EP2416881A1 - Einweg-mikrofluidik-testkassette zur bioassay von analyten - Google Patents

Einweg-mikrofluidik-testkassette zur bioassay von analyten

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Publication number
EP2416881A1
EP2416881A1 EP10711021A EP10711021A EP2416881A1 EP 2416881 A1 EP2416881 A1 EP 2416881A1 EP 10711021 A EP10711021 A EP 10711021A EP 10711021 A EP10711021 A EP 10711021A EP 2416881 A1 EP2416881 A1 EP 2416881A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
chamber
test cassette
analyte
detection
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10711021A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ingmar Dorn
Andreas Schade
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Intellectual Property GmbH
Original Assignee
Bayer Technology Services GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Technology Services GmbH filed Critical Bayer Technology Services GmbH
Publication of EP2416881A1 publication Critical patent/EP2416881A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic technology-based disposable test cassette for the bioassay of analytes by means of bio and / or chemosensors, a device for bioassaying of analytes by means of bio and / or chemosensors comprising the test cassette according to the invention, a method for operating this test cassette, and their use in environmental analysis, the food sector, human and veterinary diagnostics and plant protection.
  • Bio or chemosensors are devices that can qualitatively or quantitatively detect an analyte with the aid of a signal converter and a recognition reaction.
  • the recognition reaction is generally referred to as the specific binding or reaction of a so-called analyte with a so-called recognition element.
  • recognition reactions are the binding of ligands to complexes, the complexation of ions, the binding of ligands to (biological) receptors, membrane receptors or ion channels, of antigens or haptens to antibodies, of substrates to enzymes, of DNA or RNA to specific proteins, the hybridization of DNA / RNA / PNA or the processing of substrates by enzymes.
  • Analytes may be: ions, proteins, natural or artificial antigens or haptens, hormones, cytokines, mono- and oligosaccharides, metabolites or other biochemical markers used in diagnostics, enzyme substrates, DNA, RNA, PNA, potential drugs, medications, Cells, viruses.
  • recognition elements are: natural or artificial receptors such. As complexing agents for metals / metal ions, cyclodextrins, crown ethers, antibodies, antibody fragments, anticalins enzymes, DNA, RNA, PNA, DNA / RNA-binding proteins, membrane receptors, ion channels, cell adhesion proteins or gangliosides, enzymes, mono- or oligosaccharides and haptamers.
  • bio- or chemosensors can be used in environmental analysis, the food industry, human and veterinary diagnostics and crop protection to qualitatively and / or quantitatively determine analytes.
  • the specificity of the recognition reaction also allows analytes in complex samples such. As ambient air, contaminated water or body fluids with little or no prior purification to determine qualitatively or quantitatively.
  • bio- or chemosensors can also be used in (bio-) chemical research and drug discovery to study the interaction between two different substances (eg between proteins, DNA, RNA, or biologically active substances and proteins, DNA, RNA, etc.).
  • a new class of electrical biosensors relies on the detection of analytes which are supported by metallic particles, e.g. Nanoparticles are marked. For detection, these particles are enlarged by autometallographic deposition to the extent that they short a microstructured circuit. This is demonstrated by a simple DC resistance measurement (US 4,794,089; US 5,137,827; US 5,284,748). Detection of nucleic acids by DC resistance measurement has recently been demonstrated (R. Möller, A. Csäki, J. M. Köhler, and W. Fritzsche, Langmuir 17, 5426 (2001)).
  • Field effect transistors may be used as electronic transducers e.g. for an enzymatic reaction (Zayats et al., Biosens. & Bioelectron., 15, 671 (2000)).
  • quartz crystals are described in which the change in the resonance frequency by mass occupancy takes place (Steinern et al., Biosens. & Bioelectronics 12, 787 (1997)).
  • interdigital structures are used to excite surface waves that are modified by target adsorption (Howe et al., Biosens. & Bioelectron., 15, 641 (2000)).
  • the recognition reaction can be detected by the magnetic influence of the beads on the giant magnetoresistance (GMR) of a corresponding resistor (Baselt et al., Biosens., And Bioelectron., 13, 731 (1998)).
  • GMR giant magnetoresistance
  • Integration of the recognition reaction with the signal transducer into a biosensor or chemosensor can be accomplished by immobilizing the recognition element or analyte on the surface of the transducer.
  • the recognition reaction d. H. the binding or reaction of the analyte with the recognition element, the optical properties of the medium change directly on the surface of the transducer (eg, change in optical refractive index, absorption, fluorescence, phosphorescence, luminescence, etc.) is translated by the signal converter into a measurement signal.
  • Optical (planar) waveguides are a class of signal transducers that can detect the change in optical properties of a medium that is adjacent to a waveguiding layer, typically a dielectric.
  • a medium typically a dielectric.
  • the light field at the medium / waveguide interface does not abruptly decay but decays exponentially in the so-called detection medium adjoining the waveguide.
  • This exponentially decreasing light field is called evanescent field designates.
  • waste lengths of the evanescent field intensity drops to the value 1 / e) of ⁇ 200 nm are achieved. Change the optical properties of the adjacent to the waveguide medium -.
  • the recognition element or the analyte when the recognition element or the analyte is immobilized at the interface of the waveguide, the binding to the recognition element or the reaction of the recognition element can be surface-sensitively detected, while changing the optical properties of the detection medium (liquid, solid, gaseous) at the interface to the waveguide ,
  • test cassette ready-to-use In order to simplify the operation of chemo- or biosensors, attempts have been made for some years to reduce these devices and, as far as possible, all reagents needed for the qualitative and / or quantitative determination of a sample are placed in a so-called test cassette ready-to-use.
  • microfluidics technology is being used, with the aim of providing cost-effective, storable and easy-to-use disposable cassettes that can deliver timely, reproducible results.
  • the mixing of the analyte with the detection reagent is not optimal for detection because of the uncontrollable laminar flow
  • laminar flow is affected by different surface properties which are difficult to control in the manufacture and storage of a test cartridge, such as e.g.
  • Air bubbles can form during the transport of the liquid
  • DE102005011530 describes a microfluidic device for real-time quantification of a very small amount of analyte.
  • the real-time evaluation is achieved by flowing the sample into a detection unit.
  • the detection unit consists of a flow channel in the analyte capture units for trapping the analyte z.
  • antibodies are immobilized on a variety of analyte detection units along the flow channel.
  • the quantitative determination of the analyte is z. B. by means of an optical signal.
  • the analyte sample is z. B. transported with a micropump in the flow channel.
  • the aim of the above device is to optimize the number of analytes trapped by the analyte trap unit in the direction of flow.
  • the analytes are quantitated over a wide range (the length of the flow channel) without decreasing the detection sensitivity.
  • This device consists of a variety of microscopic components based on semiconductor technologies or microscopic precision devices - micropumps, microvalves, sensors, and the like, which are miniaturized, accumulated, and integrated.
  • the manufacture and operation of this device is too complicated and too expensive for a potential use as a disposable test assay.
  • WO2005 / 070533 describes a microfluidic device for determining the concentration of an analyte in a sample fluid having a structured body which has chamber systems connected to duct systems, optionally with built-in filter units with an inlet and an outlet, and which is closed on at least one side with a sealing layer is.
  • This device comprises a reaction chamber containing reagents for binding to at least one component of the sample liquid, which are immobilized either on the lid of the chamber or on coated particles.
  • a sample chamber is filled with the sample liquid through the inlet and the inlet is closed by means of a lid.
  • the sample liquid is conveyed by means of a pump from the sample chamber through a channel system into the reaction chamber.
  • the device has further channel systems containing a label liquid and a washing liquid, and a discharge channel system for evacuating waste liquids.
  • Different parts of the complex duct systems can be closed by means of soft seals, which can be broken open under low pressure as needed.
  • the flow direction in the device is ensured by means of valves and brush-like or valve-like flow diodes.
  • the device allows precise control of volumes and reaction times.
  • the structure of this device requires several processes in the reaction chamber before it can be measured and is correspondingly expensive.
  • Due to the fluidic elements used, the device is very complex, which is reflected in susceptibility and high production costs.
  • the use of fluidic elements also reduces the shelf life of the device.
  • the dry assay technology in which all reagents in the dry state in the cassette, if necessary, are available in separate chambers.
  • the sample liquid is usually conveyed by means of microfluidic channels from one chamber to the next.
  • WO 2005/088300 describes an integrated microfluidic test cassette for blood analysis which consists of a lower and an upper body part. Both elements are structured with chambers and channels, which are closed by the joining of the two parts.
  • the pretreatment elements are, in particular, filter elements or elements with porous properties in the form of a channel or a (micro / nano) cushion, which optionally carry dry reagents.
  • the sample is first passed through the pretreatment elements, then into the multilayer dry assay element.
  • the multilayer dry assay detection element comprises at least one functional layer bearing recognition elements for a qualitative and quantitative assay in dry and stable form.
  • This reagent layer consists of a water-absorbing layer in which stimulable recognition elements are reasonably regularly distributed in a hydrophilic polymer binder material (gelatin, agarose, etc.).
  • the detection is carried out by reflection photometry through a light-transparent window, by irradiating a detection layer in the multi-layered dry assay element in which the optically excitable liquid has diffused from the detection reaction.
  • Disadvantage of this device is that the structure of the multilayer dry assay element is expensive. Accurate control of volume, mixing and incubation times is not possible, so that the test results are quantitatively not reproducible.
  • the cassette is inserted into a device for operating the cassette, which has a light source for irradiating the reaction chamber, a filter for concentration of the signal from the reaction chamber and a detection unit.
  • Lateral flow assays have been known for many years for biochemical analysis. Lateral flow assays (LFA) exploit the effect of the antibody-antigen reaction.
  • the sample to be analyzed solution
  • capillary forces For example, to detect analytes by LFA, a direct, competitive immunoassay can be performed on a nitrocellulose strip, whereby the sample to be analyzed is pulled through the entire nitrocellulose strip due to capillary forces.
  • the zone in which the anti-analyte antibody was immobilized serves as a detection zone for the streak test.
  • An example of an LFA assay for the detection of mycotoxins is the "Reveal Assay” (test cassette) from Neogen, Lansing, MI, USA with the associated "AccuScan” reader.
  • the test cassette is inserted into the reader and the device takes a picture of the result area of the strip test.
  • the reader interprets the result image and when a line is detected, a rating is given.
  • the device eliminates the subjectivity of the interpretation and gives an objective, traceable documentation of the test result.
  • the test described is simple and relatively fast to carry out and does not require elaborate read-out devices. The disadvantage is that the method only allows a qualitative mycotoxin detection.
  • test cassette for the qualitative and / or quantitative analysis of analytes, which contains all the reagents required for carrying out the test procedure in dry form.
  • the test cassette according to the invention has a structured body in which cavities which are connected to one another by channels have been introduced.
  • the test cassette has at least one inlet for introducing an analyte-containing sample liquid, at least one reagent chamber in which one or more reagents for reaction with the analyte or for mixing with the sample liquid are housed, and at least one detection chamber in which Signal for detection or quantitative analysis of the analyte is detected, and is characterized in that:
  • the bottom or the ceiling of the detection chamber is a signal converter or a window for detecting a signal
  • the channels are designed so that the sample liquid is not drawn by capillary forces into the chamber or to the opening,
  • the reagents in the reagent chamber and optionally other reagents are housed in the detection chamber in dry form.
  • a precisely defined volume of sample liquid is conveyed in the channels and in the chambers, which is made possible by the design of the channels and the use of a suitable means for conveying the sample liquid. Reaction times can also be precisely controlled, which contributes to better reproducibility of the analysis.
  • the proper design of the chamber and channels ensures an optimal flow profile with reduced dead volume and optimal contact with any immobilized detection reagents.
  • various reaction steps e.g. Reconstitution of the reagents, mixing of the reagents with the sample liquid, reaction between reagents and analytes.
  • the detection step occurs immediately after a detection reaction without a previous wash, further simplifying the construction of the cartridge and its handling.
  • the body may be transparent or light-tight and made of various polymer materials such.
  • the bodies are made by known methods, e.g. machining (milling etc.), injection molding, embossing techniques or glass / anorg. Materials by photolithography / etching or other known methods.
  • the shape and size of the test cassette can be anything as long as the total volume of the test cassette remains low and easy to handle.
  • the chamber and the channels are incorporated into the body and closed on at least one side by means of a closure unit with the exception of the inlet and usually by optional air openings and / or a sample chamber.
  • the test cassette is constructed so that it can be tempered by contact with temperature-controllable elements.
  • the design of the test cartridge is configured such that the optional sample chamber, the reagent chamber, and the detection chamber are directed toward the underside of the body.
  • the signal converter or the window for detection then preferably form the bottom of the detection chamber.
  • this side of the cassette is closed with a thin closure unit, in particular a closure film.
  • the closure unit may be light-tight or transparent. If you place the cassette on a tempered surface, so a rapid temperature compensation between tempered pad and the sample solution can take place in the chambers.
  • the closure unit is a sealing film of 30 ⁇ m to 1000 ⁇ m, preferably 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, thick. It is advantageous if the closure film can be fastened tightly over the body and can not bend.
  • polyolefin films or polymethylmethacrylate (PMMA) films may be used as the closure films.
  • the closure unit is applied to the upper and lower sides of the test cassette. This simplifies the production of the test cassette according to the invention.
  • the top and bottom closure foils may be the same or different thicknesses.
  • the closure units may be secured to the body by conventional bonding techniques such as, for example, U.S. Pat. B. welding or gluing, if necessary with the aid of adhesive.
  • a precisely defined volume of liquid is held up in the chambers for a certain time and forwarded after this time.
  • test cassette In the test cassette according to the invention usually from 1 to 1000 .mu.l, preferably 10 to 500 .mu.l, particularly preferably 10 to 250 ul transported.
  • the shape of the chamber can be arbitrary. Preference is given to quadrangular detection chambers and / or round reagent chambers.
  • the volumes of the chambers are usually 1 to 1000 ⁇ l, preferably 10 to 500 ⁇ l.
  • the sample chamber is typically round, preferably 5 to 15 mm, preferably 8 to 12 mm in diameter.
  • the reagent chamber is usually round with preferably 5 to 15 mm, preferably 5 to 10 mm in diameter. Both chambers can hold a fluid volume of 1 to 1000 ⁇ l.
  • the detection chamber is usually quadrangular with dimensions of preferably 5 to 15 mm wide and 5 to 15 mm long, more preferably 10 mm x 10 mm and typically absorbs a liquid volume of 1 to 1000 ul, and it must be completely filled according to the invention of the liquid.
