ES2691872T3 - Aminofucoidan como un vector para la fibrinolisis en enfermedades trombóticas - Google Patents

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Didier Letourneur
Frédéric CHAUBET
Benoît HO-TIN-NOE
Murielle MAIRE
Jean-Baptiste Michel
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Abstract

Un vector que tiene propiedad de unión a t-PA que consiste en un resto fucoidan, que está aminado por un enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y un grupo químico que comprende uno o más grupos amino.

Description

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DESCRIPCION
Aminofucoidan como un vector para la fibrinolisis en enfermedades tromboticas CAMPO DE LA INVENCION
La invencion se refiere a sistemas mejorados y estrategias moleculares para la prevencion y el tratamiento de enfermedades tromboticas vasculares agudas.
Mas particularmente, la invencion se refiere a fibrinolisis inducida por el activador del plasminogeno tisular recombinante por via intravenosa utilizando vectorizacion del activador del plasminogeno tisular (tambien denominado aqui como t-PA) a trombo por una molecula bipolar quimerica que incluye un resto que contiene amina que se une al activador del plasminogeno del tejido, y un resto fucoidan que se une al trombo y realiza un sistema de vector capaz tanto de proteger el t-PA inyectado por via intravenosa durante su transporte al plasma como de vectorizarlo al trombo intravascular.
Por lo tanto, de acuerdo con uno de sus aspectos, la invencion se refiere a un vector que tiene propiedad de union a t-PA que consiste en un resto fucoidan, que esta aminado por un enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y un grupo quimico que comprende uno o mas grupos amino.
De acuerdo con otro de sus aspectos, la invencion se refiere a un t-PA vectorizado y/o a composiciones farmaceuticas que lo comprenden, asi como a metodos para preparar dicho t-PA vectorizado al trombo o composiciones farmaceuticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La hemostasia se puede definir como un sistema homeostatico esencial que conduce a la formacion de un coagulo hemostatico. La hemostasia debe ajustarse con precision con el fin de evitar el riesgo de sangrado, o hemorragia, y la aparicion de coagulos de sangre obstructivos patologicos, a lo que se alude tambien en esta memoria como trombosis. Los eventos tromboticos agudos siguen siendo la principal causa de mortalidad y morbilidad en los paises occidentales.
La formacion de un coagulo resulta de la activacion coordinada de la cascada de coagulacion y de las plaquetas. Este es un proceso amplificado con plaquetas activantes que soporta el ensamblaje de complejos enzimaticos de coagulacion y la enzima final de la coagulacion, siendo la trombina un potente activador de plaquetas. El producto final esta compuesto de agregados de plaquetas que expresan sitios especificos en su superficie y de fibras de fibrina polimerizadas. El papel respectivo de la coagulacion y las plaquetas puede variar de acuerdo con el lecho vascular y las condiciones reologicas, siendo las plaquetas y la fibrina mas predominantes en los trombos arteriales y venosos, respectivamente.
Para una mejor comprension de la coagulacion como un proceso dinamico, el experto en la tecnica tambien puede consultar informacion complementaria de Kottke-Marchant & Lefkowitz (KOTTKE-MaRCHANT & LEFKOWITZ, 2008, Capitulo 1 - Coagulation Pathway and Physiology. An Algorithmic Approach to Hemostasis Testing).
Cuando se forma un coagulo hemostatico, se tienen que considerar mecanismos biologicos adicionales que provocan la reabsorcion secundaria del coagulo, permitiendo la reparacion del tejido (cicatrizacion). Esos mecanismos secundarios pueden denominarse comunmente sistema de eliminacion de coagulos, o «fibrinolisis».
Se ha de considerar que un coagulo esta en equilibrio permanente entre la construccion y la destruccion. Cuando se forma un coagulo trombotico en una arteria o vena, la reabsorcion espontanea del coagulo se retrasa demasiado como para que sea eficaz para proteger el tejido aguas abajo de una isquemia irreversible. Por lo tanto, actualmente se utilizan dos estrategias para tratar la trombosis: (i) limitar la formacion incremental del coagulo por farmacos antiplaquetarios y anticoagulantes y (ii) mejorar la destruccion del coagulo mediante la induccion de fibrinolisis.
La invencion se refiere a esta segunda estrategia.
La via fibrinolitica se compone de activadores e inhibidores. Asi, un «activador» de la via fibrinolitica puede tener la capacidad de provocar la lisis de la fibrina, mientras que un «inhibidor» de la via fibrinolitica puede tener el efecto opuesto.
Durante su formacion, el coagulo expone los elementos requeridos para su reabsorcion: la fibrina expone los sitios de union para el zimogeno plasminogeno circulante y su activador, el activador del plasminogeno de tipo tisular (t- PA). La formacion de un complejo ternario en el que se asocian la fibrina, el plasminogeno y el t-PA garantiza la eficacia de la fibrinolisis y evita su extension al torrente sanguineo (fibrinogenolisis). El plasminogeno unido a fibrina
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se escinde en Arg-561-Val562 por su activador t-PA, generando el enlace disulfuro que une la plasmina de proteasa de dos cadenas.
Es bien conocido que el t-PA y la plasmina se unen a residuos cationicos, principalmente grupos amina (NH2) de residuos de lisina expresados en la red de fibrina (Lijnen et al, 2001, Elements of the fibrinolytic system. Ann N Y Acad Sci, 936, 226-236).
Ademas, el plasminogeno se une con una alta afinidad a lisinas (Lys) carboxi terminales. La escision de la fibrina por parte de la plasmina expone una nueva Lys carboxi-terminal, lo que conduce a mas sitios de union al plasminogeno y a mas plasmina formada (proceso de amplificacion). En contraposicion, TAFI (siglas inglesas de inhibidor de fibrinolisis activable por trombina), una carboxipeptidasa, separa la Lys carboxi terminal, evitando la union del plasminogeno e inhibiendo la fibrinolisis. El t-PA tambien se une a la cadena lateral de la amina libre.
Mimeticos de lisina tales como el acido □-aminocaproico o el acido tranexamico (Royston, 1995, Blood-sparing drugs: Aprotinin, tranexamic acid and epsilon-aminocaproic acid, Int Anesthesiol Clin) desplazan el plasminogeno de los residuos lisina C-terminales, limitando asi la fibrinolisis. Por otro lado, el t-PA unido a amina esta protegido de la inhibicion por las serpinas, principalmente el inhibidor del activador del plasminogeno (PAI-1), tambien conocido como inhibidor del activador del plasminogeno endotelial o como serpina E1.
El tratamiento no intervencionista agudo sigue siendo principalmente la inyeccion intravenosa de activador del plasminogeno tisular recombinante, tambien denominado en esta memoria rt-PA (Alteplase, Actilyse® o Tenecteplase, Metalyse®, Boehringer Ingelheim). Por ejemplo, las directrices internacionales recomiendan la inyeccion IV mas temprana de t-PA recombinante en la apoplejia aguda (grupo IST et al, 2012, The benefits and harms of intravenous thrombolysis with recombinant tissue plasminogen activator within 6 h of acute ischaemic stroke (the third international stroke trial [ist-3]): A randomised controlled trial, Lancet). Pero la eficacia de la inyeccion periferica de t-PA recombinante se limita al 10% debido a:
- la dilucion del compuesto potente en la sangre entera,
- la inhibicion de t-PA recombinante por quelantes circulantes tales como PAI-1 durante su trafico en plasma,
- el bajo nivel inicial de union de rt-PA al trombo.
- el mayor riesgo de hemorragia por altas dosis e inyeccion retrasada.
Ademas, aunque los efectos tromboliticos del t-PA son beneficiosos, su neurotoxicidad, en los intervalos de dosis alta requeridos que se usan actualmente, es problematica.
Para proteger provisionalmente el rt-PA de los inhibidores del plasma, se condiciona en presencia de Arg (formulacion Alteplase). El efecto protector de los residuos amina tambien se ha explotado con el uso de anexina 2 como una chaperona. De hecho, la co-localizacion de plasminogeno y t-PA en la superficie de la celula permite que las celulas desempenen un papel regulador en la fibrinolisis. El complejo anexina2-S100A10 proporciona una plataforma de este tipo para la activacion del plasminogeno gracias a la presentacion de una Lys C-terminal en la orientacion tridimensional correcta para el reconocimiento de t-PA y plasminogeno (Madureira et al, 2011 The role of the annexin A2 heterotetramer in vascular fibrinolysis, Blood). En este contexto, la anexina A2 se ha propuesto con exito como una chaperona para la inyeccion IV de t-PA (Zhu et al., 2010, Annexin 2 combined with low-dose t-PA improves thrombolytic therapy in a rat model of focal embolic stroke, J Cereb Blood Flow Metab). Las limitaciones de esta estrategia son la ausencia de vectorizacion de t-PA y el hecho de que la anexina A2 es una proteina recombinante muy costosa de producir.
Existe una necesidad general de tratamientos mejorados relacionados con enfermedades tromboticas vasculares agudas. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de nuevas formas de t-PA o compuestos activos derivados de t- PA mas terapeuticamente efectivos en cantidades de t-PA mas bajas que las administradas actualmente, con el fin de al menos moderar los efectos secundarios toxicos de este ingrediente activo.
Por lo tanto, la proteccion del t-PA durante su circulacion en el plasma y su eficiente vectorizacion al trombo representan un desafio importante.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a un compuesto que tiene la capacidad de unirse tanto a t-PA como al trombo y que es capaz de vectorizar el t-PA terapeutico en su diana biologica.
Esta invencion concierne a un compuesto de vector de este tipo, que comprende un resto fucoidan que fija como objetivo el trombo unido covalentemente a un grupo que contiene amina con propiedades de union a t-PA y de proteccion de t-PA.
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La propiedad de union al trombo del resto fucoidan se utiliza para fijar como objetivo el compuesto terapeutico al coagulo.
Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un vector que tiene una propiedad de union a t-PA que consiste en un resto fucoidan, que esta aminado por un enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y un grupo quimico que comprende uno o mas grupos amino (-NH2), tales como grupos amina primaria o grupos guanidina.
En determinadas realizaciones, dicho vector es un compuesto de formula (I):
FUCO-C1 -[NH]y-[L]z-[NH]x-R1 (I),
en donde
- "FUCO" significa un resto fucoidan, que opcionalmente contiene uno o mas grupos amina primaria enlazados covalentemente a la cadena de fucoidan,
- x, y y z son numeros enteros independientes que significan 0 o 1,
- C1 es el atomo de carbono en la posicion 1 de la unidad de sacarido ubicada en el extremo reductor del resto fucoidan,
- L es un enlazador, y
- R1 es un grupo quimico que comprende uno o mas grupos amino, o que consiste en un grupo amino,
- L y R1 son independientes y pueden ser iguales o diferentes.
En algunas realizaciones, dicho vector es un compuesto de formula (I), en donde:
- R1 es un grupo quimico que comprende o consiste en una cadena hidrocarbonada terminada en amina primaria, lineal o ramificada; un aminoacido; un poliaminoacido; y/o un grupo quimico seleccionado en la lista que comprende, o que consiste en: lisina, polilisina, arginina, poliarginina, ornitina, poliornitina, acido Y-aminobutirico, poliaminas, polieteraminas, o cualquier otro grupo quimico que comprenda un grupo guanidina o una amina primaria,
en donde:
- dicho grupo quimico esta interrumpido opcionalmente por uno o mas anillos de hidrocarburos no aromaticos que tienen 5 o 6 atomos de carbono, y preferiblemente no mas de un anillo de hidrocarburo no aromatico que tiene 5 o 6 atomos de carbono,
- dicho grupo quimico esta interrumpido opcionalmente por uno o mas heteroatomos,
- dicho grupo quimico contiene opcionalmente uno o mas grupos amida y/o uno o mas grupos ester, en particular uno o mas grupos amida,
- dicho grupo quimico esta opcionalmente sustituido con uno o mas grupos amina,
- dicho grupo quimico esta opcionalmente interrumpido y/o sustituido con uno o mas grupos, identicos o diferentes, y seleccionados de: (a) una cadena de hidrocarburos lineal o ramificada, (b) un aminoacido o un poliaminoacido, (c) una poliamina o una polieteramina, (d) un acido Y-aminobutirico, (e) un grupo guanidina y (f) una amina primaria.
En algunas realizaciones de dicho vector, el resto fucoidan tiene un peso molecular medio que es menor que 100 000 Da, preferiblemente menor que 20 000 Da, y en particular que oscila entre 2000 Da y 15 000 Da.
Esta invencion tambien se refiere a un t-PA vectorizado que comprende complejos de un vector tal como se definio arriba con t-PA.
En algunas realizaciones, dicho t-PA vectorizado tiene una relacion molar de vector a t-PA que oscila entre 40:1 y 1:1; preferiblemente entre 20:1 y 3:1, y lo mas preferiblemente entre 15:1 y 5:1.
Esta invencion tambien concierne a un metodo para preparar un t-PA vectorizado, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un vector tal como se define arriba,
b) proporcionar t-PA, y
c) poner en contacto el vector proporcionado en la etapa a) con el t-PA proporcionado en la etapa b), con el fin de obtener complejos entre dicho vector y t-PA.
Tambien se refiere a un kit que comprende:
- un primer recipiente que comprende un vector tal como se define arriba, y
- un segundo recipiente que comprende t-PA.
La presente invencion pertenece tambien a una composicion farmaceutica que comprende complejos de un vector tal como se define arriba con t-PA, asi como a los usos terapeuticos de dicha composicion farmaceutica.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1: Lisis in vitro de un trombo rico en plaquetas por t-PA vectorizado con aminofucoidan.
