EP2773994A2 - Automatische strukturbestimmung - Google Patents

Automatische strukturbestimmung

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Publication number
EP2773994A2
EP2773994A2 EP12791089.1A EP12791089A EP2773994A2 EP 2773994 A2 EP2773994 A2 EP 2773994A2 EP 12791089 A EP12791089 A EP 12791089A EP 2773994 A2 EP2773994 A2 EP 2773994A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
structures
optical unit
analysis
image
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP12791089.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Peter Schimon
Jens BLECKEN
Markus Wulf
Matthias Wende
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aeneas GmbH and Co KG
Original Assignee
Matthias Torsten
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE102011117273A external-priority patent/DE102011117273A1/de
Application filed by Matthias Torsten filed Critical Matthias Torsten
Priority to EP12791089.1A priority Critical patent/EP2773994A2/de
Priority claimed from PCT/EP2012/004527 external-priority patent/WO2013064237A2/de
Publication of EP2773994A2 publication Critical patent/EP2773994A2/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/025—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations having a carousel or turntable for reaction cells or cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G02B21/244—Devices for focusing using image analysis techniques
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/32—Micromanipulators structurally combined with microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison

Definitions

  • the invention relates to an automated method for the optical analysis of structures, in particular for the analysis and determination of biological, cellular structures, and a device for this purpose.
  • samples of biological organisms are also examined microscopically for changes in constituents or structures in order to detect diseases and to monitor their progress.
  • the implementation of chemical and biological testing procedures is becoming more and more automated, thereby improving the cost and speed of the analysis.
  • the microscopic examination is then carried out by an experienced person.
  • WO 2006/000115 describes an apparatus and method for arranging pipette or dispenser tips in a system for manipulating fluid samples.
  • Such apparatus includes a robotic manipulator for aligning pipette or dispenser tips in an X direction and in a substantially perpendicular thereto Y direction with respect to sample containers disposed in or on the system.
  • Such devices also include pipette or dispenser tips that extend substantially vertically and that are raisable and lowerable in a Z-direction that is substantially perpendicular to the X and Y directions. These holders are preferably guided on the work table displaced.
  • Liquid samples may also be located in the wells of microtiter plates or from the wells Sample tubes have been pipetted into these wells or wells. In this case, usually two microtiter plates are arranged on a so-called “carrier”, which is preferably likewise displaceably guided on the work table.
  • carrier which is preferably likewise displaceably guided on the work table.
  • such a device for manipulating samples in containers and / or on slides in the region of an XY field is further known, in which the first and the second robot manipulator can process at least the entire area of the XY field , practically without affecting each other.
  • the action areas of the two robot manipulators can be chosen freely.
  • the second robot manipulator can pass the first robot manipulator with or without objects loaded.
  • the repositioning of a wide variety of objects with the second robot manipulator e.g. moving active devices in the form of scanners (1 D, 2D), cameras, printheads, etc. allows the use of the functions of these devices across the entire field of the work platform.
  • EP 1 829 613 A1 discloses a storage unit for biological samples, with a substantially horizontal main floor space and a plurality of storage chambers.
  • biological samples e.g. Tissue samples obtained by biopsy, very often stored as tissue pieces in cassettes or as thin sections on glass slides.
  • a selection of such cassettes and glass slides are described e.g. offered by the company Thermo Shandon.
  • WO 2005/103725 A1 also discloses a device for transporting or examining liquids in a system for working with liquid samples.
  • the device comprises at least one functional element with at least one functional end, wherein the functional elements are aligned substantially perpendicular to the working field in a Z-direction.
  • DE 10 2007 018 483 A1 describes working platforms for treating liquids, such as, for example, pipetting liquids from containers and distributing them in the wells of a microtiter plate, which are known from document WO 02/059626 A1 entitled "Pipetting device”. and EP 1 477 815 A1, entitled "Apparatus for Precise Starting of Microplate Wells”.
  • a device for conditioning a system liquid for a liquid handling device is further disclosed, wherein reference is made to the following prior art.
  • Industries involved in biochemical techniques for example in pharmaceutical research and clinical diagnostics, require equipment for processing fluid volumes and fluid samples.
  • Automated systems usually include a liquid handling device, such as a single pipetting device or multiple pipetting devices, which are used on liquid containers, which are located on the work table of a workstation or a so-called "liquid handling workstation".
  • microtiter plates In the prior art, as known, for example, from WO 2006/000115 A1, WO 02/059626 A1 and EP 1 477 815 A1, it is customary for microtiter plates to have either all eight wells or positions of a microtiter plate with eight equidistant plates. at the same time filled and washed and provided with reagent.
  • EP 1 921 552 relates to a network-controlled method for ensuring the authenticity and quality of visually collected findings in laboratory diagnostics due to manual or semi-automated medical laboratory analyzes using the technique "indirect immunofluorescence".
  • the laboratory system used is intended to reduce human error sources by electronically networking the sample processing steps and to ensure that the visually collected findings are based on a correct and error-free database associated with the patient sample being examined.
  • the visually collected findings are based on an assessment of the fluorescence pattern of the findings and are therefore based on a manual step.
  • the present invention is therefore based on the object to avoid the disadvantages of the prior art described above, to dispense with manual steps in an optical determination, as well as to achieve an increased level of system stability.
  • the invention therefore aims to provide a method and an apparatus for detecting or for the optical analysis of two- and / or three-dimensional structures of material obtained in particular from biological samples, with which a microscopic analysis is carried out without human intervention can be.
  • the invention also aims to recognize by means of these structures the sample known typical conditions such as diseases or anomalies.
  • the invention also aims to perform this optical analysis in a device together with a chemical and biological analysis.
