in each case in an amount of 1 ⁇ 10 -8 to 5% by weight, based on active protein.
  • Each enzyme is increasingly preferred in an amount of 1 x 10 -3 ⁇ 7 wt .-%, of 0.00001-1 wt .-%, of 0.00005 to 0.5 wt .-%, from 0.0001 to 0, 1 wt .-% and particularly preferably from 0.0001 to 0.05 wt .-% in inventive compositions, based on active protein.
  • the enzymes show synergistic cleaning performance against certain stains or stains, ie the enzymes contained in the middle composition mutually support each other in their cleaning performance. Synergistic effects can occur not only between different enzymes, but also between one or more enzymes and other ingredients of the composition according to the invention.
  • the amylase (s) is preferably an ⁇ -amylase.
  • the hemicellulase is preferably a ⁇ -glucanase, a pectinase, a pullulanase and / or a mannanase.
  • the cellulase is preferably a cellulase mixture or a one-component cellulase, preferably or predominantly an endoglucanase and / or a cellobiohydrolase.
  • the oxidoreductase is preferably an oxidase, in particular a choline oxidase, or a perhydrolase.
  • the proteases used are preferably alkaline serine proteases. They act as nonspecific endopeptidases, that is, they hydrolyze any acid amide linkages that are located inside peptides or proteins and thereby cause degradation of proteinaceous soils on the items to be cleaned. Their pH optimum is usually in the clearly alkaline range.
  • the protein concentration can be determined by known methods, for example the BCA method (bicinchoninic acid, 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method.
  • the determination of the active protein concentration takes place via a titration of the active sites using a suitable irreversible inhibitor (for proteases, for example phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) and determination of the residual activity (compare M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc , 24 (1966), pp. 5890-5913).
  • a suitable irreversible inhibitor for proteases, for example phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
  • the enzymes to be used may also be formulated together with adjuncts, such as from fermentation.
  • the enzymes are preferably used as enzyme liquid formulation (s).
  • the enzymes are usually not provided in the form of the pure protein, but rather in the form of stabilized, storable and transportable preparations. To this
  • Prefabricated preparations include, for example, the solid preparations obtained by granulation, extrusion or lyophilization or, especially in the case of liquid or gel-form detergents, solutions of the enzymes, advantageously as concentrated as possible, low in water and / or added with stabilizers or further auxiliaries.
  • the enzymes may be encapsulated for both the solid and liquid dosage forms, for example by spray-drying or extruding the enzyme solution together with a preferably natural polymer or in the form of capsules, for example those in which the enzymes are entrapped as in a solidified gel or in those of the core-shell type, in which an enzyme-containing core is coated with a water, air and / or chemical impermeable protective layer.
  • a preferably natural polymer or in the form of capsules for example those in which the enzymes are entrapped as in a solidified gel or in those of the core-shell type, in which an enzyme-containing core is coated with a water, air and / or chemical impermeable protective layer.
  • further active ingredients for example stabilizers, emulsifiers, pigments, bleaches or dyes, may additionally be applied.
  • Such capsules are applied by methods known per se, for example by shaking or rolling granulation or in fluid-bed processes.
  • such granules for example by applying
  • the agent according to the invention may comprise one or more enzyme stabilizers. Therefore, the agent according to the invention can also have a
  • Enzyme stabilizer for example, selected from the group consisting of sodium formate, sodium sulfate, lower aliphatic alcohols and boric acid and their esters and salts. Of course, two or more of these compounds may be used in combination.
  • the salts of the compounds mentioned can also be used in the form of hydrates, such as, for example, sodium sulfate decahydrate.
  • lower aliphatic alcohols as used herein includes monoalcohols, diols, and higher alcohols having up to 6 carbon atoms.
  • Polyols in particular, are to be understood as belonging to the group of lower aliphatic alcohols. For example, glycerol, (mono) ethylene glycol, (mono) propylene glycol or sorbitol, without the invention being limited to these.
  • an agent of the invention may also contain at least one further stabilizer.
  • Such stabilizers are known in the art.
  • Reversible protease inhibitors protect the enzymes contained in a detergent or cleanser from proteolytic degradation by reversibly inhibiting the enzymatic activity of the proteases contained in the agent.
  • reversible protease inhibitors benzamidine hydrochloride, boronic acids or their salts or esters are frequently used, including in particular derivatives with aromatic groups, such as ortho, meta or para-substituted
  • Phenylboronic in particular 4-formylphenyl-boronic acid, or the salts or esters of said compounds.
  • peptide aldehydes that is oligopeptides with a reduced C-terminus, especially those of 2 to 50 monomers are used for this purpose.
  • peptidic reversible protease inhibitors include ovomucoid and leupeptin.
  • enzyme stabilizers are amino alcohols such as mono-, di-, triethanol- and -propanolamine and mixtures thereof, aliphatic carboxylic acids up to C12, such as succinic acid, other dicarboxylic acids or salts of said acids. End-capped fatty acid amide alkoxylates are also suitable for this purpose. Some organic acids used as builders can additionally stabilize an enzyme. Also calcium and / or magnesium salts are used for this purpose, such as calcium acetate.
  • Polyamide oligomers or polymeric compounds such as lignin, water-soluble vinyl copolymers or cellulose ethers, acrylic polymers and / or polyamides stabilize the enzyme preparation, inter alia, against physical influences or pH fluctuations.
  • Polyamine N-oxide-containing polymers act simultaneously as enzyme stabilizers and as
  • Dye transfer inhibitors Other polymeric stabilizers are linear Cs-ds polyoxyalkylenes. Also, alkylpolyglycosides can stabilize the enzymatic components of the agent according to the invention and, preferably, are capable of additionally increasing their performance.
  • Crosslinked N-containing compounds preferably perform a dual function as soil release agents and as enzyme stabilizers.
  • Hydrophobic, nonionic polymer stabilizes in particular an optionally contained cellulase. Reducing agents and antioxidants increase the stability of the enzymes to oxidative degradation; For example, sulfur-containing reducing agents are familiar, for example sodium sulfite and reducing sugars.
  • the compositions according to the present invention are liquid and contain water as the main solvent, i. they are aqueous agents.
  • the water content of the aqueous composition of the present invention is usually 15 to 70% by weight, preferably 20 to 60% by weight. In various embodiments, the water content is more than 5% by weight, preferably more than 15% by weight and particularly preferably more than 50% by weight, in each case based on the total amount of agent.
  • non-aqueous solvents may be added to the composition.
  • Suitable non-aqueous solvents include mono- or polyhydric alcohols, alkanolamines or glycol ethers, provided that they are miscible with water in the specified concentration range.
  • the solvents are preferably selected from ethanol, n-propanol, i-propanol, butanols, glycol, propanediol, butanediol, methylpropanediol, glycerol, diglycol, propyldiglycol, butyldiglycol, hexyleneglycol, ethylene glycol methyl ether, ethylene glycol ethyl ether,
  • Propylene glycol propyl ether dipropylene glycol monomethyl ether, dipropylene glycol monoethyl ether, methoxytriglycol, ethoxytriglycol, butoxytriglycol, 1-butoxyethoxy-2-propanol, 3-methyl-3-methoxybutanol, propylene glycol t-butyl ether, di-n-octyl ether and mixtures thereof
  • the one or more non-aqueous solvents is usually contained in an amount of 0.1 to 10% by weight, preferably 1 to 8% by weight, based on the total composition.
  • compositions according to the invention may contain further ingredients which further improve the performance and / or aesthetic properties of the cleaning agent.
  • additives for improving the flow and drying behavior for adjusting the viscosity and / or for stabilization, as well as other cleaning agents and additives customary in detergents, such as UV stabilizers, perfume, pearlescing agents, dyes, corrosion inhibitors, preservatives, bittering agents, organic Salts, disinfectants, structuring polymers, defoamers, encapsulated ingredients (eg encapsulated perfume), pH adjusters and skin feel-improving or nourishing additives.
  • An agent according to the invention, in particular washing or cleaning agent preferably contains at least one water-soluble and / or water-insoluble, organic and / or inorganic builder (builders).
  • the builders which can generally be used are, in particular, the aminocarboxylic acids and their salts, zeolites, silicates, carbonates, organic (co) builders and, where there are no ecological prejudices against their use, also the phosphates.
  • the agents are phosphate-free.
  • the water-soluble organic builder substances include polycarboxylic acids, in particular citric acid and sugar acids, monomeric and polymeric aminopolycarboxylic acids, in particular methylglycinediacetic acid, nitrilotriacetic acid and ethylenediaminetetraacetic acid and also
  • Polyaspartic acid Polyphosphonic acids, in particular Aminotris (methylenphosphonklare), ethylenediaminetetrakis (methylenephosphonic) and 1-hydroxyethane-1, 1-diphosphonic acid, polymeric hydroxy compounds such as dextrin and polymeric (poly) carboxylic acids, polymeric acrylic acids, methacrylic acids, maleic acids and copolymers thereof, which also small amounts of polymerizable substances without carboxylic acid functionality may contain polymerized.
  • Suitable, although less preferred, compounds of this class are copolymers of acrylic or methacrylic acid with vinyl ethers, such as vinylmethyl ethers, vinyl esters, ethylene, propylene and styrene, in which the acid content is at least 50% by weight.
