EP2368123A1 - Inprozesskontrolle in einem verfahren zur herstellung von epo - Google Patents

Inprozesskontrolle in einem verfahren zur herstellung von epo

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EP2368123A1
EP2368123A1 EP09764266A EP09764266A EP2368123A1 EP 2368123 A1 EP2368123 A1 EP 2368123A1 EP 09764266 A EP09764266 A EP 09764266A EP 09764266 A EP09764266 A EP 09764266A EP 2368123 A1 EP2368123 A1 EP 2368123A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
erythropoietin
membrane
antibody
bound
acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09764266A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Franz-Rudolf Kunz
Florian Glaser
Wolfgang Wienand
Rudolf Hanko
Wilfried Eul
Dietmar Reichert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Degussa GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Degussa GmbH filed Critical Evonik Degussa GmbH
Publication of EP2368123A1 publication Critical patent/EP2368123A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/746—Erythropoetin

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of erythropoietin, in particular for Inreakontrolle of culture supernatants of erythropoietin-producing eukaryotic cells in the context of the fermentative production process.
  • the method is characterized in particular by the fact that the isoform composition of the produced erythropoietin can be determined directly using a special isoelectric focusing (IEF).
  • IEF isoelectric focusing
  • the quality of the synthesis crude product can be assessed during or immediately after the end of the fermentation, and the subsequent purification process can thus be controlled. This is particularly advantageous in the context of the use of perfusion reactors.
  • Erythropoietin is a glycoprotein having a molecular weight of about 34 to 39 kDa. It consists of an unbranched polypeptide chain with 165 amino acids and an O-glycosidic (Ser 126) and three N-glycosidic (Asn 24, Asn 38 and Asn 83) bonded sugar side chains (carbohydrate moiety).
  • the side chains are composed of the monosaccharides mannose, galactose, fucose, N-acetylglycosamine, N-acetylgalactosamine and N-acetylneuraminic acid.
  • the erythropoietin can occur in various isoforms.
  • erythropoietin Variance in the molecular weight of erythropoietin is due to the heterogeneity of sugar chains that are terminally linked to neuraminic acid derivatives. Through different lengths and branching of the chains, a multitude of "sugar branches" can be constructed, which effect the expression of all isoforms of an EPO molecule.
  • EPO is mainly produced in the kidneys and stimulates the growth factor as the formation of erythrocytes in the bone marrow.
  • the damaged kidneys produce too little or no EPO at all, with the result that too few erythrocytes emerge from the stem cells of the bone marrow.
  • This renal anemia can be treated by administering EPO in physiological amounts that stimulate the formation of erythrocytes in the bone marrow.
  • the EPO used for administration can either be obtained from human urine or generated by genetic engineering methods. Since EPO is present in trace amounts in the human body, the isolation of EPO from the natural source for therapeutic applications is virtually impossible. Therefore, genetic engineering methods provide the only economic opportunity to produce this substance in larger quantities.
  • erythropoietin takes place by genetic engineering, above all in so-called CHO cells (Chinese hamster ovary), three basically different methods being used for the cultivation of the eukaryotic host cells (described, inter alia, in EP-AO 148) 605 and EP-A-205,564, BioProcess International 2004, 46; Gorenflo et al., Biotech Bioeng., 2002, 80, 438 and WO9501214).
  • Cultivation introduced into the bioreactor. Nutrients are not added until the end of cultivation and cells are removed from the fermenter, only oxygen is supplied. When one or more substrates are consumed, the process is stopped and the products are harvested from the fermentation supernatant.
  • the second known cultivation method is the continuous process in which fresh medium is constantly fed and taken to the same extent fermenter content.
  • it comes to a constant supply of nutrients, while removing or diluting undesirable metabolic products such as the growth-inhibiting substances ammonium and lactate. Therefore, with this method, higher cell densities can be achieved and over be maintained for a comparatively long period of time.
  • a special case of continuous process management is provided by so-called dialysis reactors in which high molecular weight substances such as proteins are retained in the fermenter, while low molecular weight substances such as substrates can be added or the main waste products ammonium and lactate can be removed from the system.
  • dialysis reactors in which high molecular weight substances such as proteins are retained in the fermenter, while low molecular weight substances such as substrates can be added or the main waste products ammonium and lactate can be removed from the system.
  • perfusion reactors in the microbial production of chemical compounds and proteins with various cell restraint systems is well known and also described for EPO.
  • the third possible method is the fed-batch fermentation, in which the culture is started with a fraction of the total fermenter volume and after a short growth phase fresh substrate is added. This enables higher cell densities and longer process times than in the batch process.
  • Another advantage of this method is that the metabolism of the cells can be influenced by the amount of feed, which can lead to a lower production of waste substances. Compared to the continuous process, the product of the cells is accumulated here in the fermenter over a relatively long period of time and thus higher product concentrations are achieved, which facilitates the subsequent work-up.
  • a sample containing erythropoietin is subjected to separation in a polyacrylamide gel, for example, an isoelectric focusing, and the proteins contained are separated by applying an electric field.
  • the electrophoresis is followed by a so-called immunoblot (immunoimprint or immuno-transfer), in which the proteins are transferred to a membrane.
  • immunoblot immunoimprint or immuno-transfer
  • an image of the individual proteins is obtained on the surface of the membrane.
  • the membranes used have the advantage that the proteins are mainly strongly fixed by hydrophobic interactions and the membranes otherwise behave chemically neutral. Because the EPO molecules are located on the membrane surface, they are readily accessible to antibodies that are used to visualize the erythropoietin.
  • isoelectric focusing the isoforms of erythropoietin can be separated.
  • the membrane is first incubated with a monoclonal anti-EPO antibody which specifically binds to all existing EPO molecules. Other proteins do not react with the antibody. Monoclonal antibodies not bound to EPO can be washed off the membrane because the remainder of the membrane surface has previously been blocked with a non-specific protein.
  • the binding of the antibody to EPO is reversible because it is based on non-covalent interactions, and may be e.g. reversed by pH changes.
  • the antibodies bound to erythropoietin are transferred to a second membrane: in an acidic environment, the antibody changes the conformation of its binding domain and upon application of an electric field, the monoclonal antibody dissociates from the EPO molecule and travels in the electric field in the direction Cathode, where it is bound to a second membrane.
