EP2619593A2 - Verfahren zum nachweis von fettlöslichen vitaminen - Google Patents

Verfahren zum nachweis von fettlöslichen vitaminen

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Publication number
EP2619593A2
EP2619593A2 EP11763894.0A EP11763894A EP2619593A2 EP 2619593 A2 EP2619593 A2 EP 2619593A2 EP 11763894 A EP11763894 A EP 11763894A EP 2619593 A2 EP2619593 A2 EP 2619593A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
vitamin
reagent
vessel
sample
biological materials
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP11763894.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Florian J. Schweigert
Ralf Mothes
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BAPaT GmbH
Original Assignee
BAPaT GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BAPaT GmbH filed Critical BAPaT GmbH
Publication of EP2619593A2 publication Critical patent/EP2619593A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/203332—Hydroxyl containing

Definitions

  • the colorimetric detection of fat-soluble vitamins, in particular of vitamin A and of vitamin D, is based on the reaction of these compounds with a color reagent, which in the presence leads to a concentration-dependent color reaction.
  • the special colorimetric detection of vitamin A (in the form of retinol or retinyl esters)
  • it is based on the reaction with antimony (III) chloride (SbC) dissolved in chloroform.
  • Alternative color reagents are, for example, trifluoroacetic acid, trichloroacetic acid or other reagents known or to be used in the future which are based on comparable approaches.
  • Suitable solvents in addition to chloroform for example dichloromethane or hexane in question.
  • other suitable solvents or solvent mixtures known to the person skilled in the art are also suitable for the application.
  • the reagents so far regularly produced fresh, dosed via specific equipment and added to the sample. Because of the high speed and the pronounced temperature dependence of the color reaction, the measuring instruments have to be elaborately prepared and then the results evaluated. Further, because of possible color reaction interfering compounds, the samples must be prepared in advance by various methods. For greasy samples, this is usually a saponification step.
  • the aim of the method is therefore to improve the currently be carried out only under laboratory conditions quantitatively detection by means of a color reaction so that a quantitative laboratory-independent rapid test for fat-soluble vitamins, especially vitamins A and D, is possible. Such a test is especially important for the difficult analytical conditions in developing and emerging countries.
  • the present invention solves the underlying technical problem by the aforementioned method for the analysis of fat-soluble vitamins, in particular of vitamin A, vitamin D and vitamin E, in biological materials. This concerns the stability of the reagent, the control of the course of the color reaction and the presence of other interfering compounds, which in particular also lead to color reactions. - -
  • the stability of the reagent could be improved from the usually few weeks to up to 2 years.
  • the application form of the sample to be examined now allows a second-precise initiation of the time-sensitive color reaction and special evaluation methods allow the measurement of the vitamins even in samples that are rich in compounds that interfere with the color reaction. Another approach makes it possible to standardize the temperature deviations.
  • the colorimetric method for the determination of fat-soluble vitamins is feasible even under less controlled conditions than in a laboratory environment.
  • a test kit consisting of a reagent vessel in which both the storage of reagent mixtures and the application of the sample takes place.
  • the reagent vessel preferably also serves as a measuring chamber for the color reaction.
  • the measurement is carried out in a preferably portable photometer, which is tuned to the optical conditions of the measuring vessel and allows an evaluation of the results. Disturbances caused by other ingredients of the sample and temperature differences can be taken into account or corrected.
  • this invention also relates to standard measurement methods and the application of the evaluation method to values which were determined on a standard photometer. - -
  • reagents used in the invention are usually very sensitive to water (hygroscopic), they must be subjected to appropriate cleaning and drying processes known to those skilled in the art. Subsequently, storage is only possible over a limited period of a few weeks.
  • the purified and dried solvents for example, chloroform, dichloromethane, hexane, etc.
  • chemicals antimony (III) chloride, trifluoroacetic acid, trichloroacetic acid, etc.
  • the closure is preferably provided with a cap containing a septum through which, for example, the sample can subsequently be injected.
  • the closure can be done by, for example, crimping, screwing or gluing. But other methods for gas-tight closure are provided according to the invention.
  • the septum can be made of a variety of materials that can perform at least two functions, namely, stability to the reagents and tightness to evaporation of the solvent and ingress of air and water, for example, water vapor.
  • Another criterion is the possibility of injecting the sample, for example with a syringe via a cannula.
  • the vessel is at best made of glass, but other known and unknown materials with comparable characteristics in terms of stability to organic solvents and corrosive substances are conceivable.
  • the vessel preferably serves not only for the stable storage of the reagents but also as a reaction vessel and as a measuring chamber which can be brought into a measuring device.
  • the color reaction between reagents and analytes is time and temperature dependent. Especially with vitamin A, the reaction usually takes just a few seconds. Usually it reaches its maximum after 5 seconds and is completed after 60 seconds. Therefore, the timing of the start of the reaction must be well controlled. Usually, this is achieved by the addition of the reagent to the sample and rapid mixing.
  • test samples to the reagent is also possible with a reversed step without initially causing a reaction.
  • the reagent is added to the sample, but the sample is added to the reagent. This is particularly effective when reagent and sample differ in their density and / or viscosity.
  • An oil or fat sample of plant or animal origin for example, due to the significant differences in their density - - And viscosity in relation to all solvents used are easily layered over the reagent.
  • the reagent system used can optionally be optimized.
  • a hexane extract of the fat-soluble vitamins can be easily layered over a reagent containing chloroform or dichloromethane.
  • the coating is carried out according to the invention best in a reaction vessel, which can also be used for mixing and measurement.
  • the two phases are then mixed by a brief shaking and the color reaction is initiated.
  • the phases preferably differ in terms of their viscosity at least by a factor of 2, better by at least a factor of 5 to 50 and optimally by more than a factor of 100.
  • the oil differs with a viscosity of about 10 2 (rj in mPa * s) Of the solvents commonly used, hexane (0.320) and chloroform (0.560) more than a hundredfold.
  • the phases also differ in their density by more than 5%, better still by more than 10 to 50% and even better by at least 100%.