  • Such a comparison can be carried out by means of an algorithm, for example by means of a so-called “best fit” method, which makes it possible to recognize specific features or structures in images and to assign them to already known features
  • malignant changes are routinely detected without the influence of human activities being assigned to certain patterns.
  • they To enable such a computer-aided recognition of the two-dimensional or three-dimensional structures, they must be extremely accurately recorded, ie the sample to be examined must be as closely as possible in the focus of the For this purpose, it has been found according to the invention that this is possible by a combination of contrast analysis and color value recognition.
  • a stop signal is triggered which stops the change in distance between the optical unit and the sample.
  • an autofocusing system can be obtained, which allows a complete renunciation of human manipulation, while at the same time increasing the stability of the system. In particular, this can be dispensed with the additional labeling of positive / negative cells as a control.
  • the method according to the invention avoids the need for special exposure settings and ensures protection against false focus, in particular dust focusing.
  • Typical methods for contrast analysis are known per se and commercially available.
  • the procedure is such that a pattern of different colors is imaged and the position of the focus of the optics and / or the position of the sample is changed until a maximum number of different, separate color pixels is reached. In the procedure according to the invention, this is preferably done with the colors red, green and / or blue.
  • Such algorithms for color value analysis are known per se and available on the Internet and in the trade, for. B. Fa. Keyence.
  • the sample container on contrast features such as lines, dots, checks, etc., which may possibly also be colored. These features are preferably arranged so that they leave the sample container, but come to lie as close to this. With such features, it is also possible to detect any tilting of sample containers and to adjust them by the previously described autofocusing. This is particularly advantageous if a variety of juxtaposed sample containers to a so-called “multiwell plate” is summarized.
  • the sample usually contained in a liquid is prepared in such a way that it has a surface which is as flat as possible. This is done, for example, in that the sample is added only in a small amount of liquid or the liquid is removed again after application.
  • an analysis device can be used as the analysis device, as described in DE 10 2008 022 835, which additionally contains an electro-optical unit.
  • a microscope in the sense of the present invention can be understood to mean a movable microscope such as, for example, a conventional light microscope, a laser microscope, in particular also scanning microscopes, in particular laser scanning microscopes.
  • a sample is a biochemical or chemical sample.
  • the sample can be placed in a small container such as
  • test tube wells, pots, or on a sample carrier, in particular be applied to a slide.
  • the sample itself may comprise cells, both living and dead cells, viruses, RNA and DNA molecules, cell components or organelles such as membranes.
  • the electronic detection or imaging of the sample by means of an electro-optical unit is preferably carried out by the sample is placed just below the beam path of the microscope or optics.
  • the generated images are directed to a converter that converts light signals into electronic signals.
  • this is a CCD device.
  • contrast analysis takes place by means of a displacement-controlled computer via contrast analysis and color value recognition.
  • contrast analysis the contrast is optimized by means of a per se known algorithm by shifting the optics and / or the sample in the vertical direction (Z-axis). This puts the sample in the focus of the optics of the microscope.
  • color value recognition for example, different colors such as red, green or blue are determined separately in the pixels of the electro-positive unit and a maximum of separate pixels of these colors is generated.
  • a preset of the focus done and in particular a fast automatic detection of the correct focus setting can be achieved.
  • an alignment layer may be present for each individual sample.
  • the alignment layer may be located at various points on or on the multi-well plate. This can advantageously height differences as z. B. can be detected faster at tilts of the sample over the whole multiwell plate.
  • the method additionally comprises processing the sample.
  • a sample to be examined on a slide in a test tube can be brought into contact with other biochemical, chemical compounds, in particular in solution, so that a biochemical or chemical reaction can occur.
  • the processing of the sample includes a waiting time, such as an incubation time, or a mixing time. The sample is not examined immediately with the electronic unit, but only after the waiting time.
  • the method according to the invention comprises covering the sample with a covering device.
  • a cover device may be a glass plate, a plastic plate or another translucent plate.
  • the samples for example, when applied to a slide, may be surrounded by an applied liquid drop.
  • the procedure according to the invention also includes a computer-aided differentiation by means of a data bank / library structures such as B of a histogram.
  • a positive or negative recognition is implemented in such a way that image information is displayed in such a way by means of a mathematical classification based on an algorithm that the image displays positive or negative structures, in particular characteristic rasters, structures or patterns.
  • FIG. 1 shows an exemplary embodiment of the method as a flow chart
  • FIG. 2 shows a schematic structure of the analytical device according to the invention without a microscope
  • FIG. 3 shows a schematic structure of the analysis device according to the invention with a microscope
  • FIG. 1 shows an exemplary embodiment of the method according to the invention.
  • the step shown in block A structure determination
  • the step shown in block A consists of the sample preparation consisting of reading the sample identification by means of barcode reader integrated in the analysis device and loading the analyzer with the reagents necessary for the respective test with subsequent start of the fully automatic sample processing of the immunofluorescence test and the automatic microscopy and / or recording the samples.
  • the autofocusing is performed with the aid of a contrast analysis and a color value recognition and subsequently electronic images are generated with a CCD camera.
  • image processing image processing
  • the previously generated images are stored in a picture and data archive by means of data processing software and can thus be used for the subsequent automatic classification (pos / neg) by means of histograms.
  • the step shown in block C serves to secure the diagnosis and to confirm the classification.
  • the aids shown in block D can be consulted. Completion of the procedure is completed by producing a report.
  • FIG. 2 shows an overall perspective view of an analysis device 2 according to the invention for examining biological and chemical samples 5, which is used as analysis device 2.
  • the analysis device 2 has a helmet-shaped device housing 2 with an unfolded visor-like cover 3, which can be opened and closed around two hinges 4.
