EP2350168A1 - Copolymères à blocs à base de polysaccharide et de polypeptide, les vésicules constituées de ces copolymères et leur utilisation - Google Patents

Copolymères à blocs à base de polysaccharide et de polypeptide, les vésicules constituées de ces copolymères et leur utilisation

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EP2350168A1
EP2350168A1 EP09759750A EP09759750A EP2350168A1 EP 2350168 A1 EP2350168 A1 EP 2350168A1 EP 09759750 A EP09759750 A EP 09759750A EP 09759750 A EP09759750 A EP 09759750A EP 2350168 A1 EP2350168 A1 EP 2350168A1
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EP
European Patent Office
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poly
polysaccharide
polypeptide
copolymer
micellar
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09759750A
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German (de)
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Inventor
Sébastien LECOMMANDOUX
Jean-François LE MEINS
Christophe Schatz
Kamal Kumar Upadhyay
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1
Institut Polytechnique de Bordeaux
Original Assignee
Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1
Institut Polytechnique de Bordeaux
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Publication date
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    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use

Definitions

  • the invention relates to a novel diblock copolymer polysaccharide-b / oc-polypeptide, bioabsorbable or biodegradable and biocompatible, its method of preparation, the nucellar vesicles consisting of this copolymer, and their use for encapsulation, transport, vectorization, and the targeting of molecules of interest, natural or synthetic, with or without a therapeutic activity.
  • Naturally occurring organisms exist in vesicular structures resulting from the assembly of amphiphilic biomolecules formed from lipids, proteins and carbohydrates. These natural vesicles are of variable size, the larger ones acting as membranes that protect the intracellular content of the extracellular environment, while small lipid vesicles play a role of transporter of biomolecules inside the cell.
  • Stable vesicular structures could be prepared synthetically, starting with liposomes in the 1960s, obtained by assembling natural or synthetic phospholipids, until the recent polymer vesicles formed by the assembly of synthetic block copolymers, called " polymersomes "(BMDischer et al., Science 1999, 284, 1143).
  • polymersomes seem very promising for the development of biomedical applications, especially for the transport of therapeutic agents or as microreactors mimicking the behavior of living cells.
  • polymersomes have many advantages over liposomes, including a lower critical concentration of aggregation, a unilamellar or multilamellar vesicular structure associated with low size dispersion, and stability. higher membrane decreasing passive leakage of encapsulated molecules.
  • the chemical diversity of the block copolymers makes it possible to envisage infinite possibilities of modifying the properties of the vesicle to conform to the desired application.
  • polymersomes reported in the literature have been formed by assembling synthetic amphiphilic compounds, such as, for example, polylactide- ⁇ -poly-ethylene oxide, polybutadiene-b / oc poly (ethylene oxide), polycaprolactone-oc-poly-ethylene oxide and poly (2-methyloxazoline) -oc-poly (dimethylsiloxane) -oc-poly (2- methyloxazoline), highly studied because of the biocompatibility or bioresorbability of their respective blocks.
  • synthetic amphiphilic compounds such as, for example, polylactide- ⁇ -poly-ethylene oxide, polybutadiene-b / oc poly (ethylene oxide), polycaprolactone-oc-poly-ethylene oxide and poly (2-methyloxazoline) -oc-poly (dimethylsiloxane) -oc-poly (2- methyloxazoline
  • polypeptide constructs comprising natural blocks, such as polypeptides or polysaccharides.
  • interest for polypeptide constructs lies in the fact that they have unique physicochemical properties: they are optically active by nature, biocompatible and biodegradable in some cases, can be used to mimic natural polypeptide sequences, and are capable of to undergo reversible conformational transitions according to the pH and / or temperature conditions.
  • Block copolypeptides represent a particular subclass associating two synthetic polypeptide blocks that combine self-assembly capability with highly ordered three-dimensional structures. They have been described in the literature as promising materials for applications such as biosensors, tissue engineering or selective release of active ingredients. The chemistry of polypeptide-based block copolymers has been extensively studied in the literature using the ring-opening polymerization of the N-carboxyanhydride ("NCA") monomers of the corresponding amino acids initiated by amino derivatives. .
  • NCA N-carboxyanhydride
  • block copolypeptides could be synthesized, such as poly (L-glutamic acid) -b / oc-poly (L-lysine) (J. Rodriguez-Hernandez and S. Lecommandoux). ,
  • dextran- ⁇ b / ⁇ -poly has been reported to self-assemble in water into polydisperse micellar structures having an average diameter of about 100 nm (J. Liu et al. Polymers Carbohydrate, 2007, 69, 196).
  • J. Liu et al. Polymers Carbohydrate, 2007, 69, 196 J. Liu et al. Polymers Carbohydrate, 2007, 69, 196.
  • block copolymers combining in a single linear chain a polypeptide segment and a polysaccharide block.
  • a glycoprotein is a protein carrying at least one polysaccharide group and a polypeptide chain.
  • many glycoproteins are on the outer surface of the plasma membrane, with the glycosylated part oriented towards the extracellular medium.
  • Glycoproteins are present, in particular, in microorganisms such as viruses and bacteria.
  • many pathogenic microorganisms have evolved to recognize the sugars present on the surface of the cells and use them as anchors and entry points in the cells to be infected.
  • the HIV virus enters cells of the immune system by binding to membrane receptors such as the CXCR4 and CXCR5 receptors, which are glycoproteins.
  • synthetic biomimetic structures that can mimic glycoproteins and may self-assemble as vesicles. This allows, for example, to form "synthetic viruses” mimicking the structure of viruses and their functional role, and to consider effective intracellular delivery of molecules of interest.
  • the object of the invention is therefore, according to a first aspect, a b-polysaccharide / oc-polypeptide diblock copolymer consisting of a block of natural or synthetic saccharide units and a block of natural or synthetic peptide units.
  • block copolymer as by “diblock copolymer” is meant a linear structure in which a polysaccharide block and a polypeptide block are joined at their ends.
  • the linear structure of the copolymers according to the invention advantageously makes it possible to have a high degree of control and reproducibility of the copolymer structure, thus ensuring a regularity of the properties.
  • the diblock polysaccharide-b / oc-polypeptide copolymer according to the invention is bioabsorbable or biodegradable and biocompatible.
  • saccharide unit block may be used interchangeably to designate a sequence of saccharide monomeric units forming a polysaccharide or a polysaccharide derivative.
  • peptide unit block polypeptide block or polypeptide will be used interchangeably to denote a sequence peptide monomer units forming a polypeptide or polypeptide derivative.
  • the diblock copolymer according to the invention may comprise any type of natural or synthetic polysaccharide, or a derivative thereof, and any type of natural or synthetic polypeptide, or a derivative thereof.
  • polysaccharide derivatives compounds resulting from a chemical modification of a polysaccharide, capable of conferring, for example, a hydrophobic character on a naturally hydrophilic polysaccharide, or, optionally, of adding new functional groups to the molecule.
  • Preferred polysaccharides may be, for example, selected from dextran, hyaluronic acid and their derivatives.
  • Polysaccharide derivatives and methods for modifying polysaccharides are described, for example, in the reference books “Polysaccharides I”, Adv. Polym. Sci. (2005), 186, and “Polysaccharides II", Adv. Polym. Sci. (2006), 205.
  • Polypeptide derivatives means compounds derived from a chemical modification of a polypeptide, capable of conferring, for example, a hydrophobic character on a naturally hydrophilic polypeptide, or, optionally, of add new functional groups on the molecule.
  • Such derivatives may be, for example, ester or ether derivatives, in particular organic esters; aliphatic or aromatic inorganic esters; ether derivatives, such as, for example, alkyl or hydroxyalkyl derivatives, amide or imine derivatives, etc.
  • the polysaccharide / oc-polypeptide diblock copolymer may comprise a polysaccharide block which has a hydrophilic character and a polypeptide block which is hydrophobic under physiological conditions, either by nature or by chemical modification giving it hydrophobicity.
  • the diblock polysaccharide-ib / oc-polypeptide copolymer may comprise a polysaccharide block which has a hydrophobic character, in particular by chemical modification capable of conferring hydrophobicity on a naturally hydrophilic polysaccharide, and a polypeptide block which has a character hydrophilic under physiological conditions.
  • the diblock polysaccharide-fo / oc-polypeptide copolymers according to the invention are amphiphilic compounds able to self-assemble to form a new type of assembled micellar vesicles based on natural or synthetic polymers.
  • the applications of these vesicles based on diblock copolymer polysaccharide-b / oc-polypeptide offer new possibilities thanks to the intrinsic properties of the polymers used.
  • the vesicles based on diblock polysaccharide-b / oc-polypeptide copolymer have the following advantages in particular: a biocompatible and bioresorbable or biodegradable character, a high stability in aqueous solution, an ability to encapsulate hydrophilic and hydrophobic species, and a diversity of chemical functions that can be easily used to modify the surface of the vesicles and thus give them a particular property such as the affinity for a biological receptor.
  • polysaccharides or polypeptides having the property of being ligands of cellular receptors also makes it possible to prepare micellar vesicles allowing the targeted release of molecules of interest, said polysaccharide being able, by its nature, to be involved in receptor-mediated endocytosis (RME) mechanisms.
  • RME receptor-mediated endocytosis
  • the copolymers according to the invention may comprise, in particular, from 5 to 100 saccharide units and from 5 to 100 peptide units, in particular from 10 to 100 saccharide units and from 10 to 100 peptide units and, preferably, from about 10 to about 50 saccharide units and about 10 to 50 peptide units.
  • the hydrophilic polymer / hydrophobic polymer mass ratio can be, for example, about 1/1.
  • Advantageous copolymers according to the invention have a molar mass of 1000 to 50000 g / mol.
  • the polysaccharide may be chosen, for example, from dextran, chitin, chitosan, hyaluronic acid, pullulan, fucan, sulphated fucan, succinoglycan, galactan, arabinogalactan, sulphated galactan or alginates.
  • glucan polysialic acid, heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, acharan sulfate, keratan sulfate, dermatan sulfate, xanthan, pectin, xylan, amylose, amylopectin, cellulose, agarose, mannan, galactomannans, curdlane, arabinan, carrageenans, schizophyllan and their derivatives.
  • polypeptide in which the amino acid which constitutes it can be in optically active form L or D or in DL racemic form, can be chosen, for example, from poly (alanine), poly (arginine), poly ( aspartic acid), poly (asparagine), poly (aspartate), poly (cysteine), poly (glutamic acid), poly (glutamate), poly (glutamine), poly (glycine), poly ( histidine), poly (isoleucine), poly (leucine), poly (lysine), poly (methionine), poly (phenylalanine), poly (proline), poly (pyrrolysine), poly (selenocysteine) , poly (serine), poly (threonine), poly (tryptophan), poly (tyrosine), poly (valine), poly (benzyl glutamate), poly (alkyl glutamate), poly (trifluoroacetyl-Lysine), poly (sarcosine) poly (hydroxyethylasparagine
  • Preferred hydrophobic polypeptides are, for example, poly ( ⁇ -benzyl L-glutamate) and poly ( ⁇ -trifluoroacetyl-L-lysine). According to another advantageous aspect, said polypeptide is hydrophilic under physiological conditions.
  • Preferred hydrophilic polypeptides are, for example, poly (L-glutamic acid), poly (L-glutamate) and poly (L-lysine).
  • the polypeptide can be obtained by a ring-opening polymerization process of the N-carboxyanhydride (NCA) monomer of the corresponding amino acid, cited above.
  • NCA N-carboxyanhydride
  • the invention also relates, in a further aspect, to a process for the preparation of the bioabsorbable or biodegradable biocompatible diblock polysaccharide- ⁇ / polypeptide copolymers described above.
  • the synthesis of the copolymers according to the invention implements well-controlled chemical reactions, in particular "chemistry-click” reactions allowing an efficient and quantitative coupling under mild conditions.
  • cycloadditions of unsaturated species for example, 1,3-dipolar azide-alkyne cycloadditions, Diels Aider reactions between a diene and a dienophile.