  • oil 0.8 - 0.9 g / cm 3
  • n-hexane 0.66 g / cm 3
  • the color reaction in fat-soluble vitamins shows a marked temperature dependence, especially with vitamin A.
  • this influencing variable can be taken into account by correcting a simultaneous measurement of the temperature in or in the vicinity of the measuring cell in the measuring device.
  • the measurement accuracy can be improved, especially in the lower range.
  • the color reagents are preferably cooled down and the sample is usually cooled down at room temperature or preferably also cooled down, for example by injection through a septum.
  • the temperature is between + 40 ° C and -80 ° C.
  • the temperature range is between + 30 ° C and -18 ° C, more preferably the range between 20 ° C and 4 ° C.
  • condensate can form on the outside of the tube after cooling of the reaction vessel, in particular of tubes, and measurement at ambient temperature.
  • the tubes can be used before or after cooling down or even during the production process of a so-called antifogging agent.
  • the vessel can simply be wiped off.
  • wetting agents can prevent microscopic droplets from forming in the condensation of water vapor, which scatter the light and render the clear parts of the surface almost or completely opaque.
  • An alternative method is, for example, the coating with embedded in a polymer film silicon nanoparticles.
  • the application is carried out by a method known to those skilled in the art.
  • biological materials contain substances and ingredients that can interfere with the color detection of fat-soluble vitamins. These are usually substances with several double bonds. These can either influence the kinetics of the reaction or interfere with the measurement by means of their own color reaction. If the color reaction takes place in a different wavelength range than the vitamine-typical reaction, then the disturbance can be taken into account by recording different wavelengths with a wavelength difference measurement. - -
  • the measurement takes place in a wavelength range between 250 and 900 nm, better at 370-800 nm and most preferably at 450-700 nm.
  • ingredients of palm oil react with the color reagent for vitamin A in a comparable wavelength range as vitamin A itself. Unlike vitamin A, this color reaction is not short-term and rapidly fading, but stable over the period of the color reaction of vitamin A. Therefore, according to the invention, for example, the calculation is carried out either via the speed of the drop of the reaction or by the difference which is measured at two points in time.
  • the time course between 1 and 2000 seconds is measured. Better between 3 and 600 seconds and even better between 3 and 300 seconds. Best between 3 and 60 seconds.
  • materials obtained from “plants, animals, humans and / or microorganisms” are to be understood as “biological materials”, in particular the body's own materials, preferably samples of the body's own materials.
  • microorganisms are to be understood as meaning, in addition to, for example, eukaryotes, such as algae, prokaryotes and / or fungi, such as yeasts, also viruses.
  • biological materials include organisms derived from culture and culture supernatants.
  • the method according to the present invention is intended for the analysis of fat-soluble vitamins, preferably vitamin A, vitamin D and vitamin E biological materials.
  • the analysis of the biological materials is carried out directly, preferably with sufficient liquefaction and at a water content of less than 5%, in particular between 2 and 4%, or preferably between 0.01 and 2%.
  • a pretreatment in the form of an extraction of the ingredients to be determined is usually necessary. Any method known to those skilled in the art can be used here.
  • foods of animal and / or plant origin in particular homogenates of foods, are used as biological materials.
  • oils and fats of animal or vegetable origin come into question as foods.
  • milk and milk products such as butter, eggs, preferably whole egg yolk, fruits and vegetables can be examined with the method according to the invention as food.
  • foods which contain the fat-soluble vitamins are preferably suitable.
  • tissues, organs and / or body fluids are used as biological materials.
  • those biological materials are used which are used in the medical field for diagnostics and / or therapy tracking.
  • blood, plasma, serum or milk are used as body fluids and / or secretions.
  • the process is carried out at a pressure between 0.5 bar to 5 bar, in particular between 0.8 bar to 2 bar.
  • the biological materials are transferred to a solvent-resistant environment prior to initiation of the color reaction with the reagents.
  • a vessel made of glass is used as the solvent-resistant environment.
  • vessels may be used which contain the contents, i. usually the dissolved in solvent color reagent, airtight seal.
  • the airtight seal prevents the ingress of moisture and thus improves the stability of the reagent or reagents.
  • vessels are used which are such that they are suitable for spectroscopic investigations.
  • vessels are used in which the sample can be transferred through a septum into the vessel by means of an applicator, preferably by means of a syringe with a cannula.
  • the present invention also solves the technical problem underlying it by providing a spectrophotometer, in particular a hand-held photometer, for measuring ingredients of biological materials in a cylindrical vessel, the beam path of the photometer being adjusted so that the measurement is an upper half of the vessel detected.
  • a cylindrical vessel is understood to be a vessel which has a constant profile over substantially its entire length.
  • a constant profile for example, a rectangular cross-section, in particular a square cross-section, as it finds use in spectroscopic cuvettes in question.
  • the analysis of the ingredients is carried out without time delay in the spectrophotometer.
  • the present invention greatly improves the precision of quantitative colorimetric detection of fat-soluble vitamins and greatly simplifies their handling. Furthermore, the endangerment of the investigator by potentially harmful chemicals is greatly reduced. In particular, the analysis of oils and fats is simplified by this. Furthermore, elaborate preparation methods, such as the saponification of the samples, are not required.
  • the invention can be carried out in one step. It is therefore suitable for the miniaturized methods, in particular high-throughput methods, which are in the form of chip laboratories. - - are known and are preferably used in the so-called "point-of-care" - systems, particularly suitable.
  • Fig. 1 Stability of the reagent under stress test conditions (storage at 57 ° C for 3 weeks);
  • Fig. 1 a Tabellarischer comparison of Fig. 1 shown as the mean and standard deviation.
  • Fig. 2 Tabular comparison of measurement results of an analysis according to the invention in test tubes that were freshly filled, and those that were stored under the conditions of the invention for 50 weeks at room temperature (18 - 29 ° C).
  • FIG. 1 shows a diagram in which the storage stability of the reagent filled and stored under conditions according to the invention was tested under so-called stress conditions at 57 ° C. This period corresponds to storage at room temperature for at least 2 years.
