EP2356229A1 - Verfahren zur hochdurchsatzfähigen präparation sequenzierungsfähiger dna aus enzelnen plaques von peptiden präsentierenden phagen - Google Patents

Verfahren zur hochdurchsatzfähigen präparation sequenzierungsfähiger dna aus enzelnen plaques von peptiden präsentierenden phagen

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Publication number
EP2356229A1
EP2356229A1 EP09741232A EP09741232A EP2356229A1 EP 2356229 A1 EP2356229 A1 EP 2356229A1 EP 09741232 A EP09741232 A EP 09741232A EP 09741232 A EP09741232 A EP 09741232A EP 2356229 A1 EP2356229 A1 EP 2356229A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
phage
dna
phages
pcr
medium
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09741232A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bastian Budde
Amber Riblett
Sascha Plug
Jürgen BENTING
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Bayer Intellectual Property GmbH
Original Assignee
Bayer Technology Services GmbH
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Filing date
Publication date
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Publication of EP2356229A1 publication Critical patent/EP2356229A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for DNA isolation from single plaques of peptide-presenting bacteriophages in a high-throughput PCR, wherein the PCR products obtained are sequenceable and a sample of each phage examined remains in a reproducible state.
  • the PCR succeeds despite the presence of inhibiting components, for example, from the culture medium or the host bacteria.
  • Bacteriophages are virus-like particles that can infect bacteria and use them as specific host cells for propagation. They consist of one or more envelope proteins that include the phage genome (ssDNA or dsDNA).
  • Such libraries are used, for example, to identify binding partners in which, in a repetitive selection process ("biopanning”), the library phages first interact with a substrate via their presented peptides and subsequently wash out weakly or non-binding phages ("phage display ”) is used, for example, to screen protein-protein interactions.
  • biopanning the library phages first interact with a substrate via their presented peptides and subsequently wash out weakly or non-binding phages
  • phage display Another possible application is the identification of phages as selective, optionally self-assembling adhesion promoters.
  • the coupling of an inorganic substrate with biological components for modifying the surface properties is known in biomimetics. From a phage library selected, short peptides presenting bacteriophages have hitherto been used, for example, to precipitate or deposit inorganic materials (WO2003 / 078451).
  • hybrid materials of an inorganic substrate and specific polypeptide ligands are used as a potential solution for changing the substrate surface.
  • the concept of a bifunctional ligand for binding two inorganic components is addressed in the art (see, for example, Sarikaya et al., Nature Materials, 2003, 2, 577-585).
  • the binding of cells or biomolecules to a polymer substrate by bacteriophages having bifunctional binding properties is described, for example, in WO2004 / 035612. It is possible to use bacteriophages to treat the Adhesion of a coating material (eg a paint) on surfaces to be coated (eg a polymer workpiece) to improve.
  • a coating material eg a paint
  • phages for the adhesion promotion of an active substance with a substrate in order, for example, to bind active substances to a target in a targeted manner, to direct active substances in a targeted manner into a body region or to achieve a time-delayed release of active substances.
  • a phage display library is usually exposed to a substrate so that binding of some phage can take place. Weak or non-binding phages are washed off using a wash buffer. After washing still binding phages are then peeled off (eluted) using another buffer (elution buffer). The eluted phages are propagated and re-exposed to the substrate in further rounds of panning until a population of well-binding phage accumulates.
  • the phage clones are usually singulated on agar plates in a so-called plaque assay and in a random sample a sufficiently large number of phage plaques are selected and picked up from the nutrient medium (picking). These are then separately amplified in a lengthy process in host cells, separated from the host cells and purified by repeated precipitation and concentrated to obtain a sufficient amount of DNA for the following steps. By lysis of the protein shell, the DNA of the phage clones is cleaned with subsequent precipitation and concentrated. This DNA can then be used as a template for a polymerase chain reaction (PCR) to determine its base sequence (Sanger DNA sequencing). In sequencing, the base sequence is usually determined only for that DNA segment in which the phage clones differ.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the sample of clones examined for their sequence is on the order of 10 pieces. But if you want a more accurate statement about the enrichment of a clone or the appearance of a binding motif often requires sequencing of 50-100 phage clones.
  • the determination of the binding peptide sequence of the phage clones consists of the following steps: A) separation of the phages from the binding phage population obtained from step 2 on a nutrient medium hosted by host bacteria by plating out a suitable dilution of the phages,
  • a high-throughput method for DNA preparation of phages which generates a DNA capable of replication and generates DNA capable of being sequenced directly from phage plaques without the complicated steps of phage amplification and DNA isolation being necessary.
  • phages after singulation a culture medium containing host bacteria (plaque assay) can be suspended in a medium immediately after picking and fed to a lysis with subsequent optimized PCR. In each case, a replicable sample remains behind from each phage clone.
  • the present invention therefore relates to a method for the high-throughput preparation of DNA capable of sequencing from individual plaques of peptides presenting phages while at the same time obtaining infectious phages, comprising at least the following steps:
  • peptide is also used synonymously for the terms "protein” or "protein part.”
  • Peptides can bind bacteriophages to a substrate, whereby these peptides are gene products of the phage genome which, for example, encase the envelope
  • a binding peptide does not have to be present on the natural form of the phage ("wild-type") but can be presented on the phage, for example, by means of molecular genetic manipulations of the phage genome.
  • Such a binding peptide is e.g. on further peptides / proteins of the bacteriophage fused, which means that it is either N-terminal or C-terminal via a peptide bond with the other protein / peptide.
  • a first step of the method according to the invention is the separation of peptides presenting phages from a phage population (A).
  • Methods for the separation of microorganisms and cells are known to those skilled in the field of microbiology.
  • the isolation can be done, for example, by plating out a suitable dilution of the phages (the appropriate dilution can be determined empirically) on a nutrient medium containing appropriate host bacteria (eg an agar plate).
  • the isolated phages are amplified (eg by incubation) until a sufficient amount of phage is present (B).
  • a sufficient amount is to be understood as meaning an amount which makes it possible to carry out the subsequent steps of the method according to the invention, in particular step (C) of the uptake of the phages.
  • a sufficient amount is understood to mean an amount visible to the human eye which can be absorbed by a suitable tool (eg a pipette tip).
  • the phages are taken up in a third step of the method according to the invention with a suitable sterile tool from the soil (picking) and the thus obtained phage, bacteria and nutrient-containing sample (the so-called. "Agar-plug" in a for the A suitable medium is defined as preserving the infectivity of the phage therein, for which the medium must have suitable conditions for hydrophilicity and polarity of the solvent as well as pH and ionic strength an aqueous solution of approximately neutral pH (eg a buffer) and suitable salinity Suitable media are, for example, LB medium (lysogeny broth) or PBS (English phosphate-buffered saline) If the phages used are the host bacteria Confer antibiotic resistance, it is advantageous to add to the medium used this antibiotic to Avoid growth of contaminating bacteria. In a high-throughput process, picking can be performed, for example, in sterile 96-well
  • a suitable sterile tool is defined by the fact that you can transfer the plaque completely from the nutrient medium in a working vessel, without much of the other nutrient medium are dissolved out with.
  • a suitable tool is e.g. a tubular instrument having an inner diameter equal to the outer diameter of the
  • Agar plaques with which the agar plaque can be gouged.