  • On the rear side (not shown) are the electrical plug connection strips, to which various plugs for the electrical 24 V network, for the electrical control signals to a data processing system (personal computer) and for measuring signals (in particular a USB interface) are connected.
  • a data processing system personal computer
  • measuring signals in particular a USB interface
  • the analysis device 2 has a base plate 12, which carries a work plate 13, which is also arranged horizontally in use, often called a carousel, and which can be rotated about its vertical axis by a motor or drive into a predetermined angle of rotation.
  • a work plate 13 which is also arranged horizontally in use, often called a carousel, and which can be rotated about its vertical axis by a motor or drive into a predetermined angle of rotation.
  • two rectangular recesses for receiving two sample containers 13 a are provided, wherein only a sample container 13 a is placed, which contains in a matrix arrangement a plurality of pots or wells 13 b:
  • This inner work plate 13 is in the radial direction through an annular worktop 14, are arranged on the circumferentially transparent slides 15 which carry biological or chemical samples each.
  • This annular work plate 14 is fixed by means of supports 16 on the base plate 12.
  • This annular work plate 14 can in other embodiments not shown, however, via a be rotated separate rotary drive or rotated together with the inner worktop.
  • an approximately semicircular test tube holder 20 is provided which has holes 21 for smaller test tubes.
  • an approximately quarter-circular test tube holder 22 with larger holes 23 for larger test tubes 24 is arranged in the same circumferential region on the left side of FIG.
  • a sample manipulator 3 which carries a support arm 26 extending parallel to the inner work surface 13 in a horizontal direction and a carriage (not visible) movable along this support arm 26 by means of a horizontal spindle drive 27.
  • This carriage carries a vertically movable Z-direction needle system with the needle unit 32, which can be brought from a first vertical drive 33 in predetermined vertical positions. Thereby, the free tips of the needle unit 32 can be positioned in an upper position above and in a lower position within a puddle 13b of a sample container 13a.
  • FIG. 3 illustrates the arrangement from FIG. 2 together with the microscope 4.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein automatisiertes Verfahren zur optischen Analyse von Strukturen insbesondere zur Analyse und Bestimmung biologischer, zellulärer Strukturen, sowie eine Vorrichtung hierzu, wobei eine elektrooptische Einheit eine elektronische Abbildung von in der Probe vorliegenden zwei- und dreidimensionalen Strukturen erzeugt, ein Speichermedium die Abbildung abspeichert, eine rechnergesteuerte Verschiebeeinrichtung eine optimierte Bildschärfe der Abbildung durch ein Verändern des Abstands von Probe und optischer Einheit einstellt, wobei die Verschiebeeinrichtung durch eine Kontrastanalyse und eine Farbwerterkennung gesteuert wird und eine Recheneinheit die von der elektrooptischen Einheit erzeugten Abbildungen von zwei- und/oder dreidimensionalen Strukturen mit den in einer Datenbank gespeicherten bekannten Strukturen abgleicht, die von der optischen Einheit erfassten Strukturen mittels eines Algorithmus zu charakteristi- sehen Rastern, Strukturen oder Mustern zugeordnet werden.

Description

Automatische Strukturbestimmung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein automatisiertes Verfahren zur optischen Analyse von Strukturen insbesondere zur Analyse und Bestimmung biologischer, zellulärer Strukturen, sowie eine Vorrichtung hierzu.
Stand der Technik
Zur Bestimmung von Erkrankungen und deren Verlaufskontrolle werden Proben von biologischen Organismen neben der chemischen und biologischen Analyse auch mikroskopisch auf Veränderungen von Bestandteilen bzw. Strukturen untersucht, um Erkrankung zu erkennen. Zur Erleichterung derartiger Bestimmungen wird die Durchführung von chemischen und biologischen Testverfahren mehr und mehr automatisiert, wodurch Kosten und Schnelligkeit der Analyse verbessert werden. Die mikroskopische Betrachtung wird dann von einer erfahrenen Person durchgeführt.
Vorrichtungen zur automatisierten bzw. zur semiautomatischen Analyse von chemischen und biologischen Substanzen bzw. Parameter sind generell bekannt. So beschreibt beispielsweise die WO 2006/000115 eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Anordnen von Pipetten- oder Dispenser-Spitzen in einem System zum Manipulieren von Flüssigkeitsproben. Eine solche Vorrichtung umfasst einen Robotermanipulator zum Ausrichten von Pipetten- oder Dispenser-Spitzen in einer X- Richtung und in einer im Wesentlichen rechtwinklig dazu verlaufenden Y- Richtung bezüglich in oder auf dem System angeordneten Probenbehältern. Solche Vorrichtungen umfassen zudem Pipetten- oder Dispenser-Spitzen, die sich im Wesentlichen vertikal erstrecken und die in einer im Wesentlichen senkrecht zu den X- und Y- Richtungen verlaufenden Z-Richtung anhebbar und absenkbar sind. Diese Halter sind vorzugsweise auf dem Arbeitstisch geführt verschiebbar. Flüssigkeitspro- ben können sich auch in den Wells von Mikrotiterplatten befinden, bzw. aus den Proben röhrchen in diese Wells bzw. Näpfchen umpipettiert worden sein. Dabei werden üblicherweise zwei Mikrotiterplatten auf einem so genannten "Carrier" angeordnet, welcher vorzugsweise ebenfalls auf dem Arbeitstisch geführt verschiebbar ist. Ein derartiges Analysegerät wird von der Aesku-Systems GmbH & Co. KG, Wendelsheim, DE unter der Bezeichnung Helmed vertrieben.