  • the stability was tested with three palm oil samples, which differ in their vitamin A content.
  • the measurement was carried out according to the invention.
  • Fig. 1a shows the values of Fig. 1 as mean and standard deviation. The results show the comparability in both values.
  • Fig. 2 is a graph showing the measurement results of vitamin A in palm oil from 14 samples of different concentration - - are.
  • the reagents were filled and stored as described in the invention. Storage took place at room temperature (18-29 ° C) for 2 or 50 weeks.
  • Figure 2 captures the results of the mapping as mean and standard deviation. The results show the comparability in both values.
  • the palm oil samples were first determined according to FIG. 3 without correction in the method according to the invention (described as 0). Subsequently, the average average of the basal absorption was subtracted from the measured values (0 values) after 180 seconds. In a further step according to the invention, a calculation of the values based on the kinetics (time course) over 30 seconds was carried out. The results (shown as calculated) show that this method gives the best possible match with the values determined by HPLC as the gold standard.
  • the liquid or liquefied sample is applied as shown in FIG. 4 according to the invention via the septum located in the cap. In this case, careful overlaying of the reagent with the sample takes place. This forms two phases. The initiation of the reaction is triggered only by mixing within the reaction vessel.
  • vitamin D-containing oil samples The analysis of vitamin D-containing oil samples was carried out according to the invention. The measurement was carried out in the spectrophotometer. The vitamin D-enriched oil sample was diluted at five equidistant intervals and then measured according to the invention. This is shown in FIG. 7.
  • the oil was introduced by means of an applicator (syringe with needle) in a defined volume of 500 ⁇ in the reagent vessel.
  • the cannula was used to puncture the occlusion septum of the vessel and the oil was slowly layered onto the reagent already present in the reagent vessel. There were no visible mixtures and two clearly defined phases emerged.
  • the oil sample as upper phase, the reagent below.
  • the phase separation prevented a premature and uncontrolled color reaction.
  • the color reaction was then started by brief vigorous shaking of the reagent vessel. Depending on the concentration of vitamin A in the sample, the color was more intense. The color intensities are measured directly in the spectrophotometer.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von fettlöslichen Vitaminen biologischer Materialien Es wird vorgeschlagen, Reagenzienlagerung, Probenapplikation und Durchführung der Messung in einem Reaktionsgefäß durchzuführen und störende Inhaltsstoffe bei der photometrischen Auswertung zu korrigieren.

Description

Beschreibung
Verfahren zum Nachweis von fettlöslichen Vitaminen
Anwendungsgebiet und Stand der Technik
Kolorimetrische Verfahren finden in der aktuellen Vitaminanalytik wenig Anwendung, da sie aus verschiedenen Gründen schwierig umzusetzen sind. So ist das Reagenz relativ instabil und die Probe muss mit einer hohen zeitlichen Genauigkeit gemischt werden, da die Reaktion nur sehr kurz zu beobachten ist. Weiter muss die Arbeitstemperatur genau eingehalten werden, da die Farbreaktion sehr temperaturabhängig ist. Ferner finden sich in verschiedenen biologischen Materialien, die Grundlage der Analytik sind, Inhaltsstoffe, die die Farbreaktion in unerwünschter Weise beeinflussen können.
Der kolorimetrische Nachweis von fettlöslichen Vitaminen, insbesonde- ren von Vitamin A und von Vitamin D, beruht auf der Reaktion dieser Verbindungen mit einem Farbreagenz, das bei Anwesenheit zu einer konzentrationsabhängigen Farbreaktion führt. Der spezielle kolorimetrische Nachweis von Vitamin A (in Form von Retinol oder Retinyl Estern) - - beruht beispielsweise auf der Reaktion mit Antimon(lll)chlorid (SbC ), gelöst in Chloroform. Alternative Farbreagenzien sind beispielsweise Trifluoressigsäure, Trichloressigsäure oder andere dem Fachmann bekannte oder zukünftig zum Einsatz kommende Reagenzien, die auf vergleichbaren Ansätzen beruhen. Als Lösungsmittel kommen neben Chloroform beispielsweise Dichlormethan oder Hexan in Frage. Aber auch andere dem Fachmann bekannte geeignete Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische kommen für die Anwendung in Frage.
Für diese Analytik müssen die Reagenzien bisher regelmäßig frisch hergestellt, über spezifische Geräte dosiert und der Probe zugegeben werden. Wegen der hohen Geschwindigkeit und der ausgeprägten Temperaturabhängigkeit der Farbreaktion müssen die Messgeräte aufwendig vorbereitet und anschließend die Ergebnisse ausgewertet werden. Ferner müssen die Proben wegen möglicher die Farbreaktion störender Verbindungen durch verschiedene Verfahren vorher vorbereitet werden. Bei fetthaltigen Proben ist dies üblicherweise ein Verseifungsschritt.
Diese Besonderheiten machen den Einsatz solcher Verfahren als quantitativen Nachweis für fettlösliche Vitamine besonders unter laborfernen Bedingungen sehr schwer. Aus diesem Grund werden heute Analysen in der Regel nur noch mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) durchgeführt. Dies ist zwar sehr genau, gleichzeitig aber sehr geräte- und arbeitsintensiv. Unter einfachen Bedingungen, wie beispielsweise auch in Entwicklungsländern, ist der Nachweis zwar notwendig, kann aber nicht durchgeführt werden.
Es besteht somit ein großer Bedarf an einem Verfahren zur Analyse von fettlöslichen Vitaminen in biologischen Materialien, insbesondere in Ölen oder Fetten, welches auch mit unvorbereiteten oder nicht gereinigten Proben in einem einfachen analytischen Umfeld durchgeführt werden kann. - -
Aufgabe und Lösung
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur ko- lorimetrischen Analyse von fettlöslichen Vitaminen in biologischen Materialien bereitzustellen, welches die Stabilität der Reagenzien und die Kontrolle der zeit- und temperatursensitiven Farbreaktion verbessert. Darüber hinaus soll möglichst eine quantitative Analytik auch unter Anwesenheit störender Inhaltstoffe ermöglicht werden. Schließlich ist es Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Analyse durch das Verfahren gewonnener Inhaltsstoffe bereitzustellen.