  • a sterile disposable pipette tip or a Pasteur pipette is used, by means of which the plaque is punched out and then the agar plug is blown out into the medium with a pipette.
  • the picked phage clone is suspended in the medium and then exposed to an energy input, preferably ultrasound treatment. Also possible are vertexes as well as mechanical crushing of the agar plug. These procedures apparently promote the passage of phage from the culture medium into the medium.
  • the volume of the medium should exceed the volume of the agar plug by a multiple, preferably by a factor of 2 to 10.
  • a volume is chosen in which the agar plug is completely covered in the vessel used.
  • an agar plug picked with a disposable pipette tip is suspended in a well of a 96-well plate in 20 to 100 ⁇ l of medium.
  • the suspension must be freshly processed.
  • the lysis of the clone is carried out with subsequent PCR within 16 hours, more preferably within 8 hours. If one day has elapsed between the cloning of the clone and the PCR reaction, there may be errors in the amplification of the template DNA. Apparently, a sufficiently large amount diffuses more inhibitory in the course of this period
  • the lysis buffer contains a buffer substance in aqueous solution at a slightly alkaline pH, a surfactant and a complexing agent.
  • the buffer substance is preferably used in a pH range> 8 and ⁇ 9, a non-denaturing, nonionic substance as surfactant and a chelating agent which complexes divalent metal ions.
  • Tris, Tricin, Bicin or Taps at a pH of 8.3 are particularly preferred, as surfactant an octylphenol ethoxylate (eg Triton X-100 or Nonidet-P40) or a polysorbate (eg Tween®-20) as well as complexing agent EDTA, EGTA, citrate, oxalate or tartrate used.
  • an octylphenol ethoxylate eg Triton X-100 or Nonidet-P40
  • a polysorbate eg Tween®-20
  • the Lyse intimid comprises heating the suspension to a temperature> 40 0 C and ⁇ 100 0 C, preferably to a temperature> 80 0 C and ⁇ 98 0 C, more preferably to a temperature> 93 0 C and ⁇ 97 0 C.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Sequencing of the phage DNA e.g. connect to Sanger.
  • the determined sequence of the variable region of the phage clone DNA allows the conclusion to the amino acid sequence of the binding peptide.
  • the identified DNA sequence can be used to genetically engineer other phage to present the same bindable peptides as fusion proteins.
  • the phages differ only in the binding peptide
  • only the part of the phage DNA responsible for the coding of the variable peptides is amplified by PCR. This is done by choosing two suitable primers that bind to binding sites just before or just after the variable region of the phage DNA.
  • the primers are selected such that the resulting in the PCR amplicon has a size of> 60 and ⁇ 500 bp.
  • the method of the invention is generally accessible to all phages that can form a plaque. It is preferably used for DNA preparation from clones of phage display libraries.
  • the method according to the invention is preferably suitable as a DNA preparation process for phages which present at least one sort of randomized peptides fused to their coat proteins, which have a length of from> 1 amino acids to ⁇ 100 Amino acids, preferably> 5 amino acids to ⁇ 50 amino acids, more preferably> 6 amino acids to ⁇ 20 amino acids.
  • the peptides can be linear but also loop-shaped. Peptides with such a number of amino acids can be well fused to the phage proteins by conventional molecular biological methods and are suitable for binding to substrates.
  • Such short-chain binding peptides have the advantage that the DNA of the various phages in the considered phage population is largely identical and has only differences in the regions of the DNA which encodes the binding peptides.
  • the PCR can be targeted on short DNA sections (> 60 and ⁇ 500 bases), which has the advantage that the same primer and the same PCR conditions can be used for all the picked clones.
  • the erfmdungswashe method is suitable in a particular embodiment preferably as a DNA preparation process for phages of type Ml 3.
  • phages are well changeable and readily available (for example, New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Germany) and readily reproducible in culture. They have as gene products the proteins gpi ⁇ , gpVI, gpVII, gpVIH and gpIX. At least one additional short peptide may be fused to the protein gpIII or gpVTQ. The extension of these proteins with additional peptides, ie, the fusion, is well feasible on these proteins.
  • M13 phage display libraries comprising a randomized peptide as a gpHI fusion protein, in particular as a linear peptide with a length of 7 amino acids, as a linear peptide with a length of 12 amino acids, or as a loop-shaped peptide with 7 amino acids , which are framed by a disulfide bridge between two cysteine residues (trade names Ph.D.-7 TM, Ph.D.-12 TM and Ph.D.-C7C TM, respectively).
  • the method according to the invention is part of a selection process for substrate-binding phage species from a library presenting randomized peptides.
  • a binding phage has the property that it can bind to at least one substrate via a peptide which has been fused to a phage-clad protein.
  • the person skilled in the art is aware of this technique as a "phage display”.
  • FIG. 1 shows the result of a PCR which was carried out with differently treated M13 phage plaques as DNA source.
  • the PCR products were loaded on a 1.2% (w / v) agarose gel and electrophoresed. The agarose gel was stained with ethidium bromide and photographed under UV light.
  • 2: complete, intact phage plaque 3: phage plaque suspended in LB medium according to the invention
  • 4 positive control (purified phage DNA), 5: negative control (without DNA template).
  • the phage plaque as a DNA source (lane 3) suspended in LB medium according to the invention gives a qualitatively equivalent product as the purified phage DNA (lane 4).
  • the complete plaque can also be used successfully as a DNA source (lane 1), but no intact phage remain from this sample for later amplification. Despite the high number of 40 PCR cycles, no artifacts are found in the negative control (lane 5).
  • FIG. 2 shows the result of a PCR performed with M13 phage plaques suspended in LB medium as DNA source.
  • the PCR products were loaded on a 1.2% (w / v) agarose gel and subjected to electrophoresis. The agarose gel was stained with ethidium bromide and photographed under UV light.
  • 1 DNA size standard
  • 2-9 plaques of different phage clones
  • 10 positive control (purified phage DNA)
  • 11 negative control (without DNA template).
  • the 334 bp PCR products can be clearly recognized in the samples of good quality (lanes 3-9) and in the positive control (lane 10).
  • the lower running phage clone DNA in lane 2 could be identified in the subsequent sequencing as phage without insert (equivalent to M 13KE without library insert).
  • the negative control (lane 11) shows no artifacts as expected.
  • Figure 3 shows a typical elution profile of DNA sequencing performed on the primer "-96gIII" (5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG ⁇ ', see example) on a PCR product of a phage plaque according to the invention
  • the phage clone is derived from a Ph .D.-12 TM M13 Phage Display Library
  • the phage clone variable DNA region of interest (position 89-124) has high sequence quality.
  • Polyurethane substrate was made from mixing equivalent amounts of Desmophen® 670 BA and Desmodur® N3300 (Bayer MaterialScience AG), the curing was carried out for 16 h at room temperature. 20 mg of the substrate were for 10 min in Tris-buffered saline (TBS, consisting of 50 mmol / 1 Tris-HCl pH 7.5, 150 mmol / 1 NaCl) and equilibrated for 60 min with 4 * 10 10 pfu (10 ul of the original Library) in 1 ml of TBS at room temperature. The substrate was washed ten times with 10 ml each of TBST (TBS plus 0.1 vol% Tween-20) (by short vortexing, five minutes rotation plus 5 seconds ultrasonic bath).