  • reactions involving an electrophilic non-aldol carbonyl group for example, formation of oxime ethers from an oxyamine, hydrazones from a hydrazine, or thiosemicarbazones from a thiosemicarbazine
  • reactions involving a thiol group formation of thioethers from an alkene and mixed disulfides
  • reactions involving thiocarboxylic acid functions or thioesters formation of thioester bonds and amides
  • Staudinger ligations involving phosphine and azide functions for example, formation of oxime ethers from an oxyamine, hydrazones from a hydrazine, or thiosemicarbazones from a thiosemicarbazine
  • reactions involving a thiol group formation of thioethers from an alkene and mixed disulfides
  • reactions involving thiocarboxylic acid functions or thioesters
  • the process according to the invention for the preparation of the diblock polysaccharide-b / oc-polypeptide copolymers comprises the steps of:
  • said method comprises the steps of:
  • Reductive amination can be carried out, for example, using an amine such as propargylamine in the presence of a reducing agent such as sodium borocyanohydride.
  • the azotur ⁇ function can be introduced at the end of the polypeptide chain using a bifunctional agent, such as 3-azidoaminopropane, the amine function serving to initiate the ring opening polymerization of the monomer NCA of the acid. corresponding amine.
  • the length of the polypeptide block can thus be controlled by the monomeric NCA / bifunctional agent molar ratio.
  • a solvent for the coupling step of the polysaccharide chain and the polypeptide chain it is possible to use, for example, an organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • This reaction is preferably catalyzed by copper derivatives, such as, for example, CuBr, in the presence of a ligand, for example pentamethyldiethylenetriamine.
  • the hydrophilic chain, polypeptide or polysaccharide can be added in slight excess, of the order of 2 molar equivalents, then removed by dialysis, in order to ensure a quantitative coupling reaction and the formation of pure block copolymers.
  • the invention also relates, in a further aspect, to new micellar vesicles formed from diblock polysaccharide-fe / oc-polypeptide copolymers consisting of a block of natural or synthetic saccharide units and a block of natural peptide units. or synthetic, connected by their end in a linear chain structure, as described above.
  • said copolymers comprise from 5 to 100 saccharide units and from 5 to 100 peptide units, especially from 10 to 100 saccharide units and from 10 to 100 peptide units, and preferably from about 10 to about 50 saccharide units and about 10 about 50 peptide units.
  • said copolymers are bioresorbable or biodegradable, and biocompatible.
  • micellar vesicles may be prepared by various conventional methods such as, for example, direct dissolution, film hydration, emulsification / diffusion process or nanoprecation. Nanoprecipitation, which consists of mixing a polymer solution in a water-miscible organic solvent, will preferably be used.
  • an organic solution of the diblock copolymer according to the invention in water with moderate stirring simultaneously induces a phase separation and a self-assembly process which progresses as the organic solvent diffuses into the water.
  • aqueous phase the latter being in excess relative to the organic phase.
  • a suitable organic solvent is, for example, dimethylsulfoxide (DMSO) or formamide.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the vesicles are recovered directly in aqueous solution. They can then be lyophilized in order to obtain them in the form of a redispersible solids. Their size can be modulated by adjusting the emulsification / diffusion or nanoprecation process (addition direction, nature of the organic solvent, phase volume, copolymer concentration, etc.).
  • micellar vesicles according to the invention can be characterized by dynamic and static scattering of light, scattering of neutrons at small angles and transmission electron microscopy. Such techniques for the characterization of micellar systems are described, for example, in G.Riess, Progress in Polymer Science, 2003, 28, 1107.
  • said micellar vesicle formed from diblock polysaccharide-6 / oc copolymers -polypeptide contains at least one molecule of interest, natural or synthetic, with or without activity therapeutic.
  • This molecule can be introduced, depending on its polarity, in the aqueous phase or in the organic phase before the nanoprecipitation process. It is thus encapsulated during the manufacturing process of the vesicle. It can also be introduced after vesicle formation by pH gradient or emulsification / diffusion methods.
  • molecule having a therapeutic activity is meant, for example, a natural or synthetic molecule used for the prevention or treatment of a pathology or the restoration of a biological function, in vitro or in vivo, in particular in humans. animal, including humans, or isolated cells.
  • Such molecules may be, for example, a drug active ingredient, such as an antibiotic, an analgesic, an anti-inflammatory, an antitumoral, etc. or a peptide, a protein, a hormone, an enzyme, a nucleic acid, an oligonucleotide, an antigen, an antibody, an interferon, a growth factor, an enzymatic activity modulator, an activator or a cell receptor inhibitor , a vitamin etc.
  • a drug active ingredient such as an antibiotic, an analgesic, an anti-inflammatory, an antitumoral, etc. or a peptide, a protein, a hormone, an enzyme, a nucleic acid, an oligonucleotide, an antigen, an antibody, an
  • Such molecules having a therapeutic activity can be used, for example, in the pharmaceutical or medical field.
  • the encapsulation of said molecule having a therapeutic activity in a micellar vesicle according to the invention makes it possible to significantly reduce the toxicity of said molecule.
  • antitumor agents such as, in particular, their cardiotoxicity, for example in the case of the use of doxorubicin or mitoxantrone or their neurotoxicity, for example in the case of the use of vincristine
  • molecule of interest having no therapeutic activity is meant, for example, a natural or synthetic molecule which is not used for the prevention or treatment of a pathology or the restoration of a function. biological, in vitro or in vivo, especially in animals, including humans, or isolated cells.
  • diagnostic agents such as, for example, contrast agents, isotopes, fluorescent probes
  • olfactory molecules pigments, dyes, antioxidants, antibacterial agents, antiseptic agents, emollients, exfoliating agents, moisturizers, etc .;
  • cleaning and detergency surfactants, dyes, antioxidants, antibacterials, antiseptics, whiteners, etc .;
  • phytopharmacy pesticides, fungicides, herbicides, insecticides, growth accelerators, etc.
  • - agrifood coloring agents, flavor enhancers etc
  • organic chemistry organic, metallic or inorganic catalytic derivatives, etc., or in any other field of activity in which it is desired to encapsulate a molecule in a micellar vesicle, the latter having the advantage of being bioabsorbable or biodegradable and biocompatible .
  • micellar vesicles formed from diblock polysaccharide-fc / oc-polypeptide copolymers consisting of a block of natural or synthetic saccharide units and a block of natural or synthetic polypeptide units, as described above, as vehicles for encapsulation, transport, vectorization and / or targeting of at least one molecule of interest, natural or synthetic, with or without a therapeutic activity, represents another aspect of the invention.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising micellar vesicles formed from diblock polysaccharide - /> / oc-polypeptide copolymers consisting of a block of natural or synthetic saccharide units and a block of natural or synthetic polypeptide units. and containing at least one molecule of interest, natural or synthetic, with or without a therapeutic activity, as described above, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutically acceptable excipients may be chosen according to the method of administration envisaged from the usual excipients in the pharmaceutical field.
  • the excipients may be selected from binders, fillers, disintegrants, adjuvants or retarders and for oral administration as suspensions, solutions or emulsions.
  • binders for oral administration in tablet form
  • the excipients may be selected from binders, fillers, disintegrants, adjuvants or retarders and for oral administration as suspensions, solutions or emulsions.
  • the compositions may also contain suspending agents; emulsifiers, non-aqueous vehicles or preservatives
  • the pharmaceutical compositions may be in the form of aqueous and non-aqueous sterile injectable solutions which may contain antioxidants, buffers, bacteriostatic agents and solutes which render the formulation isotonic with the blood of the selected recipient; or in the form of sterile aqueous or non-aqueous suspensions which may include suspending agents and thickening agents.
  • compositions according to the invention may also be administered by other routes, such as the oral or sublingual route using a suitable excipient, the topical route on the epidermis, in the form of cream or gel, ointment, lotion or transdermal patch, the intranasal route, in the form of a spraying liquid, a powder or drops or by inhalation, using a suitable propellant.
  • routes such as the oral or sublingual route using a suitable excipient, the topical route on the epidermis, in the form of cream or gel, ointment, lotion or transdermal patch, the intranasal route, in the form of a spraying liquid, a powder or drops or by inhalation, using a suitable propellant.
  • micellar vesicles according to the invention can be used both for the encapsulation of hydrophobic molecules and hydrophilic molecules, because they have two compartments of different polarity, namely the membrane which is hydrophobic and the internal cavity which is hydrophilic.
  • said micellar vesicle is formed from a diblock polysaccharide-6 / oc-polypeptide copolymer in which the polysaccharide has affinity for at least one cellular receptor.
  • said micellar vesicle is formed from a b-polysaccharide / oc-polypeptide diblock copolymer in which the polypeptide has affinity for at least one cellular receptor.
  • micellar vesicles may advantageously be used for targeting a molecule of interest.
  • hyaluronic acid which has an affinity for CD44 receptors.
  • CD44 receptors are present at elevated levels in tumor cells of various carcinomas, melanomas, lymphomas, etc. ("Chemistry and Biology of Hyaluronan", H.G. Garg and CA.Haies Ed. (2004), Chapter 5, Elsevier Ltd.).
  • Polypeptides of interest in this regard are, for example, polyglutamic acid or polyglutamate.
  • polyglutamic acid or polyglutamate are, for example, glutamate receptor ligands (Mornet C, Briley M, Trends Pharmacol Sci., 1988; 9: 278-279) or TLR4 receptors ( Poo et al 22 (2) 517 - The FASEB Journal).
  • micellar vesicle is formed from a diblock polysaccharide-b / oc-polypeptide copolymer wherein said polysaccharide is capable of being involved in a receptor-controlled endocytosis mechanism ("Receptor”). mediated endocytosis "or RME).
  • Receptor receptor-controlled endocytosis mechanism
  • RME mediated endocytosis
  • micellar vesicle is formed from a b-polysaccharide / oc-polypeptide diblock copolymer wherein said polypeptide is capable of being involved in a receptor controlled endocytosis mechanism.
  • Receptor-controlled endocytosis is a biological mechanism by which molecules in the extracellular space bind to cellular receptors and are internalized, also allowing the targeting of a molecule of interest.
  • a polysaccharide of interest for the purposes of the invention is arabinogalactan, which interacts with hepatocyte receptors involved in controlled endocytosis mechanisms.
  • dextran-block-poly ( ⁇ -benzyl L-glutamate) copolymer Two equivalents of alkynyl dextran (0.4 g, 6.06.10 5 mol) and one equivalent of PBLG-azide (0.147 g, 3.03 ⁇ 10 5 mol) ) are solubilized in 25 mL of anhydrous DMSO. The mixture is stirred for 20 minutes then 12.6 ⁇ l of pentamethyldiethylenetriamine (6.06 ⁇ 10 5 mol) are added under a nitrogen atmosphere. The mixture is then degassed 3 times by freeze / thaw cycles and transferred under nitrogen into a Schlenk-type flask containing CuBr (9 mg, 6.06 ⁇ 10 5 mol).
  • the reaction mixture is left stirring at ambient temperature for 3 days and then dialyzed against milliQ water using a Spectra / Por® dialysis membrane 6 characterized by a cutoff threshold of 50 kDa.
  • the copolymer is then recovered by lyophilization.
  • the mass of product recovered is 0.302 g (yield: 87%).
  • a solution of vesicles is thus obtained and characterized by dynamic and static scattering of light, diffusion of small angle neutrons and transmission electron microscopy.
  • Polymeric vesicles of 200 nm in radius with a small size distribution and having a membrane thickness of about 9 nm are thus obtained.
  • FIG. 2 shows the size distribution of the vesicles (hydrodynamic radius) obtained by light scattering.
  • FIG. 3 represents an image of transmission electron microscopy obtained on these same vesicles.
  • the ⁇ -benzyl dextran-b / ⁇ -poly ( ⁇ -benzyl L-glutamate) copolymer of Example 2 is dissolved in 1 ml of DMSO at a concentration of 0.5 mg / ml, then 9 ml of milliQ water are gradually added to the solution. using a syringe pump at 18 mL / h with shaking.
  • the DMSO is then removed by dialysis against milliQ water using a Spectra / Por® dialysis membrane 6 characterized by a 2kDa cut-off.
  • the vesicles then formed are analyzed by dynamic light scattering and transmission electron microscopy.
  • Polymeric vesicles of 40 nm in radius are thus obtained with a small size distribution.
  • FIG. 4 shows the size distribution of the vesicles (hydrodynamic radius) obtained by light scattering.
  • FIG. 5 represents an image of transmission electron microscopy obtained on these same vesicles.
  • Example 6 Encapsulation of an Active Principle in a Micellar Vesicle
  • Doxorubicin and docetaxel were encapsulated in micellar vesicles based on the hyaluronic acid-b / oc-poly ( ⁇ -benzyl L-glutamate) copolymer of Example 1 by nanoprecipitation.