Ziel des Verfahrens ist es also, den zurzeit nur unter Laborbedingungen quantitativ durchzuführenden Nachweis mittels einer Farbreaktion so zu verbessern, dass ein quantitativer laborunabhängiger Schnelltest für fettlösliche Vitamine, insbesondere der Vitamine A und D, möglich ist. Ein derartiger Test ist vor allem auch für die schwierigen analytischen Bedingungen in Entwicklungs- und Schwellenländern von Bedeutung.
Die genannten Aufgaben werden gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie durch den Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 15. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens und dieses Kits sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 14 bzw. 16 und 17 dargestellt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem durch das eingangs genannte Verfahren zur Analyse von fettlöslichen Vitaminen, insbesondere von Vitamin A, Vitamin D und Vitamin E, in biologischen Materialien. Dies betrifft die Stabilität des Reagenz, die Kontrolle des Ablaufes der Farbreaktion sowie das Vorhandensein von anderen störenden Verbindungen, die insbesondere ebenfalls zu Farbreaktionen führen. - -
In dem beschriebenen Verfahren konnte die Stabilität des Reagenz von den üblicherweise wenigen Wochen auf bis zu 2 Jahre verbessert werden. Die Applikationsform der zu untersuchenden Probe erlaubt nun eine sekundengenaue Einleitung der zeitsensitiven Farbreaktion und spezielle Auswerteverfahren erlauben die Messung der Vitamine selbst in Proben, die reich an Verbindungen sind, die die Farbreaktion stören. Ein weiterer Ansatz erlaubt es, die Temperaturabweichungen zu standardisieren. Damit ist das kolorimetrische Verfahren zur Bestimmung von fettlöslichen Vitaminen auch unter weniger kontrollierten Bedingungen als in einer Laborumgebung durchführbar.
Gelöst wurden die Probleme auch durch ein Testkit, bestehend aus einem Reagenzgefäß, in dem sowohl die Lagerung der Reagenzgemische als auch die Applikation der Probe erfolgt. Gleichzeitig dient das Reagenzgefäß vorzugsweise auch als Messkammer für die Farbreaktion. Die Messung erfolgt in einem vorzugsweise portablen Photometer, das auf die optischen Bedingungen des Messgefäßes abgestimmt ist und eine Auswertung der Ergebnisse ermöglicht. Dabei können Störungen durch andere Inhaltsstoffe der Probe und die Temperaturunterschiede berücksichtigt oder korrigiert werden.
Eine Anwendung von allen Schritten oder Teilen des beschriebenen Verfahrens in anderen Konstellationen ist Bestandteil der Erfindung. Dies betrifft die Verwendung anderer Messeinrichtungen wie beispielsweise Standard photometer oder die Verwendung von abgewandelten Messgefäßen, die in der grundlegenden Auslegung dem erfindungsgemäßen Anspruch entsprechen.
Ferner betrifft dies erfindungsgemäß auch Standardmessverfahren und die Anwendung des Auswertungsverfahrens an Werten, die an einem Standardphotometer ermittelt wurden. - -
Zentrale Aspekte der Erfindung sollen nunmehr im folgenden unter den entsprechenden Überschriften abgehandelt werden. Es versteht sich, dass die in den einzelnen Abschnitten beschriebenen Merkmale erfindungsgemäß auch in Kombination miteinander verwirklicht sein können.
Verbesserung der Reagenzienstabilität
Da die bei der Erfindung verwendeten Reagenzien in der Regel sehr empfindlich gegenüber Wasser (hygroskopisch) sind, müssen sie entsprechenden, dem Fachmann bekannten Reinigungs- und Trocknungsverfahren unterworfen werden. Anschließend ist eine Lagerung nur über einen beschränkten Zeitraum von wenigen Wochen möglich.
Bei der Erfindung werden die gereinigten und getrockneten Lösungsmittel (beispielsweise Chloroform, Dichlormethan, Hexan u.a.) und Chemikalien (Antimon(lll)Chlorid, Trifluoressigsäure, Trichloressigsäure u.a.) entsprechend dem Fachmann bekannten Zusammensetzungen und Konzentrationen gemischt und in gasdicht bzw. luftdicht verschließbare Glasgefäße abgefüllt. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Anspruch erfolgt der Verschluss vorzugsweise mit einer Kappe, die ein Septum enthält, durch das beispielsweise die Probe anschließend eingespritzt werden kann. Der Verschluss kann durch beispielsweise Vercrimpen, Verschrauben oder Verkleben erfolgen. Aber auch andere Verfahren zum gasdichten Verschluss sind erfindungsgemäß vorgesehen.
Das Septum kann aus verschiedenen Materialien bestehen, die mindestens zwei Aufgaben erfüllen können, nämlich Stabilität gegenüber den Reagenzien und Dichtigkeit gegenüber Evaporation des Lösungsmittels und Eindringen von Luft und Wasser beispielsweise von Wasserdampf. Ein weiteres Kriterium ist die Möglichkeit der Injektion der Probe beispielsweise mit einer Spritze über eine Kanüle. - -
Wegen seiner hohen Stabilität und der großen Gasdichtigkeit besteht das Gefäß im besten Fall aus Glas, aber auch andere bekannte und unbekannte Materialien mit vergleichbaren Charakteristika hinsichtlich Stabilität gegenüber organischen Lösungsmitteln und ätzenden Substanzen sind vorstellbar.
Im erfindungsgemäßen Fall dient das Gefäß vorzugsweise nicht nur zur stabilen Lagerung der Reagenzien sondern auch als Reaktionsgefäß und als Messkammer, die in ein Messgerät verbracht werden kann.