  • sample chamber The construction of the sample chamber, reagent chamber and detection chamber should ensure an optimal flow profile with reduced dead volume and optimal contact with the immobilized detection reagents that may be present.
  • the channels may be straight or curved, preferably straight with angular turns.
  • the shape of the channel cross section is arbitrary, usually round or square, preferably round.
  • the cross-sectional sizes of the channels may be the same or different; to be favoured
  • Channels of the same size usually from 0.2 to 3 mm, preferably 0.5 to 1.5 mm in cross section or diameter.
  • the length of the channels is usually 5 mm to 1000 mm, preferably 5 mm to 500 mm.
  • liquids are conveyed by means of a means for accurately and accurately transporting the sample liquids in terms of time and volume.
  • a means for accurately and accurately transporting the sample liquids in terms of time and volume.
  • predefined fluid volumes are pushed from one to the next chamber.
  • the means for transporting the sample liquids is part of a device for operating the test cassette according to the invention, which is also the subject of the present invention.
  • the means for transporting the sample fluids into a docking station for introducing the test cartridge into the o. G. Integrated device.
  • the handling of liquids preferably takes place only in the test cassette according to the invention, so that the above-mentioned device does not come into contact with sample liquid or reagents.
  • precisely defined air bursts are given in the test cassette over time and volume via the means for transporting the sample liquids. These jets of air guide the sample fluid through the various channels and cavities.
  • the sample liquid to be analyzed is introduced into the test cassette through the inlet, preferably into a sample chamber.
  • the test cassette is then usually hermetically sealed by means of one or more lids.
  • the lids may be made of polymeric or inorganic materials which may be obtained by various techniques, e.g. Gluing, welding, laminating, etc. are connected to the body airtight.
  • the reagents in the reagent chamber in a fibrous or porous material for. B. fine particles or tissue, in the form of a reagent pad, in the reagents (adsorbed on, fixed on, dispersed in, dried in) were housed.
  • the reagent pad is selected to meet the requirements of the detection chamber with respect to the required liquid volume of the supernatant solution and the concentration of the individual components in this solution.
  • a preferred reagent pad is made of glass or polymers such. Cellulose. Reagent pads that are also used in so-called lateral flow tests and are commercially available in various forms are suitable.
  • the "extra thick glass filter” from Paill Corporation pore size 1 ⁇ m, typical thickness 1270 ⁇ m (50 mils), typical water flow rate 210 mL / min / cm 2 at 30 kPa is selected, with two circular Filter pieces with a suitable diameter are stacked on top of each other.
  • the reagents of the reagent chamber are typically:
  • recognition elements that are used in recognition reaction, in particular natural or artificial receptors such.
  • Anticalins enzymes DNA, RNA, PNA, DNA / RNA binding proteins, membrane receptors, ion channels, cell adhesion proteins or gangliosides, enzymes, mono- or oligosaccharides and haptamers and / or
  • analytes such as ions, proteins, natural or artificial antigens or haptens, hormones, cytokines, mono- and oligosaccharides,
  • Metabolites or other biochemical markers used in diagnostics be, enzyme substrates, DNA, RNA, PNA, potential drugs, drugs, cells, viruses.
  • labeled antibodies are used as recognition elements.
  • cofactors or other chemicals that are required or advantageous for reacting a recognition element with an analyte are also accommodated in the reagent chamber.
  • the reagent chamber also contains adjuvants to suppress nonspecific interactions between the reagents, to assist in impregnating or triggering the reagents from the reagent pad, such as, for example.
  • adjuvants such as surfactants, lipids, biopolymers, polyethylene glycol, biomolecules, proteins, peptides.
  • the reagents are applied in predefined concentrations and ensures the reproducibility of their release during operation of the cassette.
  • the reagent pad is usually impregnated with about 50 to 500 .mu.l of a solution containing the reagents in concentrations of 10 "3 M to 10 " 15 M, preferably nanomolar concentrations, and usually auxiliaries in amounts of 15 wt.% To 0, Contains 1 ppb.
  • the impregnation is carried out, for example, by drying or lyophilization.
  • the sample fluid delivery means displaces the sample fluid so that it flows into the reagent chamber and completely wets the reagent pad.
  • the reagents are dissolved and react with the analytes or are perfectly mixed with the sample liquid.
  • the reagents are both dissolved (usually by 1 ms to 10 s, preferably about 500 ms to 5, particularly preferably 1 sec) wetting of the reagent pad with a defined sample volume (by the defined air burst) ( reconstituted) and optimally mixed with the sample liquid, and the concentration of the reagents in the sample liquid is set very reproducible. This makes it possible to carry out a quantitative determination of the analytes in the sample volume.
  • a defined time pre-incubation time
  • the sample volume with the dissolved reagents is transported via a channel further into the detection chamber.
  • the sample liquid is filtered in the test cassette in front of the reagent chamber and freed from cells, blood components or other biological, organic or inorganic particles.
  • one or more filter units z.
  • the filter unit may preferably separate particles of 0.2 to 100 ⁇ m, preferably 0.5 to 15 ⁇ m, from the sample liquid.
  • vent (s) takes place.
  • the detection via a signal converter (sensor platform, biochip), which is installed in the detection chamber as a floor.
  • the closure unit is applied over the entire lower side of the cassette, with the exception of the detection chamber.
  • one or more separate measuring ranges are defined, in which one or more further binding partners for detecting the analyte are immobilized in the sample.
  • a biochemical reaction between immobilized binding partner and analyte takes place on the surface of the biochip.
  • the labeled reactants are excited in the detection chamber, the generated signal is detected and used to quantify the analytes.
  • biochips such as e.g. Surface Plasmon Resonance, Planar Waveguides, Quartz Micro Weighing, Electroluminescence, are used and various procedures, eg. As measurement of the refractive index changes by the binding to the surface of the biochip, can be used (see, for example, WO02 / 20873 and EP1316594).
  • Reactions in the detection chamber are for example:
  • a planar thin-film waveguide is used as a biochip, which is a first optically transparent
  • the excitation light is coupled in the thin-film waveguide via the one or more coupling elements and optionally coupled via one or more decoupling elements.
  • lattice structures of the same period and / or modulation depth are preferably used as coupling elements.
  • one or more reactants are immobilized on the surface of the sensor platform for the detection of the analytes directly by physical absorption or electrostatic interaction alternatively by means of an optical transparent primer layer.
  • the binding partners are selectively applied to spatially separated measurement areas on the surface of the sensor platform and the area passivated between the measurement areas to suppress non-specific binding.
  • one or more methods can be used from the group formed by ink jet spotting, mechanical spotting by means of pen or spring, micro contact printing, fluidic contacting of the measuring ranges with the biological or Biochemical or synthetic recognition elements by their supply in parallel or crossed microchannels, under the influence of pressure differences or electrical or electromagnetic potentials.
  • binding-specific detectable recognition elements for one or more analytes of the sample liquid are provided in predefined concentrations in the reagent chamber.
  • the recognition elements are dissolved and enter into the analyte with a specific binding (analyte-recognition element conjugate).
  • the free binding sites of the recognition elements are increasingly saturated with increasing amount of analytes in the sample liquid.
  • analyte-recognition element conjugates and optionally recognition elements with free binding sites to immobilized binding partners By another air blast the analyte-recognition element conjugates and optionally recognition elements with free binding sites to immobilized binding partners, z.
  • analyte-protein conjugates in particular analyte-BSA conjugates, on the signal converter.
  • Free-binding site recognition elements specifically bind with the corresponding immobilized analyte-protein conjugates.
  • the more detectable recognition elements with free binding sites are present in the solution, that is, the lower the proportion of the corresponding analyte in the sample liquid, the more detectable recognition elements are bound on the chip.
  • the analyte-saturated recognition elements from the sample liquid remain in the solution.
  • the recognition elements bound and labeled on the immobilized analyte-protein conjugates can be excited in the evanescent field of the waveguide.
  • the labeled recognition elements present in the solution are not excited in this case. In this way, an indirect quantification of the analytes contained in the sample liquid is possible.
  • the detection chamber has as bottom a transparent window, by which the biochemical reaction taking place in the detection chamber can be detected.
  • the transparent window can through the sealing film, which must be transparent in this case, and z. B. from polymethylmethacrylate (PMMA), are formed or constitute an independent element.
  • the window is preferably made of glass or of a plastic which is transparent to the light used, and is fastened on the side of the test cassette by means of the closure unit, with the exception of the detection chamber.
  • reagents are preferably placed only in the reagent chamber in which mixing with the sample liquid takes place prior to transport into the detection chamber.
  • a reagent in the solution is reacted, depending on the concentration of the analyte to be determined, in such a way that it alters its spectral properties, for example absorption, luminescence, fluorescence, etc., which can be optically detected.
  • a detection reagent is bound in the solution depending on the concentration of the analyte to be determined to another reagent or to the analyte itself, so that the detection reagent changes its spectral properties - eg absorption, luminescence, fluorescence, electroluminescence, electrical capacitance, etc. that can be optically detected.
  • one or more signal transducers are located in the detection chamber, by means of which the biochemical reaction taking place in the detection chamber can be detected.
  • the window may be transparent or light-tight.
  • the reagents are also preferably placed here only in the reagent chamber, in which the mixing with the sample liquid takes place before being transported into the detection chamber.
  • a reagent in the solution can be reacted depending on the concentration of the analyte to be determined so as to maintain its material properties - e.g.
  • each test cassette carries a bar code which preferably includes the following information for describing the test cassette:
  • this information is contained by the device for the bioassay of analytes by means of bio and / or chemosensors the inventive test cassette, which is also the subject of the present invention, read and used.
  • test cassette has a plurality of adjacent channel and chamber systems, so that different detection reactions could be performed simultaneously in a test cassette.
  • the present invention further provides an apparatus for bioassaying analytes by means of bio- and / or chemosensors comprising the test cassette according to the invention, at least one docking station for the positioning of the test cassette according to the invention, at least one means for conveying the sample liquids in the test cassette.
  • the device according to the invention for controlling the operating temperature in the test cassette also has at least one temperature regulating unit.
  • the temperature regulating unit has at least one flat temperature-controllable element on which the thin side of the test cassette according to the invention is placed, so that a rapid temperature compensation between tempered support and sample solution can take place in the chambers.
  • Peltier or cartridge elements can be used to control the temperature of the overlay.
  • the temperature control unit is computer controlled and the temperature is kept constant during operation of the test cartridge.
  • the test cassette is operated at a temperature of 20 to 37 0 C, preferably around 25 0 C.
  • Fig. 13 Dew point temperature diagram
  • the coupling point has a mechanical trigger on which the reaction, that is to say the first air blast, starts with the aid of the means for conveying the sample liquid and / or the tempering by means of the tempering unit in the test cassette.
  • the device according to the invention also comprises at least one optical unit which has at least one source for an excitation light, in particular a laser and at least one read-out unit for detecting the biochemical reaction in the detection chamber of the test cassette according to the invention.
  • the readout unit is a location-resolving detector, for example from the group formed by CCD cameras, CCD chips, photodiode arrays, avalanche diode arrays, multi-channel plates and multi-channel photomultipliers.
  • the optical unit usually also has mirrors, prisms and / or lenses for shaping - in particular focus, graduation, redirection and orientation - of the excitation light.
  • a goniometer for controlling and regulating the excitation path, in particular for optimizing the coupling parameters by positioning the laser beam with respect to angle of incidence and position to the lattice structure in the optical unit. Precise adjustment of the laser beam maximizes the intensity of the light scattered from the PWG sensor platform.
  • test cassette is also held precisely by means of a fixing unit in the coupling point.
  • a precision of 100 ⁇ m parallel to the grating and 200 ⁇ m normal to the surface of the PWG chip is preferred.
  • the second positioning is set in the course of the coupling-in setting with a resolution of 50 ⁇ m. It is noted that the quality of the signal depends on the exact positioning of the sensor platform to the laser beam so that tolerance limits should be considered.
  • the test cassette z. B sealed with a silicone lid and the means for transporting the sample liquid, for.
  • a syringe, a stamp or a pump presses a first volume of air in the test cartridge.
  • the air pressure transports the sample fluid from the sample chamber into the reagent chamber and cross-links the reagent pad.
  • the toxins of the sample reacts with the fluorescent antibody.
  • the preincubation time is from 1 to 20 minutes, preferably from 3 to 7 minutes, depending on the reactants. Usually, a longer preincubation time produces a stronger signal. It is preferred to control the preincubation time with a precision of 3 seconds.
  • the means for conveying the sample liquid pushes a second predefined volume of air into the test cassette, which leads to the further transport of the sample liquid - possibly through a filter - into the channel into the reaction chamber.
  • the main incubation takes place, which usually lasts from 1 to 100 minutes.
  • the detection is preferably carried out after 1 to 30 minutes, preferably 5 to 15 minutes with a precision of ⁇ 5 seconds.
  • a laser beam is directed into the detection chamber on the surface of the sensor platform and the fluorescence generated is registered by the readout unit.
  • the reaction has not reached equilibrium. It is therefore preferred to precisely observe the duration of the respective steps in order to ensure the reproducibility of the measurement.
  • the device according to the invention has a control unit for automatically controlling the means for conveying the sample liquid and / or the temperature regulation unit and / or the optical unit and corresponding positioning of the test cassette in the coupling site by means of a fastening unit, control and adjustment of the biochemical reaction parameters, such. Incubation time / temperature, reaction time / temperature, etc.
  • the control unit also has a calculator element for calculating the analyte values by reference to a calibration curve and display of the analyte values.
  • the user inserts the test cassette into the docking station.
  • the device according to the invention carries out the following steps independently with the aid of the control unit:
  • the temperature control unit heats the test cassette until a temperature of e.g. B. 25 ° C and maintained.
  • the sample liquid conveying means conveys the sample liquid into the reagent chamber. The preincubation is started.
  • the sample liquid conveying means conveys the sample liquid into the reaction chamber. The main incubation is started.
  • the coupling conditions are finely optimized. An angle compensation of 1 ° is taken into account because of the change in the refractive index (air in step 5, water solution now). 8.
  • the laser beam is switched on and the resulting signal is registered by the readout unit.
  • the rate of wetting is controlled and is preferably 1 ms to 10 s,
  • a precisely defined volume of sample liquid is preferably conveyed. It is also advantageous to control the temperature of the cassette in the reagent chamber and in the detection chamber by means of the temperature regulating unit during operation.
  • a great advantage of the invention is that the person performing an analysis with the new microfluidic test cassette does not have to perform any quantitative process steps of the analysis, such as exact metering of the sample volume and exact metering of the reagents.
