EP3177927A1 - Procédé de production d'une phase de capture pour la détection d'une cible biologique, procédés et kits de détection associes - Google Patents

Procédé de production d'une phase de capture pour la détection d'une cible biologique, procédés et kits de détection associes

Info

Publication number
EP3177927A1
EP3177927A1 EP15766894.8A EP15766894A EP3177927A1 EP 3177927 A1 EP3177927 A1 EP 3177927A1 EP 15766894 A EP15766894 A EP 15766894A EP 3177927 A1 EP3177927 A1 EP 3177927A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
biological
polymer
ligand
capture phase
micelles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP15766894.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Laure Allard
Thomas Trimaille
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Biomerieux SA
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Aix Marseille Universite, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP3177927A1 publication Critical patent/EP3177927A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/586—Liposomes, microcapsules or cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the invention relates to the technical field of detection of biological targets "Specifically, the invention has for an object a new process for the production of capture phases for the detection of s a biological target in a biological sample, and methods of detection and corresponding detection kits.
  • the application WO 98/47000 describes a method for detecting a target biological material contained in a sample, according to which a capture phase is available, said target biological material is brought into contact with at least the phase capture, and detects the capture phase-target biological material complex.
  • Said method is characterized in that the capture phase is in microparticulate or linear form and is constituted by at least a first particulate or linear polymer, with an apparent hydrophilic character and first compiexan groups, the latter being bound by coordination to a first transition metal, which is itself bound to a first biological ligand, capable of specifically recognizing the target biological material.
  • Such a capture phase is proposed to optimize the attachment of the material thereon, while decreasing or eliminating any secondary adsorption reaction dudlt material on said capture phase.
  • this document proposes the use of a particulate or linear hydrophilic polymer, and in particular a polymer functionalized product obtained by polymerization of a water-soluble monomer, acrylamide, an acryfamide derivative, methacrylamide or a methacrylamide derivative, at least one reaculatton agent and at least one monomer functional the monomer water-soluble is preferably selected from H-isopropylacrylamide, N-ethyl methacrylamide, propylene glycol, N-propyl methacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, ydoprapylacrylamide, diethylacrylamide, methyl; -.
  • ⁇ f isopropylacrylamide N-methyl-Nn propylacryiamide
  • the monomer preferably being N isopropylacrylamlde (IPAH) and the functional monomer is ,, preferably selected from carboxylic acids, optionally nitrogen, itaconic acid, acrylic derivatives and methacrylic derivatives.
  • a particulate polymer of the poly (N-isopropylacrylamide) (PN) type comprising complexing groups derived from itaconic acid or maleic anhydride- ⁇ -methylvinylether is used.
  • the application WO 98/59241 proposes to use a capture and / or detection phase which comprises an organic molecule; having at least one reactive function and at least one protein material capable of recognizing or binding specifically and directly or indirectly to the target biological material, said protein material having a specific covalent binding site to the reactive function of the organic molecule, which consists of at least one tag comprising at least six lysine residues or lysine derivative, contiguous, the capture phase is advantageously f immobilized on a solid support by passive or covalent adsorption, the organic molecule may especially be a polymer, particulate or linear, homopolymers such as polylysine, polytyrosine, copolymers such as maleic anhydride copolymers, N-vinylpyrrolidone copolymers, and in particular the maleic anhydride copolymer / methyl-vinyl-stirrup the copolymer M ⁇ vinvI-pyrrolidone / IM-acryloxysuce
  • HVE 65 poly (methylvinyl ether / malic anhydride), PEAM 86 poly (maleic anhydride anhydride), SAM 49 poly (styrene / malic anhydride) and NVPAM 3 ⁇ poly (-vinypyrrolidone / malic anhydride),
  • WO 03/044533 proposes a method for obtaining a capture phase of a target biological material, comprising a modified protein of interest, capable of specifically binding, directly or indirectly, to said target biological material and immobilized on an immobilization phase comprising reactive groups, in which at least two different peptide sequences, comprising the peptldic sequence of the protein of interest, and one comprising a succession of at least six lysine residues at its N-terminal end; and a succession of at least six residues bistidlne at its C-terminal end,! !
  • phase of immoblilsation corresponds to a polymer, which is then itself immobilized on a solid support.
  • a poly (methyl vinyl ether-maleic anhydride) amve 57 is used.
  • the polymer Since the polymer is not hydrosolubized, it is necessary to dissolve it in anhydrous DMSO (dlmethylsulfoxide) prior to the coupling reaction, carried out in a 95% aqueous medium with the partner protein of the biological target to be detected.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the capture phases retain the biological activity of the immobilized or coupled biological ligand, after purification and immobilization or coupling, so that the latter can then interact properly with the biological target to detect and enable reliable detection.
  • the capture phase comprises an immobilized protein
  • immobilization of the proteins on the capture phase carried out at least partly in organic solvent, as is the case in the application WO 01/92361
  • the invention proposes to modify the capture phases used in the detection methods, in particular by developing a new preparation process, in order to increase the detection sensitivity.
  • a method is proposed in which the coupling of the biological ligand to the polymer can be carried out in an essentially aqueous solution.
  • the invention relates to a process for preparing a capture phase for the detection and / or quantification of a target biological entity, said capture phase comprising a biological ligand for the biological entity, said biological ligand being bound so Covendinge an amphiphilic polymer and being immobilized on a solid support, characterized in that the biological ligand is immobilized on the solid support, by contacting the support: solid with a dispersion of micelles formed of a plurality of chains of the amphiphilic polymer said micelles being surface carriers of a plurality of molecules of the biological IgGand.
  • the amphiphilic polymer has a hydrophobic part oriented towards the heart of the micelles and a hydrophilic part on the surface of the micelles, the biological ligand being covalently coupled to the hydrophilic part.
  • the immobilization is carried out in a solvent or solvent mixture consisting of at least 90% by weight, preferably at least 95% by weight, and even more preferably at less than 99% by weight of water.
  • This solvent or solvent mixture equal to that present in the micelle dispersion used for the immobilization, immobilization
  • Such aqueous phase avoids the denaturation of biological iigand as compared to processes of the prior art that use an asset in an aqueous phase / organic phase mixture, with a high proportion of organic phase,
  • amphiphilic polymer concentration of 50 to 500 ⁇ g / ml will, for example, be used when the micelles are brought into contact with the ⁇ support. This concentration will correspond to the concentration of the micelle dispersion used.
  • the polymer after immobilization, the polymer remains, at least in part, in the form of micelles, such that micelles formed of a plurality of chains of the ampullated polymer, the micelles being surface-bearing. a plurality of molecules of the biological ligand covalently bonded to the amphiphite polymer, soot immobilized on the surface of the support.
  • the concentration of amphotile polymer during contacting with the support must be greater than the critical micelle concentration (CMC) of the polymer, so as to maintain the micellar state.
  • CMC critical micelle concentration
  • the method according to the invention may comprise a coupling step send between the biological ligand and the polymer amp lphile performed while the polymer is in the form of micelles., So as to form the surface-bearing micelles of a plurality of biological Iigand molecules.
  • the coupling is advantageously carried out in a solvent or solvent mixture consisting of at least 90% by weight, preferably at least 95% by weight, and even more preferably at least 99% by weight. % by mass of water.
  • a solvent or solvent mixture consisting of at least 90% by weight, preferably at least 95% by weight, and even more preferably at least 99% by weight. % by mass of water.
  • the coupling is carried out with an ampiphile polymer concentration at least 10 times greater than that used when the micelles are brought into contact with the support, in order to promote the coupling efficiency, to guarantee the preservation of the state. micellar during this coupling (and thus allow an orientation of this coupling to the outer portion of the hydrophilic crown), Such a concentration makes it possible to promote the preservation of the micelle shape during coupling and then during immobilization.
  • an amphiphilic polymer concentration of 0.5 to 5 mg / ml during the covalent coupling step between the biological ligand. ?
  • the coupling of the biological figand is carried out in such a way as to obtain micelles with the hydrophilic part of the polymer oriented towards the surface of the micelles, covalently coupled to the biological ligand.
  • the polymer remains, at least in part, in the form of micelles, so that micelles formed of a plurality of chains of the amphiphilic polymer, are immobilized on the surface of the carrier lesdltes micelles being carriers at the surface of a plurality of molecules of the biological ligand covalently bound to the amphiphilic polymer.
  • the micelles is finally immobilized by adsorption on the solid support by means of a biological interaction / solid support interaction, a portion of the micelles possibly being immobilized by adsorption on the solid support by via a polymer / solid support interaction, the interactions involved possibly being electrostatic or ionic bonds, or hydropole interactions,
  • part of the biological ligands is free, in particular is not bound to the support.
  • a coupling step will be carried out with a polymer concentration corresponding to at least 50 times, preferably at least 200 times the critical mass concentration of the polymer.
  • the amphiphilic polymer is preferably a linear block polymer comprising at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block, the hydrophilic block being positioned at the surface of the micelles, and being covalently bonding carrier of at least one molecule of the biological ligand.
  • the method will be implemented with one or other of the following features, any combination of the following features, or all of the following features;
  • the average density of biological ligand molecules per polymer chain is from 0.1 to 100, and in particular from 1 to 100, the average density of ligand molecules per polymer chain can be deduced from the determination of the residual reactive functions of the ligand involved in the coupling;
  • the micelles in the dispersion and / or micelles finally immobilized on the support are formed from 100 to 5000 d chains of polymers and / or carry 10 to 500 000 molecules of biological ligand.
  • the dispersion of micelles has a polydispersity index of
  • amphiphilic polymer has a molar mass greater than 5000 g / mol, preferably greater than 10,000 g / mol;
  • the biological ligand is an antigen, a hapten, or a protein
  • the amphiphilic polymer comprises, or even consists exclusively of, a first linear block consisting of a hydrophobic homopolymer resulting from the polymerization of a hydrophobic monomer; a second linear block consisting of a hydrophilic copolymer resulting from the copolymerisatson of a monomer B bearing a reactive function X and a hydrophilic monomer C not carrying a reactive function, said second block being bonded to one end of the first block eovalently; in this case preferably;
  • the monomer est is chosen from the hydrophobic derivatives of niethacrylate, acrylate, acrylamide, methacrylamide, acetates, or from styrene and its derivatives and is preferably n-butyl acrylate, ertiobutyl acrylate, tert-butyl acrylamide, ⁇ -dichloride scryfamide, laetide, lactlde-co-glycolide or styrene and / or the monomer 8 is chosen from functional derivatives of aerylate, methacrylate, acrylamide or methacrylamide, styrene functional derivatives, and is preferably N-acryloxy sucdinimide, N-methacryloxy succine, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-aminoethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-aminoethyl acrylate or 1,2,2,4-di-O-isopropylidene-6-O-
  • the monomer S is carrying a reactive functional group X chosen from the functional groups -NH3 ⁇ 4 -CQOH, -OH, -SH, OOCH, ester, C, sulfhydryl, disulfide, hydrazine, hydrazone, azide, isocyanate, isothiocyanate, alkoxyamine, aldehyde, epoxy, nielle, maleimetal / haloalkyl, nalelmide ,.
  • a reactive functional group X chosen from the functional groups -NH3 ⁇ 4 -CQOH, -OH, -SH, OOCH, ester, C, sulfhydryl, disulfide, hydrazine, hydrazone, azide, isocyanate, isothiocyanate, alkoxyamine, aldehyde, epoxy, nielle, maleimetal / haloalkyl, nalelmide ,.
  • an activating agent such as carbodiimides, and in particular an activated carboxylic acid in the form of an ester of H-hydroxysuccinimide, pentahlorophenyl, trichlorophéoyl, p-nitrophényle, cartayphenyl, or among the compounds homo- or heterobifunctional;
  • the monomer C is chosen from hydrophilic derivatives of acrylamide, methacrylamide and ⁇ -methylpyrrolidone; and preferably the oxyethylene, the monomer is N-vinylpyrrolidone or H-acryloylpropylene; the first block has a molar mass of between 1000 and 250 000 g / mol;
  • the second block has a molar mass greater than 1000 g / mol and, preferably, greater than 2000 g / mol; the second block is a statistical copolymer, the composition of which, expressed by the ratio of the amounts of monomers in mol, amount of monomer, to amount of monomer B, preferably belongs to the range from 1 to 10, preferably from 1.5 to 4.
  • the invention also relates to a capture phase of a target biological entity, characterized in that it comprises micelles immobilized on a solid support, said micelles being formed of a plurality of chains of an amphiphilic polymer, and said micelles being surface-bearing of a plurality of molecules of at least one biological ligand for the target biological entity, said molecules of the biological ligand being covalently bound to the chains of the amphiphilic polymer.
  • the capture phase according to the invention will have one or other of the following characteristics, any combination of the following characteristics, or all of the following characteristics:
  • the micelles are immobilized by adsorption on the solid support
  • the micelles are immobilized by adsorption on the solid support by means of a biological ligand / solid support interaction, a portion of the micelles possibly being immobilized by adsorption on the solid support via a polymer interaction.
  • solid support the interactions involved being in particular electrostatic bonds or it ionic, or hydrophobic interactions; however, even if a portion of the biological ligands immobilized to the support surface ,, intervenes to allow the immobilization of mi ⁇ lies on the solid support, part of the biological ligands is free, in particular is not bound to the support; a part of the biological ligands, corresponding in particular to at least 50% of the biological ligands present on the capture phase, remains accessible and will be available to interact and bind with a target biological entity, to allow capture of the latter when the capture phase will be used in a detection method; C 'is why the support on which the micelles are immobilized is referred to as capture phase;
  • the micelles immobilized on the support are formed from 100 to 5000 polymer chains and / or carry 10 to 500 000 biological ligand molecules
  • the amphipile polymer has a hydrophobic portion oriented to the heart of the micelles and a hydrophilic part on the surface of the micelles, the biological ligand being covalently coupled to the hydrophilic part,
  • the amphiphilic polymer is a linear block polymer comprising at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block, the hydrophilic block being positioned on the surface of the micelles, and being covalently bonded, at least one molecule of the biological ligand
  • amphiphilic polymer has a molar mass greater than 5,000 g / mol, preferably greater than 10,000 g / mol;
  • the amphiphilic polymer includes, or even consists exclusively of, a first linear block consisting of a hydrophobic homopolymer resulting from the polymerization of a hydrophobic monomer A; a second linear block consisting of a hydrophilic copolymer resulting from the copolymerization of a monomer 8 bearing a reactive function X and a hydrophilic monomer C having no reactive function, said second block being bonded to one end of the first block covalently; the monomers A, B, C and the reactive functional groups K f and the blocks are preferably as defined previously in the context of the process;
  • the biological ligsnd is an antigen, a hapten, or a protein.
  • the invention also relates to a device for detecting and / or quantifying a target biological entity comprising a capture phase according to the invention and at least one tracer for detection.
  • Linvenrion also relates to a device for detecting and / or quantifying a target biological entity, comprising a capture phase obtained according to the method of the invention and at least one tracer for detection.
  • the invention also relates to a kit for detecting and / or quantifying a target biological entity comprising;
  • a dispersion in aqueous solution of micelles formed of chains of an amphiphilic polymer, bearing at the surface of a plurality of molecules of at least one biological figure for the target biological entity, said biological ligand molecules being covalently bonded the chains of the amphiphilic polymer;
  • the dispersion and the solid support will preferably have the same characteristics as those in the present description in connection with the method of preparing the capture phase.
  • the subject of the invention is also a method for detecting and / or quantifying in vitro a biological target entity in a biological sample, according to which a capture phase according to the invention is available.
  • said biological sample with at least the capture phase, and detecting and / or quantifying said target biological entity attached to the capture phase, after binding of the biological entity in a biological ligand molecule covalently bonded channels of the amphiphilic polymer of the capture phase.
  • Another subject of the invention is a method for the in vitro detection and / or quantification of a target biological entity in a biological sample, according to which: a capture phase obtained according to the process according to the invention is available; contacting said biological sample with at least the capture plasmid thus obtained, and detecting and / or quantifying said fixed biological entity on the capture phase, after binding of the biological entity to a biological ligand molecule bound to covalently to the chains of the amphiphilic polymer of the capture phase,
  • the invention also relates to a process for the in vitro detection and / or quantification of a target biological entity in a biological sample, in which: a capture phase is prepared according to the method of the invention. in contact with said biological sample with at least the capture phase thus prepared, and said target biological entity fixed on the capture phase is detected and / or quantified after binding of the biological entity to a biological ligand molecule bound in a covalently to the chains of the amphiphilic polymer of the capture base.
  • Such detection and / or quantification methods may be a direct method, in which the sample, which may contain the target biological entity, is brought into contact with the capture phase and the bond between the biological ligand immobilized on the support and the target biological entity is highlighted by the presence of a tracer.
  • the tracer is in particular a biological ligand of the target biological entity coupled to a marker.
  • Sandwich immunoassays also called immunometric, are the most commonly used formats.
  • Such detection and / or quantification methods may be an indirect method in which the sample likely to contain the target biological entity is brought into contact with the capture phase, in the presence of a biological entity analogue. and binding between the immobilized biological ligand on the capture medium and the target biological entity is: evidenced by the presence of a tracer, indirectly by detection of the binding between the immobilized biological ligand on the support and the analogue of the target biological entity.
  • the tracer is in particular the analogue of the target biological entity coupled to a marker.
  • Immunoassays in competition are the formats that will be the most conventionally used.
  • the label is, for example, selected from enzymes, chromophores, radioactive molecules, fluorescent molecules and electrochemiluminescent salts.
  • micelle formed of a plurality of channels of an amphiphilic polymer f is meant an assembly in a spheroidal form chains of an amphiphilic polymer including a hydrophilic part forms ia ring (facing the aqueous solution in which the micelles are located), and a hydrophobic portion forms the heart, as schematically illustrated in FIG.
  • An amphiphilic polymer will self-assemble in this form, therefore, it is in aqueous solution at a concentration greater than a characteristic concentration of said polymer, called critical micellar concentration.
  • the micelles are characterized by their hydrodynamic diameter. The latter is calculated from the hydrodynamic radius measured by the technique of dynamic diffusion of the light.
  • the hydrodynamic radius is the radius of a theoretical sphere that would have the coefficient of diffusion that the particle considered.
  • the miceiies generally have a hydrodynamic diameter of 50 to 200 nm, preferably 50 to 150 nm.
  • the hydrodynamic diameter of the micelles can be measured in a dispersion of 50 ⁇ g / ml of polymer in an aqueous solution of 1 mM NaQ, for example, using a Zetasizer ano ⁇ S90 (a! Vern, UK) device.
  • this polydispersity (defined as the square of the ratio of the standard deviation on the hydrodynamic diameter determined by the same apparatus), representative of the distribution width in a range, is typically less than 0.2 and the most often less than 0.1 ? characteristic of the narrow size distribution of such micelia.
  • amphiphilic polymer is meant a polymer which has both a hydrophilic part or block and a hydrophobic part or block.
  • the amphiphilic character of the polymer is characterized, in aqueous solution and above a concentration called critical critical concentration (CMC), by its aggregation in the form of micelia, this process making it possible to reduce the free energy of the system.
  • CMC critical critical concentration
  • the amphiphilic polymer chains will preferably be linear and unbranched so as to promote their assembly in the form of micelia.
  • An amphiphilic polymer that can be used in the context of the invention is a copolymer consisting of at least two linear blocks, at least one globally hydrophobic block and at least one generally hydrophilic block.
  • each monomer In a linear block, each monomer, with the exception of the two end monomers, is bonded to two other monomers, flanking said monomer along the chain.
  • One of the ends of the overall hydrophobic block is covalently bonded to one end of the generally hydrophilic block.
  • copolymer unless that! otherwise specified, must be understood as a polymer formed by at least two monomers, the term copolymer covers both random copolymers, block or alternating polymers,
  • Such a polymer may comprise a first amphiphiie b! Oc hydrophobic, in the form of a hydrophobic homopolymer that is to say comprising a concatenation of a single monomer A hydrophobic.
  • Such an amphiphilic polymer may comprise a second bioe bringing its hydrophilic component to the polymer, in the form of a copolymer consisting of two monomers: a first monomer bringing hydrophilicity, in order to promote a maximum deployment of the second block in aqueous phase, and another monomer B providing a reactive function X, in order to perform the covatent coupling of the biological ligand.
  • this second block is a random copolymer and will advantageously have a sufficient number of reactive functions close to the end of the hydrophilic block not bound to the hydrophobic block (i.e., in the midle, the end deployed to the solution), to ensure adequate presentation / accessibility of the ligand after coupling, in the solution, for increased recognition efficiency.
  • the second block may also consist of a single non-functional monomer, of which only the monomer located at the end of the chain (on the end not bound to the hydrophobic block) will be functionalized. This is the case, for example, of a hydrophilic polyethylene glycol block PEG (monomer unit -CHrCHi-Q- non-functional) whose hydroxyl chain end can be exploited for conjugation to ligands.
  • At least 1 reactive function K f and preferably from 1 to 100 reactive functions X are present per amphiphilic polymer chain,
  • the second block of the amphiphilic polymer will preferably be a random copolymer (in which the monomer units B and C are statistically distributed along the macromolecular chain) or an alternating copolymer (in which the monomers B and C follow one another. 1? regularly according to a general structure (B €) n in which n is an integer).
  • copolymers can be obtained by reaction of polycondensatlon. or by free-radical ionic polymerization, or by group transfer, advantageously by living radical polymerization such as reversible termination polymerization (nitroxide-controlled polymerization, NMP), atom transfer polymerization (ATRP), and preferably reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization, called RAPT (see WO 98/01478).
  • NMP reversible termination polymerization
  • ATRP atom transfer polymerization
  • RAPT reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization
  • hydrophobic monomer is meant a monomer whose homopolymer has in the aqueous phase a compact ball structure, corresponding to a Hark Houwink-Sakurada coefficient (form factor) of less than 0.8.
  • hydrophilic monomer is meant a monomer whose homopolymer has in the aqueous phase a deployed structure, corresponding to a Mark-Houwink Sakurada coefficient greater than 0.8.
  • biological ligand is meant a biological entity capable of recognizing or binding to the target biological entity.
  • the biological ligand is therefore a binding partner for the target biological entity as exemplary of such biological ligands.
  • a protélque glycoprotéiqu material or such as an antigen, a hapten, an antibody, a protein, a oanofitine, a peptide "an enzyme, u sugar and fragments thereof, a lectin..; but also a nucleic material such as a nucleic acid (DNA or AN), a nucleic acid fragment, a probe or a primer.
  • the invention is particularly suitable for biological ligands chosen from antigens, haptens and proteins.
  • target biological entity refers to a biological material of interest
  • biological material of interest examples include antibodies, receptors ,, , haptens antigens, proteins, peptldes” the enzymes, sugars, nucleic acids.
  • Antibodies acting as a biological ligand for the target biological entity are polyclonal or monoclonal antibodies.
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunizing an animai with, as an immunogen, the biological entity target "a fragment thereof or a close equivalent in terms structurai, followed by recovery of the desired antibodies in purified form" by collection of the serum from the animal, and separation of said antibodies from the other components of the serum, in particular by affinity chromatography on a column, on which is fixed an antigen specifically recognized by the antibodies, especially immunogen.
  • the monoclonal antibodies can be obtained by the hybridoma technique, widely known to those skilled in the art.
  • the monoclonal antibodies can also be recombinant antibodies obtained by genetic engineering, by techniques well known to those skilled in the art.