  • TBS Tris-buffered saline
  • the first elution was carried out in acid by immersing the substrate in 1 ml of 0.1 mol / 1 glycine pH 2.5 for 10 s with subsequent neutralization of the substrate in 1 ml of 0.1 mol / 1 Tris-HCl pH 8 for 1 min.
  • the first elution solution was neutralized by adding 200 ⁇ l of 1 mol / l Tris-HCl pH 8.
  • the second elution was carried out in basic by immersing the substrate in 1 ml of 0.1 mol / l triethylamine pH 11.5 for 1 min, followed by neutralization of the substrate in 1 ml of 0.1 mol / l Tris-HCl pH 7.5 for 1 minute
  • the second elution solution was neutralized by adding 200 ⁇ l of 1 mol / l Tris-HCl pH 7.5.
  • the substrate was then stored in TBST to observe time-release effects of non-eluted phage.
  • the elution fraction was then subjected to a plaque assay.
  • bacteria of strain E. coli K12 ER2738 New England Biolabs
  • LB-Tet agar plate 15 g / l agar, 10 g / l bacto-tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl, 20 mg / 1 tetracycline
  • LB-Tet medium (10 g / l bacto-tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl, 20 mg / 1 tetracycline) were inoculated with a single colony ER2738 and up to an OD 60O of 0.4 at 37 0 C shaken.
  • the phage DNA for the positive control was isolated and purified in the following manner: 2 ml of LB-Tet medium were inoculated with 100 ⁇ l of an E. coli ER2738 bacterial suspension (see above) and a blue plaque from a plaque assay and incubated for 4.5 h shaken at 37 0 C. The culture was centrifuged for 10 min at 4500 xg and 4 0 C and the supernatant then centrifuged again. 1 ml of the supernatant was mixed with 500 ul PEG / NaCl solution and incubated for 2 h at 4 0 C.
  • the phages were 15 min at 14,000 xg and 4 0 C and centrifuged in 100 ul of 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 4 M NaI resuspended.
  • the DNA was precipitated by adding 250 ul of ethanol and 10 min at 14,000 ⁇ g for 15 min and 20 0 C by centrifugation.
  • the pellet was washed with 70% ethanol, 1 min at 14,000 xg and 20 0 C centrifuged, dried and resuspended in 30 ul 10 mM Tris-HCl pH 8.0 resuspended.
  • the 96-well plate was sealed with PCR strips.
  • the lysis of the phage was carried out by heating the plate for 20 min at 95 0 C in a thermocycler. Subsequently, the PCR was performed.
  • 26 ⁇ l of PCR master mix which had the following composition, were pipetted into each well:
  • the PCR primers have the following sequence:
  • the primers in the case of the Ph.D.-12 TM phage library used which is based on the vector M13KE, include a region of 334 bp long containing the 36 bp variable sequence of each phage clone.
  • the PCR cycle was performed in a thermocycler with the following conditions: 1st 30 sec 95 0 C
  • PCR products were separated in a 1.2% agarose gel in TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 50 mM Na 2 -EDTA pH 8.0). In this way, a sample of 8 samples was analyzed for their quality (Figure 2).
  • Anticodon strand of the template was first rewritten in the complementary sequence.
  • the variable region amino acid sequence could then be analyzed using the reduced genetic code (Ph.D.-12 TM Phage Display Peptide Library Kit Instruction Manual, Ph.D.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur DNA-Isolierung aus Einzelplaques von Peptiden präsentierenden Bakteriophagen in einer hochdurchsatzfähigen PCR, wobei die erhaltenen PCR-Produkte sequenzierungsfähig sind und eine Probe jedes untersuchten Phagen in einem vermehrungsfähigen Zustand zurückbleibt. Die PCR gelingt trotz Anwesenheit inhibierender Bestandteile aus dem Nährboden oder den Wirtsbakterien.

Description

Verfahren zur hochdurchsatzfähigen Präparation sequenzierungsfähiger DNA aus einzelnen Plaques von Peptiden präsentierenden Phagen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur DNA-Isolierung aus Einzelplaques von Peptiden präsentierenden Bakteriophagen in einer Hochdurchsatz-PCR, wobei die erhaltenen PCR- Produkte sequenzierungsfähig sind und eine Probe jedes untersuchten Phagen in einem vermehrungsfähigen Zustand zurückbleibt. Die PCR gelingt trotz Anwesenheit inhibierender Bestandteile, die zum Beispiel aus dem Nährboden oder den Wirtsbakterien stammen.
Bakteriophagen (kurz: Phagen) sind virusähnliche Partikel, die Bakterien infizieren können und diese als spezifische Wirtszellen zur Vermehrung nutzen. Sie bestehen aus einem oder mehreren Hüllproteinen, die das Phagengenom (ssDNA oder dsDNA) einschließen.
Eine wichtige biotechnologische Anwendung für Bakteriophagen nutzt die direkte Kopplung von Genotyp und Phänotyp. Durch gentechnische Modifizierung des Phagengenoms mittels Einbau entsprechender Oligonucleotidsequenzen in die DNA können Peptide, Proteinteile oder gesamte Proteine an Hüllproteine des Phagen angekoppelt (fusioniert) und so auf der Oberfläche des Phagen präsentiert werden. Randomisiert man einen Teil der in die DNA ligierten Oligonucleotidsequenzen, erhält man eine entsprechend große Bibliothek von Phagen, die korrespondierend randomisierte Peptide tragen (engl, „phage display library").
Solche Bibliotheken werden beispielsweise zur Identifizierung von Bindungspartnern genutzt, in dem in einem repetitiven Selektionsprozess („biopanning") die Bibliotheks-Phagen über ihre präsentierten Peptide zunächst mit einem Substrat wechselwirken und anschließend schwach oder nicht bindende Phagen herausgewaschen werden. Diese Technik („phage display") wird beispielsweise zum Screening von Protein-Protein-Wechselwirkungen benutzt. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist die Identifikation von Phagen als selektive, ggf. selbstorganisierende Haftvermittler. Die Kopplung eines anorganischen Substrats mit biologischen Komponenten zur Modifikation der Oberflächeneigenschaften ist in der Biomimetik bekannt. Aus einer Phagenbibliothek selektierte, kurze Peptide präsentierende Bakteriophagen wurden bisher beispielsweise dazu verwendet, anorganische Materialien zu fällen bzw. abzuscheiden (WO2003/078451). Auch Hybridmaterialien aus einem anorganischen Substrat und spezifischen Polypeptid-Liganden werden als potentielle Lösung zur Veränderung der Substratoberfläche verwendet. Das Konzept eines bifunktionellen Liganden zur Bindung von zwei anorganischen Komponenten wird im Stand der Technik angesprochen (siehe zum Beispiel Sarikaya et al., Nature Materials, 2003, 2, 577-585). Die Bindung von Zellen oder Biomolekülen an einem Polymersubstrat durch Bakteriophagen mit bifunktionellen Bindungseigenschaften ist zum Beispiel in WO2004/035612 beschrieben. Es ist möglich, Bakteriophagen einzusetzen, um die Haftung eines Beschichtungsmaterials (z.B. ein Lack) auf zu beschichtenden Oberflächen (z.B. ein Polymerwerkstück) zu verbessern. Ebenso ist es möglich, Phagen zur Haftvermittlung eines Wirkstoffes mit einem Substrat einzusetzen, um z.B. Wirkstoffe zielgerichtet an ein Target zu binden, Wirkstoffe zielgerichtet in eine Körperregion zu lenken oder zeitverzögerte Freisetzung von Wirkstoffen zu erzielen.