Kontrolle der Farbreaktion
Die Farbreaktion zwischen Reagenzien und Analyten ist zeit- und temperaturabhängig. Vor allem bei Vitamin A läuft die Reaktion üblicherweise in wenigen Sekunden ab. Üblicherweise erreicht sie nach 5 Sekunden ihr Maximum und ist nach 60 Sekunden abgeschlossen. Deshalb muß der Zeitpunkt des Reaktionsbeginns gut kontrolliert werden. Üblicherweise wird dies durch die Zugabe des Reagenz zur Probe und eine rasche Durchmischung erreicht.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass auch mit einem umgekehrten Schritt die Zugabe von zu untersuchenden Proben zum Reagenz möglich ist, ohne dass es zunächst zu einer Reaktion kommt. In diesem Fall wird nicht das Reagenz zur Probe gegeben, sondern die Probe zum Reagenz. Besonders effektiv ist dies, wenn sich Reagenz und Probe in ihrer Dichte und/oder Viskosität unterscheiden.
Eine Öl- oder Fettprobe pflanzlichen oder tierischen Ursprungs kann beispielsweise auf Grund der deutlichen Unterschiede in ihrer Dichte - - und Viskosität im Verhältnis zu allen zum Einsatz kommenden Lösungsmitteln problemlos über das Reagenz geschichtet werden.
Bei anderen Probenzusammensetzungen kann das verwendete Reagenzsystem ggf. optimiert werden. So kann ein Hexanextrakt der fettlöslichen Vitamine problemlos über ein Chloroform oder Dichlormethan enthaltendes Reagenz geschichtet werden.
Die Überschichtung erfolgt erfindungsgemäß am besten in einem Reaktionsgefäß, das auch zur Mischung und Messung verwendet werden kann.
Durch die Schichtung befinden sich Probe und Reagenz in unmittelbarem Kontakt, ohne dass es zur Initiierung der Farbreaktion kommt. Die üblicherweise an der Interphase stattfindende Grenzfächenreaktion kann dabei in der Regel vernachlässigt werden.
Erfindungsgemäß werden dann durch ein kurzes Schütteln die beiden Phasen gemischt und die Farbreaktion wird eingeleitet.
Erfindungsgemäß unterscheiden sich die Phasen hinsichtlich ihrer Viskosität vorzugsweise mindestens um den Faktor 2, besser mindestens um den Faktor 5 bis 50 und optimal um mehr als den Faktor 100. So unterscheidet sich Öl mit einer Viskosität von etwa 102 (rj in mPa*s) von den üblicherweise verwendeten Lösungsmitteln Hexan (0,320) und Chloroform (0,560) um mehr als das Hundertfache.
Erfindungsgemäß unterscheiden sich die Phasen ferner hinsichtlich ihrer Dichte um mehr als 5 %, besser um mehr als 10 bis 50 % und noch besser um mindestens 100 %. Bei der Verwendung von Öl (0,8 - 0,9 g/cm3) und n-Hexan (0,66 g/cm3) als Probe bzw. Träger der Probe ist bei der - -
Verwendung von Chloroform (1 ,48 g/cm3) oder Dichlormethan (1 ,33 g/cm3) eine klare Phasentrennung erreichbar.
Kontrolle der Temperatur
Die Farbreaktion bei den fettlöslichen Vitaminen zeigt besonders bei Vitamin A eine deutliche Temperaturabhängigkeit.
Erfindungsgemäß kann diese Einflußgröße durch eine gleichzeitige Messung der Temperatur in oder in der Nähe der Messzelle im Messgerät korrigierend berücksichtigt werden.
Ferner kann durch eine Kontrolle der Temperatur die Messgenauigkeit vor allem im unteren Bereich verbessert werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Farbreagenzien vorzugsweise heruntergekühlt und die Probe wird üblicherweise bei Raumtemperatur oder vorzugsweise auch heruntergekühlt, beispielsweise durch Injektion durch ein Septum zugegeben.
Erfindungsgemäß erfolgt die Temperierung zwischen +40°C und -80°C. Bevorzugt ist der Temperaturbereich zwischen +30°C und -18°C, noch bevorzugter der Bereich zwischen 20°C und 4°C.
In Abhängigkeit von der Luftfeuchtigkeit kann sich nach dem Abkühlen des Reaktionsgefäßes, insbesondere von Röhrchen, und Messung bei Umgebungstemperatur Kondenswasser auf der Außenseite des Röhrchens bilden. Zur Vermeidung der Bildung von Kondenswasser auf der Röhrchenaußenseite können die Röhrchen vor oder nach dem Herunterkühlen oder bereits im Herstellungsprozess einer sog. Antifog- - -
Beschichtung oder -Behandlung unterzogen werden. Im einfachsten Falle kann das Gefäß einfach abgewischt werden.
Unter einer Antifog-Beschichtung oder einem Antifog- Coating ist im erfinderischen Sinne eine spezielle Oberflächenbehandlung auf glasklaren Oberflächen, die ein Beschlagen (Kondensieren) unter Einwirkung von Wasserdampf verhindert, zu verstehen.
So kann durch spezielle, dem Fachmann bekannte Sprays oder Flüssigkeiten, so genannte Netzmittel, verhindert werden, dass sich bei der Kondensation von Wasserdampf mikroskopische Tröpfchen bilden, die das Licht streuen und die klaren Teile der Oberfläche fast oder vollständig undurchsichtig werden lassen.
Eine alternative Methode ist beispielsweise die Beschichtung mit in einem Polymerfilm eingebetteten Silizium-Nanopartikeln. Die Aufbringung erfolgt mit einem dem Fachmann bekannten Verfahren.
Berücksichtigung der Störsubstanzen
Vor allem biologische Materialien enthalten Substanzen und Inhaltsstoffe, die sich störend auf den Farbnachweis von fettlöslichen Vitaminen auswirken können. Üblicherweise sind dies Substanzen mit mehreren Doppelbindungen. Diese können entweder die Kinetik der Reaktion beeinflussen oder durch eine eigene Farbreaktion die Messung stören. Findet die Farbreaktion in einem anderen Wellenlängenbereich als die vitamintypische Reaktion statt, dann kann durch die Aufzeichnung verschiedener Wellenlängen mit einer Wellenlängendifferenzmessung die Störung messtechnisch berücksichtigt werden. - -
Erfindungsgemäß erfolgt die Messung in einem Wellenlängenbereich zwischen 250 und 900 nm, besser bei 370 - 800 nm und am besten bei 450 - 700 nm.