  • the EPO molecules as well as other non-specific proteins remain on the first membrane, since the binding to the first membrane is not affected by pH fluctuations. This is a re-image of the EPO band or the EPO bands obtained. However, there are no erythropoietin molecules on the second membrane, but the specific monoclonal antibodies that previously bound to the erythropoietin molecules fixed on the first membrane.
  • the visualization of the antibody band (s) is carried out by a second antibody (secondary antibody) which reacts with the anti-EPO monoclonal antibody.
  • This secondary antibody is coupled to specific enzymes (e.g., alkaline phosphatase or peroxidase) that catalyze substrate conversion that undergoes a color reaction.
  • the need for the second transfer is to reduce the nonspecific signals since the enzyme-labeled secondary antibody can not undergo nonspecific reactions to other components of the sample on the first membrane.
  • a signal amplification and a concomitant increase in sensitivity by multiple formation of the antibody i5 enzyme conjugates to the first antibody is conceivable.
  • a disadvantage of the double blot method is the significantly increased material and time required.
  • Erythropoietin known and familiar to the expert, but it is either the detection of erythropoietin described above the significantly more complex doping
  • the object of the present invention is to provide a simplified and improved method for the detection of erythropoietin, which serves the in-process control, wherein the method makes it possible to characterize the culture supernatants from the EPO fermentation processes so that only selected and suitable evaluated fermentation solutions are supplied to each extensive cleaning processes.
  • the present method should be superior to the prior art methods from the economical point of view.
  • the technical object is achieved by a method for determining the isoform composition of erythropoietin comprising the following steps: a) isoelectric focusing of a sample containing erythropoietin in a gel over a pH range whose lower limit is from 2.5 to 3.5 and the upper limit thereof is from 5 to 8, wherein the erythropoietin-containing sample is from a culture supernatant of erythropoietin-producing eukaryotic cells; b) transferring the proteins contained in the gel and separated on a membrane; c) Detection of erythropoietin bound to the membrane by specific antibodies.
  • first antibodies directed against erythropoietin are bound to the erythropoietin bound to the membrane in step c), whereby the binding of the first antibodies to the erythropoietin bound to the membrane is detected, while the first antibody is detected on the erythropoietin bound erythropoietin bound to the membrane. It is preferred that the detection of the binding of the first antibody to the erythropoietin bound to the membrane by second antibodies, which are directed against the first antibody.
  • first antibodies directed against erythropoietin bind to the erythropoietin bound to the membrane, and second antibodies directed against the first antibodies bind to the first antibodies bound to erythropoietin.
  • the isoform composition of the fermentation supernatants are determined directly, an advantageous and provided a simplified method which can be used to control the fermentation process and to decide on the selection of the culture supernatants to be purified.
  • the method is simplified to such an extent that the detection of the erythropoietin can already take place after a single protein transfer (blot).
  • an enzyme preferably alkaline phosphatase
  • the second antibody which produces a color reaction by catalytically reacting a substrate.
  • two antibody solutions on the membrane for colohmetic EPO detection of which the second antibody contains an alkaline phosphatase, so that then a substrate of this enzyme can be used as a staining reagent.
  • anti-EPO mouse and anti-mouse IgG in combination with BCIP / NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate / nitrotetrazolium blue).
  • the solution used in the washing steps following incubation of the membrane with the first antibody directed against erythropoietin, an organic acid in an aqueous medium.
  • This unspecifically bound antibodies are removed from the membrane again and possibly still existing free binding sites on the blotting membrane blocked. Overall, this significantly increases the selectivity of the bands.
  • the solution contains 0.1 to 1, 5 wt .-%, preferably 0.5 to 1 wt .-%, particularly preferably 0.6 to 0.8 wt .-% of the organic acid.
  • the organic acid is mono-, di- or tricarboxylic acids (such as, for example, acetic acid, propionic acid, lactic acid, succinic acid, ascorbic acid, adipic acid or citric acid), particularly preferably acetic acid.
  • the incubation with the first antibody solution is carried out in duplicate and a four-step washing procedure is performed therebetween.
  • TBST Tris-Buffered-Saline-Tween
  • TBS Tris-Buffered-Saline
  • Dilute aqueous acetic acid and very particularly preferably dilute aqueous acetic acid in the concentration range between 0.5% and 1% are particularly preferably used for this purpose.
  • the membrane used is a polyvinylidene fluoride membrane.
  • a membrane is used for blotting, which is suitable for binding proteins.
  • Particularly preferred is a microporous polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, and most preferred is the Immobilon-P blotting membrane from Millipore.
  • PVDF microporous polyvinylidene fluoride
  • polyacrylamide gels are used for the isoelectric focusing, which are mounted on an inert Sufo- Ne.
  • IEF utilizes standardized polyacrylamide gels immobilized on an inert support sheet, e.g. made of polyester.
  • gels whose pH gradient is formed by free carrier ampholytes in the electric field are particularly preferred. Very particular preference is given to Blank PreNets from Serva.
  • Gels ampholines are used, which adjust a pH range of pH 3 to pH 6 during the isoelectric focusing in the gel. Very particular preference is given to Servalyt TM 3-6 from Serva.
  • the sample containing erythropoietin is from a culture supernatant of erythropoietin-producing eukaryotic cells maintained in perfusion reactors.
  • the erythropoietin-containing sample is desalted before isoelectric focusing and optionally concentrated.
  • the determination of the isoform composition of the erythropoietin takes place during the fermentation.
  • an ELISA test is used for determining the EPO content of the culture supernatants.
  • the EPO ELISA test from Roche Diagnostics.
  • the reference material used is a commercially available Erypo®
  • the invention further provides a method for the in vitro control of culture supernatants resulting from the fermentation of erythropoietin-producing eukaryotic cells, comprising the following steps:
  • the method is characterized in particular by the fact that the isoform composition of the fermentation supernatants can be determined directly with a special isoelectric focusing (IEF). Together with the data from the EPO content determination (preferably determined by means of ELISA), the EPO quality in the crude product can be directly assessed during or immediately after the end of the fermentation, thus controlling the purification process.
  • IEF isoelectric focusing
  • FIG. 1 shows a blot of various EPO fractions (fractioni to
  • Fraction 5 on a membrane after isoelectric focusing and development.
