EP2776812A1 - Systeme de detection et/ou de quantification in vitro par fluorimetrie - Google Patents

Systeme de detection et/ou de quantification in vitro par fluorimetrie

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Publication number
EP2776812A1
EP2776812A1 EP12773073.7A EP12773073A EP2776812A1 EP 2776812 A1 EP2776812 A1 EP 2776812A1 EP 12773073 A EP12773073 A EP 12773073A EP 2776812 A1 EP2776812 A1 EP 2776812A1
Authority
EP
European Patent Office
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signal
digital
fluorescence
demodulation
carrier frequency
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12773073.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Véronica Lucia ROSSI
Giuseppe FERORELLI
Massimo Galdiero
Franco Francini
David Jafrancesco
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP2776812A1 publication Critical patent/EP2776812A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/062—LED's
    • G01N2201/0624—Compensating variation in output of LED source

Definitions

  • the present invention relates to a system for the detection and / or in vitro quantification by fluorimetry of at least one analyte present in a sample of fluid constituting a biological material.
  • the present invention finds application in automated in vitro diagnostic instruments in the clinical field or in the industrial field.
  • diagnosis is made from a human biological sample (urine, blood, saliva, pus, cerebrospinal fluid, etc.), for the detection or quantification of analytes, whether or not derived from external microorganism (bacterium, virus, parasite, antibodies, etc.) in the form of immunological tests or molecular biology tests.
  • a human biological sample urine, blood, saliva, pus, cerebrospinal fluid, etc.
  • analytes whether or not derived from external microorganism (bacterium, virus, parasite, antibodies, etc.) in the form of immunological tests or molecular biology tests.
  • microbiological tests In the industrial field, the diagnosis is made from a sample of food, pharmaceutical or cosmetic product, to control the microbiological quality of the product in the form of microbiological tests. Such microbiological tests generally verify either the sterility (no microorganism should be present), the absence of pathogenic bacteria (at the origin of an infection), or even a commensal bacterium (normally present in humans and trivial in low concentration) is present only below a certain threshold.
  • the invention can also find an application in the field of dynamic analysis, that is to say in real time, in this case in immunological tests and molecular biology tests where the immunological / biological reactions can be controlled or monitored in time.
  • the invention relates more particularly to an in vitro fluorimetric detection and / or quantification system comprising:
  • an optical splitter disposed at the output of the radiation source for dividing the main beam into a first excitation beam of the sample and a second reference beam;
  • a first photodetector means adapted to deliver a first analog detection signal in response to a detection of a radiation of fluorescence emitted by the sample, in a so-called fluorescence wavelength, under the effect of the excitation induced by the first excitation beam;
  • second photodetector means adapted to output a second analog detection signal in response to a detection of the second reference beam.
  • Such in vitro detection and / or quantification systems are known, in particular in automated in vitro diagnostic fluorimetry instruments, as for example in EP 0 864 089 B1, EP 0 871 863 B1, EP 0 241 268 A1, and WO 2004/055502 A2, which employ radiation sources of the pulsed light source type, laser lamp or arc lamp.
  • the analysis of the signals coming from the two photodetector means is carried out by an analog processing, in particular with a fluorescence peak detection algorithm representative of the presence / amount of analyte to be detected.
  • analog processing lies essentially in its limitations to reduce noise, and therefore to increase the signal-to-noise ratio.
  • the state of the art also includes the teaching of WO 00/37850 A1 which relates to an apparatus for measuring the emission delay time during irradiation of a sample, comprising a system generating first and second digital input signals a device for converting these two signals into sinusoidal signals analog, a source of radiation modulated at a specific frequency and which irradiates the sample, which causes the generation by the sample of a emission.
  • the apparatus also includes an emission detector from the sample, which produces a first output signal having a phase shift with respect to the phase of the first input signal, and a device for digitizing the first and second output analog signals, a mixer receiving the output signals and comparing the phase of the signal to produce a phase change indicator signal.
  • a feedback device alters, on the basis of the mixer signal, the phase of the second input signal to quadrature the first and second output signals.
  • the object of the present invention is to provide an in vitro fluorimetric detection and / or quantification system comprising signal processing means providing detection / quantification of the analyte with improved sensitivity obtained by increasing the signal-to-noise ratio. .
  • an optical splitter disposed at the output of the radiation source for dividing the main beam into a first excitation beam of the sample and a second reference beam;
  • a first photodetector means designed to deliver a first analog detection signal in response to a detection of fluorescence radiation emitted by the sample, in a so-called fluorescence wavelength, under the effect of the induced excitation by the first excitation beam;
  • second photodetector means adapted to output a second analog detection signal in response to a detection of the second reference beam
  • a generator delivering a sinusoidal carrier signal at a predefined frequency called carrier frequency, and at least one demodulation digital signal at this same carrier frequency; a digital / analog conversion means connected to the generator for converting the carrier sinusoidal signal into an analog modulation signal at the carrier frequency;
  • an amplitude modulator connected to the digital / analogue conversion means and to the radiation source for amplitude modulating the main beam at the carrier frequency, by applying the analog modulation signal to said radiation source;
  • digital processing means connected to the generator and to the analogue / digital conversion means, designed for firstly processing the first digital fluorescence signal by demodulation at the carrier frequency so as to calculate a first so-called fluorescence value characteristic of the amplitude of the fluorescence radiation and, on the other hand, processing the second digital reference signal by demodulation at the carrier frequency in order to calculate a second so-called reference value characteristic of the amplitude of the reference beam;
  • the system according to the invention performs a digital processing by amplitude modulation and demodulation, which achieves particularly interesting signal-to-noise ratios.
  • Such digital processing is preferably carried out with a light-emitting diode (LED), especially in the UV spectrum, as a radiation source, since the light-emitting diodes are particularly well suited for modulating control.
  • LED light-emitting diode
  • the following digital processing makes it possible to reject / limit the noise.
  • first digital fluorescence signal and the second digital reference signal are separately demodulated at the same frequency corresponding to the carrier frequency of the carrier sinusoidal signal, before making the comparison which will make it possible to extract the final result which is preferably present as a relative fluorescence unit (RFU).
  • REU relative fluorescence unit
  • the digital processing means comprise:
  • first demodulation means adapted to demodulate the first digital fluorescence signal, by multiplying it by at least one demodulation digital signal at the carrier frequency, in order to generate at least a first demodulated fluorescence signal
  • a first calculation means designed to calculate, from the at least one first demodulated fluorescence signal, the first fluorescence value.
  • the first demodulation means comprises:
  • a first multiplier by a demodulation digital signal at the carrier frequency and in phase with the carrier sinusoidal signal, said first multiplier possibly being followed by a first low-pass filter at a cut-off frequency lower than the carrier frequency, in order to delivering a first demodulated fluorescence signal said in phase;
  • a second multiplier by a digital demodulation signal at the carrier frequency and in phase quadrature with respect to the carrier sinusoidal signal, said second multiplier optionally being followed by a second low-pass filter at the same cut-off frequency, in order to deliver a first fluorescence demodulated signal said in quadrature phase;
  • the first calculating means calculates the first fluorescence value corresponding to the modulus of the sum of the first demodulated phase fluorescence signal and the first phase quadrature fluorescence demodulated signal.
  • the demodulation method corresponds to coherent demodulation in phase and phase quadrature which is particularly advantageous for improving the signal-to-noise ratio.
  • the system optionally comprises at least one low-pass filter, at a cut-off frequency lower than the carrier frequency, at the output of the first demodulation means for filtering the or each first demodulated fluorescence signal.
  • the digital processing means comprise, at the input of the first and second multipliers: a notch filter centered on the carrier frequency in order to filter the first digital fluorescence signal and to deliver a first filtered intermediate signal; and
  • the notch filter associated with the subtractor ultimately forms a bandpass filter excluding the frequency input component at the carrier frequency.
  • the digital processing means comprise:
  • second demodulation means adapted to demodulate the second reference digital signal, by multiplying it by at least one demodulation digital signal at the carrier frequency, in order to generate at least one second reference demodulated signal;
  • a second calculation means designed to calculate, from the at least one second reference demodulated signal, the second reference value.
  • the second processing means applies demodulation processing to the second digital reference signal, with the advantages relating to this type of method for improving the signal-to-noise ratio.
  • the second demodulation means comprises:
  • a first multiplier by a demodulation digital signal at the carrier frequency and in phase with the carrier sinusoidal signal, said first multiplier possibly being followed by a first low-pass filter at a cut-off frequency lower than the carrier frequency, in order to delivering a second reference demodulated signal said in phase;
  • a second multiplier by a digital demodulation signal at the carrier frequency and in quadrature phase with respect to the sinusoidal signal carrier, said second multiplier possibly being followed by a second low-pass filter at the same cut-off frequency, in order to deliver a second demodulated reference signal said in quadrature phase;
  • the second calculating means calculates the second reference value corresponding to the modulus of the sum of the second in-phase demodulated reference signal and the second quadrature phase demodulated reference signal.
  • the digital processing means comprise, at the input of these first and second multipliers: a notch filter centered on the carrier frequency in order to filter the second digital reference signal and to deliver a second intermediate signal filtered; and
  • the system further comprises, interposed between the radiation source and the optical divider, a band-pass optical filter centered substantially on the emission wavelength.
  • optical band-pass filter makes it possible to increase the signal at the level of the photodetector means, by improving at the source the signal by filtering the interfering frequencies.
  • the system further comprises, interposed between the sample and the first photodetector means, an optical bandpass filter centered substantially on the fluorescence wavelength.
  • the system further comprises, interposed between the band-pass optical filter and the first photodetector means, a waveguide made in the form of a guide cone.
  • the system further comprises, interposed between the optical divider and the second photodetector means, a low-pass optical filter having a low cut-off wavelength substantially less than the wavelength of program.
  • the system further comprises, interposed between the low-pass optical filter and the second photodetector means, a waveguide made in the form of a guide cone.
  • the carrier sinusoidal signal is in the form of a series of several sinusoidal periodic iterations at the carrier frequency, the time difference between two consecutive iterations being greater than the period of the sinusoidal iterations.
  • FIG. 1 is a schematic view of a system according to the invention.
  • FIG. 2 is a schematic view of a system according to the invention in a first configuration
  • FIG. 3 is a schematic view of a system according to the invention according to a second configuration
  • FIG. 4 is a graph respectively illustrating the transmission spectrum of a bandpass optical filter and the emission spectrum of a UV diode, both equipping a system according to the invention, as well as the excitation spectra. 4-MU and 4-MUP;
  • FIG. 5 is a schematic graph of a transmission spectrum of an optical divider equipping a system according to the invention.
  • FIG. 6 is a schematic graph of the variation of the photosensitivity of a photodiode equipping a system according to the invention, as a function of the wavelength of the detected radiation, at a temperature of 25 ° C .;
  • FIG. 7 is a schematic graph of the fluorescence spectrum of 4-MU, and the transmission spectrum of another bandpass optical filter and a guide cone, both equipping a system according to the invention
  • FIG. 8 is a schematic view of a system according to the invention illustrating its signal processing part, according to a first configuration
  • FIG. 9 is a graph illustrating the curves of variation as a function of time of the sinusoidal carrier signal SNM, of the first signal digital fluorescence SFN and the second reference digital signal SRN, these signals being in the form of four periodic sinusoidal iterations;
  • FIG. 10 is a graph illustrating an iteration for the three curves of FIG. 9;
  • FIG. 1 is a schematic view of two frames carrying the digital data for the system according to the invention
  • FIG. 12 is a schematic view of a system according to the invention illustrating its signal processing part, according to a second configuration corresponding to an improvement of the first configuration;
  • FIG. 13 is a graph illustrating the variation curve of the RFU as a function of the 4-MU concentration in the sample
  • FIG. 14 is a graph illustrating the variation curve of the driving current ID (t) as a function of time t for a pulse
  • FIG. 15 is a graph illustrating the variation curve of the driving current ID (f) as a function of the frequency f;
  • FIG. 16 is a graph illustrating the variation curve of the first analog detection signal SAD1 (t) as a function of time t for a pulse;
  • FIG. 17 is a graph illustrating the variation curve of the first digital fluorescence signal SFN (f) as a function of the frequency f;
  • FIG. 18 is a graph illustrating the variation curve of the function H No tch (f) as a function of the frequency f;
  • FIG. 19 is a graph illustrating the variation curve of the first filtered fluorescence signal SFN 0 (f) as a function of the frequency f;
  • FIG. 20 is a schematic view of a set of two multipliers, two low-pass filters and a calculation means for a first acquisition / processing module of the digital fluorescence signal;
  • FIG. 21 is a graph illustrating the variation curve of the demodulated intermediate phase signal SF S iN '(f) as a function of the frequency f;
  • FIG. 22 is a graph illustrating the variation curve of the SF C os' (f) phase quadrature demodulated intermediate signal as a function of the frequency f;
  • FIG. 23 is a graph illustrating the variation curve of the function H L p S mooth (f) as a function of the frequency f;
  • FIG. 24 is a graph illustrating the curve of variation of the first demodulated in-phase signal SF S iN (f) as a function of the frequency f;
  • FIG. 25 is a graph illustrating the variation curve of the first SF C os (f) phase quadrature demodulated signal as a function of the frequency f.
  • the first part of the description which follows relates to the architecture or structural part of the system 1 according to the invention for the in vitro detection and / or quantification by fluorimetry of at least one analyte present in a sample E of fluid constituting a biological material.
  • Figures 1 to 3 schematically illustrate the architecture of such a system 1 according to the invention and designed to equip an automated instrument for in vitro diagnostics.
  • This system 1 is intended in particular for fluorimetric analysis of the fluorescent radiation emitted during an immunological test based on 4-methylumbelliferone (4-MU), as resulting from the hydrolysis of the substrate 4-methylumbelliferyl phosphate (4 -MUP) in the sample E of fluid.
  • the function of this system is to perform an instantaneous measurement of the fluorescent radiation emitted by the 4-MU in the sample E, under the influence of an excitation beam adapted to excite the 4-MU, while avoiding to excite the 4-MUP substrate.
  • This system 1 comprises a frame B supporting a source of light radiation 10 emitting a main beam FP.
  • the radiation source 10 consists of a light emitting diode in the ultraviolet (UV LED).
  • the curves C3 and C4 of FIG. 4 respectively illustrate the excitation spectra of 4-MUP and 4-MU, as a function of wavelength (in nm), which have excitation peaks at 350 nm respectively. and 365-370 nm.
  • the maximum excitation peak of 4-MU is at 365 nm, it is preferable, however, that the main beam FP be centered around 370 nm. Indeed, a wavelength of 365 nm for the main beam would excite 4-MUP too much and thus cause harmful interference to the good fluorescence signal analysis of 4-MU.
  • the light-emitting diode 10 is therefore preferably emitting in a wavelength of approximately 370 nm; a diode being theoretically monochromatic.
  • the diode 10 consists of a reference diode "NSHU591 A Rank 6" marketed by the company NICHIA Corporation, transmitting in the wavelength range 370-375 nm, with a half spectrum width of 1 5 nm.
  • Curve C2 of FIG. 4 illustrates the spectrum of reference diode NSHU591A as a function of wavelength (in nm).
  • the system 1 further comprises a band-pass optical filter 1 1 centered on the wavelength of 370 nm; this optical band-pass filter 1 1 being disposed in front of the diode 10.