Liegt die Farbreaktion der Störsubstanzen im Wellenlängenbereich der Farbreaktion des Vitamins, vor allem im Bereich von 620 nm bei der Farbreaktion von Vitamin A, dann ist die oben genannte Korrektur nicht möglich. In diesem Fall können Zuordnungen durch Unterschiede in der Zeitreaktion der Kinetik der verschiedenen Komponenten erfolgen und dadurch der Analyt quantifiziert werden.
Beispielsweise reagieren Inhaltsstoffe des Palmöls mit dem Farbreagenz für Vitamin A in einem vergleichbaren Wellenlängenbereich wie Vitamin A selbst. Anders als bei Vitamin A ist diese Farbreaktion nicht kurzfristig und rasch verblassend, sondern über den Zeitraum der Farbreaktion von Vitamin A stabil. Erfindungsgemäß erfolgt deshalb beispielsweise die Berechnung entweder über die Geschwindigkeit des Abfalls der Reaktion oder durch die Differenz, die an zwei Zeitpunkten gemessen wird.
Erfindungsgemäß wird der Zeitverlauf zwischen 1 und 2000 Sekunden gemessen. Besser zwischen 3 und 600 Sekunden und noch besser zwischen 3 und 300 Sekunden. Am besten zwischen 3 und 60 Sekunden.
Im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung sollen unter„biologischen Materialien" von Pflanzen, Tieren, Menschen und/oder Mikroorganismen gewonnene Materialien, insbesondere körpereigene Materialien, vorzugsweise Proben von körpereigenen Materialien, verstanden werden.
Unter„Mikroorganismen" sollen im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung neben beispielsweise Eukaryoten, wie Algen, Prokaryoten und/oder Pilzen, wie Hefen, auch Viren umfasst sein. Insbesondere sol- - - len„biologische Materialien" aus Kultur gewonnene Organismen sowie Kulturüberstände umfassen.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist zur Analyse von fettlöslichen Vitaminen, vorzugsweise von Vitamin A, Vitamin D und Vitamin E biologischer Materialien vorgesehen.
Die Analyse der biologischen Materialien erfolgt direkt, vorzugsweise bei ausreichender Verflüssigung und bei einem Wasseranteil von unter 5%, insbesondere zwischen 2 und 4 %, oder vorzugsweise zwischen 0.01 und 2 %. Bei Proben, die einen höheren Wasseranteil haben, ist in der Regel eine Vorbehandlung in Form einer Extraktion der zu bestimmenden Inhaltsstoffe notwendig. Jedes dem Fachmann bekannte Verfahren kann hier Anwendung finden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden als biologische Materialien Lebensmittel tierischen und/oder pflanzlichen Ursprungs, insbesondere Homogenisate von Lebensmitteln, eingesetzt.
Als Lebensmittel kommen insbesondere Öle und Fette tierischen oder pflanzlichen Ursprungs in Frage. Daneben können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren als Lebensmittel Milch und Milchprodukte wie Butter, Eier, vorzugsweise Volleigelb, Obst und Gemüse untersucht werden.
Bevorzugterweise kommen für das erfindungsgemäße Verfahren Lebensmittel in Betracht, welche die fettlöslichen Vitamine enthalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden als biologische Materialien Gewebe, Organe und/oder Körperflüssigkeiten verwendet. - -
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden solche biologischen Materialien verwendet, welche im medizinischen Bereich für eine Diagnostik und/oder Therapieverfolgung eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden als Körperflüssigkeiten und/oder -sekrete Blut, Plasma, Serum oder Milch verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren bei einem Druck zwischen 0,5 bar bis 5 bar, insbesondere zwischen 0,8 bar bis 2 bar, durchgeführt.
Bevorzugterweise werden die biologischen Materialien vor der Einleitung der Farbreaktion mit den Reagenzien in eine lösungsmittelbeständige Umgebung überführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als lösungsmittelbeständige Umgebung ein Gefäß aus Glas verwendet.
Vorteilhafterweise können im erfindungsgemäßen Verfahren Gefäße verwendet werden, die den Inhalt, d.h. in der Regel das in Lösungsmittel gelöste Farbreagenz, luftdicht verschließen. Der luftdichte Verschluss verhindert den Zutritt von Feuchtigkeit und verbessert damit die Stabilität des Reagenz bzw. der Reagenzien. Bevorzugterweise werden Gefäße verwendet, welche so beschaffen sind, dass sie für spektroskopische Untersuchungen geeignet sind.
Bevorzugterweise werden Gefäße verwendet, bei denen die Probe durch ein Septum in das Gefäß mittels eines Applikators, vorzugsweise mittels einer Spritze mit Kanüle, überführt werden kann. - -
Für die nachfolgende Analyse der Inhaltsstoffe kommen sämtliche bekannten oder auch bisher unbekannten Analyse-Techniken in Frage.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem ferner auch durch die Bereitstellung eines Spektrophotometers, insbesondere eines Handphotometers, zur Messung von Inhaltsstoffen von biologischen Materialien in einem zylindrischen Gefäß, wobei der Strahlengang des Photometers so eingestellt ist, dass die Messung eine obere Hälfte des Gefäßes erfasst.