  • the sample is from a perfusion fermentation of an erythropoietin-producing CHO cell line over a period of 47 days.
  • EPO is produced by fermentation in CHO cells.
  • the fermentation is carried out according to standard methods, as described in the patent and scientific literature for eukaryotic, in particular CHO cells.
  • Cultivation takes place in the perfusion reactor in culture medium which is free from animal components.
  • the harvest takes place continuously over a period of up to 50 days.
  • Each fermentation solution to be analyzed is desalted and concentrated prior to isoelectric focusing.
  • a total EPO content of about 14 mg / L is determined by ELISA test
  • 15 mL of the sample with the Ultrazentrifugationskit and a molecular weight CutOff of 1 OkDa by centrifugation 60 min at 4000 g and 60 min at 14000 g) to 200 .mu.l concentrated and 12 .mu.l of the concentrate with 28 .mu.l ultrapure water and 10 .mu.L Ethanol mixed and stored for 60 min at -20 0 C.
  • the sample solution is centrifuged in a refrigerated centrifuge (20 min, 16100 g, 0 0 C) and the LJ supernatant of the solution for isoelectric focusing used (IEF sample solution).
  • Isoelectric focusing starts with a prefocussing of the
  • the preparation of the Immobilon P blotting membrane (Millipore) is carried out. Thereafter, the gel is blotted onto the membrane under the following conditions: 50 V constant for 50 min in blotting buffer (1X Tris / Glycine with 20% methanol, Bio-Rad). Immediately after protein transfer, three washes are sequentially performed first in methanol and then twice in water for 30 seconds each. The membrane is then placed in blocking solution (5% skim milk powder solution (Bio-Rad) in IxTBS buffer (Bio-Rad)) and incubated at room temperature for 60 min with gentle shaking.
  • blocking solution 5% skim milk powder solution (Bio-Rad) in IxTBS buffer (Bio-Rad)
  • the membrane is treated with the second antibody solution (1% BSA (Sigma) in 30 ml of IXTBS buffer (Bio-Rad) with 60 ⁇ l of 500 mM sodium azide solution of 35 ⁇ l of anti-mouse IgG (Sigma) - lo is added).
  • the second antibody solution 1% BSA (Sigma) in 30 ml of IXTBS buffer (Bio-Rad) with 60 ⁇ l of 500 mM sodium azide solution of 35 ⁇ l of anti-mouse IgG (Sigma) - lo is added).
  • EPO ELISA test from Roche Diagnostics GmbH (photometric enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative in vitro determination of erythropoietin in human serum / plasma for research purposes using antibody precoated microtiter plates).
  • EPO contents are determined in the following ranges: Fraction 1 (fermentation until day 5): approx. 80 mg / L

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Isoformenzusammensetzung von Erythropoietin umfassend die folgenden Schritte: a) isoelektrische Fokussierung einer Erythropoietin enthaltenden Probe in einem Gel über einen pH-Bereich, dessen untere Grenze von 2,5 bis 3,5 und dessen obere Grenze von 5 bis 8 liegt, wobei die Erythropoietin enthaltende Probe aus einem Kulturüberstand von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen stammt; b) Übertragen der im Gel enthaltenen und aufgetrennten Proteine auf eine Membran; c) Nachweis des an der Membran gebundenen Erythropoietins durch spezifische Antikörper; sowie ein Verfahren zur Inprozesskontrolle von Kulturüberständen von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen im Rahmen des fermentativen Herstellungsprozesses.

Description

Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO
[0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Erythropoietin, insbesondere zur Inprozesskontrolle von Kulturüberständen von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen im Rahmen des fermentativen Herstellungsprozesses. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass mit einer speziellen isoelektrischen Fokussierung (IEF) die Isoformen-Zusammensetzung des produzierten Erythropoietins direkt bestimmt werden kann. Zusammen mit den Daten aus der Erythropoietin-Gehaltsbestimmung (vorzugsweise mittels ELISA ermittelt) kann so während oder unmittelbar nach Beendigung der Fermentation die Qualität des Syntheserohproduktes beurteilt und so der sich anschließende Aufreinigungsprozess gesteuert werden. Dies ist vor allem im Rahmen des Einsatzes von Perfusionsreaktoren äußerst vorteilhaft.
[0002] Erythropoietin, kurz EPO genannt, ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 34 bis 39 kDa. Es besteht aus einer unverzweigten PoIy- peptidkette mit 165 Aminosäuren und einer O-glykosidisch (Ser 126) und drei N- glykosidisch (Asn 24, Asn 38 und Asn 83) gebundenen Zuckerseiten ketten (Koh- lenhydratanteil). Die Seitenketten ihrerseits setzen sich aus den Monosacchariden Mannose, Galaktose, Fucose, N-Acetylglycosamin, N-Acetylgalactosamin und N- Acetylneuraminsäure zusammen.
[0003] Das Erythropoietin kann in verschiedenen Isoformen auftreten. Diese
Varianz des Molekülgewichts von Erythropoietin kommt durch die Heterogenität der Zuckerketten zustande, die endständig mit Neuraminsäuredehvaten verknüpft sind. Durch unterschiedliche Längen und Verzweigungen der Ketten lässt sich eine Vielzahl von "Zuckerzweigen" konstruieren, die die Ausprägung aller Isofor- men eines EPO-Moleküls bewirken.
[0004] EPO wird hauptsächlich in den Nieren gebildet und regt als Wachstumsfaktor die Bildung der Erythrocyten im Knochenmark an. Bei Niereninsuffi- zienz produzieren die geschädigten Nieren zu wenig oder überhaupt kein EPO, was zur Folge hat, dass aus den Stammzellen des Knochenmarks zu wenig E- rythrocyten hervorgehen. Diese renale Anämie kann durch Verabreichung von EPO in physiologischen Mengen, die die Bildung von Erythrocyten im Knochen- mark stimulieren, behandelt werden. Das zur Verabreichung verwendete EPO kann entweder aus Humanurin gewonnen oder durch gentechnologische Methoden erzeugt werden. Da EPO im menschlichen Körper nur in geringen Spuren enthalten ist, ist die Isolierung von EPO aus der natürlichen Quelle für therapeutische Anwendungen praktisch unmöglich. Daher bieten gentechnische Methoden die einzige wirtschaftliche Möglichkeit, diesen Stoff in größeren Mengen zu produzieren.