Zusammenfassend besteht also ein großer Bedarf an der Herstellung, Isolierung und Identifikation von Phagen mit spezifischen Eigenschaften für eine Vielzahl von Anwendungen.
Die Selektion von Phagen aus einer Phagenbibliothek, in der die Phagen eine Vielzahl unterschiedlicher Peptide präsentieren, ist nach dem Stand der Technik bekannt (Sarikaya et al., Nature Materials, 2003, 2, 577-585; O'Neil und Hoess, Current Opinion in Structural Biology, 1995, 5, 443-449; Smith und Scott, Methods in Enzymology 1993, 217, 228-257; Sambrook und Russell (Hrsg.), 2001, Molecular cloning: A laboratory manual (third edition), CoId Spring Harbor Press, Seite 18.115 bis 18.122).
Für die evolutive Selektion von einigen Phagenspezies aus einer großen kombinatorischen Phagenpopulation an einem Substrat wird üblicherweise eine Phagen-Display-Bibliothek einem Substrat ausgesetzt, so dass die Bindung von einigen Phagen stattfinden kann. Schwach oder nicht bindende Phagen werden durch Benutzung eines Waschpuffers abgewaschen. Nach dem Waschen noch bindende Phagen werden anschließend durch Benutzung eines anderen Puffers (Elutionspuffer) abgelöst (eluiert). Die eluierten Phagen werden vermehrt und in weiteren Panning-Runden erneut dem Substrat ausgesetzt, bis sich eine Population von gut bindenden Phagen anreichert. Nach jeder Panning-Runde werden die Phagenklone üblicherweise auf Agar- Platten in einem so genannten Plaque-Assay vereinzelt und in einer Stichprobe eine ausreichend große Anzahl von Phagenplaques ausgewählt und vom Nährboden aufgenommen (Picking). Diese werden dann separat in einem langwierigen Prozess in Wirtszellen vermehrt (amplifiziert), von den Wirtszellen getrennt und durch wiederholte Fällung gereinigt und aufkonzentriert, um eine genügend große Menge an DNA für die folgenden Schritte zu erhalten. Durch Lyse der Proteinhülle wird die DNA der Phagenklone unter nachfolgender Fällung gereinigt und aufkonzentriert. Diese DNA kann dann als Templat für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt werden, um deren Basenabfolge zu bestimmen (DNA-Sequenzierung nach Sanger). Bei der Sequenzierung wird üblicherweise die Basenabfolge nur desjenigen DNA-Abschnitts bestimmt, in dem sich die Phagenklone unterscheiden.
Häufig befindet sich die Stichprobe der auf ihre Sequenz überprüften Klone in der Größenordnung von 10 Stück. Will man jedoch eine genauere Aussage über die Anreicherung eines Klons bzw. das Auftreten eines Bindungsmotivs erhalten, ist oft eine Sequenzierung von 50-100 Phagenklonen notwendig.
Im Stand der Technik lassen sich zwar Hochdurchsatzverfahren zur Präparation von sequenzierungsfähiger DNA (Sequenzierungstemplaten) finden, jedoch benötigen diese Verfahren stets größere Mengen fermentierter Phagensuspension als DNA-Quelle, ohne auf die zeitsparende und effiziente PCR-Methode zurückzugreifen. Die Gewinnung der Phagensuspensionen aus den Einzelplaques benötigt aber stets mehrere Stunden der Fermentation in Wirtsbakterien. So isoliert z.B. Wilson (Biotechniques 1993, 15(3), S. 414-422) die DNA durch Natriumiodid-Behandlung von Phagensuspensionen mit anschließender Ethanolfällung bzw. magnetischer Separation. Haas und Smith (Biotechniques 1993, 15(3), S. 422-41) präparieren die DNA aus Phagensuspensionen durch alkalische Hydrolyse. In DE3724442 Al wird die DNA aus Phagensuspensionen über Glasfaserfilter gereinigt. In DE69008825T2 ersetzen die Erfinder die Zentrifugationsschritte durch Filtrationsverfahren. Körner et al. (DNA Seq. 1994, 4(4), S. 253-257) nutzen einen halbautomatischen Cell Harvester, benötigen allerdings ebenfalls größere Mengen Phagensuspensionen. Die DNA-Präparation aus Einzelplaques wird bei Wang et al. (Biotechniques 1995, 18(1), S. 130-135) beschrieben. Jedoch bleiben auch dort aufgrund der verwendeten Lifting- Methode keine vermehrungsfähigen Phagen erhalten. Vaiman (Biotechniques 2002, 33(4), S. 764- 766) nutzt die PCR-Technik zum Screenen großer λ-Genbibliotheken, allerdings unter Verlust der Vermehrungsfähigkeit der einzelnen Phagen sowie der Gefahr von Kontaminationen durch Bildung von „Superpools".
Die Selektion von Phagenspezies aus einer kombinatorischen Phagenpopulation umfasst nach dem Stand der Technik die folgenden Schritte:
1) Inkubation einer Phagen-Display-Bibliothek mit einem Substrat,
2) Separation der an das Substrat bindenden und nicht-bindenden Phagen,
3) Bestimmung der Sequenz des präsentierten Peptids von einigen der bindenden Phagen,
4) Amplifizierung der bindenden Phagen,
5) Ggf. mehrfache Wiederholung der Schritte 1 bis 4, dabei bildet das Amplifikat der bindenden Phagen die neue Bibliothek,
Die Bestimmung der bindenden Peptidsequenz der Phagenklone besteht dabei aus den folgenden Schritten: - A - a) Vereinzelung der Phagen aus der aus Schritt 2 erhaltenen bindenden Phagenpopulation auf einem mit Wirtsbakterien belegten Nährboden durch Ausplattieren einer geeigneten Verdünnung der Phagen,
b) Separate Amplifizierung einer genügend großen Stichprobe bindender Phagenklone,
c) Trennung der einzelnen Phagenklone von den Wirtszellen,
d) Reinigung der Phagenklone und Aufkonzentration,
e) Isolierung der DNA der einzelnen bindenden Phagenklone,
f) Reinigung und Aufkonzentration der DNA,
g) Sequenzierung der DNA durch eine Polymerase-Kettenreaktion nach Sanger,
h) Bestimmung der Identität (Sequenz) des bindenden Peptids durch Übersetzen der DNA-
Sequenz.
Diese nach dem Stand der Technik etablierte Vorgehensweise beinhaltet viele Verfahrensschritte zwischen dem Vereinzeln der Phagen im Plaque-Assay und der DNA-Sequenzierung, die zeitaufwändig und fehleranfällig sind. Ebenso ist die Zahl der parallel bearbeitbaren Proben begrenzt. Vor dem Hintergrund der oben skizzierten hohen Bedeutung von Phagen und der Vielzahl an Einsatzmöglichkeiten wäre es wünschenswert, den Prozess der Identifizierung von für den jeweiligen Anwendungszweck geeigneten Phagen beschleunigen und parallelisieren zu können. Wünschenswert wäre außerdem die Möglichkeit, die Phagen dabei in einem vermehrungsfähigen Zustand zu erhalten, um interessante Phagenklone nach der Sequenzierung separat zu vermehren und für andere Zwecke einzusetzen.