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Coagulos ricos en plaquetas se incubaron con rt-PA (control, primera columna), o rt-PA complejado con aminofucoidanos (segunda, tercera y cuarta columnas) o fucoidan no aminado (columna 7) o fucoidan solo (columna 6). Se midio la lisis de fibrina y se expresa como un porcentaje en el eje y. El valor de la mediana se indica con una barra horizontal (n = 3 por condicion). Di-lys y Tri lys (segunda y tercera columnas) representan, respectivamente, di- lisina y tri-lisina. Ac-Tran (cuarta columna) representa acido tranexamico y DETA (quinta columna) representa dietilentriamina.
Figura 2: Lisis in vivo de trombos mesentericos por t-PA vectorizado en ratones.
En el momento 0, la trombosis de los vasos mesentericos se indujo por exposicion a FeCl3 y ocurrio a T = 10/15 minutos. La trombolisis fue inducida por rt-PA (control) o rtPA acoplado a aminofucoidan. La lisis se observo solo cuando fue inducida por aminofucoidan en 40 a 50 min. Los vasos expuestos mesentericos se observan tanto con luz visible (columna izquierda) como fluorescencia (columna derecha) utilizando t-PA-FITC.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Fucoidan, en referencia a un tipo de polisacarido sulfatado (polianion) derivado principalmente de algas pardas, es un imitador que se produce de forma natural de Sialyl-LewisX (Li et al, 2008, Fucoidan: Structure and bioactivity, Molecules).
Sialyl LewisX, tambien conocido como sialyl LeX y SLeX, es un hidrato de carbono tetrasacarido que se puede unir a O-glicanos o N-glicanos en la superficie de las celulas, y eso es importante para el reconocimiento celula-celula.
Es capaz de unir P-selectina plaquetaria (Bachelet, 2009, Affinity of low molecular weight fucoidan for P-selectin triggers its binding to activated human platelets, Biochim Biophys Acta) y trombo intraluminal in vivo (Rouzet et al, 2011, Radiolabeled fucoidan as a P-selectin targeting agent for in vivo imaging of platelet-rich thrombus and endothelial activation, J Nucl Med).
Ahora se demuestra que un aminofucoidan puede actuar como un agente vectorizante para el activador del plasminogeno tisular al coagulo vascular intraluminal. En particular, se demuestra que un aminofucoidan puede actuar como vector para la prevencion y/o el tratamiento de patologias asociadas con la aparicion de trombo intraluminal en un sujeto y/o en enfermedades tromboticas.
De acuerdo con la invencion, un «vector» o «agente vectorizante» se refiere a un agente biologico que comprende un fucoidan o un resto fucoidan como un vehiculo para transportar una molecula, en particular una proteina, a un coagulo de sangre.
El «sujeto», o «diana biologica», puede ser cualquier entidad biologica que pueda producir y/o contener selectinas. Por ejemplo, la diana biologica puede ser una celula, un fluido biologico o un tejido biologico. La diana biologica puede proceder de un sujeto vivo (p. ej., puede obtenerse extrayendo sangre o mediante biopsia) o en un sujeto fallecido (p. ej., puede obtenerse en la autopsia). El sujeto puede ser un ser humano u otro mamifero. En determinadas realizaciones preferidas, la diana biologica procede de un paciente sospechoso de tener una afeccion clinica asociada con la aparicion de un trombo intravascular. En particular, dicho sujeto puede sufrir una enfermedad trombotica cronica o aguda o un trastorno trombotico.
De acuerdo con la invencion, la expresion «activador de plasminogeno», o t-PA, tambien abarca t-PA nativo y recombinante, por ejemplo, un t-PA de dos cadenas o un t-PA recombinante de una sola cadena. En seres humanos, t-PA es una proteina de SEQ ID NO1, o tal como se describe en Harris et al. (Harris et al., 1986, Cloning of cDNA coding for human tissue-type plasminogen activator and its expression in Escherichia coli, Mol. Biol. Med. 3 (3), 279-292).
De acuerdo con la invencion, los fucoidanos se refieren a un tipo de polisacarido, que contiene porcentajes sustanciales de grupos ester de L-fucosa y sulfato, principalmente derivados de algas pardas y algunos otros invertebrados marinos. Dichos fucoidanos pueden obtenerse mediante diversos metodos conocidos en la tecnica, que se desarrollaran mas adelante. Para una revision mas completa sobre la estructura y bioactividad de los fucoidanos, el experto en la tecnica puede referirse a Li et al. (Li et al., 2008, Fucoidan: Structure and Bioactivity, Molecules).
Los terminos y expresiones «fucoidan», «fraccion de fucoidan», «fucan», «fucosan» y «fucan sulfatado» son equivalentes para los fines de la presente descripcion.
De acuerdo con una realizacion preferida, la invencion se refiere a cualquier entidad de fucoidan que exhibe una alta afinidad, especificidad y/o selectividad por selectinas y, por lo tanto, por el trombo. En el contexto de la presente invencion, cuando se utiliza un resto fucoidan como agente vectorizante, el primero confiere su propiedad de
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especificidad/selectividad/afinidad a la molecula, y la molecula se convierte en "objetivo de trombo" (es decir, la molecula interactua especifica y/o eficientemente con y/o se une a selectinas y fibrina). La expresion "afinidad de union" y el termino "afinidad" se utilizan en esta memoria de manera indistinta y se refieren al nivel de atraccion entre entidades moleculares. Las afinidades se pueden expresar cuantitativamente como constante de disociacion (Kd), o su inversa, la constante de asociacion (Ka).
De acuerdo con la invencion, el termino «aproximadamente» puede entenderse como mas o menos 10%.
De acuerdo con la invencion, las «enfermedades tromboticas» y los «trastornos tromboticos» son enfermedades y/o trastornos que estan asociados con la aparicion o persistencia de coagulos de sangre intravasculares y/o trombos no deseados.
Los trastornos y las enfermedades tromboticas de acuerdo con la invencion pueden dar como resultado, por ejemplo, la formacion de trombosis venosa tal como trombosis venosa profunda, trombosis de la vena porta, trombosis de la vena renal, trombosis de la vena yugular o trombosis del seno venoso cerebral. En algunos casos, dicha trombosis puede conducir a flebitis, a la que tambien se alude en esta memoria como "tromboflebitis" y, en ocasiones, a embolias pulmonares. Tambien puede implicar trombos auriculares y ventriculares relacionados con las arritmias cardiacas.
Tambien pueden resultar en una trombosis arterial, que a menudo es consecuencia de la ruptura de una placa aterosclerotica, en cuyo caso tambien puede denominarse «aterotrombosis». Una trombosis arterial puede conducir, por ejemplo, a una apoplejia, un infarto de miocardio y/o una embolia arterial.
Las enfermedades tromboticas son bien conocidas en la tecnica y pueden tener diversas causas. Pueden ser enfermedades primarias o adquiridas. En particular, pueden ser hereditarias y/o estar vinculadas a predisposiciones geneticas. Ejemplos de este tipo de enfermedades comprenden, por ejemplo, hemofilias, enfermedad de Von Willebrand y otras coagulopatias relacionadas con la hiper- e hipo-coagulabilidad.
Fucoidan es capaz de fijar como objetivo in vivo trombo que contiene plaquetas y fibrina con excelente sensibilidad y especificidad (Rouzet et al., 2011, Radiolabeled fucoidan as a P-selectin targeting agent for in vivo imaging of platelet-rich thrombus and endothelial activation. J Nucl Med).
De acuerdo con la invencion, un «aminofucoidan» es un resto fucoidan, que esta aminado por un enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y un grupo quimico que comprende uno (fucoidan mono-amina) o mas grupos amino (-NH2) (fucoidan poli-amina) como grupos de amina primaria o grupos guanidina. Preferiblemente, dicho grupo quimico solo comprende, como sustituyente(s) terminal(es), uno o mas grupos amino (-NH2).
Incluso mas preferiblemente, dicho grupo quimico solo comprende, como sustituyente(s) terminal(es) una o mas aminas primarias.
De acuerdo con la invencion, un grupo amino (-NH2) se refiere a cualquier grupo quimico con un radical (-NH2) libre, en particular grupos de amina primaria y grupos guanidina, y mas particularmente grupos amina primaria. De manera no limitativa, se puede seleccionar un grupo quimico en el grupo que consiste en lisina, arginina, ornitina o acido Y-aminobutirico.
De acuerdo con la invencion, un "sustituyente terminal" se refiere a cualquier sustituyente en el extremo de una cadena hidrocarbonada.
De acuerdo con la invencion, una «cadena hidrocarbonada» puede comprender, en particular, entre 1 y 44 atomos de carbono, que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43 o 44 atomos de carbono, mas particularmente entre 1 y 22 atomos de carbono, e incluso mas particularmente entre 1 y 10 atomos de carbono.
De acuerdo con una realizacion preferida, dicho grupo quimico comprende como sustituyente o sustituyentes terminales, solo sustituyente o sustituyentes terminales que consiste(n) en un grupo amino primario. Por lo tanto, a dicho aminofucoidan tambien se le puede aludir en esta memoria como un "fucoidan modificado terminado en amina primaria, similar/mimetico de la lisina".
De acuerdo con la invencion, el aminofucoidan es un fucoidan que esta modificado en su extremo reductor. Debido a ello, no se altera la actividad biologica de dicho fucoidan, que depende de la cantidad y la distribucion de los grupos sulfato a lo largo de su cadena. Sin embargo, tambien es posible introducir aminas primarias adicionales directamente en los grupos hidroxilo de fucosas que componen dicha cadena.
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Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion particular, dicho fucoidan comprende grupos que contienen aminas primarias enlazadas covalentemente a la cadena de fucoidan.
De acuerdo con esa realizacion particular, dicha cadena comprende, por termino medio, entre 1 y 10 grupos que contienen aminas primarias por cadena de fucoidan, que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 grupos que contienen aminas primarias.
De acuerdo con la invencion, un "heteroatomo" se refiere a un atomo que se selecciona preferiblemente de nitrogeno (N), azufre (S) y oxigeno (O), e incluso mas preferiblemente se selecciona de nitrogeno y oxigeno.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona una plataforma molecular bipolar y metodos para preparar dichos vectores bipolares, a los que tambien se alude en esta memoria como aminofucoidanes.
Se demuestra, de acuerdo con la invencion, que dichos vectores bipolares tienen dos caracteristicas principales:
- un polo (fucoidan anionico) es capaz de vectorizar al trombo,
- un polo es capaz de interactuar con y proteger t-PA a traves de al menos una funcion de union a amina primaria.
Por lo tanto, la invencion se refiere a un complejo entre un aminofucoidan y un activador de plasminogeno tisular (t- PA). Dicho complejo es un complejo no covalente.
En particular, la fijacion como objetivo de selectina P (que se expresa en la superficie de las plaquetas) por un resto fucoidan aumenta ventajosamente la concentracion local de t-PA en o cerca del trombo, que luego es la responsable de una tasa incrementada de fibrinolisis.
Ventajosamente, la amina primaria en un polo del aminofucoidan es parte de o, alternativamente, imita a un aminoacido o un poli-aminoacido, en particular una lisina, una polisilina o un derivado de lisina. Lisinas, polilisinas o derivados de lisina de este tipo sirven como residuos de anclaje entre t-PA, plasminogeno y fibrina.
A menos que se especifique lo contrario, un "aminoacido", tal como una "lisina", se refiere tanto a un aminoacido como a sus derivados.
De una manera no limitativa, el polo de la amina tambien puede implicar un resto que contiene amina primaria capaz de unirse a t-PA, tal como lisina, arginina, ornitina o acido Y-aminobutirico.
Por supuesto, el aminoacido o poli-aminoacido se puede acoplar al fucoidan mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, siempre que el aminofucoidan resultante comprenda al menos un grupo amino libre (-NH2), tal como una amina primaria o un grupo guanidina, como sustituyente terminal.
De acuerdo con una realizacion preferida, un aminoacido o un poli-aminoacido se acopla a un fucoidan, o a un enlazador L a traves de un grupo amida.
Sin desear estar ligada a teoria particular alguna, la solicitante cree que se supone que la union no covalente de t- PA al resto amina del compuesto lo protege de las serpinas y permite que se administre a la fibrina.
La solicitante tambien cree que vincular un resto fucoidan a t-PA a traves de un grupo amino, tal como una amina primaria, en particular aminoacidos y derivados de aminoacidos, induce un cambio conformacional dentro del t-PA. Este cambio conformacional puede entonces proteger su sitio activo de los inhibidores circulantes y, asi, aumentar la semivida y la biodisponibilidad de un complejo de t-PA/aminofucoidan hacia el trombo.
De acuerdo con la invencion, los aminoacidos y/o sus derivados pueden tener una configuracion L o una configuracion D, en particular una configuracion L.
De acuerdo con la invencion, un «derivado de aminoacido» es un aminoacido modificado que tiene una configuracion L o una configuracion D, en particular una configuracion L, y al menos un grupo amino libre, en particular una amina primaria libre, preferiblemente dos o mas de dos aminas primarias libres.
Un aminoacido modificado es un aminoacido, en el que la cadena lateral esta opcionalmente interrumpida o sustituida con uno o mas grupos quimicos, identicos o diferentes.
A menos que se especifique, un «aminoacido» de acuerdo con la invencion puede abarcar tanto dicho «aminoacido» como sus derivados.
Ventajosamente, los aminoacidos pueden enlazarse covalentemente entre si mediante enlaces peptidicos (o grupos amida) para formar poli-aminoacidos.