  • antibody fragments As examples of antibody fragments, mention may be made of Fab Fab f! f F (ab ! ) 2 as well as the chains scFv (of the English “Single chain variable fragment”), dsFv (of the English “Doubie-stranded variable fragment”), These functional fragments can in particular be obtained by genetic engineering .
  • Nanofitins are small proteins that, like antibodies, are able to bind to a biological target that can detect, capture, or simply target within an organism.
  • hapten refers to non-immunogenic compounds, i.e., incapable by themselves of promoting an immune reaction by production of antibodies, but capable of being recognized by antibodies obtained by immunization of animals. under known conditions, in particular, by immunization with a hapten-protein conjugate, these compounds generally have a molecular weight of less than 3000 Da, and most often less than 2000 Da and may be, for example, glycosylated peptides. meta olites, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins or various drugs, nucleosides and nudeotides.
  • lectin refers to proteins that bind specifically and reversibly to certain sugars. They play a major role in (Immunity, recognizing the specific carbohydrates of some pathogenic infectious agents, eg a lectin is Concanavalin A (HA), which is responsible among others for the s hémagglut! Nafion,
  • HA Concanavalin A
  • the biological ligands used may or may not be specific to the target biological entity. They are said to be specific when they are able to bind exclusively or almost exclusively to the target biological entity. They are said to be nonspecific when the binding selectivity to the target biological entity is low and they are then able to bind to other biological entities such as other proteins or antibodies. In general, it will be preferred to use a biological ligand specific for the target biological entity.
  • the biological ligand behaving as a binding partner for the target biological entity is chosen according to the target biological entity that is to be detected:
  • the biological ligand is an antigen that recognizes said antibody, preferably specifically;
  • the target biological entity is an antigen
  • the biological ligand is an antibody that recognizes the antigen, preferably specifically
  • the biological ligand is a protein which binds to said receptor, preferably specifically;
  • the biological ligand is an antibody or a protein that recognizes said hapten, preferably specifically.
  • the invention is particularly suited to cases where the biological ligand is an antigen, a hapten, or a protein.
  • reactive function present, on the one hand, on the polymer and on the other hand, on the biologic ligand.
  • Such reactive functions X are chosen, by way of example, from ester, halogenocardony, sulfhydrite, disulfide, amine (MHz), carboxylic acid (COOH), hydrazine, hydrazone, azide, isocyanate, isothiocyanate, alkoxyamine, aldehyde groups.
  • an activated carboxylic acid in the form of an ester of N-hydraxystrcimide, pentachlorophenyl, trichlorophenyl, p-nitrophenite or arboxyphenyl.
  • the reactive function (s) present on the biological ligand and allowing to form a slow cove bond between the micelle polymer and the biological ligand may exist naturally on the biologic ligand.
  • amines borne by the side chain of lysine can be used for coupling.
  • the reactive functions must be "Introduced" previously for example in the form of a tag, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • a tag may be defined as an amino acid sequence.
  • the biological ligand is a proteinaceous material
  • a tag comprising six lysine or lysine derivative residues, or more and, optionally, other amino acids
  • tags may be anywhere in the protein
  • the tag will be located at its end-or C-terminus ale.
  • a polynucleotide is synthesized by a solid support chemical method having a reactive function at any point in the chain, such as, for example, the 5 'end . or the 3 'end or on a base or on an internucleotide phosphate or on position 2 !
  • a primary amine function can be coupled to an activated carboxylic acid, especially N-hydroxy succinimide or an aldehyde; an alkoxyamine function with a ketone or an aldehyde; a hydrazine function with an aldehyde; or else a thiol function on a haloalkyl or a maleimide.
  • the micelles will carry, on average, 10 to 500,000 molecules of biological ligand depending on their molecular weight and nature.
  • the micelles of polylactide ⁇ b "PGly copolymer ( ⁇ vinylpyrrolidone ⁇ co ⁇ - acryloxysuednlmide) ⁇ PLA ⁇ hF (VP ⁇ co-MAS)) used in the examples which follow (including a chain comprises in 80 reactive functions of the N-hydroxy succyrimide ester type), it was possible to couple (in PBS pH 7.4) approximately 7500 p24 proteins per micelle (molar mass p24: 24000 g / mol), or approximately one protein per chain.
  • This number of ligands can be determined from the residual amino function assay of the ligand after the coupling reaction (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid or fluorescamine assay method) and can be supplemented with a gel SDS-PGE in the case of protein coupling, of course, since most of the time the polymer chains will carry several reactive functions, several molecules of biological ligand may therefore be attached to a polymer chain, thus multiplying the number of biological ligand molecules fixed by micelle,
  • the coupling is carried out on the copolyoid micelies, the ligand binding on the end of the hydrophilic block, strongly deployed in solution, is favored, thus facilitating its future recognition by the target.
  • the coupling of the ligand will be the same. more efficient than the number of reactive functions on the hydrophilic block (particularly on its outermost part deployed in solution) will be high.
  • the micellar state of the polymer during the coupling of the ligand makes it possible to orient the ligand to the hydrophilic end of the polymer, and thus to promote its accessibility in solution.
  • controlled polymerization techniques will be used for the preparation of the polymers, such as the polymerization controlled by nitroxides, MNP, atom transfer polymerization (ATRP), radical polymerization by reversible chain transfer by addition / fragmentation (RAPT) or ionic polymerization.
  • the copolymer is obtained in two stages.
  • the first hydrophobic block ⁇ ! ⁇ (0.1-lactide) is obtained by ring opening polymerization of a monomer D, t-lactide, functionalized at the end of the chain by a nitroxide fragment 561, capable of initiating the NMP copolymerization of the pair of monomers I-vinyl-pyrrolidone (VP, hydrophilic monomer) and N-acryloxysuccinimide (NAS, functional monomer, carrying hydroxyl succinic acid ester functions
  • VP polyvinyl-pyrrolidone
  • NAS N-acryloxysuccinimide
  • miceiles from amphiphilic polymer can be done according to any known technique.
  • the common solvent method the most widely used, is described below (G. Riess., Prog, Polym., Sci. 1107-1170. (2003) ⁇ .
  • the polymer will be dissolved in a solvent, most often organic, which solubilizes both the hydrophobic part and the hydrophilic part of the polymer, so as to obtain the sterilization of the polymer.
  • One such solvent may be chosen from those miscible with water (acetone, acetonitrile, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran (THF) or dimethylsulfoxide (DMSO)) and will be selected according to the nature of the amphophilic copolymer . Water is then added, leading to the formation of the miceiles, and then the initial solvent is removed by evaporation under reduced pressure (in the case of sufficiently volatile solvent (s), acetone type, acetonitrile, THF ) or dialysis against water (in the case of solvent (s) more "heavy (s)", type DMSO).
  • the copolymer concentration range in the organic solvent is ⁇ to 15 mg / ml and the organic solvent / water volume ratios are 1 to 0.2.
  • Such a technique is described in the case of a polymer of the polylacid-b type " poly ⁇ -vinylpyrrolidone ⁇ co- ⁇ acryloxysuccinimide) ⁇ , LA- -P ⁇ A5 ⁇ co-VP) ⁇ f in the publication N. Handké et al. Macromol. Biosci, 13, 1213-1220 (2013) ,. to which we can refer for more details.
  • miceiles Pourron Other well known methods for preparing miceiles Pourron be used, in particular, the dialysis method of placing the copolymer in solution in a common solvent in a dialysis device, and performing dialysis against water.
  • the method of direct dissolution of the copolymer in water may also be used in the case of copolymers having a high hydrophilic balance / hydrophere.
  • the solid support may be in any suitable form such as a plate, a cone, a ball, the ball being optionally radioactive, fluorescent, magnetic and / or conductive, a bar, a glass tube, a well , a sheet, a chip, a micro-titration plate or the like.
  • the support is in the form of beads, these have, most often, a diameter ranging from one hundred micrometers to the nanometer.
  • the support material is preferably selected from latices, polystyrenes, copolymers styrene-butadiene; stene-butadiene copolymers in admixture with one or more polystyrenes, polypropylene, polycarbonates, polystyrene-acrylonitrile copolymers, methyl styrene-methyl methacrylate copolymers among synthetic and natural fibers; among the polysaccharides and drifts of cellulose; among glass, silicon and their derivatives.
  • the micelle-biological ligand conjugate will be immobilized on the solid support, by any appropriate means, most often by adsorpdon. Such immobilization can be carried out by "passive" absorption on the solid phase, in particular by means of hydrophobic, electrostatic, Van der Waals or hydrogen bond interactions, the relative contribution of which will depend on the nature of the amphiphilic polymer, the ligand coupled and solid support dlmmoNilsation.
  • the same conditions as those applied, and conventionally used by those skilled in the art, for the immobilization of a biological ligand on a solid support can be implemented. In particular, a dispersion of the micelia carrying biological ligands can be deposited in a buffered aqueous solution.
  • the buffered aqueous solution will be formed of a solvent or mixture of solvents consisting of at least 90% by weight, preferably at least 95% by weight, and still more preferably at least 99% by weight water.
  • Buffers conventionally used in the field of diagnosis may be implemented, so as to obtain and stabilize the pH in the desired range depending on the nature of the biological ligand. It is possible, for example., Using a PBS buffer (phosphate buffered saline ⁇ or tris (tris hydroxyméthylaminomé hane). In the copolymer concentrations used in excess of the CMC polymer., It is reasonable to estimate that i f adsorpt!
  • micellar state is very generally preserved on the support, as shown by most studies of visualization of micelles by electron microscopes and / or atomic force microscopes, which require a deposition on support (Cho et ai, 3 Am Chem Soc, 128, 9935-9942 (2006)). ), Gensel et al, Soft Matter, 7, 11144 (2011)).
  • the micelles are still formed and are immobilized on the support, mainly by support-ligand interactions, and to a lesser extent potentially by support-polymer interactions as shown in FIG.
  • the capture phases described or obtained in the context of the invention may be used for the purpose of detecting and / or assaying and / or purifying a target biological entity.
  • the user can directly dispose of the solid support on which the combined organic micelie-ligands is immobilized or kit comprising a solid support and a dispersion of the organic micelle-llgands conjugates described in the context of the invention in an aqueous solution,
  • the aqueous solution will advantageously consist of a solvent or solvent mixture consisting of at least 90% by weight, preferably at least 95% by weight, and even more preferably at least 99% by weight of water.
  • it will be a buffered aqueous solution, as described previously,
  • the capture phases described or obtained in the context of the invention may be implemented in any technique for detecting and / or quantifying a target biological entity in a biological sample.
  • Quantification means that the concentration of the present biological entity is determined.
  • biological sample is meant any animal biological sample, preferably human, likely to contain a biological entity of interest. These samples are widely known to those skilled in the art, they may correspond to a biological fluid sample, for example whole blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, organic secretion, Tissue collection or isolated cells. This sample can be used as it is, or it can undergo prior to the implementation of the method of detection and / or quantification, an enrichment type preparation or ass u; according to methods known to those skilled in the art.
  • samples used in the detection and / or quantification methods may, in fact, be modified beforehand or not before their use.
  • sample that have not previously been modified mention may be made of biological fluids such as whole blood, and as examples of a sample that has been modified beforehand, mention may be made of serum, plasma and cells that It is recovered from a biopsy, or after surgery, and cultured in vitro.
  • the detection or quantification method can then be carried out in the culture supernatant or in the cell lysate.
  • the detection and / or quantification techniques generally use, in addition to the capture phase, a tracer or detection phase, which makes it possible to detect the immobilization of the target biological entity on the capture phase.
  • a tracer or detection phase which makes it possible to detect the immobilization of the target biological entity on the capture phase.
  • detection or tracer phases comprise a marker.
  • the detection and / or quantification method may implement direct or indirect detection.
  • the sample likely to contain the target biological entity is brought into contact with the capture and binding phase between the biological ligand immobilized on the support and the target biological entity is then highlighted. thanks to the presence of a tracer.
  • the tracer is usually a biological Hgand the target biological entity (most often different from the biological ligand immobilized on the support at the level of the capture base) coupled to a marker,
  • Indirect detection methods also called competitive methods, are also assays widely known to those skilled in the art and used, in particular, when the target biological entity is a hapten. It consists in assaying the target biological entity in the sample by creating a competition between the target biological entity of the sample and an analogue of this target biological entity. In this case, the sample that may contain the target biological entity is contacted with the capture phase in the presence of an analogue of the target biological entity. The binding between the immobilized biological ligand on the support and the target biological entity is then demonstrated by the presence of a tracer, indirectly by detecting the binding between the immobilized biological ligand on the support and the like of target biological entity.
  • the target biological entity analog is used in the competition reaction after coupling to a label to form a conjugate or tracer.
  • the measured signal emitted by the tracer is then inversely proportional to the amount of target biological entity of the sample.
  • marker any molecule capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • a non-limiting list of these direct detection markers consists of;
  • enzymes that produce a detectable signal for example, by colorimetry ,. fluorescence, luminescence f such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase., glueose ⁇ 6 ⁇ phosphate dehydrogenase ,.
  • Cbroniophores such as fluorescent, luminescent, dyes,
  • radioactive molecules such as 32 P f 5 S or n %
  • Fluorescent molecules such as Alexa or His cycocyanins, and * The hydroelectrolytic salts such as organometallic derivatives based acridinlum or ruthenium.
  • Indirect detection systems may also be used, such as, for example, ligands capable of reacting with an antigen.
  • the ligand then corresponds to the marker to constitute, with the analogue of the target biological entity, the tracer,
  • Hgand / anti-ligand couples are well known to those skilled in the art, which is the case, for example, in the following pairs: biotin / streptavidin, hatene / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complementoler of polyneuteotide,
  • the antMigand can then be detectable directly by the direct detection markers described above or be itself detectable by another pair ligand / antl-ligand, and so on,
  • reagents allowing the visualization of the marking or the emission of a detectable signal by any type of suitable measuring apparatus, such as, for example, a spectrophotometer, a spectrofluoron meter or a high definition camera.
  • the signal proportional (in the case of a direct process) or inversely proportional (in the case of an indirect process) to the amount of The target biological entity of the sample may be compared with a calibration curve obtained beforehand by techniques widely known to those skilled in the art. So; for example, the calibration curve is obtained by performing an assay using the same biological ligand, as well as known increasing amounts of target biological entity. A short is thus obtained by placing on the abscissa, the target biological entity concentration and on the ordinate, the corresponding signal obtained after assaying,
  • the detection / quantification method according to the invention can be directly applied to the format of commercially available tests for the detection / quantification of target biological entity
  • a biological ligand for which the invention can be applied include p24 and g i20 HIV, the core, NS3 f S4 and S5 of hepatitis C, ORF2 and ORF3 proteins of hepatitis E f l3 ⁇ 4ligosaccharide gaiactomannan fungi of the genus AspergMus,
  • the targeted biological entities are the immunoglobulins (humoral response) directed against these pathogens.
  • biomarkers of human pathologies such as S10GS protein, troponin I and T, anti-muhlerian hormone (AMH), procaicitonin, PSA (prostate - specific antigen) and other tumor markers.
  • AMH anti-muhlerian hormone
  • procaicitonin PSA (prostate - specific antigen)
  • other tumor markers such as S10GS protein, troponin I and T, anti-muhlerian hormone (AMH), procaicitonin, PSA (prostate - specific antigen) and other tumor markers.
  • the targeted biological entities are autoantibodies.
  • FIG. 1 is a diagrammatic representation of micelia carrying biological ligands, in the case of a block-type amphiphilic copolymer
  • Fi ⁇ yre 2 is a schematic representation of micellas carrying biological ligands immobilized on the surface of a support, which highlights the interactions between the micelia and the support; A) by (Intermediate of the membrane present on the surface of the micelles, B) via the amphiphilic polymer (via a hydrophilic chain); VS) by adsorpdon in a monomeric form (via hydrophobic / hydrophilic part
  • FIG. 3 illustrates the preparation of p24-coupled micelia, used in the examples below,
  • Figure 4 shows the results obtained with an ELISA test with free p24 (o) or p24 coupled with micelia ( ⁇ ) in capture as well as with micelies alone ( ⁇ ) (under the same dilution conditions as with p24) .
  • Flgyre S and SB present the results obtained with the same ELISA test format as in the case of FIG. 4, but by varying the detection antibody concentration, with immobilization carried out with a p24 concentration of a): 10 pg / ml (FIG. 5A), b): 1 ⁇ g / ml (FIG. SB); pure absorbance signal graphs and Signal / Noise ratio as a function of antibody dilution (Ab).
  • FIGS. 1A and 6I show the influence of the coupling conditions (diluted or concentrated) of the p24 on the sensitivity gain in ELISA after immobilization performed with a p24 concentration of: a): 10 ⁇ g / ml (Figura SA) b): 1 ⁇ g / ml ( Figure SB); pure absorbance graphs and signal-to-noise ratio as a function of antibody dilution.
  • Figure 7 demonstrates the stability of the micelia tested in ELISA after immobilization performed with a p24 concentration of 1 ⁇ g / ml; graphs in pure absorbance signal and signal-to-noise ratio as a function of antibody dilution,
  • Figure 8 shows different conditions of immobilization of the S10 ⁇ B antigen on the solid support used hereinafter.
  • Figures ⁇ A and ⁇ show the ELISA results for the different types of dimmbllisation made according to Figur ⁇ 8; pure absorbent signal graphs and Signal / Noise ratio as a function of antibody concentration (ab). Examples
  • micei-protein conjugates The effect of the use of micei-protein conjugates on the increased sensitivity of immunoenzymatic assays, in the capture phase, has been demonstrated:
  • the micelles are prepared by the common solvent method (or nanoprecipitation).
  • the copolymer (20 mg) is dissolved in 2 ml of acetonitrile and then this solution is added with a regular flow rate to 4 ml of milli-Q water.
  • the acetonitrile is evaporated under reduced pressure.
  • the micellar aqueous solution obtained is typically 5.2 mg. (precise determination by measurement of the solid level after passage in an oven).
  • the average micelle case is 56 rsm.
  • Coupling of the protein on the micelles is achieved by adding a volume (typically 500 ⁇ L) of micelle dispersion at 5.2 mg / mL to the same volume of p2 solution.
  • PBS pH 7.4 at varying concentrations (0 to 2.4 mg.mL -1 )
  • the final coupling medium thus contains the micelles at 2.6 mg.mL and the protein at concentrations ranging from 0 to 1, 2 mg.mL * 1.
  • the samples are placed on a stirring wheel for 20 hours at room temperature.
  • the coupling is total When increasing this amount (0.24 to D; 4B mg / g), more and more free protein is detected, indicating a "saturation" the surface of the micelles, and thus a non-quantitative coupling.
  • the condition retained for the continuation is that corresponding to a quantitative coupling, the. 0.12 mg of p24 per mg of copolymer, ie p24 at 0.3 mg / mL and 2.6 mg / mL copolymer
  • the hydrodynamic diameter of the micelles diluted 1/50 in a solution of iMM aCI is measured by dynamic light scattering (DLS, for Dynamic Light Scattering) using a device.
  • the hydrodynamic diameter of the samples is 100 nm for control in PBS coupling medium (mlels without p24); the hydrolysis of the reactive functions of esters of NS to carboxyates leads to the unfolding of the hydrophilic chains, and of 11 nm for the micelles having coupled the p24,
  • Mieeife Dsameter fp 24 (mg rog CMC hydrodynsmii u co polymer) (Mg mL)
  • the coupled or free p24 was immobilized on the solid phase (Nunc MaxISorp F mlcrotltration plate) at different concentrations. in PBS (Cascade dilutions) f for 12 hours at room temperature; passivation is carried out in PBS - horse serum (SC) 10%; detection with a biotioylated anti-p24 antibody (rabbit) diluted in PBS-Tween-SC 10%, followed by addition of streptavidin-peroxidase CHRP) in PBS-T een-HS 10%, and revelation with 3,3 '5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) (absorbance at 450 nm); free p24 controls and micelles alone are systematically prepared under the same conditions as those of the coupling, but in the absence of micelles and p24, respectively.
  • FIGS. 4 and 5 show an important gain of the antibody detection signal, relative to the free p24. Moreover, the copolymer tested in the absence of p24 at the different dilutions does not cause significant background. This sensitivity gain is confirmed by working with an immobilization carried out with a concentration of p24 (coupled or free) of 10 ⁇ g / ml or 1 ⁇ g / ml and by varying the detection antibody concentration.
  • the molecular state (the nanoparticle of about 100 nm) is indispensable when coupling the protein to increase the sensitivity of the diagnostic test (Le. the liquid phase due to the preferential coupling towards the end of the hydrophilic block).
  • Coupling "diluted” the coupling of p24 is carried out directly under the conditions used for immobilization on the ELISA plate, Le. :
  • P24 micelles (0.3 mg / ml) of p24 were stored at 4 ° C for 1 month. Compared to free p24 control, more suitable for optimal sensitivity (p24 supplier given at 2.4 mg / ml, stored at ⁇ 2Q € °) f-p24 micelles maintain their superiority in terms of sensitivity ( Figure 7) .
  • the Tn1 protein was coupled to Pt ⁇ b ⁇ P miceifcs (A $ ⁇ co ⁇ NVP) in PBS at a concentration of 0.137 mg / ml in Tnl and 0.868 mg / ml micelles (0/158 mg Tnl per ml). mg of copolymer). Coupling was analyzed by SDS-PAGE gel which shows that the coupling of the micelles seem almost total, since the free TnI n f is not detected. The TnI thus coupled to the micelles was tested on VIDAS® (bioeric) and compared with TnI alone, with micelles alone on the solid phase.
  • VIDAS® bioeric
  • the VIDAS automated test is composed of 2 elements:
  • the cartridge is a plastic strip containing 10 wells sealed with an aluminum film in which the different solutions are distributed,
  • the cone serves as a pipetting system and solid phase. Each reagent of the cartridge is sucked up and then discharged by the cone.
  • the cones are immobilized either with free TnI (ITC) at 0.03 ⁇ g / ml or micelles alone at 0.190 ⁇ g / ml or mlcelles-Tnl at 0.03 ⁇ g / ml in Tnl and 0.190 ⁇ g / ml. in copolymer, in a volume of 300 ⁇ L.
  • the cones are emptied, then brought into contact with the passlvation buffer (0.2 M Tris buffer, pH 6.2) containing a protein or peptide saturation agent.
  • the cones are then seeded and stored at + 4 ° C until use.
  • the 3 capture phases prepared were compared by reacting them with a tracer which is a mixture of two anti-Tl mono-lonal antibodies (clones 16 ⁇ and 789 marketed by HYTEST, Sweden).
  • a tracer which is a mixture of two anti-Tl mono-lonal antibodies (clones 16 ⁇ and 789 marketed by HYTEST, Sweden).
  • this antibody is directly coupled to the alkaline phosphatase enzyme, making it possible to reduce the number of stages of the immunological reaction and to reduce the duration thereof (DEX2 protocol of VIDAS®, total duration approximately 40 min).
  • the concentration of use of this tracer is 0.14 ⁇ g / ml in a volume of 400 ⁇ l.
  • the generation of the signal is done by adding the substrate 4-Hymethyl mbellif eryf phosphate; the enzyme of the conjugate catalyzes the hydrolysis reaction of this substrate to 4-methylheferone whose emission is measured at 450 nm.
  • the signal-to-noise ratio is improved when the TnI is coupled to the polymer
  • the objective of this study is to demonstrate the need to use antigen-bearing copolymer micelles to increase the sensitivity of diagnostic tests for antigen immobilization.
  • the antigen selected for this study is the $ 1008 protein (native antigen, bovine brain extract, HyTest).
  • the polymer is PLA-b-P (NAS-co-NVP) as in the previous examples. It is used either in a micellarre form (in dispersion in 100% aqueous buffer) or dissolved in DMSO ("copolymer" form) for coupling with the 51008 antigen in a 5% DMSO-95% aqueous buffer medium. These two protocols, carried out in parallel, are carried out to evaluate the influence of the coupling conditions, that is to say coupling in 100% aqueous media with micelles versus coupling in a semi-organic medium DMSO / water with an initially dissolved polymer.
  • the polymer-antigen couplings are made either in solution in an Eppendorf tube or on an ELISA microplate after immobilization of the mole or copolymer.
  • the assay is carried out as previously reported for the p24 protein. Following the coupling, the% of modified amines is approximately 100%.
  • 96 wells (unc Haxisor F96) are distributed 100 .mu.L / well of only micelies (l st step condition 2 ⁇ or copolymer alone (1 st condition of step 3) diluted in water to 74 pg / L
  • the microplate are Incubated 12h at temperature
  • the reaction mixture is then stirred for 1 hour in order to obtain the adsorption and then drained in order to carry out the couplings under dilute conditions, in the microplate directly, 100 ⁇ l / well of a solution of SIQ0B at 5 ⁇ g / ml are added to the wells.
  • the microplate is incubated for an additional 12 hours.
  • microplate is incubated for 1 h at 37 ° C f followed by 3 washes in TBS,
  • An anti-SlOOB antibody (8D5 clone) as Fab 'and coupled to alkaline phosphatase is distributed (100 pL / well, concentration ranging from 0.2 to 1.2 mg / ml), incubated for 1 h at 37 ° C., followed by 3 washes in T8S, Finally, 100 ⁇ l / well of the substrate -nitropenyl phosphate are added, the reading of the colorimetric signal is carried out at 405 nm on microplate reader,
  • the coupling of the antigen to the copolymer in the form of micelles can improve the detection sensitivity with respect to the free S100B system, unlike the same coupling on the copolymer in non ⁇ miceliaire (semi-organic conditions DMSO / water polymer initially dissolved in DMSO), or with respect to the posterior coupling of the antigen on a solid phase modified with the same or the same non -cellular copolymer.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