  • the optical band-pass filter 1 1 may consist of a reference band-pass optical filter "Biom-0007 Rev A-370/10" marketed by Semrock, having the following characteristics:
  • the curve C1 of FIG. 4 illustrates the transmission spectrum of such a band-pass optical filter 1 1 as a function of the wavelength (in nm).
  • the system 1 comprises, behind the band-pass optical filter 11, a convergence lens 12, such as a plano-convex lens. particularly well suited for a UV diode.
  • the system 1 further comprises, behind the convergence lens 12, an optical divider 13 for dividing the main beam FP into a first excitation beam FE of the sample and a second reference beam FR.
  • This optical divider 13 is for example made in the form of a semi-reflective mirror or semi-reflective prism or beam splitter.
  • the optical divider 13 may consist of a semi-reflective type BK7 glass prism having a refraction (or transmission) rate of about 95%, and a reflection ratio of about 5%; the first excitation beam FE corresponding to the beam refracted (or transmitted) by the optical divider 13 and the second reference beam FR corresponding to the beam reflected by the optical divider 13.
  • FIG. 5 illustrates the transmission spectrum of such a prism semi-reflective glass type BK7.
  • the refraction rate (or transmission) will subsequently be taken into account in the determination of the energy transmitted to the sample E.
  • the system 1 also comprises a support S for the sample E, this support S being positioned so that the first excitation beam FE irradiates the sample E and excites the 4-MU which will then emit an RF fluorescence radiation under the effect of the excitation induced by this first excitation beam FE.
  • the RF fluorescence radiation of 4-MU (or fluorescence signal of 4-MU) has an emission peak at about 450 nm.
  • Curve C1 1 in FIG. 7 illustrates the fluorescence spectrum of 4-MU which has an emission peak at about 450 nm.
  • the system 1 comprises a first photodetector means 14 designed to detect this RF fluorescence radiation, and deliver a first analog detection signal SAD1 in response to a detection of this RF fluorescence radiation.
  • the first photodetector means 14 is for example of the photodiode type, and the first analog detection signal SAD1 corresponds to a diode current (intensity in amperes).
  • the first photodetector means 14 consists of a reference silicon photodiode "S1227 BR" marketed by the company Hamamatsu, and FIG. 6 illustrates the variation of the photosensitivity as a function of the wavelength of the detected radiation. at a temperature of 25 ° C. It is thus noted that such a silicon photodiode has a photosensitivity of the order of 0.25 A / W for a wavelength of the order of 450 nm, corresponding to the length of the emission peak of the RF fluorescence radiation of 4-MU.
  • the system 1 comprises, in an RF fluorescence radiation guide channel placed between the sample E and the first photodetector means 14, a filter optical bandpass 141 and a waveguide 142.
  • the optical bandpass filter 141 is centered substantially on the wavelength of the RF fluorescence radiation, and thus on the wavelength of 450 nm for the detection of fluorescence of 4-MU.
  • the optical bandpass filter 141 has the following optical characteristics:
  • the curve C13 of FIG. 7 illustrates the transmission spectrum of such a band-pass optical filter 141, which has a transmission peak coinciding substantially with the peak of the fluorescence spectrum of the 4-MU illustrated on the curve C1 1.
  • the waveguide 142 is preferably in the form of a guide cone or optical cone, for example polymethyl methacrylate (PMMA), in order to channel the filtered RF fluorescence radiation by the optical bandpass filter 141 towards the first photodetector means 14.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • the guide cone 142 may have a high-pass filter characteristic, with a low cut-off frequency less than the wavelength of the RF fluorescence radiation, in this case less than 450 nm.
  • Curve C12 of FIG. 7 illustrates the transmission spectrum of such a guide cone 142 which has a low cut-off wavelength of the order of 375-385 nm.
  • FIG. 7 illustrates that the guide cone 142 does not influence the RF fluorescence radiation in spectral terms, and that the selected bandpass optical filter 141 is adapted for detection by the first photodetector means 14. optical characteristics of the filter band-pass optics 141 substantially coincide with the emission spectrum of the RF fluorescence radiation and strongly attenuate the interfering excitation signals emitted by the irradiated sample E.
  • the system also comprises a convergence lens 143 arranged at the entrance of the RF fluorescence radiation guide channel, before the band-pass optical filter 141 to converge the RF fluorescence radiation towards the guide cone 142; this convergence lens 143 may be of the biconvex lens type.
  • the first excitation beam FE interacts with the medium contained in the sample E, thus causing the emission of an RF fluorescence radiation that is collected by the lens 143, before passing through the optical bandpass filter 141 and the guide cone 142 to the first photodetector means 14.
  • the system 1 also comprises a second photodetector means 15 designed to detect the second reference beam FR, and deliver a second analog detection signal SAD2 in response to detection of the second reference beam FR.
  • the second photodetector means 15 is for example of the photodiode type, and the second analog detection signal SAD2 corresponds to a diode current (intensity in amperes).
  • the second photodetector means 15 is of the same type as the first photodetector means 14 and may be consists of a reference silicon photodiode "S1227 BR" marketed by Hamamatsu, and whose FIG. photosensitivity as a function of the wavelength of the detected radiation, at a temperature of 25 ° C. It is thus noted that such a silicon photodiode has a photosensitivity of the order of 0.1 7 A / W for a wavelength of the order of 370 nm, corresponding substantially to the length of the main beam FP , and therefore the second reference beam FR, after passing through the optical bandpass filter 1 1 described above.
  • the system 1 comprises, in a guide channel of the second reference beam FR placed between the optical divider 13 and the second photodetector means 15, a low-pass filter. 151 and a waveguide 152.
  • the low-pass optical filter 151 has a low cut-off wavelength substantially less than the wavelength of the second reference beam FR, which as a reminder is of the order of 370 nm.
  • the optical low-pass filter 151 has the following optical characteristics:
  • the waveguide 152 is preferably in the form of a guide cone or optical cone, for example polymethyl methacrylate (PMMA), in order to channel the second filtered reference beam FR by the low-pass optical filter. 151 towards the second photodetector means 15.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • reflecting mirrors 144 and 154 are arranged at 45 ° respectively after the convergence lens 143 on the guide channel of the RF fluorescence radiation and after the optical splitter 13 on the guide channel of the second reference beam FR, to be able to arrange the two photodetector means 14, 15 below the diode 10.
  • optical elements may be incorporated such as for example additional lenses.
  • the second part of the description which follows relates to the signal processing part of the system 1 according to the invention, which makes it possible to analyze the signals coming from the two photodetector means 14, 15 and to control the diode 10 to carry out a detection by fluorimetry of the analyte present in the sample E, with the advantage of obtaining a very satisfactory signal-to-noise ratio.
  • FIG. 8 schematically illustrates a system 1 according to the invention equipped with its signal processing part, according to a first configuration.
  • This signal processing part comprises three main blocks, namely: a preamplification block 2 (or “Preamplification Board”) connected to the two photodetector means 14, 15;
  • a digital signal processing unit 3 (or "Digital Signal Process Board") disposed at the output of the preamplification block 2 to calculate the quantity of analyte present in the sample;
  • control block 4 of the diode 10 (or "LED Driver Board") disposed at the output of the digital signal processing unit 3 and driving the diode 10 in current.
  • the preamp block 2 comprises:
  • a first analog / digital conversion means 21 connected to the first photodetector means 14 for converting the first analog detection signal SAD1 into a first digital signal known as SFN fluorescence.
  • a second analog / digital conversion means 22 connected to the second photodetector means 15 for converting the second analog detection signal SAD2 into a second digital signal called reference SRN.
  • FIG. 12 relating to a second configuration of the system 1 illustrates in a more complete and detailed manner the preamplification block 2.
  • the first analog / digital conversion means 21 comprises:
  • RD1 where RD1 corresponds to a first Ohm resistor used for the current conversion SAD1 / voltage VD1;
  • a first analog / digital converter 24 at the output of the first current / voltage converter 23 for converting the first detection voltage VD1 into the first digital signal called fluorescence SFN.
  • the second analog / digital conversion means 22 comprises:
  • RD2 is a second Ohm resistor used for current conversion SAD2 / voltage VD2; and a second analog-to-digital converter 26 at the output of the second current / voltage converter 25 for converting the second detection voltage VD2 into the second digital signal referred to as reference SRN.
  • the digital signal processing unit 3 comprises a modulation / demodulation signal generating module 30, which comprises:
  • a generator 300 delivering a sinusoidal carrier signal SNM at a predefined carrier frequency fo, which is fixed for the rest of the description at 2 kHz;
  • an analog output module 301 disposed at the output of the generator 30.
  • the SNM carrier sinusoidal signal is transmitted in 16-bit digital data packets, and is in the form of a series of several sinusoidal periodic iterations.
  • each iteration is formed of thirty-one sinusoidal oscillations.
  • Each sinusoidal oscillation (otherwise a single period of the sinusoidal signal) is constructed with forty sampling points each spaced at 12.5 ps (or 0.0125 ms).
  • the period of the sinusoidal signal inside an iteration is 500 is (ie 0.5 ms, corresponding to forty times 0.0125 ms). Consequently, each sinusoidal iteration lasts 15.5 ms, equivalent to thirty-one times the period of 0.5 ms, due to the thirty-one sinusoidal oscillations in an iteration.
  • the time difference between two consecutive iterations ie between the end of an iteration and the beginning of an iteration, is 80 ms, much greater than the period of sinusoidal oscillations (0.5 ms) and the duration an iteration (15.5 ms).
  • the periodicity of the iterations is 95.5 ms and in total, a series of four iterations generally lasts 302 ms between the first and last iterations.
  • the generator 300 also transmits two digital demodulation signals at this same carrier frequency fo, namely:
  • the generator 300 integrates a 90 ° phase-shifter to generate the COSINE demodulation digital signal.
  • the analog output module 301 at the output of the generator 300, successively comprises:
  • a digital / analog conversion means 303 for converting the SNM carrier sinusoidal signal, before filtering, into an initial modulation analog signal SAM 0 at the carrier frequency fo;
  • an analog processing module 304 which processes analogously the initial modulation analog signal SAM 0 to deliver an analog modulation signal SAM (or "LED Signal") at the carrier frequency fo, this analog modulation signal SAM forming an analog control signal of the diode 10.
  • this analog processing module 304 successively comprises:
  • a predefined gain amplifier 307 which outputs the analog modulation signal SAM.
  • control block 4 comprises an amplitude modulator connected to the digital-to-analog conversion means 303 and to the diode 10 for modulating in amplitude the main beam FP at the carrier frequency fo, by applying the analog modulation signal SAM on the diode 10.
  • the control block 4 more specifically comprises a voltage / current converter 40 for converting the analog modulation signal SAM into a control current ID of the diode 10 via a resistor RD in Ohm.
  • the driving block 4 drives in tension and therefore in intensity the diode 10 so that it emits a main beam FP composed of several regularly spaced flashes in time, each flash being modulated at the carrier frequency fo, in other words has a sinusoidal component at the carrier frequency fo.
  • the digital signal processing unit 3 furthermore comprises a feedback control module 308 which receives as input the measured voltage VD (sinusoidal feedback signal) coming from the control block 4, in order to to determine the error or the difference between this voltage VD measured across the resistor RD and the analog modulation signal SAM which drives the diode 10, for a servo feedback loop of the driving current ID of the diode 10.
  • VD sinusoidal feedback signal
  • a second object of this retroactive control module 308 is to make it possible to control, at each iteration of the signal, the offset between the driving current ID and the analog modulation signal SAM, in order to generate alerts if an offset threshold or a error is exceeded.
  • the two analog detection signals SAD1, SAD2, measured across two photodetectors 14, 15, are also each in the form of a series of several sinusoidal periodic iterations at the carrier frequency fo.
  • the first digital fluorescence signal SFN (or "Fluo Signal") and the second digital reference signal SRN (or "Ref Signal"), at the output of the preamplification block 2 are each in the form of a series of several sinusoidal periodic iterations, having substantially the same temporal and frequency characteristics as the sinusoidal SNM signal.
  • the digital signal processing unit 3 comprises a main signal acquisition / processing module 31 arranged at the output of the generator 300 and the preamplifier block 2.
  • This digital signal processing unit 3 comprises a first acquisition / processing module 32 of the digital fluorescence signal SFN (or "Fluo Signal") and a second acquisition / processing module 33 of the second reference digital signal SRN (or "Ref Signal”).
  • the digital signal processing unit 3 uses for the transmission of the sinusoidal carrier signal SNM and the reception / acquisition of the first digital fluorescence signal SFN and the second digital reference signal SRN, a communication bus BCO digital such as 32-bit Serial Peripheral Interface Bus (SPI), able to receive and transmit at the same time 32 bits.
  • a communication bus BCO digital such as 32-bit Serial Peripheral Interface Bus (SPI)
  • the generator 300 of the digital signal processing block 3 emits at a regular interval a sampling point PEM (i) (i being an integer) for the sinusoidal carrier signal SNM in a packet 16-bit PD1 1 data of the 32-bit frame, the other 16-bit PD12 data packet being unused.
  • the time difference between two successive sampling points PEM (i-1) and PEM (i) is 12.5 s (or 0.0125 ms), which corresponds to a time difference between two successive frames of 12.5 MS.
  • the digital signal processing block 3 each time a PEM (i) sampling point is transmitted for the SNM carrier sinusoidal signal, the digital signal processing block 3, and more specifically its main acquisition / acquisition module signal processing 31, receiving a PEF sampling point (i-1) for the first digital fluorescence signal SFN and a sampling point PER (i-1) for the second digital reference signal SRN; the sampling points PEF (i-1) and PER (i-1) being the previously emitted PEM (i-1) sampling point responses for the sinusoidal carrier signal SNM.
  • the PEF (i-1) and PER (i-1) sampling points are transmitted and received in two respective packets of 16-bit PD21, PD22 data of the 32-bit frame.
  • the time interval between two PEM sampling points (i) for the SNM carrier sinusoidal signal (12.5 s) corresponds to the same acquisition time interval between the PEF (i) and PER sampling points. (i).
  • phase shifts any phase shifts possibly introduced by the system do not affect the signal analysis to extract a quantification value of the analyte present in the sample E; such phase shifts can originate in response times between the driving current ID and the emission of the main beam FP, delays introduced along the optical paths of the beams FP, FE, FR, RF, response times between the detection of the RF fluorescence radiation by the first photodiode 14 and the generation of the first analog detection signal SAD1, the response delays between the detection of the second reference beam FR by the second photodiode 15 and the generation of the second analog detection signal SAD2, the phase inversion introduced by the first subtractor 27 of the first analog / digital conversion means 21 and the phase inversion introduced by the second subtractor 28 of the second analog / digital conversion means 22 (see FIG. 12), trans-impedance amplification
  • the first iteration only to check whether the two analog detection signals SAD1, SAD2 are above predefined minimum thresholds, for example set at -7V and + 8V. If the first detection signal SAD1 is below the corresponding minimum threshold, a feedback loop is provided to reduce the analog modulation signal SAM, in particular of the order of three times compared to the initial signal.
  • a correction coefficient is applied upstream on the module of the first detection signal SAD1, for each iteration, in order to compensate for a decrease in the first excitation beam FE.
  • the purpose of such a feedback loop is to avoid misread due to electronic channel saturations, and also to extend the fluorescence read range, so that even high concentrations of 4-MU can be detected.
  • the other three iterations are used to extract the values of the modules of the first digital fluorescence signal SFN and the second digital reference signal SRN, for each iteration.