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Los poli-aminoacidos estan compuestos ventajosamente de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoacidos, en particular 2 o 4 aminoacidos.
En particular, los poliaminoacidos pueden seleccionarse en la lista que consiste en: polilisinas, poliargininas, poliglutaminas, policitrulinas, poliornitinas y preferiblemente polilisinas.
Cuando el resto fucoidan esta unido a t-PA a traves de poli-lisina(s), dicha o dichas poli-lisinas estan compuestas ventajosamente de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 lisinas, en particular 2 o 4 lisinas.
Por lo tanto, los dendrimeros de lisinas tambien son considerados por la invencion como "derivados de lisina". Si no estan disponibles comercialmente, pueden sintetizarse de acuerdo con el protocolo descrito en Kim & Zimmerman et al., (Y. Kim y SC Zimmerman, 1998, «Applications of dendrimers in bioorganic chemistry», Current Opinion in Chemical Biology, vol. 2, pags. 733-742).
Tal como se menciono arriba, la vectorizacion con dicho aminofucoidan permite un aumento de la concentracion de t-PA en o cerca del trombo, y protege dicho t-PA durante su suministro plasmatico. Por lo tanto, dicha vectorizacion tiene la doble ventaja de aumentar la concentracion local de t-PA, pero tambien de proteger t-PA de otros compuestos y/o inhibidores tales como PAI-1.
Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion, la invencion se refiere a un vector que tiene propiedad de union a t-PA que consiste en un resto fucoidan que esta aminado por un enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y un grupo quimico que comprende uno o mas grupos amino.
De acuerdo con la invencion, la expresion «extremo reductor» es el extremo en el que el atomo de carbono anomerico (C1 para una hexosa tal como glucosa y C2 para una pentosa tal como fructosa) esta libre y no se ha utilizado para formar un enlace glicosidico.
De acuerdo con una realizacion particular, dicho vector es un compuesto de formula (I):
FUCO-C1 -[NH]y-[L]z-[NH]x-R1 (I),
en donde
- "FUCO" significa un resto fucoidan, que opcionalmente contiene uno o mas grupos amina primaria enlazados covalentemente a la cadena de fucoidan,
- x, y y z son numeros enteros independientes que significan 0 o 1,
- C1 es el atomo de carbono en la posicion 1 de la unidad de sacarido ubicada en el extremo reductor del resto fucoidan,
- L es un enlazador, y
- R1 es un grupo quimico que comprende uno o mas grupos amino, o que consiste en un grupo amino,
- L y R1 son independientes y pueden ser iguales o diferentes.
Un «enlazador» L puede aludir a cualquier grupo quimico, que incluye grupos quimicos con y sin aminas primarias.
De acuerdo con una realizacion mas particular, dicho vector es un compuesto de formula (I), en donde y y z significan 0.
Asi, de acuerdo con dicha realizacion, dicho vector es un compuesto de formula (I’):
FUCO-C1 -[NH]x-R1 (I’),
en donde
- "FUCO" significa un resto fucoidan, que opcionalmente contiene uno o mas grupos amina primaria enlazados covalentemente a la cadena de fucoidan,
- x es un numero entero que significa 0 o 1,
- C1 es el atomo de carbono en la posicion 1 de la unidad de sacarido ubicada en el extremo reductor del resto fucoidan,
- L es un enlazador, y
- R1 es un grupo quimico que comprende uno o mas grupos amino, o que consiste en un grupo amino,
- L y R1 son independientes y pueden ser iguales o diferentes.
En algunas realizaciones, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’), en donde:
- R1 es un grupo quimico que comprende o consiste en una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que termina en amina primaria; un aminoacido; un poli-aminoacido; y/o un grupo quimico seleccionado en la lista que
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comprende, o que consiste en: lisina, polilisina, arginina, poliarginina, ornitina, poliornitina, acido Y-aminobutirico, poliaminas, polieteraminas, o cualquier otro grupo quimico que comprenda un grupo guanidina o una amina primaria, en donde:
- dicho grupo quimico esta interrumpido opcionalmente por uno o mas anillos hidrocarbonados no aromaticos que tienen 5 o 6 atomos de carbono, y preferiblemente no mas de un anillo hidrocarbonado no aromatico que tiene 5 o 6 atomos de carbono,
- dicho grupo quimico esta interrumpido opcionalmente por uno o mas heteroatomos,
- dicho grupo quimico contiene opcionalmente uno o mas grupos amida y/o uno o mas grupos ester, en particular uno o mas grupos amida,
- dicho grupo quimico esta opcionalmente sustituido con uno o mas grupos amina,
- dicho grupo quimico esta opcionalmente interrumpido y/o sustituido con uno o mas grupos, identicos o diferentes, y se selecciona de: (a) una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, (b) un aminoacido o un poli-aminoacido, (c) una poliamina o una polieteramina, (d) un acido Y-aminobutirico, (e) un grupo guanidina y (f) una amina primaria.
De acuerdo con una realizacion, L es un enlazador que comprende o consiste en una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada terminada en amina primaria; un aminoacido; un poli-aminoacido; y/o un grupo quimico seleccionado en la lista que comprende o consiste en: lisina, polilisina, arginina, poliarginina, glutamina, poliglutamina, citrulina, policitrulina, ornitina, poliornitina, acido Y-aminobutirico, poliaminas, polieteraminas, o cualquier otro grupo quimico que comprenda un grupo guanidina o una amina primaria, en donde:
- dicho grupo quimico esta interrumpido opcionalmente por uno o mas anillos de hidrocarburos no aromaticos que tienen 5 o 6 atomos de carbono, y preferiblemente no mas de un anillo de hidrocarburo no aromatico que tiene 5 o 6 atomos de carbono,
- dicho grupo quimico esta interrumpido opcionalmente por uno o mas heteroatomos,
- dicho grupo quimico contiene opcionalmente uno o mas grupos amida y/o uno o mas grupos ester, en particular uno o mas grupos amida,
- dicho grupo quimico esta opcionalmente sustituido con uno o mas grupos amina,
- dicho grupo quimico esta opcionalmente interrumpido y/o sustituido con uno o mas grupos, identicos o diferentes, y seleccionados de: (a) una cadena de hidrocarburos lineal o ramificada, (b) un aminoacido o un poli-aminoacido, (c) una poliamina o una polieteramina, (d) un acido Y-aminobutirico, (e) un grupo guanidina y (f) una amina primaria.
De acuerdo con otra realizacion particular, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’), en donde:
- R1 es un grupo quimico que comprende o consiste en una cadena hidrocarbonada que termina en amina primaria, lineal o ramificada; un aminoacido; un poli-aminoacido; y/o un grupo quimico seleccionado en la lista que comprende, o que consiste en: lisina, polilisina, arginina, poliarginina, glutamina, poliglutamina, citrulina, policitrulina, ornitina, poliornitina, acido Y-aminobutirico, poliaminas, polieteraminas, o cualquier otro grupo quimico que comprenda un grupo guanidina o una amina primaria.
De acuerdo con otra realizacion particular, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’), en donde R1 o L esta sustituido con 1 a 4 grupos amina, lo que significa 1, 2, 3 o 4 grupos amina.
De acuerdo con otra realizacion particular, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’), en donde R1 y/o L esta sustituido con 1 a 4 grupos amida y/o 1 a 4 grupos ester, lo que significa 1, 2, 3 o 4 grupos amina y/o 1, 2, 3 o 4 grupos ester.
De acuerdo con una realizacion mas particular, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’), en donde L significa una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, en particular una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 22 atomos de carbono, en particular 1 a 10 atomos de carbono, y mas particularmente de 1 a 5 atomos de carbono, en donde:
- dicha cadena hidrocarbonada esta interrumpida opcionalmente por uno o mas heteroatomos,
- dicha cadena hidrocarbonada contiene opcionalmente uno o mas grupos amida,
- dicha cadena hidrocarbonada esta opcionalmente sustituida con uno o mas grupos amina.
De acuerdo con una realizacion particular, L se selecciona en un grupo que consiste en (CH2)2, (CH2)3 y (CH2)2-NH-(CH2)2, y preferiblemente (CH2)3 y (CH2)2-NH-(CH2)2.
Ventajosamente, cuando R1 es un grupo quimico elegido en una lista de aminoacidos o poli-aminoacidos, dicho aminoacido o poli-aminoacido puede estar enlazado al fucoidan a traves de (a) el extremo C-terminal (-COOH), o (b) el extremo N-terminal (-NH2) de dicho aminoacido.
Preferiblemente, el aminoacido o poli-aminoacido esta unido al fucoidan a traves del extremo C-terminal (-COOH) de dicho aminoacido.
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De acuerdo con la invencion, el "extremo N-terminal" o el "extremo C-terminal" de un aminoacido o un poli- aminoacido debe entenderse como respectivamente la amina primaria (-NH2) y el grupo carboxflico (-COOH) nacidos por el carbono a de este aminoacido.
Por supuesto, cuando el aminoacido o poli-aminoacido esta enlazado a traves de su extremo N-terminal (-NH2), se tiene que elegir un aminoacido, o un derivado que porte al menos una amina primaria libre adicional o un grupo guanidina libre como un sustituyente terminal, con el fin de obtener un aminofucoidan que contenga al menos un grupo amino libre adecuado para vectorizar t-PA al trombo.
De acuerdo con otra realizacion particular, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’), en donde -[NH]x-R1 se selecciona del grupo que consiste en:
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De acuerdo con una realizacion preferida, dicho vector se selecciona del grupo que consiste en:
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en donde
- "FUCO" significa un resto fucoidan, que opcionalmente contiene uno o mas grupos amina primaria enlazados covalentemente a la cadena de fucoidan,
- C1 es el atomo de carbono en la posicion 1 de la unidad de sacarido ubicada en el extremo reductor del resto fucoidan.
De acuerdo con una realizacion particular, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’) que comprende una poli-lisina o un derivado de lisina, en particular una poli-lisina.
5 De acuerdo con esta realizacion particular, -[NH]x-R1 puede ser de formula (VI):
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en donde:
- «Lys» es una lisina o un derivado de lisina, y preferiblemente una lisina,
- x es al menos igual o superior a 1, preferiblemente igual a 2, 3, 4, 5 o 6 y lo mas preferiblemente igual a 2 o 4.
10 Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion preferida, dicho vector es un compuesto de formula (VI’):
o
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HN ^
(Lys)x
(VI’),
en donde
- "FUCO" significa un resto fucoidan, que opcionalmente contiene uno o mas grupos amina primaria enlazados covalentemente a la cadena de fucoidan,
15 - C1 es el atomo de carbono en la posicion 1 de la unidad de sacarido ubicada en el extremo reductor del resto
fucoidan,
- «Lys» es una lisina o un derivado de lisina, y preferiblemente una lisina,
- x es al menos igual o superior a 1, preferiblemente igual a 2, 3, 4, 5 o 6 y lo mas preferiblemente igual a 2 o 4.
De acuerdo con una realizacion preferida, aminoacidos tales como lisinas estan enlazados covalentemente a traves 20 de grupos amida, para formar polilisinas o dendrimeros. Dichas polilisinas o dendrimeros se pueden obtener por cualquier metodo conocido en la tecnica.
De acuerdo con otra realizacion particular, -[NH]x-R1 y/o un derivado de lisina pueden ser de formula (VII):
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en donde
25 - «Lys» es una lisina o un derivado de lisina, y preferiblemente una lisina,
- x es al menos igual o superior a 1, preferiblemente igual a 2, 3, 4, 5 o 6 y lo mas preferiblemente igual a 2 o 4.
Por lo tanto, dicha formula (VII) puede ser parte de un dendrimero de lisinas.
Aparte de las lisinas y polilisinas, otros aminoacidos y poliaminoacidos pueden acoplarse al fucoidan. En particular, la invencion tambien se refiere a vectores de formula general (I) o (I’), en donde R1 se deriva de una arginina, una 30 poliarginina y/o cualquier otro grupo quimico que contenga guanidina.
Poliaminas y polieteraminas
De acuerdo con otra realizacion, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’), en donde R1 se deriva de una poliamina o una polieteramina. Las polieteraminas pueden ser una monoamina polieteramina o una poliamina polieteramina, tal como una diamina o una triamina polieteramina, y preferiblemente una poliamina polieteramina.
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Ventajosamente, la poliamina y/o polieteramina se pueden acoplar al fucoidan o un enlazador L a traves de cualquiera de sus aminas primarias libres.
De acuerdo con una realizacion particular, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’), en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en polieteraminas.
Tales polieteraminas son bien conocidas en la tecnica y pueden venderse bajo el nombre de polieteraminas JEFFAMINE®.
Las polieteraminas contienen grupos amina primaria unidos al extremo de una cadena principal de polieter. La cadena principal de polieter se basa en unidades de oxido de propileno (PO), unidades de oxido de etileno (EO) o unidades mixtas de PO/EO.
La cadena principal de polieter de polieteraminas de este tipo puede, por lo tanto, variar dependiendo de una relacion de unidades PO/EO dada. Las polieteraminas pueden comprender grupos amina primaria en un extremo (a las que tambien se alude como monoaminas en esta memoria), en dos extremos (diaminas) o en tres extremos (triaminas).
A continuacion se proporciona una formula general (VIII) de monoamina polieteraminas adecuada para la invencion:
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en donde R es H para (EO), o CH3 para (PO), y preferiblemente CH3, en donde x e y pueden ser iguales o diferentes.
Dichas monoaminas se pueden preparar por reaccion de un iniciador de mono-alcohol con EO y/o PO, seguido de la conversion de los grupos hidroxilo terminales resultantes en aminas.