  • the active ingredient was dissolved in DMSO or Tris buffer in bulk ratios of active ingredient: copolymer of 0.1: 1, 0.2: 1 and 0.3: 1.
  • the amount of encapsulated doxorubicin (in the hydrophobic or hydrophilic portion of the vesicles) and the encapsulation efficiency were determined by breaking the charged vesicles into a DMSO: Tris (80:20) mixture. After centrifugation for 1 h, the sample was filtered and measured by UV spectroscopy at 485 nm. Quantification was performed from the calibration curve of doxorubicin in the DMSO: Tris (80:20) mixture. The amount of encapsulated docetaxel and the encapsulation efficiency were determined from the reconstitution of a dry vesicle extract containing docetaxel in ethanol. Then, the filtered sample was measured by UV spectroscopy at 230 nm. Quantification was performed from the calibration curve of doxorubicin in ethanol.
  • Encapsulated quantity (mass of active principle in the charged vesicle / mass of vesicle) x100
  • the desired amount for example, a volume of 4mL at a concentration of 1mg / mL
  • doxorubicin and docetaxel loaded vesicles is poured into a dialysis tube (Spectra / Por® Float-A-Lyzer® Dialysis
  • the dialysis tube is introduced vertically into a measuring cylinder of 50 ml.
  • the system is maintained at 37 ° C + 2 and covered with parafilm to prevent evaporation.
  • a measuring cylinder of 50 ml.
  • sampling is done in the dialysis tube and then reinserted as is after analysis.
  • sampling is done outside the dialysis tube.
  • the dialysis medium contained 50 mL of Tris buffer (pH 7.4) with 2% v / v ethanol to increase the solubility of the released docetaxel and to avoid aggregation of the free docetaxel.
  • Quantification is performed by the calibration curve of free active principles in their respective solvents.
  • the release profiles expressed as a percentage of cumulative release as a function of time (in second 1/2 ) are represented in FIGS. 6 (doxorubicin) and 7 (docetaxel).
  • the free active ingredient is represented by the symbol -o- (empty circle) and the release of the encapsulated active ingredient is represented by the symbol - • - (full circle).
  • toxicity and in vitro release experiments were carried out from vesicles based on hyaluronic acid- ⁇ / ⁇ -poly ( ⁇ -benzyl L-glutamate) diblock copolymer prepared in Example 6, containing 11% of doxorubicin.
  • rat C6 glioma cells were placed in 10 cm diameter falcons and grow in 10 ml of the culture medium containing penicillin (10000 ⁇ g / ml), streptomycin (10000 ⁇ g / ml) and amphotericin.
  • B 25 ⁇ g / ml [Invitrogen Corporation] in an incubator at 37 ° C. in a controlled atmosphere at 5% CO 2 .
  • C6 cells were incubated in a 24-well plate (15 ⁇ 10 4 cells per well) for 24 hours.
  • Viability was determined by a standard tetrazolium salt test MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide).
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide.
  • the tetrazolium it contains is reduced in fomnazan by the mitochondrial succinate dehydrogenase of living living living cells.
  • the color of the medium then changes from yellow to purplish blue.
  • the intensity of this staining is proportional to the number of living cells present during the test.
  • analysis is performed spectrophotometrically (U-2800A, HITACHI) by measuring the absorbance at 570 nm.
  • the measurements are standardized by a control experiment, for which the MTT test is performed without cells.
  • the value of IC50 is thus determined for a time of 48 hours, corresponding to the concentration for which half of
  • the follow-up of cellular intemalisation was performed in vitro by fluorescence microscopy.
  • the C6 cells were incubated (15 ⁇ 10 4 cells) in a 4-well plate of 16 mm.
  • the vesicles containing doxorubicin at a concentration of 4.54 ⁇ M were incubated at times of 3h, 6h and 24h at 37 ° C. in a controlled atmosphere at 5% CO 2 .
  • the cells are washed twice with PBS buffer, fixed on a microscope slide cover with 4% paraformaldehyde (PF4) in PBS buffer, left in the dark at room temperature for 30 min, and then washed. once with PBS buffer and once with pure water.
  • PF4 paraformaldehyde
  • This dispersion was applied to a dose of O 1 SmL 1 under semi-occlusive dressing, for 4 hours on a healthy skin area in 3 rabbits.
  • the experimental protocol is that of OECD Directive No. 404 of 24 April 2002 and Test Method B.4 of EC Directive 440/2008.
  • Example 1 A 1% (w / v) dispersion of hyaluronic acid-6 / oc-poly ( ⁇ -benzyl L-glutamate) diblock copolymer of Example 1 was used.
  • the copolymer dispersion was applied to the dorsal surface of the ear of a female mouse line.
  • the copolymer dispersion was administered intravenously in a male and a female Swiss mouse at an administration volume of 10 ml / kg. Considering the density of the formulation, this administration corresponds to a dose of 10 g / kg.
  • MTD Maximum tolerated dose of the copolymer dispersion according to the invention intravenously is greater than 10 g / kg in the mouse.
  • the human cell line MCF-7 which significantly expresses CD44 receptors, was used.
  • a competitive inhibition assay was performed by previously adding free hyaluronic acid to the incubation medium in order to block to some extent the receptors for hyaluronic acid on the surface of the cells.
  • the cells were then washed twice with PBS buffer and collected by centrifugation (1000 rpm for 10 min). The cells were then resuspended in 300 ⁇ l of PBS buffer prior to measurement.
  • Samples were collected on a Calibur FACS flow cytometer (Beckton Dickinson) and analyzed using CeII Quest software provided by the manufacturer. For each analysis, at least 10,000 cells were counted.
  • FIG. 9 represents the relative fluorescence intensity measured in arbitrary units (AU) in the MCF-7 cells measured after incubation in the presence of encapsulated doxorubicin (black column), free doxorubicin
  • DMBA 7,12-dimethylbenz [ ⁇ ] anthracene
  • the tumor-bearing animals were separated and randomly divided into different treatment groups, and then treated with a single dose of 250 ⁇ l intravenous doxorubicin at 5mg / kg, either in the form of doxorubicin free, either in the form of doxorubicin encapsulated in the micellar vesicles of Example 6.
  • the control group received a single dose of 250 ⁇ l of buffer
  • PBS (pH 7.4) intravenously.
  • Figure 10 reports the change in tumor volume as a function of time, following treatment with free doxorubicin (curve represented by the symbol -V-), encapsulated doxorubicin (curve represented by the symbol -D-) or PBS (curve represented by the symbol - • -).
  • free doxorubicin and encapsulated doxorubicin significantly inhibit tumor growth compared to the PBS treated control group.
  • encapsulated doxorubicin causes tumor suppression significantly higher than free doxorubicin.
  • doxorubicin One of the main well-known side effects of doxorubicin is its cardiotoxicity. This can be evaluated by measuring the production of specific enzymes, mainly lactate dehydrogenase and creatine kinase.

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Abstract

L'invention concerne un nouveau type de copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide, biorésorbable ou biodégradable et biocompatible, son procédé de préparation, les vésicules micellaires constituées de ce copolymère, et leur utilisation pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation, et le ciblage de molécules d'intérêt.

Description

Copolymères à blocs à base de polysaccharide et de polypeptide, les vésicules constituées de ces copolymères et leur utilisation
L'invention concerne un nouveau copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide, biorésorbable ou biodégradable et biocompatible, son procédé de préparation, les vésicules nrucellaires constituées de ce copolymère, et leur utilisation pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation, et le ciblage de molécules d'intérêt, naturelles ou synthétiques, ayant ou non une activité thérapeutique.
Il existe naturellement chez les organismes vivants des structures vésiculaires résultant de l'assemblage de biomolécules amphiphiles formées à partir de lipides, de protéines et de carbohydrates. Ces vésicules naturelles sont de taille variable, les plus grandes jouant le rôle de membranes qui protègent le contenu intracellulaire de l'environnement extracellulaire, alors que les petites vésicules lipidiques jouent un rôle de transporteur de biomolécules à l'intérieur de la cellule.
Des structures vésiculaires stables ont pu être préparées par synthèse, en commençant par les liposomes dans les années 1960, obtenus par assemblage de phospholipides naturels ou synthétiques, jusqu'aux récentes vésicules de polymères formées par l'assemblage de copolymères à blocs synthétiques, appelées « polymersomes » (B.M.Discher et al., Science 1999, 284, 1143).
Les « polymersomes » semblent très prometteurs pour le développement d'applications biomédicales, notamment pour le transport d'agents thérapeutiques ou comme microréacteurs mimant le comportement des cellules vivantes.
De plus, les « polymersomes » présentent de nombreux avantages par rapport aux liposomes, notamment une concentration critique d'agrégation plus faible, une structure vésiculaire unilamellaire ou multilamellaire associée avec une faible dispersion de taille, et une stabilité membranaire plus élevée diminuant la fuite passive des molécules encapsulées.
De plus, la diversité chimique des copolymères à blocs permet d'envisager des possibilités infinies de modification des propriétés de la vésicule pour la conformer à l'application souhaitée.
La plupart des « polymersomes » rapportés dans la littérature ont été formés par assemblage de composés synthétiques amphiphiles, comme, par exemple, le polylactide-/3/oc-poly( oxyde d'éthylène), le poly(butadiène)-b/oc- poly(oxyde d'éthylène), la polycaprolactone-jb/oc-poly(oxyde d'éthylène) et la poly(2-méthyloxazoline)-Λ/oc-poly(diméthylsiloxane)-/?/oc-poly(2-méthyloxa- zoline), très étudiés du fait de la biocompatibilité ou de la biorésorbabilité de leurs blocs respectifs.
L'intérêt scientifique s'est ensuite porté sur des assemblages comportant des blocs naturels, tels que des polypeptides ou des polysaccharides. En particulier, l'intérêt pour des assemblages de polypeptides repose sur le fait qu'ils présentent des propriétés physicochimiques uniques : ils sont optiquement actifs par nature, biocompatibles et biodégradables dans certains cas, peuvent servir à mimer des séquences polypeptidiques naturelles, et sont capables de subir des transitions conformationnelles réversibles selon les conditions de pH et/ou de température.
Les copolypeptides à blocs représentent une sous-classe particulière associant deux blocs synthétiques polypeptidiques qui combinent une capacité d'auto-assemblage et de structures tridimensionnelles hautement ordonnées. Ils ont été décrits dans la littérature comme des matériaux prometteurs pour des applications telles que les biocapteurs, l'ingénierie tissulaire ou la libération sélective de principes actifs. La chimie des copolymères à blocs à base de polypeptides a été étudiée de manière approfondie dans la littérature, en utilisant la polymérisation par ouverture de cycle des monomères N-carboxyanhydrides (en anglais « NCA ») des acides aminés correspondants, amorcée par des dérivés aminés. En adaptant la technique de couplage par cycloaddition 1 ,3-dipolaire de Huisgen, communément appelée « chimie-click » (en anglais « click-chemistry »), dont le principe repose sur la formation d'une liaison 1 ,2,3 triazole-1 ,4 disubstituée, combinant des conditions opératoires douces, la tolérance des groupes fonctionnels et un rendement élevé, à ce type de copolymères, des copolymères à blocs à base de polypeptides ont été préparés, comme par exemple le poly(L-glutamate de γ-benzyle)-b/oc-poly(ε-trifluoroacetyl-L-l_ysine) (D. Taton et S. Lecommandoux, Macromolecular Rapid Communications, 2008, 29, 1147).
En utilisant des méthodes chimiques plus conventionnelles, d'autres copolypeptides à blocs ont pu être synthétisés, tels que le poly(L-acide glutamique)-b/oc-poly(L-lysine) (J. Rodriguez-Hernandez et S. Lecommandoux,
J.A.C.S, 2005, 127, 2026) ou le poly(L-lysine)-b/oc-poly(L-leucine) (E.G.
Bellomo et al., Nat. Mater., 2004, 3, 244) ou encore le poly(L-lysine)-/>/oc- poly(γ-benzyl-L-glutamate)-d/oc-poly(L-lysine) (H. latrou et al., Biomacro- molecules, 2007, 8, 2173). II est possible d'obtenir par cette chimie des tailles de vésicules très variables, allant de 100 nm à quelques μm, en faisant varier les conditions opératoires, jusqu'à des vésicules géantes allant jusqu'à 50 μm utilisées comme modèles des membranes de cellules vivantes.