  • the last sinusoidal oscillation is used to check the voltage VD, otherwise known as the sinusoidal feedback signal of the diode 10 ("Led Feedback Signal"), which corresponds as a reminder to the actual voltage measured across diode 10.
  • the module of the first digital fluorescence signal SFN corresponds to the envelope of the sinusoidal part (within a sinusoidal iteration) of the first digital fluorescence signal SFN
  • the module of the second digital reference signal SRN corresponds to the envelope of the sinusoidal part (within a sinusoidal iteration) of the second digital reference signal SRN.
  • the SFN and SRN fluorescence digital signals are modulated signals and the respective modules of these two signals correspond substantially to half the voltage amplitude Vpp of the sinusoidal portion of the signal. corresponding signal.
  • the digital signal processing unit 3 automatically checks, at the end of each iteration, that the module of the second digital reference signal SRN is within a predefined operating range, that is to say between two predefined security thresholds.
  • the remainder of the description relates specifically to the main signal acquisition / processing module 31 which makes it possible to implement an in-phase and quadrature amplitude demodulation method.
  • the main signal acquisition / processing module 31 comprises, as a reminder:
  • a first acquisition / processing module 32 connected to the generator 300 and the first analog / digital conversion means 21 of the preamplification block 2, for the acquisition and processing of the first digital SFN fluorescence signal;
  • a second acquisition / processing module 33 connected to the generator 300 and the second analog / digital conversion means 22 of the preamplification block 2, for the acquisition and processing of the second digital reference signal SRN.
  • the first acquisition / processing module 32 comprises a first demodulation means 34 designed to demodulate the first digital fluorescence signal SFN, and comprising:
  • a second multiplier 342 by the phase quadrature COSINE demodulation digital signal, this second multiplier 342 being followed by a second low-pass filter 352 at the same cut-off frequency fc, in order to to deliver a first demodulated fluorescence signal said in quadrature phase SF C os-
  • the first acquisition / processing module 32 further comprises, at the output of the first and second low-pass filters 351, 352, a calculation means 353 of a first so-called fluorescence value VALF characteristic of the amplitude of the fluorescence radiation.
  • the first acquisition / processing module 32 also comprises, at the input of the first and second multipliers 341, 342:
  • a notch filter 361 centered on the carrier frequency fo in order to filter the first digital fluorescence signal SFN and to deliver a first filtered intermediate signal SFN ';
  • the second acquisition / processing module 33 comprises a second demodulation means 37 designed to demodulate the second digital reference signal SRN, and comprising:
  • a first multiplier 371 by the digital phase demodulation signal SINE, this first multiplier 371 being followed by a first low-pass filter 381 at the cut-off frequency fc less than the carrier frequency fo, in order to deliver a second demodulated signal reference says in SRSIN phase;
  • a second multiplier 372 by the phase-quadrature COSINE demodulation digital signal, this second multiplier 372 being followed by a second low-pass filter 382 at the same cut-off frequency fc, in order to deliver a second said fluorescence demodulated signal in quadrature phase SRcos-
  • the second acquisition / processing module 33 also comprises, at the input of the first and second multipliers 371, 372:
  • a notch filter 391 centered on the carrier frequency fo in order to filter the second digital reference signal SRN and to deliver a second filtered intermediate signal SRN ';
  • the remainder of the description relates to the calculations used to determine the fluorescence of the sample E by expressing it as a relative fluorescence unit (RFU), the relative fluorescence unit being defined. as the ratio between the fluorescence intensity and the excitation intensity.
  • REU relative fluorescence unit
  • the RFU values are generally adjusted for a desired scale of values determined by a pre-calibration process.
  • the calibrated RFU value is calculated as follows:
  • RFUcai (x) (Fx.g FLUo) (RX-gREF), WHERE
  • - Fx is a raw value in mV of the fluorescence signal detected at the first photodetector, which corresponds in the context of the invention to the first value of fluorescence VALF (digital data) resulting from the demodulation process implemented in the processing block digital signal 3;
  • - Rx is a raw value in mV of the reference signal detected at the second photodetector, which corresponds in the context of the invention to the second reference value VALR (digital data) resulting from the method of demodulation implemented in the digital signal processing block 3; and
  • the gain parameters gFi_uo and gREF are established during the analysis to obtain an RFU of the order of RFUREF-
  • the concentration of 4-MU is in the range 40 nM - 40000 nM.
  • Figure 13 illustrates the variation of RFU as a function of 4-MU concentration, with RFU nonlinear function of 4-MU concentration.
  • FCONV conversion factor
  • This FCONV conversion factor is established by following a fluorimetric analysis protocol that includes several variation factors (different 4-MU solutions and different optical instruments) to ensure the robustness and repeatability of the measurement.
  • the driving current ID (t) of the diode 10 resulting from the conversion of the analog modulation signal SAM, is established.
  • the driving current ID (t) (or diode current) corresponds to the following equation (E1):
  • A corresponds to the offset intensity (offset from zero), which can take the value of 15 mA
  • - B corresponds to the half amplitude of the driving current, which can take the value of 10 mA.
  • FIG. 14 illustrates this driving current ID (t) as a function of time t for a pulse.
  • Figure 15 illustrates ID (f) versus frequency f.
  • the driving current ID (t) carrier signal resulting from the modulation method at the carrier frequency fo
  • the main beam FP is converted into the main beam FP at a given wavelength, in this case around 370 nm. , before being divided into a first excitation beam FE and a second reference beam FR.
  • the first excitation beam FE excites the sample and the 4-MU molecules, which in turn emit RF fluorescence radiation detected by the first photodetector 14; this photodetection resulting in a first analog detection signal SAD1 across the first photodetector 14.
  • z (t) is the amplification signal reflecting the emission of the RF fluorescence radiation, and which is considered constant and equal to the constant K;
  • FIG. 16 illustrates this first analog detection signal SAD1 (t) as a function of time t for a pulse.
  • the analog detection signal SAD1 (t) is converted into a digital signal to give the first digital fluorescence signal SFN after passing through the first analog / digital conversion means 21.
  • equation (E4) we obtain the following equation (E4):
  • Figure 17 illustrates SFN (f) as a function of frequency f.
  • the first digital fluorescence signal SFN is then acquired and processed by the digital signal processing unit 3, and more specifically by the main signal acquisition / processing module 31, according to the following steps of the demodulation method.
  • the first digital fluorescence signal SFN (f) passes through a bandpass filter composed of the notch filter 361 associated with the subtractor 362.
  • - fdec and a high cutoff frequency h
  • Figure 18 illustrates the function H No tch (f) as a function of the frequency f.
  • the first filtered fluorescence signal SFN 0 passes through the two multipliers 341, 342 so as to be multiplied with the digital demodulation signals SINE and COSINE.
  • FIG. 20 specifically illustrates the two multipliers 341, 342, as well as the low-pass filters 351, 352 and the calculation means 353 which follow.
  • the SFN signal 0 (t) is multiplied, on the one hand, in the first multiplier 341 by the digital demodulation signal SINE in order to output a first demodulated intermediate signal in the SF phase S iN '(t) and, d secondly, in the second multiplier 342 by the COSINE demodulation digital signal in order to output a first SF C os' (t) phase quadrature demodulated intermediate signal.
  • the digital demodulation signals SINE and COSINE are in the following time forms:
  • K sin and Kcos correspond to the amplitudes of the signals and are fixed at the value of 2.
  • demodulated intermediate phase signal SF S iN '(t) and the demodulated intermediate phase-quadrature signal SF C os' (t) satisfy the following equations (E7) and (E8), in the time domain:
  • FIG. 21 illustrates SF S iN '(f) as a function of frequency f and FIG. 22 illustrates SF C os' (f) as a function of frequency f.
  • the intermediate phase demodulated signal SFSIN 'and the demodulated intermediate phase-quadrature signal SF C os' are filtered by the respective low-pass filters 351, 352, which respectively output a first signal.
  • Each low-pass filter 351, 352 results in a function H L p (f) with a cut-off frequency fc fixed here at 1 10 Hz.
  • Each low-pass smoothing filter makes it possible to average the last 20 sampling points from the previous low-pass filter H L p (f), to increase the rejection of the signals at the multiple cut-off frequencies of 2f 0 .
  • the first demodulated signal in SFSIN phase and the first demodulated SF C os phase quadrature signal correspond to the following equations (E1 1) and (E12), in the frequency domain:
  • FIGS. 24 and 25 respectively illustrate the SF S iN (f) and SFcos (f) signals as a function of the frequency f.
  • the first demodulated signal in the SFSIN phase and the first SF C os phase quadrature demodulated signal are injected into the calculation means 353, in order to calculate the module of the first analog detection signal SAD1 ( t), which corresponds to the signal module [(SF S iN (t) + SF C os (t)) 2 ] 1 2 ; these steps of the demodulation method for extracting the amplification signal z (t) without being affected by the unknown phase shift introduced by the system.
  • the calculated module corresponding to the first value of fluorescence VALF generated at the output of the main signal acquisition / processing module 31, corresponds to the following equation (E15):
  • VALF Module [SAD1 (t)], that is
  • VALF [(KBrect T (t) .cos ( ⁇ )) 2 + [KBrect T (t) .sin ( ⁇ )] 2 ] 1 2
  • VALF [(KBrect T (t)) 2. (cos ( ⁇ ) 2 + sin ( ⁇ ) 2 )] 1 2
  • a comparison means (not shown) disposed at the output of the first acquisition / processing module 32 and the second acquisition / processing module 33 performs the calculation of the RFU value from the first fluorescence values.
  • VALFjj and second reference values VALR VALR , delivered at the output of these modules 32, 33, for each sinusoidal iteration (j corresponding to the number of iterations and being taking values 0, 1, 2, because for recall three iterations are used for fluorescence measurement) and for a 4-MU concentration numbered i.
  • VALR jt second reference value for the iteration j, obtained for the concentration i
  • rfu NV ⁇ rfu ⁇ a + ⁇ rfu ⁇ b + (rf UjJ ) 2 ⁇ c + ⁇ rfu J ) ⁇ d + ⁇ e (E17)
  • a, b, c, d and e are constants, with for example:
  • the final RFUi FIN RFU value desired, for a concentration i is calculated by averaging the ⁇ Malawi with j taking the values 0, 1 and 2, without possibly taking into account a value of too far from the average.

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Abstract

Système (1) de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie d'au moins un analyte présent dans un échantillon (E) de fluide constituant un matériau biologique, notamment pour un test immunologique, comprenant une source de rayonnement (10), suivi d'un diviseur optique (13) pour diviser le faisceau principal (FP) en un faisceau d'excitation (FE) de l'échantillon et un faisceau de référence, avec un premier moyen photodétecteur (14) pour la détection d'un rayonnement de fluorescence (RF) émis par l'échantillon et un second moyen photodétecteur (15) pour le faisceau de référence, ce système comprenant en outre un générateur (300) délivrant un signal sinusoïdal porteur (SNM) et au moins un signal numérique de démodulation (SINE, COSINE), et des moyens de traitement numérique pour traiter par démodulation les signaux issus des deux moyens photodétecteur afin d'extraire une valeur de fluorescence (VALF) caractéristique de l'amplitude du rayonnement de fluorescence et une seconde valeur de référence (VALR) caractéristique de l'amplitude du faisceau de référence. La présente invention trouve une application dans les instruments automatisés de diagnostic in vitro dans le domaine clinique ou dans le domaine industriel.

Description

SYSTEME DE DETECTION ET/OU DE QUANTIFICATION IN VITRO PAR
FLUORIMETRIE
La présente invention se rapporte à système de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie d'au moins un analyte présent dans un échantillon de fluide constituant un matériau biologique.
La présente invention trouve une application dans les instruments automatisés de diagnostic in vitro dans le domaine clinique ou dans le domaine industriel.
Dans le domaine clinique, le diagnostic est réalisé à partir d'un prélèvement biologique humain (urine, sang, salive, pus, liquide céphalo- rachidien, etc.), pour la détection ou la quantification d'analytes issus ou non d'un micro-organisme externe (bactérie, virus, parasite, anticorps, etc.) sous la forme de tests immunologiques ou de tests de biologie moléculaire.
Dans le domaine industriel, le diagnostic est réalisé à partir d'un échantillon de produit alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique, pour contrôler la qualité microbiologique du produit sous la forme de tests microbiologiques. De tels tests microbiologiques vérifient généralement soit la stérilité (aucun microorganisme ne doit être présent), soit l'absence de bactéries pathogènes (à l'origine d'une infection), soit encore qu'une bactérie commensale (normalement présente chez l'homme et banale en faible concentration) n'est présente qu'en dessous d'un certain seuil.
L'invention peut également trouver une application dans le domaine des analyses dynamiques, c'est-à-dire en temps réel, en l'occurrence dans les tests immunologiques et les tests de biologie moléculaire où les réactions immunologiques/biologiques peuvent être pilotées ou surveillées dans le temps.
L'invention se rapporte plus particulièrement à un système de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie comprenant :
- une source de rayonnement lumineux émettrice d'un faisceau principal dans une longueur d'onde dite d'émission donnée ;
- un diviseur optique disposé en sortie de la source de rayonnement pour diviser le faisceau principal en un premier faisceau d'excitation de l'échantillon et un second faisceau de référence ;
- un premier moyen photodétecteur conçu pour délivrer un premier signal analogique de détection en réponse à une détection d'un rayonnement de fluorescence émis par l'échantillon, dans une longueur d'onde dite de fluorescence, sous l'effet de l'excitation induite par le premier faisceau d'excitation ;
- un second moyen photodétecteur conçu pour délivrer en sortie un second signal analogique de détection en réponse à une détection du second faisceau de référence.
De tels systèmes de détection et/ou de quantification in vitro sont connus, en particulier dans les instruments automatisés de diagnostic in vitro par fluorimétrie, comme par exemple dans les documents EP 0 864 089 B1 , EP 0 871 863 B1 , EP 0 241 268 A1 , et WO 2004/055502 A2, qui emploient des sources de rayonnement du type source de lumière puisé, lampe laser ou lampe à arc.
De manière classique, l'analyse des signaux en provenance des deux moyens photodétecteurs s'effectue par un traitement analogique, avec notamment un algorithme de détection du pic de fluorescence représentatif de la présence/quantité d'analyte à détecter. L'inconvénient d'un tel traitement analogique réside essentiellement dans ses limitations à réduire le bruit, et donc à augmenter le rapport signal sur bruit.
L'état de la technique peut également être illustré par l'enseignement de la demande de brevet US 5 757 013 A qui divulgue un appareil de mesure de la décroissance de fluorescence (« fluorescence decay ») qui met en œuvre un traitement numérique basé sur un signal de fluorescence et un signal de référence, où le signal de référence sert essentiellement à mesurer un déphasage pourle signal de fluorescence, avec la mise en œuvre du calcul d'un produit interne entre les signaux de fluorescence et de référence démodulés à une fréquence distincte de la fréquence porteuse du signal de pilotage de la source lumineuse ; ce calcul permettant de déterminer un tel déphasage et d'en déduire la décroissance de fluorescence. L'objectif de l'appareil de mesure de la demande US 5 757 013 A est de déterminer la décroissance de fluorescence, sans référence à la concentration du fluorophore dans l'échantillon.