Es stellt sich demnach ausgehend vom Stand der Technik die Aufgabe, ein Verfahren zur DNA- Präparation von Kandidaten-Phagenklonen aus einer Phagenpopulation bereitzustellen, das gegenüber den nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren kostengünstiger und weniger zeitaufwändig ist, das die parallele Bearbeitung einer größeren Anzahl von Proben erlaubt und das nach der Sequenzierung erlaubt, ausgewählte Phagenklone in ihren Wirtsbakterien zu vermehren.
Überraschend wurde ein hochdurchsatzfähiges Verfahren zur DNA-Präparation von Phagen gefunden, das unter Erhalt einer vermehrungsfähigen Probe sequenzierungsfähige DNA direkt aus Phagenplaques generiert, ohne dass die aufwändigen Schritte der Phagen-Amplifikation und DNA- Isolierung nötig sind. Überraschend wurde gefunden, dass Phagen nach der Vereinzelung auf einem Wirtsbakterien enthaltenden Nährboden (Plaque Assay) direkt nach dem Picking in einem Medium suspendiert sowie einer Lyse mit nachfolgender optimierter PCR zugeführt werden können. Dabei bleibt von jedem Phagenklon eine vermehrungsfähige Probe zurück.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur hochdurchsatzfähigen Präparation sequenzierungsfähiger DNA aus einzelnen Plaques von Peptiden präsentierenden Phagen bei gleichzeitigem Erhalt infektiöser Phagen, mindestens umfassend die folgenden Schritte:
A Vereinzelung von Peptiden präsentierenden Phagen aus einer Phagenpopulation auf einem Wirtsbakterien enthaltenden Nährboden,
B Inkubation zur Amplifϊzierung der vereinzelten Phagen bis eine ausreichende
Menge vorhanden ist,
C Aufnahme der Phagen aus dem Nährboden und Suspendierung in einem geeigneten Medium,
D Lyse eines Teils der suspendierten Phagen aus Schritt C sowie Verwendung dieses DNA-haltigen Lysats als Templat in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Der Begriff „Peptid" wird hier synonym auch für die Begriffe „Protein" oder „Proteinteil" verwendet. Über präsentierte Peptide (oder Proteine oder Proteinteile) können Bakteriophagen an ein Substrat binden. Dabei sind diese Peptide Genprodukte des Phagengenoms, welche beispielsweise die Hülle des Bakteriophagen aufbauen. Ein bindendes Peptid muss nicht auf der natürlichen Form des Phagen („Wildtyp") enthalten sein, sondern kann beispielsweise mittels molekulargenetischer Manipulationen des Phagengenoms auf dem Phagen präsentiert werden. Ein solches bindendes Peptid ist z.B. auf weiteren Peptiden/Proteinen des Bakteriophagen fusioniert, was bedeutet, dass es entweder N-terminal oder C-terminal über eine Peptidbindung mit dem weiteren Protein/Peptid verbunden ist.
Ein erster Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt die Vereinzelung von Peptiden präsentierenden Phagen aus einer Phagenpopulation dar (A). Methoden zur Vereinzelung von Mikroorganismen und Zellen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Mikrobiologie bekannt. Die Vereinzelung kann beispielsweise durch Ausplattieren einer geeigneten Verdünnung der Phagen (wobei die geeignete Verdünnung empirisch ermittelt werden kann) auf einem entsprechende Wirtsbakterien enthaltenden Nährboden (z.B. einer Agarplatte) erfolgen. In einem zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die vereinzelten Phagen amplifiziert (z.B. mittels Inkubation) bis eine ausreichende Menge an Phagen vorhanden ist (B). Unter ausreichender Menge ist eine Menge zu verstehen, die es erlaubt, die nachfolgenden Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere Schritt (C) der Aufnahme der Phagen, auszuführen. Bevorzugt wird unter einer ausreichenden Menge eine mit dem menschlichen Auge sichtbare Menge verstanden, die mit einem geeigneten Werkzeug (z.B. einer Pipettenspitze) aufgenommen werden kann.
Nach der Amplifizierung werden die Phagen in einem dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem geeigneten sterilen Werkzeug vom Nährboden aufgenommen (Picking) und die so gewonnene phagen-, bakterien- und nährbodenhaltige Probe (der sog. „Agar-Plug") in einem für die Aufbewahrung der Phagen geeigneten Medium suspendiert (C). Ein geeignetes Medium ist dadurch definiert, dass die Infektiosität der Phagen darin erhalten bleibt. Dazu müssen im Medium geeignete Bedingungen bezüglich Hydrophilie und Polarität des Lösungsmittels sowie pH- Wert und Ionenstärke gegeben sein. Bevorzugt wird dazu eine wässrige Lösung mit annähernd neutralem pH-Wert (z.B. ein Puffer) sowie geeignetem Salzgehalt verwendet. Geeignete Medien sind z.B. LB-Medium (engl, lysogeny broth) oder PBS (engl, phosphate-buffered saline). Falls die verwendeten Phagen den Wirtsbakterien eine Antibiotikaresistenz verleihen, ist es vorteilhaft, dem verwendeten Medium dieses Antibiotikum zuzusetzen, um Wachstum kontaminierender Bakterien zu vermeiden. Im Hochdurchsatzverfahren kann das Picking beispielsweise in sterilen 96WeIl-
Platten geschehen.
Bei der nachfolgenden PCR-Reaktion (D) wirken viele im Phagen-Plug enthaltenden Bestandteile (z.B. Nährmedium, Agar, Zelltrümmer) normalerweise inhibitorisch, doch überraschend wurde gefunden, dass unter den folgenden Bedingungen ein sequenzierbares PCR-Produkt entsteht:
1. Das Picking des Agar-Plaques aus dem Nährboden erfolgt mit einem geeigneten sterilen Werkzeug. Ein geeignetes Werkzeug ist dadurch definiert, dass man damit den Plaque vollständig aus dem Nährboden in ein Arbeitsgefäß überführen kann, ohne dass große Teile des übrigen Nährbodens mit herausgelöst werden. Ein geeignetes Werkzeug ist z.B. ein röhrenförmiges Instrument, mit einem Innendurchmesser, der dem Außendurchmesser des
Agar-Plaques entspricht, mit dem der Agar-Plaque ausgestochen werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei eine sterile Einweg-Pipettenspitze oder eine Pasteurpipette benutzt, mittels derer der Plaque ausgestanzt wird und anschließend der Agar- Plug mit einer Pipette in das Medium ausgeblasen wird. 2. Der gepickte Phagenklon wird im Medium suspendiert und anschließend einem Energieeintrag, bevorzugt Ultraschallbehandlung, ausgesetzt. Ebenfalls möglich sind Vertexen sowie mechanisches Zerdrücken des Agar-Plugs. Diese Prozeduren fördern offenbar den Übergang der Phagen aus dem Nährboden in das Medium.