  • the biochemical test procedure can also be carried out by persons who are not analyst experts.
  • Another advantage is that no liquids are stored in the test cassette before starting the test, only dry reagents.
  • a major advantage of the system is that no additional liquids need to be added except for the sample solution, which makes the process easy to carry out. At the end of the analysis, the sample liquid remains in the test cassette, so that no risk to the environment from toxic or infectious substances can occur. This use of the test cassette as a disposable cassette is made economically possible by a simple structure and correspondingly low production costs.
  • test cassette a device for operating the test cassette and methods for operating the test cassette in environmental analysis, the food sector, human and veterinary diagnostics and crop protection in order to qualitatively and / or quantitatively determine analytes is likewise an object of the present invention.
  • Examples of this use are the quantitative and / or qualitative determination of chemical, biochemical or biological analytes in screening methods in pharmaceutical research, combinatorial chemistry, clinical and preclinical development, for real-time binding studies and for the determination of kinetic parameters in affinity screening and in research, for qualitative and quantitative analyte determinations, in particular for DNA and RNA analysis and the determination of genomic or proteomic differences in the genome, such as single nucleotide polymorphisms, for the measurement of protein-DNA interactions, for the determination of control mechanisms for mRNA expression and for the protein (bio) synthesis, for the preparation of toxicity studies and for the determination of expression profiles, in particular for the determination of biological and chemical marker substances, such as mRNA, proteins, peptides or low-molecular organic (messenger) substances n, and for the detection of antibodies, antigens, pathogens or bacteria in pharmaceutical product research and development, human and veterinary diagnostics, agrochemical product research and development, symptomatic and presymptomatic plant diagnostics, for patient stratification in pharmaceutical product
  • Fig. 4 Construction of the test cassette - view from above at the side Fig. 5: Structure of the test cassette - view from below at the side Fig. 6: PWG biochip Fig. 7: PWG biochip side view Fig. 8: Dimensions of the PWG biochip.
  • the test cassette 1 consists of a structured body 2, in which channels and cavities are introduced. This body is at the top and bottom with a sealing film. 5 whereby it is achieved that the various cavities and channels of the structured body are sealed airtight (with the exception of the openings 3, 19 and 20).
  • test cassette according to the invention was produced in an injection molding process.
  • the body consists of a plate of black polyoxymethylene (POM), in which the channels and chambers were drilled and milled.
  • POM polyoxymethylene
  • the test cassette 1 comprises an inlet 2 for introducing a sample liquid containing the analyte to be detected into the test cassette 1, a reagent chamber 7 into which the sample liquid is conveyed via a channel 6, and a detection chamber 9 into which the analyte is conveyed via a further channel 6 is conveyed and which includes a PWG biochip 10.
  • the sample chamber 4 is round with 10 mm diameter.
  • the reagent chamber 7 is round with 8 mm diameter.
  • the detection chamber 9 is quadrangular with dimensions of 10 mm x 10 mm.
  • the channels 6 have a round cross section with a diameter of 1 mm.
  • reagent chamber 7 there are antibodies labeled with a fluorescent dye, which are specific for an analyte from the sample liquid, impregnated on a reagent pad 8.
  • the reagent pad 8 consists of "extra thick glass filter” PaIl Corporation (pore size 1 micron, typical thickness 1270 microns (50 mils), typical water flow rate 210 mL / min / cm 2 at 30 kPa), with two circular filter pieces 8 mm diameter stacked on top of each other.
  • Both the PWG biochip 10 and the reagent pad 8 are held in place between two polyolefin films in the POM plate 2, which also serve as sealing foils 5 for sealing the test cassette.
  • the foil In the region of the PWG biochip 10, the foil has a window 21 which grants free access to the measuring region of the PWG biochip 10.
  • the upper sealing foil 5 is 180 ⁇ m thick and the lower sealing foil 5 is 80 ⁇ m thick.
  • the sample liquid is introduced into the sample chamber 4 at the beginning of the test and sealed airtight with a suitable silicone lid.
  • the liquid is distributed in the sample chamber 4 and in the adjacent channels 6, which are designed such that the liquid is not drawn by capillary forces into the reagent chamber 7 or to the inlet 3.
  • a defined volume of air is introduced into the sample chamber 4 via the channel 6 at the inlet. This volume of air displaces the sample liquid so that it flows into the reagent chamber 7 and completely wets the reagent pad 8.
  • the antibodies are dissolved and enter into a specific binding with the analytes contained in the sample liquid (analyte-antibody conjugate).
  • the free binding sites of the antibodies are increasingly saturated with increasing amount of analytes in the sample liquid.
  • the sample liquid is conveyed with containing analyte antibody conjugates in a next step with a further defined puff of air into the detection chamber. 9
  • the detection chamber 9 is completely filled by the sample liquid.
  • venting of the complete duct system takes place via the vent opening (s) 20, which are applied in the upper closure film.
  • the detection chamber 9 comprises a PWG biochip 10.
  • the PWG biochip 10 is shown schematically in plan view in FIG. 6 and schematically in a side view in FIG.
  • the course or the end point of the biochemical detection reaction is detected.
  • the PWG biochip 10 in the detection chamber 9 consists for example of a 10 mm x 12 mm glass plate with a thickness of 0.7 mm (12.0 +/- 0.05 mm x 10.0 +/- 0.05 mm x 0.70 +/- 0.05 mm).
  • On one side of the chip is a 155 nm thin waveguiding layer 12 of Ta 2 O 5 (Tantalum pentoxide).
  • the measuring region of the chip comprises a central 10 mm x 6 mm square detection area. Parallel to this detection area is a 500 ⁇ m wide crescent-shaped band: the grating 11 for coupling the excitation light.
  • the positional accuracy of the grating 11 to the edges of the PWG biochip 10 is +/- 0.05 mm.
  • the grating depth is 18 nm and the grating period is 318 nm with a duty cycle of 0.5.
  • analyte-BSA conjugates are adsorptively applied / immobilized in the form of an array 15. The free areas between the analyte-BSA conjugate spots 16 and reference spots 17 are blocked with BSA 14 (passivation).
  • the analyte-antibody conjugates and optionally antibodies with free binding sites reach the immobilized analyte-BSA conjugate spots 16 on the PWG biochip 10.
  • Antibodies with free binding sites make a specific binding with the corresponding immobilized analyte BSA Conjugates.
  • the antibodies saturated with analytes in the sample liquid remain in the solution.
  • the antibodies bound to the immobilized analyte-BSA conjugates and labeled with a fluorescent dye in the evanescent field of the thin-film waveguide 12 can be excited to fluoresce.
  • the antibodies present in the solution and labeled with a fluorescent dye are not excited in this case. In this way, an indirect quantification of the analytes contained in the sample liquid is possible.
  • FIG. 9 Particular embodiments of the device according to the invention for operating the test cassette are shown in FIG. 9 without being limited thereto.
  • Fig. 9 Schematic representation of the inventive device for operating the
  • the device for operating the test cassette according to the invention has a coupling point with a support 30 for positioning the test cassette 1 according to the invention. Below the PWG biochip 10 is a window 31 in the support 30.
  • the device also has the means for conveying the sample liquid 32 in the test cassette 1 and the tempering element 33. In FIG. 9, the tempering element 33 tempered the support 30 by contact, which in turn forwards the temperature control to the test cassette 1.
  • the device according to the invention in the optical unit has a movable laser 37, and at least one CCD camera 35 for detecting the biochemical reaction in the detection chamber of the test cassette 1.
  • the optical unit also includes a movable mirror 36 and a lens with filters 34.
  • Further prisms and / or lenses for Design - in particular focus, division, redirection and orientation - of the excitation light, and a goniometer for controlling and regulating the excitation path, in particular for optimizing the coupling parameters by positioning the laser beam with respect to angle of incidence and position to the lattice structure of the PWG biochip 10, are also possible (not shown in FIG. 9). By precisely adjusting the laser beam, the intensity of the light scattered from the PWG biochip 10 is maximized.
  • the laser beam (see FIG. 9) is reflected on the PWG chip 10 of the test cartridge 1.
  • Fluorescence photons obtained by the light excitation are registered by the CCD camera 35 through the optical window 31.
  • the docking station also has a mechanical trigger that starts the reaction in the test cartridge.
  • the temperature regulation unit 33 regulates the operating temperature in the test cassette 1. It is typically turned on by the actuation of the trigger to start the cassette.
  • the test cartridge is operated at a temperature of 25 0 C +/- 2K.
  • Fig. 10 shows the influence of temperature on the dose response curve of an assay.
  • Fig. 11 shows the experimental setup for the measurement of temperature by means of "Peltier" elements, and
  • Fig. 12 shows a simulation of the cooling rate of the test cassette.
  • the means for transporting the sample liquid 32 delivers precisely defined puffs of air to the sealed test cassette. These bursts of air direct the sample liquid through the various channels 6 and cavities and perform various reaction steps there, e.g. Reconstitution of the reagents, mixing of the reagents with the sample etc.
  • test cassette 1 is sealed with a silicone lid 21, and the sample liquid conveying means 32 (a pump) presses a first volume of air into the test cassette 1
  • Air pressure conveys the sample liquid from the sample chamber 4 into the reagent chamber 7 and crosslinks the reagent pad 8. This starts the preincubation phase, during which, for B. the toxin of the sample reacts with the fluorescent antibody.
  • the preincubation time is from 2 to 5 minutes ⁇ 3 seconds depending on the reactants. Usually, a longer preincubation time produces a stronger signal.
  • FIG. 14 shows the influence of the incubation time on the dose-response curve of the assay on the basis of the mycotoxin fumonisin.
  • the means of transportation pushes the sample liquid 32, a second predefined volume of air into the test cassette 1, which leads to further transport of the sample liquid - possibly through a filter - into the channel 6 to the detection chamber 9.
  • the detection is preferably after ten minutes with a precision of ⁇ 5 seconds.
  • a laser beam is directed into the detection chamber 9 on the surface of the PWG biochip 10 and the generated fluorescence is registered by the CCD camera 35. Usually, the reaction has not reached equilibrium. The duration of each step is precisely met.
  • the analyte values are calculated and displayed by reference to a calibration curve by means of an accounting element of the control unit 38.
  • the parameters in particular volumes, times (transport and incubation times) and / or temperature are determined and the respective elements of the device are automatically controlled by the control unit 38.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Einweg-Testkassette zur qualitativen und/oder quantitativen Analyse von Analyten, beinhaltend einen strukturierten Körper, in dem Kavitäten, die miteinander durch Kanäle verbunden sind, eingebracht sind, wobei die Testkassette mindestens einen Einlass zur Einführung einer den Analyten enthaltenden Probenflüssigkeit, mindestens eine Reagenzienkammer, in der ein oder mehrere Reagenzien zur Reaktion mit dem Analyten oder zum Vermischen mit der Probenflüssigkeit untergebracht sind und mindestens eine Detektionskammer, in der ein Signal zum Nachweis oder quantitativen Analyse des Analyten detektiert wird, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden oder die Decke der Detektionskammer aus einem Signalwandler oder ein Fenster zur Detektion eines Signals besteht, die Kanäle so gestaltet sind, dass die Flüssigkeit nicht durch Kapillarkräfte bis in die Reagenzienkammer bzw. zur Öffnung gezogen werden kann und die Reagenzien in der Reagenzienkammer und gegebenenfalls weitere Reagenzien in der Detektionskammer in trockener Form untergebracht sind. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Bioassay von Analyten mittels Bio- und / oder Chemosensoren, die die erfindungsgemäße Testkassette, mindestens eine Ankopplungsstelle für die Positionierung der Testkassette, mindestens ein Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten in der Testkassette und mindestens eine Temperaturregulierungseinheit aufweist, sowie ein Verfahren zur Bedienung dieser Vorrichtung. Die erfindungsgemäße Testkassette, Vorrichtung und das Verfahren können in der Umweltanalytik, dem Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik und dem Pflanzenschutz eingesetzt werden, um Analyten qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.

Description

Einweg-Mikrofluidik-Testkassette zur Bioassay von Analyten
Die vorliegende Erfindung betrifft eine auf Mikrofluidik-Technologie basierte Einweg- Testkassette zur Bioassay von Analyten mittels Bio- und / oder Chemosensoren, eine Vorrichtung zur Bioassay von Analyten mittels Bio- und / oder Chemosensoren umfassend die erfindungsgemäße Testkassette, ein Verfahren zur Bedienung dieser Testkassette, sowie ihre Verwendung in der Umweltanalytik, dem Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik und dem Pflanzenschutz.
Als Bio- oder Chemosensoren bezeichnet man Geräte, die mit Hilfe eines Signalwandlers und einer Erkennungsreaktion einen Analyten qualitativ oder quantitativ nachweisen können. Als Erkennungsreaktion wird ganz allgemein die spezifische Bindung oder Reaktion eines sogenannten Analyten mit einem sogenannten Erkennungselement bezeichnet.
Beispiele für Erkennungsreaktionen sind die Bindung von Liganden an Komplexe, die Komplexierung von Ionen, die Bindung von Liganden an (biologische) Rezeptoren, Membranrezeptoren oder Ionenkanäle, von Antigenen oder Haptenen an Antikörper, von Substraten an Enzyme, von DNA oder RNA an bestimmte Proteine, die Hybridisierung von DNA/RNA/PNA oder die Prozessierung von Substraten durch Enzyme.
Analyten können sein: Ionen, Proteine, natürliche oder künstliche Antigene oder Haptene, Hormone, Cytokine, Mono- und Oligosaccharide, Stoffwechselprodukte oder andere biochemische Marker, die in der Diagnostik verwendet werden, Enzymsubstrate, DNA, RNA, PNA, potentielle Wirkstoffe, Medikamente, Zellen, Viren.
Beispiele für Erkennungselemente sind: natürliche oder künstliche Rezeptoren wie z. B. Komplexbildner für Metalle/Metallionen, Cyclodextrine, Kronenether, Antikörper, Antikörperfragmente, Anticaline Enzyme, DNA, RNA, PNA, DNA/RNA-bindende Proteine, Membranrezeptoren, Ionenkanäle, Zelladhäsionsproteine oder auch Ganglioside, Enzyme, Mono- oder Oligosaccharide und Haptamere.