La chimie des copolymères blocs à base de polysaccharides a fait l'objet de plus rares études, du fait de sa complexité. Récemment, un procédé de synthèse de copolymère dibloc dextrane-b/oc-polystyrène par polymérisation radicalaire contrôlées par transfert d'atome (en anglais « ATRP ») a été rapportée (C.Houga et al., Chem. Commun., 2007, 3063). Le nombre de systèmes copolymères à blocs basés sur des sucres qui a été étudié est limité, et il existe peu d'informations disponibles sur leur comportement en solution et leurs propriétés.
Par exemple, il a été décrit que le dextrane-ιb/oc-poly(ε- caprolactoπe) s'auto-assemble dans l'eau en structures micellaires polydisperses ayant un diamètre moyen d'environ 100 nm (J. Liu et al., Carbohydrate Polymers, 2007, 69, 196). Cependant, il n'a jamais été décrit ni suggéré dans la littérature de copolymères à blocs combinant dans une seule chaîne linéaire un segment polypeptidique et un bloc polysaccharide.
On a maintenant trouvé qu'il était possible, par la synthèse de structures associant, dans un copolymère, des blocs d'unités saccharidiques et des blocs d'unités peptidiques, de préparer des composés permettant de mimer les structures naturelles glycoprotéiques qui sont impliquées dans de nombreux mécanismes biologiques.
Une glycoprotéine est une protéine portant au moins un groupement polysaccharidique et une chaîne polypeptidique. Chez les organismes uni- ou multi-cellulaires, de nombreuses glycoprotéines se trouvent sur la face externe de la membrane plasmique, la partie glycosylée étant orientée vers le milieu extracellulaire. Les glycoprotéines sont présentes, en particulier, chez les microorganismes tels que les virus et les bactéries. Ainsi, beaucoup de microorganismes pathogènes ont évolué de façon à reconnaître les sucres présents à la surface des cellules et s'en servent comme points d'ancrage et d'entrée dans les cellules à infecter. Par exemple, le virus VIH pénètre dans les cellules du système immunitaire en se liant à des récepteurs membranaires tels que les récepteurs CXCR4 et CXCR5, qui sont des glycoprotéines.
Ainsi, il est particulièrement intéressant de disposer de structures synthétiques biomimétiques pouvant mimer les glycoprotéines et susceptibles de s'auto-assembler sous forme de vésicules. Ceci permet, par exemple, de former des « virus synthétiques » mimant la structure des virus et leur rôle fonctionnel, et permettant d'envisager une délivrance intracellulaire efficace de molécules d'intérêt.
Pour aboutir à la synthèse de telles structures complexes, il a été nécessaire de mettre en oeuvre des réactions chimiques modernes, qui doivent être particulièrement bien contrôlées, en particulier les réactions de « chimie- click » permettant un couplage efficace et quantitatif des différentes entités chimiques dans des conditions douces. L'invention a donc pour objet, selon un premier aspect, un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide constitué d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques. Par « copolymère à blocs », comme par « copolymère dibloc », on entend une structure linéaire dans laquelle un bloc polysaccharide et un bloc polypeptide sont reliés par leurs extrémités.
Leur structure linéaire est une caractéristique avantageuse des copolymères selon l'invention. En effet, la modification chimique de chaînes polymères (y compris des chaînes peptidiques) sur les groupements latéraux, qui conduit à des structures greffées, peut être effectuée par des réactions chimiques simples. Cependant, de telles modifications résultent souvent dans des structures mal définies : nombre de greffons variable, répartition homogène ou hétérogène le long de la chaîne, manque de reproductibilité, etc.
Ces inconvénients majeurs sont incompatibles avec un développement industriel, en particulier dans le domaine pharmaceutique. La structure linéaire des copolymères selon l'invention permet avantageusement d'avoir degré de contrôle et une reproductibilité élevés de la structure copolymère, assurant ainsi une régularité des propriétés.
Ce contrôle moléculaire, associé à une prédiction et un contrôle des propriétés interfaciales, permet de former des vésicules de façon reproductible et prédictible.
Avantageusement, le copolymère dibloc polysaccharide-b/oc- polypeptide selon l'invention est biorésorbable ou biodégradable et biocompatible.
Dans la suite de la description, les expressions « bloc d'unités saccharidiques », « bloc polysaccharide » ou « polysaccharide » peuvent être utilisées indifféremment pour désigner un enchaînement d'unités monomères saccharidiques formant un polysaccharide ou un dérivé de polysaccharide. De même, on utilisera indifféremment les expressions « bloc d'unités peptidiques », « bloc polypeptide » ou « polypeptide » pour désigner un enchaînement d'unités monomères peptidiques formant un polypeptide ou un dérivé de polypeptide.
Le copolymère dibloc selon l'invention peut comprendre tout type de polysaccharide naturel ou synthétique, ou d'un de ses dérivés, et tout type de polypeptide naturel ou synthétique, ou d'un de ses dérivés.
Par « dérivés de polysaccharide », on entend les composés issus d'une modification chimique d'un polysaccharide, susceptible de conférer, par exemple, un caractère hydrophobe à un polysaccharide naturellement hydrophile, ou, éventuellement, d'ajouter de nouveaux groupes fonctionnels sur la molécule.
De tels dérivés peuvent être, par exemple, des dérivés esters ou éthers, en particulier des esters organiques; des esters inorganiques tels que les phosphates ou les sulfates; des dérivés éthers non ioniques, tels que, par exemple, les dérivés alkyles, hydroxyalkyles ou les hydroxyalkylaryles ; les dérivés éthers ioniques, tels que, par exemple, les dérivés sulfopropyles, carboxyméthyles ou les (diéthylamino)éthyles ; ou encore d'autres dérivés tels que les conjugués de polysaccharides, les dérivés para-toluènesulfonate, thiols ou sylilés.
Des polysaccharides préférés peuvent être, par exemple, choisis parmi le dextrane, l'acide hyaluronique et leurs dérivés.
Des dérivés de polysaccharides et des procédés de modification de polysaccharides sont décrits, par exemple, dans les ouvrages de référence « Polysaccharides I », Adv. Polym. Sci. (2005), 186, et « Polysaccharides II », Adv. Polym. Sci. (2006), 205. Par « dérivés de polypeptide », on entend les composés issus d'une modification chimique d'un polypeptide, susceptible de conférer, par exemple, un caractère hydrophobe à un polypeptide naturellement hydrophile, ou, éventuellement, d'ajouter de nouveaux groupes fonctionnels sur la molécule. De tels dérivés peuvent être, par exemple, des dérivés esters ou éthers, en particulier des esters organiques; aliphatiques ou aromatiques, des esters inorganiques; des dérivés éthers, tels que, par exemple, les dérivés alkyles ou hydroxyalkyles, des dérivés amides ou imines, etc.
Selon un aspect préféré, le copolymère dibloc polysaccharide- fe/oc-polypeptide peut comprendre un bloc polysaccharide qui présente un caractère hydrophile et un bloc polypeptide qui présente un caractère hydrophobe en conditions physiologiques, soit par nature ou par modification chimique lui conférant une hydrophobicité.
Selon un autre aspect préféré, le copolymère dibloc polysaccharide-ib/oc-polypeptide peut comprendre un bloc polysaccharide qui présente un caractère hydrophobe, notamment par modification chimique susceptible de conférer une hydrophobicité à un polysaccharide naturellement hydrophile, et un bloc polypeptide qui présente un caractère hydrophile en conditions physiologiques.
De ce fait, les copolymères dibloc polysaccharide-fo/oc-polypeptide selon l'invention sont des composés amphiphiles aptes à s'auto-assembler pour former un nouveau type de vésicules micellaires assemblées à base de polymères naturels ou synthétiques. Par rapport aux vésicules existantes, notamment les liposomes, les applications de ces vésicules à base de copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide offrent de nouvelles possibilités grâce aux propriétés intrinsèques des polymères utilisés.
En effet, les vésicules à base de copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide présentent notamment les avantages suivants : un caractère biocompatible et biorésorbable ou biodégradable, une stabilité élevée en solution aqueuse, une capacité à encapsuler des espèces hydrophiles et hydrophobes, et une diversité de fonctions chimiques pouvant être aisément mise à profit pour modifier la surface des vésicules et leur conférer ainsi une propriété particulière telle que l'affinité pour un récepteur biologique.
L'utilisation de polysaccharides ou de polypeptides particuliers présentant la propriété d'être des ligands de récepteurs cellulaires permet également de préparer des vésicules micellaires permettant la libération ciblée de molécules d'intérêt, ledit polysaccharide pouvant, de par sa nature, être impliqué dans des mécanismes d'endocytose contrôlée par un récepteur (en anglais « Receptor mediated endocytosis » ou RME).
Les copolymères selon l'invention peuvent comprendre, en particulier, de 5 à 100 unités saccharidique et de 5 à 100 unités peptidiques, notamment de 10 à 100 unités saccharidique et de 10 à 100 unités peptidiques et, de préférence, environ 10 à environ 50 unités saccharidiques et environ 10 à 50 unités peptidiques. Le rapport massique polymère hydrophile/polymère hydrophobe peut être, par exemple, d'environ 1/1.
Des copolymères avantageux selon l'invention présentent une masse molaire de 1000 à 50000 g/mole.
Le polysaccharide peut être choisi, par exemple, parmi le dextrane, la chitine, le chitosane, l'acide hyaluronique, le pullulane, le fucane, le fucane sulfaté, le succinoglycane, le galactane, l'arabinogalactane, le galactane sulfaté, les alginates, le glucane, l'acide polysialique, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroitine sulfate, l'acharane sulfate, le kératane sulfate, le dermatane sulfate, le xanthane, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, la cellulose, l'agarose, le mannane, les galactomannanes, le curdlane, l'arabinane, les carraghénanes, le schizophyllane et leurs dérivés.
Le polypeptide, dans lequel l'acide aminé qui le constitue peut être sous forme optiquement active L ou D ou sous forme racémique DL, peut être choisi, par exemple, parmi la poly(alanine), la poly(arginine), le poly(acide aspartique), la poly(asparagine), le poly(aspartate), la poly(cystéine), le poly(acide glutamique), le poly(glutamate), la poly(glutamine), la poly(glycine), la poly(histidine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(lysine), la poly(méthionine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la poly(pyrrolysine), la poly(sélénocystéine), la poly(sérine), la poly(thréonine), le poly(tryptophane), la poly(tyrosine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle), la poly(trifluoroacétyl-Lysine), la poly(sarcosine) la poly(hydroxyéthyl- asparagine), la poly(hydroxyalkyl-asparagine), la poly(hydroxyalkyl- aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) et leurs dérivés. Dans un aspect préféré, ledit polypeptide est hydrophobe en conditions physiologiques.
Des polypeptides hydrophobes préférés sont, par exemple, le poly(L-glutamate de γ-benzyle) et la poly(ε-trifluoroacétyl-L-lysine). Selon un autre aspect avantageux, ledit polypeptide est hydrophile en conditions physiologiques.
Des polypeptides hydrophiles préférés sont, par exemple, le poly(L-acide glutamique), le poly(L-glutamate) et la poly(L-lysine).
Aux fins de l'invention, le polypeptide peut être obtenu par un procédé de polymérisation par ouverture de cycle du monomère N- carboxyanhydride (NCA) de l'acide aminé correspondant, cité plus haut.
L'invention concerne également, selon un aspect ultérieur, un procédé de préparation des copolymères dibloc polysaccharide-£>/oc- polypeptide biorésorbables ou biodégradables et biocompatibles décrits ci- dessus.
Comme indiqué plus haut, la synthèse des copolymères selon l'invention met en œuvre des réactions chimiques bien contrôlées, en particulier les réactions de « chimie-click » permettant un couplage efficace et quantitatif dans des conditions douces.
Parmi les réactions de « chimie-click », on peut citer, par exemple, les cycloadditions d'espèces insaturées (par exemple, les cycloadditions 1 ,3- dipolaires azide-alcyne, les réactions de Diels Aider entre un diène et un diènophile), les réactions impliquant un groupe carbonyle électrophile, de type non aldol (par exemple, formation d'éthers d'oxime à partir d'une oxyamine, d'hydrazones à partir d'une hydrazine, ou de thiosemicarbazones à partir d'une thiosemicarbazine), les réactions mettant en jeu un groupement thiol (formation de thioéthers à partir d'un alcène et de disulfures mixtes), les réactions impliquant des fonctions acides thiocarboxyliques ou thioesters (formation des liaisons thioesters et amides) et les ligations de Staudinger impliquant des fonctions phosphine et azide. Chacun des groupes fonctionnels cités ci-dessus peut être introduit indifféremment sur le groupement polypeptide ou sur le groupement polysaccharide pour le couplage.