3. Das Volumen des Mediums sollte das Volumen des Agar-Plugs um ein Vielfaches übersteigen, bevozugt um einen Faktor 2 bis 10. Bevorzugt wird ein Volumen gewählt, bei dem der Agar- Plug in dem verwendeten Gefäß vollständig bedeckt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein mit einer Einweg-Pipettenspitze gepickter Agar-Plug in einer Vertiefung einer 96Well-Platte in 20 bis 100 μl Medium suspendiert.
4. Die Suspension muss frisch weiterverarbeitet werden. Bevorzugt wird die Lyse des Klons mit anschließender PCR innerhalb von 16 Stunden, besonders bevorzugt innerhalb von 8 Stunden durchgeführt. Wenn bereits ein Tag zwischen dem Picking des Klons und der PCR-Reaktion vergangen ist, können Fehler in der Amplifikation der Templat-DNA auftreten. Offenbar diffundiert im Laufe dieser Zeitspanne eine ausreichend große Menge inhibitorisch wirksamer
Substanzen aus dem Agar-Plug in das Medium, um die Amplifikation der Templat-DNA zu behindern.
Von der so gewonnenen Suspension wird ein kleiner Teil mit einem Lysepuffer behandelt sowie einem Lyseschritt unterzogen, um die DNA der Phagen freizulegen. Der größere Teil der Phagensuspension kann in den 96Well-Platten verbleiben und steht so für spätere gezielte Amplifikationen einzelner interessanter Phagenklone zur Verfügung. Der Lysepuffer enthält eine Puffersubstanz in wässriger Lösung bei einem leicht alkalischen pH- Wert, ein Tensid sowie einen Komplexbildner. Bevorzugt wird die Puffersubstanz in einem pH-Bereich > 8 und < 9 benutzt, als Tensid eine nicht-denaturierende, nichtionische Substanz sowie als Chelatbildner ein solcher, der zweiwertige Metallionen komplexiert. Besonders bevorzugt werden als Puffersubstanz Tris, Tricin, Bicin oder Taps bei einem pH von 8,3, als Tensid ein Octylphenolethoxylat (z.B. Triton X- 100 oder Nonidet-P40) oder ein Polysorbat (z.B. Tween®-20) sowie als Komplexbildner EDTA, EGTA, Citrat, Oxalat oder Tartrat benutzt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1 % (w/v) Triton X-100 sowie 1O mM EDTA verwendet. Der Lyseschritt umfasst das Aufheizen der Suspension auf eine Temperatur > 40 0C und < 100 0C, bevorzugt auf eine Temperatur > 80 0C und < 98 0C, besonders bevorzugt auf eine Temperatur > 93 0C und < 97 0C.
Anschließend wird die Suspension einer optimierten PCR zugeführt (D). Überraschend wurde gefunden, dass trotz Anwesenheit von inhibitorisch wirkenden Suspensionsbestandteilen die variable Region der Phagenklon-DNA fehlerfrei amplifiziert werden kann, wenn sowohl die oben beschriebenen Bedingungen bei den Schritten der Suspendierung und der Lyse eingehalten werden als auch bei der PCR-Reaktion eine Menge an Dimethylsulfoxid (DMSO) anwesend ist. Erfindungsgemäß wird dem PCR-Puffer eine Menge zwischen 0,1 und 50 Gew.-% DMSO zugefugt. Bevorzugt werden dem PCR-Puffer zwischen 1 und 30% DMSO, besonders bevorzugt zwischen 5 und 15% DMSO zugefügt. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform werden etwa 10 % DMSO eingesetzt.
Üblicherweise ist eine Separation der Templat-DNA von anderen Bestandteilen nötig, bevor eine PCR durchgeführt werden kann, da die anderen Bestandteile die Vermehrung der Templat-DNA stören oder gar unterbinden können. Überraschend wurde gefunden, dass durch die oben beschriebenen Bedingungen auf eine Isolierung, Reinigung und Aufkonzentration der Phagen- DNA verzichtet werden kann. Bestandteile wie Nährmedium, Agar, sowie Reste der Wirtszellen zeigen in dem erfindungsgemäßen Verfahren überraschenderweise keinen inhibitorischen Einfluss auf die PCR. Hierdurch ist es möglich, den DNA-Präparationsprozess in einer kürzeren Zeit, unter geringerem Aufwand, bei geringeren Kosten und verringerter Fehleranfälligkeit mit einer größeren Anzahl an Proben durchzuführen.
An das Verfahren kann eine Sequenzierung der Phagen-DNA z.B. nach Sanger anschließen. Die ermittelte Sequenz der variablen Region der Phagenklon-DNA erlaubt den Rückschluss auf die Aminosäure-Sequenz des bindenden Peptids. Die ermittelte DNA-Sequenz kann dazu benutzt werden, andere Phagen gentechnisch so zu modifizieren, dass diese die gleichen bindungsfähigen Peptide als Fusionsproteine präsentieren.
In dem Fall, dass sich die Phagen nur in dem bindenden Peptid unterscheiden, wird bevorzugt nur der für die Kodierung der variablen Peptide verantwortliche Teil der Phagen-DNA mittels PCR vermehrt. Dies geschieht durch Wahl zweier geeigneter Primer, die an Bindungsstellen kurz vor bzw. kurz nach der variablen Region der Phagen-DNA binden. Bevorzugt sind die Primer derart gewählt, dass das bei der PCR entstehende Amplicon eine Größe von > 60 und < 500 bp aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist generell für alle Phagen zugänglich, die einen Plaque bilden können. Es wird bevorzugt zur DNA-Präparation aus Klonen von Phagendisplay-Bibliotheken eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich in einer besonderen Ausführungsform bevorzugt als DNA-Präparationsprozess für Phagen, die mindestens eine Sorte von an ihre Hüllproteine fusionierten randomisierten Peptiden präsentieren, die eine Länge von > 1 Aminosäuren bis < 100 Aminosäuren, vorzugsweise > 5 Aminosäuren bis < 50 Aminosäuren, besonders bevorzugt > 6 Aminosäuren bis < 20 Aminosäuren aufweisen. Die Peptide können linear, aber auch schleifenförmig aufgebaut sein. Peptide mit einer solchen Anzahl von Aminosäuren lassen sich mittels gängiger molekularbiologischer Methoden gut auf die Phagenproteine fusionieren und sind geeignet, um an Substrate zu binden. Beispiele für solche Peptide sind lineare Peptide mit einer Länge von 7 Aminosäuren, lineare Peptide mit einer Länge von 12 Aminosäuren oder schleifenformige Peptide mit einer Länge von 7 Aminosäuren, die von einer Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinresten eingerahmt werden. Solche kurzkettigen bindenden Peptide haben den Vorteil, dass die DNA der verschiedenen Phagen in der betrachteten Phagenpopulation größtenteils identisch ist und nur Unterschiede in den Bereichen der DNA aufweist, welche die bindenden Peptide kodiert. Somit lässt sich die PCR zielgerichtet auf kurze DNA- Abschnitte (> 60 und < 500 Basen) ausrichten, was den Vorteil hat, dass für alle gepickten Klone der gleiche Primer und dieselben PCR-Bedingungen genutzt werden können.