Diese Bio- oder Chemosensoren können in der Umweltanalytik, dem Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik und dem Pflanzenschutz eingesetzt werden, um Analyten qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen. Die Spezifität der Erkennungsreaktion ermöglicht es, auch Analyten in komplexen Proben wie z. B. Umgebungsluft, verschmutztem Wasser oder Körperflüssigkeiten ohne oder nur mit geringer vorheriger Aufreinigung qualitativ oder quantitativ zu bestimmen. Zusätzlich können Bio- oder Chemosensoren auch in der (bio-) chemischen Forschung und Wirkstoffsuche eingesetzt werden, um die Interaktion zwischen zwei unterschiedlichen Substanzen zu untersuchen (z. B. zwischen Proteinen, DNA, RNA, oder biologisch aktiven Substanzen und Proteinen, DNA, RNA etc.).
Eine neue Klasse von elektrischen Biosensoren beruht auf dem Nachweis von Analyten, die durch metallische Partikel, z.B. Nanopartikel markiert sind. Zur Detektion werden diese Partikel durch autometallographische Abscheidung soweit vergrößert, dass sie einen mikrostrukturierten Stromkreis kurzschließen. Dies wird durch eine einfache Gleichstrom-Widerstandsmessung demonstriert (US 4,794,089 ; US 5,137,827 ; US 5,284,748). Die Detektion von Nukleinsäuren durch Gleichstrom-Widerstandsmessung wurde jüngst demonstriert (R. Möller, A. Csäki, J. M. Köhler, and W. Fritzsche, Langmuir 17, 5426 (2001)).
Feldeffekttransistoren können als elektronische Transducer z.B. für eine enzymatische Reaktion eingesetzt werden (Zayats et al. Biosens. & Bioelectron. 15, 671 (2000)).
Als mechanische Transducer werden Schwingquarze beschrieben, bei denen die Veränderung der Resonanzfrequenz durch Massenbelegung erfolgt (Steinern et al. Biosens. & Bioelectronics 12, 787 (1997)). In einem alternativen mechanischen Transducer werden mit Interdigitalstrukturen Oberflächenwellen angeregt, die durch Targetadsorption modifiziert werden (Howe et al., Biosens. & Bioelectron. 15, 641 (2000)).
Werden die Targetmoleküle mit magnetischen Beads markiert, so kann die Erkennungsreaktion über den magnetischen Einfluss der Beads auf den Giant Magnetic Resistance (GMR) eines entsprechenden Widerstands detektiert werden (Baselt et al. Biosens. and Bioelectron. 13, 731 (1998)).
Die Integration der Erkennungsreaktion mit dem Signalwandler zu einem Bio- oder Chemosensor kann geschehen, indem man das Erkennungselement oder den Analyten auf der Oberfläche des Signalwandlers immobilisiert. Durch die Erkennungsreaktion, d. h. das Binden oder die Reaktion des Analyten mit dem Erkennungselement, ändern sich die optischen Eigenschaften des Mediums direkt an der Oberfläche des Signalwandlers (z. B. Änderung des optischen Brechungsindexes, der Absorption, der Fluoreszenz, der Phosphoreszenz, der Lumineszenz etc.), was vom Signalwandler in ein Messsignal übersetzt wird.
Optische (planare) Wellenleiter sind eine Klasse von Signalwandlern, mit denen man die Änderung der optischen Eigenschaften eines Mediums detektieren kann, das an eine wellenleitende Schicht, typischerweise ein Dielektrikum, grenzt. Wird Licht als geführte Mode in der wellenleitenden Schicht transportiert, fällt das Lichtfeld an der Grenzfläche Medium/Wellenleiter nicht abrupt ab, sondern klingt in dem an den Wellenleiter angrenzenden sogenannten Detektionsmedium exponentiell ab. Dieses exponentiell abfallende Lichtfeld wird als evaneszentes Feld bezeichnet. Werden sehr dünne Wellenleiter verwendet, deren Brechungsindex möglichst stark von dem des angrenzenden Mediums differiert, werden Abfalllängen des evaneszenten Feldes (Intensität fällt auf den Wert 1/e ab) von < 200 nm erreicht. Ändern sich die optischen Eigenschaften des an den Wellenleiter grenzenden Mediums - z. B. durch Änderung des optischen Brechungsindexes (US 4 815 843; US 5 442 169) oder der Lumineszenz (US 5 959 292; EP 0 759 159; WO 96/35940) - innerhalb des evaneszenten Feldes, kann dies über einen geeigneten Messaufbau detektiert werden. Entscheidend für die Verwendung von Wellenleitern als Signalwandler in Bio- oder Chemosensoren ist dabei, dass die Änderung der optischen Eigenschaften des Mediums nur sehr nahe an der Oberfläche des Wellenleiters detektiert wird. Wird nämlich das Erkennungselement oder der Analyt an der Grenzfläche des Wellenleiters immobilisiert, kann das Binden an das Erkennungselement oder die Reaktion des Erkennungselementes oberflächensensitiv detektiert werden, wenn sich dabei die optischen Eigenschaften des Detektionsmediums (flüssig, fest, gasförmig) an der Grenzfläche zum Wellenleiter ändern.
Um die Bedienung von Chemo- bzw. Biosensoren zu vereinfachen, wird schon seit einigen Jahren versucht, diese Geräte zu verkleinern und möglichst alle Reagenzien, die zur qualitativen und / oder quantitativen Bestimmung einer Probe benötigt werden, in einer sogenannten Testkassette „ready— to-use" fertig zu stellen. Insbesondere wird die Mikrofluidik-Technologie eingesetzt und dabei angestrebt, kostengünstige, lagerfähige und einfach zu bedienende Einweg-Kassetten zur Verfügung zu stellen, die zeitecht reproduzierbare Ergebnisse liefern können.
Bekannte Herausforderungen eines Mikrofluidsystems sind, dass:
das Mischen des Analyten mit dem Detektionreagenzen zur Detektion wegen der nicht genau kontrollierbaren Laminarströmungen nicht optimal verläuft,
der laminare Fluss durch unterschiedliche Oberflächeneigenschaften beeinflusst wird, die bei der Herstellung und Lagerung einer Testkassette schwer kontrollierbar sind, wie z.B.
Oberflächenladung, Verschmutzung, Hydrophobie, Benetzung etc.
Luftblasen sich bei der Beförderung der Flüssigkeit bilden können,
die Flüsse und insbesondere deren Volumen und Geschwindigkeit nicht genau kontrollierbar sind,
- eine genaue zeitliche Kontrolle der einzelnen Reaktionsschritte in dem Lateral Flow nicht möglich ist. Z. B. beschreibt DE102005011530 eine mikrofluidische Vorrichtung zum Echtzeit-quantitativen Bestimmen einer sehr kleinen Menge von Analyten. Die Echtzeitauswertung wird dadurch erreicht, dass die Probe in eine Detektionseinheit fließt. Die Detektionseinheit besteht aus einem Fließkanal, in dem Analytenfängereinheiten zum Fangen des Analyten z. B. Antikörper auf einer Vielzahl von Analytdetektionseinheiten entlang des Fließkanals immobilisiert sind. Das quantitative Bestimmen des Analyten erfolgt z. B. mittels eines optischen Signals. Die Analytenprobe wird z. B. mit einer Mikropumpe in den Fließkanal befördert. Ziel der o. g. Vorrichtung ist, die Anzahl von Analyten, die durch die Analytenfängereinheit in der Richtung des Fließens gefangen werden, zu optimieren. Die Analyten werden über einen breiten Bereich (die Länge des Fließkanals) quantitativ bestimmt, ohne die Detektionsempfindlichkeit zu verringern. Diese Vorrichtung besteht aus einer Vielzahl von mikroskopischen Bestandteilen auf der Basis der Halbleitertechnologien oder mikroskopischen Präzisionsvorrichtungen — Mikropumpen, Mikroventilen, Sensoren und dergleichen, die miniaturisiert, akkumuliert und integriert sind. Die Herstellung und der Betrieb dieser Vorrichtung ist aber zu kompliziert und zu teuer für eine mögliche Anwendung als Einweg-Testassay.
WO2005/070533 beschreibt eine mikrofluidische Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probenflüssigkeit mit einem strukturierten Körper, der Kammersysteme verbunden mit Kanalsysteme, ggf. mit eingebauten Filtereinheiten mit einem Einlass und einem Auslass, aufweist und der auf mindestens einer Seite mit einer Verschlussschicht verschlossen ist. Diese Vorrichtung weist eine Reaktionskammer auf, die Reagenzien zur Bindung zu mindestens einer Komponente der Probenflüssigkeit enthält, die entweder auf dem Deckel der Kammer oder auf beschichteten Partikeln immobilisiert sind. Eine Probekammer wird durch den Einlass mit der Probenflüssigkeit befüllt und der Einlass wird mittels eines Deckels abgeschlossen. Die Probenflüssigkeit wird mittels einer Pumpe von der Probekammer durch ein Kanalsystem in die Reaktionskammer befördert. Die Vorrichtung verfügt über weitere Kanalsysteme, die eine Labelflüssigkeit und eine Waschflüssigkeit enthalten, und ein Abfuhrkanalsystem zur Evakuierung von Abfallflüssigkeiten. Verschiedene Teile der komplexen Kanalsysteme können mittels weicher Dichtungen verschlossen werden, die sich unter geringem Druck nach Bedarf aufbrechen lassen. Die Flussrichtung in der Vorrichtung wird mittels Ventile und bürstenähnlicher oder ventilähnlicher Flussdioden sichergestellt. Nach der Reaktion der Reaktionskammer mit dem Bindungsreagenz wird die Labelflüssigkeit der Reaktionskammer zugefügt und die nicht- immobilisierten Anteile der Probenflüssigkeiten mittels Waschflüssigkeit abgewaschen. Die Detektion der Reaktion erfolgt durch Bemessung eines optischen oder magnetischen Signals in der Reaktionskammer. Optische Signale werden durch den Deckel der Reaktionskammer gemessen. Die o.g. Verschlussschicht bildet den Deckel der Reaktionskammer und ist entsprechend transparent. Die Vorrichtung ermöglicht eine genaue Kontrolle der Volumen und Reaktionszeiten. Der Aufbau dieser Vorrichtung erfordert aber mehrere Vorgänge in der Reaktionskammer bevor bemessen werden kann und ist entsprechend aufwändig. Durch die verwendeten fluidischen Elemente wird die Vorrichtung sehr komplex, was sich in Störanfälligkeit und hohen Produktionskosten niederschlägt. Die Nutzung von fluidischen Elementen verringert außerdem die Lagerfähigkeit der Vorrichtung.
Zur Lagerfähigkeit und Transportierbarkeit von Kassetten wird im Stand der Technik insbesondere die Trocken-Assay-Technologie eingesetzt, bei der alle Reagenzien im trockenen Zustand in der Kassette ggf. in getrennten Kammern bereit stehen. Die Probenflüssigkeit wird üblicherweise mittels mikrofluidischer Kanäle von einer Kammer in die nächste weiterbefördert.
WO 2005/088300 beschreibt eine integrierte mikrofluidische Testkassette zur Blutanalyse, die aus einem unteren und einem oberen Körperteil besteht. Beide Elemente werden mit Kammern und Kanälen strukturiert, die durch das Zusammenfügen der beiden Teile geschlossen werden. Die Testkassette weist ein oder mehrere Vorbehandlungselemente (Vorbehandlungskammer oder - kanäle) zur Vorbereitung einer Probe, eine oder mehrere mehrschichtige Trocken-Assay-Elemente (Detektionskammer) zur Erkennung einer oder mehrerer Analyten der Probe und ein oder mehrere Kanäle (Durchschnitt <= 3mm), die die Vorbehandlungselemente mit den mehrschichtigen Trocken-Assay-Elementen verbinden, auf. Die Vorbehandlungselemente sind insbesondere Filterelemente oder Elemente mit porösen Eigenschaften in Form eines Kanals oder eines (Mikro/Nano)-Kissens, die ggf. trockene Reagenzien tragen. Die Probe wird zuerst durch die Vorbehandlungselemente, dann in das mehrschichtige Trocken-Assay-Element geführt. Das mehrschichtige Trocken-Assay-Erkennungselement weist mindestens eine funktionelle Schicht, die Erkennungselemente für einen qualitativen und quantitativen Assay in trockener und stabiler Form trägt, auf. Diese Reagenzschicht besteht aus einer wasserabsorbierenden Schicht, in der anregbare Erkennnungselemente einigermaßen regelmäßig in einem hydrophilischen Polymerbindematerial (Gelatin, Agarose, usw.) verteilt sind. Die Detektion erfolgt durch Reflektionsphotometrie durch ein Licht-durchsichtiges Fenster, durch Einstrahlen einer Detektionsschicht im mehrschichtigen Trocken-Assay-Element, in der die optisch anregbare Flüssigkeit aus der Erkennungsreaktion diffundiert ist. Zur Beförderung der Probe werden z. B. kapillarische Kräfte oder Druck verwendet. Nachteil dieser Vorrichtung ist, dass der Aufbau des mehrschichtigen Trocken-Assay-Elements aufwändig ist. Eine genaue Kontrolle der Volumen, des Vermischens und der Inkubationzeiten ist nicht möglich, so dass die Testergebnisse quantitativ nicht reproduzierbar sind.
Sowohl in WO 2005/088300 als in WO2005/070533 wird die Kassette in eine Vorrichtung zur Bedienung der Kassette eingeführt, die eine Lichtquelle zur Einstrahlung der Reaktionskammer, einen Filter zur Konzentration des Signals aus der Reaktionskammer und eine Detektionseinheit aufweist.
Lateral Flow Assays (LFA) sind schon seit vielen Jahren für die biochemische Analyse bekannt. Lateral Flow Assays (LFA) nutzen den Effekt der Antikörper-Antigen Reaktion aus. Zusätzlich wird die zu analysierende Probe (Lösung) durch Kapillärkräfte über die Sensoroberfläche gezogen. Zum Nachweis von Analyten mittels LFA kann beispielsweise ein direkter, kompetitiver Immunoassay auf einem Nitrozellulosestreifen ausgeführt werden, wobei die zu analysierende Probe aufgrund von Kapillarkräften durch den gesamten Nitrozellulosestreifen durchgezogen wird. Die Zone, in der der Anti-Analyt-Antikörper immobilisiert wurde, dient als Detektionszone für den Streifentest. Ein Beispiel für einen LFA-Assay zum Nachweis von Mykotoxinen (z.B. Deoxynivalenol) ist der "Reveal-Assay" (Testkassette) der Firma Neogen, Lansing, MI, USA mit dem dazugehörigen Auslesegerät "AccuScan". Die Testkassette wird in das Auslesegerät eingeführt und das Gerät nimmt ein Bild des Ergebnisbereichs des Streifentests. Das Auslesegerät interpretiert das Ergebnisbild und wenn eine Linie erkannt wird, wird eine Bewertung abgegeben. Das Gerät eliminiert die Subjektivität der Interpretation und gibt eine objektive, nachvollziehbare Dokumentation des Testergebnisses. Der beschriebene Test ist einfach und relativ schnell durchzuführen und kommt ohne aufwändige Auslesegeräte aus. Nachteilig ist, dass das Verfahren nur einen qualitativen Mykotoxin-Nachweis erlaubt.