Aus der CH 696 030 A5 ist weiterhin eine solche Vorrichtung zum Manipulieren von Proben in Behältern und/oder auf Objektträgern im Bereich eines X- Y-Feldes bekannt, bei welcher der erste und der zweite Robotermanipulator zumindest den ganzen Bereich des X-Y-Feldes bearbeiten können, praktisch ohne sich gegenseitig zu beeinträchtigen. Die Aktionsbereiche der beiden Robotermanipulatoren können dabei frei gewählt werden. Der zweite Robotermanipulator kann mit oder ohne Objekte beladen den ersten Robotermanipulator passieren. Das Umplatzieren von unterschiedlichsten Objekten mit dem zweiten Robotermanipulator, wie z.B. das Versetzen von aktiven Geräten in Form von Scannern (1 D, 2D), Kameras, Druckköpfen, etc. ermöglicht das Nutzen der Funktionen dieser Geräte auf dem ganzen Feld der Arbeitsplattform.
Aus der EP 1 829 613 A1 ist eine Aufbewahrungseinheit für biologische Proben, mit einer im Wesentlichen horizontalen Hauptstandfläche und mehreren Aufbewahrungskammern offenbart. In biologischen Labors, insbesondere in den Labors von pathologischen Instituten von Universitäten oder Spitälern, werden biologische Proben, z.B. durch Biopsie gewonnene Gewebeproben, sehr oft als Gewebestücke in Kassetten oder als Dünnschnitte auf Glasobjektträgern aufbewahrt. Eine Auswahl solcher Kassetten und Glasobjektträger wird z.B. von der Firma Thermo Shandon angeboten.
Aus der WO 2005/103725 A1 ist weiterhin eine Vorrichtung für das Transportieren oder Untersuchen von Flüssigkeiten in einem System zum Arbeiten mit Flüssig- keitsproben bekannt. Die Vorrichtung umfasst zumindest ein Funktionselement mit wenigstens einem funktionellen Ende, wobei die Funktionselemente im Wesentlichen senkrecht zum Arbeitsfeld in einer Z-Richtung ausgerichtet sind. In der DE 10 2007 018 483 A1 sind Arbeitsplattformen zum Behandeln von Flüssigkeiten, wie zum Beispiel das Pipettieren von Flüssigkeiten aus Behältern und zum Verteilen derselben in den Wells einer Mikrotiterplatte beschrieben, die aus der Druckschrift WO 02/059626 A1 mit dem Titel„Pipettiervorrichtung" und aus der Druckschrift EP 1 477 815 A1 mit dem Titel„Vorrichtung zum präzisen Anfahren von Mikroplatten-Wells" bekannt sind. Es handelt sich dabei vorzugsweise um Arbeitsplattformen, bei denen z.B. eine Pipettenspitze an einem bestimmten Ort automatisiert positioniert werden kann. In der WO 2007/071613 A1 wird weiterhin eine Vorrichtung zum Konditionieren einer Systemflüssigkeit für ein Liquidhandlinggerät offenbart, worin auf folgenden Stand der Technik hingewiesen wird. Industriezweige, die sich z.B. in der pharmazeutischen Forschung bzw. in der klinischen Diagnostik mit biochemischen Techniken befassen, benötigen Anlagen zum Verarbeiten von Flüssigkeitsvolumina und Flüssigkeitsproben. Automatisierte Anlagen umfassen üblicherweise ein Liquidhandlinggerät, wie z.B. ein einzelnes Pipettiergerät oder mehrere Pipettiergeräte, welche an Flüssigkeitsbehältern eingesetzt werden, die sich auf dem Arbeitstisch einer Arbeitsstation bzw. einer so genannten "Liquidhandling Workstation" befinden.
In der EP 1 206 967 A2 wird ein Stand der Technik beschrieben, wonach es bekannt ist, dass Tropfen mit einem Volumen von mehr als 10 μΙ sehr einfach aus der Luft abgegeben werden können, weil die Tropfen bei korrektem Umgang mit der Pipette von selbst die Pipettenspitze verlassen. Die Tropfengröße wird dann durch die physikalischen Eigenschaften der Probenflüssigkeit, wie Oberflächenspannung oder Viskosität bestimmt. Die Tropfengröße limitiert somit die Auflösung der abzugebenden Menge Flüssigkeit. Aus EP 0 725 267 A2 ist z.B. eine Pipettenspitze in der Form einer Mikroejektionspumpe bekannt, mit welcher aktiv eine Flüssigkeitsprobe abgetrennt wird. Das Nachliefern der Flüssigkeit geschieht durch den in der Leitung zwischen Vorratsgefäß und Pipettenspitze herrschenden, hydrostatischen Druck. Beim bisherigen Stand der Technik, wie z.B. aus den WO 2006/000115 A1 , WO 02/059626 A1 und EP 1 477 815 A1 bekannt, ist es üblich, dass bei Mikrotiterplat- ten entweder alle acht Wells oder Positionen einer Mikrotiterplatte mit acht äqui- distant angeordneten Hohlnadeln gleichzeitig befüllt und gewaschen und mit Rea- genz versehen werden.
Die EP 1 921 552 betrifft ein netzplangesteuertes Verfahren zur Sicherstellung der Authentizität und Qualität visuell erhobener Befunde in der Labordiagnostik aufgrund manuell oder teilautomatisiert durchgeführter medizinischer Laboranalysen mit der Technik "Indirekte Immunfluoreszenz". Das dabei verwendete Laborsystem soll durch eine elektronische Vernetzung der Probenprozessierungsschritte menschliche Fehlerquellen verringern und soll gewährleisten, dass die visuell erhobenen Befunde auf einer korrekten und fehlerfrei zur untersuchten Patientenprobe assoziierten Datenbasis beruhen. Die visuell erhobenen Befunde beruhen jedoch auf einer Beurteilung des Fluoreszenzmusters der Befunddaten und basieren daher auf einem manuellen Schritt.