  • the organic builder substances can be used, in particular for the preparation of liquid agents, in the form of aqueous solutions, preferably in the form of 30 to 50 percent by weight aqueous solutions. All of the acids mentioned are generally used in the form of their water-soluble salts, in particular their alkali metal salts.
  • Organic builders may, if desired, be included in amounts of up to 40% by weight, more preferably up to 25% by weight, and preferably from 1% to 8% by weight. Quantities close to the stated upper limit are preferably used in paste-form or liquid, in particular water-containing, agents according to the invention.
  • Aftertreatment agents such as e.g. Softener, may optionally also be free of organic builder.
  • water-soluble inorganic builder materials are in particular alkali metal silicates and, if there are no concerns about their use, also polyphosphates, preferably
  • Sodium triphosphate into consideration.
  • water-insoluble, water-dispersible inorganic builder materials in particular crystalline or amorphous alkali metal aluminosilicates, if desired, in amounts of up to 50 wt .-%, preferably not more than 40 wt .-% and in liquid agents, in particular from 1 wt .-% to 5 wt. -%, are used.
  • the detergent-quality crystalline sodium aluminosilicates in particular zeolite A, P and
  • Suitable aluminosilicates have, in particular, no particles with a particle size greater than 30 ⁇ m, and preferably consist of at least 80% by weight of particles having a size of less than 10 ⁇ m.
  • Suitable substitutes or partial substitutes for the said aluminosilicate are crystalline alkali silicates which may be present alone or in a mixture with amorphous silicates.
  • the alkali metal silicates useful as builders in the compositions according to the invention preferably have a molar ratio of alkali metal oxide to SiO 2 below 0.95, in particular from 1: 1, 1 to 1: 12, and may be present in amorphous or crystalline form.
  • Preferred alkali metal silicates are the sodium silicates, in particular the amorphous sodium silicates, with a molar ratio of Na 2 O: SiO 2 of from 1: 2 to 12.8.
  • Crystalline silicates which may be present alone or in a mixture with amorphous silicates are preferably crystalline phyllosilicates of the general formula Na.sub.2SixO.sub.2.sup.x + H.sub.2O.sub.2, in which x, the so-called modulus, is a number from 1.9 to 4 and y is a number from 0 is up to 20 and preferred values for x are 2, 3 or 4.
  • Preferred crystalline phyllosilicates are those in which x in the abovementioned general formula assumes the values 2 or 3.
  • both beta- and delta-sodium disilicates Na 2 Si 2 O y H 2 O
  • beta- and delta-sodium disilicates Na 2 Si 2 O y H 2 O
  • amorphous alkali silicates practically anhydrous crystalline alkali silicates of the abovementioned general formula in which x is a number from 1, 9 to 2.1, can be used in inventive compositions.
  • a crystalline sodium layer silicate with a modulus of 2 to 3 is used, as can be prepared from sand and soda. Crystalline sodium silicates with a modulus in the range of 1.9 to 3.5 are used in a further preferred embodiment of compositions according to the invention.
  • the weight ratio of aluminosilicate to silicate is preferably 1:10 to 10: 1.
  • the weight ratio of amorphous alkali metal silicate to crystalline alkali metal silicate is preferably 1: 2 to 2: 1 and especially 1: 1 to 2: 1.
  • Builders are, if desired, in the inventive compositions preferably in amounts of up to 60 wt .-%, in particular from 5 wt .-% to 40 wt .-%, included. Particularly preferred are water-soluble builders in liquid formulations.
  • Aftertreatment agents such as e.g. Softener, are preferably free of inorganic builder.
  • polymeric thickeners are the polycarboxylates which have a thickening effect as polyelectrolytes, preferably homo- and copolymers of acrylic acid, in particular acrylic acid copolymers such as acrylic acid-methacrylic acid copolymers, and the polysaccharides, in particular heteropolysaccharides, as well as other conventional thickening polymers.
  • Suitable polysaccharides or heteropolysaccharides are the polysaccharide gums, for example gum arabic, agar, alginates, carrageenans and their salts, guar, guar gum, tragacanth, gellan, Ramzan, dextran or xanthan and their derivatives, e.g. propoxylated guar, as well as their mixtures.
  • Other polysaccharide thickeners such as starches or cellulose derivatives, may be used alternatively, but preferably in addition to a polysaccharide gum, for example starches of various origins and starch derivatives, e.g.
  • Hydroxyethyl starch starch phosphate esters or starch acetates, or carboxymethyl cellulose or its sodium salt, methyl, ethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl, hydroxypropylmethyl or hydroxyethyl methyl cellulose or cellulose acetate.
  • Acrylic acid polymers suitable as polymeric thickeners are, for example
  • acrylic acid copolymers are the following acrylic acid copolymers: (i) Copolymers of two or more monomers from the group of acrylic acid, methacrylic acid and their simple ester, preferably formed with C 1-4 alkanols (INCI acrylates copolymer), to which approx the copolymers of methacrylic acid, butyl acrylate and methyl methacrylate (CAS 25035-69-2) or of butyl acrylate and methyl methacrylate (CAS 25852-37-3); (ii) crosslinked high molecular weight acrylic acid copolymers, such as those crosslinked with an allyl ether of sucrose or pentaerythritol copolymers of Cio-30-alkyl acrylates with one or more monomers from the group of acrylic acid, methacrylic acid and their simple, preferably with Ci-4-alkanols formed esters (INCI acrylates / C 10-30 alkyl acrylate crosspolymer).
  • the content of polymeric thickener is usually not more than 8 wt .-%, preferably between 0.1 and 7 wt .-%, particularly preferably between 0.5 and 6 wt .-%, in particular between 1 and 5 wt .-% and most preferably between 1, 5 and 4 wt .-%, for example between 2 and 2.5 wt .-%, based on the total weight of the composition.
  • one or more dicarboxylic acids and / or salts thereof may be added, in particular a composition of Na salts of adipic, succinic and glutaric acid, for example as available under the trade name Sokalan ® DSC is.
  • the use is advantageously carried out in Amounts from 0.1 to 8 wt .-%, preferably 0.5 to 7 wt .-%, in particular 1, 3 to 6 wt .-% and particularly preferably 2 to 4 wt .-%, based on the total weight of the cleaning agent ,
  • the detergents according to the invention can be compared with reference detergents in order to determine the increased anti-pilling performance of the compositions according to the invention.
  • Washing system can be composed as follows (all figures in weight percent):
  • Reference agent anionic surfactant 5-7%, builder (eg citric acid and phosphonates) 0-1%, caustic soda 0-1%, palm kernel fatty acid 0-1%, glycerol 0-1%, sodium chloride 1-3%, boric acid 0-1%, other additives (preservative, defoamer, opt. brightener, dye, perfume) 0-1% and remainder demineralized water.
  • builder eg citric acid and phosphonates
  • Inventive agent anionic surfactant 5-7%, builder (eg citric acid and phosphonates) 0-1%, caustic soda 0-1%, palm kernel oil fatty acid 0-1%, glycerol 0-1%, sodium chloride 1-3%, boric acid 0-1% , further additives (preservative, defoamer, optical brightener, dye, perfume) 0-1%, lipase according to the invention 0.001-0.1% and remainder demineralized water.
  • the dosage of the liquid detergent is between 4.5 and 6.0 grams per liter of wash liquor, for example, 4.7, 4.9 or 5.9 grams per liter of wash liquor.
  • Preference is given to washing in a pH range between pH 8 and pH 10.5, preferably between pH 8 and pH 9.
  • the abovementioned embodiments of the present invention comprise all solid, powdery, liquid, gelatinous or paste-like administration forms of agents according to the invention which, if appropriate, may also consist of several phases and may be present in compressed or uncompressed form.
  • the agent can be present as a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l.
  • the solid dosage forms of the composition also include extrudates, granules, tablets or pouches.
  • the agent can also be liquid, gelatinous or pasty, for example in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
  • agent may be present as a one-component system. Such funds consist of one phase. Alternatively, an agent can also consist of several phases. Such an agent is therefore divided into several components (multi-component system).
  • Another object of the invention is a process for the cleaning of textiles, which is characterized in that in at least one process step, an inventive agent is applied.
  • the method described above is characterized in that the agent according to the invention is used at a temperature of 0-100 ° C, preferably 0-80 ° C, more preferably 30-70 and most preferably 40-60.
  • Processes for the purification of textiles are generally distinguished by the fact that various cleaning-active substances are applied to the fabric in several process steps
  • the material to be cleaned is applied and washed off after the action time, or the material to be cleaned is treated in any other way with a detergent or a solution or dilution of this agent.
  • All conceivable washing or cleaning methods can be enriched in at least one of the method steps to the application of a washing or cleaning agent according to the invention and then represent embodiments of the present invention.
  • All facts, objects and embodiments described for means according to the invention are also applicable to this subject of the invention , Therefore, reference is made at this point expressly to the disclosure in the appropriate place with the statement that this disclosure also applies to the above inventive method.
  • a single and / or the only step of such a method may be that the only cleaning active component is a lipase with the Pollution is brought into contact, preferably in a buffer solution or in water.
  • the invention also encompasses the use of the agent described herein, for example as detergents or cleaning agents as described above, for the (improved) removal of stains, for example textiles.