Aus dem Stand der Technik bestand Bedarf nach einem kostengünstigen, lagerfähigen und einfach zu bedienenden Mittel zur Durchführung von biochemischen Testverfahren zur Bioanalytik, Umweltanalytik, Agrodiagnostik, dem Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik und dem Pflanzenschutz, um Analyten qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine reproduzierbare quantitative Echtzeitbestimmung mittels einer einfachen Vorrichtung, mit einfachem Handling zu ermöglichen. Hierfür sollte die vorliegende Erfindung die Kontrolle der Reaktionsbedingungen, insbesondere Volumen und Zeiten, aber am Besten auch ein optimales Vermischen und die Kontrolle der Betriebstemperatur ermöglichen.
Diese Aufgabe wird erfϊndungsgemäß durch eine mikrofluidische Testkassette zur qualitative und/oder quantitativen Analyse von Analyten, die alle für die Durchführung des Testverfahrens benötigten Reagenzien in trockener Form beinhaltet, gelöst. Die erfindungsgemäße Testkassette weist einen strukturierten Körper auf, in den Kavitäten, die miteinander durch Kanäle verbunden sind, eingebracht wurden. Erfindungsgemäß weist die Testkassette mindestens einen Einlass zur Einführung einer Analyten enthaltenden Probenflüssigkeit, mindestens eine Reagenzienkammer, in der ein oder mehrere Reagenzien zur Reaktion mit dem Analyten oder zum Vermischen mit der Probenflüssigkeit untergebracht sind, und mindestens eine Detektionskammer auf, in der ein Signal zum Nachweis oder quantitativen Analyse des Analyten detektiert wird, und ist dadurch gekennzeichnet, dass:
der Boden oder die Decke der Detektionskammer ein Signalwandler oder ein Fenster zur Detektion eines Signals ist,
- die Kanäle so gestaltet sind, dass die Probenflüssigkeit nicht durch Kapillarkräfte bis in die Kammer bzw. zur Öffnung gezogen wird,
die Reagenzien in der Reagenzienkammer und gegebenenfalls weitere Reagenzien in der Detektionskammer in trockener Form untergebracht sind.
Im Sinne der Erfindung wird in den Kanälen und in den Kammern ein präzise definiertes Volumen Probenflüssigkeit befördert, was durch die Gestaltung der Kanäle und den Einsatz eines geeigneten Mittels zur Beförderung der Probenflüssigkeit ermöglicht wird. Dabei können Reaktionszeiten ebenfalls genau kontrolliert werden, was zur besseren Reproduzierbarkeit der Analyse beiträgt. Durch das passende Design der Kammer und der Kanäle wird ein optimales Flussprofil mit reduziertem Totvolumen und optimalen Kontakt mit den ggf. vorhandenen immobilisierten Detektionreagenzien gewährleistet. In den Kammern werden verschiedene Reaktionsschritte, wie z.B. Rekonstitution der Reagenzien, Vermischung der Reagenzien mit der Probenflüssigkeit, Reaktion zwischen Reagenzien und Analyten, durchgeführt. Bei der vorliegenden Erfindung erfolgt der Detektionsschritt direkt nach einer Erkennungsreaktion ohne vorherigen Waschgang, was den Aufbau der Kassette und deren Handling weiter vereinfacht.
Der Körper kann transparent oder lichtdicht sein und aus verschiedenen Polymermaterialien wie z. B. Polyoxymethylen (POM), Polymethymethacrylat (PMMA), Polystyren (PS), Polypropylen (PP), Polyamid, Polycyclic olefine, Polycarbonate, Polyethylen (PE), Polyethylenterephtalate (PET), Polydimethylsiloxane (PDMS), natürlichem Kautschuk oder Derivate davon, Polyurethane, Teflon oder Analoga oder verschiedenen anorganischen Werkstoffen, wie z.B. Glas, Quartz, Silizium bestehen. Bevorzugt ist die Verwendung von POM und Polyamid. Hergestellt werden die Körper mit bekannten Verfahren, wie z.B. maschinelle Bearbeitung (Fräsen etc.), Spritzguss, Prägetechniken oder bei Glas/anorg. Materialien durch Photolithographie/Ätzen oder anderen bekannten Verfahren.
Die Form und Größe der Testkassette kann beliebig sein, solange das Gesamtvolumen der Testkassette gering bleibt und sie einfach zu handhaben ist. Vorzugsweise werden in den Körper die Kammer und die Kanäle eingearbeitet und auf mindestens einer Seite mittels einer Verschlusseinheit mit Ausnahme des Einlasses und üblicherweise von optionalen Luftöffnungen und / oder einer Probekammer verschlossen.
Es ist vorteilhaft, die Temperatur in der Reagenzienkammer und in der Detektionskammer während des Betriebs der Testkassette zu kontrollieren.
Hierfür ist vorzugsweise die Testkassette so aufgebaut, dass sie per Kontakt mit temperierbaren Elementen temperiert werden kann.
Vorzugsweise ist das Design der Testkassette so gestaltet, dass die optionale Probenkammer, die Reagenzienkammer und die Detektionskammer nach der Unterseite des Körpers gerichtet sind. Der Signalwandler oder das Fenster zur Detektion bilden dann vorzugsweise den Boden der Detektionskammer. Vorzugsweise wird diese Seite der Kassette mit einer dünnen Verschlusseinheit, insbesondere eine Verschlussfolie verschlossen. Die Verschlusseinheit kann lichtdicht oder transparent sein. Wenn man die Kassette auf eine temperierte Oberfläche legt, kann so ein schneller Temperaturausgleich zwischen temperierter Unterlage und der Probenlösung in den Kammern stattfinden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Testkassette ist die Verschlusseinheit eine Verschlussfolie von 30 μm bis 1000 μm, bevorzugt 50 μm bis 500 μm, dick. Es ist dabei vorteilhaft, wenn die Verschlussfolie straff über den Körper befestigt werden kann und sich nicht biegen kann. Beispielsweise können Polyolefinfolien oder Folien aus Polymethylmethacrylate (PMMA) als Verschlussfolien verwendet werden.
In einer besonderen Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Verschlusseinheit auf der oberen und unteren Seite der Testkassette aufgebracht. Dies vereinfacht die Herstellung der erfindungsgemäßen Testkassette. Die oberen und unteren Verschlussfolien können gleich oder unterschiedlich dick sein.
Die Verschlusseinheiten können mit den im Stand der Technik üblichen Bindungstechniken auf dem Körper befestigt werden, wie z. B. Schweißen oder Kleben ggf. mit Hilfe von Klebstoff.
Im Sinne der Erfindung wird in den Kammern ein präzise definiertes Volumen Flüssigkeit für eine bestimmte Zeit aufgehalten und nach dieser Zeit weiterbefördert.
In der erfindungsgemäßen Testkassette werden üblicherweise von 1 bis 1000 μl, bevorzugt 10 bis 500 μl, besonders bevorzugt 10 bis 250 μl befördert. Die Form der Kammer kann beliebig sein. Bevorzugt werden viereckige Detektionskammern und / oder runde Reagenzienkammern.
Die Volumen der Kammern betragen üblicherweise 1 bis 1000 μl, bevorzugt 10 bis 500 μl.
Die Probenkammer ist typischerweise rund mit vorzugsweise 5 bis 15 mm, bevorzugt 8 bis 12 mm Durchmesser. Die Reagenzienkammer ist üblicherweise rund mit vorzugsweise 5 bis 15 mm, bevorzugt 5 bis 10 mm Durchmesser. Beide Kammern können ein Flüssigkeitsvolumen von 1 bis 1000 μl aufnehmen.
Die Detektionskammer ist üblicherweise viereckig mit Dimensionen von vorzugsweise 5 bis 15 mm breit und 5 bis 15 mm lang, besonders bevorzugt 10 mm x 10mm und nimmt typischerweise ein Flüssigkeitsvolumen von 1 bis 1000 μl auf, wobei sie erfindungsgemäß von der Flüssigkeit vollständig gefüllt werden muss.
Der Aufbau der Probenkammer, Reagenzienkammer und Detektionskammer soll ein optimales Flussprofil mit reduziertem Totvolumen und optimalem Kontakt mit den ggf. vorhandenen immobilisierten Detektionreagenzien gewährleisten.
Die Kanäle können gerade oder gebogen, bevorzugt gerade mit eckigen Wendungen sein.
Hierdurch können relativ lange Kanäle in die begrenzte Fläche der Kassette eingebracht werden.
Die Form des Kanalsquerschnitts ist beliebig, üblicherweise rund oder viereckig, bevorzugt rund.
Die Querschnittsgrößen der Kanäle können gleich oder unterschiedlich sein; bevorzugt werden
Kanäle gleicher Größe üblicherweise von 0,2 bis 3 mm, bevorzugt 0,5 bis 1,5 mm Querschnitt oder Durchmesser. Die Länge der Kanäle beträgt üblicherweise 5 mm bis 1000 mm, bevorzugt 5 mm bis 500 mm.
Bei der vorliegenden Erfindung werden Flüssigkeiten mit Hilfe eines Mittels zur zeitlich und volumenmäßig genau definierten Beförderung der Probenflüssigkeiten befördert. Vorzugsweise werden vordefinierte Flüssigkeitsvolumen von einer in die nächste Kammer gedrückt.
Das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten ist Teil einer Vorrichtung zur Bedienung der erfindungsgemäßen Testkassette, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Insbesondere wird das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten in eine Ankopplungsstelle zum Einbringen der Testkassette in die o. g. Vorrichtung integriert.
Vorzugsweise erfolgt das Handling von Flüssigkeiten nur in der erfindungsgemäßen Testkassette, so dass die o. g. Vorrichtung mit Probenflüssigkeit bzw. Reagenzien nicht in Kontakt tritt. Üblicherweise werden über das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten zeitlich und volumenmäßig genau definierte Luftstöße in die Testkassette gegeben. Durch diese Luftstöße wird die Probenflüssigkeit durch die verschiedenen Kanäle und Kavitäten geleitet.
Die zu analysierende Probenflüssigkeit wird in die Testkassette durch den Einlass vorzugsweise in eine Probenkammer eingebracht. Die Testkassette wird daraufhin üblicherweise mittels eines oder mehrerer Deckel luftdicht verschlossen. Die Deckel können aus polymeren oder anorganischen Werkstoffen sein, die über verschiedene Techniken, wie z.B. Kleben, Schweißen, Laminieren etc. mit dem Körper luftdicht verbunden werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Testkassette werden die Reagenzien in der Reagenzienkammer in einem faserartigen oder porösen Material z. B. feinen Partikeln oder Gewebe, in Form eines Reagenzien-Pads, in das Reagenzien (adsorbiert auf, fixiert auf, dispergiert in, eingetrocknet in) untergebracht wurden.
Das Reagenzien-Pad wird so ausgewählt, dass es die Anforderungen der Detektionskammer bezüglich des geforderten Flüssigkeitsvolumens der überstehenden Lösung und der Konzentration der Einzelkomponenten in dieser Lösung erfüllt.
Ein bevorzugtes Reagenzien-Pad besteht aus Glas oder Polymeren wie z. B. Zellulose. Geeignet sind Reagenzien-Pads, die auch in sog. Lateral Flow Tests verwendet werden und in verschiedenen Formen kommerziell erhältlich sind. Zum Befullen dieser Reagenzienkammer wird beispielsweise das „extra thick glass filter" der Firma PaIl Corporation (Porengröße 1 μm, typische Dicke 1270 μm (50 mils), typisches Wasser Flussrate 210 mL/min/cm2 bei 30 kPa) ausgewählt, wobei zwei kreisrunde Filterstücke mit einem passenden Durchmesser übereinander gestapelt werden.
Die Reagenzien der Reagenzienkammer sind typischerweise:
markierte oder unmarkierte Erkennungselemente, die in Erkennungsreaktion eingesetzt werden, insbesondere natürliche oder künstliche Rezeptoren wie z. B. Komplexbildner für Metalle/Metallionen, Cyclodextrine, Kronenether, Antikörper, Antikörperfragmente,
Anticaline Enzyme, DNA, RNA, PNA, DNA/RNA-bindende Proteine, Membranrezeptoren, Ionenkanäle, Zeiladhäsionsproteine oder auch Ganglioside, Enzyme, Mono- oder Oligosaccharide und Haptamere und / oder
markierte oder unmarkierte Analyten wie z. B. Ionen, Proteine, natürliche oder künstliche Antigene oder Haptene, Hormone, Cytokine, Mono- und Oligosaccharide,
Stoffwechselprodukte oder andere biochemische Marker, die in der Diagnostik verwendet werden, Enzymsubstrate, DNA, RNA, PNA, potentielle Wirkstoffe, Medikamente, Zellen, Viren.
Insbesondere werden markierte Antikörper als Erkennungselemente verwendet.
Bei Bedarf werden Cofaktoren oder weitere Chemikalien, die zur Reaktion eines Erkennungs- elements mit einem Analyten erforderlich oder vorteilhaft sind, ebenfalls in der Reagenzienkammer untergebracht.
Optional enthält die Reagenzienkammer außerdem Hilfsstoffe zur Unterdrückung von unspezifi- schen Wechselwirkungen zwischen den Reagenzien, zur Unterstützung der Imprägnierung oder des Auslösens der Reagenzien aus dem Reagenzien-Pad, wie z. B. oberflächenaktiven Substanzen wie Tenside, Lipide, Biopolymere, Polyethylenglycol, Biomoleküle, Proteine, Peptide.
Vorzugsweise werden die Reagenzien in vordefinierten Konzentrationen aufgebracht und die Reproduzierbarkeit ihrer Freisetzung beim Betrieb der Kassette gewährleistet.
Das Reagenzien-Pad wird üblicherweise mit ca. 50 bis 500 μl einer Lösung imprägniert, die die Reagenzien in Konzentrationen von 10"3 M bis 10"15 M, bevorzugt nanomolare Konzentrationen, sowie üblicherweise Hilfsstoffe in Mengen von 15 Gew. % bis 0,1 ppb enthält. Die Imprägnierung erfolgt z.B. durch Eintrocknen oder Lyophilisieren.
Das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten verdrängt die Probenflüssigkeit, so dass sie in die Reagenzienkammer strömt und das Reagenzien-Pad komplett benetzt.