L'état de la technique comporte également l'enseignement du document WO 00/37850 A1 qui porte sur un appareil destiné à mesurer le temps de retard d'émission lors d'irradiation d'un échantillon, comprenant un système générant des premier et second signaux numériques d'entrée un dispositif de conversion de ces deux signaux en signaux sinusoïdaux analogiques, une source de rayonnement modulée à une fréquence spécifique et qui irradie l'échantillon, ce qui provoque la génération par l'échantillon d'une émission. L'appareil comprend aussi un détecteur de l'émission provenant de l'échantillon, et qui produit un premier signal de sortie présentant un décalage de phase par rapport à la phase du premier signal d'entrée, et un dispositif qui permet de numériser les premier et second signaux analogiques de sortie, un mélangeur recevant les signaux de sortie et comparant la phase du signal afin de produire un signal indicateur du changement de phase. Un dispositif de rétroaction altère, sur la base du signal de mélangeur, la phase du second signal d'entrée afin de mettre en quadrature les premier et second signaux de sortie.
La présente invention a pour but de fournir un système de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie comprenant des moyens de traitement des signaux assurant une détection/quantification de l'analyte avec une sensibilité améliorée obtenue par une augmentation du rapport signal sur bruit.
A cet effet, elle propose un système de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie d'au moins un analyte présent dans un échantillon de fluide, comprenant :
- une source de rayonnement émettrice d'un faisceau principal dans une longueur d'onde dite d'émission donnée;
- un diviseur optique disposé en sortie de la source de rayonnement pour diviser le faisceau principal en un premier faisceau d'excitation de l'échantillon et un second faisceau de référence ;
- un premier moyen photodétecteur conçu pour délivrer un premier signal analogique de détection en réponse à une détection d'un rayonnement de fluorescence émis par l'échantillon, dans une longueur d'onde dite de fluorescence, sous l'effet de l'excitation induite par le premier faisceau d'excitation ;
- un second moyen photodétecteur conçu pour délivrer en sortie un second signal analogique de détection en réponse à une détection du second faisceau de référence ;
ce système étant remarquable en ce qu'il comprend :
- un générateur délivrant un signal sinusoïdal porteur à une fréquence prédéfinie dite fréquence porteuse, et au moins un signal numérique de démodulation à cette même fréquence porteuse ; - un moyen de conversion numérique/analogique relié au générateur pour convertir le signal sinusoïdal porteur en un signal analogique de modulation à la fréquence porteuse ;
- un modulateur d'amplitude relié au moyen de conversion numérique/analogique et à la source de rayonnement pour moduler en amplitude le faisceau principal à la fréquence porteuse, par application du signal analogique de modulation sur ladite source de rayonnement ;
- des moyens de conversion analogique/numérique reliés aux moyens photodétecteurs pour convertir le premier signal analogique de détection en un premier signal numérique dit de fluorescence, et le second signal analogique de détection en un second signal numérique de référence ;
- des moyens de traitement numérique reliés au générateur et aux moyens de conversion analogique/numérique, conçus pour, d'une part, traiter le premier signal numérique de fluorescence par démodulation à la fréquence porteuse afin de calculer une première valeur dite de fluorescence caractéristique de l'amplitude du rayonnement de fluorescence et, d'autre part, traiter le second signal numérique de référence par démodulation à la fréquence porteuse afin de calculer une seconde valeur dite de référence caractéristique de l'amplitude du faisceau de référence ;
- un moyen de comparaison entre la première valeur de fluorescence et la seconde valeur de référence pour calculer un résultat final pour établir la détection et/ou la quantification de l'analyte.
Ainsi, le système selon l'invention effectue un traitement numérique par modulation d'amplitude et démodulation, qui permet d'atteindre des rapports signal sur bruit particulièrement intéressants.
Un tel traitement numérique est de préférence réalisé avec une diode électroluminescente (LED), notamment dans le spectre UV, comme source de rayonnement, car les diodes électroluminescentes sont particulièrement bien adaptées pour un pilotage en modulation. Avec une diode électroluminescente, on peut en particulier assurer une série de flashs lumineux d'amplitude, de formes temporelles et fréquentielles bien définies et contrôlées, les flashs pouvant être espacés temporellement les uns des autres de manière contrôlée et précise. Avec une telle possibilité de pilotage de la diode électroluminescente, le traitement numérique qui suit permet de rejeter/limiter le bruit. Il est bien entendu que le premier signal numérique de fluorescence et le second signal numérique de référence sont démodulés séparément à la même fréquence correspondant à la fréquence porteuse du signal sinusoïdal porteur, avant de réaliser la comparaison qui permettra d'extraire le résultat final qui se présente, de préférence, sous la forme d'une unité relative de fluorescence (RFU).
Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de traitement numérique comprennent :
- un premier moyen de démodulation conçu pour démoduler le premier signal numérique de fluorescence, en le multipliant par au moins un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse, afin d'engendrer au moins un premier signal démodulé de fluorescence ; et
- un premier moyen de calcul conçu pour calculer, à partir du au moins un premier signal démodulé de fluorescence, la première valeur de fluorescence.
Selon une caractéristique, le premier moyen de démodulation comprend :
- un premier multiplicateur par un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse et en phase avec le signal sinusoïdal porteur, ledit premier multiplicateur étant éventuellement suivi d'un premier filtre passe-bas à une fréquence de coupure inférieure à la fréquence porteuse, afin de délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en phase ; et
- un second multiplicateur par un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse et en quadrature de phase par rapport au signal sinusoïdal porteur, ledit second multiplicateur étant éventuellement suivi d'un second filtre passe-bas à la même fréquence de coupure, afin de délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en quadrature de phase ;
et en outre le premier moyen de calcul, en sortie desdits premier et second multiplicateurs, calcule la première valeur de fluorescence correspondant au module de la somme du premier signal démodulé de fluorescence en phase et du premier signal démodulé de fluorescence en quadrature de phase.
Avec cette caractéristique, le procédé de démodulation correspond à une démodulation cohérente en phase et quadrature de phase qui est particulièrement avantageuse pour améliorer le rapport signal sur bruit.
Le système comprend éventuellement au moins un filtre passe-bas, à une fréquence de coupure inférieure à la fréquence porteuse, en sortie du premier moyen de démodulation afin de filtrer le ou chaque premier signal démodulé de fluorescence.
Selon une autre caractéristique, les moyens de traitement numérique comprennent, en entrée des premier et second multiplicateurs : - un filtre à encoche centré sur la fréquence porteuse afin de filtrer le premier signal numérique de fluorescence et délivrer un premier signal intermédiaire filtré ; et
- un soustracteur réalisant la soustraction du premier signal numérique de fluorescence et du premier signal intermédiaire filtré, afin de générer un premier signal de fluorescence filtré, ce premier signal de fluorescence filtré étant injecté dans lesdits premier et second multiplicateurs du premier moyen de démodulation.
Le filtre à encoche associé au soustracteur forme au final un filtre passe-bande excluant la composante entrante fréquentielle à la fréquence porteuse.
Dans une réalisation particulière, les moyens de traitement numérique comprennent :
- un second moyen de démodulation conçu pour démoduler le second signal numérique de référence, en le multipliant par au moins un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse, afin d'engendrer au moins un second signal démodulé de référence ; et
- un second moyen de calcul conçu pour calculer, à partir du au moins un second signal démodulé de référence, la seconde valeur de référence.
Dans cette réalisation, le second moyen de traitement applique un traitement par démodulation sur le second signal numérique de référence, avec les avantages afférents à ce type de procédé pour améliorer le rapport signal sur bruit.
Selon une possibilité de l'invention, le second moyen de démodulation comprend :
- un premier multiplicateur par un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse et en phase avec le signal sinusoïdal porteur, ledit premier multiplicateur étant éventuellement suivi d'un premier filtre passe-bas à une fréquence de coupure inférieure à la fréquence porteuse, afin de délivrer un second signal démodulé de référence dit en phase ; et
- un second multiplicateur par un signal numérique de démodulation à la fréquence porteuse et en quadrature de phase par rapport au signal sinusoïdal porteur, ledit second multiplicateur étant éventuellement suivi d'un second filtre passe-bas à la même fréquence de coupure, afin de délivrer un second signal démodulé de référence dit en quadrature de phase ;
et le second moyen de calcul, en sortie desdits premier et second multiplicateurs, calcule la seconde valeur de référence correspondant au module de la somme du second signal démodulé de référence en phase et du second signal démodulé de référence en quadrature de phase.
Selon une autre possibilité de l'invention, les moyens de traitement numérique comprennent, en entrée de ces premier et second multiplicateurs : - un filtre à encoche centré sur la fréquence porteuse afin de filtrer le second signal numérique de référence et délivrer un second signal intermédiaire filtré ; et
- un soustracteur réalisant la soustraction du second signal numérique de référence et du second signal intermédiaire filtré, afin de générer un second signal de référence filtré, ce second signal de référence filtré étant injecté dans lesdits premier et second multiplicateurs du second moyen de démodulation.
Avantageusement, le système comprend en outre, intercalé entre la source de rayonnement et le diviseur optique, un filtre optique passe-bande centré sensiblement sur la longueur d'onde d'émission.
L'emploi d'un tel filtre optique passe-bande permet d'augmenter le signal au niveau des moyens photodétecteurs, en améliorant à la source le signal par filtrage des fréquences interférentes.
Selon une caractéristique, le système comprend en outre, intercalé entre l'échantillon et le premier moyen photodétecteur, un filtre optique passe- bande centré sensiblement sur la longueur d'onde de fluorescence.
L'emploi d'un tel filtre optique passe-bande permet d'augmenter le signal au niveau du le premier moyen photodétecteur, en filtrant les fréquences interférentes.
Selon une caractéristique, le système comprend en outre, intercalé entre le filtre optique passe-bande et le premier moyen photodétecteur, un guide d'ondes réalisé sous la forme d'un cône de guidage.
Dans un mode de réalisation particulier, le système comprend en outre, intercalé entre le diviseur optique et le second moyen photodétecteur, un filtre optique passe-bas qui présente une longueur d'onde basse de coupure sensiblement inférieure à la longueur d'onde d'émission. Selon une possibilité de l'invention, le système comprend en outre, intercalé entre le filtre optique passe-bas et le second moyen photodétecteur, un guide d'ondes réalisé sous la forme d'un cône de guidage.
Selon une autre possibilité de l'invention, le signal sinusoïdal porteur se présente sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales à la fréquence porteuse, l'écart de temps entre deux itérations consécutives étant supérieur à la période des itérations sinusoïdales.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, d'un exemple de mise en œuvre non limitatif, faite en référence aux figures annexées dans lesquelles :
- la figure 1 est une vue schématique d'un système conforme à l'invention ;
- la figure 2 est une vue schématique d'un système conforme à l'invention selon une première configuration ;
- la figure 3 est une vue schématique d'un système conforme à l'invention selon une seconde configuration ;
- la figure 4 est un graphe illustrant respectivement le spectre de transmission d'un filtre optique passe-bande et le spectre d'émission d'une diode UV équipant tous deux un système conforme à l'invention, ainsi que les spectres d'excitation du 4-MU et du 4-MUP ;
- la figure 5 est un graphe schématique d'un spectre de transmission d'un diviseur optique équipant un système conforme à l'invention ;
- la figure 6 est un graphe schématique de la variation de la photosensibilité d'une photodiode équipant un système conforme à l'invention, en fonction de la longueur d'onde du rayonnement détecté, à une température de 25°C ;
- la figure 7 est un graphe schématique du spectre de fluorescence du 4-MU, et le spectre de transmission d'un autre filtre optique passe-bande et d'un cône de guidage équipant tous deux un système conforme à l'invention ;
- la figure 8 est une vue schématiquement d'un système conforme à l'invention illustrant sa partie traitement du signal, selon une première configuration ;
- la figure 9 est un graphe illustrant les courbes de variation en fonction du temps du signal sinusoïdal porteur SNM, du premier signal numérique de fluorescence SFN et du second signal numérique de référence SRN, ces signaux se présentant sous la forme de quatre itérations périodiques sinusoïdales ;
- la figure 10 est un graphe illustrant une itération pour les trois courbes de la figure 9 ;
- la figure 1 1 est une vue schématique de deux trames transportant les données numériques pour le système conforme à l'invention ;
- la figure 12 est une vue schématique d'un système conforme à l'invention illustrant sa partie traitement du signal, selon une seconde configuration correspondant à un perfectionnement de la première configuration ;
- la figure 13 est un graphe illustrant la courbe de variation du RFU en fonction de la concentration en 4-MU dans l'échantillon ;
- la figure 14 est un graphe illustrant la courbe de variation du courant de pilotage ID(t) en fonction du temps t pour une impulsion ;
- la figure 15 est un graphe illustrant la courbe de variation du courant de pilotage ID(f) en fonction de la fréquence f ;
- la figure 16 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal analogique de détection SAD1 (t) en fonction du temps t pour une impulsion ;
- la figure 17 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal numérique de fluorescence SFN(f) en fonction de la fréquence f ;
- la figure 18 est un graphe illustrant la courbe de variation de la fonction HNotch(f) en fonction de la fréquence f ;
- la figure 19 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal de fluorescence filtré SFN0(f) en fonction de la fréquence f ;
- la figure 20 est une vue schématique d'un ensemble de deux multiplicateurs, deux filtres passe-bas et un moyen de calcul pour un premier module d'acquisition/traitement du signal numérique de fluorescence ;
- la figure 21 est un graphe illustrant la courbe de variation du signal démodulé intermédiaire en phase SFSiN'(f) en fonction de la fréquence f ;
- la figure 22 est un graphe illustrant la courbe de variation du signal démodulé intermédiaire en quadrature de phase SFCos'(f) en fonction de la fréquence f ; - la figure 23 est un graphe illustrant la courbe de variation de la fonction HLpSmooth(f) en fonction de la fréquence f ;
- la figure 24 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal démodulé en phase SFSiN(f) en fonction de la fréquence f ;
- la figure 25 est un graphe illustrant la courbe de variation du premier signal démodulé en quadrature de phase SFCos(f) en fonction de la fréquence f.
La première partie de la description qui suit porte sur l'architecture ou partie structurelle du système 1 conforme à l'invention pour la détection et/ou la quantification in vitro par fluorimétrie d'au moins un analyte présent dans un échantillon E de fluide constituant un matériau biologique. Les figures 1 à 3 illustrent schématiquement l'architecture d'un tel système 1 conforme à l'invention et conçu pour équiper un instrument automatisé de diagnostic in vitro.
Ce système 1 est destiné en particulier à l'analyse par fluorimétrie du rayonnement fluorescent émis lors d'un test immunologique basé sur la 4- méthylumbelliférone (4-MU), comme résultant de l'hydrolyse du substrat 4- méthylumbelliferyl-phosphate (4-MUP) dans l'échantillon E de fluide. Ainsi, la fonction de ce système est d'effectuer une mesure instantanée du rayonnement fluorescent émis par la 4-MU dans l'échantillon E, sous l'incidence d'un faisceau d'excitation adapté pour exciter la 4-MU, tout en évitant d'exciter le substrat 4-MUP.
Ce système 1 comprend un bâti B supportant une source de rayonnement 10 lumineux émettrice d'un faisceau principal FP. La source de rayonnement 10 est constituée d'une diode électroluminescente émettrice dans l'ultraviolet (UV LED).
Les courbes C3 et C4 de la figure 4 illustrent respectivement les spectres d'excitation du 4-MUP et du 4-MU, en fonction de la longueur d'ondes (en nm), qui présentent des pics d'excitation respectivement à 350 nm et 365- 370 nm. Pour obtenir une émission d'un rayonnement de fluorescence du 4- MU, il est donc nécessaire d'avoir une diode qui émette un faisceau principal FP dans la gamme de longueur d'onde de 365-370 nm.