[0005] Die rekombinante Herstellung von Erythropoietin erfolgt auf gentechnologischem Weg vor allem in sogenannten CHO-Zellen (Chinese Hamster Ova- ry), wobei grundsätzlich drei unterschiedliche Verfahrensweisen für die Kultivie- rung der eukaryontischen Wirtszellen eingesetzt werden (beschrieben u.a. in EP- A-O 148 605 und EP-A-205 564; BioProcess International 2004, 46; Gorenflo et al., Biotech. Bioeng. 2002, 80, 438 und WO9501214).
[0006] Bei einem Batch-Prozess werden Medium und Zellen zu Beginn der
Kultivierung in den Bioreaktor eingebracht. Bis zum Ende der Kultivierung werden weder Nährstoffe zugefügt noch Zellen aus dem Fermenter entfernt, lediglich Sauerstoff wird zugeführt. Wenn eines oder mehrere Substrate verbraucht sind, wird der Prozess beendet und die Produkte werden aus dem Fermentationsüberstand geerntet.
[0007] Das zweite bekannte Kultivierungsverfahren ist das kontinuierliche Verfahren, bei dem ständig frisches Medium zugeführt und im gleichen Maße Fermenterinhalt entnommen wird. So kommt es zu einer ständigen Zufuhr von Nährstoffen, wobei gleichzeitig unerwünschte Stoffwechsel produkte wie die wachstumshemmenden Substanzen Ammonium und Lactat entfernt bzw. verdünnt werden. Daher können mit diesem Verfahren höhere Zelldichten erreicht und über einen vergleichsweise langen Zeitraum aufrechterhalten werden. Ein Spezialfall der kontinuierlichen Prozessführung ermöglichen sogenannte Dialysereaktoren, bei denen hochmolekulare Substanzen wie Proteine im Fermenter zurückgehalten werden, während niedermolekulare Substanzen wie Substrate zugefügt oder die Hauptabfallprodukte Ammonium und Lactat aus dem System entfernt werden können. Ebenso ist der Einsatz von Perfusionsreaktoren in der mikrobiellen Herstellung von chemischen Verbindungen und Proteinen mit verschiedenen Zellrückhaltesystemen allgemein bekannt und auch für EPO beschrieben.
[0008] Das dritte mögliche Verfahren schließlich ist die Fed-Batch- Fermentation, bei der die Kultivierung mit einem Bruchteil des gesamten Fermen- tervolumens gestartet wird und nach kurzer Anwachsphase frisches Substrat zugegeben wird. Dadurch werden höhere Zelldichten und längere Prozesszeiten als im Batch-Verfahren ermöglicht. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass sich der Stoffwechsel der Zellen über das Maß der Zufütterung beeinflussen lässt, was zu einer geringeren Produktion von Abfallsubstanzen führen kann. Gegenüber dem kontinuierlichen Verfahren wird hier das Produkt der Zellen über einen längeren Zeitraum im Fermenter akkumuliert und somit höhere Produktkonzentrationen erreicht, wodurch die anschließende Aufarbeitung erleichtert wird.
[0009] An den fermentativen Prozess gekoppelt sind umfangreiche chroma- tographische Reinigungsverfahren, damit aus den Kulturüberständen ein EPO isoliert werden kann, das therapeutisch anwendbar ist und dem in der Europäischen Pharmacopoeia (Ph.Eur.; 01/2002:1316) definierten Standard bzw. der Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoetins (EMEA/CHMP/94256/2005) entspricht. Diesbezüglich ist der Stand der Technik in einer Vielzahl von Verfahren, wie beispielsweise in der WO-A-05/121173, EP-A-O 228 452, EP-A-O 267 678, EP-A-O 830 376, EP-A-1 127 063, WO-A-03/045996, EP-A-O 428 267 und WO2005121173 beschrieben.
[0010] Gemäß den Verfahren des Standes der Technik wird eine Erythro- poietin enthaltende Probe in einem Polyacrylamidgel einer Trennung unterworfen, beispielsweise einer isoelektrischen Fokussierung, und die enthaltenen Proteine werden durch Anlegen eines elektrischen Feldes aufgetrennt. Der Elektrophorese schließt sich ein sogenannter Immunoblot (Immuno-Abdruck bzw. Immuno- Transfer) an, bei dem die Proteine auf eine Membran überführt werden. Dabei wird ein Abbild der einzelnen Proteine auf der Oberfläche der Membran erhalten. Die verwendeten Membranen haben den Vorteil, dass die Proteine hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen sehr stark fixiert werden und die Membranen sich ansonsten chemisch neutral verhalten. Dadurch, dass sich die EPO- Moleküle an der Membranoberfläche befinden, sind sie leicht zugänglich für Anti- körper, die dazu dienen, die Erythropoietin sichtbar zu machen. Bei Anwendung einer isoelektrischen Fokussierung lassen sich die Isoformen des Erythropoietins auftrennen.
[0011] Zum Nachweis des Erythropoietins wird die Membran zunächst mit einem monoklonalen Anti-EPO-Antikörper inkubiert, der spezifisch an alle vorhan- denen EPO-Moleküle bindet. Andere Proteine reagieren nicht mit dem Antikörper. Nicht an EPO gebundene monoklonale Antikörper können von der Membran gewaschen werden, weil die restliche Membran-Oberfläche zuvor mit einem unspezifischen Protein blockiert wurde.
[0012] Die Bindung des Antikörpers an EPO ist reversibel, weil sie auf nicht kovalenten Wechselwirkungen beruht, und kann so z.B. durch pH-Veränderungen rückgängig gemacht werden. Beim Doppel-Blot-Verfahren werden die an Erythropoietin gebundenen Antikörper auf eine zweite Membran übertragen: im sauren Milieu ändert der Antikörper die Konformation seiner Bindungsdomäne und beim Anlegen eines elektrischen Feldes dissoziiert der monoklonale Antikörper vom EPO-Molekül ab und wandert im elektrischen Feld in Richtung Kathode, wo er an eine zweite Membran gebunden wird.