Häufig ist es notwendig biologische und/oder chemische Reaktionen der biologischen Systeme wie z. B. Gewebeteile, ganzen Zellen oder auch Zellbestandteile wie z. B. Zellorganellen etc. optisch zu untersuchen. Hierzu werden die zu untersuchenden Objekte unter einem Mikroskop analysiert und betrachtet und hierzu werden bislang üblicherweise von einem menschlichen Betrachter visuell begutachtet und anhand seiner subjektiven Erfahrungen einem Zustand zugeordnet. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die zuvor geschilderten Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden, auf manuelle Schritte bei einer optischen Bestimmung zu verzichten, sowie ein erhöhtes Maß an Systemstabilität zu erzielen. Die Erfindung hat daher zum Ziel ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Erkennen bzw. zur optischen Analyse von zwei- und/oder dreidimensionalen Strukturen von insbesonders aus biologischen Proben gewonnenem Material bereitzustellen mit dem ohne menschlichen Eingriff eine mikroskopischer Analyse durchgeführt werden kann. Die Erfindung hat auch zum Ziel mittels dieser Strukturen der Probe bekannte typische Zustände wie Erkrankungen oder Anomalien zu erkennen. Die Erfindung hat auch zum Ziel diese optische Analyse in einer Vorrichtung zusammen mit einer chemischen und biologischen Analyse durchzuführen.
Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch die in den unabhängigen Ansprüchen definierten Merkmale gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche. Bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise wird eine optische insbesondere mikroskopische Analyse bzw. Bestimmund einer Probe wie z. B. biologischem Material wie Zellen, Gewebe und/oder auch Zellkomponenten automatisch mittels einer optischen Einrichtung durchgeführt. Dabei wird eine Abbildung der Probe mittels eines optoelektronischen System erfasst und in einem elektronischen Speichermedium gespeichert. Die so erfasste und gespeicherte Abbildung wird dann mit weitern in einer Datenbank vorliegenden Sammlung von Abbildungen bzw. Teilstrukturen davon verglichen. Ein derartiger Vergleich ist beispielsweise mittels eines sogenannten„best fit" - Verfahrens durch einen Algorithmus durchführbar. Damit ist es auch möglich bestimmte Merkmale oder Strukturen in Abbil- düngen zu erkennen und diesen bereits bekannten Merkmalen zuzuordnen. Auf diese Weise können sowohl natürliche als auch unnatürliche, insbesonders maligne Veränderungen routinemäßig erkannt ohne den Einfluss menschlicher Tätigkeiten bestimmte Mustern zugeordnet erkannt werden. Damit eine derartige rechnergestützte Erkennung von den zwei- bzw. dreidimensionalen Strukturen möglich ist, müssen diese äußert genau erfasst werden d.h. die zu untersuchende Probe muss möglichst genau im Fokus der optischen Einrichtung angeschaut werden. Hierzu wurde erfindungsgemäß gefunden, dass dies durch eine Kombination von Kontrastanalyse und Farbwerterkennung möglich ist.
Dies erfolgt erfindungsgemäß dadurch, dass der Abstand zwischen der optischen Einrichtung und der im Probenbehälter angeordneten Probe solange verändert wird, bis die Probe im Fokus zu liegen kommt. Dies wird erfindungsgemäß mittels einer rechnergesteuerten Verschiebeeinrichtung durchgeführt, welche den Abstand von Probe und optischer Einheit sowohl mittels einer Kontrastanalyse als auch einer Farbwerterkennung steuert.
Sobald mit diesen beiden Verfahren ein Optimum an maximalen Kontrast- und maximaler Farbwerterkennung erreicht ist, wird ein Stoppsignal ausgelöst, welches die Abstandsveränderung zwischen optischer Einheit und Probe stoppt. Auf diese Weise kann ein Autofokussierungssystem erhalten werden, welches einen völligen Verzicht auf menschliche Manipulation ermöglicht und dabei gleichzeitig die der Systemstabilität erhöht. Insbesondere kann dadurch auf die zusätzliche Markierung von positiven/negativen Zellen als Kontrolle verzichtet werden. Ebenfalls kann durch das erfindungsgemäße Vorgehen auf spezielle Belichtungseinstellungen verzichtet und eine Absicherung gegen Fehlfokussierung, insbesondere Staubfokussierung, erreicht werden.
Typische Verfahren zur Kontrastanalyse sind an sich bekannt und kommerziell erhältlich. Bei der erfindungsgemäß durchgeführten Farbwertanalyse wird derart vorgegangen, dass ein Muster verschiedener Farben abgebildet wird und die Lage des Fokusses der Optik und/oder die Lage der Probe solange geändert wird, bis eine maximale Anzahl unterschiedlicher, separater Farbpixel erreicht wird. Bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise erfolgt dies vorzugsweise mit den Farben Rot, Grün und/oder Blau. Derartige Algorithmen zur Farbwertanalyse sind an sich bekannt und im Internet und im Handel erhältlich, z. B. Fa. Keyence.
In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weist der Probenbehälter Kontrastmerkmale wie Linien, Punkte, Karos etc. auf, die ggf. auch farbig sein können. Diese Merkmale sind vorzugsweise derart angeordnet, dass diese die Probenbehälter freilassen, jedoch möglichst nah an diesen zu liegen kommen. Mit derartigen Merkmalen ist es auch möglich eventuelle Verkippungen von Probenbehältern zu erkennen und diese durch die zuvor geschilderte Autofokussierung nach zu justieren. Dies ist insbesonders dann von Vorteil wenn eine Vielzahl von nebeneinander angeordneten Probenbehältern zu einer sogenannten„Multiwell- Platte" zusammengefasst ist.