Bien que le maximum du pic d'excitation du 4-MU soit situé à 365 nm, il est cependant préférable que le faisceau principal FP soit centré autour de 370 nm. En effet, une longueur d'onde de 365 nm pour le faisceau principal exciterait trop le 4-MUP et provoquerait ainsi une interférence nuisible à la bonne analyse du signal de fluorescence de la 4-MU. La diode électroluminescente 10 est donc de préférence émettrice dans une longueur d'onde d'environ 370 nm ; une diode étant théoriquement monochromatique.
Par exemple, la diode 10 est constituée d'une diode de référence « NSHU591 A Rank 6 » commercialisée par la société NICHIA Corporation, émettrice dans la gamme de longueurs d'ondes 370-375 nm, avec une demi- largeur de spectre de 1 5 nm. La courbe C2 de la figure 4 illustre le spectre de la diode de référence NSHU591A en fonction de la longueur d'ondes (en nm).
Pour répondre à la problématique de limitation de la longueur d'onde du faisceau principal FP autour de 370 nm, le système 1 comprend en outre un filtre optique passe-bande 1 1 centré sur la longueur d'onde de 370 nm ; ce filtre optique passe-bande 1 1 étant disposé devant la diode 10.
Par exemple, le filtre optique passe-bande 1 1 peut être constitué d'un filtre optique passe-bande de référence « Biom-0007 Rev A - 370/10 » commercialisé par la société Semrock, ayant les caractéristiques suivantes :
- longueur d'onde centrale (CWL pour Central Wave Lenght) : 370 nm ;
- largeur totale à la moitié du pic de transmission (FWHM pour Full Width at Half Maximum) : 1 1 ,5 nm ± 1 nm ;
- pourcentage de transmission au pic : 90 % ;
- densité optique (OD pour Optical Density) > 5 pour la gamme 300-355 nm ; et
- densité optique (OD pour Optical Density) > 4 pour la gamme 385-1000 nm.
La courbe C1 de la figure 4 illustre le spectre de transmission d'un tel filtre optique passe-bande 1 1 en fonction de la longueur d'ondes (en nm).
Bien entendu, d'autres couples de diode 10 et de filtre optique passe-bande 1 1 peuvent être envisagés. Dans tous les cas, il est indispensable de sélectionner une diode par sa bande spectrale d'émission en fonction de la bande spectrale de transmission du filtre optique passe-bande, ou inversement, étant donné qu'il faut faire coïncider ces deux bandes spectrales relativement étroites.
Pour canaliser le rayonnement émis par la diode 10 et filtré par le filtre optique passe-bande 1 1 , le système 1 comprend, derrière le filtre optique passe-bande 1 1 , une lentille de convergence 12, telle qu'une lentille plan- convexe particulièrement bien adaptée pour une diode UV.
Le système 1 comprend en outre, derrière la lentille de convergence 12, un diviseur optique 13 pour diviser le faisceau principal FP en un premier faisceau d'excitation FE de l'échantillon et un second faisceau de référence FR. Ce diviseur optique 13 est par exemple réalisé sous la forme d'un miroir semi-réfléchissant ou prisme semi-réfléchissant ou lame séparatrice (beam splitter en anglais).
Par exemple, le diviseur optique 13 peut être constitué d'un prisme semi-réfléchissant en verre de type BK7 présentant un taux de réfraction (ou transmission) d'environ 95 %, et un taux de réflexion d'environ 5 % ; le premier faisceau d'excitation FE correspondant au faisceau réfracté (ou transmis) par le diviseur optique 13 et le second faisceau de référence FR correspondant au faisceau réfléchi par le diviseur optique 13. La figure 5 illustre le spectre de transmission d'un tel prisme semi-réfléchissant en verre de type BK7.
Comme décrit ultérieurement, il est indispensable de récupérer une partie du faisceau principal FP sous la forme du second faisceau de référence FR, pour réaliser la détection de l'intensité de la diode 10 et contrôler sa stabilité. En outre, le taux de réfraction (ou transmission) sera ultérieurement pris en compte dans la détermination de l'énergie transmise à l'échantillon E.
Le système 1 comprend également un support S pour l'échantillon E, ce support S étant positionné pour que le premier faisceau d'excitation FE irradie l'échantillon E et excite la 4-MU qui émettra alors un rayonnement de fluorescence RF sous l'effet de l'excitation induite par ce premier faisceau d'excitation FE.
Le rayonnement de fluorescence RF de la 4-MU (ou signal de fluorescence de la 4-MU) présente un pic d'émission à environ 450 nm. La courbe C1 1 de la figure 7 illustre le spectre de fluorescence de la 4-MU qui présente un pic d'émission à environ 450 nm.
Le système 1 comprend un premier moyen photodétecteur 14 conçu pour détecter ce rayonnement de fluorescence RF, et délivrer un premier signal analogique de détection SAD1 en réponse à une détection de ce rayonnement de fluorescence RF. Le premier moyen photodétecteur 14 est par exemple du type photodiode, et le premier signal analogique de détection SAD1 correspond à un courant de diode (intensité en ampère).
Par exemple, le premier moyen photodétecteur 14 est constitué d'une photodiode à silicium de référence « S1227 BR » commercialisée par la société Hamamatsu, et dont la figure 6 illustre la variation de la photosensibilité en fonction de la longueur d'onde du rayonnement détecté, à une température de 25°C. On note ainsi qu'une telle photodiode à silicium présente une photosensibilité de l'ordre de 0,25 A/W pour une longueur d'onde de l'ordre de 450 nm, correspondant pour rappel à la longueur du pic d'émission du rayonnement de fluorescence RF de la 4-MU.
Pour que le premier moyen photodétecteur 14 soit sensible au rayonnement de fluorescence RF de la 4-MU, le système 1 comprend, dans un canal de guidage du rayonnement de fluorescence RF placé entre l'échantillon E et le premier moyen photodétecteur 14, un filtre optique passe-bande 141 et un guide d'ondes 142.
Le filtre optique passe-bande 141 est centré sensiblement sur la longueur d'onde du rayonnement de fluorescence RF, et donc sur la longueur d'onde de 450 nm pour la détection de la fluorescence de la 4-MU.
Par exemple, le filtre optique passe-bande 141 présente les caractéristiques optiques suivantes :
- longueur d'onde centrale : 450 nm ± 5 nm ;
- largeur de la bande-passante : 40 nm ± 4 nm ;
- pourcentage de transmission à la longueur d'onde centrale > 45 %, de l'ordre de 80 à 90 %.
La courbe C13 de la figure 7 illustre le spectre de transmission d'un tel filtre optique passe-bande 141 , qui présente un pic de transmission coïncidant sensiblement avec le pic du spectre de fluorescence de la 4-MU illustré sur la courbe C1 1 .
Le guide d'ondes 142 est réalisé de préférence sous la forme d'un cône de guidage ou cône optique, par exemple en polyméthacrylate de méthyle (PMMA), afin de canaliser le rayonnement de fluorescence RF filtré par le filtre optique passe-bande 141 en direction du premier moyen photodétecteur 14.
Par exemple, le cône de guidage 142 peut présenter une caractéristique de filtre passe-haut, avec une fréquence basse de coupure inférieure à la longueur d'onde du rayonnement de fluorescence RF, en l'occurrence inférieure à 450 nm. La courbe C12 de la figure 7 illustre le spectre de transmission d'un tel cône de guidage 142 qui présente une longueur d'onde basse de coupure de l'ordre de 375-385 nm.
La figure 7 illustre que le cône de guidage 142 n'influe pas sur le rayonnement de fluorescence RF en termes spectrales, et que le filtre optique passe-bande 141 sélectionné est adapté pour la détection par le premier moyen photodétecteur 14. En effet, les caractéristiques optiques du filtre optique passe-bande 141 coïncident sensiblement avec le spectre d'émission du rayonnement de fluorescence RF et atténuent fortement les signaux d'excitation interférents pouvant être émis par l'échantillon E irradié.
Le système comprend également une lentille de convergence 143 disposé en entrée du canal de guidage du rayonnement de fluorescence RF, avant le filtre optique passe-bande 141 pour faire converger le rayonnement de fluorescence RF vers le cône de guidage 142 ; cette lentille de convergence 143 pouvant être du type lentille biconvexe.
Ainsi, le premier faisceau d'excitation FE interagit avec le milieu contenu dans l'échantillon E, provoquant ainsi l'émission d'un rayonnement de fluorescence RF qui est collecté par la lentille 143, avant de passer par le filtre optique passe-bande 141 et le cône de guidage 142 jusqu'au premier moyen photodétecteur 14.
Le système 1 comprend également un second moyen photodétecteur 15 conçu pour détecter le second faisceau de référence FR, et délivrer un second signal analogique de détection SAD2 en réponse à une détection de ce le second faisceau de référence FR. Le second moyen photodétecteur 15 est par exemple du type photodiode, et le second signal analogique de détection SAD2 correspond à un courant de diode (intensité en ampère).
Par exemple, le second moyen photodétecteur 15 est du même type que le premier moyen photodétecteur 14 et peut être est constitué d'une photodiode à silicium de référence « S1227 BR » commercialisé par la société Hamamatsu, et dont la figure 6 illustre la variation de la photosensibilité en fonction de la longueur d'onde du rayonnement détecté, à une température de 25°C. On note ainsi qu'une telle photodiode à silicium présente une photosensibilité de l'ordre de 0,1 7 A/W pour une longueur d'onde de l'ordre de 370 nm, correspondant pour rappel sensiblement à la longueur du faisceau principal FP, et donc du second faisceau de référence FR, après passage à travers le filtre optique passe-bande 1 1 décrit ci-dessus.
Pour que le second moyen photodétecteur 15 soit sensible au second faisceau de référence FR, le système 1 comprend, dans un canal de guidage du second faisceau de référence FR placé entre le diviseur optique 13 et le second moyen photodétecteur 15, un filtre passe-bas 151 et un guide d'ondes 152. Le filtre optique passe-bas 151 présente une longueur d'onde basse de coupure sensiblement inférieure à la longueur d'onde du second faisceau de référence FR, qui pour rappel est de l'ordre de 370 nm.
Par exemple, le filtre optique passe-bas 151 présente les caractéristiques optiques suivantes :
- pourcentage de transmission de l'ordre de 40 % ± 5 % pour la gamme de longueur de d'ondes comprise entre 360 et 380 nm ;
- pourcentage de transmission inférieur à 1 % pour la gamme de longueur de d'ondes comprise entre 405 et 790 nm ; et
- pourcentage de transmission de l'ordre de 0,2 % pour la gamme de longueur de d'ondes comprise entre 425 et 790 nm.
Le guide d'ondes 152 est réalisé de préférence sous la forme d'un cône de guidage ou cône optique, par exemple en polyméthacrylate de méthyle (PMMA), afin de canaliser le second faisceau de référence FR filtré par le filtre optique passe-bas 151 en direction du second moyen photodétecteur 15.
Dans le mode de réalisation de la figure 3, des miroirs réfléchissants 144 et 154 sont disposés à 45° respectivement après la lentille de convergence 143 sur le canal de guidage du rayonnement de fluorescence RF et après le diviseur optique 13 sur le canal de guidage du second faisceau de référence FR, pour pouvoir disposer les deux moyens photodétecteur 14, 15 en-dessous de la diode 10.
Dans d'autres modes de réalisation non illustrés, d'autres éléments optiques peuvent être incorporés comme par exemple des lentilles supplémentaires.
La deuxième partie de la description qui suit porte sur la partie traitement du signal du système 1 conforme à l'invention, qui permet d'analyser les signaux en provenance des deux moyens photodétecteur 14, 15 et de contrôler la diode 10 pour réaliser une détection par fluorimétrie de l'analyte présent dans l'échantillon E, avec l'avantage d'obtenir un rapport signal sur bruit très satisfaisant.
La figure 8 illustre schématiquement un système 1 conforme à l'invention équipé de sa partie traitement du signal, selon une première configuration.
Cette partie traitement du signal comporte trois blocs principaux, à savoir : - un bloc de préamplification 2 (ou « Preamplification Board ») relié aux deux moyens photodétecteur 14, 15 ;
- un bloc de traitement numérique du signal 3 (ou « Digital Signal Process Board ») disposé en sortie du bloc de préamplification 2 pour calculer la quantité d'analyte présent dans l'échantillon ; et
- un bloc de pilotage 4 de la diode 10 (ou « LED Driver Board ») disposé en sortie du bloc de traitement numérique du signal 3 et pilotant en courant la diode 10.
Le bloc de préamplification 2 comprend :
- un premier moyen de conversion analogique/numérique 21 relié au premier moyen photodétecteur 14 pour convertir le premier signal analogique de détection SAD1 en un premier signal numérique dit de fluorescence SFN.
- un second moyen de conversion analogique/numérique 22 relié au second moyen photodétecteur 15 pour convertir le second signal analogique de détection SAD2 en un second signal numérique dit de référence SRN.
La figure 12 relative à une seconde configuration du système 1 , illustre de manière plus complète et détaillée le bloc de préamplification 2.
Comme visible sur cette figure 12, le premier moyen de conversion analogique/numérique 21 comprend :
- un premier convertisseur courant/tension 23 pour convertir le premier signal analogique de détection SAD1 (intensité en ampère) en une première tension de détection VD1 (en volt), avec une conversion du type VD1 = SAD1 . RD1 , où RD1 correspond à une première résistance en Ohm employée pour la conversion courant SAD1 / tension VD1 ; et
- un premier convertisseur analogique/numérique 24 en sortie du premier convertisseur courant/tension 23 pour convertir la première tension de détection VD1 en le premier signal numérique dit de fluorescence SFN.
De même, le second moyen de conversion analogique/numérique 22 comprend :
- un second convertisseur courant/tension 25 pour convertir le second signal analogique de détection SAD2 (intensité en ampère) en une seconde tension de détection VD2 (en volt), avec une conversion du type VD2= SAD2. RD2, où RD2 correspond à une seconde résistance en Ohm employée pour la conversion courant SAD2 / tension VD2 ; et - un second convertisseur analogique/numérique 26 en sortie du second convertisseur courant/tension 25 pour convertir la seconde tension de détection VD2 en le second signal numérique dit de référence SRN.
Dans un perfectionnement illustré sur la figure 12, le premier moyen de conversion analogique/numérique 21 comprend en outre un premier soustracteur 27 qui soustrait à la première tension de détection VD1 une tension de décalage dite tension d'offset V0FF, afin de délivrer en sortie une tension VS1 =V0FF-VD1 , ce premier soustracteur 27 étant intercalé entre le premier convertisseur courant/tension 23 et le premier convertisseur analogique/numérique 24.
De même, le second moyen de conversion analogique/numérique 22 comprend en outre un second soustracteur 28 qui soustrait à la seconde tension de détection VD2 la même tension de décalage dite tension d'offset Voff, afin de délivrer en sortie une tension VS2=V0FF-VD2, ce second soustracteur 28 étant intercalé entre le second convertisseur courant/tension 25 et le second convertisseur analogique/numérique 26.
L'introduction d'une tension de décalage V0FF permet d'utiliser toute la dynamique d'entrée des convertisseurs analogique/numérique 24, 26, en injectant dans ces derniers des tensions adaptés à leurs performances.