[0013] Die EPO-Moleküle sowie andere nicht spezifische Proteine verbleiben auf der ersten Membran, da die Bindung an die erste Membran durch pH- Schwankungen nicht beeinflusst wird. So wird ein erneutes Abbild der EPO-Bande bzw. der EPO-Banden erhalten. Allerdings befinden sich auf der zweiten Membran keine Erythropoietin-Moleküle, sondern die spezifischen monoklonalen Antikörper, die zuvor an die auf der ersten Membran fixierten Erythropoietin-Moleküle gebunden hatten.
5 [0014] Die Sichtbarmachung der Antikörperbande(n) erfolgt durch einen zweiten Antikörper (Sekundärantikörper), der mit dem Anti-EPO-monoklonalen Antikörper reagiert. Dieser sekundäre Antikörper ist mit speziellen Enzymen gekoppelt (z.B. alkalische Phosphatase oder Peroxidase), die eine Substratumwandlung katalysieren, bei der eine Farbreaktion erfolgt.
lo [0015] Die Notwendigkeit des zweiten Transfers liegt in der Verringerung der unspezifischen Signale, da der enzymmarkierte Sekundärantikörper keine unspezifischen Reaktionen zu anderen Bestandteilen der Probe auf der ersten Membran eingehen kann. Außerdem ist eine Signalverstärkung und eine damit verbundene Erhöhung der Empfindlichkeit durch Mehrfachbildung der Antikörper- i5 Enzym-Konjugate an den ersten Antikörper denkbar. Nachteilig am Doppel-Blot- Verfahren ist der deutlich erhöhte Material- und Zeitaufwand.
[0016] Somit sind im Stand der Technik Verfahren zum Nachweis von
Erythropoietin bekannt und dem Fachmann geläufig, aber es wird entweder zum Nachweis des Erythropoietins das oben beschriebene deutlich aufwendigere Dop-
20 pel-Blot-Verfahren eingesetzt (Chuan et.al., Cytotechnology 2006, 51 , 67-79; HoI- laender et.al., Laborpraxis Dezember 2004, 56-59; Lasne, Journal of Immunologi- cal Methods 2003, 276, 223-226) oder bei Anwendung der elektrischen Fokussie- rung nur ein Teil des notwendigen pH-Bereiches auf dem Gel abgebildet, so dass die Selektivität in der Trennung der Isoformen zur Beurteilung der EPO-
25 Rohproduktqualität nicht ausreicht (Wimmer et.al., Cytotechnology 1994, 16, 137- 146). [0017] Die Verfahren des Standes der Technik zum Nachweis von Erythro- poietin sind aber zu aufwendig und für eine Inprozesskontrolle bei der fementati- ven Herstellung von Erythropoietin nicht geeignet.
[0018] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein vereinfachtes und verbessertes Verfahren zum Nachweis von Erythropoietin bereit zu stellen, das der Inprozesskontrolle dient, wobei das Verfahren ermöglicht, die Kulturüberstände aus den EPO-Fermentationsprozessen so zu charakterisieren, dass nur ausgewählte und als geeignet beurteilte Fermentationslösungen den jeweils umfangreichen Reinigungsprozessen zugeführt werden. Insbesondere sollte das vorlie- gende Verfahren vom ökonomischen Gesichtspunkt den Verfahren des Standes der Technik überlegen sein.
Die technische Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Isoformenzusammensetzung von Erythropoietin umfassend die folgenden Schritte: a) isoelektrische Fokussierung einer Erythropoietin enthaltenden Probe in ei- nem Gel über einen pH-Bereich, dessen untere Grenze von 2,5 bis 3,5 und dessen obere Grenze von 5 bis 8 liegt, wobei die Erythropoietin enthaltende Probe aus einem Kulturüberstand von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen stammt; b) Übertragen der im Gel enthaltenen und aufgetrennten Proteine auf eine Membran; c) Nachweis des an der Membran gebundenen Erythropoietins durch spezifische Antikörper.
[0019] In einem bevorzugten Verfahren werden in Schritt c) gegen Erythropoietin gerichtete erste Antikörper an das an der Membran gebundene Erythropoi- etin gebunden, wobei die Bindung der ersten Antikörper an das an der Membran gebundene Erythropoietin nachgewiesen wird, während der erste Antikörper an das an der Membran gebundene Erythropoietin gebunden ist. [0020] Bevorzugt ist dabei, dass der Nachweis der Bindung der ersten Antikörper an das an der Membran gebundene Erythropoietin durch zweite Antikörper erfolgt, die gegen die ersten Antikörper gerichtet sind.
[0021] Dies bedeutet, dass in dem Verfahren in Schritt c) gegen Erythropoi- etin gerichtete erste Antikörper an das an der Membran gebundene Erythropoietin binden, und dass gegen die ersten Antikörper gerichtete zweite Antikörper an die an Erythropoietin gebundenen ersten Antikörper binden.
[0022] Dadurch, dass zusätzlich zur Bestimmung des Gehaltes an EPO, die vorzugsweise mittels ELISA erfolgt, mit einer speziellen isoelektrischen Fokussie- rung (IEF) in Kombination mit einem einzigen Blottingschritt die Isoformen- Zusammensetzung der Fermentationsüberstände direkt bestimmt werden, wird ein vorteilhaftes und vereinfachtes Verfahren bereitgestellt, das zur Kontrolle des Fermentationsprozesses und zur Entscheidung über die Auswahl der aufzureinigenden Kulturüberstände angewandt werden kann.
[0023] Der Fachmann, der sich mit der formulierten Aufgabenstellung konfrontiert sieht, hätte angesichts des bestehenden Standes der Technik nicht mit Aussicht auf Erfolg in Betracht gezogen, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Selektion der Fermentationsfraktionen vor dem Aufreinigungsprozess eingesetzt werden kann. Bislang ist ein vergleichbar einfaches und effizientes Verfahren in der Literatur nicht beschrieben. Vorteilhaft ist insbesondere, dass bei der isoelektrischen Fokussierung erfindungsgemäß ein pH-Bereich, dessen untere Grenze von 2,5 bis 3,5 und dessen obere Grenze von 5 bis 8 liegt, insbesondere in einem pH-Bereich von 3 bis 6, auf dem Gel abgebildet wird, so dass die für die Beurteilung der EPO-Rohproduktqualität notwendige Selektivität in der Trennung der Isoformen ausreichend ist. Weiterhin ist in einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren so weit vereinfacht, dass der Nachweis des Erythropoietins bereits nach einem einzigen Proteintransfer (Blot) erfolgen kann. Im Stand der Technik dagegen wird zur Detektion das deutlich aufwendigere Doppel -Blot-Verfahren eingesetzt. [0024] In einem bevorzugten Verfahren ist ein Enzym, vorzugsweise alkalische Phosphatase, kovalent an den zweiten Antikörper gebunden, das durch kata- lytische Umsetzung eines Substrates eine Farbreaktion erzeugt. Somit ist bevorzugt, zum colohmethschen EPO-Nachweis auf der Membran zwei Antikörperlö- sungen einzusetzen, wovon der zweite Antikörper eine alkalische Phosphatase enthält, so dass dann als Färbereagenz ein Substrat dieses Enzyms eingesetzt werden kann. Besonders bevorzugt werden Anti-EPO-Mouse und Anti-Mouse-IgG in Kombination mit BCIP/NBT (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat / Nitrotetrazoli- umblau) eingesetzt.