Üblicherweise ist es nicht möglich räumlich große Proben wie z. B. eine Zelle auf- grund der geringen Tiefenschärfe üblicher Optiken scharf abzubilden.
Mittels der erfindungsgemäßen autofokussierenden Vorgehensweise ist es nun möglich durch eine Höhenverstellung einer räumlichen Probe wie beispielsweise einer Zelle den Fokus in verschiedene Ebenen der Probe zu legen und aus diesen nach Abspeichern in einem Speichermedium eine zwei- und/oder auch dreidimensionale Struktur der Probe zusammenzusetzen. Hierbei werden über die jeweilige Tiefenschärfe hinweg mehrere Aufnahmen angefertigt und diese dann üblicherweise mittels„Stitching" zu einer einzigen Abbildung zusammengesetzt. Derartige sogenannte„Stitching-Verfahren" sind an sich bekannt und können beispielsweise kostenfrei aus dem Internet heruntergeladen werden. Mittels der im Verfahren angewendeten„Stitching'-Methode ist es auch möglich Proben welche sonst nur in Teilbereichen im Fokus liegen und damit nur Teile scharf erkennbar sind zu einer ganzen, scharfen Abbildung zusammenzusetzen wie dies sonst mit einer manuellvisuellen Durchführung durch einen menschlichen Betrachter nicht möglich ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die üblicherweise in einer Flüssigkeit enthaltenen Probe derart aufbereitet, dass diese eine möglichst ebene Oberfläche aufweist. Dies erfolgt beispielsweise dadurch, dass die Probe nur in einer geringen Menge Flüssigkeit zugesetzt wird oder die Flüssigkeit nach dem Auftragen wieder entfernt wird.
Hierbei hat es sich als zweckmäßig erwiesen die jeweilige Probe nach Entfernung der Flüssigkeit vor dem Austrocknen zu schützen, dies kann beispielsweise durch eine Abdeckung mittels eines Abdeckglases oder auch durch eine Erhöhung des Flüssigkeitsdampfdruckes über der Probe zu verhindern. Als Analysevorrichtung kann beispielsweise eine Analysevorrichtung dienen, wie sie in der DE 10 2008 022 835 beschrieben wird und die zusätzlich eine elektroop- tische Einheit enthält. Ein Mikroskop im Sinne der vorliegenden Erfindung kann ein bewegliches Mikroskop wie z.B. ein übliches Lichtmikroskop, ein Lasermikroskop, insbesondere auch Rastermikroskope, insbesondere Laserrastermikroskope verstanden werden.
Eine Probe ist eine biochemische oder chemische Probe. Insbesondere kann da- bei die Probe in einem kleinen Behälter wie
z. B. Reagenzglas, Näpfchen, Töpfchen, oder auf einem Probenträger, insbesondere auf einem Objektträger aufgebracht sein. Die Probe selbst kann aus Zellen, sowohl lebendige als auch tote Zellen, Viren, RNA- und DNA-Moleküle, Zellbestandteile oder Organelle wie Membranen umfassen.
Das elektronische Erfassen bzw. Abbilden der Probe mittels einer elektrooptischen Einheit erfolgt vorzugsweise indem die Probe genau unter dem Strahlengang des Mikroskops bzw. der Optik angeordnet wird. Dabei werden die generierten Abbildungen auf einen Wandler gelenkt, der Lichtsignale in elektronische Signale um- wandelt. Vorteilhafterweise handelt es sich dabei um eine CCD-Einrichtung.
Elektronische, mechanische Autofokussierung erfolgt mittels einer über Kontrastanalyse und Farbwerterkennung rechnergesteuerten Verschiebeeinrichtung. Bei der Kontrastanalyse wird durch eine Verschiebung der Optik und/oder der Probe in vertikaler Richtung (Z-Achse) der Kontrast mittels eines an sich bekannten Algorithmus optimiert. Dadurch kommt die Probe in den Fokus der Optik des Mikroskops zu liegen. Bei einer Farbwerterkennung werden beispielsweise unterschiedliche Farben wie rot, grün oder blau in den Pixeln der elektroopitschen Einheit getrennt bestimmt und ein Maximum an separaten Pixeln dieser Farben erzeugt.
Desweiteren kann beispielsweise mit einer auf oder in der Nähe der Probe aufgebrachte Justierschicht, beispielsweise Linien, Punkte oder Karos in unterschiedli- chen Farben eine Voreinstellung des Fokusses erfolgen und insbesondere ein schnelles automatisches Erfassen der richtigen Fokusseinstellung erzielt werden.
Insbesondere kann eine Justierschicht für jede einzelne Probe vorhanden sein. Das bedeutete mit anderen Worten, dass bei einer Vielzahl von Proben, wie sie beispielsweise in einer Multiwell-Platte verwendet werden, die Justierschicht an verschiedenen Punkten an oder auf der Multiwell-Platte angeordnet sein kann. Damit können vorteilhafterweise Höhenunterschiede wie sie z. B. bei Verkippungen der Probe über die ganze Multiwell-Platte schneller erfasst werden.
Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verfahren zusätzlich ein Bearbeiten der Probe. Dabei kann beispielsweise eine zu untersuchende Probe auf einem Objektträger in einem Reagenzglas mit anderen biochemischen, chemischen Verbindungen in Kontakt ge- bracht werden, insbesondere in Lösung, so dass eine biochemische oder chemische Reaktion auftreten kann. Ebenfalls umfasst das Bearbeiten der Probe eine Wartezeit, wie beispielsweise eine Inkubationszeit, oder auch eine Durchmischungszeit. Dabei wird die Probe nicht sofort mit der elektronischen Einheit untersucht, sondern erst nach der Wartezeit.
Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ein Abdecken der Probe mit einer Abdeckvorrichtung. Dabei kann beispielsweise eine Abdeckvorrichtung eine Glasplatte, eine Kunststoffplatte oder eine weitere lichtdurchlässige Platte sein. Ebenso können die Proben, beispiels- weise wenn sie auf einen Objektträger aufgebracht werden, mittels eines aufgebrachten Flüssigkeitstropfens umgeben sein. Dabei ist allerdings zu beachten, dass es nicht zu einer Beeinträchtigung der mikroskopischen Aufnahme kommt. Das kann mittels der Verwendung von beschichteten Gläsern zur Herabsetzung der Oberflächenspannung, Zugabe von Oberflächenspannung vermindernden Mitteln erzielt werden oder durch Zugabe einer geringen Menge an Flüssigkeit an sich.
Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Vorgehensweise auch ein rechnergestütztes Unterscheiden mittels in einer Daten- bank/Bibliothek vorliegenden Strukturen wie z. B eines Histogramms. Hierbei wird eine positive oder negative Erkennung dahingehend umgesetzt, dass mittels einer mathematischen Klassifikation, die auf einem Algorithmus beruht, Bildinformationen dergestalt angezeigt werden, dass die Abbildung beispielsweise positive oder negative Strukturen, insbesondere aber charakteristische Raster, Strukturen oder Muster anzeigt.
Ein weiterer Gegenstand ist eine Analysevorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Zeichnungen
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Gegenstände werden durch die Zeichnungen veranschaulicht und in der nachfolgenden Beschreibung erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Zeichnungen nur be- schreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken. Es zeigen:
FIG. 1 zeigt eine beispielhafte Ausführungsform des Verfahrens als Flussdiagramm
FIG. 2 zeigt einen schematischen Aufbau des erfindungsgemäßen Analysegeräts ohne Mikroskop
FIG. 3 zeigt einen schematischen Aufbau des erfindungsgemäßen Analysegeräts mit Mikroskop
Figur 1 zeigt eine beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der unter Block A (Strukturbestimmung) dargestellte Schritt setzt sich zusammen aus der Probenbereitstellung bestehend aus Lesen der Probenkennung mittels im Analysevorrichtung integriertem Barcodeleser sowie beladen des Analysegerätes mit den für den jeweiligen Test notwendigen Reagenzien mit anschließendem Start der vollautomatischen Probenprozessierung des Immunfluoreszenztests und dem automatischen Mikroskopieren und/oder Erfassen der Proben. Hierbei wird die Autofokussierung mit Hilfe einer Kontrastanalyse und einer Farbwerterkennung vollzogen und anschließend mit einer CCD-Kamera elektronische Bilder erzeugt. In einem unter Block B (Bildverarbeitung) dargestellten Schritt werden die zuvor erzeugten Bilder mittels Datenverarbeitungssoftware in einem Bild- und Datenarchiv gespeichert und können so zur anschließenden automatischen Klassifizierung (pos/neg) mittels Histogrammen verwendet werden. Der unter Block C (Datenbank) dargestellte Schritt dient dazu die Diagnose abzusichern und die Klassifizierung zu bestätigen. Hierzu können die in Block D dargestellten Hilfsmittel zu Rate gezogen werden. Der Abschluss des Verfahrens wird durch Erzeu- gung eines Befundvorschlagsvollzogen.
Die Figur 2 zeigt eine perspektivische Gesamtansicht eines erfindungsgemäßen Analysegeräts 2 zum Untersuchen von biologischen und chemischen Proben 5, die als Analysevorrichtung 2 eingesetzt wird. Das Analysevorrichtung 2 hat ein helmförmiges Gerätegehäuse 2 mit einem aufgeklappten visierähnlichen Deckel 3, der um zwei Drehgelenke 4 auf- und zugeklappt werden kann. Auf der Rückseite (nicht gezeigt) befinden sich die elektrischen Steckeranschlussleisten, an die diverse Stecker für das elektrische 24 V Netz, für die elektrischen Steuersignale zu einer Datenverarbeitungsanlage (Personal Computer) und für Messsignale (insbe- sondere eine USB-Schnittstelle) angeschlossen werden.
Das Analysevorrichtung 2 weist eine Grundplatte 12 auf, die eine in Gebrauch horizontal angeordnete Arbeitsplatte 13 - oft auch Karussell genannt - trägt, die um ihre vertikale Achse von einem Motor oder Antrieb in eine vorgegebene Win- kelstellung φ gedreht werden kann. Auf dieser inneren Arbeitsplatte 13 sind zwei rechteckige Aussparungen zur Aufnahme zweier Probenbehälter 13a vorgesehen, wobei nur ein Probenbehälter 13a aufgesetzt ist, der in einer Matrixanordnung eine Vielzahl von Töpfchen bzw. Wells 13b enthält: Diese innere Arbeitsplatte 13 wird in radialer Richtung durch eine ringförmige Arbeitsplatte 14 erweitert, auf der in Umfangsrichtung durchsichtige Objektträgern 15 angeordnet sind, die biologische oder chemische Proben jeweils tragen. Diese ringförmige Arbeitsplatte 14 ist mittels Stützen 16 auf der Grundplatte 12 befestigt. Diese ringförmige Arbeitsplatte 14 kann bei weiteren nicht dargestellten Ausführungsformen jedoch über einen separaten Drehantrieb gedreht werden bzw. mit der inneren Arbeitsplatte gemeinsam gedreht werden. Radial außerhalb dieser ringförmigen Arbeitsplatte 14 ist ein etwa halbkreisförmiger Reagenzglashalter 20 vorgesehen, der Löcher 21 für kleinere Reagenzgläser aufweist. Weiterhin ist im gleichen Umfangbereich auf der linken Seite der Fig. 1 ein etwa viertelkreisförmiger Reagenzglashalter 22 mit größeren Löchern 23 für größere Reagenzgläser 24 angeordnet.