Comme illustré sur la figure 8, le bloc de traitement numérique du signal 3 comprend un module de génération de signaux de modulation/démodulation 30, qui comprend :
- un générateur 300 délivrant un signal sinusoïdal porteur SNM à une fréquence porteuse fo prédéfinie, qui est fixée pour la suite de la description à 2kHz ; et
- un module de sortie analogique 301 disposé en sortie du générateur 30.
En référence à la figure 9, le signal sinusoïdal porteur SNM est transmis dans des paquets de données numériques de 16 bits, et se présente sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales.
Dans l'exemple des figures 9 et 10 (la figure 10 illustrant l'une des cinq itérations des trois courbes de la figure 9), le nombre d'itérations est de quatre et chaque itération est formée de trente et une oscillations sinusoïdales. Chaque oscillation sinusoïdale (autrement une période unique du signal sinusoïdal) est construite avec quarante points d'échantillonnage espacés chacun de 12,5 ps (soit 0,0125 ms). Ainsi, la période du signal sinusoïdal à l'intérieur d'une itération est de 500 is (soit 0,5 ms, correspondant à quarante fois 0,0125 ms). En conséquence, chaque itération sinusoïdale dure 15,5 ms, équivalent à trente et une fois la période de 0,5 ms, du fait des trente et une oscillations sinusoïdales dans une itération.
L'écart de temps entre deux itérations consécutives, autrement dit entre la fin d'une itération et le début d'une itération, est de 80 ms, largement supérieur à la période des oscillations sinusoïdales (0,5 ms) et à la durée d'une itération (15,5 ms). Ainsi, la périodicité des itérations est de 95,5 ms et au total, une série de quatre itérations dure globalement 302 ms entre les première et dernière itérations.
Le générateur 300 émet également deux signaux numériques de démodulation à cette même fréquence porteuse fo, à savoir :
- un signal numérique de démodulation SINE à la fréquence porteuse fo et en phase avec le signal sinusoïdal porteur SNM, ce signal numérique de démodulation SINE étant identique au signal sinusoïdal porteur SNM ; et
- un signal numérique de démodulation COSINE à la fréquence porteuse fo et en quadrature de phase par rapport au signal sinusoïdal porteur SNM.
Pour cela, le générateur 300 intègre un déphaseur à 90° pour générer le signal numérique de démodulation COSINE.
Le module de sortie analogique 301 , en sortie du générateur 300, comprend successivement :
- un moyen de conversion numérique/analogique 303 pour convertir le signal sinusoïdal porteur SNM, avant filtrage, en un signal analogique de modulation initial SAM0 à la fréquence porteuse fo ; et
- en sortie du moyen de conversion numérique/analogique 303, un module de traitement analogique 304 qui traite analogiquement le signal analogique de modulation initial SAM0 pour délivrer un signal analogique de modulation SAM (ou « LED Signal ») à la fréquence porteuse fo, ce signal analogique de modulation SAM formant un signal de pilotage analogique de la diode 10.
Comme illustré sur la figure 12, ce module de traitement analogique 304 comporte successivement :
- un filtre passe-bas 305 du type filtre RC ;
- en sortie du filtre passe-bas 305, un soustracteur 306 qui soustrait à la tension en sortie du filtre 305 une tension dite d'offset Txoffset, qui permet de maintenir la diode 10 éteinte quand le signal analogique de modulation initial SAMo est nul, avec par exemple Txoffset = 0,012 V ; et
- en sortie du soustracteur 306, un amplificateur 307 de gain prédéfini, et qui délivre en sortie le signal analogique de modulation SAM.
Avant de poursuivre avec la description du bloc de traitement numérique du signal 3, il est à noter que le bloc de pilotage 4 comprend un modulateur d'amplitude relié au moyen de conversion numérique/analogique 303 et à la diode 10 pour moduler en amplitude le faisceau principal FP à la fréquence porteuse fo, par application du signal analogique de modulation SAM sur la diode 10.
Le bloc de pilotage 4 comprend plus spécifiquement un convertisseur tension/courant 40 pour convertir le signal analogique de modulation SAM en un courant de pilotage ID de la diode 10 via une résistance RD en Ohm. La tension VD réelle mesurée aux bornes de la résistance RD correspond à un signal sinusoïdal de feed-back de la diode 10 (« Led Feedback Signal ») et répond à la relation VD=ID.RD.
Ainsi, le bloc de pilotage 4 pilote en tension et donc en intensité la diode 10 de sorte que celle-ci émette un faisceau principal FP composé de plusieurs flashs régulièrement espacés dans le temps, chaque flash étant modulé à la fréquence porteuse fo, autrement dit présente une composante sinusoïdale à la fréquence porteuse fo.
Dans l'exemple de la figure 12, le bloc de traitement numérique du signal 3 comprend en outre un module de contrôle rétroactif 308 qui reçoit en entrée la tension mesurée VD (signal sinusoïdal de feed-back) provenant du bloc de pilotage 4, afin de déterminer l'erreur ou l'écart entre cette tension VD mesurée aux bornes de la résistance RD et le signal analogique de modulation SAM qui pilote la diode 10, pour un asservissement par boucle de retour du courant de pilotage ID de la diode 10.
Ce module de contrôle rétroactif 308 comporte successivement : - en sortie du bloc de pilotage 4, un sommateur 309 qui somme la tension mesurée VD et une tension dite d'offset Rxoffset, qui permet de compenser la tension négative VD entrante lorsque le signal analogique de modulation initial SAMo est nul, avec par exemple Rxoffset = 0,038 V ;
- en sortie du sommateur 309, un amplificateur 313 de gain prédéfini ; et - en sortie de l'amplificateur 313, un convertisseur analogique/numérique 31 1 qui délivre en sortie un signal de feedback numérique SFD. Un premier objet de ce module de contrôle rétroactif 308 est de pouvoir ajuster l'amplitude et le zéro (classiquement appelé « offset ») du courant de pilotage ID (ID=VD/RD), afin que ce courant de pilotage ID corresponde au signal sinusoïdal souhaité.
Un second objet de ce module de contrôle rétroactif 308 est de permettre de contrôler, à chaque itération du signal, le décalage entre le courant de pilotage ID et le signal analogique de modulation SAM, afin de générer des alertes si un seuil de décalage ou d'erreur est dépassé.
Du fait de la modulation du faisceau principal FP, les deux signaux analogiques de détection SAD1 , SAD2, mesurés aux bornes de deux photodétecteurs 14, 15, se présentent également chacun sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales à la fréquence porteuse fo.
Ainsi, et comme illustré sur les figures 9 et 10, le premier signal numérique de fluorescence SFN (ou « Fluo Signal ») et le second signal numérique de référence SRN (ou « Ref Signal »), en sortie du bloc de préamplification 2, se présentent chacun sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales, ayant sensiblement les mêmes caractéristiques temporelles et fréquentielles que le signal sinusoïdal porteur SNM.
Le bloc de traitement numérique du signal 3 comprend un module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 disposé en sortie du générateur 300 et du bloc de préamplification 2. Ce bloc de traitement numérique du signal 3 comprend un premier module d'acquisition/traitement 32 du signal numérique de fluorescence SFN (ou « Fluo Signal ») et un second module d'acquisition/traitement 33 du second signal numérique de référence SRN (ou « Ref Signal »).
D'un point de vue communication, le bloc de traitement numérique du signal 3 utilise pour la transmission du signal sinusoïdal porteur SNM et la réception/acquisition du premier signal numérique de fluorescence SFN et du second signal numérique de référence SRN, un bus de communication BCO numérique comme par exemple du type SPI (Sériai Peripheral Interface Bus) à 32 bits, capable de recevoir et émettre en même temps 32 bits.
En référence à la figure 1 1 , le générateur 300 du bloc de traitement numérique du signal 3 émet à intervalle régulier un point d'échantillonnage PEM(i) (i étant un entier) pour le signal sinusoïdal porteur SNM dans un paquet de données PD1 1 de 16 bits de la trame de 32 bits, l'autre paquet de données PD12 de 1 6 bits étant inutilisé. Pour rappel, l'écart de temps entre deux points d'échantillonnage successifs PEM(i-1 ) et PEM(i) est de 12,5 s (soit 0,0125 ms), ce qui correspond à un écart de temps entre deux trames successives de 12,5 MS.
En référence à la figure 1 1 , à chaque fois qu'un point d'échantillonnage PEM(i) est transmis pour le signal sinusoïdal porteur SNM, le bloc de traitement numérique du signal 3, et plus spécifiquement son module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 , réceptionne un point d'échantillonnage PEF(i-1 ) pour le premier signal numérique de fluorescence SFN et un point d'échantillonnage PER(i-1 ) pour le second signal numérique de référence SRN ; les points d'échantillonnage PEF(i-1 ) et PER(i-1 ) étant les réponses au point d'échantillonnage PEM(i-1 ) précédemment émis pour le signal sinusoïdal porteur SNM. Les points d'échantillonnage PEF(i-1 ) et PER(i- 1 ) sont transmis et réceptionnés dans deux paquets respectifs de données PD21 , PD22 de 16 bits de la trame de 32 bits.
Ainsi, l'intervalle de temps entre deux points d'échantillonnage PEM(i) pour le signal sinusoïdal porteur SNM (12,5 s) correspond au même intervalle de temps d'acquisition entre les points d'échantillonnage PEF(i) et PER(i).
Grâce au procédé de démodulation d'amplitude en phase et en quadrature (Phase and Quadrature Cohérent Démodulation Process) mis en œuvre par le module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 et décrit ultérieurement, tous les déphasages (« phase shifts ») éventuellement introduits par le système n'affectent pas l'analyse des signaux pour extraire une valeur de quantification de l'analyte présent dans l'échantillon E ; de tels déphasages pouvant trouver leurs origines dans des délais de réponse entre le courant de pilotage ID et l'émission du faisceau principal FP, des délais introduits le long des chemins optiques des faisceaux FP, FE, FR, RF, des délais de réponse entre la détection du rayonnement de fluorescence RF par la première photodiode 14 et la génération du premier signal analogique de détection SAD1 , des délais de réponse entre la détection du second faisceau de référence FR par la seconde photodiode 15 et la génération du second signal analogique de détection SAD2, l'inversion de phase introduite par le premier soustracteur 27 du premier moyen de conversion analogique/numérique 21 et l'inversion de phase introduite par le second soustracteur 28 du second moyen de conversion analogique/numérique 22 (voir figure 12), des délais d'amplification trans-impédance introduits par des condensateurs en parasitage.
Il est particulièrement intéressant de générer un signal sinusoïdal porteur SNM sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales.
En effet, il est possible d'utiliser la première itération uniquement pour vérifier si les deux signaux analogiques de détection SAD1 , SAD2 sont au-dessus de seuils minimaux prédéfinis, par exemple fixés à -7V et +8V. Si le premier signal de détection SAD1 est en-dessous du seuil minimal correspondant, une boucle de retour est prévue pour réduire le signal analogique de modulation SAM, notamment de l'ordre de trois fois par rapport au signal initial.
Ainsi, un coefficient de correction est appliqué en amont sur le module du premier signal de détection SAD1 , pour chaque itération, afin de compenser une décroissance du premier faisceau d'excitation FE. L'objet d'une telle boucle de retour est d'éviter une mauvaise lecture due à des saturations de canaux électronique, et également d'étendre la gamme de lecture par fluorescence, de sorte que même des hautes concentrations de 4-MU puissent être détectées.
Les trois autres itérations sont utilisées pour extraire les valeurs des modules du premier signal numérique de fluorescence SFN et du second signal numérique de référence SRN, pour chaque itération.
A l'intérieur de chacune de ces trois itérations, la dernière oscillation sinusoïdale est utilisée pour vérifier la tension VD, autrement appelée le signal sinusoïdal de feed-back de la diode 10 (« Led Feedback Signal »), qui correspond pour rappel à la tension réelle mesurée aux bornes de la diode 10.
Pour précision, et en accord avec le principe de la modulation en amplitude, le module du premier signal numérique de fluorescence SFN correspond à l'enveloppe de la partie sinusoïdale (à l'intérieur d'une itération sinusoïdale) du premier signal numérique de fluorescence SFN, et le module du second signal numérique de référence SRN correspond à l'enveloppe de la partie sinusoïdale (à l'intérieur d'une itération sinusoïdale) du second signal numérique de référence SRN. Dans l'exemple illustré sur les figures 9 et 10, les signaux numériques fluorescence SFN et de référence SRN sont des signaux modulés et les modules respectifs de ces deux signaux correspondent sensiblement à la moitié de l'amplitude en tension Vpp de la partie sinusoïdale du signal correspondant.
Pour détecter un éventuel défaut ou une éventuelle défaillance de la diode 10 ou des dispositifs optiques 1 1 , 12, 13 illustrés sur les figures 2 et 3, le bloc de traitement numérique du signal 3 vérifie automatiquement, à la fin de chaque itération, que le module du second signal numérique de référence SRN est compris à l'intérieur d'une gamme de fonctionnement prédéfinie, autrement dit entre deux seuils prédéfinis de sécurité.
La suite de la description porte spécifiquement sur le module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 qui permet de mettre en œuvre d'un procédé de démodulation d'amplitude en phase et en quadrature.
Le module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 comporte, pour rappel :
- un premier module d'acquisition/traitement 32 relié au générateur 300 et au premier moyen de conversion analogique/numérique 21 du bloc de préamplification 2, pour l'acquisition et le traitement du premier signal numérique de fluorescence SFN ; et
- un second module d'acquisition/traitement 33 relié au générateur 300 et au second moyen de conversion analogique/numérique 22 du bloc de préamplification 2, pour l'acquisition et le traitement du second signal numérique de référence SRN .
Le premier module d'acquisition/traitement 32 comprend un premier moyen de démodulation 34 conçu pour démoduler le premier signal numérique de fluorescence SFN, et comprenant :
- un premier multiplicateur 341 par le signal numérique de démodulation SINE en phase, ce premier multiplicateur 341 étant suivi d'un premier filtre passe-bas 351 à une fréquence de coupure fc inférieure à la fréquence porteuse fo (par exemple fc = 1 10 Hz), afin de délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en phase SFSIN ; et
- un second multiplicateur 342 par le signal numérique de démodulation COSINE en quadrature de phase, ce second multiplicateur 342 étant suivi d'un second filtre passe-bas 352 à la même fréquence de coupure fc, afin de délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en quadrature de phase SFCos-
Le premier module d'acquisition/traitement 32 comporte en outre, en sortie des premier et second filtres passe-bas 351 , 352, un moyen de calcul 353 d'une première valeur dite de fluorescence VALF caractéristique de l'amplitude du rayonnement de fluorescence RF, correspondant au module du premier signal numérique de fluorescence SFN et ainsi au module de la somme du premier signal démodulé de fluorescence en phase SFSIN et du premier signal démodulé de fluorescence en quadrature de phase SFCos- Plus précisément, la première valeur de fluorescence VALF est calculée selon l'équation suivante : VALF = (SFSIN2 + SFCos2)1 2-
Le premier module d'acquisition/traitement 32 comporte aussi, en entrée des premier et second multiplicateurs 341 , 342 :
- un filtre à encoche 361 centré sur la fréquence porteuse fo afin de filtrer le premier signal numérique de fluorescence SFN et délivrer un premier signal intermédiaire filtré SFN' ; et
- un soustracteur 362 réalisant la soustraction du premier signal numérique de fluorescence SFN et du premier signal intermédiaire filtré SFN', afin de générer un premier signal de fluorescence filtré SFN0 = SFN - SFN', ce premier signal de fluorescence filtré SFN0 étant injecté dans les premier et second multiplicateurs 341 , 342.