Selon une alternative préférée, le procédé selon l'invention pour la préparation des copolymères dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide comprend les étapes consistant à :
- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, - introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polypeptidique, et
- coupler la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique dans un solvant commun.
Selon une autre alternative du procédé selon l'invention, ledit procédé comprend les étapes consistant à :
- introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polypeptidique,
- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, et
- coupler la chaîne polypeptidique et la chaîne polysaccharidique dans un solvant commun.
Le couplage de la chaîne polypeptidique et de la chaîne polysaccharidique, ou inversement, ainsi que les copolymères dibloc à structure linéaire ainsi obtenus, sont représentés schématiquement sur la figure 1.
Les aspects préférés de l'invention relatifs aux copolymères dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide, tels que mentionnés plus haut, s'appliquent également à leur procédé de préparation. L'amination réductive peut être effectuée, par exemple, à l'aide d'une aminé telle que la propargylamine en présence d'un agent réducteur tel que le borocyanohydrure de sodium. La fonction azoturβ peut être introduite à l'extrémité de la chaîne polypeptidique à l'aide d'un agent bifonctionnel, tel que le 3- azidoaminopropane, la fonction aminé servant à amorcer la polymérisation par ouverture de cycle du monomère NCA de l'acide aminé correspondant. La longueur du bloc polypeptide peut ainsi être contrôlée par le rapport molaire monomère NCA/agent bifonctionnel.
En tant que solvant pour l'étape de couplage de la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique, on peut utiliser, par exemple, un solvant organique tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO). Cette réaction est, de préférence, catalysée par des dérivés de cuivre, tel que, par exemple,CuBr, en présence d'un ligand, par exemple le pentaméthyldiéthylènetriamine. La chaîne hydrophile, polypeptide ou polysaccharide, peut être ajoutée en léger excès, de l'ordre de 2 équivalents molaire, puis éliminée par dialyse, afin d'assurer une réaction de couplage quantitative et la formation de copolymères à blocs purs. L'invention concerne également, selon un aspect ultérieur, de nouvelles vésicules micellaires formées à partir de copolymères dibloc polysaccharide-fe/oc-polypeptide constitués d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques, reliés par leur extrémité dans une structure de chaîne linéaire, tel que décrits plus haut.
De préférence, lesdits copolymères comprennent de 5 à 100 unités saccharidiques et de 5 à 100 unités peptidiques, notamment de 10 à 100 unités saccharidiques et de 10 à 100 unités peptidiques, et, de préférence, environ 10 à environ 50 unités saccharidiques et environ 10 à environ 50 unités peptidiques.
Avantageusement, lesdits copolymères sont biorésorbables ou biodégradables, et biocompatibles.
En tant que polysaccharide et polypeptide préférés, il y a lieu de se référer aux aspects préférés de l'invention relatifs aux copolymères dibloc polysaccharide-fo/oc-polypeptide, tels que mentionnés plus haut, qui s'appliquent également auxdites vésicules micellaires. Les vésicules micellaires selon l'invention peuvent être préparées par différents procédés usuels tels que, par exemple, la dissolution directe, l'hydratation de film, le procédé d'émulsification/diffusion ou la nanoprécitation. On utilisera de préférence la nanoprécipitation, qui consiste à mélanger une solution de polymère dans un solvant organique miscible à l'eau. L'introduction d'une solution organique du copolymère dibloc selon l'invention dans l'eau sous agitation modérée induit simultanément une séparation de phases et un procédé d'auto-assemblage qui progresse au fur et à mesure que le solvant organique diffuse dans la phase aqueuse, celle-ci étant en excès par rapport à la phase organique. Un solvant organique approprié est, par exemple, le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le formamide. Après élimination du solvant organique par évaporation et/ou dialyse, on récupère les vésicules directement en solution aqueuse. Elles peuvent ensuite être lyophilisées afin de les obtenir sous la forme d'un extrait sec redispersable. Leur taille peut être modulée en ajustant le procédé d'émulsification/diffusion ou de nanoprécitation (sens d'ajout, nature du solvant organique, volume des phases, concentration en copolymère...).
Leur taille peut aussi être facilement contrôlée et adaptée en fonction de l'application souhaitée. Elle peut être notamment réduite jusqu'à environ 100nm après formation par action d'ultrasons ou par extrusion sur des membranes de porosité contrôlée lorsqu'on envisage une application biomédicale. Dans d'autres applications, par exemple dans le domaine de la cosmétique, de l'hygiène, du nettoyage ou autres, les vésicules selon l'invention peuvent présenter une taille de l'ordre du μm ou de plusieurs dizaines de μm. Les vésicules micellaires selon l'invention peuvent être caractérisées par diffusion dynamique et statique de la lumière, diffusion de neutrons aux petits angles et microscopie électronique en transmission. De telles techniques pour la caractérisation des systèmes micellaires sont décrites, par exemple, dans G.Riess, Progress in Polymer Science, 2003, 28, 1107. Dans un aspect avantageux, ladite vésicule micellaire formée à partir de copolymères dibloc polysaccharide-6/oc-polypeptide contient au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique. Cette molécule peut être introduite, en fonction de sa polarité, dans la phase aqueuse ou dans la phase organique avant le procédé de nanoprécipitation. Elle est ainsi encapsulée durant le processus de fabrication de la vésicule. Elle peut aussi être introduite après la formation des vésicules par des méthodes de gradient de pH ou d'émulsification/diffusion.
Par « molécule ayant une activité thérapeutique », on entend, par exemple, une molécule naturelle ou synthétique utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées. De telles molécules peuvent être, par exemple, un principe actif de médicament, tel qu'un antibiotique, un antalgique, un antiinflammatoire, un antitumoral, etc. ou encore un peptide, une protéine, une hormone, une enzyme, un acide nucléique, un oligonucléotide, un antigène, un anticorps, un interféron, un facteur de croissance, un modulateur d'activité enzymatique, un activateur ou un inhibiteur de récepteur cellulaire, une vitamine etc.
De telles molécules ayant une activité thérapeutique peuvent être utilisées, par exemple, dans le domaine pharmaceutique ou médical.
Le cas échéant, l'encapsulation de ladite molécule ayant une activité thérapeutique dans une vésicule micellaire selon l'invention permet de diminuer significativement la toxicité de ladite molécule. En particulier la toxicité bien documentée des agents antitumoraux, telle que, notamment, leur cardiotoxicité, par exemple dans le cas de l'utilisation de la doxorubicine ou de la mitoxantrone ou leur neurotoxicité, par exemple dans le cas de l'utilisation de la vincristine, peuvent être significativement diminuées. Par « molécule d'intérêt n'ayant pas d'activité thérapeutique », on entend, par exemple, une molécule naturelle ou synthétique qui n'est pas utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées. Le cas échéant, une telle molécule peut néanmoins présenter une activité biologique, notamment vis-à-vis des végétaux ou des microorganismes. On peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, les domaines d'application suivants : - l'imagerie médicale : agents de diagnostic, tels que, par exemple, des agents de contraste, des isotopes, des sondes fluorescentes
- la cosmétique et l'hygiène : molécules olfactives, pigments, colorants, antioxydants, agents antibactériens, agents antiseptiques, agents émollients, agents exfoliants, agents hydratants, etc;
- le nettoyage et la détergence : tensioactifs, colorants, antioxydants, antibactériens, antiseptiques, agents blanchissants, etc;
- la phytopharmacie : pesticides, fongicides, herbicides, insecticides, accélérateurs de croissance, etc, - l'agroalimentaire : agents colorants, exhausteurs de goût etc,
- la chimie organique : dérivés catalytiques organiques, métalliques ou inorganiques, etc, ou dans tout autre domaine d'activité dans lequel on souhaite encapsuler une molécule dans une vésicule micellaire, celle-ci présentant l'avantage d'être biorésorbable ou biodégradable et biocompatible.
L'utilisation des vésicules micellaires formées à partir de copolymères dibloc polysaccharide-fc/oc-polypeptide constitués d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités polypeptidiques naturelles ou synthétiques, tel que décrits plus haut, en tant que véhicules pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation et/ou le ciblage d'au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique, représente un autre aspect de l'invention.
L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant les vésicules micellaires formées à partir de copolymères dibloc polysaccharide-/>/oc-polypeptide constitués d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités polypeptidiques naturelles ou synthétiques, et contenant au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique, telles que décrites plus haut, et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les excipients pharmaceutiquement acceptables, peuvent être choisis selon le mode d'administration envisagé parmi les excipients habituels dans le domaine pharmaceutique.
Par exemple, pour une administration orale sous forme de comprimés, les excipients peuvent être choisis parmi des liants, des charges, des agents de délitement, des adjuvants ou des agents retardateurs et pour une administration par voie orale sous forme de suspensions, solutions ou émulsions aqueuses ou huileuses, les compositions peuvent également contenir des agents de mise en suspension; des agents émulsionnants, des véhicules non aqueux ou des conservateurs
Pour une administration par voie parentérale, les compositions pharmaceutiques peuvent se trouver sous forme de solutions injectables stériles aqueuses et non aqueuses pouvant contenir des antioxydants, des tampons, des agents bactériostatiques et des solutés qui rendent la formulation isotonique avec le sang du receveur choisi ; ou sous forme de suspensions aqueuses ou non aqueuses stériles qui peuvent comprendre des agents de mise en suspension et des agents épaississants.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également être administrées par d'autres voies, telles que la voie buccale ou sublinguale à l'aide d'un excipient adapté, la voie topique sur l'épiderme, sous forme de crème, de gel, de pommade, de lotion ou de timbre transdermique, la voie intranasale, sous forme d'un liquide d'atomisation, d'une poudre ou de gouttes ou par inhalation, au moyen d'un agent propulseur convenable.
Avantageusement, les vésicules micellaires selon l'invention sont utilisables aussi bien pour l'encapsulation de molécules hydrophobes que de molécules hydrophiles, car elles possèdent deux compartiments de polarité différente, à savoir la membrane qui est hydrophobe et la cavité interne qui est hydrophile. Par ailleurs, comme l'auto-assemblage des copolymères en vésicules se fait par des interactions faibles, la dissociation des vésicules et la libération concomitante de la molécule d'intérêt encapsulée peut être obtenue dans des conditions définies (salinité, température, pH, hydrolyse, etc.) Selon un aspect préféré de l'invention, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-6/oc-polypeptide dans lequel le polysaccharide présente une affinité pour au moins un récepteur cellulaire. Selon un autre aspect préféré de l'invention, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc- polypeptide dans lequel le polypeptide présente une affinité pour au moins un récepteur cellulaire.
Dans de tels cas, les vésicules micellaires pourront, avantageusement, être utilisées pour le ciblage d'une molécule d'intérêt.
Parmi les polysaccharides de ce type, on peut citer, par exemple, l'acide hyaluronique, qui présente une affinité pour les récepteurs CD44. Les récepteurs CD44 sont présents à des niveaux élevés dans les cellules tumorales de différents carcinomes, mélanomes, lymphomes etc (« Chemistry and Biology of Hyaluronan », H. G. Garg et CA. Haies Ed. (2004), Chapitre 5, Elsevier Ltd).
Des polypeptides intéressants à cet égard sont, par exemple, le poly(acide glutamique) ou le poly(glutamate). En effet, le poly(acide glutamique) ou le poly(glutamate) sont, par exemple, des ligands des récepteurs du glutamate (Mornet C, Briley M, Trends Pharmacol Sci. 1988;9:278-279) ou des récepteurs TLR4 (Poo et al. 22 (2) 517 - The FASEB Journal).
Dans un autre aspect préféré, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide dans lequel ledit polysaccharide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose contrôlée par un récepteur (en anglais « Receptor mediated endocytosis » ou RME).
Alternativement, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide dans lequel ledit polypeptide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose contrôlée par un récepteur.