[0025] Weiterhin ist bevorzugt, dass nach Inkubation der Membran mit einem ersten gegen Erythropoietin gerichteten Antikörper ein oder mehrere Waschschritte erfolgen und anschließend erneut eine Inkubation der Membran mit dem ersten gegen Erythropoietin gerichteten Antikörper durchgeführt wird. Diese doppelte bzw. mehrfache Inkubation der Membran mit dem gegen Erythropoietin ge- richteten Antikörper ermöglicht eine vollständigere Ausbildung der Antigen- Antikörperreaktion und so eine Erhöhung des spezifischen Signals für Erythropoietin.
[0026] In einem besonders bevorzugten Verfahren enthält mindestens eine
Lösung, die bei den Waschschritten verwendet wird, die einer Inkubation der Membran mit dem ersten gegen Erythropoietin gerichteten Antikörper folgt, eine organische Säure in wässrigem Medium. Damit werden unspezifisch gebundene Antikörper von der Membran wieder entfernt und eventuell noch vorhandene freie Bindungsstellen auf der Blotting-Membran blockiert. Insgesamt wird dadurch die Trennschärfe der Banden deutlich erhöht. Dabei ist bevorzugt, dass die Lösung 0,1 bis 1 ,5 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 1 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,6 bis 0,8 Gew.-% der organischen Säure enthält. Insbesondere handelt es sich bei der organischen Säure um Mono-, Di- oder Tricarbonsäuren (wie z.B. Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure, Adipinsäure oder Citro- nensäure), besonders bevorzugt Essigsäure. [0027] Wie oben erwähnt, wird in einem bevorzugten Verfahren die Inkubation mit der ersten Antikörperlösung zweifach vorgenommen und dazwischen ein vierstufiges Waschprozedere durchgeführt. Dabei wird bevorzugt TBST (Tris- Buffered-Saline-Tween) und TBS (Tris-Buffered-Saline) eine verdünnte wässrige organische Säure eingesetzt. Besonders bevorzugt wird hierzu verdünnte wässrige Essigsäure und ganz besonders bevorzugt verdünnte wässrige Essigsäure im Konzentrationsbereich zwischen 0.5 % und 1 % verwandt.
[0028] In einem bevorzugten Verfahren wird als Membran eine Polyviny- lidenfluorid-Membran eingesetzt. In bevorzugter Weise wird zum Blotting eine Membran eingesetzt, die geeignet ist, Proteine zu binden. Besonders bevorzugt ist eine mikroporöse Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) und ganz besonders bevorzugt wird die Immobilon-P-Blottingmembran der Firma Millipore.
[0029] In einem weiteren bevorzugten Verfahren werden für die isoelektrische Fokussierung Polyacrylamidgele verwendet, die auf einer inerten Trägerfo- Ne angebracht sind. In bevorzugter Weise werden zur IEF standardisierte Polyacrylamidgele eingesetzt, die auf einer inerten Trägerfolie, z.B. aus Polyester gebunden sind. Besonders bevorzugt werden Gele, deren pH-Gradient durch freie Trägerampholyte im elektrischen Feld gebildet wird. Ganz besonders bevorzugt werden Blank PreNets der Fa. Serva.
[0030] Insbesondere ist bevorzugt, dass zur Einstellung des pH-Wertes des
Gels Ampholine eingesetzt werden, die während der isoelektrischen Fokussierung in dem Gel einen pH-Bereich von pH 3 bis pH 6 einstellen. Ganz besonders bevorzugt wird Servalyt™ 3-6 der Fa. Serva eingesetzt.
[0031] In einem weiteren bevorzugten Verfahren stammt die Erythropoietin enthaltende Probe aus einem Kulturüberstand von in Perfusionsreaktoren gehaltenen Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen. Vorzugsweise wird die Erythropoietin enthaltende Probe vor der isoelektrischen Fokusierung entsalzt und gegebenenfalls aufkonzentriert. [0032] In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs- gemäßen Verfahrens erfolgt die Bestimmung der Isoformenzusammensetzung des Erythropoietins während der Fermentation.
[0033] Ebenfalls bevorzugt wird zur EPO-Gehaltsbestimmung der Kultur- überstände ein ELISA Test eingesetzt. Besonders bevorzugt ist der EPO ELISA Test der Fa. Roche Diagnostics.
[0034] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren resultieren im EPO-
Herstellungsprozess ein deutlich geringerer apparativer und personeller Aufwand und somit enorme Zeit- und Kostenersparnis. Spätestens 24 h nach Vorliegen der Probe eines Kulturüberstandes, z.B. aus einem Perfusionsfermentationsprozess, kann entschieden werden, ob eine Aufreinigung der Fermentationslösung sinnvoll ist und wie der Aufreinigungsprozess gesteuert werden kann.
[0035] Als Referenzmaterial dient ein kommerziell erhältliches Erypo®-
Präparat (Janssen-Cilag).