Im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung wird unter einem zylindrischen Gefäß ein Gefäß verstanden, welches im Wesentlichen über seine gesamte Länge ein gleichbleibendes Profil aufweist. Als gleichbleibendes Profil kommt beispielsweise ein rechteckiger Querschnitt, insbesondere ein quadratischer Querschnitt, wie er in spektroskopischen Kü- vetten Verwendung findet, in Frage. Vorteilhafterweise finden für die Messung der Inhaltsstoffe der biologischen Materialien die Gefäße Verwendung, in welchen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wurde. Vorteilhafterweise erfolgt die Analyse der Inhaltsstoffe ohne Zeitverzögerung im Spektrophotometer.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass die hier vorliegende Erfindung den quantitativen kolorimetrischen Nachweis von fettlöslichen Vitaminen hinsichtlich seiner Präzision stark verbessert und hinsichtlich der Handhabung stark vereinfacht. Ferner wird die Gefährdung des Untersuchers durch potentiell gesundheitsgefährdende Chemikalien stark reduziert. Insbesondere die Analytik von Ölen und Fetten wird hierdurch vereinfacht. Ferner werden aufwendige Auf bereitungsverfahren, wie die Verseifung der Proben, nicht benötigt. Die Erfindung läßt sich in einem Schritt durchführen. Sie ist daher für die miniaturisierten Verfahren, insbesondere Hochdurchsatzverfahren, die in Form von Chiplaboren be- - - kannt sind und vorzugsweise in den sogenannten „point-of-care"- Systemen Verwendung finden, besonders geeignet.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen anhand von Beispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
Detaillierte Beschreibung der Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird nachfolgend anhand ausgewählter Ausführungsbeispiele im Zusammenhang mit den beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben und erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 Stabilität des Reagenz unter Stresstestbedingungen (Lagerung bei 57°C für 3 Wochen);
Fig. 1 a Tabellarischer Vergleich der Fig. 1 dargestellt als Mittelwert und Standardabweichung.
Fig. 2 Tabellarischer Vergleich von Messergebnissen einer erfindungsgemäßen Analyse in Reagenzröhrchen, die frisch abgefüllt wurden, und solchen, die unter den erfindungsgemäßen Bedingungen für 50 Wochen bei Raumtemperatur (18 - 29°C) gelagert wurden.
Fig. 3 Ergebnisse der Auswertung von mit unterschiedlichen
Gehalten an Vitamin A angereicherten Palmölproben vor und nach der erfindungsgemäßen Datenkorrektur im portab- - - len Photometer. Die Werte wurden im Vergleich zur HPLC Messung gesetzt.
Fig. 4 Graphische Darstellung des Überschichtens des Analysereagenz mit einer Ölprobe unter den erfindungsgemäßen Bedingungen.
Fig. 5 Kinetik der Farbreaktion einer Palmölprobe mit und ohne
Vitamin-A-Anreicherung.
Fig. 6 Einfluß der Temperatur auf die Intensität und Stabilität der
Farbreaktion.
Fig. 7 Linearität der Messung von Vitamin D in Ölproben unterschiedlicher Konzentration
Fig. 1 zeigt ein Diagramm, in welchem die Lagerstabilität des unter erfindungsgemäßen Bedingungen abgefüllten und gelagerten Reagenzes unter sogenannten Stressbedingungen bei 57°C getestet wurde. Dieser Zeitraum entspricht einer Lagerung bei Raumtemperatur über mindestens 2 Jahre.
Getestet wurde die Stabilität mit drei Palmölproben, die sich hinsichtlich ihres Vitamin-A-Gehaltes unterscheiden. Die Messung wurde entsprechend der Erfindung durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Messungen über den ganzen Zeitraum stabil sind.
Fig. 1 a zeigt die Werte der Fig. 1 als Mittelwert und Standardabweichung. Die Ergebnisse zeigen die Vergleichbarkeit in beiden Werten.
Fig. 2 zeigt eine Abbildung, in der die Messergebnisse von Vitamin A in Palmöl aus 14 Proben mit unterschiedlicher Konzentration dargestellt - - sind. Die Reagenzien wurden wie in der Erfindung beschrieben abgefüllt und gelagert. Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur (18 -29°C) für 2 bzw. 50 Wochen. Fig. 2 erfasst die Ergebnisse der Abbildung als Mittelwert und Standardabweichung. Die Ergebnisse zeigen die Vergleichbarkeit in beiden Werten.
Die Palmölproben wurden gemäß Fig. 3 zunächst ohne Korrektur im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt (als 0 beschrieben). Anschließend wurde der durchschnittliche Mittelwert der Grundabsorption nach 180 Sekunden von den gemessenen Werten (0 Werte) abgezogen. In einem weiteren erfindungsgemäßen Schritt wurde eine Berechnung der Werte auf der Basis der Kinetik (Zeitverlauf) über 30 Sekunden durchgeführt. Die Ergebnisse (als berechnet dargestellt) zeigen, dass mit diesem Verfahren die bestmöglichen Übereinstimmungen mit den Werten erzielt werden können, die von der HPLC als goldener Standard ermittelt wurden.
Die flüssige oder verflüssigte Probe wird gemäß Fig. 4 entsprechend der Erfindung über das in der Verschlusskappe befindliche Septum appliziert. Dabei erfolgt eine vorsichtige Überschichtung des Reagenzes mit der Probe. Dabei bilden sich zwei Phasen aus. Die Initierung der Reaktion wird erst durch das Mischen innerhalb des Reaktionsgefäßes ausgelöst.
Zwei Ölproben mit und ohne Vitamin A entsprechend der erfindungsgemäßen Analyse zeigen gemäß Fig. 5 einen unterschiedlichen Reaktionsverlauf. Die Ergebnisse der erfindungsgemäßen Analyse zeigen den störenden Einfluss von unerwünschten Inhaltsstoffen in Öl.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Analyse unter verschiedenen Temperaturbedingungen und deren Einfluss auf den zeitlichen Verlauf ist in Fig. 6 bei 20°C, 30°C und 40°C dargestellt. - -
Die Analyse von Vitamin-D-haltigen Ölproben wurde erfindungsgemäß durchgeführt. Die Messung erfolgte im Spektrophotometer. Die mit Vitamin D angereicherte Ölprobe wurde in fünf äquidistanten Abständen verdünnt und anschließend erfindungsgemäß vermessen. Dies ist in Fig. 7 dargestellt.