L'invention concerne on nouveau procédé de préparation d'une phase de capture pour la détection et/ou la quantification d'une entité biologique cible, ladite phase de capture comportant un ligand biologique pour l'entité biologique, ledit ligand biologique étant lié de façon covalente à un polymère amphiphile et étant Immobilisé sur un support solide, caractérisé en ce que le ligand biologique est immobilisé sur le support solide, par mise en contact du support solide avec une dispersion de micelles formées d'une pluralité de chaînes du polymère amphiphile, lesdites micelles étant porteuses en surface d'une pluralité de molécules du ligand biologique, ainsi que les phases de capture correspondantes et les procédés et kits de détection associés.

Description

associés
L'invention concerne le domaine technique de la détection de cibles biologiques» Plus précisément, l'Invention a pour un objet un nouveau procédé de production de phases de capture pour la détection dsune cible biologique dans un échantillon biologique, et les procédés de détection et kits de détection correspondants.
Dans le domaine des tests de détection, il est toujours recherché d'améliorer la sensibilité et la spécificité de détection. De telles améliorations peuvent être obtenues en jouant sur différents facteurs,, comme les conditions de détection, la phase de capture ou de détection et différentes solutions visant à résoudre de telles problématiques ont été proposées dan l'art antérieur,
A titre d'exemple de solutions proposées, on peut se référer aux documents suivants :
- la demande WO 98/47000 décrit un procédé de mise en évidence d'un matériel biologique cible, contenu dans un échantillon, selon lequel on dispose d'une phase de capture, on met en contact ledit matériel biologique cible avec au moins ia phase de capture, et on détecte le complexe phase de capture-matériel biologique cible. Ledit procédé est caractérisé pa le fait que la phase de capture est sous forme micro- particulaire ou linéaire et est constituée par au moins un premier polymère particulaire ou linéaire, avec un caractère apparent hydrophile et des premiers groupements compiexan s, ces derniers étant liés par coordination à un premier métal de transition,, qui est lui-même lié à un premier ligand biologique., susceptible de reconnaître spécifiquement le matériel biologique cible. Une telle phase de capture est proposée afin d'optimiser la fixation du matériel sur celle-ci, tout en diminuant, voire éliminant, toute réaction secondaire d'adsorption dudlt matériel sur ladite phase de capture. En particulier, ce document propose l'utilisation d'un polymère particulaire ou linéaire hydrophile, et notamment un polymère fonctionnalisé obtenu par polymérisation d'un monomère hydrosoluble, d'acrylamide, d'un dérivé d'acryfamide, de rnéthacryiarnide ou d'un dérivé de méthacrylamide, d'au moins un agent de réUculatton et d'au moins un monomère fonctionnel le monomère hydrosoluble est, de préférence, choisi parmi le H~ isopropylacrylamlde, le N-é hylméthacrylarnide, le -n~ prop lacrylamlde, Se N-n-propyi méthacrylamide, le N- isopropylmét acryiamide, le ^ydoprapylacrylamlde le , - diéthylacrylamide., le -méthyl- ~isopropylacrylamidef le N-méthyl-N-n- propylacryiamide., le monomère étant de préférence le N- isopropylacrylamlde ( IPAH) et le monomère fonctionnel est,, de préférence, choisi parmi les acides carboxyliques, éventuellement azotés, l'acide itaconique, les dérivés acryliques et les dérivés méthacryliques. De manière préférée, un polymère particulaire du type poiy{N~ isopropylacrylamlde) (PNÎ Â ) comprenant des groupes oomplexants dérivés de l'acide itaconique ou de l'anhydride maléique-co- méthylvinyléther est utilisé.
- La demande WO 98/59241 propose d'utiliser une phase de capture et/ou de détection qui comprend une molécule organique; ayant au moins une fonction réactive et au moins un matériel protéique susceptible de reconnaître ou de se lier spécifiquement et directement ou indirectement, au matériel biologique cible, ledit matériel protéique possédant un site spécifique de liaison par covalen à la fonction réactive de la molécule organique, qui consiste en au moins un tag, comprenant au moins six résidus lysine, ou dérivé de lysine, contigus, La phase de capture est, de manière avantageusef immobilisée sur un support solide par adsorption passive ou liaison covalente, La molécule organique peut notamment être un polymère, particulaire ou linéaire, les homopolymères tels que la polylysine, la polytyrosine, les copolyrnères tels que les copolyrnères d'anhydride maléique,, les copolyrnères de N- vinyl-pyrrolidone, et notamment le copolymère anhydride maléique/méthyl-vinyi-étrier, le copolymère M~ vinvI-pyrrolidone/IM- acryloxysuceinirnide, les polysaccha ides comme le poly-6-aminoglycose, nature s ou synthétiques,, les polynudéotides et le copolymères d'acides aminés comme les enzymes,, sont cités en tant qu'exemples de polymère. Dans les exemples, tes polymères suivants sont utilisés : l'ÂHVE 65 ; polyCméthylvinyléther/anhydride malique), le PEAM 86 poly (é hyiène anhydride malique), le SAM 49 poly(styrène/anhydride malique) et le NVPÂM 3β poly( -vinypyrrolidone/anhydnde malique),
- La demande WO 03/044533 propose un procédé d'obtention d'une phase de capture d'un matériel biologique cible, comprenant une protéine d'intérêt modifiée, capable de se lier spécifiquement, directement ou indirectement audit matériel biologique cible et immobilisée sur une phase d'Immobilisation comportant des groupements réactifs, dans lequel au moins deux séquences peptidiques différentes, comprenant la séquence peptldique de la protéine d'intérêt, et l'une comprenant une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité N-termlnale et une succession d'au moins six résidus bistidlne à son extrémité C-termînale, !!autre comprenant une succession d'au moins six résidus histidine à son extrémité N-terminale et une succession d'au moins six résidus lysine à son extrémité C-termïnale, sont cbacune immobilisées sur la phase d'immobilisation, par réaction covalente entre les groupements aminé primaire des séquences peptidiques et les groupements réactifs de la phase d mmoblilsation, et dans lequel la séquence peptidlque la plus efficacement couplée à la phase d'immobilisation est choisie en tant que phase de capture, La phase dlmmoblilsation correspond à un polymère, qui est ensuite lui-même immobilisé sur yn support solide» Dans ies exemples de cett demande de brevet, un poly (méthylvinyléther-anhydrlde maléique) i'AMVE 57 est utilisé. Le polymère n'étant pas hydrosolubie, il est nécessaire de le dissoudre dans du DMSO (dlméthyisulfoxyde) anhydre préalablement à la réaction de couplage, réalisée en milieu aqueux à 95% avec la protéine partenaire de la cible biologique à détecter,
Comme décrit dans ia demande WO 01/92361, bien que ces différents copolymères permettent une amélioration de la sensibilité dans les tests diagnostiques, ils présenten un certain nombre d'Inconvénients : tout d¾bord, le copofymère est adsorbé sur le support solide en plusieurs points, répartis le long du squelette, ce qui a pour conséquence que la disponibilité des ligands biologiques pour réagir avec le matériel biologique cible es limitée. De plus, dans certains cas, les conjugués copolymère-ligands biologiques présentent une structure agrégée (voir par exemple Emut M. N. e al,f Bioconjugate Chemistry, 7 (5), 568-575, {1996} ou Delair T. et al., Polymers for Advanced Technologies, 9,349-361, (1998), Ce phénomène d'agrégation est résolu totalement par les méthodes mises en œuvre dans la demande WO 99/07749, mais la sensibilité des tests de détection des molécules cibles s¾n trouve affectée.
Dans ce contexte, la demande WO 01/92361 propose un nouveau type de polymère pour la fixation de ligands biologiques qui présente :
-une architecture contrôlée pour éloigner les molécules biologiques du support solide et favoriser la réactivité de ces ligands biologiques avec des molécules cibles en solution,
-une taille suffisante pour permettre un taux de greffage élevé des ligands biologiques tout en conservant un espacement entre lesdits ligands et donc favoriser la sensibilité des tests diagnostiques.
Par ailleurs, dans les techniques de détection comme ELISA, il est essentiel que les phases de capture conservent l'activité biologique du ligand biologique immobilisé ou couplé, après purification et immohiiisation ou couplage, afin que ce dernier puisse, ensuite, interagir correctement avec la cible biologique à détecter et permettre une détection fiable. Dans les cas notamment où la phase de capture comporte une protéine immobilisée, l'Immobilisation des protéines sur la phase de capture réalisée au moins en partie en solvant organique, comme c'est le cas dans la demande WO 01/92361, peut engendrer des phénomènes de dénaturation, entraînant au final une baisse de sensibilité du procédé de détection. Dans ce contexte, l'invention se propose de modifier les phases de capture utilisées dans les procédés de détection,, en développant notamment un nouveau procédé de préparation, afin d'augmenter la sensibilité de détection. Pour cela, il est proposé un procédé dans lequel le couplage du lîgand biologique au polymère peut être réalisé dans une solution essentiellement aqueuse.
L'invention concerne un procédé de préparation d'une phase de capture pour la détection et/ou la quantification d'une entité biologique cible, ladite phase de capture comportant un llgand biologique pour l'entité biologique, ledit Iigand biologique étant lié de façon covaiente à un polymère amphiphile et étant immobilisé sur un support solide, caractérisé en ce que le llgand biologique est immobilisé sur le support solide, par mise en contact du support: solide avec une dispersion de micelles formées d'une pluralité de chaînes du polymère amphiphile, lesdites micelles étant porteuses en surface d'une pluralité de molécules du llgand biologique.
Dans le cadre de l'invention, le polymère amphiphile présente une partie hydrophobe orientée vers le cœur des micelles et une partie hydrophile à la surface des micelles, le iigand biologique étant couplé de manière covaiente sur la partie hydrophile.
De manière avantageuse, dans le cadre de l'invention, l'immobilisation est réalisée dans un solvant ou mélange de solvants constitué à au moins 90% en masse., de préférence à au moins 95% en masse, et encore plus préférentiellement à au moins 99% en masse d'eau. Ce solvant ou mélange de solvants correspondra à celui présent dans la dispersion de micelles utilisées pour l'Immobilisation, Une telle immobilisation en phase aqueuse permet d'éviter la dénaturation du iigand biologique, par rapport aux procédés de l'art antérieur qui utilisent une immobilisation en mélange phase aqueuse/phase organique., avec une forte proportion de phase organique,
Une concentration en polymère amphiphile de 50 à 500 pg/mL sera,, par exemple,, utilisée lors de la mise en contact des micelles avec le β support. Cette concentration correspondra à la concentration de la dispersion de micelles utilisées.
De manière avantageuse, après {immobilisation, le polymère reste,, au moins en partie., sous la forme de micelles., de sorte que des micelles formées d'une piuralité de chaînes du polymère ampbiphiie, lesdttes micelles étant porteuses en surface d'une pluralité de molécules du iigand biologique liées de façon covalente a polymère amphiphite, soien Immobilisées à la surface du support. Pour cela, notamment, la concentration en polymère ampiiîphile lors de la mise en contact avec le support doit être supérieure à la concentration micellaire critique (CMC) du polymère., de manière à maintenir l'état micellaire.
Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de couplage envoient entre le Iigand biologique et le polymère amp lphile réalisée alors que le polymère se trouve sous la forme de micelles., de manière à former les micelles porteuses en surface d'une pluralité de molécules du Iigand biologique. Dans ce cas, le couplage est., de façon avantageuse, réalisé dans un solvant ou mélange de solvants constitué à au moins 90% en masse., de préférence à au moins 95% en masse., et encore plus préférentiellement à au moins 99% en masse d¾au. Là encore, un tel couplage en phase aqueuse permet d'éviter la dénafuration du Iigand biologique,
De manière avantageuse, le couplage est réalisé avec une concentration en polymère amp iphile au moins 10 fois supérieure à celle utilisée lors de la mise en contact des micelles avec le support, pour favoriser l'efficacité de couplage, garantir la préservation de l'état micellaire lors de ce couplage (et ainsi permettre une orientation de ce couplage vers la partie externe de la couronne hydrophile), Une telle concentration permet de favoriser la conservation de la forme de micelles lors du couplage et ensuite lors de l'immobilisation. On utilisera; par exemple, une concentration en polymère amphiphile de 0,5 à 5 mg/mt lors de l'étape de couplage covaienf entre le Iigand biologique. ?
Le couplage du figand biologique est réalisé de manière è obtenir des micelles avec la partie hydrophile du polymère orientée vers la surface des micelles, couplée de manière covalente au ligand biologique. Ainsi, après l'immobilisation, le polymère reste, au moins en partie, sous la forme de micelles,, de sorte que des micelles formées d'une pluralité de chaînes du polymère amphiphile, sont immobilisées à la surface du support lesdltes micelles étant porteuses en surface d'une pluralité de molécules du ligand biologique liées de façon covalente su polymère amphiphile. En particulier, au moins une partie des micelles est, au final, immobilisée par adsorptîon sur le support solide par l'intermédiaire d'une interaction figand biologique/support solide, une partie des micelles pouvant éventuellement être immobilisée par adsorptîon sur le support solide par l'intermédiaire d'une interaction polymère/support solide, les Interactions mises en jeu pouvant notammen être des liaisons électrostatiques ou ioniques, ou des interactions hydrop obes,
Néanmoins., même si une partie des llgands biologiques immobilisées à la surface du support interviennent pour permettre l'immobilisation des micelles sur le support solide, une partie des ligands biologiques est libre, notamment n'est pas liée au support. Une partie des ligands biologiques, correspondant en particulier à au moins 50 % des ligands biologiques présents sur la phase de capture, reste accessible et va être disponible pour interagir et se lier avec, une entité biologique cible, pour permettre la capture de cette dernière lorsque la phase de capture va être utilisée dans un procédé de détection, C'est d'ailleurs pourquoi le support obtenu à l'issue du procédé selon l'invention est qualifié de phase de capture.
Par exemple, pour favoriser l'immobilisation du polymère sous la forme de micelles en surface, une étape de couplage, telle que précédemment définie, sera mise en œuvre avec une concentration en polymère correspondant à au moins 50 fois, de préférence à au moins 200 fois la concentration mleellaire critique du polymère. Dans le cadre de l'Invention,, le polymère amphiphile est, de préférence, un polymère linéaire à bloc comportant au moins un bloc hydrophile et au moins un bloc hydrophobe, le bloc hydrophile étant positionné au niveau de la surface des micelles, et étant porteur par liaison covalente, d'au moins une molécule du ligand biologique.
De manière avantageuse, le procédé sera mis en œuvre avec l'une ou l'autre des caractéristiques suivantes, une combinaison quelconque des caractéristiques suivantes, voire toutes les caractéristiques suivantes ;
- dans la dispersion de micelles, la densité moyenne de molécules de ligand biologique par chaîne de polymère est de 0,1 à 100, et notamment de 1. à 100 la densité moyenne d molécules de ligand par chaîne de polymère pourra être déduite à partir du dosage des fonctions réactives résiduelles du ligand impliquées dans le couplage ;
~ les micelles dans la dispersion et/ou les micelles immobilisées au final sur le support sont formées de 100 à 5000 d chaînes de polymères et/ou sont porteuses de 10 â 500 000 molécules de ligand biologique.,
- la dispersion d micelles présente un indice de polydispersité de
0 à 0,2 déterminé par diffusion dynamique de la lumière ;
- le polymère amphlphile présente une masse molaire supérieure à 5000 g/mole,, préférentiellement supérieure à 10 000 g/mole ;
- le ligand biologique est un antigène., un haptène, ou une protéine ;
~ le polymère amphiphile comporte, voire est exclusivement constitué d'un premier bloc linéair consistant en un homopolymère hydrophobe résultant d l polymérisation d'un monomère â hydrophobe ; un deuxième bloc linéaire consistant en un copolymère hydrophile résultant de la copolymérisatson d'un monomère B portant une fonction réactive X et d'un monomère C hydrophile ne portant pas de fonction réactive, ledit deuxième bloc étant lié à une extrémité du premier bloc de manière eovalente ; dans ce cas de préférence ;
o le monomère  est choisi parmi les dérivés hydrophobes de niéthacrylate, acrylate, acryiamide, méthacrylamide, tes iactides, ou parmi le styrène et ses dérivés et est préférentiel lement le n-butyl acrylate, le ertiobutyl acrylate, le tertiobutyl acrylamlde, ocîadécyi scryfamide, le laetide, le lactlde-co-glycolide ou le styrène et/ou o le monomère 8 est choisi parmi les dérivés fonctionnels d'aerylate, méthacrylate, acrylamlde ou méthacrylamide, les dérivés fonctionnels styrènlques, et est préférentiellement le N-acryloxy sucdnimide, le N- méthacryloxy succini sde, le 2-bydroxyéthyl méthacryiate, le 2-aminoéthyl méthacrylate, le 2- hydroxyéthyl acryiate, le 2-aminoéthyl acrylate ou le l,2:3,4-di-0-isopropy idène-6"0-acryloyi"'D'"
galactopyranose ;
o le monomère S est porteur d'une fonction réactive X choisie parmi les fonctions -NH¾ -CQOH, -OH, ~SH, ■OCH, groupements ester,, halogénoearbonyle, sulfhydfiie, disulfure, hydrazine, hydrazone, azîde, isocyanate, isothiocyanate, alcoxyamine, aldéhyde,, époxy, nielle., maléimlde/ halogénoalkyle, nalélmide,. parmi les fonctions activantes par un agent activant comme les carbodiimîdes, et notamment un acide carboxylique activé sous forme d'ester de H- hydroxysuccinimide, de pentaehlorophényie, de trichlorophéoyle, de p-nitrophényle, de cartayphényle, ou encore parmi les composés homo- ou hétéro- bifonctlonnels ;
o le monomère C est choisi parmi les dérivés hydrophiles d'acrylamide,, de méthacrylamide, ia -vlnylpyrrolidone et l'oxyéthylène de préférence, le monomère€ est la N- vinyipyrrolidone ou la H-acryloyl morpiioîi e ; o le premier bloc a une masse molaire comprise entre 1000 et 250 000 g/mole ;
o le deuxième bloc a une masse molaire supérieure à 1 000 g/mole et, de préférence, supérieure à 2 000 g/mole ; o le deuxième bloc est un copolvmère statistique, dont la composition exprimée par le rapport des quantités de monomères en mole, quantité de monomère € sur quantité de monomère B, appartient, de préférence, à la gamme allant de I à 10, préférentieilement allant de 1,5 a 4.
Llnvention a également pour objet une phase de capture d'une entité biologique cible, caractérisée en ce qu'elle comporte des micelles immobilisées sur un support solide, lesdites micelles étant formées d'une pluralité de chaînes d'un polymère amphiphlle, et lesdites micelles étant porteuses en surface d'une pluralité de molécules d'au moins un ligand biologique pour l'entité biologique cible, lesdites molécules du ligand biologique étant liées de façon covalente aux chaînes du polymère amphiphile.
De manière avantageuse, la phase de capture selon l'invention présentera l'une ou l'autre des caractéristiques suivantes, une combinaison quelconque des caractéristiques suivantes,, voire toutes les caractéristiques suivantes :
- les micelles son immobilisées par adsorption sur le support solide ;
~ au moins une partie des micelles sont immobilisées par adsorption sur le support solide par Intermédiaire d'une interaction ligand biologique/support solide, une partie des micelles pouvant éventuellement être immobilisées par adsorption sur le support solide par l'intermédiaire d'une interaction polymère/support solide, les interactions mises en jeu pouvant notamment être des liaisons électrostatiques ou il ioniques, ou des Interactions hydrophobes ; néanmoins, même si une partie des ligands biologiques immobilisée à la surface du support,, intervient pour permettre l'Immobilisation des miœlies sur le support solide, une partie des ligands biologiques est libre, notamment n'est pas liée au support, ; une partie des ligands biologiques, correspondant en particulier à au moins 50% des ligands biologiques présents sur ia phase de capture, reste accessible et va être disponible pour interagir et se lier avec une entité biologique cible, pour permettre la capture de cette dernière lorsque la phase de capture va être utilisée dans un procédé de détection ; C'est d'ailleurs pourquoi le support sur lequel les micelles sont immobilisées est qualifié de phase de capture ;