Le second module d'acquisition/traitement 33 comprend un second moyen de démodulation 37 conçu pour démoduler le second signal numérique de référence SRN, et comprenant :
- un premier multiplicateur 371 par le signal numérique de démodulation SINE en phase, ce premier multiplicateur 371 étant suivi d'un premier filtre passe-bas 381 à la fréquence de coupure fc inférieure à la fréquence porteuse fo, afin de délivrer un second signal démodulé de référence dit en phase SRSIN ; et
- un second multiplicateur 372 par le signal numérique de démodulation COSINE en quadrature de phase, ce second multiplicateur 372 étant suivi d'un second filtre passe-bas 382 à la même fréquence de coupure fc, afin de délivrer un second signal démodulé de fluorescence dit en quadrature de phase SRcos-
Le second module d'acquisition/traitement 33 comporte en outre, en sortie des premier et second filtres passe-bas 381 , 382, un moyen de calcul 383 d'une seconde valeur dite de référence VALR caractéristique de l'amplitude du faisceau de référence FR, correspondant au module du second signal numérique de référence SRN et ainsi au module de la somme du second signal démodulé de référence en phase SRSIN et du second signal démodulé de référence en quadrature de phase SRcos- Plus précisément, la seconde valeur de référence VALR est calculée selon l'équation suivante : VALR = (SRSIN2 + SRcos2)1'2-
Le second module d'acquisition/traitement 33 comporte aussi, en entrée des premier et second multiplicateurs 371 , 372 :
- un filtre à encoche 391 centré sur la fréquence porteuse fo afin de filtrer le second signal numérique de référence SRN et délivrer un second signal intermédiaire filtré SRN' ; et
- un soustracteur 392 réalisant la soustraction du second signal numérique de référence SRN et du second signal intermédiaire filtré SRN', afin de générer un second signal de référence filtré SRN0 = SRN - SRN', ce second signal de référence filtré SRN0 étant injecté dans les premier et second multiplicateurs 371 , 372.
La suite de la description porte sur les calculs mis en œuvre pour déterminer la fluorescence de l'échantillon E en l'exprimant sous forme d'unité relative de fluorescence (ou RFU pour Relative Fluorescence Unit), l'unité relative de fluorescence étant définie comme le ratio entre l'intensité de fluorescence et l'intensité d'excitation.
Les valeurs de RFU sont généralement ajustées pour une échelle de valeurs désirée, déterminée par un procédé de calibration préalable.
Dans le cas du présent système 1 , pour une concentration « x » donnée de la 4-MU contenue dans l'échantillon E lors de la mesure par fluorimétrie, la valeur de RFU calibrée est calculée comme suit :
RFUcai(x) = (Fx.g FLUo) (RX-gREF) , OÙ
- Fx est une valeur brute en mV du signal de fluorescence détecté au premier photodétecteur, qui correspond dans le cadre de l'invention à la première valeur de fluorescence VALF (donnée numérique) issue du procédé de démodulation mis en œuvre dans le bloc de traitement numérique du signal 3 ;
- Rx est une valeur brute en mV du signal de référence détecté au second photodétecteur, qui correspond dans le cadre de l'invention à la seconde valeur de référence VALR (donnée numérique) issue du procédé de démodulation mis en œuvre dans le bloc de traitement numérique du signal 3 ; et
- 9FLUO et gREF sont des paramètres de gain ajustés durant la calibration optique du système 1 .
Le procédé de calibration est effectué par une analyse préalable, par fluorimétrie, d'une solution liquide de référence présentant une concentration CREF connue de la 4-MU et donnant une valeur donnée de RFUREF, avec par exemple CREF = 6410 nM et RFU REF - 3144 avec un certain intervalle de précision. Les paramètres de gain gFi_uo et gREF sont établis durant l'analyse pour obtenir en sortie un RFU de l'ordre de RFUREF-
Dans le cadre d'un test immunologique, la concentration de la 4- MU se situe dans la gamme 40 nM - 40000 nM. La figure 13 illustre la variation du RFU en fonction de la concentration en 4-MU, avec RFU fonction non linéaire de la concentration en 4-MU. Pour obtenir une telle courbe avec un système 1 conforme à l'invention, il est prévu d'appliquer sur la sortie du bloc de traitement numérique du signal 3 un facteur de conversion FCONV, en l'occurrence une fonction polynomiale de la concentration en 4-MU, pour que le RFU mesuré par le système 1 coïncide avec la courbe illustrée en figure 13 et ainsi obtenir la forme de courbe désirée. Ce facteur de conversion FCONV est établi en suivant un protocole d'analyses par fluorimétrie incluant plusieurs facteurs de variation (différentes solutions de 4-MU et différents instruments optiques) afin d'assurer la robustesse et la répétabilité de la mesure.
Le détail des calculs est décrit ci-après.
Dans un premier temps, on établit le courant de pilotage ID(t) de la diode 10, issu de la conversion du signal analogique de modulation SAM. Pour une impulsion sinusoïdale, le courant de pilotage ID(t) (ou courant de diode) répond à l'équation (E1 ) suivante :
ID(t)= [A+B.sin (2nf0t)].rectT(t), soit
ID(t)= [A+B.cos (2TTf0t - n/2)].rectT(t) (E1 )
où
- f0 = 2KHz (fréquence porteuse),
- T = 15,5 ms (durée d'une impulsion sinusoïdale),
- A correspond à l'intensité d'offset (décalage par rapport au zéro), qui peut prendre la valeur de 15 mA, et - B correspond à la demi amplitude du courant de pilotage, qui peut prendre la valeur de 10 mA.
La figure 14 illustre ce courant de pilotage ID(t) en fonction du temps t pour une impulsion.
Dans le domaine fréquentiel, cette équation (E1 ) se traduit par l'équation (E2) suivante :
ID(f)= A.T.sinc(fT)+B.T/2.(e"jn 2.sinc[(f-f0)T)] + ejn 2.sinc[(f+f0)T)]) (E2)
La figure 15 illustre ID(f) en fonction de la fréquence f.
Dans un deuxième temps, le courant de pilotage ID(t) (signal porteur issu du procédé de modulation à la fréquence porteuse fo) est converti en le faisceau principal FP à une longueur d'onde donnée, en l'occurrence autour de 370 nm, avant d'être divisé en un premier faisceau d'excitation FE et un second faisceau de référence FR. Le premier faisceau d'excitation FE excite l'échantillon et les molécules de 4-MU, qui émettent en retour un rayonnement de fluorescence RF détecté par le premier photodétecteur 14 ; cette photodétection se traduisant par un premier signal analogique de détection SAD1 aux bornes du premier photodétecteur 14.
On établit l'équation (E3) suivante qui traduit le passage du courant de pilotage ID(t) vers le premier signal analogique de détection SAD1 (t), signal en sortie du premier photodétecteur 14 et à l'entrée du premier moyen de conversion analogique/numérique 21 ou du premier convertisseur analogique/numérique 24 :
SAD1 (t) = z(t).ID(t), soit
SAD1 (t) = K.[A+B.cos(2nf0t - π/2 + A)].rectT(t), soit
SAD1 (t) = K.A.rectT(t) + [K.B.cos(2nf0t + d )].rectT(t) (E3)
où
- z(t) est le signal d'amplification traduisant l'émission du rayonnement de fluorescence RF, et que l'on considère comme constant et égal à la constante K ;
- d - Δ-π/2, avec Δ correspondant à un déphasage introduit par le système entre la diode 10 et le premier photodétecteur 14.
La figure 16 illustre ce premier signal analogique de détection SAD1 (t) en fonction du temps t pour une impulsion. Dans un troisième temps, le signal analogique de détection SAD1 (t) est converti en signal numérique pour donner le premier signal numérique de fluorescence SFN, après le passage dans le premier moyen de conversion analogique/numérique 21 . Dans le domaine fréquentiel, on obtient ainsi l'équation (E4) suivante :
SFN(f) = K.A.T.sinc(fT)+K.B.T/2.(ejô.sinc[(f-f0)T)] + e"jô.sinc[(f+f0)T)]), soit
SFN(f) = Y(f) = K.A.T.sinc(fT)+K.B.T/2.(ejô.sinc[(f-f0)T)] + e"jô.sinc[(f+f0)T)]) (E4)
La figure 17 illustre SFN(f) en fonction de la fréquence f. Le premier signal numérique de fluorescence SFN est ensuite acquis et traité par le bloc de traitement numérique du signal 3, et plus spécifiquement par le module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 , selon les étapes suivantes du procédé de démodulation.
Dans une première étape du procédé de démodulation, le premier signal numérique de fluorescence SFN(f) passe par un filtre passe-bande composé du filtre à encoche 361 associé au soustracteur 362.
Le filtre à encoche 361 se traduit par une fonction HNotch(f) centrée sur la fréquence porteuse f0 avec une fréquence de coupure basse fi = |f0| - fdec et une fréquence de coupure haute h = |f0|+ fdec, où fdec peut être fixé à 100 Hz, de sorte que la largeur fréquentielle Afnotch de l'encoche est Afnotch = 2.fdec = 200Hz. La figure 18 illustre la fonction HNotch(f) en fonction de la fréquence f.
Le premier signal intermédiaire filtré SFN'(f) répond donc à l'équation SFN'(f) = HNotch(f). SFN(f).
Ainsi, le filtre passe-bande composé du filtre à encoche 361 associé au soustracteur 362, se traduit par une fonction HBp(f) =1 - HNotch(f), qui est appliqué au premier signal numérique de fluorescence SFN(f).
Le premier signal de fluorescence filtré SFN0(f) = SFN(f) - SFN'(f), répond ainsi à l'équation (E5) suivante :
SFNo(f) = HBP(f).SFN(f) = (1 - HNotch(f)).SFN(f), soit
SFNo(f) = K.B.T/2.( ejô.sinc[(f-f0)T)] + e"jô.sinc[(f+f0)T)]) (E5)
La figure 19 illustre SFN0(f) en fonction de la fréquence f. Dans le domaine temporel, cette équation (E5) se traduit par l'équation (E6) suivante :
SFN0(t) = [K.B.cos(2nf0t + ô)].rectT(t), donc SFNo(t) = K.B.rectT(t).cos(ô).cos(2nf0t) - K.B.rectT(t).sin(ô).sin(2nf0t), soit SFNo(t) = Kc(t).cos(2nf0t) - Ks(t).sin(2nf0t) (E6)
avec Kc(t) = K.B.rectT(t) cos(ô) et Ks(t) = K.B.rect T(t).sin(ô)
Dans une deuxième étape du procédé de démodulation, le premier signal de fluorescence filtré SFN0 passe par les deux multiplicateurs 341 , 342 afin d'être multiplié aux signaux numériques de démodulation SINE et COSINE. Pour la description de cette deuxième étape, nous nous référerons utilement à la figure 20 qui illustre spécifiquement les deux multiplicateurs 341 , 342, ainsi que les filtres passe-bas 351 , 352 et le moyen de calcul 353 qui suivent.
Le signal SFN0(t) est multiplié, d'une part, dans le premier multiplicateur 341 par le signal numérique de démodulation SINE afin de générer en sortie un premier signal démodulé intermédiaire en phase SFSiN'(t) et, d'autre part, dans le second multiplicateur 342 par le signal numérique de démodulation COSINE afin de générer en sortie un premier signal démodulé intermédiaire en quadrature de phase SFCos'(t).
Les signaux numériques de démodulation SINE et COSINE se présentent sous les formes temporelles suivantes :
SINE(t) = Ksin.sin(2nfot) = 2.sin(2nf0t), et
COSINE(t) = K∞s.cos(2nfot) = 2.cos(2nf0t)
où Ksin et Kcos correspondent aux amplitudes des signaux et sont fixés à la valeur de 2.
Le signal démodulé intermédiaire en phase SFSiN'(t) et le signal démodulé intermédiaire en quadrature de phase SFCos'(t) répondent aux équations suivantes (E7) et (E8), dans le domaine temporel :
SFsiN'(t) = [Kc(t).cos(2nf0t) - Ks(t).sin(2nf0t) ].2 sin(2nf0t), soit
SFsiN'(t) = 2.[1/2.Ks(t) - 1/2.Kc(t).cos(2n2f0t) - 1/2.Ks(t).sin(2n2f0t)], soit SFsiN'(t) = Ks(t) - Kc(t).cos(2n2f0t) - Ks(t).sin(2n2f0t) (E7)
SFcos'(t) = [Kc(t).cos(2nf0t) - Ks(t).sin(2nf0t) ].2 cos(2nf0t), soit
SFcos'(t) = 2.[1/2.Kc(t) + 1/2.Kc(t).cos(2n2f0t) - 1/2.Ks(t).sin(2n2f0t)], soit SFcos'(t) = Kc(t) + Kc(t).cos(2n2f0t) - Ks(t).sin(2n2f0t) (E8) Dans le domaine fréquentiel, ces équations (E7) et (E8) se traduisent par les équations (E9) et (E10) suivantes :
SFsiN'(f) = [K.B.T.sin(3)].sinc(fT) - [(K.B.T.cos(ô))/2].(sinc[(f-2f0)T)] + sinc[(f+2f0)T)]) -
[(K.B.T.sin(ô))/2].(e"jn 2.sinc[(f-2f0)T)] + ejn 2.sinc[(f+2f0)T)]) (E9)
SFcos'(f) = [K.B.T.cos(ô)].sinc(fT) +
[(K.B.T.cos(a))/2].(sinc[(f-2fo)T)]+sinc[(f+2f0)T)]) - [(K.B.T.sin(ô))/2] (e"jn 2.sinc[(f-2f0)T)] + ejn 2.sinc[(f+2f0)T)]) (E10)
La figure 21 illustre SFSiN'(f) en fonction de la fréquence f et la figure 22 illustre SFCos'(f) en fonction de la fréquence f.
Dans une troisième étape du procédé de démodulation, le signal démodulé intermédiaire en phase SFSIN' et le signal démodulé intermédiaire en quadrature de phase SFCos' sont filtrés par les filtres passe-bas 351 , 352 respectifs, qui délivrent en sortie respectivement un premier signal démodulé en phase SFSIN et un premier signal démodulé en quadrature de phase SFCos- Chaque filtre passe-bas 351 , 352 se traduit par une fonction HLp(f) avec une fréquence de coupure fc fixée ici à 1 10 Hz.
Dans un perfectionnement non illustré, chaque filtre passe-bas 351 , 352 est suivi d'un filtre passe-bas de lissage (ou smooth low pass filter) qui se traduit par une fonction HLpSmooth(f) illustrée en figure 23, avec des fréquences de coupure à fc1 = 2f0, fc2 = 4f0, etc. Chaque filtre passe-bas de lissage permet d'effectuer une moyenne sur les vingt derniers points d'échantillonnage issus du filtre passe-bas HLp(f) précédent, pour augmenter le rejet des signaux aux fréquences de coupure multiple de 2f0.
Le premier signal démodulé en phase SFSIN et le premier signal démodulé en quadrature de phase SFCos répondent aux équations suivantes (E1 1 ) et (E12), dans le domaine fréquentiel :
SFsiN(f) = SFsiN'(f). HLp(f). HLPsmooth(f) = [K.B.T.sin(a)].sinc(fT) (E1 1 )
SFcos(f) = SFcos'(f). HLp(f). HLPsmooth(f) = [K.B.T.cos(ô)] sinc(fT) (E12)
Les figures 24 et 25 illustrent respectivement les signaux SFSiN(f) et SFcos(f) en fonction de la fréquence f.