De acuerdo con dicha realizacion, cuando R es igual a CH3, la relacion y / x puede estar, en particular, en un intervalo de 0,1 a 10, en particular de 0,15 a 9.
Ventajosamente, una monoamina polieteramina de formula (VIII) puede tener un peso molecular medio que oscila entre 500 y 5000 g/mol-1, en particular entre 600 y 2000 g/mol-1.
Las monoamina polieteraminas que corresponden a la formula general arriba mencionada se venden como monoaminas JEfFaMINE® (serie M), por ejemplo M-600, M-1000, M-2005 y M-2070.
A continuacion se proporciona una primera formula general (IX) de diamina polieteraminas adecuadas para la invencion:
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en donde x es un numero entero que puede oscilar entre 1 y 100, en particular entre 2 y 70.
Ventajosamente, una diamina polieteramina de formula (IX) puede tener un peso molecular medio que oscila entre 100 y 5000 g/mol-1, en particular entre 200 y 4000 g/mol-1.
A continuacion se proporciona una segunda formula general (X) de diamina polieteraminas adecuadas para la invencion:
H'lM.
: : x y I :
CHj CHj 6h:
NB?
en donde x, y y z pueden ser iguales o diferentes, en donde y puede variar de 1 a 50, en particular de 2 a 40, en donde x y z pueden variar de 0 a 10, en particular de 0 a 6, en donde la suma de x y z puede variar opcionalmente de 1 a 6.
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Ventajosamente, una diamina polieteramina de formula (X) puede tener un peso molecular medio que oscila entre 100 y 5000 g/mol-1, en particular entre 200 y 2000 g/mol-1.
A continuacion se proporciona una tercera formula general (XI) de diamina polieteraminas adecuadas para la invencion:
K?lsk / >0,
\chJ
'O'
NH?
(XI)
x x1
en donde x puede variar de 1 a 5, en particular de 1 a 3, y preferiblemente 2 o 3.
Ventajosamente, una diamina polieteramina de formula (XI) puede tener un peso molecular medio que oscila entre 100 y 500 g/mol-1, en particular entre 100 y 200 g/mol-1.
Las diamina polieteraminas pueden comercializarse como diaminas JEFFAMINE® (series D, ED, EDR), por ejemplo, D-230, D400, D-2000, D-4000, HK-511, ED-60D, ED-90D, ED-20D3, EDR-148, EDR-176.
A continuacion se proporciona una formula general (XII) de triamina polieteraminas adecuadas para la invencion:
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en donde n puede ser igual a 0 o 1, en donde R puede representar H o C2H5,
en donde x, y y z pueden ser iguales o diferentes y pueden variar de 0 a 100, en particular de 0 a 85, en donde la suma de x, y y z varia de 5 a 100, en particular de 5 a 85.
Las triamina polieteraminas se pueden comercializar como triaminas JEFFAMINE® (serie T), por ejemplo T-403, T- 3000, T5000.
Preferiblemente, las polieteraminas se pueden elegir en el grupo que consiste en poliamina polieteraminas, y mas preferiblemente diamina o triamina polieteraminas, tales como polieteraminas de formulas en las que x, y y z varian de 2 a 10.
Alternativamente, dicho vector es un compuesto de formula (I) o (I’), en donde R1 se deriva de una poliamina tal como espermina o espermidina, diaminopropano o dietilentriamina.
Espermina es una poliamina de formula (XIII):
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Espermidina es una poliamina de formula (XIV):
(XIII).
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Una poliamina o una polieteramina se enlaza con el fucoidan o un enlazador L utilizando cualquier metodo conocido en la tecnica o descrito a continuacion, o como se muestra en los ejemplos.
Por ejemplo, una poliamina o una polieteramina se puede enlazar a un fucoidan a traves de una aminacion reductora mediante una reaccion de acoplamiento de extremo a extremo entre la funcion aldehido del azucar reductor del fucoidan y la funcion amina de una polieteramina, tal como en Belbekhouche et al.. (Belbekouche S. et al., 2013, Carbohydrate Polymers,
http://dx.doi.org/10.1016/i.carbpol.2013.02.032).
Ventajosamente, compuestos de la invencion pueden obtenerse adicionalmente de acuerdo con los metodos definidos a continuacion, o como se ilustra en los ejemplos 1, 2, 3 y 4.
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t-PA vectorizado
Por lo tanto, la invencion tambien se refiere a un metodo para preparar un t-PA vectorizado, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un vector de la invencion,
b) proporcionar t-PA, y
c) poner en contacto el vector proporcionado en la etapa a) con el t-PA proporcionado en la etapa b), con el fin de obtener complejos entre dicho vector y t-PA.
De acuerdo con una realizacion, la invencion se refiere, ademas, a un t-PA vectorizado que comprende complejos de un vector de acuerdo con la invencion, con t-PA.
De acuerdo con una realizacion, una composicion que comprende un vector o un t-PA vectorizado de la invencion se considera en una forma sustancialmente pura.
Una composicion sustancialmente pura tal como se define anteriormente, y que comprende un vector o un t-PA vectorizado de acuerdo con la invencion puede contener, como forma principal, un vector o un t-PA vectorizado, en el que el fucoidan esta aminado en su extremo reductor, en comparacion con la cantidad total de fucoidan en dicha composicion o con la cantidad total de fucoidan aminado en dicha composicion.
De acuerdo con dicha realizacion, una composicion sustancialmente pura puede contener al menos 50% en una relacion molar de un vector que esta aminado en su extremo reductor, en donde dicha relacion molar se basa en la cantidad total de fucoidan en dicha composicion.
Alternativamente, una composicion sustancialmente pura puede contener al menos 50% en una relacion molar de un vector que esta aminado en su extremo reductor, en donde dicha relacion molar se basa en la cantidad total de fucoidan aminado en dicha composicion.
Por lo tanto, una composicion sustancialmente pura tal como se define anteriormente puede contener al menos 50% en una relacion molar, y preferiblemente mas, de un vector que esta aminado en su extremo reductor, que incluye 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% en relacion molar.
Como se menciono anteriormente, la presencia de funciones amina en un polo del vector bipolar le permite interactuar con t-PA y plasminogeno y protegerlo.
Ventajosamente, es posible variar la cantidad media de vector que puede interactuar con t-PA como un complejo, o en el contexto de una composicion farmaceutica.
De acuerdo con una realizacion particular, el t-PA vectorizado puede tener una relacion molar de vector a t-PA que oscila entre 40:1 y 1:1; preferiblemente entre 20:1 y 3:1, y lo mas preferiblemente entre 15:1 y 5:1.
De acuerdo con una realizacion preferida, la relacion molar de vector a t-PA es de aproximadamente 10:1 cuando el vector es un mono.amina fucoidan, y aproximadamente 5:1 cuando el vector es un poli-amina fucoidan.
Por lo tanto, un t-PA vectorizado de acuerdo con la invencion puede estar destinado para uso como un medicamento. En particular, dicho t-PA vectorizado puede estar destinado para uso como un ingrediente activo para prevenir o tratar un trombo en un sujeto.
De lo anterior, el experto en la tecnica entiende que un vector o un t-PA vectorizado de la invencion o, alternativamente, una composicion farmaceutica que comprende un vector o un t-PA vectorizado de la invencion, deberia ser adecuado para una administracion a un sujeto que lo necesite.
En particular, una composicion farmaceutica de este tipo deberia ser adecuada y/o compatible con una administracion parenteral a un sujeto que lo necesite.
Preferiblemente, una composicion farmaceutica de la invencion deberia ser esteril y/o carente de microorganismos. Restos fucoidan
Los fucoidanos (tambien llamados fucos, fucosanos o fucanos sulfatados) son polisacaridos sulfatados con un amplio espectro de actividades biologicas, que incluyen actividades anticoagulantes, antitromboticas, antiviricas, antitumorales, inmunomoduladoras, anti-inflamatorias y antioxidantes. Los fucoidanos se encuentran principalmente
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en diversas especies de algas pardas (B. Li et al, Molecules, 2008, 13: 1671-1695; M. Kusaykin et al, Biotechnol. J., 2008, 3: 904-915).
De acuerdo con una realizacion particular, un fucoidan o un resto fucoidan adecuado para la invencion se obtiene a partir de algas y, en particular, de algas pardas.
Tambien se han encontrado formas variantes de fucoidanos en especies de animales marinos, incluido el pepino de mar. Por lo tanto, en comparacion con otros polisacaridos sulfatados, los fucoidanos estan ampliamente disponibles a partir de diversos tipos de fuentes baratas, y se obtienen facilmente utilizando metodos de extraccion conocidos en la tecnica (C. Colliec et al, Phytochemistry, 1994, 35(3):697-700).
Estos metodos de extraccion generalmente proporcionan fucoidanos con pesos moleculares en el intervalo de 70800 kDa. Tambien se han desarrollado procedimientos para despolimerizar fucoidanos de alto peso molecular en fucoidanos de bajo peso molecular, p. ej., inferiores a aproximadamente 20 kDa (documento EP 0403 377B, Pat. de EE.UU. N° 5.321.133), o inferiores a aproximadamente 10 kDa (documento EP 0 846 129 B; Pat. de EE.UU. N° 6.028.191; A. Nardella et al, Carbohydr. Res., 1996, 289: 201-208).
De acuerdo con una realizacion particular, un fucoidan o un resto fucoidan adecuado para la invencion se obtiene de acuerdo con el metodo de extraccion y despolimerizacion descrito en el ejemplo 1.
De acuerdo con otra realizacion, los fucoidanos se pueden obtener comercialmente de las siguientes companfas: Fucoidan de la companfa Sigma-Aldrich (EE.UU.): Fucoidan crudo (de Fucus vesiculosus) ref F5631, numero CAS 9072-19-9. MM = 20,000 - 200,000 g/mol; Fucoidan de la companfa Algues-et-Mer (Francia): Asphyscient® (de Ascophyllum nodosum), a pedido, MM = 5.000 - 10.000 g/mol; Fucoidan de Kraeber GmbH (Alemania): a pedido, LMWF, 8.500 g/mol, HMWF, 600.000 g/mol, de diferentes algas pardas.
Los fucoidanos generalmente estan hechos de una cadena principal lineal formada por un a-1,3-L Fuc o alternando a-1,3-L Fuc, a-1,4-L Fuc o a-1,2-L Fuc que puede estar presente en la ramificacion de la cadena principal. Los grupos sulfato ocupan el C-2 y/o C-3 o C-4 de fucosa.
De acuerdo con una realizacion particular, los fucoidanos son polfmeros de L-fucosa con enlaces a-1,2 o a-1,3 que estan principalmente sulfatados en la posicion 4 y en la posicion 2 o 3 despues del enlace glicosfdico. Sin embargo, ademas de los residuos fucosa y sulfato, los fucoidanos tambien contienen otros monosacaridos (p. ej., manosa, galactosa, glucosa, xilosa, etc.) y grupos acido uronico. Se sabe en la tecnica que la estructura de los fucoidanos de diferentes algas pardas varfa de una especie a otra.
Cuando los fucoidanos contienen acido uronico (UA) y otras hexosas, la estructura de dichos fucoidanos se puede construir alrededor de una cadena principal lineal de poli-L fucosa polisulfatada que porta sustituyentes seleccionados en un grupo que consiste en: acido uronico, una hexosa (1 unidad), un grupo sulfato y un grupo acetilo. Como un ejemplo, la estructura esquematica ampliamente admitida de fucoidan extrafdo del alga parda Ascophyllum nodosum se da en Berteau & Mulloy o Pomin & Mourao (O. Berteau y B. Mulloy, 2003, Glycobiology, 13(6) 29-40, DOI: 10.1093/glycob/cwg058; V. Pomin y PAS Mourao, 2008, Glycobiology 18(12) 1016-1027, revision, DOI: 10.1093/glycob/cwn085).
De acuerdo con una realizacion preferida, un fucoidan puede estar compuesto por una unidad repetitiva de formula (IX):
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en donde
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- Ri y R2 significan, uno independientemente del otro: H, un grupo sulfato, un grupo acetilo, una hexosa y/o acido uronico,
- n es igual o superior a 1.
Ademas, la estructura de los fucoidanos tambien puede modificarse quimicamente. Por ejemplo, se han desarrollado metodos para aumentar el porcentaje de grupos sulfato de fucoidanos con el fin de obtener fucoidanos sobre- sulfatados o fragmentos de fucoidan sobre-sulfatados (T. Nishino et al, Carbohydr. Res., 1992, 229: 355-362; S. Soeda et al., Thromb. Res., 1993, 72: 247-256).
De acuerdo con una realizacion particular, el fucoidan o el resto fucoidan esta polisulfatado.
De acuerdo con una realizacion mas particular, dicho fucoidan polisulfatado tiene una relacion de sulfato a azucar superior a 1, en particular superior a 1,2, preferiblemente superior o igual a 1,9.
De acuerdo con una realizacion particular, el fucoidan o el resto fucoidan comprende aminas primarias enlazadas covalentemente a la cadena de fucoidan, pero no al extremo reductor de dicho fucoidan.
Alternativamente, cuando el fucoidan es un aminofucoidan, dicho aminofucoidan comprende, ademas, aminas primarias enlazadas covalentemente a la cadena de fucoidan.
De acuerdo con dichas realizaciones, dicho fucoidan o aminofucoidan pueden comprender por termino medio entre 1 y 10 aminas primarias por cadena de fucoidan.
De acuerdo con una realizacion mas particular, dicho fucoidan o aminofucoidan esta aminado en un grupo hidroxilo libre de la cadena de fucoidan, por ejemplo de una fucosa, por una amina primaria.