  • the gene was transformed into a pET24a
  • the wash liquor with a final concentration of 4.0 g / L, was preheated to 40 ° C.
  • lye and enzyme were added to the stain and incubated for 1 h at 40 ° C and 600 rpm. After washing, the soiling was rinsed several times with clear water, dried and the brightness determined with a colorimeter.
  • lipase according to the invention shows good washing performance on all three soils. A significant improvement in performance is already mentioned as of 1 unit, where up to 7.7 units have been improved.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie, insbesondere der lipolytischen Wirkung von Enzymen auf Fette und Öle, wie sie zum Beispiel in Wasch- oder Reinigungsmitteln, verwendet werden. Die Erfindung betrifft ein Mittel, insbesondere Wasch- oder Reinigungsmittel, welches eine Lipase, wie hierin definiert, enthält. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Textilien sowie die Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels zur Entfernung von Anschmutzungen.

Description

Pseudomonas stutzeri Lipase und ihre Verwendung
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie, insbesondere der lipolytischen Wirkung von Enzymen auf Fette und Öle, wie sie zum Beispiel in Wasch- oder Reinigungsmitteln, verwendet werden. Die Erfindung betrifft ein Mittel, insbesondere Wasch- oder Reinigungsmittel, welches eine Lipase, wie hierin definiert, enthält. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Textilien sowie die Verwendung des
erfindungsgemäßen Mittels zur Entfernung von Anschmutzungen.
Lipasen gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt. Ihr Einsatz in Wasch- und Reinigungsmittel ist industriell etabliert und sie sind in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthalten. Lipasen sind Enzyme, die die Hydrolyse von
Esterbindungen in Lipidsubstraten, insbesondere in Fetten und Ölen, katalysieren und damit zur Gruppe der Esterasen gehören. Lipasen sind typischerweise Enzyme, die eine Vielzahl an
Substraten spalten können, beispielsweise aliphatische, alizyklische, bizyklische und aromatische Ester, Thioester und aktivierte Amine. Lipasen werden zur Entfernung von fetthaltigen
Anschmutzungen eingesetzt, indem sie deren Hydrolyse (Lipolyse) katalysieren. Lipasen mit breiten Substratspektren werden insbesondere dort verwendet, wo inhomogene Rohstoffe oder Substratgemische umgesetzt werden müssen, also beispielsweise in Wasch- und
Reinigungsmitteln, da Anschmutzungen aus unterschiedlich aufgebauten Fetten und Ölen bestehen können. Die in den aus dem Stand der Technik bekannten Wasch- oder
Reinigungsmitteln eingesetzten Lipasen sind üblicherweise mikrobiellen Ursprungs und stammen in der Regel aus Bakterien oder Pilzen, beispielsweise der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus, Humicola, Trichoderma oder Trichosporon. Lipasen werden üblicherweise nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete
Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Pilze.
In der europäischen Patentanmeldung EP 443063 ist beispielsweise eine für Wasch- und
Reinigungsmittel vorgesehene Lipase aus Pseudomonas sp. ATCC 21808 offenbart. In der japanischen Patentanmeldung JP 1225490 ist eine Lipase aus Rhizopus oryzae offenbart. Generell sind nur ausgewählte Lipasen für den Einsatz in flüssigen Tensid-haltigen Zubereitungen überhaupt geeignet. Viele Lipasen zeigen in derartigen Zubereitungen keine ausreichende katalytische Leistung oder Stabilität. Insbesondere in Waschverfahren, die im Allgemeinen bei Temperaturen durchgeführt werden, die höher als 20°C liegen, zeigen viele Lipasen thermische Instabilität, die wiederum zu einer unzureichenden katalytischen Aktivität während des
Waschvorgangs führt. In Phosphonat-haltigen flüssigen Tensidzubereitungen ist diese Problematik noch gravierender, beispielsweise auf Grund der komplexbildenden Eigenschaften der Phosphonate oder auf Grund von unvorteilhaften Wechselwirkungen zwischen dem Phosphonat und der Lipase.
Folglich haben Lipase- und Tensid-haltige flüssige Formulierungen aus dem Stand der Technik den Nachteil, dass sie oftmals in den Temperaturbereichen, die ein Waschverfahren erfordert, keine zufriedenstellende lipolytische Aktivität aufweisen und daher keine optimale
Reinigungsleistung an Lipase-sensitiven Anschmutzungen zeigen.
Überraschenderweise haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass eine Lipase aus Pseudomonas stützen, wie hierin beschrieben, unter Waschprozess-Bedingungen aktiv ist und gute lipolylitische Eigenschaften aufweist. Die Sequenz der hierin identifizierten Lipase weist keine signifikanten Sequenzhomologien zu bislang in Wasch- oder Reinigungsmitteln eingesetzten Lipasen auf. Daher eröffnet sie viele Möglichkeiten, die genetische Vielfalt der kommerziell genutzten Lipasen zu erhöhen und ggf. noch das Leistungsspektrum durch Mutagenese zu verändern.
Daher richtet sich in einem ersten Aspekt die vorliegende Erfindung auf ein Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Lipase enthält, die mindestens 65 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Reinigung von Textilien, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein
erfindungsgemäßes Mittel angewendet wird.
In noch einem Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung ferner auf die Verwendung eines wie hierin beschriebenen Mittels, vorzugsweise Wasch- oder Reinigungsmittels, besonders bevorzugt flüssigen Waschmittels, zur Entfernung von (fetthaltigen) Anschmutzungen.
Die erfindungsgemäßen Lipasen weisen enzymatische Aktivität auf, das heißt, sie sind zur Hydrolyse von Fetten und Ölen befähigt, insbesondere in einem Wasch- oder Reinigungsmittel. Eine erfindungsgemäße Lipase ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von Esterbindungen in Lipid-Substraten katalysiert und dadurch in der Lage ist, Fette oder Öle zu spalten. Ferner handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Lipase vorzugsweise um eine reife (mature) Lipase, d.h. um das katalytisch aktive Molekül ohne Signal- und/oder Propeptid(e). Soweit nicht anders angegeben beziehen sich auch die angegebenen Sequenzen auf jeweils reife (prozessierte) Enzyme. ln verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Lipase eine Lipase, die mindestens 70 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist. In weiter bevorzugten Ausführungsformen umfasst die im erfindungsgemäßen Mittel enthaltene Lipase die in SEQ ID NO:1 angegebene Aminosäuresequenz oder besteht im Wesentlichen daraus oder besteht daraus. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Erfindung auch Lipasen, die von der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , beispielsweise mittels Mutagenese, abgeleitet sind. In verschiedenen weiteren
Ausführungsformen umfasst die Erfindung auch Lipasen, die durch die Expression einer
Nukleotidsequenz, die für ein Protein gemäß SEQ ID NO: 1 kodiert, erhältlich sind. In einem Aspekt der Erfindung umfasst die Erfindung auch Nukleotidsequenzen, die zu der Nukleotidsequenz, die für das Protein gemäß SEQ ID NO:1 kodiert, über deren Gesamtlänge zu mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,8%, 99,0%, 99,2%, 99,4% oder 99,6% identisch sind, mit der Maßgabe, dass die native, für die Lipase aus Pseudonomas stützen kodierende Sequenz ausgenommen ist.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Lipase eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,8%, 99,0%, 99,2%, 99,4% oder 99,6% identisch ist oder besteht aus einer solchen Sequenz.
In verschiedenen weiteren Ausführungsformen ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass
(a) die Lipase aus einer wie oben definierten Lipase als Ausgangsmolekül durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution erhältlich ist; und/oder
(b) die Lipase aus einer wie oben definierten Lipase als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine
Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 182, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 245, 250, 260, 270, 271 , 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279 oder 280
zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
Die erfindungsgemäßen Mittel enthalten die Lipase vorzugsweise in einer Menge von 0,00001 - 1 Gew.-%, weiter bevorzugt in einer Menge von 0,0001 - 0,5 Gew.-%, besonders bevorzugt in einer Menge von 0,001 - 0, 1 Gew.-%, jeweils bezogen auf das aktive Protein. Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403- 410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500), T- Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren. Ferner möglich sind Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische
Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch in Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz. ln verschiedenen Ausführungsformen umfasst die Lipase eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,8%, 99,0%, 99,2%, 99,4% oder 99,6% homolog ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Lipase dadurch gekennzeichnet, dass ihre lipolytische Leistung gegenüber derjenigen einer Lipase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenzen entspricht, nicht signifikant verringert ist, d.h. mindestens 70%, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % der Referenz-Leistung besitzt. Die lipolytische Leistung kann in einem Waschsystem bestimmt werden, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Lipase enthält, wobei die zu vergleichenden Lipasen konzentrationsgleich (bezogen auf aktives Protein) eingesetzt sind und die lipolytische Leistung wie hierin beschrieben ermittelt wird. Beispielsweise kann der
Waschvorgang für 60 Minuten bei einer Temperatur von 60°C erfolgen und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° (deutsche Härte) aufweisen. Die Konzentration der Lipase in dem für dieses Waschsystem bestimmten Waschmittel beträgt von 0,00001 - 1 Gew.-%, bevorzugt von 0,0001 - 0,5 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,001 - 0, 1 Gew.-%, bezogen auf aktives, gereinigtes Protein.