Dans le domaine temporel, ces équations (E1 1 ) et (E12) se traduisent par les équations (E13) et (E14) suivantes : SFsiN(t) = Ks(t) = K.B.rect T(t).sin(ô) (E13)
SFcos(t) = Kc(t) = K.B.rectT(t).cos(ô) (E14)
Dans une quatrième étape du procédé de démodulation, le premier signal démodulé en phase SFSIN et le premier signal démodulé en quadrature de phase SFCos sont injectés dans le moyen de calcul 353, afin de calculer le module du premier signal analogique de détection SAD1 (t), qui correspond au module du signal [(SFSiN(t) + SFCos(t))2]1 2 ; ces étapes du procédé de démodulation permettant d'extraire le signal d'amplification z(t) sans être affecté par le déphasage inconnu introduit par le système.
Le module calculé, correspondant à la première valeur de fluorescence VALF générée en sortie du module principal d'acquisition/traitement des signaux 31 , répond à l'équation (E15) suivante :
VALF = Module [SAD1 (t)], soit
VALF = [Kc(t)2 + Ks(t)2]1'2
VALF = [(K.B.rectT(t).cos(ô))2 + [K.B.rectT(t).sin(ô)]2]1 2
VALF = [(K.B.rectT(t))2.(cos(ô)2+ sin(ô)2)]1 2
VALF = K.B.rectT(t)
et donc, étant donné que rect T(t) = 1 pour t < T
VALF = K.B (E15)
Les mêmes équations se répètent pour le faisceau de référence
FR, et ainsi pour le calcul du second signal analogique de détection SAD2, du second signal numérique de référence SRN et au final de la seconde valeur dite de référence VALR.
Dans un quatrième temps, un moyen de comparaison (non illustré) disposé en sortie du premier module d'acquisition/traitement 32 et du second module d'acquisition/traitement 33 réalise le calcul de la valeur de RFU à partir des premières valeurs de fluorescence VALFjj et des secondes valeurs de référence VALR,,, délivrées en sortie de ces modules 32, 33, pour chaque itération sinusoïdale (j correspondant au nombre d'itérations et étant prenant les valeurs 0, 1 , 2, car pour rappel trois itérations sont utilisées pour la mesure de fluorescence) et pour une concentration en 4-MU numérotée i.
Pour une itération j, avec une concentration i, la valeur préalable de RFU, nommée rfuj,,, répond à l'équation (E16) suivante : rfu i = {x i + rfuoffse) (E 1 6) où Xj,i répond aux équations suivantes :
dans des coordonnées normales :
r{{VALFJ4 - offset AiR) - K0 F T°))
{VALR i -AZ) · ^ · *- dans des coordonnées étendues :
f
avec
- i = numéro de la concentration en 4-MU
- j = numéro de l'itération (0,1 ,2)
. Λ Ο Γ = coefficient d'ajustement pour le rayonnement de fluorescence calculé durant le procédé de calibration préalable
çFUJO
opt = coefficient d'ajustement en coordonnées étendues pour le rayonnement de fluorescence calculé durant le procédé de calibration préalable
A REF
. ΛΟΡΤ = coefficient d'ajustement pour le faisceau de référence calculé durant le procédé de calibration préalable
= coefficient d'ajustement en coordonnées étendues pour le faisceau de référence calculé durant le procédé de calibration préalable
STD = coefficient d'ajustement de lecture interne calculé durant l'auto- calibration
STRIP = coefficient d'ajustement de position optique référence calculé durant le procédé de calibration optique
- VALFj . = première valeur de fluorescence pour l'itération j, obtenue pour la concentration i
- VALR j t = seconde valeur de référence pour l'itération j, obtenue pour la concentration i
- 0ffsetAm = première valeur de fluorescence moyenne obtenue pour une lecture dans l'air
- °ffSETEXR = première valeur de fluorescence moyenne en coordonnées étendues obtenue pour une lecture dans l'air - rfuoffset = valeur de RFU d'offset
Ensuite, après avoir calculé les j valeurs de rfuj,,, on réalise une conversion polynomiale comme expliqué ci-dessus, en référence à la figure 13, concernant le facteur de conversion FCONV- Pour une itération j, avec une concentration i, la valeur de RFU après application du facteur de conversion FCONV, nommée rfu v , répond à l'équation (E17) suivante : rfu NV = {rfu ■ a + {rfu ■ b + (rfUjJ)2■ c + {rfuJ )■ d + ■ e (E17) où a, b, c, d et e sont des constantes, avec par exemple :
- a = 1 ,3240745951716500 E-13 ;
- b = -3,7686707018928200 E-09 ;
- c = 7,3337036404781 100 E-07 ;
- d = 1 ,031 1832028790600 E+00 ;
- e = 9,4239190294182200 E-01 ;
et où :
- pour une valeur de rfuj C°NV calculée avec (E17) et supérieure à un seuil Rmax, ici égal à la valeur de 23433, rfu^NV est fixé à la valeur du seuil Rmax ; et
- pour une valeur de rfu^NV calculée avec (E17) et inférieure au seuil Rmax, rfu reste égale à cette valeur calculée.
Enfin, la valeur de RFU finale RFUiFIN souhaitée, pour une concentration i, est calculée en effectuant la moyenne des ™Νν avec j prenant les valeurs 0, 1 et 2, sans éventuellement prendre en considération une valeur de trop éloignée de la moyenne.
On obtient au final l'équation (E18) finale :
(E18) Dans un cinquième temps, celle valeur de RFU finale RFU, est transmise à un système d'exploitation, tel qu'un terminal informatique externe ou un système informatique intégré à un instrument automatisé de diagnostic in vitro, pour évaluer, avec des calculs complémentaires, la concentration en analyte.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Système (1 ) de détection et/ou de quantification in vitro par fluorimétrie d'au moins un analyte présent dans un échantillon (E) de fluide, comprenant :
- une source de rayonnement (10) émettrice d'un faisceau principal (FP) dans une longueur d'onde dite d'émission donnée ;
- un diviseur optique (13) disposé en sortie de la source de rayonnement (10) pour diviser le faisceau principal (FP) en un premier faisceau d'excitation (FE) de l'échantillon (E) et un second faisceau de référence (FR) ;
- un premier moyen photodétecteur (14) conçu pour délivrer un premier signal analogique de détection (SAD1 ) en réponse à une détection d'un rayonnement de fluorescence (RF) émis par l'échantillon (E), dans une longueur d'onde dite de fluorescence, sous l'effet de l'excitation induite par le premier faisceau d'excitation (FE) ;
- un second moyen photodétecteur (15) conçu pour délivrer en sortie un second signal analogique de détection (SAD2) en réponse à une détection du second faisceau de référence (FR) ;
ledit système (1 ) étant caractérisé en ce qu'il comprend :
- un générateur (300) délivrant un signal sinusoïdal porteur (SNM) à une fréquence prédéfinie dite fréquence porteuse (fo) prédéfinie, et au moins un signal numérique de démodulation (SINE, COSINE) à cette même fréquence porteuse (fo) ;
- un moyen de conversion numérique/analogique (303) relié au générateur (300) pour convertir le signal sinusoïdal porteur (SNM) en un signal analogique de modulation (SAM) à la fréquence porteuse (fo) ;
- un modulateur d'amplitude (4) relié au moyen de conversion numérique/analogique (303) et à la source de rayonnement (10) pour moduler en amplitude le faisceau principal (FP) à la fréquence porteuse (fo), par application du signal analogique de modulation (SAM) sur ladite source de rayonnement (10) ;
- des moyens de conversion analogique/numérique (21 , 22) reliés aux moyens photodétecteurs (14, 15) pour convertir le premier signal analogique de détection (SAD1 ) en un premier signal numérique dit de fluorescence (SFN), et le second signal analogique de détection (SAD2) en un second signal numérique de référence (SRN) ;
- des moyens de traitement numérique (32, 33) reliés au générateur (300) et aux moyens de conversion analogique/numérique (21 , 22), conçus pour, d'une part, traiter le premier signal numérique de fluorescence (SFN) par démodulation à la fréquence porteuse (fo) afin de calculer une première valeur dite de fluorescence (VALF) caractéristique de l'amplitude du rayonnement de fluorescence (RF) et, d'autre part, traiter le second signal numérique de référence (SRN) par démodulation à la fréquence porteuse (fo) afin de calculer une seconde valeur dite de référence (VALR) caractéristique de l'amplitude du faisceau de référence (FR) ;
- un moyen de comparaison entre la première valeur de fluorescence (VALF) et la seconde valeur de référence (VALR), pour calculer un résultat final (RFU) pour établir la détection et/ou la quantification de l'analyte.
2. Système (1 ) selon la revendication 1 , dans lequel les moyens de traitement numérique (32, 33) comprennent :
- un premier moyen de démodulation (34) conçu pour démoduler le premier signal numérique de fluorescence (SFN), en le multipliant par au moins un signal numérique de démodulation (SINE, COSINE) à la fréquence porteuse (fo), afin d'engendrer au moins un premier signal démodulé de fluorescence (SFSIN, SFcos) ; et
- un premier moyen de calcul (353) conçu pour calculer, à partir du au moins un premier signal démodulé de fluorescence (SFSIN, SFCOS), une première valeur dite de fluorescence (VALF) caractéristique de l'amplitude du rayonnement de fluorescence (RF) ;
3. Système (1 ) selon la revendication 2, dans lequel le premier moyen de démodulation (34) comprend :
- un premier multiplicateur (341 ) par un signal numérique de démodulation (SINE) à la fréquence porteuse (fo) et en phase avec le signal sinusoïdal porteur (SNM), ledit premier multiplicateur (341 ) étant éventuellement suivi d'un premier filtre passe-bas (351 ) à une fréquence de coupure (fc) inférieure à la fréquence porteuse (fo), afin de délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en phase (SFSIN) ; et - un second multiplicateur (342) par un signal numérique de démodulation (COSINE) à la fréquence porteuse (fo) et en quadrature de phase par rapport au signal sinusoïdal porteur (SNM), ledit second multiplicateur (342) étant éventuellement suivi d'un second filtre passe-bas (352) à la même fréquence de coupure (fc), afin de délivrer un premier signal démodulé de fluorescence dit en quadrature de phase (SFCos) ;
et dans lequel le premier moyen de calcul (353), en sortie desdits premier et second multiplicateurs (341 , 342), calcule la première valeur de fluorescence (VALF) correspondant au module de la somme du premier signal démodulé de fluorescence en phase (SFSIN) et du premier signal démodulé de fluorescence en quadrature de phase (SFCos)-
4. Système (1 ) selon la revendication 3, dans lequel les moyens de traitement numérique (32, 33) comprennent, en entrée des premier et second multiplicateurs (341 , 342) :
- un filtre à encoche (361 ) centré sur la fréquence porteuse (fo) afin de filtrer le premier signal numérique de fluorescence (SFN) et délivrer un premier signal intermédiaire filtré (SFN') ; et
- un soustracteur (362) réalisant la soustraction du premier signal numérique de fluorescence (SFN) et du premier signal intermédiaire filtré
(SFN'), afin de générer un premier signal de fluorescence filtré (SFN0), ce premier signal de fluorescence filtré (SFN0) étant injecté dans lesdits premier et second multiplicateurs (341 , 342) du premier moyen de démodulation (34).
5. Système (1 ) selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens de traitement numérique (32, 33) comprennent :
- un second moyen de démodulation (37) conçu pour démoduler le second signal numérique de référence (SRN), en le multipliant par au moins un signal numérique de démodulation (SINE, COSINE) à la fréquence porteuse (fo), afin d'engendrer au moins un second signal démodulé de référence (SRSIN, SRcos) ; et
- un second moyen de calcul (383) conçu pour calculer, à partir du au moins un second signal démodulé de référence (SRSIN, SRCOS), la seconde valeur de référence (VALR).
6. Système (1 ) selon la revendication 5 dans lequel le second moyen de démodulation (37) comprend :
- un premier multiplicateur (371 ) par un signal numérique de démodulation (SINE) à la fréquence porteuse (fo) et en phase avec le signal sinusoïdal porteur (SNM), ledit premier multiplicateur (371 ) étant éventuellement suivi d'un premier filtre passe-bas (381 ) à une fréquence de coupure (fc) inférieure à la fréquence porteuse (fo), afin de délivrer un second signal démodulé de référence dit en phase (SRSIN) ; et
- un second multiplicateur (372) par un signal numérique de démodulation (COSINE) à la fréquence porteuse (fo) et en quadrature de phase par rapport au signal sinusoïdal porteur (SNM), ledit second multiplicateur (372) étant éventuellement suivi d'un second filtre passe-bas (382) à la même fréquence de coupure (fc), afin de délivrer un second signal démodulé de référence dit en quadrature de phase (SRcos) ;
et dans lequel le second moyen de calcul (383), en sortie desdits premier et second multiplicateurs (371 , 372), calcule la seconde valeur de référence (VALR) correspondant au module de la somme du second signal démodulé de référence en phase (SRSIN) et du second signal démodulé de référence en quadrature de phase (SRcos)-
7. Système (1 ) selon la revendication 6, dans lequel les moyens de traitement numérique (32, 33) comprend, en sortie du second moyen de conversion analogique/numérique (22) et en entrée desdits premier et second multiplicateurs (371 , 372) :
- un filtre à encoche (391 ) centré sur la fréquence porteuse (fo) afin de filtrer le second signal numérique de référence (SRN) et délivrer un second signal intermédiaire filtré (SRN') ; et
- un soustracteur (392) réalisant la soustraction du second signal numérique de référence (SRN) et du second signal intermédiaire filtré (SRN'), afin de générer un second signal de référence filtré (SRN0), ce second signal de référence filtré (SRN0) étant injecté dans lesdits premier et second multiplicateurs (371 , 372) du second moyen de démodulation (37).
8. Système (1 ) selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre, intercalé entre la source de rayonnement (10) et le diviseur optique (13), un filtre optique passe-bande (1 1 ) centré sensiblement sur la longueur d'onde d'émission.
9. Système (1 ) selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre, intercalé entre l'échantillon (E) et le premier moyen photodétecteur (14), un filtre optique passe-bande (141 ) centré sensiblement sur la longueur d'onde de fluorescence.
10. Système (1 ) selon la revendication 9, comprenant en outre, intercalé entre le filtre optique passe-bande (141 ) et le premier moyen photodétecteur
(14) , un guide d'ondes (142) réalisé sous la forme d'un cône de guidage.
1 1 . Système (1 ) selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre, intercalé entre le diviseur optique (13) et le second moyen photodétecteur (15), un filtre optique passe-bas (151 ) qui présente une longueur d'onde basse de coupure sensiblement inférieure à la longueur d'onde d'émission.
12. Système (1 ) selon la revendication 1 1 , comprenant en outre, intercalé entre le filtre optique passe-bas (151 ) et le second moyen photodétecteur
(15) , un guide d'ondes (152) réalisé sous la forme d'un cône de guidage.
13. Système (1 ) selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le signal sinusoïdal porteur (SNM) se présente sous la forme d'une série de plusieurs itérations périodiques sinusoïdales à la fréquence porteuse (fo), l'écart de temps entre deux itérations consécutives étant supérieur à la période des itérations sinusoïdales.
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