Ausführungsbeispiele
Bestimmung von Vitamin A aus Pflanzenölen
Das Öl wurde mittels eines Applikators (Spritze mit Nadel) in einem definierten Volumen von 500 μΙ in das Reagenzgefäß eingebracht. Dazu wurde mit der Kanüle das Verschlussseptum des Gefäßes durchstoßen und das Öl langsam auf das bereits im Reagenzgefäß befindliche Reagenz geschichtet. Dabei kam es zu keinen sichtbaren Vermischungen und es entstanden zwei deutlich abgegrenzte Phasen. Die Ölprobe als obere Phase, das Reagenz darunter. Durch die Phasentrennung wurde eine vorzeitige und unkontrollierte Farbreaktion verhindert. Die Farbreaktion wurde anschließend durch kurzes kräftiges Schütteln des Reagenzgefäßes gestartet. Je nach Konzentration von Vitamin A in der Probe fiel die Färbung intensiver aus. Die Farbintensitäten werden direkt im Spektralphotometer vermessen.
Extraktion und Bestimmung von Vitamin D in Ölen
Die Versuchsdurchführung wurde wie beschrieben beibehalten. Ebenfalls die Vermessung der Probe. Die Farbintensität war direkt proportional zur Konzentration von Vitamin D in der Probe (Fig. 7). Die erfindungsgemäße Analyse wurde hinsichtlich der Linearität an angereicher- - - ten Ölproben getestet. Die Linearität betrug 0.956. Die Richtigkeit der Ergebnisse wurde mittels des goldenen Standards HPLC bestimmt.
Extraktion und Bestimmung von Vitamin A und Vitamin D aus Margarine.
Als biologisches Material wurde Margarine verwendet. Versuchsdurchführung und Vermessung wurden wie angegeben vorgenommen. Allerdings erfolgte vor der Vermessung eine Extraktion der Lipide in organische Lösungsmittel. Dies wurde in bekannter Weise, z.B. nach einem in der DE 10 2006 044 795 A1 beschriebenen Verfahren, durchgeführt. Die mit Vitamin A und Vitamin D angereicherte Margarineprobe wurde zunächst leicht erwärmt, um sie zu verflüssigen. Anschließend wurde die Probe in Hexan überführt. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Nach der Extraktion der Probe in Hexan wurde das Extrakt entsprechend des bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens zum Reagenz verbracht und entsprechend überschichtet. Die Farbreaktion wurde durch Mischen von Probe und Reagenz initiiert. Der Farbverlauf war zweiphasig. Zunächst trat die Blaufärbung auf, dann die Vitamin-D-typische Farbreaktion von rosa-rot. Die Intensität der Farbreaktion für Vitamin A und Vitamin D entsprachen den Ergebnissen, die mittels HPLC ermittelt wurden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur vorzugsweise quantitativen kolorimetrischen Bestimmung von fettlöslichen Vitaminen in biologischen Materialien, insbesondere von Vitamin A, Vitamin D und/oder Vitamin E, bei welchem die Art der Abfüllung des Reagenz bzw. der Reagenzien und die Applikation der Probe zu einer Verlängerung der Reagenzienstabilität und zum kontrollierten Start der zeit- und temperaturkritischen Farbreaktion führt und insbesondere unter Verzicht auf eine Vorbehandlung die störenden Einflüsse von Fremdstoffen durch spezielle Mess- und Analyseverfahren im Photometer korrigiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzienlagerung, die Probenapplikation und die Durchführung der Farbreaktion in einem Reagenzgefäß stattfinden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenapplikation zum Analysereagenz so erfolgt, dass es zwischen Reagenz und Probe zu einer klaren Phasentrennung unter Ausbildung von mindestens zwei Phasen kommt, wobei vorzugsweise die Farbreaktion durch die Mischung der beiden Phasen ausgelöst wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur des Reagenz zur Verbesserung der automatischen Quantifizierung konstant gehalten wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Messverfahren um eine oder mehrere unterschiedliche spektroskopische Messverfahren bei unterschiedlichen Wellenlängen handelt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Auswertung eine Differenz zwischen verschiedenen Farbreaktionen verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abfallgeschwindigkeit der vitaminspezifischen Farbreaktion für die Quantifizierung verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhaltsstoffe während eines Zeitraumes von 3 Sekunden bis 10 Minuten, insbesondere von 10 Sekunden bis 5 Minuten, vorzugsweise von 5 Sekunden bis 2 Minuten, untersucht werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Materialien pflanzliche, tierische, menschliche und/oder mikrobielle Materialien umfassen, welche insbesondere aus Zellkulturen stammen.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Materialien vor ihrem Einsatz Vorbehandlungen, insbesondere Reinigungsvorgängen, unterworfen werden.
1 1. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Materialien Lebensmittel tierischen und/oder pflanzlichen Ursprungs, insbesondere Homoge- nisate von Lebensmitteln, eingesetzt werden, wobei vorzugsweise als Lebensmittel Öle und Fette pflanzlichen oder tierischen Ursprungs verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Materialien Gewebe, Organe und/oder Körperflüssigkeiten verwendet werden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren bei einer Temperatur im Bereich von -80°C bis 60°C, insbesondere im Bereich von 8°C bis 30°C, durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren bei einem Druck zwischen 0,5 bar bis 5 bar, insbesondere zwischen 0,8 bar bis 2 bar, durchgeführt wird.
15. Kit für die vorzugsweise quantitative kolorimetrische Bestimmung von fettlöslichen Vitaminen in biologischen Materialien, insbesondere von Vitamin A, Vitamin D und/oder Vitamin E, umfassend mindestens ein Gefäß, das die für die kolorimetrische Bestimmung vorgesehenen Reagenzien enthält und gegenüber der Umgebung luftdicht abgeschlossen ist, wobei das Gefäß vorzugsweise zur direkten Verwendung in einem Photometer, insbesondere einem portablen Photometer, ausgebildet ist.
16. Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß mindestens ein Septum zum Einbringen einer Probe, die die fettlöslichen Vitamine enthält, in das Gefäß aufweist.
17. Kit nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß auf mindestens einem Teil seiner Außenfläche mit einer sogenannten Antifog-Beschichtung versehen ist.
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