Ein bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): Aniontensid 5-7%, Gerüststoff (z.B. Zitronensäure und Phosphonate) 0-1 %, Natronlauge 0-1 %, Palmkernölfettsäure 0-1 %, Glycerin 0-1 %, Natriumchlorid 1-3%, Borsäure 0-1 %, weitere Zusätze (Konservierungsmittel, Entschäumer, opt. Aufheller, Farbstoff, Parfüm) 0-1 % und Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9.
Im Rahmen der Erfindung erfolgt die Bestimmung der lipolytischen Leistung bei 40°C unter Verwendung eines flüssigen Waschmittels wie vorstehend angegeben, wobei der Waschvorgang vorzugsweise für 60 Minuten erfolgt.
Der Weißegrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, als Maß für die Reinigungsleistung wird mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.
Durch den aktivitätsgleichen Einsatz der jeweiligen Lipase wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften, also beispielsweise die Reinigungsleistung an bestimmten Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann.
Die Lipaseaktivität kann ansonsten auch in fachüblicher Weise bestimmt werden, und zwar vorzugsweise wie beschrieben in Bruno Stellmach,„Bestimmungsmethoden Enzyme für
Pharmazie, Lebensmittelchemie, Technik, Biochemie, Biologie, Medizin" (Steinkopff Verlag Darmstadt, 1988, S. 172ff). Hierbei werden Lipase-haltige Proben zu einer Olivenölemulsion in emulgator-haltigem Wasser gegeben und bei 30°C und pH 9,0 inkubiert. Dabei werden Fettsäuren freigesetzt. Diese werden mit einem Autotitrator über 20 Minuten laufend mit 0,01 N Natronlauge titriert, so dass der pH-Wert konstant bleibt („pH-stat-Titration"). Anhand des Natronlauge- Verbrauchs erfolgt mittels Bezug auf eine Referenzlipaseprobe die Bestimmung der Lipaseaktivität.
Ein alternativer Test zur Feststellung der lipolytischen Aktivität der erfindungsgemäßen Lipasen ist ein optisches Mess verfahren, bevorzugt ein photometrisches Verfahren. Der hierfür geeignete Test umfasst die Lipase-abhängige Spaltung des Substrats para-Nitrophenol-butyrate (pNP-butyrate). Dieses wird durch die Lipase in para-Nitrophenolat und Butyrat gespalten. Die Anwesenheit von para-Nitrophenolat kann unter Verwendung eines Photometers, z.B. des Tecan Sunrise Geräts und der XFLUOR Software, bei 405 nm ermittelt werden und ermöglicht somit einen Rückschluss auf die enzymatische Aktivität der Lipase.
Proteine können über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefasst werden. Die Angehörigen einer solchen Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen. Sie sind daher einander strukturell so ähnlich, dass sie von einem Antiserum oder bestimmten Antikörpern erkannt werden. Einen weiteren
Erfindungsgegenstand bilden daher Lipasen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene Determinanten mit einer in einem erfindungsgemäßen Mittel verwendeten Lipase aufweisen.
Solche Lipasen sind auf Grund ihrer immunologischen Übereinstimmungen den in den
erfindungsgemäßen Mitteln verwendeten Lipasen strukturell so ähnlich, dass auch von einer gleichartigen Funktion auszugehen ist. Weitere in den erfindungsgemäßen Mitteln verwendete Lipasen können im Vergleich zu der in SEQ ID N0: 1 beschriebenen Lipase weitere Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure- Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen, aufweisen. Solche Lipasen sind beispielsweise durch gezielte genetische Veränderung, d.h. durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, Stabilität, usw.) optimiert. Ferner können Nukleinsäuren, die die verwendeten Lipasen kodieren, in Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Lipasen oder anderer Polypeptide genutzt werden.
Das Ziel ist es, in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen einzuführen, um beispielsweise die Reinigungsleistung von erfindungsgemäßen Enzymen zu verbessern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So kann beispielsweise die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen die Stabilität der Lipase noch weiter erhöht und dadurch ihre Reinigungsleistung verbessert werden. Vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Substitutionen, können sich ergänzen. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Lipasen, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Aktivität, kann daher im Rahmen der Erfindung zusätzlich weiterentwickelt sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Mittel enthaltend eine Lipase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer Lipase wie vorstehend beschrieben als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution. Der Begriff
"konservative Aminosäuresubstitution" bedeutet den Austausch (Substitution) eines
Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren
Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, l=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T. Dabei ist die Homologie der derartig modifizierten Lipasen zu der Lipase mit der SEQ ID NO:1 vorzugsweise wie oben definiert.
Alternativ oder ergänzend ist die Lipase dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer in einem erfindungsgemäßen Mittel enthaltenen Lipase als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch
Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine
Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 182, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 245, 250, 260, 270, 271 , 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279 oder 280
zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne dass dadurch die hydrolytische Aktivität verloren oder vermindert wird. Ferner kann durch derartige Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese beispielsweise auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Vorteilhafterweise behalten die Enzyme auch nach der
Mutagenese ihre hydrolytische Aktivität, d.h. ihre hydrolytische Aktivität entspricht mindestens derjenigen des Ausgangsenzyms, d.h. in einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die hydrolytische Aktivität mindestens 80, vorzugsweise mindestens 90 % der Aktivität des
Ausgangsenzyms. Auch weitere Substitutionen können vorteilhafte Wirkungen zeigen. Sowohl einzelne wie auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren können gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.
In verschiedenen Ausführungsformen kann die Lipase zusätzlich zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz N- oder C-terminal eine oder mehrere weitere Aminosäuren aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen kann es sich bei solchen N-terminalen Peptiden um die natürlicherweise vorkommenden Signalpeptide für die Lipase handeln oder auch um einen einzelnen Methionin-Rest.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Lipase, wie hierin definiert, enthält. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel.
Alle Prozentangaben, die im Zusammenhang mit den hierin beschriebenen
Zusammensetzungen/Mitteln gemacht werden, beziehen sich, sofern nicht explizit anders angegeben auf Gew.-%, jeweils bezogen auf die jeweilige Mischung/das jeweilige Mittel.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stehen Fettsäuren bzw. Fettalkohole bzw. deren Derivate - soweit nicht anders angegeben - stellvertretend für verzweigte oder unverzweigte Carbonsäuren bzw. Alkohole bzw. deren Derivate mit vorzugsweise 6 bis 22 Kohlenstoffatomen. Insbesondere sind auch die beispielsweise nach der RoELENschen Oxo-Synthese erhältlichen Oxo-Alkohole bzw. deren Derivate entsprechend einsetzbar.
Wann immer im Folgenden Erdalkalimetalle als Gegenionen für einwertige Anionen genannt sind, so bedeutet das, dass das Erdalkalimetall natürlich nur in der halben - zum Ladungsausgleich ausreichenden - Stoffmenge wie das Anion vorliegt. Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder in der Handwäsche. Dazu gehören beispielsweise
Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Zu den Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen
Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen, Gele oder Suspensionen vorliegen können, können neben der oben beschriebenen Lipase alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Tenside, Builder (Gerüststoffe), Bleichmittel, insbesondere Persauerstoffverbindungen, oder Bleichaktivatoren enthalten. Ferner können sie wassermischbare organische Lösungsmittel, weitere Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und/oder weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibi- toren, Schaumregulatoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.
Insbesondere eine Kombination des erfindungsgemäßen Mittels mit einem oder mehreren weiteren Inhaltsstoff(en) ist vorteilhaft, da ein solches Mittel in bevorzugten erfindungsgemäßen
Ausgestaltungen eine verbesserte Reinigungsleistung durch sich ergebende Synergismen aufweist. Insbesondere durch die Kombination des erfindungsgemäßen Mittels mit einem Tensid und/oder einem Builder (Gerüststoff) und/oder einer Persauerstoffverbindung und/oder einem Bleichaktivator kann ein solcher Synergismus erreicht werden.
Vorteilhafte Inhaltsstoffe erfindungsgemäßer Mittel sind offenbart in der internationalen
Patentanmeldung WO2009/121725, dort beginnend auf Seite 5, vorletzter Absatz, und endend auf Seite 13 nach dem zweiten Absatz. Auf diese Offenbarung wird ausdrücklich Bezug genommen und der dortige Offenbarungsgehalt in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen.
Diese und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden für den Fachmann aus dem Studium der folgenden detaillierten Beschreibung und Ansprüche ersichtlich. Dabei kann jedes Merkmal aus einem Aspekt der Erfindung in jedem anderen Aspekt der Erfindung eingesetzt werden. Ferner ist es selbstverständlich, dass die hierin enthaltenen Beispiele die Erfindung beschreiben und veranschaulichen sollen, diese aber nicht einschränken und insbesondere die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist. Alle Prozentangaben sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichts-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. Numerische Bereiche, die in dem Format„von x bis y" angegeben sind, schließen die genannten Werte ein. Wenn mehrere bevorzugte numerische Bereiche in diesem Format angegeben sind, ist es selbstverständlich, dass alle Bereiche, die durch die Kombination der verschiedenen Endpunkte entstehen, ebenfalls erfasst werden.
Die erfindungsgemäßen Mittel enthalten neben der Lipase vorzugsweise auch mindestens eine Verbindung aus der Klasse der Tenside, insbesondere ausgewählt aus anionischen und nichtionischen, aber auch kationischen, zwitterionischen oder amphoteren Tensiden.