Durch Einleitung der Analyten enthaltenden Probenflüssigkeit in die Reagenzienkammer werden die Reagenzien gelöst und gehen mit den Analyten eine Reaktion ein oder werden mit der Probenflüssigkeit perfekt durchmischt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass durch eine schnelle - üblicherweise von 1 ms bis 10 s, bevorzugt ca. 500 ms bis 5, besonders bevorzugt I s - Benetzung des Reagenzien-Pads mit einem definierten Probenvolumen (durch den definierten Luftstoß) die Reagenzien sowohl gelöst (rekonstituiert) und optimal mit der Probenflüssigkeit durchmischt werden, als auch die Konzentration der Reagenzien in der Probenflüssigkeit sehr reproduzierbar eingestellt wird. Dadurch wird es möglich, eine quantitative Bestimmung der Analyten im Probenvolumen vorzunehmen. Nach der Benetzung des Reagenzien-Pads kann eine definierte Zeit (Präinkubationszeit) gewartet werden, z.B. bis eine biochemische Reaktion abgeschlossen ist oder bis eine bestimmte Reaktionstemperatur erreicht ist. Mit einem weiteren definierten Luftstoß wird das Probenvolumen mit den gelösten Reagenzien über einen Kanal weiter in die Detektionskammer transportiert.
Vorzugsweise wird die Probenflüssigkeit in der Testkassette vor der Reagenzienkammer filtriert und von Zellen, Blutbestandteilen oder sonstigen biologischen, organischen oder anorganischen Partikeln befreit. Zu diesem Zweck können eine oder mehrere Filtereinheiten z. B. aus Glasfaser oder porösem Material in Form eines (Mikro)-Kissens oder Kanals, ein Glasfϊlterpapier oder eine Membrane in der Testkassette eingebaut werden. Die Filtereinheit kann vorzugsweise Partikel von 0,2 bis 100 μm bevorzugt 0,5 bis 15 μm von der Probenflüssigkeit abtrennen.
Vorzugsweise findet die Entlüftung des kompletten Kanalsystems über Entlüftungsöffnung(en) statt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Detektion über einen Signalwandler (Sensorplattform, Biochip), der in der Detektionskammer als Boden eingebaut ist. In diesem Fall wird die Verschlusseinheit über die komplette untere Seite der Kassette mit Ausnahme der Detektionskammer aufgebracht.
Auf der Oberfläche des Signalwandlers sind üblicherweise ein oder mehrere voneinander getrennte Messbereiche definiert, an denen ein oder mehrere weitere Bindungspartner zum Nachweis des Analyten in der Probe immobilisiert sind. In der Detektionskammer findet eine biochemische Reaktion zwischen immobilisierten Bindungspartner und Analyten an der Oberfläche des Biochips statt. Die markierten Reaktionspartner werden in der Detektionskammer angeregt, das erzeugte Signal wird detektiert und verwendet, um die Analyten zu quantifizieren.
Zur Detektion können verschiedene Biochips, wie z.B. Surface Plasmon Resonanz, Planare Wellenleiter, Quarz Mikro Waage, Elektrolumineszenz, verwendet werden und verschiedene Verfahren, z. B. Bemessung der Brechungsindexänderungen durch die Bindung an die Oberfläche des Biochips, benutzt werden (siehe z. B. WO02/20873 und EP1316594).
Reaktionen in der Detektionskammer sind beispielsweise:
• direkte Bindung eines (detektierbaren) Analyten an den immobilisierten Bindungspartner (Erkennungselement);
• direkte Bindung des Analyten an den immobilisierten Bindungspartner (Erkennungselement) und Markierung des Analyten durch ein zweites oder mehrere Reagenzien aus der Reaktionslösung, das optisch oder elektrisch detektiert werden kann (Sandwich Assay); • Bindung eines detektierbaren Reagenz an den immobilisierten Bindungspartner
(Erkennungselement), das in Kompetition mit dem Analyten in der Lösung steht (kompetitiver Assay).
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Testkassette wird ein planarer Dünnschichtwellenleiter als Biochip verwendet, welcher eine erste optisch transparente
Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als
Schicht (a) aufweist. Wobei ein oder mehrere Einkoppelelemente in der ersten optischen Schicht
(a) oder in der zweiten optischen Schicht (b) senkrecht zum Pfad eines Anregungslichts orientiert eingebracht.Wobei das Anregungslicht in dem Dünnschichtwellenleiter über das eine oder mehrere Einkoppelelemente eingekoppelt und optional über eine oder mehrere Auskoppelelemente ausgekoppelt wird.
Bevorzugt werden erfindungsgemäß als Einkoppelelemente Gitterstrukturen gleicher Periode und / oder Modulationstiefe eingesetzt.
Vorzugsweise werden auf der Oberfläche der Sensorplattform ein oder mehrere Reaktionspartner zum Nachweis der Analyten direkt durch physikalische Absorption oder elektrostatische Wechselwirkung alternativ mittels einer optischen transparenten Haftvermittlungsschicht immobilisiert. Vorzugsweise werden die Bindungspartner selektiv in räumlich getrennte Messbereiche auf der Oberfläche der Sensorplattform aufgebracht und die Fläche zwischen den Messbereichen passiviert, um unspezifische Bindungen zu unterdrücken.
Zur Aufbringung der Bindungspartner selektiv in räumlich getrennte Messbereiche auf die Oberfläche der Sensorplattform, können ein oder mehrere Verfahren verwendet werden aus der Gruppe gebildet von Ink jet Spotting, mechanischem Spotting mittels Stift oder Feder, micro contact printing, fluidische Kontaktierung der Messbereiche mit den biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselementen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen.
Verschiedene Ausführungsformen der Sensorplattform und entsprechende Nachweisverfahren sind beispielsweise in WO95/33197, WO95/33198, WO97/373211 oder WO200113096 beschrieben. Die verschiedenen Ausführungsformen der Sensorplattform und entsprechende Nachweisverfahren werden hiermit per Referenz integriert.
In einer besonderen Ausführungsform der Testkassette werden in der Reagenzienkammer bindungsspezifϊsche detektierbare Erkennungselemente für ein oder mehrere Analyten der Probenflüssigkeit in vordefϊnierten Konzentrationen bereitgestellt. Durch Einleitung der Analyten enthaltenden Probenflüssigkeit in die Reagenzienkammer werden die Erkennungselemente gelöst und gehen mit den in dem Analyten eine spezifische Bindung ein (Analyten-Erkennungselement- Konjugat). Dabei werden die freien Bindungsstellen der Erkennungselemente mit zunehmender Menge an Analyten in der Probeflüssigkeit zunehmend gesättigt.
Durch einen weiteren Luftstoß gelangen die Analyten-Erkennungselement-Konjugate und ggf. Erkennungselemente mit freien Bindungsstellen zu immobilisierten Bindungspartnern, z. B. Analyten-Protein-Konjugaten, insbesondere Analyten-BSA-Konjugaten, auf den Signalwandler. Erkennungselemente mit freien Bindungsstellen gehen eine spezifische Bindung mit den entsprechenden immobilisierten Analyten-Protein-Konjugaten ein.
Je mehr detektierbare Erkennungselemente mit freien Bindungsstellen in der Lösung vorhanden sind, das heißt je geringer der Anteil des korrespondierenden Analyten in der Probenflüssigkeit ist, desto mehr detektierbare Erkennungselemente werden auf dem Chip gebunden. Die mit Analyten gesättigten Erkennungselemente aus der Probenflüssigkeit verbleiben in der Lösung. Durch Einkoppelung elektromagnetischer Strahlung in den Biochip können die an den immobilisierten Analyt-Protein-Konjugaten gebundenen und markierten Erkennungselemente im evaneszenten Feld des Wellenleiters angeregt werden. Die in der Lösung befindlichen markierten Erkennungselemente werden hierbei nicht angeregt. Auf diese Weise ist eine indirekte Quantifizierung der in der Probenflüssigkeit enthaltenden Analyten möglich.
Kombinationen von detektierbaren Erkennungselementen und immobilisierten Bindungspartnern zum Nachweis von Mykotoxinen werden in WO2007/079893 beschrieben, dessen Inhalt per Referenz in der Beschreibung eingeführt wird.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Testkassette weist die Detektionsskammer als Boden ein transparentes Fenster auf, durch das die biochemische Reaktion, die in der Detektionskammer abläuft, detektiert werden kann. Das transparente Fenster kann durch die Verschlussfolie, die in diesem Fall transparent sein muss und z. B. aus polymethylmethacrylate (PMMA) besteht, gebildet werden oder ein selbständiges Element darstellen. In diesem Fall besteht das Fenster bevorzugt aus Glas oder aus einem Kunststoff, das für das verwendete Licht transparent ist, und wird mittels der Verschlusseinheit mit Ausnahme der Detektionskammer auf die Seite der Testkassette befestigt.
In dieser Ausführungsform werden Reagenzien vorzugsweise nur in der Reagenzienkammer untergebracht, in der das Vermischen mit der Probenflüssigkeit vor der Beförderung in die Detektionskammer stattfindet. Üblicherweise wird ein Reagenz in der Lösung abhängig von der Konzentration des zu bestimmenden Analyten so umgesetzt, dass es seine spektralen Eigenschaften - z.B. Absorption, Lumineszenz, Fluoreszenz usw. - ändert, die optisch detektiert werden können. Alternativ wird ein Nachweisreagenz in der Lösung abhängig von der Konzentration des zu bestimmenden Analyten an ein weiteres Reagenz oder an den Analyten selbst gebunden, so dass das Nachweisreagenz seine spektralen Eigenschaften - z.B. Absorption, Lumineszenz, Fluoreszenz, Elektrolumineszenz, elektrische Kapazität, usw. - ändert, die optisch detektiert werden können.
In einer weiteren Ausfϊihrungsform befinden sich in der Detektionskammer ein oder mehrere Signalwandler, durch den die biochemische Reaktion, die in der Detektionsskammer abläuft, detektiert werden kann. In dieser Ausfuhrungsform kann das Fenster transparent oder lichtdicht sein. Die Reagenzien werden hier ebenfalls vorzugsweise nur in der Reagenzienkammer untergebracht, in der das Vermischen mit der Probenflüssigkeit vor der Beförderung in die Detektionskammer stattfindet.
In diesem Fall kann ein Reagenz in der Lösung abhängig von der Konzentration des zu bestimmenden Analyten so umgesetzt werden, dass es seine Materialeigenschaften - z.B.
Absorption, Lumineszenz, Fluoreszenz, Elektrolumineszenz, Kapazität, Leitfähigkeit, pH, Masse usw. - ändert, die durch den Signalwandler detektiert werden können. Alternativ wird ein
Nachweisreagenz in der Lösung abhängig von der Konzentration des zu bestimmenden Analyten an ein weiteres Reagenz oder an den Analyten selbst gebunden, so dass das Nachweisreagenz seine Materialeigenschaften - wie z. B. Absorption, Lumineszenz, Fluoreszenz, Elektrolumineszenz, elektrische Kapazität, Leitfähigkeit, pH, Masse usw. - ändert, die durch den Signalwandler detektiert werden können.
Die Kombination eines transparenten Fensters zur Detektion von optischen Signalen als Boden der Detektionskammer mit weiteren Signalwandlern in der Detektionskammer ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ebenfalls möglich.
In einer weiteren Ausfϊihrungsform der vorliegenden Erfindung trägt jede Testkassette einen Bar- Code, der vorzugsweise folgende Information zur Beschreibung der Testkassette beinhaltet:
Assay-Typ,
Batch/lot number/Herstellungsdatum - Ablaufdatum
Spot array Geometrie Kodierung, die die Geometrie der Messbereiche beschreibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diese Informationen von der Vorrichtung zur Bioassay von Analyten mittels Bio- und / oder Chemosensoren enthaltend die erfmdungsgemäße Testkassette, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, gelesen und verwendet.
Für bestimmte Anwendungen kann es vorteilhaft sein, wenn eine Testkassette mehrere nebeneinander gelegte Kanal- und Kammersysteme aufweist, so dass in einer Testkassette verschiedene Detektionsreaktionen gleichzeitig geführt werden könnten.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bioassay von Analyten mittels Bio- und / oder Chemosensoren die die erfindungsgemäße Testkassette, mindestens eine Ankopplungsstelle für die Positionierung der erfindungsgemäßen Testkassette, mindestens ein Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten in der Testkassette, aufweist. Um optimale repro- duzierbare Ergebnisse zu sichern, verfügt die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Kontrolle der Betriebstemperatur in der Testkassette außerdem über mindestens eine Temperaturregulierungseinheit.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die Temperaturregulierungseinheit mindestens ein flaches temperierbares Element auf, auf das die dünne Seite der erfindungsgemäßen Testkassette gelegt wird, so dass ein schneller Temperaturausgleich zwischen temperierter Auflage und Probenlösung in den Kammern stattfinden kann. Z.B. können Peltiers- oder Cartridge-Elemente zur Temperierung der Auflage verwendet werden.
Idealerweise wird die Temperaturregulierungseinheit computergesteuert und die Temperatur wird während des Betriebs der Testkassette konstant gehalten. Vorzugsweise wird die Testkassette bei einer Temperatur von 20 bis 37 0C bevorzugt um 25 0C betrieben.
Bei der Temperaturkontrolle wird vorzugssweise darauf geachtet, dass keine Kondensation auf der Testkassette stattfindet, die eine optische Detektion beeinträchtigen könnte. Dabei soll auf die Temperatur der Testkassette, Raumtemperatur und die jeweilige Raumfeuchtigkeit geachtet werden. (Fig. 13: Taupunkttemperaturdiagramm). Es wird bevorzugt, die erfindungsgemäße Vorrichtung bei Temperaturen von 15 bis 40 0C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 65 % zu betreiben.
Üblicherweise weist die Kopplungsstelle einen mechanischen Auslöser, auf der die Reaktion, das heißt den ersten Luftstoß, mit Hilfe des Mittels zur Beförderung der Probenflüssigkeit und / oder die Temperierung mittels der Temperiereinheit in der Testkassette startet.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist die erfindungsgemäßen Vorrichtung außerdem mindestens eine optische Einheit, die mindestens eine Quelle für ein Anregungslicht, insbesondere einen Laser und mindestens eine Ausleseeinheit zur Detektion der biochemischen Reaktion in der Detektionskammer der erfindungsgemäßen Testkassette auf.
Vorzugweise ist die Ausleseeinheit ein ortauflösender Detektor beispielweise aus der Gruppe, die von CCD-Kameras, CCD-Chips, Photodioden-Arrays, Avalanche-Dioden-Arrays, Multi- channelplates und Vielkanal-Photomultiplier gebildet wird.