- les micelles immobilisées sur le support sont formées de 100 à 5000 de chaînes de polymères et/ou sont porteuses de 10 à 500 000 de molécules de ligand biologique
~ le polymère amphip ile présente une partie hydrophobe orientée ver le cœur des micelles et une partie hydrophile à la surface des micelles, le ligand biologique étant couplé de manière covaSente sur la partie hydrophile,
~ le polymère amphiphile est un polymère linéaire à bloc comportant au moins un bloc hydrophile et au moins un bloc hydrophobe, le bloc hydrophile étant positionné en surface des micelles, et étant porteur par liaison covalente, d'au moins une molécule du ligand biologique
- le polymère amphiphile présente une masse molaire supérieure à 5 000 g/mole, préférentiellement supérieure à 10 000 g/mole ;
- le polymère amphiphile comporte,, voire est exclusivement constitué d'un premier bloc linéaire consistant en un homopolymère hydrophobe résultant de la polymérisation d'un monomère A hydrophobe ; un deuxième bloc linéaire consistant en un copolymère hydrophile résultant de la copolymérisa ion d'un monomère 8 portant une fonction réactive X et d'un monomère C hydrophile ne portant pas de fonction réactive, ledit deuxième bloc étant lié à une extrémité du premier bloc de manière covalente ; les monomères A, B, C et les fonctions réactives Kf et les blocs sont, de préférence, tels que définis précédemment dans le cadre du procédé ;
- le ligsnd biologique est un antigène, un haptène, ou une protéine. L'invention a également pour objet un dispositif de détection et/ou de quantification d'une entité biologique cible comprenant une phase de capture selon l'invention et au moins un traceur pour la détection.
Linvenrion a également pour objet un dispositif de détection et/ou de quantification d'une entité biologique cible, comprenant une phase de capture obtenue selon le procédé de l'Invention et au moins un traceur pour la détection.
L'invention a également pour objet une trousse d détection et/ou de quantification d'une entité biologique cible comprenant ;
un support solide ;
- une dispersion en solution aqueuse de micelles formées de chaînes d'un polymère amphlphïle, porteuses en surface d'une pluralité de molécules d'au moins un figand biologique pour l'entité biologique cible, lesdites molécules de ligand biologique étant liées de façon covalente aux chaînes du polymère amphiphile ; et
au moins un traceur pour la détection,
La dispersion et le support solide présenteront, de préférence, les mêmes caractéristiques que celtes données, dans la présente description, en relation avec le procédé de préparation de la phase de capture.
L'invention a également pour objet un procédé de détection et/ou de quantification m vitro d'une entité biologique cible dans un échantillon biologique, selon lequel i on dispose d'une phase de capture selon l'invention., on met en contact ledit échantillon biologique avec au moins la phase de capture,, et on détecte et/ou on quantifie ladite entité biologique cible fixée sur la phase de capture, après liaison de l'entité biologique à une molécule de ligand biologique liée de façon covalente aux chaînes du polymère amphiphile de la phase de capture. [/invention a également pour objet un procédé de détection et/ou de quantification in vitro d'une entité biologique cible dans un échantillon biologique, selon lequel : on dispose d'une phase de capture obtenue selon le procédé selon l'Invention, on met en contact ledit échantillon biologique avec au moins la pbase de capture ainsi obtenue, et on détecte et/ou on quantifie ladite entité biologique cibie fixée sur la phase de capture, après liaison de l'entité biologique à une molécule de ligand biologique liée de façon covalente aux chaînes du polymère amphiphiie de la phase de capture,
L'Invention a également pour objet un procédé de détection et/ou de quantification in vitra d'une entité biologique cible dans un échantillon biologique,, seion lequel : on prépare une phase de capture selon le procédé de l'invention., on met en contact ledit échantillon biologique avec au moins la phase de capture ainsi préparée, et on détecte et/ou on quantifie ladite entité biologique cible fixée sur la phase de capture, après liaison de l'entité biologique à une molécule de ligand biologique liée de façon covalente aux chaînes du polymère amphiphiie de la pbase de capture.
De tels procédés de détection et/ou de quantification pourront être un procédé direct, dans lequel l'échantillon, susceptible de contenir l'entité biologique cible, est mis en contact avec la phase de capture et la liaison entre le ligand biologique immobilisé sur le support et l'entité biologique cible est mise en évidence grâce à la présence d'un traceur. Dans ce cas., le traceur est notamment un ligand biologique de l'entité biologique cible couplé à un marqueur. Les immunodosages Sandwich, également nommés immunométriques, sont les formats qui seront les plus classiquement utilisés.
De tels procédés de détection et/ou de quantification pourront être un procédé indirect dans lequel l'échantillon susceptible de contenir l'entité biologique cible est mis en contact avec la phase de capture, en présence d'un analogue de l'entité biologique cibie et la liaison entre le ligand biologique immobilisé sur le support de la pbase de capture et l'entité biologique cible est: mise en évidence grâce à la présence d'un traceur, indirectement par détection de la liaison entre le ligancf biologique immobilisé sur le support et l'analogue de l'entité biologique cible. Dans ce cas,, le traceur est notamment l'analogue de l'entité biologique cible couplé à un marqueur. Les immunodosages en compétition, sont les formats qui seront les plus classiquement utilisés.
Dans les traceurs utilisés, que ce soit dans un procédé direct ou indirect; te marqueur est, par exemple,, choisi parmi les enzymes,, les chromophores., les molécules radioactives,, les molécules fluorescentes et les sels électrochimiluminescents.
Une amélioration de la sensibilité de détection a été constatée en utilisant la phase de capture décrite ou obtenue dans le cadre de l'invention. Cette amélioration de la sensibilité peut s'expliquer de différentes manières : du fait de ia non dénaturation du Hgand biologique, son couplage et son immobilisation pouvant être faits en milieu aqueux,, du fait d'une meilleure présentation du figand biologique, favorisant ensuite son interaction et sa liaison avec l'entité biologique cible, ou de ia combinaison de ces différents effets.
Les définitions et descriptions plus détaillées ci-après permettent de mieux comprendre !!nvent!om
Par « micelle formée d'une pluralité de chaînes d'un polymère amphiphile »f on entend un assemblage sous une forme sphéroïdale de chaînes d'un polymère amphiphile, dont une partie hydrophile forme ia couronne (dirigée vers la solution aqueuse dans laquelle les micelles se trouvent), et une partie hydrophobe forme le cœur, comme illustré schématiquement sur ia Figyre î. Un polymère amphiphile va s'auto- assembler sous cette forme, dès lors,, qu'il se trouve en solution aqueuse, à une concentration supérieure à une concentration caractéristique dudit polymère, nommée concentration micellaire critique. Dans le cadre de l'invention, les micelles sont caractérisées par leur diamètre hydrodynamique. Ce dernier est calculé à partir du rayon hydrodynamique mesuré par la technique de la diffusion dynamique de la lumière. Le rayon hydrodynamique est le rayon d'une sphère théorique qui aurait le mène coefficient de diffusion que la particule considérée. Dans le cadre de l'invention, les miceiies présentent généralement un diamètre hydrodynamique de 50 à 200 nm, de préférence de 50 à 150 nm. Le diamètre hydrodynamique des micelies peut être mesuré dans une dispersion de 50 pg/ml de polymère dans une solution aqueuse de NaQ 1 mM, par exemple, à l'aide d'un appareil Zetasizer ano© S90 ( a!vern, UK) à une température de 25°C Lindice ce poiydispersité (défini comme le carré du rapport de l'écart type sur le diamètre hydrodynamique déterminé par le même appareil}, représentatif de la largeur de distribution en taiile est typiquement inférieur à 0,2 et le plus souvent inférieur à 0,1? caractéristique de la distribution en taille étroite de telles micelies.
Par « polymère amphiphlle », on entend un polymère qui possède à la fois une partie ou bloc hydrophile et une partie ou bloc hydrophobe. Le caractère amphiphlle du polymère se caractérise, en solution aqueuse et au-dessus d'une concentration appelée concentration miœiiaîre critique (CMC),, par son agrégation sous forme de micelies, ce processus permettant de diminuer l'énergie libre du système. Dans le cadre de l'invention, les chaînes de polymères amphiphiles seront, de préférence, linéaires et non ramifiées de manière à favoriser leur assemblage sous la forme de micelies. Un polymère amphiphlle utilisable dans le cadre de l'Invention est un copolymère constitué d'au moins deux blocs linéaires, au moins un bloc globalement hydrophobe et au moins un bloc globalement hydrophile. Dans un bloc linéaire, chaque monomère, à l'exception des deux monomères d'extrémité, est lié à deux autres monomères, encadrant ledit monomère le long d la chaîne. Une des extrémités du bloc globalement hydrophobe est liée de manière covalente à une des extrémités du bloc globalement hydrophile.
Le terme copolymère,, à moins qui! n'en soit spécifié autrement, doit être compris comme un polymère formé par au moins deux monomères différents, Le terme copolymère couvre aussi bien tes copoiymères statistiques, à bloc ou les polymères alternés,
Un tel polymère amphiphiie peut comporter un premier b!oc hydrophobe, sous la forme d'un homopolymère hydrophobe c'est-à-dire comprenant un enchaînement d'un seul monomère A hydrophobe.
Un tel polymère arnphiphlle peut comporter un deuxième bioe apportant sa composante hydrophile au polymère, sous la forme d'un copolymère constitué de deux monomères : un premier monomère £ apportant de rhydrophiiie, afin de favoriser un déploiement maximal du deuxième bloc en phase aqueuse, et un autre monomère B apportant une fonction réactive X, afin de réaliser le couplage covatent du ligand biologique, De préférence, ce deuxième bloc est un copolymère statistique et présentera avantageusement un nombre suffisant de fonctions réactives proches de l'extrémité du bloc hydrophile non liée au bloc hydrophobe (c'est-à-dire, dans la mi lle, l'extrémité déployée vers la solution), pour assurer une présentation/accessibilité adéquate du ligand après couplage, dans la solution, pour une efficacité de reconnaissance accrue. Dans un cas extrême, le deuxième bloc peut être aussi constitué d'un seul monomère non fonctionnel, dont seul ie monomère situé en bout de chaîne (sur l'extrémité non liée au bloc hydrophobe) sera fonctionnalisé. C'est !e cas,, par exemple, d'un bloc hydrophile polyéthyiène glycol PEG (unité monomère -CHrCHi-Q- non fonctionnelle) dont le bout de chaîne hydroxyle peut être exploité pour la conjugaison à des ligands.
De manière avantageuse, au moins 1 fonction réactive Kf et de préférence, de 1 à 100 fonctions réactives X, sont présentes par chaîne de polymère amphiphiie,
Le deuxième bloc du polymère amphiphiie sera, de préférence, un copolymère statistique (dans lequel les motifs monomères B et€ sont répartis statistiquement le long de la chaîne macromoléculaire) ou un copolymère alterné (dans lequel les monomères B et C se succèdent 1? régulièrement selon une structure générale (B€)n dans laquelle n est un nombre entier).
Ces différents copolymères peuvent être obtenus par réaction de polycondensatlon,. ou par polymérisation en chaîne par vo e radicalaire, ionique, ou par transfert de groupe, avantageusement par polymérisation radicalaire vivante comme la polymérisation par terminaison réversible (polymérisation contrôlée par les nitroxydes, NMP), ia polymérisation par transfert d'atome (ATRP), et de préférence ia polymérisation par transfert réversible de chaîne par addition-fragmentation, appelée RAPT (voir WO 98/01478), Ces différentes techniques de polymérisation sont décrites, par exemple, dans K. Matyjazewski, Controlled Radical Polymerizatlon, American Chemical Society Séries,. Washington DC, USA, 1997 ; G. Qdian, Princsptes of Polymerizatlon, Third édition, Wïiey- Interscience Publication, 1991. La demande WO 01/92361. décrit la préparation de tels polymères amphiphiies et on pourra s'y référer pour plus de détails.
Par « monomère hydrophobe », on entend un monomère dont homopolymère présente en phase aqueuse une structure de pelote compacte., correspondant à un coefficient de Hark Houwink-Sakurada (facteur de forme) inférieur à 0,8.
Par « monomère fonctionnel », on entend on monomère porteur d'une fonction réactive X.
Par « monomère hydrophile », on entend un monomère dont homopolymère présente en phase aqueuse une structure déployée, correspondant à un coefficient de Mark-Houwink Sakurada supérieur à 0,8.
La technique de mesure de la niasse molaire dfun polymère, qui est exprimée dans la présente invention par le Mn (masse molaire en nombre en g/mole) est la chromatographie d'exclusion stérique (CES.) avec détecteur réfractométrîque, qui donne des masses molaires dites relatives à un étalonnage (standard polystyrène en phase organique, par exemple). Par « iigand biologique », on entend une entité biologique susceptible de reconnaître ou de se lier à l'entité biologique cible, Le ligand biologique est donc un partenaire de liaison pour l'entité biologique cible» Λ titre d'exemple de tels iigands biologiques, on peut citer notamment., un matériel protélque ou glycoprotéiqu tel qu'un antigène, un haptène, un anticorps, une protéine., une oanofitine, un peptide» une enzyme, u sucre et les fragments de ceux-ci, une lectine ; mais aussi un matériel nucléique tel qu'un acide nucléique (ADN ou A N), un fragment d'acide nucléique,, une sonde ou une amorce» L'invention est particulièrement adaptée aux Iigands biologiques choisis parmi les antigènes, haptènes et protéines.
Par « entité biologique cible »f on entend un matériel biologique dintérêt A titre d'exemple de tels matériels biologiques d'intérêt» on peut citer les anticorps, les récepteurs,, les haptènes,, les antigènes, les protéines, les peptldes» les enzymes,, les sucres, les acides nucléiques.
Les anticorps Jouant le rôle de ligand biologique pour l'entité biologique cible sont des anticorps poiyclonaux ou monoclonaux.
Les anticorps poiyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animai avec, comme immunogène, l'entité biologique cible» un fragment de ce dernier ou encore un équivalent proche sur le plan structurai , suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée» par prélèvement du sérum à ài animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par ehromatographie d'affinité sur une colonne, sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment ilmmunogène.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybrkfomes, largement connue de l'homme du métier, Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier,
 titre d'exemple de fragments d'anticorps, on peut citer les fragments Fabf Fab! f F(ab!)2 ainsi que les chaînes scFv (de l'anglais « Single chain variable fragment »), dsFv (de l'anglais « Doubie-stranded variable fragment »), Ces fragments fonctionnels peuvent notamment être obtenus par génie génétique.
Les nanofitines (nom commercial) sont de petites protéines qui, comme les anticorps, sont capables de se lier à une cible biologique permettant ainsi de la détecter, de la capturer., ou tout simplemen de la cibler au sein d'un organisme.
Le terme « hap ène » désigne des composés non Immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux-mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par productio d'anticorps, mais capables d'être reconnus par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier, par Immunisation avec un conjugué haptène-protéine, Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être,, par exemple, des peptides glyeosylés., des méta olites, des vitamines., des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et les nudéotides.
Le terme « lectine » désigne des protéines qui se lient spécifiquement et de façon réversible à certains sucres. Elles jouent un rôle majeur dans (Immunité, en reconnaissant les glucides spécifiques de certains agents infectieux pathogènes, Un exemple de lectine est la Concanavaline A (hémagglutinine) qui est responsable entre autres de lshémagglut!nafion,
Les ligands biologiques utilisés peuvent être spécifiques ou non de l'entité biologique cible, Ils sont dits spécifiques., quand ils sont capables de se lier de façon exclusive, ou quasi-exclusive, à Tentité biologique cible. Ils sont dits non spécifiques lorsque la sélectivité d liaison à l'entité biologique cible est faible et qu'ils sont alors capables de se lier à d'autres entités biologiques telles que d'autres protéines ou anticorps. D'une manière générale, on préférera utiliser un ligand biologique spécifique de l'entité biologique cible. Bien entendu, le ligand biologique se comportant comme un partenaire de liaison pour l'entité biologique cible est choisi en fonction de l'entité biologique cible que l'on souhaite détecter :
- si l'entité biologique cible est un anticorps, le ligand biologique est un antigène qui reconnaît ledit anticorps,, de préférence spécifiquement ;
- si l'entité biologique cible est un antigène; le ligand biologique est un anticorps qui reconnaît ledi antigène, de préférence spécifiquement ;
- si l'entité biologique cibie est un récepteur, le ligand biologique est une protéine qui se lie audit récepteur,, de préférence spécifiquement ;
- si l'entité biologique cible est un haptène, le ligand biologique est un anticorps ou une protéine qui reconnaît ledit haptène, de préférence spécifiquement.
L'invention est particulièrement adaptée aux cas où le ligand biologique est un antigène,, un haptène,, ou une protéine.
Par « fonction réactive » présente, d'une part, sur le polymère et d'autre part, sur le ligand bioiogique., on entend soit une fonction capable de former un lien cuvaient par réaction avec une autre fonction réactive, soit les fonctions activables qui conduisent à une fonction réactive après activation. De telles fonctions réactives X sont choisies, à titre d'exemple., parmi les groupements ester, halogénocardonyie, sulfhydrite, disuifure, aminé (MHz), acide carboxylique (COOH), hydrazine, hydrazone, azîde, isocyanate, isothiocyanate, alcoxyamine, aldéhyde, époxy, n trlle, maléimide, halogënoalkyie, hydraxyle, thfol, alcyne (~OCH-), maléîmide et les fonctions activabies par un agent activant comme les car odiimides ou des composés homo- ou bétéro-bifonctionnels. On pourra notamment utiliser un acide carboxy!ique activé sous forme d'ester de N- hydraxystrcdnimide, de pentachlorophényle, de trichlorophényie, de p~ nîtrophényte, de arboxyphényle.
La ou les fonctions réactives présentes sur le ligand bioiogique et permettant de former une liaison cove lente entre le polymère des micelles et le ligand biologique peuvent exister naturellement sur le ligand bioiogique. Par exemple, dans le cas d'un ligand biologique de type protéine possédant une composition en lysine suffisante., les amin s portées par la chaîne latérale de la lysine peuvent être utilisées pour le couplage. Néanmoins, dans de nombreux cas, les fonctions réactives doivent être 'Introduites" préalablement par exemple sous la forme d'un tag, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Un tag peut être défini comme une séquence d'acides aminés rapportée., c'est-à- dire ajoutée à la structure originale d'une protéine utilisée en tant que ligand biologique, qui est introduite en un lieu privilégié de ladite structure originale pour lui permettre d'être exposée de façon pertinente, en particulier, vis-à-vis de sa fixation covalente sur le polymère, Dans le cas où le ligand biologique est un matériel protéîque, il est, par exemple, possible d'utiliser un tag comprenant six résidus lysine, ou dérivé de lysine, ou plus, et éventuellement, d'autres acides aminés. De tels tags peuvent se trouver à un endroit quelconque de la protéine. De préférence, dans le cas où le ligand biologique est une protéine, le tag sera situé à son extrémité -ou C-terminale.