Geeignete Tenside sind beispielsweise anionische Tenside der Formel (I)
In dieser Formel (I) steht R für einen linearen oder verzweigten unsubstituierten Alkylarylrest. Y steht für ein einwertiges Kation oder den n-ten Teil eines n-wertigen Kations, bevorzugt sind dabei die Alkalimetallionen und darunter Na+ oder K+, wobei Na+ äußerst bevorzugt ist. Weitere Kationen Y+ können ausgewählt sein aus NhV, Mn2+, und deren Mischungen.
„Alkylaryl", wie hierin verwendet, bezieht sich auf organische Reste, die aus einem Alkylrest und einem aromatischen Rest bestehen. Typische Beispiele für derartige Reste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Alkylbenzolreste, wie Benzyl, Butylbenzolreste, Nonylbenzolreste, Decylbenzolreste, Undecylbenzolreste, Dodecylbenzolreste, Tridecylbenzolreste und ähnliche.
In verschiedenen Ausführungsformen sind derartige Tenside ausgewählt aus linearen oder verzweigten Alkylbenzolsulfonaten der Formel A-1
(A-1 ), in der R' und R" zusammen 9 bis 19, vorzugsweise 1 1 bis 15 und insbesondere 1 1 bis 13 C- Atome enthalten, dargestellt. Ein ganz besonders bevorzugter Vertreter lässt sich durch die Formel A-1a beschreiben:
In verschiedenen Ausführungsformen handelt es sich bei der Verbindung der Formel (I) vorzugsweise um das Natriumsalz eines linearen Alkylbenzolsulfonats.
In erfindungsgemäßen Mitteln ist die mindestens eine Verbindung aus der Klasse der anionischen Tenside der Formel (I) in einer Menge von 0,001 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 0,001 - 10 Gew.-%, ferner bevorzugt 2 - 6 Gew.-%, noch bevorzugter 3 - 5 Gew.-%, in dem Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des Reinigungsmittels.
In verschiedenen Ausführungsformen enthalten die erfindungsgemäßen Mittel vorzugsweise mindestens ein anionisches Tensid der Formel
R -0-(AO)n-S03- X+ (II).
In dieser Formel (II) steht R für einen linearen oder verzweigten, substituierten oder
unsubstituierten Alkyl-, Aryl- oder Alkylarylrest, vorzugsweise für einen linearen, unsubstituierten Alkylrest, besonders bevorzugt für einen Fettalkoholrest. Bevorzugte Reste R sind ausgewählt aus Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecyl, Pentadecyl-, Hexadecyl-, Heptadecyl-,
Octadecyl-, Nonadecyl-, Eicosylresten und deren Mischungen, wobei die Vertreter mit gerader Anzahl an C-Atomen bevorzugt sind. Besonders bevorzugte Reste R sind abgeleitet von C12-C18- Fettalkoholen, beispielsweise von Kokosfettalkohol, Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder von Cio-C2o-Oxoalkoholen.
AO steht für eine Ethylenoxid- (EO) oder Propylenoxid- (PO) Gruppierung, vorzugsweise für eine Ethylenoxidgruppierung. Der Index n steht für eine ganze Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise von 1 bis 20 und insbesondere von 2 bis 10. Ganz besonders bevorzugt steht n für die Zahlen 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8. X steht für ein einwertiges Kation oder den n-ten Teil eines n-wertigen Kations, bevorzugt sind dabei die Alkalimetallionen und darunter Na+ oder K+, wobei Na+ äußerst bevorzugt ist. Weitere Kationen X+ können ausgewählt sein aus NH4 +, Vi Zn2+,V2 Mg2+,1^ Ca2+,V2 Mn2+, und deren Mischungen.
Zusammenfassend enthalten Mittel in verschiedenen Ausführungsformen somit mindestens ein anionisches Tensid ausgewählt aus Fettalkoholethersulfaten der Formel A-2 mit k = 1 1 bis 19, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8. Besonders bevorzugte Vertreter sind Na-Ci2-14
Fettalkoholethersulfate mit 2 EO (k = 1 1-13, n = 2 in Formel A-2).
In verschiedenen Ausführungsformen enthält das Reinigungsmittel das mindestens eine anionische Tensid der Formel (II) in einer Menge von 2 - 10 Gew.-%, vorzugsweise 3 - 8 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Reinigungsmittels.
Weitere einsetzbare anionische Tenside sind die Alkylsulfate der Formel
R2-0-S03 X+ (III).
In dieser Formel (III) steht R2 für einen linearen oder verzweigten, substituierten oder
unsubstituierten Alkylrest, vorzugsweise für einen linearen, unsubstituierten Alkylrest, besonders bevorzugt für einen Fettalkoholrest. Bevorzugte Reste R2 sind ausgewählt aus Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecyl-, Pentadecyl-, Hexadecyl-, Heptadecyl-, Octadecyl-, Nonadecyl-, Eicosylresten und deren Mischungen, wobei die Vertreter mit gerader Anzahl an C-Atomen bevorzugt sind. Besonders bevorzugte Reste R2 sind abgeleitet von Ci2-Ci8-Fettalkoholen, beispielsweise von Kokosfettalkohol, Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder von Cio-C2o-Oxoalkoholen. Y steht für ein einwertiges Kation oder den n-ten Teil eines n- wertigen Kations, bevorzugt sind dabei die Alkalimetallionen und darunter Na+ oder K+, wobei Na+ äußerst bevorzugt ist. Weitere Kationen Y+ können ausgewählt sein aus NhV,
Mn2+, und deren Mischungen.
In verschiedenen Ausführungsformen sind diese Tenside ausgewählt aus Fettalkoholsulfaten der Formel A-3 mit k = 1 1 bis 19. Ganz besonders bevorzugte Vertreter sind Na-Ci2-14 Fettalkoholsulfate (k = 1 1-13 in Formel A-3).
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Mittel neben den vorstehend beschriebenen Aniontensiden, insbesondere solchen der Formeln (l)-(lll), oder alternativ dazu mindestens ein anderes Tensid enthalten. Als alternative oder zusätzliche Tenside kommen insbesondere weitere anionische Tenside, nichtionische Tenside und deren Gemische, aber auch kationische, zwitterionische und amphotere Tenside in Frage.
In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die Mittel mindestens ein nichtionisches Tensid, insbesondere mindestens ein Fettalkoholalkoxylat.
Geeignete nichtionische Tenside sind solche der Formel
R3-0-(AO)m-H (IV), in der
R3 für einen linearen oder verzweigten, substituierten oder unsubstituierten Alkylrest,
AO für eine Ethylenoxid- (EO) oder Propylenoxid- (PO) Gruppierung,
m für ganze Zahlen von 1 bis 50 stehen.
In der vorstehend genannten Formel (IV) steht R3 für einen linearen oder verzweigten, substituierten oder unsubstituierten Alkylrest, vorzugsweise für einen linearen, unsubstituierten Alkylrest, besonders bevorzugt für einen Fettalkoholrest. Bevorzugte Reste R2 sind ausgewählt aus Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecyl, Pentadecyl-, Hexadecyl-, Heptadecyl-,
Octadecyl-, Nonadecyl-, Eicosylresten und deren Mischungen, wobei die Vertreter mit gerader Anzahl an C-Atomen bevorzugt sind. Besonders bevorzugte Reste R3 sind abgeleitet von C12-C18- Fettalkoholen, beispielsweise von Kokosfettalkohol, Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder von Cio-C2o-Oxoalkoholen.
AO steht für eine Ethylenoxid- (EO) oder Propylenoxid- (PO) Gruppierung, vorzugsweise für eine Ethylenoxidgruppierung. Der Index m steht für eine ganze Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise von 1 bis 20 und insbesondere von 2 bis 10. Ganz besonders bevorzugt steht m für die Zahlen 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8. Zusammenfassend handelt es sich bei vorzugsweise einzusetzenden Fettalkoholalkoxylaten um Verbindungen der Formel mit k = 1 1 bis 19, m = 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8. Ganz besonders bevorzugte Vertreter sind C12-18 Fettalkohole mit 7 EO (k = 1 1-17, m = 7 in Formel (V)).
Weitere nichtionische Tenside, die im Sinne der vorliegenden Erfindung in den beschriebenen Mitteln enthalten sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Alkylglykoside, alkoxylierte Fettsäurealkylester, Aminoxide, Fettsäurealkanolamide, Hydroxymischether,
Sorbitanfettsäurester, Polyhydroxyfettsäureamide und alkoxylierte Alkohole.
Geeignete Amphotenside sind beispielsweise Betaine der Formel (R^XR^XR^NTChhCOO-, in der Ri einen gegebenenfalls durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen unterbrochenen Alkylrest mit 8 bis 25, vorzugsweise 10 bis 21 Kohlenstoffatomen und Riv sowie Rv gleichartige oder verschiedene Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeuten, insbesondere Cio-Cis-Alkyl- dimethylcarboxymethylbetain und Cn-Ci7-Alkylamidopropyl-dimethylcarboxymethylbetain.