Üblicherweise weist die optische Einheit außerdem Spiegel, Prismen und / oder Linsen zur Gestaltung - insbesondere Fokus, Teilung, Umleitung und Orientierung - des Anregungslichts auf.
Zur Bedienung einer Testkassette mit PWG-Sensorplattform ist es vorteilhaft, einen Goniometer zur Kontrolle und Regelung des Anregungspfads, insbesondere zur Optimierung der Koppelparameter durch Positionierung des Laserstrahls bezüglich Einfallwinkel und Position zur Gitterstruktur in die optische Einheit, zu integrieren. Durch präzise Einstellung des Laserstrahls wird die Intensität des aus der PWG-Sensorplattform gestreuten Lichts maximiert.
Vorzugsweise wird die Testkassette ebenfalls präzise mittels einer Befestigungseinheit in der Kopplungsstelle festgehalten.
Wird eine Testkassette mit PWG-Sensorplattform verwendet, wird eine Präzision von 100 μm parallel zu dem Gitter und 200 μm normal zu der Fläche des PWG-Chips bevorzugt. Die zweite Positionierung wird im Laufe der Einkoppeleinstellung mit einer Resolution von 50 μm eingestellt. Es wird vermerkt, dass die Qualität des Signals von der genauen Positionierung der Sensorplattform zum Laserstrahl abhängig ist, so dass Toleranzgrenzen beachtet werden sollten.
Üblicherweise wird die Testkassette z. B. mit einem Silikondeckel versiegelt und das Mittel zu Beförderung der Probenflüssigkeit, z. B. ein Druckstoß, eine Spritze, ein Stempel oder eine Pumpe, bevorzugt eine Pumpe, drückt ein erstes Volumen Luft in die Testkassette. Der Luftdruck befördert die Probenflüssigkeit aus der Probenkammer in die Reagenzienkammer und vernetzt das Reagenzien-Pad. Hiermit wird die Präinkubationsphase gestartet, währenddessen z. B. die Toxine der Probe mit dem fluoreszierenden Antikörper reagiert. Üblicherweise beträgt die Präinkubationszeit von 1 bis 20 min bevorzugt 3 bis 7 min abhängig von den Reaktionspartnern. Üblicherweise wird durch eine längere Präinkubationszeit ein stärkeres Signal erzeugt. Es wird bevorzugt, die Präinkubationszeit mit einer Präzision von 3 Sekunden zu kontrollieren. In einem weiteren Schritt drückt das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit ein zweites vordefiniertes Volumen Luft in die Testkassette, was zur weiteren Beförderung der Probenflüssigkeit - ggf. durch einen Filter hindurch - in den Kanal bis in die Reaktionskammer führt. Dort findet die Hauptinkubation statt, die üblicherweise von 1 bis 100 min dauert. Die Detektion erfolgt vorzugsweise nach 1 bis 30 Minuten, bevorzugt 5 bis 15 Minuten mit einer Präzision von ± 5 Sekunden. Hierfür wird beispielsweise ein Laserstrahl in die Detektionskammer auf die Oberfläche der Sensorplattform geleitet und die erzeugte Fluoreszenz wird von der Ausleseeinheit registriert. Üblicherweise hat die Reaktion noch kein Equilibrium erreicht. Es wird daher bevorzugt, die Dauer der jeweiligen Schritte präzise einzuhalten, um die Reproduzierbarkeit der Messung zu gewährleisten.
Vorzugsweise verfügt die erfindungsgemäße Vorrichtung über eine Steuereinheit zur automatischen Steuerung des Mittels zur Beförderung der Probenflüssigkeit und /oder der Temperaturregulierungseinheit und / oder der optischen Einheit und entsprechende Positionierung der Testkassette in der Kopplungsstelle mittels Befestigungseinheit, Steuerung und Einstellung der biochemischen Reaktionsparameter, wie z. B. Inkubationszeit/-temperatur, Reaktionszeit/- temperatur usw.. Die Steuereinheit verfügt außerdem über ein Rechnerelement zur Berechnung der Analyten-Werte durch Bezug auf eine Kalibrationskurve und Anzeige der Analyten- Werte.
Üblicherweise erfolgt die Bedienung der erfindungsgemäßen Vorrichtung wie folgt:
1. Der Nutzer führt die Testkassette in die Ankopplungsstelle ein.
2. Der Nutzer drückt den Auslöseknopf um die erfϊndungsgemäße Vorrichtung zu starten.
Die erfϊndungsgemäße Vorrichtung führt selbständig mit Hilfe der Steuereinheit folgende Schritte durch:
3. Die Temperaturregulierungseinheit erwärmt die Testkassette, bis eine Temperatur von z. B. 25 ° C erreicht und eingehalten wird.
4. Wird eine Kassette mit integriertem planarem Wellenleiter verwendet, werden die Koppelbedingungen optimiert. Die Position des Lasers wird mit Hilfe des Goniometers eingestellt.
5. Das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit befördert die Probenflüssigkeit in die Reagenzienkammer. Die Präinkubation wird gestartet.
6. Das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit befördert die Probenflüssigkeit in die Reaktionskammer. Die Hauptinkubation wird gestartet.
7. Die Koppelbedingungen werden fein optimiert. Dabei wird eine Winkelkompensation von 1 ° wegen der Veränderung des refraktiven Indexes (Luft in Schritt 5, Wasserlösung jetzt) berücksichtigt. 8. Der Laserstrahl wird eingeschaltet und das resultierende Signal von der Ausleseeinheit registriert.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bedienung der erfindungsgemäßen Testkassette durch folgende Schritte gekennzeichnet:
A. Einführung einer Analyten enthaltenden Probenflüssigkeit in die Testkassette,
B. Transport der Probenflüssigkeit in eine Reagenzienkammer durch ein Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit, dann
C. Benetzung eines Reagenzien-Pads in der Reagenzienkammer und Auflösung von dort aufgebrachten Reagenzien, wobei das Reagenzien-Pad komplett benetzt wird, die Geschwindigkeit der Benetzung kontrolliert wird und vorzugsweise 1 ms bis 10 s beträgt,
D. Optionale Präinkubation, wobei die Präinkubationszeit vorzugsweise mit einer Präzision von 3 Sekunden kontrolliert wird, dann
E. Transport in eine Detektionskammer durch ein Mittel zur Beförderung der Probeflüssigkeit, wobei die Detektionskammer komplett gefüllt wird,
F. biochemische Reaktion ggf. mit in der Detektionskammer aufgebrachten Reagenzien (Inkubation), die zur quantitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten dient, wobei die Inkubationszeit kontrolliert wird, gefolgt von
G. Anregung und Bemessung von Änderungen der spektralen Eigenschaften und / oder Materialeigenschaften der Probeflüssigkeit in der Detektionskammer.
H. Berechnung und Anzeige der Analyten-Werte durch Bezug auf eine Kalibrationskurve.
Für die Reproduzierbarkeit des Verfahrens wird bevorzugt ein präzis definiertes Volumen Probenflüssigkeit befördert. Es ist außerdem vorteilhaft die Temperatur der Kassette in der Reagenzienkammer und in der Detektionskammer mit Hilfe der Temperaturregulierungseinheit während des Betriebs zu kontrollieren.
Für die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses bei der Wiederholung des Verfahrens mit einer anderen Testkassette wird bevorzugt, die Parameter insbesondere Volumen, Zeiten (Beförderungsund Inkubationszeiten) und / oder Temperatur festzulegen und automatisch durch die Steuereinheit zu kontrollieren. Ein großer Vorteil der Erfindung ist, dass die Person, die eine Analytik mit der neuen mikrofluidischen Testkassette durchführt, keine quantitativen Prozessschritte der Analytik durchführen muss, wie z.B. exakte Dosierung des Probenvolumens und exakte Dosierung der Reagenzien. Dadurch kann das biochemische Testverfahren auch von Personen durchgeführt werden, die keine Analytikexperten sind. Ein weiterer Vorteil ist, dass vor Beginn des Tests in der Testkassette keine Flüssigkeiten gelagert sind, sondern nur trockene Reagenzien. Ein großer Vorteil des Systems besteht darin, dass außer der Probenlösung keine weiteren Flüssigkeiten zugegeben werden müssen, was das Verfahren leicht durchführbar macht. Am Ende der Analyse verbleibt die Probenflüssigkeit in der Testkassette, so dass keine Gefährdung der Umwelt durch giftige oder infektiöse Stoffe stattfinden kann. Diese Nutzung der Testkassette als Einwegkassette wird durch einen einfachen Aufbau und entsprechend geringe Herstellungskosten wirtschaftlich ermöglicht.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Testkassette, Vorrichtung zur Bedienung der Testkassette und Verfahren zur Bedienung der Testkassette in der Umweltanalytik, dem Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik und dem Pflanzenschutz, um Analyten qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen, ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Beispiele für diese Verwendung sind die quantitative und / oder qualitative Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA-und RNA-Analytik und die Bestimmung von genomischen oder proteomischen Unterschieden im Genom, wie beispielsweise Einzelnukleotid-Polymorphismen, zur Messung von Protein-DNA-Wechselwirkungen, zur Bestimmung von Steuerungsmechanismen für die m-RNA- Expression und für die Protein(bio)synthese, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofϊlen, insbesondere zur Bestimmung von biologischen und chemischen Markerstoffen, wie mRNA, Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen organischen (Boten)Stoffen, sowie zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Produktforschung und -entwicklung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktforschung und -entwicklung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, insbesondere in der Lebensmittel- und Umweltanalytik. Besondere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Testkassette werden in den Figuren 1 bis 6 dargestellt, ohne sich darauf zu begrenzen. Fig 1 : Testkassette Fig 2: Testkassette Seitenansicht Fig. 3: Testkassette mit Bemaßung
Fig. 4: Aufbau der Testkassette - Sicht von oben seitlich Fig. 5: Aufbau der Testkassette - Sicht von unten seitlich Fig 6: PWG-Biochip Fig. 7: PWG-Biochip Seitenansicht Fig. 8: Dimensionen des PWG-Biochips.
Bezugszeichen:
1 Testkassette
2 Strukturierter Körper 3 Einlass
4 Probenkammer
5 Verschlussfolie
6 Kanal
7 Reagenzienkammer 8 Reagenzien-Pad
9 Detektionskammer
10 PWG-Biochip
11 Gitter
12 Dünne wellenleitende Schicht auf eine Glassplatte (nicht gezeichnet) 13 Haftvermittlungsschicht
14 BSA
15 Arrays
16 Mykotoxin-BSA-Konjugate-Spots
17 Referenzspots 18 Luftkanal
19 Luftöffnung
20 Entlüftungsöffnung
21 Fenster der Verschlussfolie
22 Entlüftungskanal
Die Testkassette 1 besteht aus einem strukturierten Körper 2, in den Kanäle und Kavitäten eingebracht sind. Dieser Körper ist an der Ober- und Unterseite mit einer Verschlussfolie 5 versehen, wodurch erreicht wird, dass die verschiedenen Kavitäten und Kanäle des strukturierten Körpers luftdicht abgeschlossen werden (mit Ausnahme der Öffnungen 3, 19 und 20).
Beispielweise wurde die erfindungsgemäße Testkassette in einem Spritzgussverfahren produziert. Der Körper besteht aus einer Platte aus schwarzem polyoxymethylen (POM), in der die Kanäle und Kammern aufgebohrt und abgefräst wurden.
Die Testkassette 1 umfasst einen Einlass 2 zur Eingabe einer Probenflüssigkeit mit dem zu detektierenden Analyten in die Testkassette 1, eine Reagenzienkammer 7, in die die Probeflüssigkeit über einen Kanal 6 befördert wird, und eine Detektionskammer 9, in die der Analyt über einen weiteren Kanal 6 befördert wird und die einen PWG-Biochip 10 umfasst.
Die Probenkammer 4 ist rund mit 10 mm Durchmesser. Die Reagenzienkammer 7 ist rund mit 8 mm Durchmesser. Der Detektionskammer 9 ist viereckig mit Dimensionen von 10 mm x 10 mm. Die Kanäle 6 haben einen runden Querschnitt mit einem Durchmesser von 1 mm.
In der Reagenzienkammer 7 befinden sich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Antikörper, die für einen Analyten aus der Probenflüssigkeit spezifisch sind, imprägniert auf einem Reagenzien-Pad 8.
Das Reagenzien-Pad 8 besteht aus „extra thick glass filter" der Firma PaIl Corporation (Porengröße 1 μm, typische Dicke 1270 μm (50 mils), typisches Wasser Flussrate 210 mL/min/cm2 bei 30 kPa), wobei zwei kreisrunde Filterstücke 8 mm Durchmesser übereinander gestapelt werden.
Sowohl der PWG-Biochip 10 als auch das Reagenzien-Pad 8 werden zwischen zwei Polyolefinfolien in der POM-Platte 2 festgehalten, die auch als Verschlussfolien 5 zur Dichtung der Testkassette dienen. Die Folie weist im Bereich des PWG-Biochips 10 ein Fenster 21 auf das freien Zugang zu der Messregion des PWG-Biochips 10 gewährt. Die obere Verschlussfolie 5 ist 180μm dick und die untere Verschlussfolie 5 ist 80 μm dick.
Die Probenflüssigkeit wird bei Testbeginn in die Probenkammer 4 eingebracht und mit einem geeigneten Silikondeckel luftdicht verschlossen. Die Flüssigkeit verteilt sich in der Probenkammer 4 und in den angrenzenden Kanälen 6, die so gestaltet sind, dass die Flüssigkeit nicht durch Kapillarkräfte bis in die Reagenzienkammer 7 bzw. zum Einlass 3 gezogen wird. Mit Hilfe der Beförderungseinheit wird an dem Einlass ein definiertes Luftvolumen in die Probenkammer 4 über den Kanal 6 eingebracht. Dieses Luftvolumen verdrängt die Probenflüssigkeit, so dass sie in die Reagenzienkammer 7 strömt und das Reagenzien-Pad 8 komplett benetzt. Durch Einleitung der Probenflüssigkeit in die Reagenzienkammer 7 werden die Antikörper gelöst und gehen mit den in der Probenflüssigkeit enthaltenen Analyten eine spezifische Bindung ein (Analyten-Antikörper-Konjugat). Dabei werden die freien Bindungsstellen der Antikörper mit zunehmender Menge an Analyten in der Probenflüssigkeit zunehmend gesättigt.