Dicha aminacion, que es distinta de una aminacion en el extremo reductor de dicho fucoidan, puede lograrse, por ejemplo, utilizando el protocolo definido en el ejemplo 1.
Restos fucoidan adecuados para uso en la presente invencion son restos fucoidan que tienen un cierto grado de atraccion para las selectinas, en particular la P-selectina, y que pueden desempenar un papel de fijacion de objetivo cuando son parte de un agente vectorizante. Preferiblemente, los restos fucoidan son entidades estables y no toxicas que conservan sus propiedades de afinidad/especificidad/selectividad en condiciones in vitro e in vivo. En realizaciones preferidas, los restos fucoidan exhiben una alta afinidad y especificidad para las selectinas, es decir, interactuan especifica y eficazmente, se unen a o se asocian con las selectinas. Restos fucoidan adecuados incluyen fucoidanos que muestran afinidad y especificidad para solo una de las selectinas (es decir, para L-selectina, E-selectina o P-selectina), asi como fucoidanos que exhiben afinidad y especificidad para mas de una selectina, incluyendo aquellos restos que pueden interactuar, unirse o asociarse eficientemente con las tres selectinas. Preferiblemente, la interaccion entre una selectina y un resto fucoidan como parte de un agente vectorizante es lo suficientemente fuerte durante al menos el tiempo necesario para vectorizar t-PA a un trombo. En determinadas realizaciones, un resto fucoidan adecuado interactua con una selectina con una constante de disociacion (Kd) entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente 500 nM, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 nM y aproximadamente 10 nM, mas preferiblemente entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 5 nM.
Los fucoidanos pueden ser de alto peso molecular o de bajo peso molecular.
Un «peso molecular», de acuerdo con la invencion, se refiere al «peso molecular medio ponderado», o Mw.
Un «fucoidan de bajo peso molecular», de acuerdo con la invencion, se refiere a cualquier fucoidan con un peso molecular medio igual o inferior a 20000 Da, en particular dentro de un intervalo entre 2000 y 20000 Da.
Un "fucoidan de alto peso molecular", de acuerdo con la invencion, se refiere a cualquier fucoidan con un peso molecular medio superior a 20000 Da, en particular dentro de un intervalo entre 20000 y 600000 Da.
En determinadas realizaciones, el resto fucoidan tiene un peso molecular medio de aproximadamente 2000 a aproximadamente 8000 Da. En otras realizaciones, el resto fucoidan tiene un peso molecular medio de aproximadamente 20000 a aproximadamente 70000 Da. En aun otras realizaciones, el resto fucoidan tiene un peso molecular medio de aproximadamente 100000 a aproximadamente 500000 Da.
De acuerdo con una realizacion, el resto fucoidan tiene un peso molecular medio que es inferior a 100000 Da, y preferiblemente inferior a 20000 Da, por ejemplo entre 2000 y 20000 Da.
De acuerdo con otra realizacion, el resto fucoidan tiene un peso molecular medio que oscila entre 2000 Da y 15000 Da.
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De acuerdo con una realizacion particular, los fucodainos se eligen entre fucoidanos de bajo peso molecular, tales como los descritos en el documento WO2010116209.
Metodos para obtener amino-fucoidanos
A continuacion se ensenan metodos para obtener aminofucoidanos de acuerdo con la invencion. El experto en la tecnica puede adaptar facilmente dichos metodos a su conveniencia para obtener aminofucoidanos particulares.
De una manera no limitativa, una estrategia para sintetizar derivados de amina de fucoidanos, a los que tambien se alude como "aminofucoidanos", puede ser un procedimiento de dos etapas:
1. Aminacion reductiva de fucoidan en el extremo reductor
a. Formacion por base de Schiff (imina) entre un aldehido del polisacarido y una amina primaria de un espaciador, a saber, un «compuesto puente», tal como diaminopropano (DAP). Esta reaccion es reversible en un medio acuoso.
b. Reduccion de la imina en una amina para bloquear la reversibilidad de dicha reaccion.
2. Acoplamiento de residuos o derivados de aminoacidos haciendo reaccionar la funcion carboxilica (-COOH) en su extremo C-terminal y la amina primaria del diaminopropano que ha sido fijada en el resto fucoidan en la etapa 1.
Esa segunda etapa se logra, por ejemplo, utilizando reactivos de acoplamiento de activacion, tales como NHS y EDC. Dichos reactivos NHS y EDC estan disponibles comercialmente y son vendidos por companias tales como Sigma Aldrich (Ref. 130672 o Ref. 03449).
Este protocolo de dos etapas tiene la ventaja de ser especifico para la reaccion entre el grupo aldehido y el extremo reductor de la cadena polisacaridica y la amina primaria del espaciador. Tiene las ventajas de (i) ser simple y robusto y (ii) limitar la modificacion estructural del resto polisacarido hasta el final, para evitar el riesgo de perjudicar la actividad biologica cuando se realizan modificaciones quimicas dentro de la cadena (O. Roger et al., 2002, « Polysaccharide labelling: impact on structural and biological properties », Carbohyd. Pol., 50(3)273-278). La segunda etapa es una reaccion de acoplamiento clasica entre una funcion amina primaria y una funcion carboxilica en un medio acuoso y, por lo tanto, es facil, de seguir (G.T. Hermanson, « Bioconjugate Techniques » Academic Press, 2008).
Ademas, la robustez de dicho protocolo permite ventajosamente reemplazar el diaminopropano (DAP) por otros «espaciadores», o enlazadores L, con el fin de obtener cualquier aminofucoidan que comprenda al menos un grupo amino libre en su extremo, en particular una amina primaria.
Un «espaciador», de acuerdo con la invencion, comprende, y preferiblemente consiste en cualquier compuesto que tenga al menos dos grupos amino libres, tales como aminas primarias libres.
Ventajosamente, dicho diaminopropano (DAP) puede sustituirse por cualquier compuesto que comprenda dos aminas primarias libres.
Por lo tanto, la invencion contempla, ademas, aminofucoidanos de los cuales el espaciador no es diaminopropano (DAP) y/o cuyo extremo reductor no esta funcionalizado por un diaminopropano.
Por lo tanto, la invencion tambien se refiere a un vector que tiene una propiedad de union a t-PA, que consiste en un resto fucoidan que esta aminado por un enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y un grupo quimico que comprende uno o mas grupos amino, en donde dicho grupo quimico no se obtiene dirigido a partir del enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y diaminopropano.
De acuerdo con una realizacion particular, el diaminopropano (DAP) de formula (NH2-(CH2)3-NH2) puede sustituirse en una primera etapa con otros compuestos que contienen aminas primarias libres, tales como, por ejemplo, poliaminas y, en particular, dietilentriamina. (DETA) de formula (NH2-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2).
Se entiende que la invencion tambien contempla aminofucoidanos, de los cuales el espaciador no es dietilentriamina (DETA) y/o cuyo extremo reductor no esta funcionalizado por una dietilentriamina.
Por lo tanto, la invencion tambien se refiere a un vector que tiene una propiedad de union a t-PA que consiste en un resto fucoidan que esta aminado por un enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y un grupo quimico que comprende uno o mas grupos amino, en donde dicho grupo quimico no se obtiene dirigido a partir del enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y dietilentriamina.
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De acuerdo con una realizacion particular, los residuos o derivados de aminoacidos que pueden acoplarse en la segunda etapa de la reaccion pueden seleccionarse en un grupo que comprende, y preferiblemente consiste en acido aminocaproico, acido tranexamico, una lisina o una poli/oligolisina, o un derivado de lisina.
Tambien se informan otras estrategias, que podrian definirse como "estrategias alternativas". Aunque pueden sustituir el metodo de dos etapas tal como se definio anteriormente, tambien estan impedidas por algunas limitaciones.
Tres de esas "estrategias alternativas" se desarrollan a continuacion.
A. Formacion de una lactona
En una realizacion particular, un aminofucoidan se puede obtener a traves de la formacion de una lactona tal como en Hernandez et al. (Hernandez et al., 2007, "Synthesis, reactivity, and pH-responsive assembly of new double hydrophilic block copolymers of carboxymethyldextran and poly (ethylene glycol)", Polymer 48, pags. 921-930).
De acuerdo con esta realizacion particular, el metodo comprende las etapas de:
1. Formacion de una lactona en el extremo reductor del fucoidan por oxidacion del azucar reductor con una mezcla de di-yoduro y potasa.
2. Reaccion de una molecula que porta una amina primaria, tal como un residuo o un derivado de aminoacido, a traves de dicha amina con la lactona para formar un enlace amida.
De acuerdo con dicha realizacion, el azucar oxidado debe estar exento de cualquier sustituyente, de modo que la oxidacion siga siendo eficiente, lo cual no es necesariamente cierto para todos los fucoidanos sulfatados. El derivado de amina que reacciona con la lactona tambien debe estar en gran exceso. Ademas, la reaccion puede durar unos pocos dias a 60°C, lo que podria alterar la estructura del propio fucodain, contrariamente al dextrano que se ensena en Hernandez et al.
B. Formacion de una semicarbazona o una tiosemicarbazona
En otra realizacion particular, un aminofucoidan se puede obtener a traves de la formacion de una semicarbazona o una tiosemicarbazona tal como en Zhang et al. (Zhang et al., 2011, "One-pot fluorescent labeling of saccharides with fluorescein-5-thiosemicarbazide for imaging polysaccharides transported in living cells", Carbohyd. Res.,346 pags. 2156-2164). Dicha semicarbazona se puede obtener, por ejemplo, por condensacion de una semicarbazida con un aldehido o una cetona.
Cuando la semicarbazona se obtiene a traves de la condensacion de un aldehido (el extremo reductor de un polisacarido, por ejemplo), la reaccion es la siguiente:
R-CHO + NH2- NH-(C=O)-NR'2 ^ R-CH=N-NH-(C=O)-NR'2
en donde R es un polisacarido, tal como un fucoidan, y en donde R' es una estructura de carbono, tal como un fluoroforo.
La semicarbazona se estabiliza por reduccion del doble enlace C=N.
De acuerdo con dicha realizacion, la semicarbazida se puede sintetizar de tal manera que el radical R' contiene una funcion amina libre (-NH2), en particular una funcion amina (-NH2) que se puede acoplar adicionalmente, a traves de EDC/NHS, con la funcion carboxilica de los otros compuestos, tales como aminoacidos y/o derivados de aminoacidos.
C. Formacion de una oxima
En otra realizacion particular, se puede obtener un aminofucoidan a traves de la formacion de una oxima tal como en Novoa-Carballal & Miiller (Novoa-Carballal y Muller, 2012, "Synthesis of polysaccharide-b-PEG block copolymers by oxime click", Chem Comm, 48 pags. 3781-3783).
Dicha realizacion particular se basa en la llamada "quimica click", que permite condensar en una sola etapa el extremo reductor (aldehido) de un polisacarido tal como fucoidan, con un derivado de R-O-NH2.
De acuerdo con dicha realizacion, el derivado de R-O-NH2 debe prepararse a partir de un precursor R-OH de acuerdo con la sintesis organica compleja (reaccion de Mitsonobu). La oxima se forma eficientemente a pH 3 y a 45°C. En esas condiciones, el fucoidan, que es sensible a un pH inferior a 5, tendria una tendencia a degradarse rapidamente.
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Por lo tanto, todos los compuestos que son aminoacidos, tales como lisinas, polilisinas y derivados de lisina que poseen una funcion acido carboxilico, y que, ademas, son solubles en agua, pueden considerarse para esta estrategia.
Tambien se puede considerar la sintesis de aminofucoidanos que comprenden dendrimeros de lisina. De acuerdo con esa realizacion particular, dichos dendrimeros deben sintetizarse por separado y antes de la etapa de acoplamiento al fucoidan.
Preferiblemente, cuando se consideran poliaminoacidos, tales como oligolisinas y/o dendrimeros, se debe tener cuidado para evitar la formacion de interpolielectrolitos, lo que puede resultar en el plegamiento de la cadena peptidica cationica en el polisacarido anionico (en ese caso, el aminofucoidan), y que puede reducir la solubilidad en agua de dicho aminofucoidan.
Por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a aminofucoidanos que pueden obtenerse de acuerdo con dichos metodos, en particular compuestos de formula (I), (I’), (II’), (III’), (IV’), (V’) y (VI').
Los fucoidanos y aminofucoidanos, de acuerdo con la invencion, pueden caracterizarse, ademas, por sus propiedades ffsico-qufmicas, en particular su grado de aminacion, su grado o porcentaje en masa de fucosa, su grado o porcentaje en masa de acido uronico o glucuronico, su grado o porcentaje en masa de sulfatacion y su peso molecular.
Dichas propiedades deben entenderse como valores medios. Los porcentajes en masa se pueden expresar en %, asi como en g/100 g. Por lo tanto, el experto en la tecnica tambien considerara las preparaciones de fucoidanos y aminofucoidanos como mezclas o preparaciones heterogeneas, que no necesariamente comprenden un solo tipo de fucoidan o aminofucoidan, sino un conjunto de compuestos relacionados entre si de acuerdo con las propiedades ffsico-qufmicas medias.
De acuerdo con una realizacion particular, dichos aminofucoidanos tienen un grado de aminacion que oscila entre aproximadamente 0,1 NH2/mol y aproximadamente 3 NH2/mol, en particular que oscila entre aproximadamente 1 NH2/mol y aproximadamente 3 NH2/mol, y preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2 NH2/mol.
De acuerdo con una realizacion particular, dichos fucoidanos tienen un porcentaje en masa de fucosa que oscila entre aproximadamente 30% y aproximadamente 60%, en particular que oscila entre aproximadamente 30% y aproximadamente 50%.