Geeignete Kationtenside sind u.a. die quartären Ammoniumverbindungen der Formel
(Rvi)(Rvii)(Rviii)(Rix)N+ X", in der Rvi bis Rix für vier gleich- oder verschiedenartige, insbesondere zwei lang- und zwei kurzkettige, Alkylreste und X" für ein Anion, insbesondere ein Halogenidion, stehen, beispielsweise Didecyldimethylammoniumchlorid, Alkylbenzyldidecylammoniumchlorid und deren Mischungen. Weitere geeignete kationische Tenside sind die quaternären oberflächenaktiven Verbindungen, insbesondere mit einer Sulfonium-, Phosphonium-, Jodonium- oder
Arsoniumgruppe, die auch als antimikrobielle Wirkstoffe bekannt sind. Durch den Einsatz von quaternären oberflächenaktiven Verbindungen mit antimikrobieller Wirkung kann das Mittel mit einer antimikrobiellen Wirkung ausgestaltet werden bzw. dessen gegebenenfalls aufgrund anderer Inhaltsstoffe bereits vorhandene antimikrobielle Wirkung verbessert werden.
In verschiedenen Ausführungsformen beträgt die Gesamtmenge der Tenside bezogen auf das Gewicht des Mittels 2 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 25 Gew.-%, noch bevorzugter 10 bis 20 Gew.-%, am bevorzugtesten 14 bis 18 Gew.-%, wobei die (linearen) Alkylbenzolsulfonate höchstens in einer Menge von 0,001 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 0,001 - 10 Gew.-%, ferner bevorzugt 2 - 6 Gew.-%, noch bevorzugter 3 - 5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Mittels vorliegen. Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können neben der Lipase weitere Enzyme enthalten. Dies können hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration sein. Eine Ausführungsform der Erfindung stellen somit Mittel dar, die eines oder mehrere Enzyme umfassen. Als Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xyloglucanase, ß-Glucosidase, Pektinase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase, Cutinase oder andere Lipasen, sowie deren Gemische. Enzyme sind in dem Mittel vorteilhafterweise jeweils in einer Menge von 1 x 10~8 bis 5 Gew.-%bezogen auf aktives Protein enthalten. Zunehmend bevorzugt ist jedes Enzym in einer Menge von 1 x 10~7-3 Gew.-%, von 0,00001-1 Gew.-%, von 0,00005-0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0, 1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, bezogen auf aktives Protein. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Reinigungsleistungen gegenüber bestimmten Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.
Bei der/den Amylase(n) handelt es sich vorzugsweise um eine a-Amylase. Bei der Hemicellulase handelt es sich vorzugsweise um eine ß-Glucanase, eine Pektinase, eine Pullulanase und/oder eine Mannanase. Bei der Cellulase handelt es sich vorzugsweise um ein Cellulase-Gemisch oder eine Einkomponenten-Cellulase, vorzugsweise bzw. überwiegend um eine Endoglucanase und/oder eine Cellobiohydrolase. Bei der Oxidoreduktase handelt es sich vorzugsweise um eine Oxidase, insbesondere eine Cholin-Oxidase, oder um eine Perhydrolase.
Die eingesetzten Proteasen sind vorzugsweise alkalische Serin-Proteasen. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt, sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen und bewirken dadurch den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich.
Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren bestimmt werden. Die Bestimmung der Aktivproteinkonzentration erfolgt diesbezüglich über eine Titration der aktiven Zentren unter Verwendung eines geeigneten irreversiblen Inhibitors (für Proteasen beispielsweise Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) und Bestimmung der Restaktivität (vgl. M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), S. 5890-5913). ln den hierin beschriebenen Reinigungsmitteln können die einzusetzenden Enzyme ferner zusammen mit Begleitstoffen, etwa aus der Fermentation, konfektioniert sein. In flüssigen Formulierungen werden die Enzyme bevorzugt als Enzymflüssigformulierung(en) eingesetzt.
Die Enzyme werden in der Regel nicht in Form des reinen Proteins, sondern vielmehr in Form stabilisierter, lager- und transportfähiger Zubereitungen bereitgestellt. Zu diesen
vorkonfektionierten Zubereitungen zählen beispielsweise die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelformigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren oder weiteren Hilfsmitteln versetzt.
Alternativ können die Enzyme sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, beispielsweise solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale-Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalien-undurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Schüttel- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed-Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, beispielsweise durch Aufbringen polymerer
Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil.
Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme zusammen zu konfektionieren, so dass ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Mittel einen oder mehrere Enzymstabilisatoren aufweisen. Daher kann das erfindungsgemäße Mittel ferner einen
Enzymstabilisator beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumformiat, Natriumsulfat, niederen aliphatischen Alkoholen und Borsäure sowie deren Estern und Salzen enthalten. Natürlich können auch zwei oder mehr dieser Verbindungen in Kombination eingesetzt werden. Die Salze der genannten Verbindungen können auch in Form von Hydraten, wie beispielsweise Natriumsulfat Dekahydrat, eingesetzt werden.
Der Begriff„niedere aliphatische Alkohole", wie hierin verwendet, schließt Monoalkohole, Diole und höherwertige Alkohole mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ein. Als zu der Gruppe der niederen aliphatischen Alkohole gehörend seien in diesem Zusammenhang insbesondere Polyole, beispielsweise Glycerin, (Mono)Ethylenglykol, (Mono)Propylenglykol oder Sorbit genannt, ohne dass die Erfindung auf diese beschränkt ist.
Neben dem mindestens einen Enzymstabilisator, ausgewählt aus der obenstehenden Gruppe, kann ein erfindungsgemäßes Mittel auch mindestens einen weiteren Stabilisator enthalten.
Derartige Stabilisatoren sind im Stand der Technik bekannt.
Reversible Proteaseinhibitoren schützen die in einem Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltenen Enzyme vor proteolytischem Abbau, indem die enzymatische Tätigkeit der in dem Mittel enthaltenen Proteasen reversibel inhibiert wird. Als reversible Proteaseinhibitoren werden häufig Benzamidin-Hydrochlorid, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester eingesetzt, darunter vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa ortho-, meta- oder para-substituierte
Phenylboronsäuren, insbesondere 4-Formylphenyl-Boronsäure, beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen. Auch Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren werden zu diesem Zweck eingesetzt. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leupeptin.
Weitere Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -Propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu C12, wie beispielsweise Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Auch endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate sind für diesen Zweck geeignet. Auch manche als Builder eingesetzte organische Säuren vermögen zusätzlich ein Enzym zu stabilisieren. Auch Calcium- und/oder Magnesiumsalze werden zu diesem Zwecke eingesetzt, wie beispielsweise Calciumacetat.
Polyamid-Oligomere oder polymere Verbindungen wie Lignin, wasserlösliche Vinyl-Copolymere oder Cellulose-Ether, Acryl-Polymere und/oder Polyamide stabilisieren die Enzym-Präparation unter anderem gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert-Schwankungen. Polyamin-N- Oxid-enthaltende Polymere wirken gleichzeitig als Enzymstabilisatoren und als
Farbübertragungsinhibitoren. Andere polymere Stabilisatoren sind lineare Cs-ds Polyoxyalkylene. Auch Alkylpolyglycoside können die enzymatischen Komponenten des erfindungsgemäßen Mittels stabilisieren und vermögen vorzugsweise, diese zusätzlich in ihrer Leistung zu steigern. Vernetzte N-haltige Verbindungen erfüllen vorzugsweise eine Doppelfunktion als Soil-release-Agentien und als Enzym-Stabilisatoren. Hydrophobes, nichtionisches Polymer stabilisiert insbesondere eine gegebenenfalls enthaltene Cellulase. Reduktionsmittel und Antioxidantien erhöhen die Stabilität der Enzyme gegenüber oxidativem Zerfall; hierfür sind beispielsweise schwefelhaltige Reduktionsmittel geläufig, etwa Natrium-Sulfit und reduzierende Zucker.
In einer Ausführungsform sind die Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung flüssig und enthalten Wasser als Hauptlösungsmittel, d.h. es handelt sich um wässrige Mittel. Der Wassergehalt des erfindungsgemäßen wässrigen Mittels beträgt üblicherweise 15 bis 70 Gew.-%, vorzugsweise 20 bis 60 Gew.-%. In verschiedenen Ausführungsformen beträgt der Wassergehalt mehr als 5 Gew.- %, bevorzugt mehr als 15 Gew.-% und insbesondere bevorzugt mehr als 50 Gew.-%, jeweils bezogen auf die Gesamtmenge an Mittel.
Daneben können dem Mittel nichtwässrige Lösungsmittel zugesetzt werden. Geeignete nichtwässrige Lösungsmittel umfassen ein- oder mehrwertige Alkohole, Alkanolamine oder Glykolether, sofern sie im angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind.
Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, Butanolen, Glykol, Propandiol, Butandiol, Methylpropandiol, Glycerin, Diglykol, Propyldiglycol, Butyldiglykol, Hexylenglycol, Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether,
Ethylenglykolpropylether, Ethylenglykolmono-n-butylether, Diethylenglykolmethylether,
Diethylenglykolethylether, Propylenglykolmethylether, Propylenglykolethylether,
Propylenglykolpropylether, Dipropylenglykolmonomethylether, Dipropylenglykolmonoethylether, Methoxytriglykol, Ethoxytriglykol, Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3- methoxybutanol, Propylen-glykol-t-butylether, Di-n-octylether sowie Mischungen dieser
Lösungsmittel.