De nombreuses méthodes pour introduire des fonctions réactives sur un ligand biologique sont disponibles ; pour les protéines, antigènes,, anticorps ou polypeptides, voir par exemple "Chemlstry of protein conjugation and cross-linking", Wong S. S., CRC pness, Boca Raton, 1991 ou "Bioeonjugate techniques", Hermanson G, T Académie Press, San Diego,, 1996- Pour les acides nucléiques, on synthétise, par exemple, un polynucléotide par méthode chimique su support, solide ayant une fonction réactive à un endroit quelconque de la chaîne comme, par exemple, l'extrémité 5! ou l'extrémité 3' ou sur une base ou sur un phosphate internucléotidique ou sur la position 2! du sucre (voir Protocols for OUgonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties édité par S. Agra al, Humana Press, Totowa, New Jersey), Des méthodes d'introduction de fonctions réactives sur des haptènes sont données notamment dans "Préparation of antigenic sterold-proteïn conjugate", F ohen et ai dans Steroid immunoassay Proceedings of the flf h tenovus workshop, Cardiff, Avril 1974, ed. EHD Cameron, SH, Hillier, K, Griffiths, comme, par exemple, Introduction d'une fonction hémisuccînate en position 6, 11, 20 ou 2i, d'une fonction chioroformîate e position II ou d'une fonction carboxyméthyle en position 6, dans le cas de la progestérone.
La fonction réactive présente sur le polymère d'une part, et celte présente sur le ligand biologique d'autre part, seront choisies de manière à réagir Tune avec l'autre et former une liaison covaleote établissant un lien permanent entre les chaînes polymère d'une micelle et les ligands biologiques. Par exempte, on peut coupler une fonction aminé primaire sur un acide carboxylique activé, notamment par le N-hydroxy succinimlde ou sur un aldéhyde ; une fonction alcoxyamine avec une cétone ou un aldéhyde ; une fonction hydrazine avec un aldéhyde ; ou bien encore une fonction thiol sur un halogénoalkyie ou un maléimlde. De manière connue, dans le cas d'un couplage entre une aminé et un aldéhyde, il est préférable de réduire l'imine formée, soit simultanément par l'action de N3BH3CN, soit dans une étape ultérieure par action de aBH ou NaBH3CN.
De manière avantageuse, en moyenne, de 0,1 à 100 molécules de ligand biologique seront fixées par chaîne polymère et les micelles seront porteuses, en moyenne, de 10 à 500 000 molécules de ligand biologique suivant leur masse molaire et leu nature. A titre d'exemple, sur les micelles de copolymère polylactide~b"PGly( ~vinylpyrrolidone~co~ - acryloxysuednlmide) {PLA~h-F( VP~co-MAS)) utilisées dans les exemples qui vont suivre (dont une chaîne comporte en moyenne 80 fonctions réactives de type esters de N-hydroxy succirsimide), i a pu être couplé (en PBS pH 7,4) environ 7500 protéines p24 par micelles (masse molaire p24 : 24000 g/mol), soit environ une protéine par chaîne. Ce nombre de ligands peut être déterminé à partir du dosage des fonctions aminé résiduelles du ligand après la réaction de couplage (méthode de dosage à l'acide 2,4,6-trinitrobenzene sulfonique ou à la fluorescamine) et peut être complété par un gel d'éiectropborèse SDS-PÂGE dans le cas du couplage de protéines. Bien entendu, étant donné que le plus souvent les chaînes polymères seront porteuses de plusieurs fonctions réactives, plusieurs molécules de ligand biologique pourront donc être fixées sur une chaîne polymère, multipliant ainsi ie nombre de molécules de ligand biologique fixées par micelle,
Le couplage étant réalisé sur les micelies de copolyoïère., la fixation du ligand du côté de l'extrémité du bloc hydrophile,, fortement déployée en solution est favorisée, facilitant ainsi sa future reconnaissance par la cible, Le couplage du ligand sera d'autant plus efficace que le nombre de fonctions réactives sur le bloc hydrophile (particulièrement sur sa partie externe la plus déployée en solution) sera élevé. L'état micellaire du polymère lors du couplage du ligand permet d'orienter ia fixation du ligand vers le bout de chaîne hydrophile du polymère., et donc de favoriser son accessibilité en solution.
De manière à contrôler la taille et la distribution en taille des chaînes polymères, et ainsi la distribution en taille des miceiles obtenues à partir des chaînes polymère, on utilisera., de préférence., des techniques de polymérisation contrôlée pour ia préparation des polymères, telles que la polymérisation contrôlée par les nitroxydes., MNP, la polymérisation par transfert d'atome (ATRP), la polymérisation radicaiaire par transfert réversible de chaîne par addition/fragmentation (RAPT) ou encore la polymérisation ionique.
Dans la plupart des cas, le copolymère est obtenu en deux étapes. Dans les exemples qui vont suivre, ie premier bloc hydrophobe ρο!γ(0,1- lactide) est obtenu par polymérisation pa ouverture de cycle d'un monomère D,t-lactide, fonctionnalisé en bout de chaîne par un fragment nitroxyde 561, capable d'amorcer la copolymérlsaton par NMP du couple de monomères I -vinyl-pyrrolidone ( VP, monomère hydrophile) et N- acryloxysuccinimide (NAS., monomère fonctionnel., porteur de fonctions esters de -hydroxysuccinimide<
La formation de miceiles à partir de polymère amphiphile peut se faire selon toute technique connue. En particulier, ia méthode d solvant commun, la plus utilisée., est décrite ci-après (G. Riess., Prog, Poïym. Sci. 28 1107-1170,. (2003)}. Le po ymère sera dissout dans un solvant,, le plus souvent organique, qui permet de solubiliser à la fols la partie hydrophobe et la partie hydrophile du polymère, de manière a obtenir la soiubllisation du polymère. Un tei solvant peut être choisi parmi ceux miscibles à l'eau (acétone, aeétonitrlle, i,4-dioxane, tétra ydrofurane (THF) ou encore dimé hyi-sulfcxyde (DMSO)) et sera sélectionné en fonction de la nature du copoiymère amphlphile. De l'eau est ensuite ajoutée, conduisant à la formation des miceiles, puis le solvant initial est éliminé, par évaporation sous pression réduite (dans le cas de solvant(s) suffisamment voiati!(s), de type acétone, aeétonitrlle, THF) ou dialyse contre l'eau (dans te cas de solvant(s) plus « iourd(s) », type DMSO). Typiquement, la gamme de concentration en copoiymère dans le solvant organique est de ί à 15 mg/ml et les ratios volume de solvant organique/eau de 1 a 0,2. Une telle technique est décrite dans le cas d'un polymère du type polv1aciide-b«poly{ -v!nylpyrroiidone~co- ~ acryloxysuccinimide) {, LA- -P{ A5~co- VP)}f dans la publication N. Handké et al. Macromol. Biosci, 13, 1213-1220 (2013),. à laquelle on pourra se référer pour plus de détails. D'autres méthodes bien connues de préparation de miceiles pourron être utilisées, en particulier, la méthode de dialyse consistant à placer le copoiymère en solution dans un solvant commun dans un dispositif de dialyse, et effectuer une dialyse contre de l'eau. La méthode de dissolution directe du copoiymère dans l'eau pourra également être utilisée dans le cas de copolymères présentant une balance hydrophiie/hydrop obe élevée.
De manière connue, le support solide peut se présenter sous toutes formes appropriées telles qu'une plaque, un cône, une bille, la bille étant éventuellement radioactive, fluorescente, magnétique et/ou conductrice, une barrette, un tube de verre, un puits, une feuille, une puce, une plaque de micro-titration ou analogues. Lorsque le support est sous la forme de billes, celles-ci ont, le plus souvent, un diamètre allant de la centaine de micromètres au nanomètre. Le matériau du support est, de préférence, choisi parmi ies latex, les polystyrènes, les copolymères styrène-butadiène, tes copolymères st rène-butadiène en mélange avec un ou plusieurs polystyrènes, poiypropylènes, polycarbonates, copolymères polystyrène-aerylonitrile, copolymères styrène- méthylméthacrylate de méthyie parmi les fibres synthétiques et naturelles ; parmi les poiysaccharides et les dérives de la cellulose ; parmi le verre, le silicium et leurs dérivés.
Le conjugué micelle-ligand biologique sera immobilisé sur le support solide, par tout moyen approprié, le plus souvent par adsorpdon. Une telle immobilisation peut être réalisée par absorption « passive » sur la phase solide, notamment par le biais d'interactions de type hydrophobe, électrostatique, Van der Waals, ou liaison hydrogène, dont la contribution relative dépendra de la nature du polymère amphiphile, du ligand couplé et du support solide dlmmoNilsation. Les mêmes conditions que celles appliquées., et classiquement utilisées par l'homme du métier, pour llmmobilisation d'un ligand biologique sur un support solide, pourron être mises en œuvre. En particulier,, on pourra déposer une dispersion des micelies porteuses de ligands biologiques dans une solution aqueuse tamponnée. De manière avantageuse, la solution aqueuse tamponnée sera formée d'un solvant ou mélange de solvants constitué à au moins 90% en masse, de préférence à au moins 95% en masse, et encore plus préférentiellement à au moins 99% en masse d'eau. Les tampons classiquement utilisés dans le domaine du diagnostic, pourront être mis en oeuvre., de manière à obtenir et stabiliser le pH dans la gamme souhaitée en fonction de la nature du ligand biologique. On pourra, par exemple., utiliser un tampon PBS (tampon phosphate salin} ou tris (tris- hydroxyméthylaminomé hane). Aux concentrations de copolymère utilisées, supérieures à la CMC du polymère., on peut raisonnablement estimer que ifadsorpt!on est régie essentiellement par l'interaction entre le ligand en surface des micelies et la phase solide, Ces interactions (de type électrostatique et/ou hydrophobe,...) sont à priori les mêmes que celles qui seraient mises en jeu pour le ligand libre, déposé seul sur le support solide de capture. L'état micellaire est très généralement conservé sur le support, comme te montrent la plupart des études de visualisation de micelles par microscople électronique et/ou microscople à force atomique, qui requièrent un dépôt sur support (Cho et ai, 3 Am Chem Soc, 128, 9935-9942 (2006), Gensel et al, Soft Matter, 7, 11144 (2011)). Toutefois, le dépôt d'une fraction du conjugué copoiymère- ligand déposé sous forme unimère n'est pas à exclure, particulièrement suivant la nature des copolymères, ligands et supports ut lisés (Freij- Larsson, Blomaterlals, 17, 2.199-220? (1996)}. Néanmoins, l'immobilisation conduira à des micelles formées du polymère arnphipbile porteuses en surface d'une pluralité de molécules du ligand biologique immobilisées sur le support solide, même si un part du polymère amphiphlie aura pu perdre son organisation sous forme micellaire.
Au final, au moins une partie des micelles sont encore formées et se trouvent immobilisées sur le support., principalement par des interactions support-ligand, et dans une moindre mesure potentiellement par des interactions support - polymère comme illustré Figure 2,
Les phases de capture décrites ou obtenues dans le cadre de l nvention pourront être utilisées dans le but de détecter et/ou doser et/ou purifier une entité biologique cible. L'utilisateur pourra directement disposer du support solide sur lequel le conjugue micelie-iigands biologiques est immobilisé ou d'un kit comprenant un support solide et une dispersion des conjugués micelle-llgands biologiques décrits dans le cadre de l'Invention dans une solution aqueuse, et procéder lui-même à l'immobilisation- La solution aqueuse sera,, avantageusement constituée d'un solvant ou mélange de solvants constitué à au moins 90% en masse, de préférence â au moins 95% en masse, et encore plus préférentiel lement â au moins 99% en masse d'eau. Là encore; il s'agira d'une solution aqueuse tamponnée, comme décrit précédemment,
Les phases de capture décrites ou obtenues dans le cadre de l'invention pourront être mises en œuvre dans toute technique de détection et/ou de quantification d'une entité biologique cible dans un échantillon biologique. Par « quantification », on entend que la concentration de l'entité biologique présente est déterminée. Par « échantillon biologique », on entend tout échantillon biologique animal,, de préférence humain, susceptible de contenir une entité biologique d'intérêt. Ces échantillons sont largement connus de l'homme du métier, ils peuvent correspondre à un prélèvement de fluide biologique, par exemple de sang total, de sérum, de plasma, d'urine, de liquide céphalo- rachidien, de sécrétion organique, â un prélèvemen tissulaire ou à des cellules isolées. Ce prélèvement peut être utilisé tel quel, ou bien il peut subir préalablement â la mise en œuvre du procédé de détection et/ou quantification,, une préparation de type enrichissement ou cul u ; selon des méthodes connues de l'homme du métier. Les échantillons mis en œuvre dans les procédés de détection et/ou quantification peuvent, en effet, être préalablement modifiés ou non avan leur utilisation. A titre d'exemples d'échantillon non préalablement modifié, on peut citer les fluides biologiques tels que le sang total, et à titre d'exemples d'échantillon préalablement modifié, on peut citer le sérum, le plasma, les celluies que l'on récupère à partir d'une biopsie, ou suite â une chirurgie, et que l'on met en culture in vitro. Le procédé de détection ou de quantification pourra alors être réalisé dans le surnageant de culture, ou encore dans le lysat cellulaire.
Les techniques de détection et/ou quantification utilisent, en général, en plus de la phase de capture, un traceur ou phase de détection, permettant la détection de l'immobilisation de l'entité biologique cible sur la phase de capture. De telles phases de détection ou traceur comprennent un marqueur.
Le procédé de détection et ou quantification pourra mettre en œuvre une détection directe ou indirecte.
Dans un procédé de détection direct, l'échantillon susceptible de contenir l'entité biologique cible est mis en contact avec la phase de capture et i liaison entre le ligand biologique, immobilisé sur l support et l'entité biologique cible est alors mise en évidence grâce à la présence d'un traceur. Le traceur correspond généralement à un Hgand biologique de l'entité biologique cible (le plus souvent différent du ligand biologique immobilisé sur le support au niveau de la pbase de capture) couplé à un marqueur,
Les procédés de détection indirect, également nommés procédés par compétition, sont également des dosages largement connus de l'homme du métier et utilisés, notamment, lorsque l'entité biologique cible est un haptène. Il consiste à doser l'entité biologique cible., dans l'échantillon,, en créant une compétition entre l'entité biologique cible de l'échantillon et un analogue de cette entité biologique cible, Dans ce cas, l'échantillon susceptible de contenir l'entité biologique cible est mis en contact avec la phase d capture, en présence d'un analogue de l'entité biologique cible. La liaison entre le ligand biologique immobilisé sur le support et l'entité biologique cible est alors mise en évidence grâce à la présence d'un traceur, indirectement par détection de la liaison entre le ligand biologique immobilisé sur le support et l'analogue de l'entité biologique cible.
L'analogue de l'entité biologique cible est utilisé dans la réaction de compétition, après couplage à un marqueur pour former un conjugué ou traceur. Le signal mesuré émis par le traceur est alors inversement proportionnel à la quantité d'entité biologique cible de l'échantillon .
Par marqueur, on entend toute molécule capable de générer directement ou indirectemen un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs de détection directe consiste en ;
* les enzymes qui produisent un signai détectable, par exemple, par colorimétne,. fluorescence, luminescencef comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline,, la β-galactosidase., la glueose~6~ phosphate déshydrogénase,.
» les cbroniophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,,
* les molécules radioactives comme le 32Pf le 5S ou le n%
» les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou Ses p ycocyanines, et * tes sels élec rochimiîumines nts tels que des dérivés organo- métailiques à base d'acridinlum ou de ruthénium.
Des systèmes indirects de détection peuvent aussi être utilisés, comme., par exemple, des ligands capables de réagir avec un antt-iigand. Le ligand correspond alors au marqueur pour constituer, avec l'analogue de l'entité biologique cible, le traceur,
De tels couples Hgand/antHigand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas, par exemple,, des couples suivants : biotine/streptavidl e, ha tène/antieorps, antigène/anticorps,, peptide/anticorps,, sucre/lectine, polynucléotide/compléroentaire du po ynudéotide,
L'antMigand peut alors être détectable directement par les marqueurs de détection directe décrits précédemment ou être lui-même détectable par un autre couple ligand/antl-ligand, et ainsi de suite,
Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire., dans certaines conditions., à une amplification du signai, De telles techniques d'amplification du signal sont bien connues de l'homme du métier, et Ton pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR 2781802 ou WO 95/08000 de la Demanderesse.
Selon le type de marquage utilisé, l'homme du métier ajoutera de réactifs permettant la visualisation du marquage ou l'émission d'un signal détectable par tout type d'appareil de mesure approprié, comme, par- exemple, un spectrophotomètre, un spectrofluori mètre ou encore une caméra haute définition.
De manière classique,, pour déterminer la quantité d'entité biologique cible présente dans un échantillon, le signal, proportionnel (dans le cas d'un procédé direct) ou inversement proportionnel (dans le cas d'un procédé indirect) à la quantité d'entité biologique cible de l'échantillon, pourra être comparé à une courbe de calibration obtenue au préalable par des techniques largement connues de l'homme du métier. Ainsi; par exemple, la courbe de calibration est obtenue en effectuant un dosage utilisant le même ligand biologique, ainsi que des quantités croissantes connues d'entité biologique cible. Une courte est ainsi obtenue en mettant en abscisse, la concentration en entité biologique cible et en ordonnée, le signal correspondant obtenu après dosage,
Le procédé de détection/quantification selon l'invention peut être directement appliqué au format de tests commerciaux disponibles pour la détection/quantification d'entité biologique cible, A titre d'exemple particulier de ligand biologique pour lesquelles l'invention pourra être appliquée, on peut citer les protéines p24, et g i20 du VîH, les protéines core, NS3f S4 et S5 du virus de l'hépatite C, les protéines ORF2 et ORF3 du virus de l'hépatite Ef l¾ligosaccharide gaiactomannan des champignons du genre AspergMus, Dans ce cas, les entités biologiques ciblées sont les immunoglobuHnes (réponse humorale) dirigées contre ces pathogènes. D'autres exemples particuliers de ligand biologique pour lesquelles l'invention pourra être appliquée sont les biomarqueurs de pathologies humaines comme la protéine S10GS, les troponines I et T, l'hormone anti-muhlérienne (AMH), ia procaicitonine, le PSA (prostate- spécifique antigène) et les autres marqueurs tumoraux. Dans ce cas, les entités biologiques ciblées sont des auto-anticorps. Bien entendu, il est possible d'appliquer l'invention au biomarqueurs apparentés chez l'animal.
Les exemples ci-après, en référence aux figures annexées, permettent d'illustrer l'invention et mettent en évidence son intérêt pour obtenir une sensibilité de détection améliorée.
La Figore î est une représentation schématique de micelies porteuses de ilgands biologiques, dans le cas d'un copolymère amphiphile de type bloc
La Fi§yre 2 est une représentation schématique de micelies porteuses de Ilgands biologiques immobilisées en surface d'un support, qui met en évidence les Interactions entre les micelies et le support ; A) par (Intermédiaire du iîgand présent en surface des micelies ; B) par l'intermédiaire du polymère amphiphile (via une chaîne hydrophile) ; C) par adsorpdon sous forme unîmère (via partie hydrophobe / hydrophile
/ou iigand.
La Figyre 3 illustre la préparation des micelies couplées à la p24, utilisées dans tes exemples ci-après,
La Figure 4 présente les résultats obtenus avec un test ELISA avec p24 libre (o) ou p24 couplée aux micelies (·) en capture ainsi qu'avec les micelies seules (□) (dans les mêmes conditions de dilution qu'avec la p24).
Les Flgyre S et SB présentent les résultats obtenus avec le même format de test ELISA que dans le cas de la Figure 4, mais en faisant varier la concentration en anticorps de détection, avec une immobilisation réalisée avec une concentration de p24 de a) :10 pg/mL (Figure 5A), b) : 1 pg/mL (Figure SB) ; graphes en signal d'absorbanœ pure et rapport Signal/Bruit en fonction de la dilution en anticorps (Ab).