Das erfmdungsgemäße Verfahren eignet sich in einer besonderen Ausführungsform bevorzugt als DNA-Präparationsprozess für Phagen vom Typ Ml 3. Diese Phagen sind gut veränderbar und leicht erhältlich (beispielsweise bei New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Deutschland) und in Kultur leicht vermehrbar. Sie weisen als Genprodukte die Proteine gpiπ, gpVI, gpVII, gpVIH und gpIX auf. Dabei kann mindestens ein zusätzliches kurzes Peptid an das Protein gpIII oder gpVTQ fusioniert sein. Die Verlängerung dieser Proteine mit zusätzlichen Peptiden, also das Fusionieren, ist an diesen Proteinen gut durchführbar.
Vorteilhafterweise werden kommerziell erhältliche M13-Phage-Display-Bibliotheken eingesetzt, die ein randomisiertes Peptid als gpHI-Fusionsprotein, insbesondere als lineares Peptid mit einer Länge von 7 Aminosäuren, als lineares Peptid mit einer Länge von 12 Aminosäuren, oder als schleifenformiges Peptid mit 7 Aminosäuren, die von einer Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinresten eingerahmt werden, besitzen (Handelsnamen Ph.D.-7™, Ph.D.-12™ bzw. Ph.D.- C7C™).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfmdungsgemäße Verfahren Bestandteil eines Selektionsprozesses für substratbindende Phagenspezies aus einer randomisierte Peptide präsentierenden Bibliothek. Dabei hat ein bindender Phage im Sinne der Erfindung die Eigenschaft, dass er über ein präsentiertes, an ein Hüllprotein des Phagen fusioniertes Peptid zu mindestens einem Substrat eine Bindung aufbauen kann. Dem Fachmann ist diese Technik als „Phage Display" bekannt.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Beispielen näher erläutert, ohne sie jedoch auf diese zu beschränken.
Es zeigen:
Figur 1 zeigt das Ergebnis einer PCR, die mit unterschiedlich behandelten M13-Phagen-Plaques als DNA-Quelle durchgeführt wurde. Die PCR-Produkte wurden auf ein l,2%iges (w/v) Agarosegel geladen und einer Elektrophorese unterzogen. Das Agarosegel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht fotografiert. 1 : DNA-Größenstandard, 2: vollständiger, intakter Phagen-Plaque, 3: erfindungsgemäß in LB-Medium suspendierter Phagen- Plaque, 4: Positivkontrolle (gereinigte Phagen-DNA), 5: Negativkontrolle (ohne DNA-Template). Der erfϊndungsgemäß in LB-Medium suspendierte Phagen-Plaque als DNA-Quelle (Bahn 3) liefert ein qualitativ gleichwertiges Produkt wie die gereinigte Phagen-DNA (Bahn 4). Der vollständige Plaque kann ebenfalls erfolgreich als DNA-Quelle eingesetzt werden (Bahn 1), jedoch verbleiben von dieser Probe keine intakten Phagen für eine spätere Amplifikation. Trotz der hohen Anzahl von 40 PCR-Zyklen finden sich in der Negativkontrolle (Bahn 5) keinerlei Artefakte.
Figur 2 zeigt das Ergebnis einer PCR, die mit in LB-Medium suspendierten M13-Phagen-Plaques als DNA-Quelle durchgeführt wurde. Die PCR-Produkte wurden auf ein l,2%iges (w/v) Agarosegel geladen und einer Elektrophorese unterogen. Das Agarosegel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht fotografiert. 1: DNA-Größenstandard, 2-9: Plaques unterschiedlicher Phagenklone, 10: Positivkontrolle (gereinigte Phagen-DNA), 11: Negativkontrolle (ohne DNA-Template). Gut zu erkennen sind die 334 bp großen PCR-Produkte in den Proben guter Qualität (Bahn 3-9) sowie in der Positivkontrolle (Bahn 10). Die niedriger laufende Phagenklon-DNA in Bahn 2 konnte in der nachfolgenden Sequenzierung als Phage ohne Insert (entspricht M 13KE ohne Bibliotheks-Insert) identifiziert werden. Die Negativkontrolle (Bahn 11) zeigt wie erwartet keinerlei Artefakte.
Figur 3 zeigt ein typisches Elutionsprofil einer DNA-Sequenzierung, die mit dem Primer ,,-96gIII" (5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG^', siehe Beispiel) an einem erfindungsgemäßen PCR- Produkt eines Phagen-Plaques durchgeführt wurde. Der Phagenklon stammt aus einer Ph.D.-12™- M13-Phagendisplaybibliothek. Der interessierende variable DNA-Bereich des Phagenklons (Position 89-124) weist eine hohe Sequenzqualität auf.
Beispiel: DNA-Isolierung von M13-Phagenklonen. die beim Panning einer kombinatorischen Phage Display Bibliothek (Ph.D.-12™, New England Biolabs) an einem Polyurethan-Substrat anfallen.
Polyurethan-Substrat wurde aus Vermischung äquivalenter Mengen Desmophen® 670 BA und Desmodur® N3300 (Bayer MaterialScience AG) hergestellt, die Aushärtung erfolgte über 16 h bei Raumtemperatur. 20 mg des Substrates wurden 10 min in Tris-Buffered Saline (TBS, bestehend aus 50 mmol/1 Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol/1 NaCl) äquilibriert und 60 min mit 4*1010 pfu (10 μl der Original-Bibliothek) in 1 ml TBS bei Raumtemperatur inkubiert. Das Substrat wurde zehnmal mit je 10 ml TBST (TBS plus 0,1 vol.-% Tween-20) gewaschen (mittels kurzem Vortexen, fünfininütiger Rotation plus 5 s Ultraschallbad). Die erste Elution erfolgte im Sauren durch Eintauchen des Substrats in 1 ml 0,1 mol/1 Glycin pH 2,5 für 10 s mit anschließender Neutralisation des Substrats in 1 ml 0,1 mol/1 Tris-HCl pH 8 für 1 min. Die erste Elutionslösung wurde durch Zugabe von 200 μl 1 mol/1 Tris-HCl pH 8 neutralisiert. Die zweite Elution erfolgte im Basischen durch Eintauchen des Substrats in 1 ml 0,1 mol/1 Triethylamin pH 11,5 für 1 min mit anschließender Neutralisation des Substrats in 1 ml 0,1 mol/1 Tris-HCl pH 7,5 für 1 min. Die zweite Elutionslösung wurde durch Zugabe von 200 μl 1 mol/1 Tris-HCl pH 7,5 neutralisiert. Das Substrat wurde anschließend in TBST aufbewahrt, um zeitliche Ablösungseffekte nicht eluierter Phagen zu beobachten.
Von der Elutionsfraktion wurde anschließend ein Plaque- Assay durchgeführt. Dazu wurden Bakterien des Stamms E. coli K12 ER2738 (New England Biolabs) auf einer LB-Tet Agarplatte (15 g/l Agar, 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 20 mg/1 Tetracyclin) ausgestrichen und über Nacht bei 37 0C inkubiert. 10 ml LB-Tet Medium (10 g/l Bacto-Trypton, 5g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 20 mg/1 Tetracyclin) wurden mit einer Einzelkolonie ER2738 angeimpft und bis zu einer OD60O von 0,4 bei 37 0C geschüttelt. 400 μl dieser Bakteriensuspension wurden mit 10 μl unverdünnter Elutionslösung versetzt, in 3 ml geschmolzenen LB-Agar-Top (7 g/l Agar, 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl) pipettiert, gevortext und auf einer LB-IPTG/X-gal Platte (15 g/l Agar, 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 1,25 mg/1 Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid, 1 mg/1 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-ß-D-galactopyranosid) verteilt. Die Platte wurde über Nacht bei 37 0C inkubiert. Jeder der dabei entstandenen blauen Plaques stellt einen Phagenklon dar.