Nach einer gewissen Verweilzeit (10 Minuten) bei einer Temperatur von 25 0C wird die Probenflüssigkeit mit enthaltendem Analyten- Antikörper-Konjugate in einem nächsten Schritt mit einem weiteren definierten Luftstoß in die Detektionskammer 9 befördert. Die Detektionskammer 9 wird von der Probeflüssigkeit komplett gefüllt.
Die Entlüftung des kompletten Kanalsystems findet über die Entlüftungsöffnung(en) 20, die in der oberen Verschlussfolie aufgebracht sind, statt.
Die Detektionskammer 9 umfasst einen PWG-Biochip 10. Der PWG-Biochip 10 ist in Fig. 6 schematisch in Aufsicht und in Fig. 7 schematisch in Seitenansicht gezeigt.
In der Detektionskammer 9 wird der Verlauf oder der Endpunkt der biochemischen Nachweisreaktion detektiert.
Der PWG-Biochip 10 in der Detektionskammer 9 besteht beispielsweise aus einer 10 mm x 12 mm Glasplatte mit einer Dicke von 0.7 mm (12.0 +/- 0.05mm x 10.0 +/- 0.05mm x 0.70 +/- 0.05mm). Auf einer Seite des Chips befindet sich eine 155 nm dünne wellenleitende Schicht 12 aus Ta2O5 (Tantalum pentoxide). Die Messregion des Chips umfasst einen zentralen 10 mm x 6 mm viereckigen Detektionsbereich. Parallel zu diesem Detektionsbereich befindet sich ein 500 μm breites sichelförmiges Band: das Gitter 11 zur Einkopplung des Anregungslichts. Die Positionsgenauigkeit des Gitters 11 zu den Kanten des PWG-Biochips 10 beträgt +/- 0.05 mm. Die Gittertiefe beträgt 18 nm und die Gitterperiode 318 nm mit einem Duty Cycle von 0,5.
Auf der dünnen wellenleitenden Schicht 12 ist eine Monoschicht aus Dodecylphosphat als Haftvermittlungsschicht 13 aufgebracht. Auf der Haftvermittlungsschicht 13 sind Analyten-BSA- Konjugate adsorptiv in Form eines Arrays 15 aufgebracht/immobilisert. Die freien Flächen zwischen den Analyten-BSA-Konjugat-Spots 16 und Referenzspots 17 sind mit BSA 14 geblockt (Passivierung).
In der Detektionskammer 9 gelangen die Analyten- Antikörper-Konjugate und ggf. Antikörper mit freien Bindungsstellen zu den immobilisierten Analyten-BSA-Konjugaten Spots 16 auf dem PWG- Biochip 10. Antikörper mit freien Bindungsstellen gehen eine spezifische Bindung mit den entsprechenden immobilisierten Analyten-BSA-Konjugaten ein. Je mehr Antikörper mit freien Bindungsstellen in der Lösung vorhanden sind, das heißt je geringer der Anteil des korrespondierenden Analyten in der Probeflüssigkeit ist, desto mehr mit einem Fluoreszenz- Farbstoff markierte Antikörper werden auf dem PWG-Biochip 10 gebunden. Die mit Analyten in der Probenflüssigkeit gesättigten Antikörper verbleiben in der Lösung.
Durch Einkoppelung elektromagnetischer Strahlung in den Dünnschichtwellenleiter 12 können die an die immobilisierten Analyten-BSA-Konjugate gebundenen und mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörper im evaneszenten Feld des Dünnschichtwellenleiters 12 zur Fluoreszenz angeregt werden. Die in der Lösung befindlichen und mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörper werden hierbei nicht angeregt. Auf diese Weise ist eine indirekte Quantifizierung der in der Probenflüssigkeit enthaltenden Analyten möglich.
Besondere Ausführungsformen der erfϊndungsgemäßen Vorrichtung zur Bedienung der Testkassette werden in Figur 9 dargestellt, ohne sich darauf zu begrenzen.
Fig. 9: Schematische Darstellung der erfϊndungsgemäßen Vorrichtung zur Bedienung der
Testkassette.
Bezugszeichen: 30: Auflage
31 : Optisches Fenster
32: Mittel zur Beförderung der Probeflüssigkeit
33: Temperierelement - Peltiers- oder Cartridge-Elemente
34: Objektiv mit Filtern 35: CCD-Kamera
36: Bewegbarer Spiegel
37: Bewegbarer Laser
38: Steuereinheit
Die Vorrichtung zur Bedienung der erfindungsgemäßen Testkassette weist eine Kopplungsstelle mit einer Auflage 30 für die Positionierung der erfindungsgemäßen Testkassette 1 auf. Unter dem PWG-Biochip 10 befindet sich ein Fenster 31 in der Auflage 30. Die Vorrichtung weist außerdem das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit 32 in der Testkassette 1 und das Temperierelement 33 auf. Im Fig. 9 temperiert das Temperierelement 33 die Auflage 30 per Kontakt, die wiederum die Temperierung an die Testkassette 1 weiterleitet.
Außerdem weist die erfindungsgemäße Vorrichtung in der optischen Einheit einen bewegbaren Laser 37 , und mindestens eine CCD-Kamera 35 zur Detektion der biochemischen Reaktion in der Detektionskammer der Testkassette 1 auf. Die optische Einheit enthält außerdem einen bewegbaren Spiegel 36 und ein Objektiv mit Filtern 34. Weitere Prismen und / oder Linsen zur Gestaltung - insb. Fokus, Teilung, Umleitung und Orientierung - des Anregungslichts, sowie ein Goniometer zur Kontrolle und Regelung des Anregungspfads, insbesondere zur Optimierung der Koppelparameter durch Positionierung des Laserstrahls bezüglich Einfallwinkels und Position zur Gitterstruktur des PWG-Biochips 10, sind auch möglich (auf Fig. 9 nicht aufgeführt). Durch präzise Einstellung des Laserstrahls wird die Intensität des aus dem PWG-Biochip 10 gestreuten Lichts maximiert.
Der Laserstrahl (siehe Fig. 9) wird auf den PWG-Chip 10 der Testkassette 1 reflektiert.
Durch die Lichtanregung erhaltene Fluoreszenzphotonen werden durch das optische Fenster 31 von der CCD-Kamera 35 registriert.
Die Kopplungsstelle weist außerdem einen mechanischen Auslöser auf, der die Reaktion in der Testkassette startet.
Um optimale reproduzierbare Ergebnisse zu sichern, reguliert die Temperaturregulierungseinheit 33 die Betriebstemperatur in der Testkassette 1. Sie wird typischerweise mit der Betätigung des Auslösers zum Start der Kassette eingeschaltet.
Vorzugsweise wird die Testkassette bei einer Temperatur um 25 0C +/- 2K betrieben. Fig. 10 zeigt den Einfluss der Temperatur auf die Dosiswirkungskurve eines Assays. Fig. 11 zeigt den experimentellen Aufbau zur Bemessung der Temperaturregulierung mittels „Peltiers"-Elemente und Fig. 12 zeigt eine Simulation der Kühlungsrate der Testkassette.
Das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit 32 gibt zeitlich und volumenmäßig genau definierte Luftstöße in die versiegelte Testkassette zu. Durch diese Luftstöße wird die Probenflüssigkeit durch die verschiedenen Kanäle 6 und Kavitäten geleitet und es werden dort verschiedene Reaktionsschritte durchgeführt, wie z.B. Rekonstitution der Reagenzien, Vermischung der Reagenzien mit der Probe etc.
Die Testkassette 1 wird mit einem Silikondeckel 21 versiegelt und das Mittel zu Beförderung der Probenflüssigkeit 32 (eine Pumpe) drückt ein erstes Volumen Luft in die Testkassette 1. Der
Luftdruck befördert die Probenflüssigkeit aus der Probenkammer 4 in die Reagenzienkammer 7 und vernetzt das Reagenzien-Pad 8. Hiermit wird die Präinkubationsphase gestartet, währenddessen z. B. das Toxin der Probe mit dem fluoreszierenden Antikörper reagiert.
Üblicherweise beträgt die Präinkubationszeit von 2 bis 5 min ± 3 Sekunden abhängig von den Reaktionspartnern. Üblicherweise wird durch eine längere Präinkubationszeit ein stärkeres Signal erzeugt. Fig. 14 zeigt den Einfluss der Inkubationszeit auf die Dosiswirkungskurve des Assays anhand des Mykotoxins Fumonisin. In einem weiteren Schritt drückt das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit 32 ein zweites vordefiniertes Volumen Luft in die Testkassette 1, was zur weiteren Beförderung der Probenflüssigkeit - ggf. durch einen Filter hindurch - in den Kanal 6 bis in die Detektionskammer 9 führt. Dort findet die Hauptinkubation statt. Die Detektion erfolgt vorzugweise nach zehn Minuten mit einer Präzision von ± 5 Sekunden. Hierfür wird ein Laserstrahl in die Detektionskammer 9 auf die Oberfläche des PWG-Biochips 10 geleitet und die erzeugte Fluoreszenz wird von der CCD-Kamera 35 registriert. Üblicherweise hat die Reaktion noch kein Equilibrium erreicht. Die Dauer der jeweiligen Schritte wird präzise eingehalten.
Die Analyten-Werte werden durch Bezug auf eine Kalibrationskurve mittels eines Rechnungselements der Steuereinheit 38 berechnet und angezeigt.
Für die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses bei der Wiederholung des Verfahrens mit einer anderen Testkassette werden die Parameter, insbesondere Volumen, Zeiten (Beförderungs- und Inkubationszeiten) und / oder Temperatur festgelegt und die jeweiligen Elemente der Vorrichtung durch die Steuereinheit 38 automatisch kontrolliert.

Claims

Patentansprüche:
1. Testkassette zur qualitativen und/oder quantitativen Analyse von Analyten, beinhaltend einen strukturierten Körper, in dem Kavitäten, die miteinander durch Kanäle verbunden sind, eingebracht sind, wobei die Testkassette:
• mindestens einen Einlass zur Einführung einer den Analyten enthaltenden
Probenflüssigkeit,
• mindestens eine Reagenzienkammer, in der ein oder mehreren Reagenzien zur Reaktion mit dem Analyten oder zum Vermischen mit der Probenflüssigkeit untergebracht sind, und
• mindestens eine Detektionskammer, in der ein Signal zum Nachweis oder quantitativen Analyse des Analyten detektiert wird,
aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass:
• der Boden oder die Decke der Detektionskammer aus einem Signalwandler oder einem Fenster zur Detektion eines Signals besteht,
• die Kanäle so gestaltet sind, dass die Flüssigkeiten nicht durch Kapillarkräfte bis in die Reagenzienkammer bzw. zur Öffnung gezogen werden können,
• die Reagenzien in der Reagenzienkammer und gegebenenfalls weitere Reagenzien in der Detektionskammer in trockener Form untergebracht sind.
2. Testkassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzien in der Reagenzienkammer auf einem Reagenzien-Pad aufgebracht sind.
3. Testkassette nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Seite des Körpers mittels einer Verschlusseinheit verschlossen ist.
4. Testkassette nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschlusseinheit eine Verschlussfolie ist.
5. Testkassette nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschlussfolie eine Dicke von 30 μm bis 1000 μm aufweist.
6. Testkassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzienkammer und die Detektionskammer auf der Unterseite des Körpers untergebracht sind.
7. Testkassette nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Signalwandler oder das Fenster zur Detektion eines Signals den Boden der
Detektionskammer bildet.
8. Testkassette nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionskammer einen Signalwandler als Boden aufweist und auf dem Signalwandler ein oder mehrere voneinander getrennte Messbereiche definiert sind, an denen ein oder mehrere weitere Bindungspartner zum Nachweis des Analyten in der Probe immobilisiert sind.
9. Testkassette nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Signalwandler ein planarer Wellenleiter ist.
10. Vorrichtung zur Bioassay von Analyten mittels Bio- und / oder Chemosensoren, die die Testkassette nach einem der Ansprüche 1 bis 9, mindestens eine Ankopplungsstelle für die
Positionierung der Testkassette, mindestens ein Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeiten in der Testkassette und mindestens eine Temperaturregulierungseinheit aufweist.
11. Vorrichtung nach dem Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur- regulierungseinheit mindestens ein flaches temperierbares Element aufweist, das mit der unteren Seite der Testkassette in Kontakt gebracht wird.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das flache temperierbare Element mittels eines Peltiers oder eines Cartridge Elements temperiert wird.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine optische Einheit aufweist, die mindestens eine Quelle zur Anregung der
Probenflüssigkeit in der Detektionskammer, mindestens eine Ausleseeinheit zur Detektion eines Signals in der Detektionskammer, und optional Spiegel, Prismen und / oder Linsen enthält.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Steuereinheit zur automatischen Steuerung des Mittels zur Beförderung der Probenflüssigkeiten und /oder der Temperaturregulierungseinheit und / oder der optischen Einheit aufweist.
15. Verfahren zur Bedienung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, durch folgenden Schritte gekennzeichnet:
A. Einführung einer Analyten enthaltende Probeflüssigkeit in die Testkassette,
B. Transport der Probenflüssigkeit in die Reagenzienkammer durch das Mittel zur Beförderung der Probenflüssigkeit,
C. Benetzung eines Reagenzien-Pads in der Reagenzienkammer und Auflösung von dort aufgebrachten Reagenzien, wobei das Reagenzien-Pad komplett benetzt wird und die Geschwindigkeit der Benetzung kontrolliert wird,
D. optionale Präinkubation, wobei die Präinkubationszeit kontrolliert wird, dann
E. Transport in die Detektionskammer durch das Mittel zur Beförderung der Probeflüssigkeit, wobei die Detektionskammer komplett gefüllt wird,
F. biochemische Reaktion ggf. mit in der Detektionskammer aufgebrachten Reagenzien (Inkubation), die zur quantitativen Bestimmung eines oder mehrerer
Analyten dient, wobei die Inkubationszeit kontrolliert wird, gefolgt von
G. Anregung und Bemessung von Änderungen der spektralen Eigenschaften und / oder Materialeigenschaften der Probenflüssigkeit in der Detektionskammer, und
H. Berechnung und Anzeige der Analyten-Werte durch Bezug auf eine Kalibrationskurve.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Geschwindigkeit der Benetzung 1 ms bis 10 s beträgt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei ein präzise definiertes Volumen Probenflüssigkeit befördert wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur in der Reagenzienkammer und in der Detektionskammer während des Betriebs kontrolliert wird.
9. Verwendung der Testkassette nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 13 und 7 oder des Verfahrens nach einem der Ansprüche 14 bis 17 in der Umweltanalytik, dem Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik und dem Pflanzenschutz, um Analyten qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.
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