Les Figure SA et 6i présentent l'influence des conditions de couplage (dilué ou concentré) de la p24 sur le gain de sensibilité en ELISA après une immobilisation réalisée avec une concentration de p24 de : a) :10 pg/ml (Figura SA), b) : 1 pg/ml (Figure SB); graphes en signai d'absorbanœ pure et rapport signal/bruit en fonction de la dilution en anticorps.
La igure 7 met en évidence la stabilité des micelies- 24 évaluées en ELISA après une immobilisation réalisée avec une concentration de p24 de 1 pg/ml ; graphes en signal d'absorbance pure et rapport signal/bruit en fonction de la dilution en anticorps,
La Figure 8 présente différentes conditions d'immobilisation de l'antigène S10ÔB sur le support solide utilisées ci-après.
Les Figure §A et § présentent les résultats ELISA pour les différents types dimmobllisation réalisés conformément à la Figur© 8 ; graphes en signal d'absorbante pure et rapport Signal/Bruit en fonction de la concentration en anticorps ( ab). Exemples
Une étude portant sur l'utilisation de micelles formées de copolymère po!ylactide~b~poiy(N"Viny1pyrrolîdone-co-N~ acryfoxysucdnimide) (PLA-b-PC AS-co- VP)) (de masses molaires respectives 19000 et 22000 g.moî1 pour les blocs PLA et P(r AS~oo- VP)) a été réalisée. Les micelles ont été préparées par la méthode du solvant commun (acétonitrile). Le couplage de protéinesf jouant le rôle de iigand biologique pour l'anticorps cible, est réalisé via leurs fonctions aminé lysin ou M-termlnale (voir Figure 3} avec les fonctions réactives ester de -succinîmidyle (NS) des unités MAS présentes sur la couronne des micelles.
L'effet de l'utilisation de conjugués micei le- protéine sur l'augmentation de la sensibilité de tests immuno-enzymatîques, en phase de capture., a été mis en évidence :
1) pour 3 sources d'antigènes différents :
a> p24 recorn binante, protéine de eapside du VIN, b. troponine I cardiaque complexe I-T-C de chez Hytest, c protéine native extrait de cerveau bovin S1008 de chez HyTest ;
2) sur 2 techniques d mmunodosage :
a, technique manuelle ELISA,.
b, technique automatisée VIDAS commercialisée par la société bioMérieux.
ETUDE EtïSA SUR IA ET CTIOM &mim m &mi~p24 COUPLAGE DE L' TIGÈ P24 SUS LES H CELLES DE COPOLYMÈRE
Préparation des miceifes
Les micelles sont préparées par la méthode du solvant commun (ou nanoprécipitation), Le copolymère (20 mg) est dissout dans 2 ml d'acétonitrlle, puis,, cette solution est ajoutée avec un débit régulier à 4 mL d'eau milli-Q, L'acétonitrile est évaporé sous pression réduite, La solution aqueuse micellaire obtenue est typiquement de 5,2 mg.mL^ (détermination précise par mesure du taux de solide après passage en étuve). La taie moyenne des micelles est de 56 rsm.
Couplage de la protéine (p24)
Le couplage de la protéine sur les micelles (PLA-b-P(MAS-co- VP)} est réalisé en ajoutant un volume (typiquement 500 pL) de dispersion de micelles à 5,2 mg/mL au même volume de solution de p2 en PBS pH 7,4 à des concentrations variables (0 à 2,4 mg.mL"1). Le milieu de couplage final contient donc les micelles a 2,6 mg.mL et la protéine à des concentrations variant de 0 à 1,2 mg.mL*1. Les échantillons sont placés sur une roue pour agitation pendant 20 h à température ambiante.
La Figure 3 illustre une telle préparation,
CARACÏERISATIO DES COUPLAGES SDS PAGE
L'analyse SDS-PAGE montre que, pour une quantité introduite de
0f12 mg de p24 par mg de copolymère, le couplage est total Lorsqu'on augmente cette quantité (de 0,24 à D;4B mg/g), de plus en plus de protéine libre est détectée, indiquant une « saturation » de la surface des micelles, et donc un couplage non quantitatif. La condition retenue pour la suite est celle correspondant à un couplage quantitatif, le. 0,12 mg de p24 par mg de copolymère, soit p24 à 0,3 mg/mL et 2,6 mg/mL copoiyrnère»
Dosage des fonctions aminé résiduelles restant sur la protéine après couplage {% modification des aminés)
90 μί du milieu de couplage est placé une plaque 96 puits (noire,
NUNC) et 30 pi de fluorescamine (dans le DMSO) à 0,4 mg/mLsont ajoutés. Après 20 minutes (à l'abri de la lumière), la lecture de fluorescence est réalisée avec un fluorimètre TECA â une longueur d'onde d'émission de 477 nm (longueur d'onde d'excitation : 416 rsm). Le % d'amines modifiées est déterminé par le rapport 100-(î du milieu
Jkto protéine S fe*100), Suite au couplage, ie % d'aminés modifiées obtenu est d'environ
100%,
Diamètre hydrodynamique des miœfiesp24 (DIS)
Le diamètre hydrodynamique des micelles diluées au 1/50 dans une solution de aCI i mM, est mesuré par diffusion dynamique de 'sa lumière (DLS, pour Dynamic Light Scattering) à l'aide d'un appareil
Zetasizer ano S90 (Malvern, U ).
Le diamètre hydrodynamique des mlceiies es de 100 nm pour le contrôle en milieu de couplage PBS (mlœlles sans p24) ; l'hydrolyse des fonctions réactives esters de NS en carboxyiates entraîne un déploiement des chaînes hydrophiles}, et de i 11 nm pour les micelles ayant couplé la p24,
Taisleau i, L'indice de poiydispersité faible (1P< 0,05} indique des tailles bien homogènes, que ce soit avant ou après couplage. La concentration micel!aire critique a été déterminée par DIS et par fluorescence à l'aide au fîuorophore hydrophobe Mile Red, comme reporté précédemment (Handké et al Macromot. Biosci., 13, 1213-1220 (2013)}. Elle est de Tordre de 10 pg/mt, sans différence significative entre les micelles et les mîcelles~p24.
Tableau i« Taille des micelles de référence (mises dans les conditions de couplage 2β mg/mL copoiymère en tampon PBS mais sans p24) et des miceiles-p24.
Mieeife dsamètre fp 24 (mg rog CMC hydrodynsmii u co polymère) (Mg mL)
(nm)
MiceiSe-ref 99,8 ± 5,B 0,03 ± 0,01 12 ± 4
ÎS/llceiie-p2 S 0,04 ± 0,01 0,115+ 0,005 10 ±.3
PROTOCOLE ELISÂ FOUR LA DÉTECTION D'ANTICORPS ΑΝΠ-Ρ24
La p24 couplée ou libre a été immobilisée sur la phase solide (plaque de mlcrotltration Nunc MaxISorp F) à différentes concentrations en PBS (dilutions en cascade)f pendant 12 heures à température ambiante ; ia passivation est réalisée en PBS - Sérum de cheval (SC) 10% ; détection avec un anticorps anti-p24 biotioylé (lapin) dilué en PBS-Tween-SC 10%, suivie de l'addition de streptavidine-peroxydase CHRP) en PBS-T een-HS 10%, et révélation avec la 3,3',5,5'- tétraméthylbenzidine (TMB) (absorbance a 450 nm); les contrôles p24 libre et micelles seules sont systématiquement préparés dans les mêmes conditions que celles du couplage, mais en absence respectivement de micelles et de p24. RÉSULTATS ELISA
Les résultats obtenus sont représentés en Flg res 4 et 5 et montrent un gain Important du signal de détection d'anticorps, par rapport à la p24 libre. Par ailleurs, le copolymère testé en absence de p24 aux différentes dilutions n'entraîne pas de bruit de fond significatif. Ce gain de sensibilité est confirmé en travaillan avec une immobilisation réalisée avec une concentration de p24 (couplée ou libre) de 10 pg/mL ou i pg/ml et: en faisant varier ia concentration en anticorps de détection.
INFLUENCE DES CONDITIONS DE COUPLAGE SUR LE GAI DE SE SIBILIT EN ELISA
L'étude qui suit, montr que l'état mi llaire (Le, nanobjet d'environ 100 nm) est indispensable lors du couplage de la protéine pour augmenter la sensibilité du test de diagnostic (Le. permet l'orientation de la protéine vers la phase liquide grâce au couplage préférentiel vers l'extrémité du bloc hydrophile).
A, Couplage en milieu dilué / concentré
- Couplage « concentré » : il s'agit du couplage de la protéine dans les conditions ci-dessus (micelles à 2,6 mg.mL"1 et p24 à 0.3 rng.mL1 en PBS). Comme montré par SDS-PAGE, le couplage est totai dans ces conditions et les tailles de micelles-p24 sont de 111 nm (ÎP~Q.Ô4). Le milieu de couplage est ensuite dilué en PBS, afin d'Obtenir des concentrations en p24 de 10 pg.mL"1 (88 pg.mL en micelle) ou de 1 pg.ml"1 (8,8 pg.nil"1 en niicelle) pour l'Immobilisation sur la plaque ELISA,
- Couplage « dilué » : le couplage de la p24 est ici réalisé directement dans les conditions utilisées pour l'Immobilisation sur la plaque ELISA, Le. :
* 10 pg,ml 1 de p24 et 88 pg.rnL4 de mleeile en PBS ; pour cela 100 pi de p24 à 0,6 mg.ml"1 et 100 pl de micelle à 5,2 mg.mL"1 sont ajoutés à 5.8 ml de PBS et la solution est agitée sur roue pendant 20h,
* 1 pg.ml'1 de p24 et 8.8 pg.ml"1 de micelle en PBS ; pour cela 10 pl de p24 à 0.6 mg.mLT et 10 pl de micelle à 5,2 mg.mL"1 sont ajoutés à 5,98 ml de P8S et la solution est agitée sur roue pendant 20h, Comme le montre le Tableau 2, les diamètres hydrodynamiques obtenus pour les différents milieux de couplage (mesure directe sur les milieux de couplage à 1 et 10 Mg.mL"1 en p24) montrent que l'état mieellaire n'est pas préservé dans le cas du couplage « dilué », comme en témoignent les tailles en nette augmentation et les indices de poiydispersité très élevées, qui mettent en évidence des phénomènes d'agrégation, contrairement aux milieux issus du couplage p24 en conditions concentrées. Ceci peut être expliqué par le fait que le couplage de la p24 se déroule dans des conditions relativement proches de la CMC du copolymère (88 pg/ml et 8,8 pg/ml de copolymère respectivement pour les couplages à 10 et 1 pg/ml p24, la CMC étant de 10 pg/ml). Ainsi, l p24 en se couplant, accentue davantage la capacité du copolymère, déjà importante (en raison de sa concentration proche de la CMC), à quitter la micelle pour former des unimères. Les miœlles étant déstabilisées., il peut s'ensuivre une réorganisation du système avec des processus d'agrégation plus ou moins contrôlés, Notons que pour les mlcelles placées dans tes mêmes conditions de couplage mais en absence de p24, les tailles observées par DIS sont de 91 nm (Ιρ-Ο,ΟΞ) pour la concentration de 88 pg/rnt, et de 77 nm (Ιρ=0,3) pour la concentration 8,8 pg/ml (témoignant d'un état mi fiaire fragilisé aux concentrations proches de la CMC, car la taille standard des mlcelles de copolymère seul est de 100 nm avec Ip=G,03, Tableau i). Ainsi cfest bien a priori la présence de p24 pour le couplage dans ces conditions qui accentue le processus de déstabilisation des mlcelles.
Ces conditions de couplage en milieu dilué, conduisant à un milieu « non mlcellaire », aboutissent à une baisse de sensibilité en ELISA par rapport à la p24 libre (Figure €),. alors qu'un gain significatif est confirmé pour les conditions standards (couplage à l'état concentré) maintenant l'état mieefeire, Taolea 2, Tailles obtenues pour les différents milieux de couplage
(mesure directe sur les milieux de couplage à 1 et 10 pg.ml'1 en p24) diamètre
Type [p24]
hydrodynamique Pi
couplage
(nm)
Con entré 10 105 0,13
Concentré I 100 Q,2
Dliuê 10 200 0,5
D?iué 1 210 0,5
Conclusion :
Ces études montrent que pour avoir un gain significatif de la sensibilité en ELISA, il est indispensable de réaliser le couplage de la protéine sur le copolymère organisé sous la forme de mlcelles. Ainsi, il est nécessaire de faire réagir la p24 sur les miceiles, dans un milieu aqueux de concentration en copolymère nettement supérieure à la CMC, afin de préserver l'état mlcellaire, ETUDE DE STABILITÉ
Les micelles-p24 (0,3 mg/ml) de p24 ont été conservées à 4°C pendant 1 mois. Par comparaison au contrôle p24 libre, le plus apte à une sensibilité optimale (p24 du fournisseur donnée à 2,4 mg/ml, conservée à ~2Q°€)f les mïcelles-p24 conservent leur supériorité en termes de sensibilité (Figure 7).
ETUDE VIDÂS SOU LA DÉTECTION D'AITOCORPS ANTI-TIWPONIN ï
Le même copolymère PLA-b~P{ ÂS-co- VP) que précédemment, a été utilisé pour le couplage de la Tnl (TTC) en vue de la détection d'anticorps antl-Tnl sur un automate d'immunœssai VIDAS® commercialisé par la société bîoMéneux.
La protéine Tnl a été couplée sur les miceifcs de PtÂ~b~P( A$~co~ NVP) en PBS à une concentration de 0,137 mg/mL en Tnl et 0,868 mg/mL de micelles (0/158 mg de Tnl par mg de copolymère). Le couplage a été analysé par gel SDS-PAGE, qui met en évidence que le couplage sur les micelles semble presque total, puisque la Tnl libre nfest pas détectée. La Tnl ainsi couplée sur les micelles a été testée sur VîDAS®(bio érieux) et comparée à la Tnl seule, aux micelles seules sur la phase solide.
Le test automatisé VIDAS est composé de 2 éléments :
1- la cartouche est une barrette plastique contenant .10 puits scellés avec un film aluminium dans lesquels sont réparties les différentes solutions,
2- le cône, appelé SP (Soiid Phase Réceptacle), fait office de système de pipetage et de phase solide. Chaque réactif de la cartouche est aspiré, puis, refoulé par le cône. Sur les cônes sont immobilisées soit de la Tnl libre (ITC) à 0,03 pg/ml, soit les micelles seules à 0,190 Mg/mL, soit des mlcelles-Tnl à 0,03 pg/mL en Tnl et 0,190 pg/mt en copolymère, dans un volume de 300 pL.
A lissue de l'étape d'immobilisation, qui est faite à température ambiante sur 12 heures, les cônes sont vidés, puis mis en contact avec te tampon de passlvation (tampon Tris 0,2 M pH 6,2) contenant un agent de saturation de type protéique ou peptidique. Les cônes sont ensuite séehés et conservées à + 4°C jusqu'à utilisation.
Dans un deuxième temps, les 3 phases de capture préparées ont été comparées, en les faisant réagir avec un traceur qui est un mélange de deux anticorps mono lonaux anti Toi (clones 16ΑΠ et 789 commercialisés pa HYTEST, Suède). Pour des raisons de praticité,. cet anticorps est directement couplé â l'enzyme phosphatase alcaline, permettant de réduire le nombre d'étapes de la réaction Immunologique et d'en diminuer la durée (protocole DEX2 du VIDAS®, durée totale environ 40 min). La concentration d'utilisation de ce traceur est d 0,14 pg/mL dans un volume de 400 pL La génération du signai se fait par ajout du substrat 4~Héthyio mbellif eryf phosphate ; l'enzyme du conjugué catalyse la réaction d'hydrolyse de ce substrat en 4-Méthyiombe iferone dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm.
Le Ts&Wea 3 résume les résultats obtenus en VIDAS® sur les Tnl couplées au polymère sous la forme de micelles et non couplées,
Le rapport signal sur bruit est amélioré lorsque la Tnl est couplée au polymère,
Taisleay 3« Résultats VIDAS de la Tnl couplée au polymère par rapport à une Tnî non couplée,
j Résultat I
I SP contrôle | 0 j
[SP Tnrïibre O?ô3' pQ/mi j 72 ;
j rapport signai / bruit ; 72
I SPR mieelies seules Qfî9Q pg/mî en \ ii
I copolymère j
i SPR miceife-Tnï 0,03 pg mt en Tnî | iiSi
0 0 pg ml en copolymère \ Conclusion
Le couplage de l'antigène sur te copolymère., organisé sous forme de micelles, permet d'améliorer la sensibilité de détection.
L'objectif de cette étude est de montrer la nécessité d'utiliser des micelles de copolymère porteuses d'antigène, pour augmenter la sensibilité des tests de diagnostic pour l'immobilisation d'antigène.
L'antigène retenu pour cette étude est la protéine $1008 (antigène natif, extrait de cerveau bovin, HyTest).
Le polymère est le PLA-b-P(NAS-co-NVP) comme dans les exemples précédents. Il est utilisé soit sous une forme micellalre (en dispersion en tampon 100% aqueux), soit dissous dans du DMSO (forme "copolymère") pour couplage avec l'antigène 51008 en milieu 5% DMSO- 95% tampon aqueux. Ces deux protocoles, menés en parallèle, sont réalisés pour évaluer l'influence des conditions de couplage, c'est-à- dire couplage en milieu 100% aqueux avec micelles versus couplage en milieu semi-organique DMSO/eau avec œpolymère initialement dissous en DMSO, su le gain de sensibilité du test ELISA, La condition de couplage protéine/copolymère en milieu DMSO/tampon aqueux est classiquement reportée dans la littérature (Allard et al, Bioconjugate Chem. 2001, 12, 972-979...)·
Les couplages polymère-antigène sont réalisés soit en solution en tube Eppendorf, soit sur rnicroplaque ELISA après immobilisation de la mleelle ou du copolymère.
RÉALISATION DES OUPLAGES
A, Préparation de conjugués mlcelle-SiOOB
Les micelles de copolymère PLÂ~P(NÂS-co~N¥P) ont été préparées comme précédemment reporté dans Γ « Etude ELISA sur la détection d'anticorps antl-p24 ». Elles sont initialement à une concentration de 5,21 mg/mL, avec une taille (avant couplage) de 56 nm et un Ip=0,l- La solution de protéine S100B a été diluée à la concentration de Qf6 mg/mL en P8S IX,
Le protocole de couplage,, identique à celui réalisé pour celui de la protéine p24 est décrit dans le Tabtea 4 ci-après.
Tableay 4
Incubation 18 heures à temp rature ambiante.
B. Préparation de conjugués polymère-SlOOB en DMSO Le protocole de couplage, est décrit dans le Titblea S ci-après
Incubation .1.8 heures â température ambiante. DES OUPLAGES
Dosage des fondions anime résiduelles restant sur la protéine après couplage (% modification des aminés)
Le dosage est réalisé comme précédemment rapporté pour la protéine p24, Suite au couplage, le % d'amines modifiées est d'environ 100%,
ELISA SÎ00B
5 conditions différentes,, présentées schématlquement Figure B ont été évaluées : i- La référence SiOOB Immobilisée directement sur ia plaque de microtitra lon (S100 ref)f
2~ Les copolymères sous forme de micelies seules immobilisées sur la plaque dans une première étape (micelies seules ref)f puis le couplage en plaque, sur micelies immobilisées, de la protéine SiOOB (micelies puis S10Q),
3- Les copolymères en D SO 5% seuls, non miceltaires, immobilisés sur la plaque dans une première étape (copo ref), puis le couplage en plaque, sur copolymère immobilisé, de la protéine SIOOB {copolymère puis SiOG),
4- L'Immobilisation des conjugués rnïeelfc-SiOÛB réalisés en tube Eppendorf (micelies + SiOQ) et
5~ L'Immobilisation des conjugués polymère e DMSO 5% + S1D0B réalisés en tube Ependorf (copolymère - S100).
Réalisation de l'EUSA
Dans une microplaque,. 96 puits ( unc Haxisor F96) sont distribués 100 pL/puits de micelies seules (lere étape condition 2} ou de copolymère seul (1ers étape condition 3) dilués en eau à 74 pg/ L La microplaque es Incubée 12h, à température ambiante, sous agitation, afin d'obtenir Ladsorption, puis vidée. Afin de réaliser les couplages en conditions diluées, dans la microplaque directement, on ajoute 100 pL/puits d'une solution de SIQ0B à S pg/mL, dans les puits préalablement incubés avec les micelies seules ou le copolymère seul. Par ailleurs., dans les puits vides, on distribue 100 μΐ/pults de S100B à 5 pg/mL (condition i, Si 00 ref), ou du conjugué micelles-SÎÛQB à 74 pg/mt de micelies et 5 pg/mL de S10QB (condition 4), ou encore du conjugué copoiymère-SiOOB à 74 pg/mL de copolymère non miceilalre et 5 ug/ml de S1008 (condition 5), La mîcroplaque est incubée i2h supplémentaires, à température ambiante, sous agitation, afin d'obtenir l'adsorption (conditions 1, 4, 5) ou le couplage (conditions 2( 3), La microplaque est vidée puis,, trois lavages TES (Tris buffered saline)- Tween®-20 0,05%,. sont effectués. Les puits sont saturés en ajoutant 300 pL/puits de tampon de passivation (tampon Tris 0,2 H pH 6,2) contenant un agent de saturation de type protéique ou peptidique. La microplaque est incubée pendant 1 h à 37°Cf suivi de 3 lavages en TBS, Un anticorps anti-SlOOB (clone 8D5) sous forme de Fab' et couplé à la phosphatase alcaline est distribué (100 pL/puits, concentration variant de 0,2 à 1,2 Mg/mL), incubé pendant i h à 37°C, suivi de 3 lavages en T8S, Finalement, 100 pL/puits du substrat -nitrop ényl phosphate sont ajoutés, La lecture du signal colorimétrique est réalisée à 405 nm sur lecteur de microplaques,
La Figura 9A représente les résultats ELISA pour les différents types d'immobilisation réalisés. L'Immobilisation d'un conjugué micelles + S100B donne plus de signa! que fa protéine S100B immobilisée seule, sans augmentation du bruit de fond. Le rapport signal sur bruit est donc amélioré avec l'utilisation des micelles pour l'immobilisation de la protéine S100B (Figure SB). L'immobilisation du polymère + S100B Issu du couplage en milieu DMSO/eau n'induit, quant à elle, qu'une sensibilité très faible par rapport à la SiOOB libre. Enfin, le fait de coupler la protéine dans un second temps, sur les micelles (tampon 100% aqueux) ou le copolymère (milieu DMSO tampon aqueux) préalablement immobilisés sur la phase solide, n'apporte pas d'amélioration de sensibilité par rapport à la S100B libre»
Conclusion
Le couplage de l'antigène sur le copolymère sous forme de micelles permet d'améliorer la sensibilité de détection par rapport au système S100B libre, contrairement au même couplage sur le copolymère sous forme non~miceliaire (conditions semi-organiques DMSO/eau polymère initialement dissous en DMSO), ou par rapport au couplage à posteriori de l'antigène sur une phase solide modifiée par les rnscelles ou le même copolymère non mîcellaire»