L'endocytose contrôlée par un récepteur est un mécanisme biologique par lequel des molécules présentes dans l'espace extracellulaire se lient à des récepteurs cellulaires et sont internalisées, permettant également le ciblage d'une molécule d'intérêt.
Un polysaccharide intéressant aux fins de l'invention est l'arabinogalactane, qui interagit avec des récepteurs hépatocytaires intervenant dans des mécanismes d'endocytose contrôlée.
Des polysaccharides susceptibles d'être impliqués dans des mécanismes d'endocytose contrôlée par un récepteur sont mentionnés, par exemple, dans les brevets US 5 336 506 et 5 554386.
L'invention est illustrée de manière non limitative par les exemples ci-dessous.
Exemple 1 : préparation d'un copolymère dibloc acide hyaluronique-b/oc-poly (L-qlutamate de γ-benzyle)
Préparation du poly(L-glutamate de γ-benzyle) possédant une fonction azoture (PBLG-azoture)
6 g (22,81 mmol) de N-carboxyanhydride de L-glutamate de γ-benzyle sont introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk préalablement flammé sous vide, et dissous dans 60 ml de DMF anhydre. La solution est agitée 10 min et 57 μL de 1-azido-3-aminopropane (570 μmol) sont ajoutés au moyen d'une seringue purgée à l'azote. La solution est agitée 40 h sous vide à température ambiante. Le polymère est récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique puis séché sous vide. La masse de produit récupéré est 4,2 g (rendement : 70%) L'analyse par spectroscopie RMN du proton fournit un degré de polymérisation moyen en nombre de 23. Analyse 1H RMN (CDCI3 : acide trifluoroacétique deutéré, 85 : 15) : 1 ,8 ppm (N3-CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 1 ,9 et 2,1 ppm (-CH2-CH2-CH- , 2H); 2,5 ppm (-CH2-CO, 2H); 2,6 ppm (N3- CH2-CH2-CH2- , 2H); 3,4 ppm (N3-CH2-CH2-CH2- , 2H); 4,6 ppm (-NH-CH- CO- , 1H); 5,1 ppm (-CH2-C6H5 , 2H); 7,3 ppm (-C6H5 , 5H); 7,9 ppm (NH, 1H). Préparation de l'acide hyaluronique possédant une fonction alcyne (acide hyaluronique alcyné)
L'acide hyaluronique (2,2 g ; 6.104 mol) possédant un degré de polymérisation moyen en nombre égal à 10 est solubilisé dans un tampon acétate (pH= 5,6) à une concentration massique de 2 %. 2,82 ml_ (4,4.10"2 mol) de propargylamine et 2,77 g (4,4.102 mol) de borocyanohydrure de sodium sont ajoutés au milieu sous agitation. Après 5 jours de réaction à 500C et sous agitation le mélange réactionnel est concentré à l'évaporateur rotatif et précipité dans 400 ml_ de méthanol froid. Le solide est récupéré par centrifugation et lavé au méthanol refroidi pour éliminer l'excès de propargylamine et de borocyanohydrure de sodium. Le précipité est alors séché sous vide pendant 2 jours. La masse de produit récupéré est 2,2 g (rendement : 100 %). Analyse 1H RMN (D2O) : 3,35 ppm (C(2)H, GIcA); 3,59 ppm (C(3)H, GIcA); 3,72 ppm (C(5)H, GIcA); 3,73 ppm (C(4)H, GIcA); 4,48 ppm (C(I)W, GIcA); 2,03 ppm (CH3, 3H, GIcNAc); 3,50 ppm (C(5)H, GIcNAc); 3,55 ppm (C(4)H, GIcNAc); 3,72 ppm (C(Z)H, GIcNAc); 3,86 ppm (C(2)H, GIcNAc); 3,90 ppm (C(6)H, GIcNAc); 4,54 ppm (C(I)H, GIcNAc); 8,22 (NH, GIcNAc); 3,72 ppm (C(3)H, β, GIcNAc); 3,83 ppm (C(2)H, β, GIcNAc); 3,91 ppm (C(3)H, α, GIcNAc); 4,05 ppm (C(2)H, α, GIcNAc); 4,73 ppm (C(I )H, β, GIcNAc); 5,16 ppm (C(I )H, α, GIcNAc); 8,41 ppm (NH, α, GIcNAc); 8,47 ppm (NH, β, GIcNAc).
Préparation du copolymère acide hyaluronique-bloc-poly(L-glutamate de γ-benzyle)
Deux équivalents d'acide hyaluronique alcyné (2,1 g ; 4,2.10"4 mol) et un équivalent de PBLG azoture (1 ,05 g ; 2.1.10"4 mol) sont solubilisés dans 70 mL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 87,04 μL de pentaméthyldiéthylènetriamine (4,1.10"4 mol) sont ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type schlenk contenant du CuBr (60 mg ; 4,18.10"4 mol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à 600C pendant 3 jours puis dialyse contre de l'eau milliQ à pH 3,5 en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 5OkDa. Le copolymère est alors récupéré par centrifugation et séché sous vide pendant deux jours. La masse de produit récupéré est 1 ,5 g (rendement : 70%). Analyse 1H RMN (DMSO d6 - 600C) : 1,8 ppm (CH3, GIcNAc); 1 ,9 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 2,05 et 2,25 ppm (- CH2-CH2-CH-, 2H) ; 2,5 ppm (CH2-CO-, 2H) ; 2,65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 3,1 ppm (C(2)W, GIcA) ; 3,2 ppm (C(3)H, GIcA) ; 3,1-3,7 ppm (C(3)H, C(A)H, C(5)H, 3H1 GIcNAc) ; 3,5 et 3,7 ppm (C(6)H, GIcNAc) ; 3,1-3,7 ppm (C(A)H, C(5)H, 2H, GIcA) ; 3,5 et 3,7 ppm (C(2)H, α et β, GIcNAc) ; 4,2 et 4,35 ppm (C(I)H, α et β, GIcA) ; 4,58 ppm (C(I)H, GIcNAc) ; 4,6 ppm (-NH-CH-CO, 1 H) ; 5 ppm (-CH2-C6H5, 2H) ; 7,25 ppm (-C6H5, 5H) ; 7,6 ppm (-N3- C(CH2)=CH-, 1H) ; 8,2 ppm (-NH-CH-CO- , 1 H).
Exemple 2 : préparation d'un copolvmère dibloc dextrane-b/oc- polvf L-qlutamate de γ-benzyle)
Préparation du dextrane possédant une fonction alcyne (dextrane alcyné)
3 g de dextrane (4,54.10"4 mol) possédant un degré de polymérisation moyen en nombre égal à 40 sont introduits dans un ballon équipé d'un réfrigérant et dissous par agitation magnétique dans un tampon acétate ajusté à pH=5 à une concentration finale de polymère de 2% en masse. La propargylamine est ajoutée en large excès (2,5g ; 4,54.10"4 mol) sous agitation. Une fois le milieu homogène, l'agent réducteur (NaBHβCN) est ajouté au milieu réactionnel en large excès (2,85g ; 4,54.10"4 mol). La solution est laissée sous vive agitation dans un bain à 500C pendant 5 jours avec un ajout quotidien d'une quantité définie d'agent réducteur (25 équivalents molaires par rapport au dextrane). Le milieu réactionnel est ensuite concentré par évaporation rotative puis dialyse contre de l'eau en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 2kDa. Le polymère est enfin récupéré par lyophilisation. La masse de polymère obtenue est 2,24 g, soit un rendement massique de 74%. Analyse 1H RMN (DMSO d6) : 3,17 ppm (C(A)H); 3,2ppm(C(2)H) ; 3,42ppm (C(3)H) ; 3,5 et 3,75 ppm (C(6)W, 2H); 3,62ppm (C(5)H) ; 4,5 ppm (C(2)OH); 4,65 ppm (C(I)H) ; 4,85 ppm (C(3)OH) ; 4,95 ppm (C(4)OH).
Préparation du copolymère dextrane-bloc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) Deux équivalents de dextrane alcyné (0,4 g ; 6,06.105 mol) et un équivalent de PBLG-azoture (0,147 g ; 3,03.105 mol) sont solubilisés dans 25mL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 12,6 μl_ de pentaméthyldiéthylènetriamine (6,06.105 mol) sont ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type schlenk contenant du CuBr (9 mg ; 6,06.105 mol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 3 jours puis dialyse contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 5OkDa. Le copolymère est alors récupéré par lyophilisation. La masse de produit récupéré est 0,302 g (rendement : 87%). Analyse 1H RMN (DMSO d6) : 1,9 ppm (-N3-CH2-CH2- CH2-, 2H); 2 et 2,15 ppm (-CH2-CH2-CH-, 2H) ; 2,45 ppm (CH2-CO-, 2H) ; 2,65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 3,1 ppm (N3-CH2-CH2-CH2, 2H); 3,15 ppm [C[A)H); 3,17 ppm (C(2)H); 3,42 (C(3)H) ; 3.5 et 3,75 ppm (C(6)H, 2H); 3,62 ppm (C(5)H) ; 4,5 ppm [C[I)OH) ; 4,65 ppm (C(I)H); 4,88 ppm (C(3)OH) ) ; 4,9-5 ppm [C[A)OH) ; 7.2 ppm (C6H5, 5H) ; 8,25 ppm (-NH-CH- CO- , 1H).
Exemple 3 : préparation d'un copolymère dibloc dextrane-b/oc- poly(ε-trifluoroacétyl-L-lvsine)
Préparation du poly(^trifluoroacétyl-L-lysine) possédant une fonction azoture (poly(e-trifluoroacétyl-L-lysine)-azoture)
2 g (7,46.10'3 mol) de N-carboxyanhydride de ε-trifluoroacétyl-L-lysine sont introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk préalablement flammé sous vide, et dissous dans 21 mL de DMF anhydre. La solution est agitée 10 min et 9 μL de 1-azido-3-aminopropane (94 μmol) sont ajoutés au moyen d'une seringue purgée à l'azote. La solution est agitée 40 h sous vide à température ambiante. Le polymère est récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique puis séché sous vide. La masse de produit récupéré est 1 ,5 g (rendement : 75%). L'analyse par spectroscopie RMN du proton fournit un degré de polymérisation moyen en nombre de 64.
Analyse 1H RMN (DMSO d6) : 1 ,1-2 ppm (-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H); 3,12 ppm (CO-NH-CH2-, 2H); 3,8ppm ( CO-CH-NH, 1 H) ; 8,2 ppm (-Λ/H-CH- CO- , 1 H) ; 9,3 (CF3-CO-Λ/H-, 1 H)
Préparation du copolymère dextrane-bloc-poly(ε-trifluoroacétyl-L-lysine)
Deux équivalents de dextrane alcyné (0,4 g ; 6,06.105 mol) et un équivalent de poly(ε-trifluoroacétyl-L-lysine)-azoture (0,271 g ; 3,03 10"5 mol) sont solubilisés dans 3OmL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 12,6 μL de pentaméthyldiéthylènetriamine (6,06.105 mol) sont ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type schlenk contenant du CuBr (9 mg ; 6,06.105 mol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 3 jours puis dialyse contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 5OkDa. La masse de produit récupéré après lyophilisation est 0,320 g (rendement : 67%). Analyse 1H RMN (DMSO d6) : 1 ,1-2 ppm (-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H); 3,12 ppm (CO-NH-CH2-, 2H) ; 3,15 ppm (C(A)H); 3,17 ppm (C(2)H); 3,42 (C(3)H) ; 3,5 et 3,72 ppm (C(6)H, 2H) ; 3,62 ppm (C(5)H) ; 3,8ppm (CO-CH-NH, 1 H) ; 4,5 ppm (C(2)OH) ; 4,65 ppm (C(I )H); 4,88 ppm (C(3)OH) ) ; 4,9-5ppm (C(A)OH) ; 8,2 ppm (-NH- CH-CO-, 1 H) ; 9,3 (CF3-CO-NH-, 1 H).