De acuerdo con una realizacion particular, dichos fucoidanos tienen un porcentaje en masa de acido glucuronico que oscila entre aproximadamente 5% y aproximadamente 40%, en particular que oscila entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30%.
De acuerdo con una realizacion particular, dichos fucoidanos tienen un porcentaje en masa de sulfato que oscila entre 10% y aproximadamente 45%, en particular que oscila entre aproximadamente 15% y aproximadamente 40%.
De acuerdo con una realizacion particular, dichos fucoidanos tienen un peso molecular medio que es inferior a 100 000 Da, y preferiblemente inferior a 20 000 Da. De acuerdo con una realizacion preferida, dichos fucoidanos tienen un peso molecular medio que oscila entre 2000 Da y 15 000 Da.
Composiciones farmaceuticas
Como ya se menciono anteriormente, la invencion se refiere a un metodo para preparar un t-PA vectorizado, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un vector de la invencion,
b) proporcionar t-PA, y
c) poner en contacto el vector proporcionado en la etapa a) con el t-PA proporcionado en la etapa b), con el fin de obtener complejos entre dicho vector y t-PA.
Por lo tanto, la invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende complejos de un vector de acuerdo con la invencion con t-PA.
Ventajosamente, una composicion farmaceutica que comprende dichos complejos se puede obtener de acuerdo con dicho metodo.
De acuerdo con una realizacion particular, la invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende una relacion molar de vector a t-PA que oscila entre 40:1 y 1:1; preferiblemente entre 20:1 y 3:1, y lo mas preferiblemente entre 15:1 y 5:1.
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De acuerdo con una realizacion preferida, la relacion molar de vector a t-PA en dicha composicion farmaceutica es de aproximadamente 10:1 cuando el vector es un mono-amina fucoidan, y de aproximadamente 5:1 cuando el vector es un poli-amina fucoidan. Alternativamente, la invencion se refiere a un kit que comprende:
- un primer recipiente que comprende un vector de la invencion, y
- un segundo recipiente que comprende t-PA.
Un «recipiente» adecuado para la invencion puede ser cualquier recipiente farmaceutico conocido en la tecnica, preferiblemente un recipiente esteril, que sea directamente adecuado para inyeccion, o que pueda ser adecuado para preparar una muestra inyectable, solo o cuando se mezcle con un segundo recipiente de acuerdo con la invencion. Ejemplos de dichos recipientes pueden seleccionarse en un grupo que comprende pildoras, comprimidos, capsulas, frascos, jeringas, agujas, cateteres, bombas de infusion, ampollas y, mas generalmente, cualquier pequeno frasco sellado que se puede utilizar para contener y conservar una muestra. Dichos recipientes pueden estar hechos de vidrio o plastico, tal como polipropileno.
Ventajosamente, dichos recipientes se mezclan posteriormente con el fin de conseguir una composicion farmaceutica especifica de acuerdo con la invencion.
De acuerdo con esta realizacion particular, el experto en la tecnica puede ajustar facilmente la cantidad de vector y t- PA en cada uno de los recipientes, con el fin de alcanzar una relacion especifica de vector a t-PA.
A menudo, las composiciones farmaceuticas se administraran mediante inyeccion. Para la administracion mediante inyeccion, las composiciones farmaceuticas de agentes tromboliticos pueden formularse como soluciones acuosas o no acuosas esteriles o, alternativamente, como polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones inyectables esteriles. Dichas composiciones farmaceuticas deben ser estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento, y deben conservarse contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.
La invencion se refiere, ademas, a un recipiente que comprende un vector de la invencion, y t-PA. Ventajosamente, cuando dicho vector y dicho t-PA se formulan en una forma anhidra, tal como polvos esteriles, la composicion farmaceutica se puede reconstituir entonces en un solo recipiente con una composicion adecuada y sin ninguna etapa de mezcladura adicional.
Soportes farmaceuticamente aceptables para administracion mediante inyeccion son disolventes o medios de dispersion, tales como soluciones acuosas (p. ej., solucion de Hank, soluciones alcoholicas/acuosas o soluciones salinas) y soportes no acuosos (p. ej., propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo). Composiciones farmaceuticas inyectables tambien pueden contener vehiculos parenterales (tales como cloruro de sodio y dextrosa de Ringer), y/o vehiculos intravenosos (tales como reponedores de liquidos y nutrientes); asi como otros aditivos y excipientes no toxicos, farmaceuticamente aceptables, que incluyen sales, tampones y conservantes, tales como agentes antibacterianos y antifungicos (p. ej., parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares). La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr anadiendo agentes que pueden retrasar la absorcion (p. ej., monoestearato de aluminio y gelatina). Los expertos en la tecnica pueden determinar facilmente el pH y la concentracion de las composiciones.
De acuerdo con una realizacion preferida, el pH de una composicion que comprende un aminofucoidan debe estar comprendido entre 5 y 8.
Soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando el o los compuestos activos y otros ingredientes en la cantidad requerida de un disolvente apropiado, y luego esterilizando la mezcla resultante, por ejemplo mediante filtracion o irradiacion. Los metodos de fabricacion de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles son bien conocidos en la tecnica e incluyen tecnicas de secado al vacio y secado por congelacion.
En general, la dosis de un t-PA vectorizado (o composicion farmaceutica del mismo) variara dependiendo de consideraciones tales como la edad, el sexo y el peso del paciente, asi como la afeccion patologica particular que se sospeche afectara al paciente, la extension del enfermedad o la o las zonas del cuerpo a examinar. Factores tales como contraindicaciones, terapias y otras variables tambien deben tenerse en cuenta para ajustar la dosis del agente a administrar. Esto, sin embargo, puede lograrse facilmente por un medico entrenado. En general, una dosis diaria adecuada de un t-PA vectorizado (o composicion farmaceutica del mismo) corresponde a la cantidad mas baja de t-PA (o composicion farmaceutica) que es suficiente para permitir la prevencion o el tratamiento del trombo en un sujeto.
La dosis diaria para la administracion de t-PA, tal como t-PA vectorizado y no vectorizado, se puede expresar en molaridad o como una masa. Cuando una dosis diaria se expresa como una masa de t-PA administrado, debe entenderse en terminos de "dosis equivalente de t-PA".
De acuerdo con la invencion, una "dosis equivalente de t-PA" significa la masa de t-PA vectorizado que se administraria con relacion a un t-PA no vectorizado, si las dos moleculas tuvieran el mismo peso molecular. Por ejemplo, el experto en la tecnica puede calcular facilmente dicha conversion al considerar el peso molecular medio de un t-PA de referencia (es decir, t-PA no vectorizado) y el peso molecular medio de un t-PA vectorizado de 5 acuerdo con la invencion.
Para minimizar esta dosis, se prefiere que la administracion sea intravenosa. La administracion intravascular puede ser proximal (es decir, inyeccion intra-coagulo) o distal al sitio diana (intravenosa). Ventajosamente, el t-PA vectorizado (o composicion farmaceutica del mismo) es adecuado para administracion distal.
Una dosis diaria puede depender de muchos factores, tales como el peso y la edad del paciente, la localizacion del 10 coagulo de sangre seleccionado y la frecuencia o el modo de administracion, es decir, proximal o distal. Por ejemplo, la inyeccion intra-coagulo de t-PA recombinante se ha propuesto para el tratamiento de la trombosis venosa profunda aguda tal como se ensena en Chang et al. (Chang et al., 2011, Low Dose Once Daily, Intraclot Injections of Alteplase for Treatment of Acute Deep Venous Thrombosis, J. Vasc Interv Radiol., 22(8):1107-1116). De acuerdo con dicho protocolo, una inyeccion intra-coagulo puede ser eficiente con una dosis total media de 7,1 mg de t-PA por 15 paciente, con una media de 2,1 tratamientos o dias de terapia.
Para el infarto agudo de miocardio (MI), el t-PA vectorizado puede administrarse, por ejemplo, como una infusion acelerada (durante 1-1/2 horas) o como una infusion de 3 horas.
En otras realizaciones tal como para tratar la apoplejia isquemica aguda, la dosis total puede alcanzar, por ejemplo, 90 mg.
20 Por lo tanto, la dosis diaria dependera principalmente del peso del paciente y de la duracion de la inyeccion. Para comparacion, el t-PA no vectorizado se puede administrar de forma periferica a un paciente de menos de 67 kg y para tratar el MI agudo de 1 a 1 h 30 en bolo a lo largo de 1-2 minutos (15 mg), y luego se puede administrar (0,75 mg/kg) durante 30 minutos a una dosis de hasta 50 mg; en una ultima etapa, se inyectan 0,5 mg/kg de t-PA a lo largo de los siguientes 60 minutos, y preferiblemente en una dosis que no exceda de 35 mg. Por consiguiente, la 25 dosis final de t-PA que se puede inyectar puede alcanzar, por ejemplo, 100 mg. Ventajosamente, la vectorizacion de t-PA con aminofucoidanos es susceptible de superar los problemas relacionados con la administracion de dosis altas al reducir la dosis diaria minima y, por lo tanto, en realizaciones particulares, puede permitir al menos una disminucion de 1 log, en realizaciones particulares al menos una disminucion de 2 log, en terminos de dosis diaria requerida.
30 En realizaciones particulares, el t-PA vectorizado puede administrarse como una inyeccion intra-coagulo para tratar o prevenir la trombosis venosa profunda aguda, a una dosis diaria minima igual o inferior a 7 mg, en particular igual o inferior a 5 mg, en particular igual o inferior a 2 mg, en particular igual o inferior a 1 mg para la trombolisis de coagulos eficiente.
En otras realizaciones, el t-PA vectorizado se puede administrar a una dosis diaria normal o incrementada sin 35 experimentar sintomas secundarios que habitualmente se asocian con la inyeccion de t-PA. Alternativamente, dichos sintomas pueden reducirse o prevenirse, en comparacion con un t-PA no vectorizado, cuando la dosis diaria se mantiene constante.
En realizaciones particulares, el t-PA vectorizado puede administrarse asi a una dosis diaria mas alta. Ventajosamente, dicha dosis diaria puede ser igual o superior a 100 mg, igual o superior a 150 mg. En realizaciones 40 particulares, la dosis diaria puede ser igual o superior a 200 mg o 300 mg.
El experto en la tecnica es capaz de modular dichas dosis diarias de acuerdo con las necesidades del paciente, y dependiendo de la afeccion a tratar.
EJEMPLOS
Los fucoidanos de partida que se utilizan en los siguientes ejemplos se obtuvieron de fuentes comerciales que se 45 describen a continuacion:
1) Fucoidan de la compania Sigma-Aldrich (EE.UU.): Fucoidan crudo (de Fucus vesiculosus) ref F5631, numero CAS 9072-19-9. MM = 20.000-200.000 g/mol.
2) Fucoidan de la compania Algues-et-Mer (Francia): Asphyscient® (de Ascophyllum nodosum), a pedido, MM = 5.000-10.000 g/mol.
50 3) Fucoidan de Kraeber GmbH (Alemania): a pedido, LMWF, 8.500 g / mol, HMWF, 600.000 g/mol, de diferentes
algas pardas.
Ejemplo 1:
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Aminacion del grupo hidroxilo de un fucoidan.
El fucoidan (500 mg, 1 mmol de 5 kDa) se disuelve en 15 mL de agua y se mezcla con 5 mL de NaOH 2,5 M y 0,1 mL de epiclorhidrina (1,3 mmol). La mezcla se agita a 40°C durante 2 h y se dializa frente a agua a 25°C durante 2 dfas. Despues de liofilizar el dializado, el residuo se disuelve en 3 mL de amonfaco al 30% (v/v) en agua y se amina a 40°C durante 90 min. La mezcla de reaccion se dializa frente a agua y se liofiliza para dar un fucoidan aminado.
De acuerdo con dicho protocolo, la cantidad de aminas primarias depende de la cantidad de epiclorhidrina que se introduce en la reaccion. Para una cantidad minima de epiclorhidrina, que puede corresponder a 0,1 mL de epiclorhidrina, el numero medio de aminas primarias que se introducen oscila entre 1 y 10 aminas primarias por cadena de fucoidan.
La reaccion se puede describir como sigue:
imagen13
en donde Fuco significa fucoidan.
Sin embargo, el principal inconveniente de dicha reaccion es que no es posible controlar con precision donde se producira la sustitucion dentro de la cadena, ya que dicha reaccion puede ocurrir en cualquiera de las funciones de hidroxilo (-OH) nacidas por el fucoidan, en particular la fucosa.
Por lo tanto, dicho metodo no es adecuado para fijar como objetivo el extremo reductor de dicho fucoidan.
Ejemplo 2:
Construccion de la molecula o el sistema bipolar utilizando una estrategia de dos etapas.
La etapa qufmica principal es el acoplamiento del extremo reductor de fucoidan con moleculas portadoras de aminas primarias, es decir, lisina, oligolisina o mimeticos de lisina y la reduccion de la imina en aminas secundarias tal como se describe ampliamente en los libros de qufmica organica basica. Dependiendo del tipo de moleculas aminadas (es decir, DAP y DETA-fuco), aquf se ilustran dos estrategias diferentes.
Estrategia 1:
En una primera etapa, Fucoidan (F) se enlaza a diaminopropano (NH2-(CH2)3-NH2), lo que conduce a F-NH-(CH2)3- NH2 (es decir, F-NH2). Por lo tanto, dicho aminofucoidan se define como un DAP-fuco.