Das eine oder die mehreren nichtwässrigen Lösungsmittel ist/sind üblicherweise in einer Menge von 0,1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 8 Gew.-% bezogen auf die Gesamtzusammensetzung enthalten.
Neben den bisher genannten Komponenten können die erfindungsgemäßen Mittel weitere Inhaltsstoffe enthalten, die die anwendungstechnischen und/oder ästhetischen Eigenschaften des Reinigungsmittels weiter verbessern. Hierzu zählen beispielsweise Additive zur Verbesserung des Ablauf- und Trocknungsverhaltens, zur Einstellung der Viskosität und/oder zur Stabilisierung, sowie weitere in Reinigungsmitteln übliche Hilfs- und Zusatzstoffe, etwa UV-Stabilisatoren, Parfüm, Perlglanzmittel, Farbstoffe, Korrosionsinhibitoren, Konservierungsmittel, Bitterstoffe, organische Salze, Desinfektionsmittel, strukturgebende Polymere, Entschäumer, verkapselte Inhaltsstoffe (z.B. verkapseltes Parfüm), pH-Stellmittel sowie Hautgefühl-verbessernde oder pflegende Additive. Ein erfindungsgemäßes Mittel, insbesondere Wasch- oder Reinigungsmittel, enthält vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder (Gerüststoffe).
Zu den generell einsetzbaren Gerüststoffen zählen insbesondere die Aminocarbonsäuren und deren Salze, Zeolithe, Silikate, Carbonate, organische (Co)Builder und - wo keine ökologischen Vorurteile gegen ihren Einsatz bestehen - auch die Phosphate. Vorzugsweise sind die Mittel aber phosphatfrei.
Zu den wasserlöslichen organischen Buildersubstanzen gehören Polycarbonsäuren, insbesondere Citronensäure und Zuckersäuren, monomere und polymere Aminopolycarbonsäuren, insbesondere Methylglycindiessigsäure, Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure sowie
Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren, insbesondere Aminotris(methylenphosphonsäure), Ethylendiamintetrakis(methylenphosphonsäure) und 1-Hydroxyethan-1 ,1 -diphosphonsäure, polymere Hydroxyverbindungen wie Dextrin sowie polymere (Poly-)carbonsäuren, polymere Acrylsäuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität einpolymerisiert enthalten können. Geeignete, wenn auch weniger bevorzugte Verbindungen dieser Klasse sind Copolymere der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Vinylethern, wie Vinylmethylethern, Vinylester, Ethylen, Propylen und Styrol, in denen der Anteil der Säure mindestens 50 Gew.-% beträgt. Die organischen Buildersubstanzen können, insbesondere zur Herstellung flüssiger Mittel, in Form wässriger Lösungen, vorzugsweise in Form 30- bis 50-gewichtsprozentiger wässriger Lösungen eingesetzt werden. Alle genannten Säuren werden in der Regel in Form ihrer wasserlöslichen Salze, insbesondere ihre Alkalisalze, eingesetzt.
Organische Buildersubstanzen können, falls gewünscht, in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen, insbesondere wasserhaltigen, erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt. Erfindungsgemäße
Wäschenachbehandlungsmittel, wie z.B. Weichspüler, können gegebenenfalls auch frei von organischem Builder sein.
Als wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere Alkalisilikate und, falls keine Bedenken wegen ihres Einsatzes bestehen, auch Polyphosphate, vorzugsweise
Natriumtriphosphat, in Betracht. Als wasserunlösliche, wasserdispergierbare anorganische Buildermaterialien können insbesondere kristalline oder amorphe Alkalialumosilikate, falls gewünscht, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht über 40 Gew.-% und in flüssigen Mitteln insbesondere von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, eingesetzt werden. Unter diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität, insbesondere Zeolith A, P und
gegebenenfalls X, bevorzugt. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln eingesetzt. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen mit einer Korngröße über 30 μιη auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.- % aus Teilchen mit einer Größe unter 10 μιη.
Geeignete Substitute beziehungsweise Teilsubstitute für das genannte Alumosilikat sind kristalline Alkalisilikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können. Die in den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis von Alkalioxid zu S1O2 unter 0,95, insbesondere von 1 :1 ,1 bis 1 :12 auf und können amorph oder kristallin vorliegen. Bevorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere die amorphen Natriumsilikate, mit einem molaren Verhältnis Na20:Si02 von 1 :2 bis 12,8. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na2Six02x+i y H2O eingesetzt, in der x, das sogenannte Modul, eine Zahl von 1 ,9 bis 4 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Bevorzugte kristalline Schichtsilikate sind solche, bei denen x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl beta- als auch delta-Natriumdisilikate (Na2Si20s y H2O) bevorzugt. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch wasserfreie kristalline Alkalisilikate der obengenannten allgemeinen Formel, in der x eine Zahl von 1 ,9 bis 2,1 bedeutet, können in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul von 2 bis 3 eingesetzt, wie es aus Sand und Soda hergestellt werden kann. Kristalline Natriumsilikate mit einem Modul im Bereich von 1 ,9 bis 3,5 werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. Falls als zusätzliche Buildersubstanz auch Alkalialumosilikat, insbesondere Zeolith, vorhanden ist, beträgt das Gewichtsverhältnis Alumosilikat zu Silikat, jeweils bezogen auf wasserfreie Aktivsubstanzen, vorzugsweise 1 : 10 bis 10:1. In Mitteln, die sowohl amorphe als auch kristalline Alkalisilikate enthalten, beträgt das Gewichtsverhältnis von amorphem Alkalisilikat zu kristallinem Alkalisilikat vorzugsweise 1 :2 bis 2: 1 und insbesondere 1 :1 bis 2: 1.
Buildersubstanzen sind, falls gewünscht, in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen bis zu 60 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 40 Gew.-%, enthalten. Besonders bevorzugt sind in flüssigen Formulierungen wasserlösliche Builder. Erfindungsgemäße
Wäschenachbehandlungsmittel, wie z.B. Weichspüler, sind vorzugsweise frei von anorganischem Builder.
Polymere Verdickungsmittel im Sinne der vorliegenden Erfindung sind die als Polyelektrolyte verdickend wirkenden Polycarboxylate, vorzugsweise Homo- und Copolymerisate der Acrylsäure, insbesondere Acrylsäure-Copolymere wie Acrylsäure-Methacrylsäure-Copolymere, und die Polysaccharide, insbesondere Heteropolysaccharide, sowie andere übliche verdickende Polymere.
Geeignete Polysaccharide bzw. Heteropolysaccharide sind die Polysaccharidgummen, beispielsweise Gummi arabicum, Agar, Alginate, Carrageene und ihre Salze, Guar, Guaran, Tragacant, Gellan, Ramsan, Dextran oder Xanthan und ihre Derivate, z.B. propoxyliertes Guar, sowie ihre Mischungen. Andere Polysaccharidverdicker, wie Stärken oder Cellulosederivate, können alternativ, vorzugsweise aber zusätzlich zu einem Polysaccharidgummi eingesetzt werden, beispielsweise Stärken verschiedensten Ursprungs und Stärkederivate, z.B. Hydroxyethylstärke, Stärkephosphatester oder Stärkeacetate, oder Carboxymethylcellulose bzw. ihr Natriumsalz, Methyl-, Ethyl-, Hydroxyethyl-, Hydroxypropyl-, Hydroxypropyl-methyl- oder Hydroxyethyl-methyl- cellulose oder Celluloseacetat.
Als polymere Verdickungsmittel geeignete Acrylsäure-Polymere sind beispielsweise
hochmolekulare mit einem Polyalkenylpolyether, insbesondere einem Allylether von Saccharose, Pentaerythrit oder Propylen, vernetzte Homopolymere der Acrylsäure (INCI Carbomer), die auch als Carboxyvinylpolymere bezeichnet werden.
Besonders geeignete polymere Verdickungsmittel sind aber folgende Acrylsäure-Copolymere: (i) Copolymere von zwei oder mehr Monomeren aus der Gruppe der Acrylsäure, Methacrylsäure und ihrer einfachen, vorzugsweise mit Ci-4-Alkanolen gebildeten, Ester (INCI Acrylates Copolymer), zu denen etwa die Copolymere von Methacrylsäure, Butylacrylat und Methylmethacrylat (CAS 25035-69-2) oder von Butylacrylat und Methylmethacrylat (CAS 25852-37-3) gehören; (ii) vernetzte hochmolekulare Acrylsäurecopolymere, zu denen etwa die mit einem Allylether der Saccharose oder des Pentaerythrits vernetzten Copolymere von Cio-30-Alkylacrylaten mit einem oder mehreren Monomeren aus der Gruppe der Acrylsäure, Methacrylsäure und ihrer einfachen, vorzugsweise mit Ci-4-Alkanolen gebildeten, Ester (INCI Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer) gehören.
Der Gehalt an polymerem Verdickungsmittel beträgt üblicherweise nicht mehr als 8 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,1 und 7 Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 6 Gew.-%, insbesondere zwischen 1 und 5 Gew.-% und äußerst bevorzugt zwischen 1 ,5 und 4 Gew.-%, beispielsweise zwischen 2 und 2,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels.