Exemple 4 : préparation de vésicules micellaires à base de copolvmère acide hvaluronique-b/oc-polv(L-qlutamate de γ-benzyle) Le copolymère acide hyaluronique-/5/oc-poly(L-glutamate de γ- benzyle) de l'exemple 1 est dissous dans le DMSO à 55°C à une concentration de 5 mg/mL et injecté au moyen d'un pousse seringue à 18mL/h dans un volume de tampon Tris (10 mM, pH=7,4 ; [NaCI] = 145 mM) jusqu'à atteindre une concentration finale en copolymère de 1mg/ml_. Le solvant organique est éliminé par dialyse contre un tampon tris (10 mM, pH=7,4 ; [NaCI] = 145 mM) en utilisant une membrane de dialyse (6 Spectra/Por®) possédant un seuil de coupure en masse molaire de 2kDa. Une solution de vésicules est ainsi obtenue et caractérisée par diffusion dynamique et statique de la lumière, diffusion de neutrons aux petits angles et microscopie électronique en transmission.
On obtient ainsi des vésicules polymères de 200nm de rayon avec une faible distribution en taille, et possédant une épaisseur de membrane d'environ 9nm.
La figure 2 représente la distribution en taille des vésicules (rayon hydrodynamique) obtenue par diffusion de la lumière. La figure 3 représente une image de microscopie électronique en transmission obtenue sur ces mêmes vésicules.
Exemple 5 : préparation de vésicules micellaires à base de copolymère dibloc dextrane-fr/oc-polv(L-glutamate de γ-benzyle)
Le copolymère dextrane-b/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 2 est dissous dans 1mL de DMSO à une concentration de 0,5mg/mL, puis 9mL d'eau milliQ sont ajoutés progressivement à l'aide d'un pousse seringue à 18mL/h sous agitation. Le DMSO est ensuite éliminé par dialyse contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 2kDa. Les vésicules alors formées sont analysées par diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique à transmission.
On obtient ainsi des vésicules polymères de 40 nm de rayon avec une faible distribution en taille.
La figure 4 représente la distribution en taille des vésicules (rayon hydrodynamique) obtenue par diffusion de la lumière. La figure 5 représente une image de microscopie électronique en transmission obtenue sur ces mêmes vésicules. Exemple 6 : encapsulation d'un principe actif dans une vésicule micellaire
La doxorubicine et le docetaxel ont été encapsulés dans des vésicules micellaires à base du copolymère acide hyaluronique-b/oc-poly(L- glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 1 par nanopréciptation.
Le principe actif a été dissous dans du DMSO ou du tampon Tris dans des rapports massiques principe actif : copolymère de 0,1 :1, 0,2 :1 et 0,3 :1. Le copolymère à blocs est solubilisé dans la phase organique de DMSO à 55°C. Cette solution est ajoutée à la solution aqueuse (tampon Tris pH = 7,4) sous agitation continue à 55°C, ou inversement. Le principe actif libre et le DMSO ont été éliminés par dialyse (seuil de coupure en masse molaire de 2kDa) contre du tampon Tris.
La quantité de doxorubicine encapsulée (dans la partie hydrophobe ou hydrophile des vésicules) et l'efficacité d'encapsulation ont été déterminées en brisant les vésicules chargées dans un mélange DMSO :Tris (80 :20). Après centrifugation pendant 1 h, l'échantillon a été filtré et mesuré par spectroscopie UV à 485 nm. La quantification a été effectuée à partir de la courbe de calibration de la doxorubicine dans le mélange DMSO :Tris (80 :20). La quantité de docetaxel encapsulé et l'efficacité d'encapsulation ont été déterminées à partir de la reconstitution d'un extrait sec de vésicule contenant du docetaxel dans de l'éthanol. Ensuite, l'échantillon filtré a été mesuré par spectroscopie UV à 230 nm. La quantification a été effectuée à partir de la courbe de calibration de la doxorubicine dans l'éthanol.
Quantité encapsulée = (masse de principe actif dans la vésicule chargée/masse de vésicule) x100
Efficacité d'encapsulation = (masse de principe actif dans la vésicule chargée/masse initiale de principe actif) x100
Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1
Les résultats montrent des taux d'encapsulations élevés de l'ordre de 10% et une efficacité d'encapsulation aux alentours de 50%.
Exemple 7 : libération d'un principe actif encapsulé dans une vésicule micellaire
La quantité voulue (par exemple, un volume de 4mL à une concentration de 1mg/mL) de vésicules chargées en doxorubicine et docetaxel est versée dans un tube de dialyse (Spectra/Por ® Float-A-Lyzer ®, Dialysis
Tubes, seuil de coupure en masse molaire de 25kDa, diamètre 10mm, volume
1OmL). Le tube de dialyse est introduit verticalement dans un cylindre de mesure de 50 mL. Le système est maintenu à 37°C+2 et couvert de parafilm pour éviter l'évaporation. Afin de maintenir les conditions osmotiques requises,
2 mL ont été prélevés à l'extérieur du tube de dialyse pour chaque temps d'échantillonnage et remplacés par le même volume de tampon Tris.
Dans le cas de la doxorubicine, l'échantillonnage est réalisé dans le tube de dialyse, puis réinséré tel quel après analyse. Pour le docetaxel, l'échantillonnage est réalisé à l'extérieur du tube de dialyse. Le milieu de dialyse contenait 50 mL de tampon Tris (pH 7,4) avec 2% v/v d'éthanol pour augmenter la solubilité du docetaxel libéré et éviter l'agrégation du docetaxel libre.
La quantification est effectuée par la courbe de calibration des principes actifs libres dans leurs solvants respectifs. Les profils de libération exprimés en pourcentage de relargage cumulé en fonction du temps (en seconde 1/2) sont représentés sur les figures 6 (doxorubicine) et 7 (docetaxel).
Le principe actif libre est représenté par symbole -o- (rond vide) et la libération du principe actif encapsulé est représentée par le symbole -•- (rond plein).
Les résultats montrent clairement que la libération de ces deux principes actifs peut être contrôlée sur plusieurs jours avec une cinétique beaucoup plus lente que celle du principe actif libre. La libération semble suivre un modèle de diffusion homogène.
Exemple 8 : libération et toxicité in vitro d'un principe actif encapsulé dans une vésicule micellaire
Les expériences de toxicité et de libération in vitro ont été réalisées à partir des vésicules à base de copolymère dibloc acide hyaluronique-/3/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) préparées dans l'exemple 6, contenant 11 % de doxorubicine.
Les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules du gliome C6 du rat, dans un milieu de culture Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) contenant 5% de sérum de veau foetal. Les cellules C6 (5.105 cellules) sont placées dans des falcons de 10cm de diamètre et croissent dans 10ml du milieu de culture contenant de la pénicilline (10000 μg/mL), de la streptomycine (10000 μg/mL) et de l'amphotéricine B (25 μg/mL) [Invitrogen Corporation] dans un incubateur à 370C dans une atmosphère contrôlée à 5% CO2. Pour les tests de viabilité (ou toxicité) cellulaire, les cellules C6 ont été incubées dans une plaque de 24 puits (15.104 cellules par puits), pendant 24h. La viabilité a été déterminée par un test classique au sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium). Le tétrazolium qu'il contient est réduit en fomnazan par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives. La couleur du milieu passe alors du jaune au bleu-violacé. L'intensité de cette coloration est proportionnelle au nombre de cellules vivantes présentes lors du test. L'analyse est réalisée par spectrophotométrie (U-2800A, HITACHI) en mesurant l'absorbance à 570nm. Les mesures sont normées par une expérience de contrôle, pour lequel le test MTT est réalisé sans cellules. On détermine ainsi la valeur d'IC50 pour un temps de 48h, correspondant à la concentration pour laquelle la moitié des cellules restent viables.
Pour la doxorubicine libre, on obtient une valeur de 0,84 μM.
Pour les vésicules encapsulant la doxorubicine, une valeur 10 fois supérieure (IC50=8,4 μM) est obtenue. La vésicule seule (sans doxorubicine) n'a présentée aucune toxicité dans les conditions expérimentales (concentration jusqu'à 200 μM, temps jusqu'à 72h).
Exemple 9 : étude de l'internalisation cellulaire des vésicules micellaires contenant un principe actif
Le suivi de l'intemalisation cellulaire a été réalisé in vitro par microscopie de fluorescence. Pour cela, les cellules C6 ont été incubées (15.104 cellules) dans une plaque de 4 puits de 16mm. Les vésicules contenant la doxorubicine à la concentration de 4,54 μM ont été incubées à des temps de 3h, 6h et 24h à 37°C dans une atmosphère contrôlée à 5% CO2. Pour chaque temps d'observation, les cellules sont lavées 2 fois avec un tampon PBS, fixées sur un couvre-lame de microscope avec 4% de paraformaldéhyde (PF4) en tampon PBS, laissées dans le noir à température ambiante pendant 30min, puis lavées une fois au tampon PBS et une fois à l'eau pure. L'observation microscopique est réalisée avec un microscope de fluorescence Zeiss (grossissement x 63 ; λexCitation = 546nm et λémissioπ = 590nm). Le suivi en microscopie de fluorescence in vitro sur les cellules C6 après 24h d'incubation en présence des vésicules contenant la doxorubicine est représenté sur la figure 8. Les vésicules contenant la doxorubicine sont internalisées par endocytose. Après 24h d'incubation, on observe une forte accumulation dans les endosomes provenant de l'internalisation des vésicules contenant la doxorubicine. Les cellules montrent des excroissances importantes, qui sont caractéristiques de cette internalisation. Exemple 10 : essai d'irritation cutanée chez le lapin
On a utilisé une dispersion à 1 % (p/v) de copolymère dibloc acide hyaluiOnique-fc/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 1.
Cette dispersion a été appliquée à une dose de O1SmL1 sous pansement semi-occlusif, pendant 4h sur une zone de peau saine chez 3 lapins.
Le protocole expérimental est celui de la Directive OCDE n° 404 du 24 avril 2002 et de la méthode d'essai B.4 de la Directive EC 440/2008.
Aucune réaction cutanée (érythème ou œdème) n'a été observée sur la zone traitée, quel que soit le temps de l'examen (24h, 48h et 72h après l'enlèvement du pansement).
Exemple 11 : Etude du potentiel d'irritation cutanée chez la souris
On a utilisé une dispersion à 1 % (p/v) de copolymère dibloc acide hyaluronique-6/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 1.
La dispersion de copolymère a été appliquée sur la surface dorsale de l'oreille d'une lignée de souris femelles.
3 groupes de 4 animaux chacun ont été traités pendant trois jours consécutifs (J1 , J2, J3) avec 50 μl (25 μl par oreille) de dispersion de test non diluée (100%), d'une part, et de dispersion de test diluée dans du diméthyl formamide (DMF) à des concentrations de 25% et de 50% (v/v). Un groupe supplémentaire de 4 animaux a été traité avec du DMF.
Au 6eme jour, la prolifération des lymphocytes dans les ganglions lymphatiques drainants de l'oreille a été déterminée par comptage cellulaire. Le protocole expérimental a été établi conformément à la Directive
OCDE n° 429 du 24 avril 2002 et à la méthode d'essai B. 42 de la Directive EC 440/2008.
Les résultats ont montré que : a) aucune mortalité ou signe de toxicité systémique n'ont été observés chez les animaux testés et les animaux témoins ; b) aucune réaction cutanée n'a été observée à des concentrations de 25%, 50% et 100%. Les résultats montrent que la dispersion de copolymère selon l'invention est non irritante aux trois concentrations testées.
Exemple 12 : Evaluation de la dose maximale tolérée par voie intraveineuse chez la souris
On a utilisé une dispersion à 1 % (p/v) de copolymère dibloc acide hyaluronique-b/oc-poly(L-glutamate de γ-benzyle) de l'exemple 1.
La dispersion de copolymère a été administrée par voie intraveineuse chez un mâle et une femelle souris Swiss à un volume d'administration de 10 mL/kg. Considérant la densité de la formulation, cette administration correspond à une dose de 10 g/kg.
Aucune mortalité n'a été observée durant les 14 jours de l'étude. L'examen macroscopique des animaux à la fin du traitement n'a montré aucune modification liée au traitement. Les résultats montrent que la dose maximale tolérée (en anglais
« maximal tolerated dose » ou MTD) de la dispersion de copolymère selon l'invention par voie intraveineuse est supérieure à 10 g/kg chez la souris.
Exemple 13 : Etude du ciblage des récepteurs CD 44 lié à l'acide hvaluronique par inhibition compétitive en présence d'acide hvaluronique libre
On a utilisé la lignée cellulaire humaine MCF-7 qui exprime de manière significative les récepteurs CD 44.