[0036] Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren bereit zur Inpro- zesskontrolle von Kulturüberständen, die aus der Fermentation von Erythropoietin- produzierenden eukaryontischen Zellen stammen, mit dem folgenden Schritten:
a) Bestimmung der Isoformenzusammensetzung von Erythropoietin gemäß dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Erythropoietin; b) Bestimmung des Gehaltes an Erythropoietin in der Probe, vorzugsweise mittels ELISA; c) Auswahl der Fermentationslösungen zur Aufreinigung von Erythropoietin anhand der in Schritten a) und b) erhaltenen Werte und Informationen, oder Wei- terführung der Fermentation. [0037] Das Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass mit einer speziellen isoelektrischen Fokussierung (IEF) die Isoformen- Zusammensetzung der Fermentationsüberstände direkt bestimmt werden kann. Zusammen mit den Daten aus der EPO-Gehaltsbestimmung (vorzugsweise mittels ELISA ermittelt) kann so während oder unmittelbar nach Beendigung der Fermentation direkt die EPO-Qualität im Rohprodukt beurteilt und so der Aufreinigungs- prozess gesteuert werden.
[0038] Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken.
Beschreibung der Figur
[0039] Figur 1 zeigt einen Blot verschiedener EPO-Fraktionen (Fraktioni bis
Fraktion 5) auf einer Membran nach der isoelektrischen Fokussierung und Entwicklung. Die Probe stammt aus einer Perfusionsfermentation einer Erythropoie- tin-produzierenden CHO-Zelllinie über einen Zeitraum von 47 Tagen.
Beispiel
[0040] EPO wird fermentativ in CHO-Zellen produziert. Die Fermentation erfolgt nach Standardverfahren, wie sie in der patent- und wissenschaftlichen Literatur für eukaryontische, insbesondere CHO-Zellen beschrieben sind. Die Kultivierung erfolgt im Perfusionsreaktor in Kulturmedium, das frei von tierischen Kompo- nenten ist. Die Ernte findet in einem Zeitraum bis zu 50 Tagen kontinuierlich statt.
[0041] Jede zu analysierende Fermentationslösung wird vor der isoelektrischen Fokussierung entsalzt und aufkonzentriert. Dazu werden zunächst bei einem Gesamt-EPO-Gehalt von ca. 14 mg/L (wird per ELISA-Test ermittelt) 15 mL der Probe mit dem Ultrazentrifugationskit und einem Molekulargewichts CutOff von 1 OkDa durch Zentrifugation (60 min bei 4000 g und 60 min bei 14000 g) auf 200 μL eingeengt und 12 μL des Konzentrats mit 28 μL Reinstwasser und 10μL Ethanol vermischt und für 60 min bei -20 0C gelagert. Anschließend wird die Probelösung in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert (20 min, 16100 g, 00C) und der LJ- berstand der Lösung zur isoelektrischen Fokussierung eingesetzt (IEF- Probelösung).
[0042] Die isoelektrische Fokussierung startet mit einer Präfokussierung des
Gels (Blank PreNets, Serva; 20 bis 60 min bis ca. 400 Vh), um den pH-Gradienten von pH 3 bis pH 6 auszubilden (Servalyt™ 3-6). Dazu werden Spannung und Stromstärke auf ca. 300 V und 3.5 mA eingestellt (Kathodenpuffer: 1 M Glycin; Anodenpuffer: jeweils 25 mM Asparaginsäure und Glutaminsäure). Danach wer- den jeweils 15 μL der IEF-Probelösung und der Kontrollprobe (Erypo®-Präparat) auf ein Sample Application Piece (Serva) pipettiert und die Lösungen für ca. 2000 Vh durch Anlegen der Spannung isoelektrisch fokussiert. Anschließend wird die Fokussierung kurz unterbrochen und die Sample Application Pieces werden entfernt, bevor der Fokussierungsprozess für weitere ca. 2500 Vh fortgesetzt wird. Nach Überschreiten von 4500 Vh Proben-Fokussierzeit wird die isoelektrische Fokussierung beendet und das Gel in vorgekühltem (4°C) Blotting-Puffer (200 mL 10X Tris/Glycine Buffer (Bio-Rad) werden mit Reinstwasser und 400 mL Methanol auf 2 L verdünnt) 15 min inkubiert.
[0043] Parallel dazu erfolgt gemäß den Angaben des Lieferanten die Vorbe- reitung der Immobilon-P-Blottingmembran (Millipore). Danach wird das Gel unter folgenden Bedingungen auf die Membran geblottet: 50 V konstant für 50 min in Blotting-Puffer (1X Tris/Glycine mit 20 % Methanol, Bio-Rad). Unmittelbar nach dem Proteintransfer werden nacheinander drei Waschschritte zuerst in Methanol und dann zweimal in Wasser jeweils 30 Sekunden durchgeführt. Anschließend wird die Membran in Blockierungslösung (5%-ige Magermilchpulverlösung (Bio- Rad) in IxTBS Puffer (Bio-Rad)) gegeben und bei Raumtemperatur 60 min unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach Entfernung der Blockierungslösung erfolgt ein dreimaliges Waschen in TBST (0.5 % Tween® 20 in TBS (Bio-Rad)). Anschließend erfolgt eine mindestens 4-stündige Inkubation in der ersten Antikörperlösung (1 % BSA (Sigma) in 30 ml IXTBS-Puffer (Bio-Rad) mit 60 μl 500 mM Natriumazid- lösung der 50 μl Anti-EPO-Mouse (RD-Systems)).
[0044] Danach schließt sich ein weiteres Waschprozedere mit TBST, TBS,
0.7%-iger wässriger Essigsäure und dann erneut mit TBST an, wobei die Mem-
5 bran in der Essigsäurelösung 60 min inkubiert wird. Dann wird die Behandlung der Membran mit der ersten Antikörperlösung unter identischen Bedingungen wiederholt. Nach dreimaligen Waschen mit TBST erfolgt die Behandlung der Membran mit der zweiten Antikörperlösung (1 % BSA (Sigma) in 30 ml IXTBS-Puffer (Bio- Rad) mit 60 μl 500 mM Natriumazidlösung der 35 μl Anti-Mouse-IgG (Sigma) zu- lo gefügt wird). Nach dreimaligem Waschen in TBST und zweimaligem Spülen mit AP-Puffer (10 ml_ 5 M Kochsalzlösung werden zusammen mit 50 ml_ 1 M Tris-HCI- Lösung (pH 9,5) und 5 ml_ 1 M Magnesiumchloridlösung mit Reinstwasser auf 1 L Lösungsvolumen verdünnt) erfolgt die Anfärbung des Gels mit BCIP/NBT Liquid Substrate System (Sigma) (10 -20 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schüt- i5 teln). Durch Zugabe von AP-Stoplösung (10 ml 0.5 M Na-EDTA-Lösung (pH 8,0) werden mit 20 mL 1 M Tris-HCI-Lösung (pH 8,0) mit Reinstwasser auf 1 L Lösungsvolumen verdünnt) wird die Farbreaktion beendet und die Membran noch einmal mit Reinstwasser gewaschen. Nach Lufttrocknung kann die Membran visuell oder densitomethsch ausgewertet werden (siehe Fig.1 ).