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé de préparation d'une phase de capture pour la détection et/ou la quantification d une entité biologique cible, ladite phase de capture comportant un ligand biologique pour l'entité biologique, ledit ligand biologique étant lié de façon covaSente à un polymère amphiphile et étant immobilisé sur un support solide,, caractérisé en ce que ie ligand biologique est immobilisé sur le support solide, par mise en contact: du support solide avec une dispersion de micelles formées d'une pluralité de chaînes du polymère amphiphile, lesdites micelles étant porteuses en surface d'une pluralité de molécules du ligand biologique.
2 - Procédé de préparation seion la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère amphiphile présente une partie hydrophobe orientée vers ie cœur des micelles et une partie hydrophile à la surface des micelles, le ligand biologique étant couplé de manière cova lente sur la partie hydrophile.
3 ~ Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce u'après l'immobilisation, le polymère reste, au moins en partie, sous la forme de micelles, de sorte que des micelles formées d'une pluralité de chaînes du polymère amphiphile, lesdites micelles étant porteuses en surface d'une pluralité de molécules du ligand biologique liées de façon covalente au poiymère amphiphile, soient immobilisées à la surface du support.
4 - Procédé de préparation selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'immobilisation est réalisée dans un solvant ou mélange de solvants constitué â au moins 90% en masse, de préférence à au moins 95% en masse, et encore plus préfërentiellement â au moins 99% en masse d¾au.
5 - Procédé de préparation selon l'une des revendications i à 4» caractérisé en ce que les miceiies dans la dispersion et/ou les micelles Immobilisées au final sur le support sont formées de 100 à 5000 de chaînes de polymères et/ou sont porteuses de 10 à 500000 de molécules de ligand biologique. 6 - Procédé de préparation seion l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de couplage covalent, entre ie Ilgand biologique et le polymère amphîphiie, réalisée alors que le polymère se trouve sous la forme de mlcelles, de manière à former les mlcelles porteuses en surface d'une pluralité de molécules du Ilgand biologique,
7 « Procédé de préparation selon la revendication 6, caractérisé en ce que le couplage est réalisé dans un solvant ou mélange de solvants constitué à au moins 90% en masse., de préférence à au moins 95% en masse, et encore plus préférentiellement à au moins 99% en masse d'eau.
S » Procédé de préparation selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que le couplage est réalisé avec une concentration en polymère correspondant à au moins 50 fols, de préférence à au moins 2Ô0 fois la concentration micellaire critique du polymère et ou avec une concentration en polymère amphîphiie au moins 10 fois supérieure à celle utilisée lors de la mise en contact des mlcelles avec le support,
9 - Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polymère amphîphiie est un polymère linéaire à bloc comportant au moins un bloc hydrophile et au moins un bloc hydrophobe, le bloc hydrophile étant positionné au niveau de la surface des mlcelles, et étant porteur par liaison covalente, d'au moins une molécule du Ilgand biologique,
iû - Procédé de préparation selo Tune quelconque des revendications I à 9, caractérisé en ce que dans la dispersion de mlcelles, la densité moyenne de molécules de Ilgand biologique par chaîne de polymère est de 0>i à 100,, et notamment de 1 à 100.
11 - Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications i à 10, caractérisé en ce que la dispersio de mlcelles présente un indice de polydispersité de 0 à 0,2 déterminé par diffusion dynamique de la lumière. 12 - Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à il, caractérisé en ce que le polymère amphiphile présente une masse molaire supérieure à 5000 g/mole, préférentlellement supérieure à 10 000 g/mole,
Î3 - Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications i à 12,, caractérisé en ce que le polymère amphiphile comporte,, voire est exclusivement constitué d'un premier bloc linéaire consistant en un hornopolynière ydropho e résultant de la polymérisation d'un monomère A hydrophobe ; un deuxième bloc linéaire consistant en un copolymère hydrophile résultant de la co polymérisation d'un monomère i portant une fonction réactive X et d'un monomère C hydrophile, ne portant pas de fonction réactive, ledit deuxième bloc étant lié à une extrémité du premier bloc de manière covalen e.
14 « Procédé de préparation selon la revendication 13, caractérisé en ce que le monomère A est choisi parmi les dérivés hydrophobes de méthacrylate, acryla e, acrylamide,, méthacrylamide, les iactides, ou parmi le styrène et ses dérivés ; de préférence le monomère A est le n- butyl acrylate, le tertlobutyl acrylate, le tertlobutyl acrylamide, Poctadécyl acrylamide, le lactide., le lactide-co~glycolide ou le styrène,
15 - Procédé de préparation selon la revendication 13 ou 14,, caractérisé en ce que ie monomère est choisi parmi les dérivés fonctionnels d'acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide, les dérivés fonctionnels styrèniques ; de préférence le monomère S est le N~ acryloxy succinlmlde, le N-méthacryloxy succinimide, le 2-hydroxyéthyl méthacrylate, le 2-aniinoéthyl méthacrylate,, le 2-hydroxyéthyl acrylate, le 2-amtnoéthyl acrylate ou le l,,2i3f4~di-0 sopropy1idène-6~0~acr>'loyl~ D-galactopyranose.
îi - Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 13 à 15,, caractérisé en ce que ie monomère B est porteur d'une fonction réactive X, choisie parmi les fonctions -NH¾ -CGOH, -OHf -SH, -D H, les groupements ester., hatogénocarbonyte, suEfhydriie, dîsuifure, hydrazine, hydrazone,, azide, isocyanate, isothiocyanate, alcoxyamine, aldéhyde,, époxy, nitriîe, malélmlde, hatogénoalkyle, maléimide, parmi les fonctions actlvables par un agent activant comme les carbodiimldes,, et notamment un acide carboxylique activé sous forme d'ester de -hydroxysuccinimide,, de pentachlorophényie, de tnchioropliényle, de p-nltrophényle, de carboxyphényle, ou encore parmi les composés homo- ou hétéro-bifonctlonnels.
17 - Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que le monomère€ est choisi parmi les dérivés hydrophiles d'acrytami e, de méthacrylamide, la - vinylpyrrolidone et l¾xyéthylène de préférence, le monomère C est la -vlnylpyrrolidone ou la N-acryloyl morpholine,.
18 - Procédé de préparation selon i'une quelconque des revendications 13 â 17, caractérisé en ce que le premier bloc a une masse molaire comprise entre 1000 et 250 000 g/mole,
35 ~ Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que le deuxième bloc a une masse molaire supérieure à 1 000 g/mole et, de préférence, supérieure à 2 000 g/mole.
20 - Procédé de préparation selon "une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que le deuxième bloc est un copolymère statistique dont la composition exprimée par le rapport des quantités de monomères en mole,, quantité de monomère C sur quantité de monomère B appartient, de préférence, à la gamme allant de ί à 10, préférentiellement allant de 1,5 à 4..
21 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 caractérisé en ce que le Iigand biologique est un antigène, un haptène, ou une protéine.
22 - Phase de capture d'une entité biologique cible caractérisée en ce qu'elle comporte des mlcelles immobilisées sur un support solide, lesdites mlcelles étant formées d'une pluralité de chaînes d'un polymère amphiphiie, et lesdites mlcelles étant porteuses en surface d'une pluralité de molécules, d'au moins un Iigand biologique pour l'entité biologique cible, iesdltes molécules du ligand biologique étant liées de façon covalente aux chaînes du polymère amphlphile,
23 » Phase de capture selon la revendication 22, caractérisée en ce que les micelles sont immobilisées par adsorptlon sur le support solide.
24 - Phase de capture selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'au moins une partie des micelles sont Immobilisées par adsorptlon sur le support solide par l'intermédiaire d'une interaction ligand biologique/support solide,, une partie des micelles pouvant éventuellement être Immobilisées par adsorptlon sur le support solide par l'Intermédiaire d'une interaction polymère/support solide, les Interactions mises en jeu pouvant, notamment, être des liaisons électrostatiques ou ioniques, ou des interactions hydropho es.
25 - Phase de capture selon Tune quelconque des revendications 22 à 24, caractérisée en ce qu'une partie des ligand biologiques, correspondant en particulier à au moins 50% des ligands biologiques présents sur la phase de capture, est accessible et disponible pour interagir et se lier avec une entité biologique cible.
26 » Phase de capture seion l'une quelconque des revendications 22 à 25,, caractérisée en ce que les micelles immobilisées sur le support sont formées de 100 à 5000 de chaînes de polymères et/ou sont porteuses de 10 à 500 000 de molécules de ligand biologique»
27 ~ Phase de capture selon Tune quelconque des revendications 22 à 26, caractérisée en ce que le polymère amphiphïie est un polymère linéaire à bloc comportant au moins un bloc hydrophile et au moins un bloc hydrophobe, le bloc hydrophile étant positionné en surface des micelles, et étant porteur par liaison covalente., d'au moins une molécule du ligand biologique.
2S - Phase de capture selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisée en ce que le polymère amphiphile présente une masse molaire supérieure à 5 000 g/molef préférentielle ment supérieure à
10 000 g/mole. 29 - Phase de capture selon l'une quelconque des revendications 22 à 28, caractérisée en ce que le polymère amphlphile comporte, voire est exclusivement constitué d'un premier bloc linéaire consistan en un homopolymère hydrophobe résultant de la polymérisation d'un monomère A hydrophobe ; un deuxième bloc linéaire consistant en un copolymère hydrophile, résultant de la copolyménsatlon d'un monomère B portant une fonction réactive X et d'un monomère C ydrophile ne portant pas de fonction réactive, ledit deuxième bloc étant lié à une extrémité du premier bloc de manière covalente.
30 » Phase de capture selon la revendication 26, caractérisée en ce que le polymère amphlphile est tel que défini à l'une quelconque des revendications 14 à 20.
3Î « Phase de capture selon Tune quelconque des revendications 22 à 30, caractérisée en ce que fe iigand biologique est un antigène., un haptène, ou une protéine,
32 - Dispositif de détection et/ou de quantification d'une entité biologique cible comprenant une phase de capture selon Tune quelconque des revendications 22 à 31 et au moins un traceur pour la détection.
33 - Dispositif de détection et/ou de quantification d'une entité biologique cible comprenant une phase de capture obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications .1 à 21 et au moins un traceur pour la détection.
3 - Trousse de détection et/ou de quantification d'une entité biologique cible comprenant :
un support solide ;
une dispersion en solution aqueuse de miceiles formées de chaînes d'un polymère amphlphile, porteuses en surface d'une pluralité de molécules d'au moins un Iigand biologique pour l'entité biologique cible, lesdites molécules de Iigand biologique étant liées de façon covalente aux chaînes du polymère amphlphile ; et au moins un traceur pour la détection.
35 - Procédé de détection et/ou de quantification in vitro d'une entité biologique cible dans un échantillon biologique, selon lequel : on dispose d'une phase de capture selon Tune quelconque des revendications 22 à 31, on met en contact ledit échantillon biologique avec au moins la phase de capture, et on détecte et/ou on quantifie ladite entité biologique cible fixée sur la phase de capture, après liaison de l'entité biologique à une molécule de ligand biologique liée de façon covalente aux chaînes du polymère amphiphile de la phase de capture.
36 - Procédé de détection et/ou de quantification m vitro d'une entité biologique cible dans un échantillon biologique, selon lequel : on dispose d'une phase de capture obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications i à 21, on met en contact ledit échantillon biologique avec au moins la phase de capture ainsi obtenue, et on détecte et/ou on quantifie ladite entité biologique cible fixée sur la phase de capture, après liaison de l'entité biologique â une molécule de ligand biologique liée de façon covalente aux chaînes du polymère amphiphile de la phase de capture.
37 « Procédé de détection et/ou de quantification in vitro d'une entité biologique cible dans un échantillon biologique, selon lequel : on prépare une phase de capture selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 â 21, on met en contact ledit échantillon biologique avec au moins la phase de capture ainsi préparée, et on détecte et ou on quantifie ladite entité biologique cible fixée sur la phase de capture, après liaison de l'entité biologique à une molécule de ligand biologique liée de façon covalente aux chaînes du polymère amphiphile de la phase de capture.
38 - Procédé de détection selon l'une des revendications 35 à 37 caractérisé en ce qui! s'agit d'un procédé direct,, dans lequel l'échantillon susceptible de contenir l'entité biologique cible est mis en contact avec la phase de capture et la liaison entre le ligand biologique immobilisé sur le si
support et l'entité biologique dble est mise en évidence grâce à la présence d'un traceur,
39 - Procédé selon la revendication 38 caractérisé en ce que le traceur est un ligand biologique de l'entité biologique cible couplé à un marqueur,
4Û - Procédé de détection selon l'une des revendications 35 à 37 caractérisé en ce qui! s'agit d'un procédé indirect dans lequel l'échantillon susceptible de contenir l'entité biologique cible est mis en contact avec la phase de capture., en présence d'un analogue de l'entité biologique cible et la liaison entre le ligand biologique immobilisé sur le support et l'entité biologique cible est mise en évidence grâce à la présence d'un traceur, indirectement par détection de la liaison entre le ligand biologique immobilisé sur le support; et l'analogue de l'entité biologique cible.
41 ~ Procédé selon la revendication 40 caractérisé en ce que le traceur est l'analogue de l'entité biologique cible couplé à un marqueur,
42 - Procédé selon la revendication 39 ou 41 caractérisé en ce que le marqueur est choisi parmi les enzymes,, chromophores, molécules radioactives, molécules fluorescentes et les sels éleetrochimiluminescents,
EP15766894.8A 2014-08-04 2015-08-03 Procédé de production d'une phase de capture pour la détection d'une cible biologique, procédés et kits de détection associes Withdrawn EP3177927A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1457578A FR3024547B1 (fr) 2014-08-04 2014-08-04 Procede de production d'une phase de capture pour la detection d'une cible biologique, procedes et kits de detection associes
PCT/FR2015/052146 WO2016027021A1 (fr) 2014-08-04 2015-08-03 Procédé de production d'une phase de capture pour la détection d'une cible biologique, procédés et kits de détection associes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3177927A1 true EP3177927A1 (fr) 2017-06-14