En un tubo de vidrio reforzado, disolver 500 mg de fucoidan seco en 5,4 mL de una solucion de diaminopropano 1,5 M en agua bidestilada. El tubo se cierra y se calienta durante 3 horas a 90°C. Despues de enfriar, se anaden 1,4 mL de dimetilborano 3M recien preparado en acido acetico glacial, y la mezcla se calienta durante 3 h a 90°C.
La solucion se neutraliza, se dializa (5 x 1 L con NaCl 1M en tampon carbonato 45 mM, pH 9,6; 5 x 1 L con NaCl 0,5 M en agua/etanol 80/20 (v:v); 5 x 1 L en agua bidestilada; en una camara de dialisis con un corte de 3000 Da y se liofiliza. F-NH2 se obtiene en forma de un solido blanco esponjoso con un rendimiento del 60% (p/p).
Posteriormente, la lisina, la oligolisina (2-4 lisinas), el acido epsilon-aminocaproico o el acido tranexamico, a los que se aludira en esta memoria como "derivados de aminoacidos", se enlazan opcionalmente a F-NH2 en una segunda etapa, tal como se muestra a continuacion.
A una solucion de 5 mL de derivado de aminoacido 10,4 mM en agua bi-destilada se anaden sucesivamente 20 mg de EDC y 12 mg de NHS, a temperatura ambiente. La mezcla se mantiene bajo agitacion durante 15 minutos antes de la adicion de 76,4 mg de F-NH2.
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Despues de 2 h bajo agitacion a temperatura ambiente, la solucion se dializa (5 x 1 L con NaCI 1M en tampon carbonato 45 mM pH 9,6; 5 x 1 L con NaCl 0,5 M en agua/etanol 80/20 (v:v); 5 x 1 L en agua bidestilada; corte 3000 D) y se liofiliza).
Estrategia 2:
Fucoidan (F) se enlaza directamente a la dietilentriamina (DETA = NH2-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2) tal como a continuacion. Por lo tanto, el aminofucoidan que se sintetiza se define como un DETA-fuco.
En un tubo de vidrio reforzado, disolver 500 mg de fucoidan seco en 5,4 mL de solucion DETA 1,5 bidestilada. El tubo se cierra y se calienta durante 3 h a 90°C. Despues de enfriar, se anaden dimetilborano 3M recien preparado en acido acetico glacial, y la mezcla se calienta durante 3 h a 90°C.
La solucion se neutraliza y se dializa (5 x 1 L con NaCl 1M en tampon de carbonato 45 mM pH 9,6; 5 x 1 0,5 M en agua/etanol 80/20 (v:v); 5 x 1 L en agua bidestilada; corte 3000 D) y se liofiliza).
Despues de ello, la lisina, la oligolisina (2-4 lisinas), el acido epsilon-aminocaproico o el acido tranexamico se enlazan a F-NH2 tal como se muestra en la estrategia 1.
A una solucion de 5 mL de derivado de aminoacido 10.4 mM en agua bidestilada se anaden sucesivamente 20 mg de EDC y 12 mg de NHS, a temperatura ambiente. La mezcla se mantiene bajo agitacion durante 15 min antes de la adicion de 76,4 mg de F-NH2.
Despues de 2 h bajo agitacion a temperatura ambiente, la solucion se dializa (5 x 1 L con NaCl 1M en tampon carbonato 45 mM pH 9,6; 5 x 1 L con NaCl 0,5 M en agua/etanol 80/20 (v:v); 5 x 1 L en agua bidestilada; corte 3000 D) y se liofiliza).
Conclusion: se han obtenido y testado varias aminas y derivados de aminoacidos, tales como, por ejemplo, fuco- diaminopropano (DAP-fuco), fuco-dietilentriamina (DETA-fuco), acido fuco-tranexamico (tran-fuco), fuco- mono/polilisina (Lys-fuco, diLys-fuco, triLys-fuco ...).
Ejemplo 3:
Propiedades ffsico-qufmicas de fucoidanos y aminofucoidanos.
A. Material y Metodos.
Cuantificacion de la aminacion
se muestra
M en agua 1,4 mL de
L con NaCl
La cantidad de amina primaria se determino con un ensayo colorimetrico de ftalaldehido utilizando bromopropilamina como patron siguiendo el trabajo de Roth (M. Roth, 1971 "Fluorescence reaction for amino acids." Analytical Chemistry, 43, 880-882).
Cuantificacion de fucosa
La cuantificacion de fucosa se ha determinado de acuerdo con Dische (Z. Dische, 1955, New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 313-358).
Cuantificacion del acido glucuronico
La cuantificacion del acido glucuronico se ha determinado de acuerdo con Bitter y Muir (T. Bitter y H.M. Muir, 1962, A modified uronic acid carbazole reaction. Anal. Biochem. 4 330-334)
Cuantificacion del sulfato
La cuantificacion del sulfato se puede determinar de acuerdo con los protocolos descritos en Bachelet et al. (Bachelet et al, 2009, Affinity of low molecular weight fucoidan for P-selectin triggers its binding to activated human platelets. Biochim Biophys Acta., 1790(2) 141-146), adaptado de Gustafsson (L. Gustafsson, 1960, Determination of ultramicro amounts of sulphate as methylene blue--II: The reduction, Talanta 4, 236).
Los sulfatos se reducen en forma de sulfuros de hidrogeno utilizando acidos yodhidrico e hipofosforoso en solucion de acido acetico; luego se complejan con Zn2+ y se deja que reaccionen con una diamina aromatica. La formacion de azul de metileno se cuantifica con absorcion a 670 y 744 nm.
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Analisis de la masa molecular.
El analisis de la masa molecular se puede determinar utilizando la tecnica MALLS (Multi Dispersion de luz laser en angulo). En resumen, se carga una columna de cromatograffa de filtracion en gel (GMPWxl de TSKgel), equilibrada en tampon Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, azida sodica al 0,02%), a 0,5 mL/min. (Bomba HPLC Dionex Ultimate 3000). La senal se detecta ademas utilizando un detector de mdice de refraccion (Iota2, Precison Instrument) y un detector de dispersion de la luz (TREOS, Wyatt).
Analisis del espectro infrarroio (IR)
Se registra un espectro IR utilizando la espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier en un aparato Nicolet avatar, utilizando el paquete de programas Omnic (Nicolet). La muestra se prepara en bromuro de potasio (KBr) en el intervalo de 2% en peso de producto liofilizado y se registra con 32 exploraciones. El espectro de KBr solo se registra en condiciones similares y se resta automaticamente.
Analisis de 1H-RMN
Se registro un espectro de 1H en un Bruker 500 Avance III de RMN (sonda: 5 mm PAQXI 1H/X) en disolvente D20 (99,9%) despues de 3 liofilizaciones: TD 32k; 16 exploraciones; SW: 10 ppm/500 Hz; P90°: 9,5 ps; Temperatura 300 K; Dl: 1 s.
B. Resultados.
Las propiedades ffsico-qufmicas de un conjunto de fucoidanos y aminofucoidanos de acuerdo con la invencion se han medido y resumido en la siguiente tabla:
Aminacion (NH2/mol PS) Fucosa (g/100g) Acido glucuronico (g/100g) Sulfato (g/100g) PM (*) (g/mol)
Fucoidan
- 30,2 ± 4,1 19,5 ± 5,2 17,8 ± 2,4 5000
Fucoidan-DAP
1,05 ± 0,01 49,3 ± 4,6 25,6 ± 2,1 25,9 ± 3,8 10000
Fucoidan-DAP-acido aminocaproico
0,32 ± 0,01 35,7 ± 13,2 8,2 ± 1,0 32 ± 2,1 10000
Fucoidan-DAP-acido tranexamico
0,61 ± 0,02 34,9 ± 11,8 7,9 ± 1,8 30,6 ± 3,4 10000
Fucoidan-DETA
1,08 ± 0,04 34,1 ± 13,3 13,8 ± 1,3 32,3 ± 1,1 10000
Fucoidan-DAP-lisina
1,11 ± 0,03 31,2 ± 7,2 14,7 ± 1,9 30,2 ± 4,4 10000
Fucoidan-DAP-dilisina
1,97 ± 0,04 53,4 ± 6,6 22,1 ± 1,9 18,6 ± 0,8 10000
Fucoidan-DAP-trilisina
2,45 ± 0,01 45,4 ± 4,1 33,9 ± 3,5 21,5 ± 0,8 10000
Fucoidan-DAP-tetralisina
2,38 ± 0,03 43,6 ± 4,6 20,7 ± 6,6 13,6 ± 0,7 10000
PS = polisacarido
(*) = peso molecular medio ponderado (mas o menos 10%)
Cada uno de los analisis se repitio de tres a ocho veces.
Los espectros IR de los compuestos fucoidan-DAP y fuco-DAP-dilisina/trilisina/tetralisina resaltan los espectros superponibles que corresponden a un polisacarido sulfatado, que comprende un pico de sulfato caracterfstico de 1200 cm-1. La ausencia de diferencias significativas entre el DAP aminado y el fucoidan aminado con lisina demuestra que las condiciones de acoplamiento entre oligolisinas (di-, tri- y tetra-lisinas) no alteran la estructura de dicho fucoidan. Una banda vibrante a 1540 cm-1 es caracterfstica de un enlace amida (CO-NH) entre el polisacarido y las oligo-lisinas, y las propias lisinas.
Como complemento de la espectroscopia IR, los perfiles de RMN de aminofucoidanos y las correspondientes preparaciones de fucoidan confirman que las estructuras de fucoidan se conservan despues de la aminacion.
Ejemplo 4:
Evaluacion farmacologica in vitro de las construcciones moleculares.
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A. Material y Metodos
Formation de Coagulos y Fibrinolisis Ex Vivo
Plasma rico y pobre en plaquetas (PRP y PPP) se obtuvieron a partir de sangre citratada despues de dos etapas de centrifugacion: a 120 g durante 15 minutos, seguido de una segunda etapa de centrifugacion a 1200 g durante 12 min. El PRP se ajusto a 3 x 108 plaquetas por mL con plasma pobre en plaquetas (PPP) y se complemento con 75 pg/mL de isotiocianato de fluoresceina-fibrinogeno. La formacion de coagulos se indujo mediante la adicion de 10 mmol/L de CaCl2 en tubos de vidrio y la incubacion durante 1 hora a 37°C. Despues de la retraccion, los coagulos se lavaron en tampon de Hank (Sigma), se secaron rapidamente en un papel absorbente y se pesaron. Para evaluar la fibrinolisis, se incubaron coagulos de PRP o PPP en un tampon de Hanks que contenia los complejos vectorizados de t-PA (correspondientes a 10 UI de t-PA, o 1,72 pg/mL) durante 1 h a temperatura ambiente. Los coagulos se transfirieron a un nuevo eppendorf que contenia 500 pl de tampon de Hank complementado con 1 pM de plasminogeno humano. La cinetica de la fibrinolisis se evaluo midiendo la liberacion de fluorescencia del coagulo al sobrenadante con un espectrofluorometro (485/520 nm). Despues de 17 horas, los coagulos se volvieron a pesar para calcular la perdida de peso correspondiente a una fibrinolisis total.
Los aminofucoidanos testados en este experimento se han preparado de acuerdo con la estrategia 1 (Tranexamic- fuco, dilisina- y trilisina-fucos) y la estrategia 2 (DETA-fuco) tal como se describe en el ejemplo 2.
Los aminofucoidanos se utilizaron en una relacion molecular variable a t-PA (10 UI (correspondiente a 1,72 pg/ml): la relacion de 1/10 se utilizo para mono-amina fucoidanos y de 1/5 para poli-amina fucoidanos. Los criterios de evaluacion fueron la cinetica de lisis inicial (aparicion de fluorescencia en el sobrenadante) y la perdida de peso final del trombo en la incubacion a 17H/37°C.
t-PA vectorizado con aminofucoidan
El complejo de una sola cadena recombinante t-PA (American diagnostica) con aminofucoidanos se formo mezclando 1 mol de t-PA con 10 moles de aminofucoidanos en solucion salina tamponada con fosfato complementada con albumina de suero humano (HSA) al 0,1% y 0,01% de Tween 20 durante 2 horas a 4°C e inmediatamente utilizado para la lisis de coagulos o almacenado a -80°C para un uso futuro. Se han hecho otras preparaciones mediante la adicion de cantidades crecientes de aminofucoidanos, de hasta 10 moles.
El t-PA recombinante de cadena sencilla es el producto de secrecion de la linea celular de ovario de hamster chino, que se habia transfectado con el ADNc para t-PA humano obtenido de una linea celular de melanoma humano (Producto N° 173 de American diagnostic).
Caracteristicas de la preparacion de t-PA recombinante de cadena sencilla:
- el peso molecular es de aproximadamente 70 000 Dalton,
- la pureza es > 98%,
- la actividad especifica es de aproximadamente 580 000 Ul/mg.
Se reconstituyeron 50 pg de este patron de proteina liofilizada t-PA exenta de soporte con 100 pl de agua desionizada filtrada de 0,22 pm y se diluyeron a una solucion de 10 pg/ml en solucion salina tamponada con fosfato.
Los experimentos de cinetica de lisis se han llevado a cabo tal como se describe en Jones et al. (Jones CI, Payne DA, Hayes PD, Naylor AR, Bell PR, Thomson MM, Goodall AH. The antithrombotic effect of dextran-40 in man is due to enhanced fibrinolysis in vivo. J Vasc Surg. 2008; 48: 715-722).