80 blaue, gut voneinander separierte Plaques wurden mit sterilen 1000 μl-Pipettenspitzen aus der Agar-Platte ausgestanzt und mittels einer 1000 μl-Pipette in je eine Vertiefung einer sterilen 96Well-Platte befördert, in der je 100 μl LB-Tet Medium vorgelegt waren. Die 96Well-Platte wurde mit PCR-Strips dicht verschlossen und 1 min in einem Ultraschallbad beschallt. Je 5 μl der so erhaltenen Phagenklon-Suspension wurden unmittelbar darauf in je eine Vertiefung einer neuen 96Well-Platte pipettiert, in der 24 μl Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 10 mM Na2-EDTA pH 8,0, 1 % (w/v) Triton X-100) vorgelegt waren. In zwei weitere Vertiefungen derselben 96 WeIl- Platte wurden als Negativkontrolle 5 μl H2O bzw. als Positivkontrolle eine Mischung aus 2 μl H2O und 3 μl gereinigter M13-Phagen-DNA eines Klons der Phage Display-Bibliothek Ph.D.-12™ (New England Biolabs) pipettiert.
Die Phagen-DNA für die Positivkontrolle wurde auf folgende Weise isoliert und gereinigt: 2 ml LB-Tet Medium wurden mit 100 μl einer E. coli ER2738-Bakteriensuspension (s.o.) sowie einem blauen Plaque aus einem Plaque-Assay angeimpft und 4,5 h bei 37 0C geschüttelt. Die Kultur wurde 10 min bei 4500 x g und 4 0C zentrifugiert und der Überstand anschließend erneut zentrifugiert. 1 ml des Überstands wurde mit 500 μl PEG/NaCl-Lsg versetzt und 2 h bei 4 0C inkubiert. Die Phagen wurden 15 min bei 14000 x g und 4 0C abzentrifugiert und in 100 μl 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 4 M NaI resuspendiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 250 μl Ethanol 10 min gefällt und 15 min bei 14000 x g und 20 0C abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70 %igem Ethanol gewaschen, 1 min bei 14000 x g und 20 0C zentrifugiert, getrocknet und in 30 μl 10 mM Tris-HCl pH 8.0 resuspendiert.
Die 96Well-Platte wurde mit PCR-Strips dicht verschlossen. Die Lyse der Phagen erfolgte durch Erhitzen der Platte für 20 min auf 95 0C in einem Thermocycler. Anschliessend wurde die PCR durchgeführt. Dazu wurden in jede Vertiefung 26 μl PCR-Mastermix pipettiert, der die folgende Zusammensetzung hatte:
Die PCR-Primer haben die folgende Sequenz:
Primer Reverse (Gen YS) : -96gEI 5 '-CCCTCATAGTTAGCGT AACG-3 '
Primer Forward (Gen Vm): M13KE_F1 5'-GATGGTTGTTGTCATTGTCG^'
Die Primer schließen im Falle der verwendeten Ph.D.-12™-Phagenbibliothek, die auf dem Vektor M13KE basiert, einen Bereich mit einer Länge von 334 bp ein, der die 36 bp lange variable Sequenz jedes Phagenklons enthält. Der PCR-Zyklus wurde in einem Thermocycler mit den folgenden Bedingungen durchgeführt: 1. 30 sek 95 0C
2. 30 sek 52.2 0C
3. 30 sek 72 0C
4. 39 Wiederholungen der Schritte 1-3 5. 5 min 72 0C
Die PCR-Produkte wurden in einem l,2%igen Agarosegel in TAE-Puffer (4O mM Tris, 2O mM Essigsäure, 50 mM Na2-EDTA pH 8,0) aufgetrennt. Auf diese Weise wurde eine Stichprobe von 8 Proben auf ihre Qualität hin analysiert (Figur 2).
Je 10 μl jedes PCR-Produkts wurden in eine neue 96Well-Platte pipettiert und für 3 h in einem Trockenschrank bei 50 0C eingetrocknet. Anschließend wurde die Platte mit einer selbstklebenden
Aluminiumfolie versiegelt und an einen DNA-Sequenzierdienstleister (Eurofms MWG Operon) verschickt. Dort wurden die Proben mit dem Primer -96giπ nach der Didesoxy-Methode sequenziert (siehe Figur 3). Die so erhaltene DNA-Sequenz einer jeden Probe stellt den
Anticodon-Strang des Templats dar und wurde zunächst in die komplementäre Sequenz umgeschrieben. Die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs konnte anschließend mithilfe des reduzierten genetischen Codes (Ph.D.-12™ Phage Display Peptide Library Kit Instruction Manual,
Version 2.7 (2006), New England Biolabs) ermittelt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur hochdurchsatzfähigen Präparation sequenzierungsfähiger DNA aus einzelnen Plaques von Peptiden präsentierenden Phagen bei gleichzeitigem Erhalt infektiöser Phagen mindestens umfassend die folgenden Schritte:
A Vereinzelung von Peptiden präsentierenden Phagen aus einer Phagenpopulation auf einem Wirtsbakterien enthaltenden Nährboden,
B Inkubation zur Amplifϊzierung der vereinzelten Phagen,
C Aufnahme der Phagen aus dem Nährboden und Suspendierung in einem Medium,
D Lyse eines Teils der suspendierten Phagen aus Schritt C sowie Verwendung dieses DNA-haltigen Lysats als Templat in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt C das Picking des Phagen-Plaques aus dem Nährboden mit einem sterilen Werkzeug erfolgt, mittels dessen der Plaque aus der Agarplatte ausgestanzt und anschließend der so erhaltene Agar-Plug in das Medium überführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspendierung in Schritt C unter Energieeintrag, bevorzugt Ultraschallbehandlung erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen des Mediums mindestens doppelt so groß ist wie das Volumens des Agar-Plugs und dass der Agar-Plug in dem für die Suspendierung verwendeten Gefäß vollständig überschichtet ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse in Schritt D innerhalb von höchstens 8 Stunden im Anschluss an Schritt C erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse in Schritt D durch Zugabe eines wässrigen Lysepuffers erfolgt, der mindestens eine Puffersubstanz, ein Tensid und einen Komplexbildner umfasst.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse in Schritt D das Aufheizen auf eine Temperatur zwischen 800C und 98°C umfasst.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt D eine Menge zwischen 1 und 30 Gew.-% DMSO der PCR zugeführt wird.
9. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 als Bestandteil eines Selektionsprozesses für bindende Phagen aus einer Phagendisplay-Bibliothek.
EP09741232A 2008-11-03 2009-10-21 Verfahren zur hochdurchsatzfähigen präparation sequenzierungsfähiger dna aus enzelnen plaques von peptiden präsentierenden phagen Withdrawn EP2356229A1 (de)

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