Pour confirmer l'internalisation cellulaire de la doxorubicine encapsulée par endocytose via les récepteurs spécifiques de l'acide hyaluronique, un essai d'inhibition compétitive a été réalisé en ajoutant préalablement de l'acide hyaluronique libre dans le milieu d'incubation de manière à bloquer dans une certaine mesure les récepteurs de l'acide hyaluronique à la surface des cellules.
Les cellules (0,1.1O6) ont été incubées pendant 1h à 37°C avec de la doxorubicine pure ou de la doxorubicine encapsulée dans les vésicules micellaires de l'exemple 6 (concentration en doxorubicine = 10μM) dans des boîtes de 40mm de diamètre dans un milieu dépourvu de sérum, en présence ou en absence d'acide hyaluronique libre (PM=5000g/mol), à une concentration de 2mg/ml_.
Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec un tampon PBS et collectées par centrifugation (1000 rpm pendant 10min). Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans 300μL de tampon PBS avant la mesure.
Les échantillons ont été collectés sur un cytomètre à flux FACS Calibur (Beckton Dickinson) et analysés en utilisant le logiciel CeII Quest fourni par le fabricant. Pour chaque analyse, au moins 10 000 cellules ont été comptées.
On observe que la présence d'acide hyaluronique libre diminue significativement l'intensité de fluorescence moyenne (IFM) de la doxorubicine libre.
La figure 9 représente l'intensité de fluorescence relative mesurée en unité arbitraire (UA) dans les cellules MCF-7 mesurée après l'incubation en présence de doxorubicine encapsulée (colonne en noir), de doxorubicine libre
(colonne en gris) et sans doxorubicine (colonne hachurée), en présence ou en absence d'acide hyaluronique libre.
Les résultats montrent que, pour la doxorubicine libre, l'incubation en présence d'acide hyaluronique libre n'a pas ou peu d'effet sur l'internalisation (pas de diminution significative de l'intensité de fluorescence moyenne).
Ceci s'explique par le fait que la doxorubicine libre diffuse librement dans les cellules, l'internalisation n'étant pas liée à la médiation des récepteurs CD 44.
En revanche, l'intensité de fluorescence en présence d'acide hyaluronique libre, diminue significativement pour la doxorubicine encapsulée.
Ces résultats montrent le rôle des récepteurs d'acide hyaluronique dans Pendocytose des vésicules micellaires à base d'acide hyaluronique selon l'invention permettant la délivrance intracellulaire de la doxorubicine. Exemple 14 : Evaluation in vivo de l'efficacité anti-tumorale de la doxorubicine encapsulée.
1/ Protocole expérimental Des femelles de rat Sprague-Dawley âgées de 8 semaines (120-
140g) ont été utilisées dans une étude de régression tumorale.
Du 7,12-diméthylbenz[α]anthracène (DMBA) a été administré par voie orale (dans de l'huile de soja) aux animaux en 3 doses de 45mg/kg à intervalle d'une semaine, pour générer la tumeur. Le traitement par la doxorubicine a été donné 10 semaines après la dernière dose de DMBA. La largeur de la tumeur (L) et sa longueur (I) ont été enregistrées avec un pied à coulisse et la taille de la tumeur a été calculée par la formule (L x I212).
Après 10 semaines d'induction de tumeur, les animaux porteurs de tumeurs ont été séparés et divisés de manière aléatoire en différents groupes de traitement, puis traités avec une dose unique de 250μl par voie intraveineuse de doxorubicine à 5mg/kg, soit sous forme de doxorubicine libre, soit sous forme de doxorubicine encapsulée dans les vésicules micellaires de l'exemple 6 . Le groupe témoin a reçu une dose unique de 250μl de tampon
PBS (pH 7,4) par voie intraveineuse.
L'étude a été terminée 30 jours après le traitement. L'observation de la survie des animaux porteurs de tumeur ayant été traités a été poursuivie jusqu'à 60 jours après le traitement.
2/ Activité anti-tumorale de la doxorubicine encapsulée
La figure 10 rapporte la variation de volume de la tumeur en fonction du temps, suite au traitement par la doxorubicine libre (courbe représentée par le symbole -V-), la doxorubicine encapsulée (courbe représentée par le symbole -D-) ou le PBS (courbe représentée par le symbole -•-). Les résultats montrent que la doxorubicine libre et la doxorubicine encapsulée inhibent significativement la croissance de la tumeur en comparaison du groupe témoin traité au PBS. Cependant, la doxorubicine encapsulée provoque une suppression tumorale nettement supérieure à la doxorubicine libre.
En effet, après 15 jours de traitement, on observe que la tumeur continue à régresser avec la doxorubicine encapsulée, alors que la régression atteint un palier avec la doxorubicine libre.
Sur la courbe de survie de Kaplan-Meier rapportée sur la Figure 11 , dont chaque point représente la moyenne ± erreur type de la moyenne (n=6), on a représenté le temps de survie des animaux après le début du traitement, pour les animaux ayant reçu par administration intraveineuse la doxorubicine encapsulée (droite continue), de la doxorubicine libre (droite en tirets) et le groupe témoin (droite en pointillés). Les résultats montrent l'absence de mortalité à 60 jours pour les animaux traités par la doxorubicine encapsulée.
3/ Cardiotoxicité
Un des principaux effets secondaires bien connus de la doxorubicine est sa cardiotoxicité. Celle-ci peut être évaluée par la mesure de la production d'enzymes spécifiques, principalement la lactate déshydrogénase et la créatine kinase.
La mesure du taux sérique de lactate déshydrogénase et de créatine kinase des différents groupes d'animaux de l'expérimentation ci-dessus montre que l'induction de lactate déshydrogénase et de créatine kinase est inférieure chez les animaux traités par de la doxorubicine encapsulée en comparaison de ceux traités par la doxorubicine libre, comme rapporté sur les Figures 12A (créatine kinase) et 12B (lactate déshydrogénase).
Les résultats montrent que la doxorubicine encapsulée induit un faible niveau de lactate déshydrogénase et de créatine kinase ce qui implique une diminution de la cardiotoxicité de la doxorubicine encapsulée dans les vésicules micellaires selon l'invention. Cette baisse de la cardiotoxicité est en accord avec la réduction significative des effets secondaires et de la mortalité qui a été observée en utilisant la doxorubicine encapsulée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide constitué d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques comprenant de 5 à 100 unités et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques comprenant de 5 à 100 unités.
2. Copolymère selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend de 10 à 100, de préférence de 10 à 50 unités saccharidiques et de 10 à 100, de préférence de10 à 50 unités peptidiques.
3. Copolymère selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit polysaccharide est choisi parmi le dextrane , la chitine, le chitosane, l'acide hyaluronique, le pullulane, le fucane, le fucane sulfaté, le succinoglycane, le galactane, l'arabinogalactane, le galactane sulfaté, les alginates, le glucane, l'acide polysialique, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroitine sulfate, l'acharane sulfate, le kératane sulfate, le dermatane sulfate, le xanthane, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, la cellulose, l'agarose, le mannane, les galactomannanes, le curdlane, l'arabinane, les carraghénanes ,Ie schizophyllane et leurs dérivés.
4. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polypeptide, dans lequel l'acide aminé qui le constitue peut être sous forme optiquement active L ou D ou sous forme racémique DL1 est choisi parmi la poly(alanine), la poly(arginine), la poly(asparagine), le poly(acide aspartique), le poly(aspartate), la poly(cystéine), le poly(acide glutamique), le poly(glutamate), la poly(glutamine), la poly(glycine), la poly(histidine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(lysine), la poly(méthionine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la poly(pyrrolysine), la poly(sélénocystéine), la poly(sérine), la poly(thréonine), le poly(tryptophane), la poly(tyrosine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle), la poly(trifluoroacétyl-Lysine), la poly(sarcosine) la poly(hydroxyéthyl- asparagine), la poly(hydroxyalkyl-asparagine), la poly(hydroxyalkyl- aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) et leurs dérivés.
5. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi le dextrane, l'acide hyaluronique et leurs dérivés.
6. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit polysaccharide est hydrophile et ledit polypeptide est hydrophobe en conditions physiologiques.
7. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit polysaccharide est hydrophobe et ledit polypeptide est hydrophile en conditions physiologiques.
8. Copolymère selon la revendication 6 caractérisé en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-glutamate de γ-benzyle) et la poly(ε-trifluoroacétyl-L- lysine).
9. Copolymère selon la revendication 7 caractérisé en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-acide glutamique) et la poly(L-lysine).
10. Procédé de préparation d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc- polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à :
- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, - introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polypeptidique, et - coupler la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique dans un solvant commun.
11. Procédé de préparation d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc- polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à :
- introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polypeptidique, - soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, et - coupler la chaîne polypeptidique et la chaîne polysaccharidique dans un solvant commun.
12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que l'introduction de la fonction azoture ou alcyne est effectuée à l'aide d'un agent bifonctionnel.
13. Vésicule micellaire formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-jb/oc-polypeptide constitué d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques.
14. Vésicule micellaire selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit copolymère comprend de 5 à 100, de préférence de 10 à 50 unités saccharidiques, et de 5 à 100, de préférence de 10 à 50 unités peptidiques.
15. Vésicule micellaire selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est choisi parmi le dextrane , la chitine, le chitosane, l'acide hyaluronique, le pullulane, le fucane, le fucane sulfaté, le succinoglycane, le galactane, l'arabinogalactane, le galactane sulfaté, les alginates, le glucane, l'acide polysialique, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroitine sulfate, l'acharane sulfate, le kératane sulfate, le dermatane sulfate, le xanthane, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, la cellulose, l'agarose, le mannane, les galactomannanes, le curdlane, l'arabinane, les carraghénanes ,Ie schizophyllane et leurs dérivés.
16. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que le polypeptide, dans lequel l'acide aminé qui le constitue peut être sous forme optiquement active L ou D ou sous forme racémique DL, est choisi parmi la poly(alanine), la poly(arginine), la poly(asparagine), le poly(acide aspartique), le poly(aspartate), la poly(cystéine), le poly(acide glutamique), le poly(glutamate), la poly(glutamine), la poly(glycine), la poly(histidine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(lysine), la poly(méthionine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la poly(pyrrolysine), la poly(sélénocystéine), la poly(sérine), la poly(thréonine), le poly(tryptophane), la poly(tyrosine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle), la poly(trifluoroacétyl-Lysine), la poly(sarcosine) la poly(hydroxyéthyl- asparagine), la poly(hydroxyalkyl-asparagine), la poly(hydroxyalkyl- aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) et leurs dérivés.
17. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi le dextrane, l'acide hyaluronique et leurs dérivés.
18. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est hydrophile et ledit polypeptide est hydrophobe en conditions physiologiques.
19. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est hydrophobe et ledit polypeptide est hydrophile en conditions physiologiques.
20. Vésicule micellaire selon la revendication 18, caractérisée en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-glutamate de γ-benzyle) et la poly(ε- trifluoroacétyl-L-lysine).
21. Vésicule micellaire selon la revendication 19, caractérisée en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-acide glutamique) et la poly(L-lysine).
22. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 21 , caractérisée en ce qu'elle contient au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique.
23. Vésicule micellaire selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide dans lequel le polysaccharide ou le polypeptide présente une affinité pour au moins un récepteur cellulaire.
24. Vésicule micellaire selon la revendication 23, caractérisée en ce que ledit polysaccharide ou ledit polypeptide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose contrôlée.
25. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, jn vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées.
26. Vésicule micellaire selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est choisie parmi un principe actif de médicament, un peptide, une protéine, une hormone, une enzyme, un acide nucléique, un oligonucléotide, un antigène, un anticorps, un interféron, un facteur de croissance, un modulateur d'activité enzymatique, un activateur ou un inhibiteur de récepteur cellulaire et une vitamine.
27. Utilisation d'une vésicule micellaire formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-fc/oc-polypeptide selon l'une quelconque des revendications 13 à 26 pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation et/ou le ciblage d'au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique.
28. Utilisation selon la revendication 27, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est utilisée dans le domaine pharmaceutique ou médical.
29. Utilisation selon la revendication 27, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est utilisée dans au moins un domaine choisi parmi l'imagerie médicale, la cosmétique, l'hygiène, le nettoyage et la détergence, la phytopharmacie, l'agroalimentaire et la chimie organique ou dans tout domaine d'activité dans lequel on souhaite encapsuler une molécule dans une vésicule micellaire .
30. Composition pharmaceutique comprenant une vésicule micellaire selon la revendication 22 et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
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