La medicion del peso del trombo se ha llevado a cabo tal como se describe en Boulaftali et al. (Boulaftali Y, Ho Tin Noe B, Pena A, Loyau S, Venisse L, Francois D, Richard B, Arocas V, Collet JP, Jandrot-Perrus M, Bouton MC. Platelet Protease Nexin-1, a Serpin that Strongly Influences Fibrinolysis and Thrombolysis. Circulation. 2011;123:1326-1334).
Los experimentos de tromboelastografia se han llevado a cabo en un tromboelastografo rotativo (Rotem®) tal como se describe en Boulaftali et al. (Boulaftali Y, Ho Tin Noe B, Pena A, Loyau S, Venisse L, Francois D, Richard B, Arocas V, Collet JP, Jandrot-Perrus M, Bouton MC. PLatelet Protease Nexin-1, a Serpin that Strongly Influences Fibrinolysis and Thrombolysis. Circulation. 2011;123:1326-1334) y Mallet et al. (Mallet SV, Cox DJA. Thromboelastograph®Analysis. British J of anaest. 1992;69:307-313).
B. Resultados
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En una primera etapa, dado que el fucoidan se une a P-selectina expresada en plaquetas activadas y agregadas, los autores de la invencion evaluaron in vitro la capacidad de los diferentes aminofucoidanos de unirse a trombos ricos en plaquetas y pobres en plaquetas utilizando fibrinogeno fluorescente (75 pg de Fg-FITC/ml de plasma).
Primero, el t-PA solo fue mas activo en la lisis inicial y final del trombo pobre en plaquetas que en el trombo rico en plaquetas, lo que demuestra las actividades antifibrinoliticas de las plaquetas. Por lo tanto, no hubo diferencias entre el t-PA solo y el t-PA vectorizado por aminofucoidan en la lisis de los trombos pobres en plaquetas, incluyendo la perdida de peso de los trombos a las 17 H, que ya es maxima con el t-PA solo (97%). En contraposicion, el t-PA vectorizado con aminofucoidan fue capaz de aumentar significativamente la lisis inicial de los trombos ricos en plaquetas en comparacion con el t-PA solo (+ 50%, p <0,01). Entre los aminofucoidanos testados, Tranexamic-fuco, DAP-fuco y dilisina-fuco eran los mas eficientes para aumentar la tasa inicial de la lisis del trombo rico en plaquetas.
En paralelo, los aminofucoidanos y el t-PA vectorizado tambien aumentaron la perdida de peso del trombo rico en plaquetas en comparacion con el t-PA solo, 65% frente a 30%, respectivamente (p <0.01) (figura 1). Dilisina- fucoidan fue uno de los mas eficientes.
En una tercera serie de experimentos in vitro, la capacidad de los aminofucoidanos de acelerar la lisis de un trombo realizado en sangre total, incluidos los globulos rojos, se ha testado con tromboelastografia rotativa (Rotem®). En este experimento, el t-PA vectorizado con dilisina-fucoidin, en una relacion (t-PA / fuco) de 1/5 o 1/10 aumento la lisis del trombo a 75% en comparacion con t-PA solo (55%). En este experimento, estaba presente el plasma PAI-1.
Conclusion: Estos ensayos no son capaces de evaluar la capacidad de los amino-fucoidanos de vectorizar el t-PA al trombo in vivo, ya que en los sistemas in vitro, los amino-fucoidanos fijan como objetivo solo por difusion y en ausencia de PAI-1 (excepto para experimentos de tromboelastografia). Sin embargo, estos experimentos farmacologicos in vitro demuestran que los amino-fucoidanos no limitan significativamente la accesibilidad de t-PA al trombo (dos ultimas columnas de la derecha). Ademas, demuestran que los amino-fucoidanos como vectores para t- PA facilitan significativamente la lisis del trombo por parte de t-PA in vitro, y que este efecto depende de la presencia de plaquetas activadas/agregadas.
Ejemplo 5:
Validacion in vivo de la vectorizacion de t-PA por amino-fucoidanos: formacion de imagenes intravitales en tiempo real de formacion de trombos y trombolisis.
A. Material y Metodos
DiLisina-fucoidan testado en este experimento se ha preparado de acuerdo con la estrategia 1 tal como se describe en el ejemplo 2.
El grupo ha publicado recientemente la capacidad de la microscopia intravital para seguir la lisis del trombo in vivo. Por lo tanto, la validacion de la vectorizacion de t-PA por parte de amino-fucoidanos con microscopia intravital se ha llevado a cabo de acuerdo con los protocolos descritos en Boulaftali et al. (Boulaftali et al., 2011, Platelet protease nexin-1, a serpin that strongly influences fibrinolysis and thrombolysis. Circulation; Boulaftali et al., 2012, The mouse dorsal skinfold chamber as a model for the study of thrombolysis by intravital microscopy. Thromb Haemost).
El trombo es inducido por la aplicacion local de oxido de hierro en recipientes expuestos en ratones. t-Pa fluorescente o una mezcla de amino-fucoidanos y t-PA se inyectan por via intravenosa tras la aplicacion local de oxido de hierro. La fluorescencia de t-PA y la lisis del trombo se siguieron mediante transiluminacion intravital del tejido mesenterico.
Mas precisamente, despues de la anestesia (100 mg/kg de ketamina, 10 mg/kg de xilazina) y laparotomia, se expusieron vasos mesentericos de raton para la induccion de trombosis y la observacion intravital video- microscopica. La lesion vascular se indujo colocando una tira de papel de filtro (1 x 0,5 mm) saturada con FeCl3 al 10% (Sigma, St. Louis, MO) durante 2,30 min. El papel de filtro se retiro despues y la zona expuesta se enjuago con solucion salina, y la formacion de trombos despues de la lesion se examino en tiempo real mediante la vigilancia de la acumulacion de plaquetas y leucocitos marcados con rodamina 6G (3 mg de rodamina 6G/kg raton, Sigma, St. Louis, MO) y de Alexa 647 conjugado de fibrinogeno humano (10 mg/kg de raton, Invitrogen Life Technologies, Paisley, Reino Unido) utilizando un microscopio de fluorescencia (Axio Observer, Carl Zeiss Microimaging) con un objetivo 5X conectado a una camara CCD (Hamamatsu). Todos los marcadores fluorescentes se administraron por via intravenosa en el seno retro-orbitario antes de la induccion de la lesion vascular. La deposicion de plaquetas y el crecimiento del trombo se vigilaron durante 15 minutos despues de la lesion y luego se inyecto por via intravenosa t- PA ± DiLisina-fucoidan para la trombolisis de los trombos formados parcialmente oclusivos. La evolucion del trombo se examino en tiempo real durante al menos 1 hora despues del tratamiento.
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B. Resultados
1 hora despues de la lesion inducida por FeCl3 (~ 45 min despues del tratamiento), se produjo una trombosis oclusiva de vasos lesionados en los 3 ratones tratados con t-PA fluorescente solo. En contraposicion, la perfusion del vaso se mantuvo en todos los ratones tratados con t-PA combinada con DiLisina-fucoidan. Ademas, en estos ratones, se observo una reduccion en el tamano del trombo despues del tratamiento (Figura 2).
Conclusion: Los experimentos in vivo demuestran el efecto beneficioso de los amino-fucoidanos como vectores en la lisis de trombos. En particular, estos experimentos demuestran que los amino-fucoidanos potencian la actividad trombolitica in vivo de t-PA inyectado perifericamente.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Institut national de la sante et de la recherche medicale
<120> como un vector para la fibrinolisis en enfermedades tromboticas
<130> PR99833
<160> 1
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1
< 211> 562
< 212> PRT
< 213> Homo sapiens
<220>
< 221>FUENTE
< 222> 1 ..562
< 223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens"

Claims (18)

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REIVINDICACIONES
1. Un vector que tiene propiedad de union a t-PA que consiste en un resto fucoidan, que esta aminado por un enlace covalente entre el extremo reductor de dicho resto fucoidan y un grupo qmmico que comprende uno o mas grupos amino.
2. El vector de acuerdo con la reivindicacion precedente, en donde dicho vector es un compuesto de formula (I):
FUCO-C1-[NH]y-[L]z-[NH]x-R1 (I),
en donde
- "FUCO" significa un resto fucoidan, que opcionalmente contiene uno o mas grupos amina primaria enlazados covalentemente a la cadena de fucoidan,
- x, y y z son numeros enteros independientes que significan 0 o 1,
- C1 es el atomo de carbono en la posicion 1 de la unidad de sacarido ubicada en el extremo reductor del resto fucoidan,
- L es un enlazador, y
- R1 es un grupo qmmico que comprende uno o mas grupos amino, o que consiste en un grupo amino,
- L y R1 son independientes y pueden ser iguales o diferentes.
3. El vector de acuerdo con la reivindicacion precedente, en donde dicho vector es un compuesto de formula (I), en donde:
- R1 es un grupo qmmico que comprende o consiste en una cadena hidrocarbonada terminada en amina primaria, lineal o ramificada; un aminoacido; un poliaminoacido; y/o un grupo qmmico seleccionado en la lista que comprende,
0 que consiste en: lisina, polilisina, arginina, poliarginina, ornitina, poliornitina, acido Y-aminobutrnco, poliaminas, polieteraminas, o cualquier otro grupo qmmico que comprenda un grupo guanidina o una amina primaria,
en donde:
- dicho grupo qmmico esta interrumpido opcionalmente por uno o mas anillos de hidrocarburos no aromaticos que tienen 5 o 6 atomos de carbono,
- dicho grupo qmmico esta interrumpido opcionalmente por uno o mas heteroatomos,
- dicho grupo qmmico contiene opcionalmente uno o mas grupos amida y/o uno o mas grupos ester,
- dicho grupo qmmico esta opcionalmente sustituido con uno o mas grupos amina,
- dicho grupo qmmico esta opcionalmente interrumpido y/o sustituido con uno o mas grupos, identicos o diferentes, y seleccionados de: (a) una cadena de hidrocarburos lineal o ramificada, (b) un aminoacido o un poliaminoacido, (c) una poliamina o una polieteramina, (d) un acido Y-aminobutfrico, (e) un grupo guanidina y (f) una amina primaria.
4. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho fucoidan comprende, ademas, grupos que contienen amina primaria, enlazados covalentemente a la cadena de fucoidan.
5. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R1 o L esta sustituido con
1 a 4 grupos amina.
6. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde -[NH]x-R1 puede ser de formula (VI) o (VII):
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o
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en donde
- «Lys» es una lisina o un derivado de lisina,
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- x es al menos igual o superior a 1, preferiblemente igual a 2, 3, 4, 5 o 6 y lo mas preferiblemente igual a 2 o 4.
7. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que se selecciona del grupo que consiste en:
imagen3
imagen4
8. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el resto fucoidan tiene un peos molecular medio que es menor que 100 000 Da.
9. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el resto fucoidan esta polisulfatado.
10. Un t-PA vectorizado que comprende complejos de un vector segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes con t-PA.
11. El t-PA vectorizado de acuerdo con la reivindicacion 10, que tiene una relacion molar de vector a t-PA que oscila entre 40:1 y 1:1; preferiblemente entre 20:1 y 3:1, y lo mas preferiblemente entre 15:1 y 5:1.
12. El t-PA vectorizado segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11, para uso como un medicamento.
13. El t-PA vectorizado segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11, para uso como un ingrediente activo para prevenir o tratar un trombo en un sujeto.
14. Un metodo para preparar un t-PA vectorizado, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un vector segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
b) proporcionar t-PA, y
c) poner en contacto el vector proporcionado en la etapa a) con el t-PA proporcionado en la etapa b), con el fin de obtener complejos entre dicho vector y t-PA.
15. Un kit. que comprende:
- un primer recipiente que comprende un vector segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y
- un segundo recipiente que comprende t-PA.
16. Un recipiente que comprende un vector segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y t-PA, en donde dicho vector y dicho t-PA estan en una forma anhidra.
17. Una composicion farmaceutica que comprende complejos de un vector segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con t-PA.
18. Una composicion farmaceutica para la administracion parenteral, que comprende un vector segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
imagen5
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019210414A1 (en) * 2018-05-02 2019-11-07 Arc Medical Devices Inc. Fucan-based compounds and complexes
CN111298133B (zh) * 2020-03-02 2022-04-29 郑州大学 一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法及其应用
KR20210157023A (ko) * 2020-06-19 2021-12-28 대구가톨릭대학교산학협력단 혈전 용해능을 갖는 인공혈관 및 이의 제조방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2648463B1 (fr) 1989-06-14 1993-01-22 Inst Fs Rech Expl Mer Polysaccharides sulfates, agent anticoagulant et agent anticomplementaire obtenus a partir de fucanes d'algues brunes et leur procede d'obtention
FR2738009B1 (fr) 1995-08-24 1997-10-31 Centre Nat Rech Scient Procede d'obtention de polysaccharides sulfates
JP2009535341A (ja) * 2006-04-27 2009-10-01 アビジェン， インコーポレイテッド 血液凝固を軽減するためのフコイダン
FR2937974B1 (fr) * 2008-10-30 2013-01-11 Univ Bordeaux 1 Copolymeres a blocs a base de polysaccharide et de polypeptide, les vesicules constituees de ces copolymeres et leur utilisation
EP3156078B1 (en) * 2009-04-10 2020-03-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fucoidans as ligands for the diagnosis of degenerative pathologies
US20120183475A1 (en) 2009-04-10 2012-07-19 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Fucoidans as Ligands for the Diagnosis of Degenerative Pathologies
KR20120086533A (ko) 2011-01-26 2012-08-03 대구가톨릭대학교산학협력단 미역포자 유래의 혈전용해용 푸코이단

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