20 [0045] Die EPO-Gehaltsbestimmung der Kulturüberstände erfolgt mittels
EPO ELISA Test der Fa. Roche Diagnostics GmbH (photometrischer Enzymgebundener Immuno Sorbent Assay zur quantitativen in vitro Bestimmung von Erythropoietin in menschlichem Serum/Plasma zu Forschungszwecken unter Verwendung von Antikörper-vorbeschichteten Mikrotiterplatten).
25 [0046] Für die Einzelfraktionen aus dem Perfusionsreaktor (Gesamtfermen- tationsdauer 47 Tage) werden EPO-Gehalte in folgenden Bereichen ermittelt: Fraktion 1 (Fermentation bis zum Tag 5) : ca. 80 mg/L
Fraktion 2 (Fermentation bis zum Tag 13): ca. 75 mg/L
Fraktion 3 (Fermentation bis zum Tag 20): ca. 140 mg/L
Fraktion 4 (Fermentation bis zum Tag 25): ca. 80 mg/L Fraktion 5 (Fermentation bis zum Tag 32): ca. 150 mg/L
[0047] Die Auswertung der Ergebnisse gemäß Figur 1 ergibt, dass insbesondere die Aufreinigung der Fraktionen 2 und 4 und gegebenenfalls noch der Fraktion 3 sinnvoll ist. In diesen Fraktionen ist der Anteil der therapeutisch nutzbaren Isoformen in Relation zum Gesamt-EPO-Gehalt am höchsten. Im Gegensatz dazu wird zwar für die Fraktion 5 gemäß ELISA-Test der höchste EPO-Gehalt nachgewiesen, die gewünschten Isoformen vergleichend zum Erypo®- Referenzmaterial sind jedoch nur in Spuren enthalten.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung der Isoformenzusammensetzung von Erythro- poietin umfassend die folgenden Schritte: a) isoelektrische Fokussierung einer Erythropoietin enthaltenden Probe in ei- 5 nem Gel über einen pH-Bereich, dessen untere Grenze von 2,5 bis 3,5 und dessen obere Grenze von 5 bis 8 liegt, wobei die Erythropoietin enthaltende Probe aus einem Kulturüberstand von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen stammt; b) Übertragen der im Gel enthaltenen und aufgetrennten Proteine auf eine lo Membran; c) Nachweis des an der Membran gebundenen Erythropoietins durch spezifische Antikörper.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) gegen Erythropoietin gerichtete erste Antikörper an das an der Membran ge- i5 bundene Erythropoietin binden, und dass die Bindung der ersten Antikörper an das an der Membran gebundene Erythropoietin nachgewiesen wird, während der erste Antikörper an das an der Membran gebundene Erythropoietin gebunden ist.
3. Das Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Bindung der ersten Antikörper an das an der Membran gebundene
20 Erythropoietin durch zweite Antikörper erfolgt, die gegen die ersten Antikörper gerichtet sind.
4. Das Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) gegen Erythropoietin gerichtete erste Antikörper an das an der Membran gebundene Erythropoietin binden, und dass gegen die ersten Antikörper gerichtete
25 zweite Antikörper an die an Erythropoietin gebundenen ersten Antikörper binden.
5. Das Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym, vorzugsweise alkalische Phosphatase, kovalent an den zweiten Antikörper gebunden ist, das durch katalytische Umsetzung eines Substrates eine Farbreaktion erzeugt.
5 6. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass nach Inkubation der Membran mit einem ersten gegen Erythropoi- etin gerichteten Antikörper ein oder mehrere Waschschritte erfolgen und anschließend erneut eine Inkubation der Membran mit dem ersten gegen Erythropoietin gerichteten Antikörper durchgeführt wird.
lo 7. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Lösung, die bei den Waschschritten verwendet wird, die einer Inkubation der Membran mit dem ersten gegen Erythropoietin gerichteten Antikörper folgt, eine organische Säure in wässrigem Medium enthält.
8. Das Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Lö- i5 sung 0,1 bis 1 ,5 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 1 Gew.-%, besonders bevorzugt
0,6 bis 0,8 Gew.-% der organischen Säure enthält.
9. Das Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Säure eine Mono-, Di- oder Tricarbonsäure ist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure,
20 Bernsteinsäure, Ascorbinsäure, Adipinsäure oder Citronensäure, und besonders bevorzugt Essigsäure ist.
10. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Membran eine Polyvinylidenfluorid-Membran eingesetzt wird.
11. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch ge- 25 kennzeichnet, dass für die isoelektrische Fokussierung Polyacrylamidgele verwendet werden, die auf einer inerten Trägerfolie angebracht sind.
12. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Einstellung des pH-Wertes des Gels Ampholine eingesetzt werden, die während der isoelektrischen Fokussierung in dem Gel einen pH- Bereich von pH 3 bis pH 6 einstellen.
5 13. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Erythropoietin enthaltende Probe aus einem Kulturüberstand von in Perfusionsreaktoren gehaltenen Erythropoietin-produzierenden euka- ryontischen Zellen stammt.
14. Das Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die lo Erythropoietin enthaltende Probe vor der isoelektrischen Fokusierung entsalzt und gegebenenfalls aufkonzentriert wird.
15. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Isoformenzusammensetzung des Erythropoietins während der Fermentation erfolgt.
i5 16. Verfahren zur Inprozesskontrolle von Kulturüberständen, insbesondere aus Perfusionsreaktoren, die aus der Fermentation von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen stammen, mit dem folgenden Schritten: a) Bestimmung der Isoformenzusammensetzung von Erythropoietin gemäß dem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15;
20 b) Bestimmung des Gehaltes an Erythropoietin in der Probe, vorzugsweise mittels ELISA; c) Auswahl der Fermentationslösungen zur Aufreinigung von Erythropoietin anhand der in Schritten a) und b) erhaltenen Werte und Informationen, oder Weiterführung der Fermentation.
25
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