Family

ID=52102767

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP15766894.8A Withdrawn EP3177927A1 (fr) 2014-08-04 2015-08-03 Procédé de production d'une phase de capture pour la détection d'une cible biologique, procédés et kits de détection associes

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20170227532A1 (fr)
EP (1) EP3177927A1 (fr)
FR (1) FR3024547B1 (fr)
WO (1) WO2016027021A1 (fr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111830289B (zh) * 2020-07-24 2023-01-03 长春理工大学 一种利用原子力显微术对生物素化抗体-IgE免疫复合物直接成像的方法
CN114539539B (zh) * 2022-03-18 2023-04-21 中国科学技术大学 条形码胶束及其制备方法、检测方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE533176C2 (sv) * 2007-07-12 2010-07-13 Euro Diagnostica Ab Antigenexponerande micell

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None *
See also references of WO2016027021A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20170227532A1 (en) 2017-08-10
FR3024547B1 (fr) 2016-08-26
WO2016027021A1 (fr) 2016-02-25
FR3024547A1 (fr) 2016-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hoshino et al. Design of synthetic polymer nanoparticles that capture and neutralize a toxic peptide
FR2917174A1 (fr) Analyse multiple d&#39;echantillons sanguins
CA2157811A1 (fr) Microsphere de latex biotinylee, procede de preparation d&#39;une telle microsphere et utilisation en tant qu&#39;agent de detection biologique
FR2997194A1 (fr) Dispositif pour la determination d&#39;au moins un analyte susceptible d&#39;etre contenu dans un echantillon liquide
WO2017109376A1 (fr) Diluant de reactifs
WO1998047000A2 (fr) Procede et reactif de mise en evidence d&#39;un materiel biologique cible
EP3177927A1 (fr) Procédé de production d&#39;une phase de capture pour la détection d&#39;une cible biologique, procédés et kits de détection associes
KR20080054963A (ko) 앱타머를 포함하는 폴리다이아세틸렌 센서칩 및 그제조방법
JPWO2018194152A1 (ja) アルドステロン及びレニンの検出方法
WO2015150583A1 (fr) Contrôles pour la mise en oeuvre de procédés d&#39;analyse multiplexe
FR2476320A1 (fr) Nouveau reactif immunologique pour la detection en tubes du facteur rhumatoide dans un echantillon biologique et procede de preparation de ce nouveau reactif
EP1247096B1 (fr) Procede d&#39;immobilisation de reactif(s) affin(s) sur phase solide hydrophobe
FR2690921A1 (fr) Polypeptides de synthèse appartenant au virus de l&#39;hépatite C (VHC) et utilisables notamment pour détecter ce dernier.
JP5099787B2 (ja) 定量分析方法
EP0132170B1 (fr) Procédé de détection d&#39;un oligomère dans un milieu liquide contenant des monomères correspondants, dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé, et application notamment à la recherche d&#39;allergènes
EP3436827B1 (fr) Procédé de détermination des concentrations actives et/ou des constantes cinétiques d&#39;interaction dans des échantillons biologiques complexes en résonance plasmonique de surface
Jiménez-Sánchez et al. Improving bioassay sensitivity through immobilization of bio-probes onto reactive micelles
JP2006138656A (ja) 分子インプリントゲル、その製造方法、該分子インプリントゲルを用いる検体中の対象分子の測定方法および対象分子測定用試薬
JP2015230293A (ja) 生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用試験片及び生体分子検出用標識試薬
CN110824106A (zh) 受试物质的检测方法
JP6691790B2 (ja) 共重合体、これを用いたコーティング剤、及びコーティング方法
JPH06160389A (ja) 抗原、抗体およびハプテン検出用のリポソーム免疫検定法
EP0598014B1 (fr) Utilisation d&#39;atélocollagène comme support solide de fixation d&#39;un capteur spécifique
WO2024056508A1 (fr) Procédé de diagnostic in vitro pour détecter la présence d&#39;une cible à l&#39;aide de protéines membranaires stabilisées
US20210299625A1 (en) Microparticle for Bioanalytical Investigations and Method for Producing Such a Microparticle

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20170202

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20180323

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: GRANT OF PATENT IS INTENDED

INTG Intention to grant announced

Effective date: 20200909

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20210120