Zur Stabilisierung des erfindungsgemäßen Mittels, insbesondere bei hohem Tensidgehalt, können ein oder mehrere Dicarbonsäuren und/oder deren Salze zugesetzt werden, insbesondere eine Zusammensetzung aus Na-Salzen der Adipin-, Bernstein- und Glutarsäure, wie sie z.B. unter dem Handelsnamen Sokalan® DSC erhältlich ist. Der Einsatz erfolgt hierbei vorteilhafterweise in Mengen von 0,1 bis 8 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 7 Gew.-%, insbesondere 1 ,3 bis 6 Gew.-% und besonders bevorzugt 2 bis 4 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Reinigungsmittels.
Kann jedoch auf deren Einsatz verzichtet werden, so ist das erfindungsgemäße Mittel
vorzugsweise frei von Dicarbonsäure(salze)n.
Die erfindungsgemäßen Waschmittel können mit Referenzwaschmitteln verglichen werden, um die erhöhte Anti-Pilling-Leistung der erfindungsgemäßen Mittel festzustellen. Ein solches
Waschsystem kann wie folgt zusammengesetzt sein (alle Angaben in Gewichts-Prozent):
Referenzmittel: Aniontensid 5-7%, Gerüststoff (z.B. Zitronensäure und Phosphonate) 0-1 %, Natronlauge 0-1 %, Palmkernölfettsäure 0-1 %, Glycerin 0-1 %, Natriumchlorid 1-3%, Borsäure 0- 1 %, weitere Zusätze (Konservierungsmittel, Entschäumer, opt. Aufheller, Farbstoff, Parfüm) 0-1 % und Rest demineralisiertes Wasser. Erfindungsgemäßes Mittel: Aniontensid 5-7%, Gerüststoff (z.B. Zitronensäure und Phosphonate) 0-1 %, Natronlauge 0-1 %, Palmkernölfettsäure 0-1 %, Glycerin 0- 1 %, Natriumchlorid 1-3%, Borsäure 0-1 %, weitere Zusätze (Konservierungsmittel, Entschäumer, opt. Aufheller, Farbstoff, Parfüm) 0-1 %, erfindungsgemäße Lipase 0,001 -0,1 % und Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9.
Die zuvor genannten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen erfindungsgemäßer Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Zu den festen Darreichungsformen des Mittels zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches. Alternativ kann das Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein, beispielsweise in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste.
Weiterhin kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in mehrere Komponenten aufgeteilt (Mehrkomponentensystem).
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Reinigung von Textilien, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet wird. ln verschieden Ausführungsformen zeichnet sich das oben beschriebene Verfahren dadurch aus, dass das erfindungsgemäße Mittel bei einer Temperatur von 0-100°C, bevorzugt 0-80°C, weiter bevorzugt 30-70 und am meisten bevorzugt bei 40-60 eingesetzt wird.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren bevorzugt sind. Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das
Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung oder Verdünnung dieses Mittels behandelt wird. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines erfindungsgemäßen Waschoder Reinigungsmittels bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.
Da Enzyme natürlicherweise bereits eine katalytische Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner und/oder der einzige Schritt eines solchen Verfahrens darin bestehen, dass als einzige reinigungsaktive Komponente eine Lipase mit der Anschmutzung in Kontakt gebracht wird, bevorzugt in einer Pufferlösung oder in Wasser. Dies stellt eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem
Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für
Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit synthetischen Bestandteilen bevorzugt.
Des Weiteren erfasst die Erfindung auch die Verwendung des hierin beschriebenen Mittels, beispielsweise als Wasch- oder Reinigungsmitteln wie oben beschrieben, zur (verbesserten) Entfernung von Anschmutzungen, beispielsweise von Textilien.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäßen Mittel und die Lipase beschrieben sind, sind auch auf die weiteren Erfindungsgegenstände anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für das vorstehende erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Verwendungen gilt. Beispiele
Beispiel 1 : Klonierung und Expression
In einem aktivitätsbasierten Screening wurden sieben Metagenomdatenbanken und insgesamt ca. 50.000 Klone durchmustert. Dabei konnten 13 Klone isoliert werden, die Aktivität auf mit Tributyrin versetzten LB-Agar-Platten aufwiesen. Außerdem wurde die Aktivität von 26 falsch-positiven Klonen nach mehrmaligen Überimpfungs- und Vereinzelungsschritten widerlegt. Die Plasmid-DNA konnte aus den 13 potentiell-positiven Klonen isoliert werden. Mittels enzymatischem Verdau wurde die ungefähre Insertionsgröße bestimmt. Die isolierte Plasmid-DNA wurde schrittweise sequenziert und ergab 10 verschiedene Open Reading Frames (ORF). Einer der ORF konnte einer Lipase aus Pseudomonas stützen (PsLip) zugeordnet werden.
Zur rekombinanten Expression der Ziellipase PsLip wurde das Gen in ein pET24a
Expressionsplasmid kloniert und in den Expressionsstamm E. coli BL21 (DE3) pLys transformiert. Es wurde eine 1 L Kultur angezogen. Die Induktion wurde mit 0, 1 mM IPTG eingeleitet und die Anzucht erfolgte bei 37°C für 24h. Anschließend wurden die Zellen per Ultraschall aufgeschlossen. Das erhaltene Rohextrakt wurde für einen Miniwaschversuch verwendet.
Beispiel 2: Waschtest
Es wurde ein Waschtest mit dem E.coli Rohextrakt durchgeführt, in dem die beschriebene Lipase exprimiert wurde.
Gewaschen wurde in einem gängigen Flüssigwaschmittel ohne Enzyme (Tabelle 1 ) bei 40°C in 16°dH Wasser über 1 h. Die Enzymkonzentration lag bei 0,32 μg Lipase / Milliliter Waschlauge, was einer üblichen Lipasekonzentration in Waschmitteln entspricht.
Tabelle 1 : Verwendete Waschmittelmatrix
Dies ist eine handelsübliche Waschmittelmatrix (ohne opt. Aufheller, Parfüm und Farbstoffe), die für den Waschtest verwendet wurde:
Chemischer Name Gew.-% Aktivsubstanz in
der
Formulierung
Aniontensid 5-7%
Niotensid 3-5%
Builder (Zitronensäure und Phosphonate) 0-1 %
Natronlauge 0-1 %
Palmkernölfettsäure 0-1 %
Glycerin 0-1 %
Natriumchlorid 1 -3% Borsäure 0-1 %
Propylengiykollaurat -
Weitere Zusätze (Konservierungsmittel, 0-1 %
Entschäumer, opt. Aufheller, Farbstoff, Parfüm)
Wasser Rest
Dosierung 4,7 g/L
Folgende Anschmutzungen wurden im Test verwendet:
1. wfk 20D Pigment/Talg Polyester/Baumwolle
2. CS 61 Rinderfett, gefärbt Baumwolle
Die einzelnen Gewebe wurden ausgestanzt (Durchmesser = 10 mm) und in einer Mikrotiterplatte vorgelegt. Die Waschlauge, mit einer Endkonzentration von 4,0 g/L, wurde auf 40°C vortemperiert. Anschließend wurden Lauge und Enzym auf die Anschmutzung geben und für 1 h bei 40°C und 600 rpm inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Anschmutzung mehrmals mit klarem Wasser gespült, getrocknet und die Helligkeit mit einem Farbmessgerät bestimmt.
Je heller das Gewebe wird, desto besser ist die Reinigungsleistung. Gemessen wird hier der L- Wert = Helligkeit, je höher desto heller. Die Helligkeitswerte der Testansätze sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Probe 1 : Waschmittel ohne Lipase
Probe 2: Waschmittel mit PsLip
Tabelle 2: Ergebnisse
Es wird deutlich, dass die erfindungsgemäße Lipase auf allen drei Anschmutzungen eine gute Waschleistung zeigt. Von einer signifikanten Leistungsverbesserung spricht man schon ab 1 Einheit, hier wurden bis zu 7,7 Einheiten Verbesserung erzielt.

Claims

Patentansprüche
1 . Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Lipase enthält, die mindestens 65 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
2. Das Mittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lipase eine
Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,8%, 99,0%, 99,2%, 99,4% oder 99,6% identisch ist.
3. Das Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
(1 ) die Lipase aus einer Lipase nach Anspruch 1 oder 2 als Ausgangsmolekül durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution erhältlich ist; und/oder
(2) die Lipase aus einer Lipase nach Anspruch 1 oder 2 als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 182, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 245, 250, 260, 270, 271 , 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279 oder 280 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
4. Das Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Lipase in einer Menge von 0,00001 - 1 Gew.-%, bevorzugt in einer Menge von 0,0001 - 0,5 Gew.-%, besonders bevorzugt in einer Menge von 0,001 - 0,1 Gew.-% in dem Mittel enthalten ist.
5. Das Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass
a. es mindestens einen zusätzlichen Inhaltsstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tensiden, Buildern (Gerüststoffe), Bleichmitteln, Bleichaktivatoren, wassermischbare organische Lösungsmittel, weitere Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren, optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren, Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthält; und/oder
b. es in fester oder flüssiger, bevorzugt flüssiger, Form vorliegt.
6. Verfahren zur Reinigung von Textilien, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5 angewendet wird.
7. Verwendung eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Entfernung von fetthaltigen Anschmutzungen, insbesondere auf Textilien.
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