Oberhalb der inneren Arbeitsplatte 13 ist ein Probenmanipulator 3 angeordnet, der einen parallel zur inneren Arbeitsplatte 13 in einer horizontalen Richtung sich ers- treckenden Tragarm 26 und einem entlang dieses Tragarmes 26 mittels eines horizontalen Spindelantriebes 27 bewegbaren Schlitten(nicht sichtbar) trägt. Dieser Schlitten trägt einen in vertikaler Z-Richtung bewegbaren Nadelsystem mit der Nadeleinheit 32, der von einem ersten vertikalen Antrieb 33 in vorgegebene vertikale Positionen gebracht werden kann. Hierdurch können die freien Spitzen der Nadeleinheit 32 in einer oberen Position oberhalb und in einer unteren Position innerhalb eines Töpfchens bzw. Wells 13b eines Probenbehälters 13a positioniert werden.
In der Figur 3 ist die Anordnung aus Figur 2 zusammen mit dem Mikroskop 4 ver- deutlicht.

Claims

Patentansprüche
1. Analysevorrichtung (2) zur automatisierten optischen Analyse von chemischen und/oder biologischen Proben, die einen Probenbehälter zum Einbringen einer zu untersuchenden Probe (5) sowie eine Detektionseinheit, die
- eine elektrooptische Einheit zum Erzeugen einer elektronischen Abbildung von in der Probe vorliegenden zwei- und/oder dreidimensionalen Strukturen,
- ein Speichermedium zum Speichern der Abbildung,
- eine rechnergesteuerte Verschiebeeinrichtung zur Einstellung einer optimierten Bildschärfe der Abbildung,
- eine elektronische Datenbank mit darin gespeicherten zwei- und/oder dreidimensionalen Strukturen,
- eine Recheneinheit zum Abgleich und Zuordnen der von der elektroopti- schen Einheit erzeugten Abbildungen von zwei- und/oder dreidimensionalen Strukturen mit den in der Datenbank gespeicherten bekannten Strukturen, sowie
- eine Ausgabeeinheit für die durch den Abgleich zugeordneten Strukturen aufweist,
dadurch gekennzeichnet, dass
die rechnergesteuerte Verschiebeeinrichtung den Abstand von Probe (5) und optischer Einheit mittels einer Kontrastanalyse und einer Farbwerterkennung steuert.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die optische Einheit ein mit einer elektronischen Kammereinheit kommunizierendes Mikroskop ist.
3. Vorrichtung nach einer der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass der Probenbehälter mindestens eine Markierung zur Durchführung von Kontrastanalyse und Farbwerterkennung enthält.
4. Vorrichtung (2) nach einer der vorhergehenden Ansprüche, umfassend - ein Gerätegehäuse (11) mit einer Grundplatte (12),
- ein Mikroskop (4),
- eine auf der Grundplatte (12) in Gebrauchslage horizontal angeordneten Arbeitsplatte (13) zur Aufnahme der Proben (5)
- ein oberhalb der Arbeitsplatte (13) angeordneten Probenmanipulator (3), der einen oberhalb zur Arbeitsplatte (13) in einer horizontaler Richtung sich erstreckenden Tragarm (26) und einem entlang dieses Tragarmes (26) mittels eines horizontalen Antriebes (27) bewegbaren Schlitten trägt, und
- ein am Schlitten (30) in vertikaler Richtung (Z) bewegbares Hohlnadelsystem (31), welches drei Hohlnadeln (45, 46, 47) trägt, und einen horizontalen Abstand der drei Hohlnadeln (45, 46, 47) aufweist, der so klein gewählt ist, dass alle drei Nadeln zueinander mit ihrer jeweiligen Hohlnadelspitze (34) innerhalb desselben Töpfchens bzw. Wells (13b) positioniert werden können.
5. Verfahren zur automatisierten optischen Analyse von zwei- und/oder dreidimensionalen Strukturen von chemischen und/oder biologischen Proben in einem Probenbehälter,
dadurch gekennzeichnet, dass
- eine elektrooptische Einheit eine elektronische Abbildung von in der Probe vorliegenden zwei- und/oder dreidimensionalen Strukturen erzeugt,
- ein Speichermedium die Abbildung abspeichert,
- eine rechnergesteuerte Verschiebeeinrichtung eine optimierte Bildschärfe der Abbildung durch ein Verändern des Abstands von Probe und optischer Einheit einstellt, wobei die Verschiebeeinrichtung durch eine Kontrastana- lyse und durch eine Farbwerterkennung gesteuert wird,
- eine Recheneinheit die von der elektrooptischen Einheit erzeugten Abbildungen von zwei- und/oder dreidimensionalen Strukturen mit den in einer Datenbank gespeicherten bekannten Strukturen abgleicht,
- die von der optischen Einheit erfassten Strukturen mittels eines Algorith- mus zu charakteristischen Rastern, Strukturen oder Mustern zugeordnet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbwerterkennung dadurch erfolgt, dass die Anzahl unterschiedlicher Farbpixel (10) in der elektronischen Einheit ein Maximum erreicht.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-6, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Abdecken der Probe (5) mit einer Abdeckeinrichtung (9) umfasst.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenbehälter und/oder eine Platte mit mehreren solchen Probebehältern verwendet wird, welcher/welche eine Codierung aufweist und dass Strukturen mittels Codierung einer Probe zugeordnet werden.
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