JP2009520705A - ヒドロゲルを形成する熱可塑性の中性化されたキトサン組成物、凍結乾燥体、およびこれらを生成する方法 - Google Patents

Abstract

水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物は、５°Ｃより高くない温度でリン酸塩のない透明ヒドロゲルを形成するものであって、１００ｋＤａより小さくない分子量、および、４０から７０％の脱アセチル化度を持つ、水酸基により中性化された、全組成に基づき０．１から５．０ｗ／ｗ％の再アセチル化キトサンと、ポリオス、およびポリオスより導出されるポリオルの中から選択される、全組成に基づき１から３０ｗ／ｗ％の複合化剤と、よりなる。
前記化合物は、注入可能な製剤設計の準備に、有用である。

Description

発明の分野
本発明は、５°Ｃより高い温度で、リン酸塩のない透明なヒドロゲルを形成する、水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン組成物、およびこれを製造する方法に関係する。

さらに、本発明は、本発明の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物を凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥体、およびこれを製造する方法に関係する。

発明の背景
ヒドロゲルは、生物医学的な応用に魅力的である。
さらに、温度とともにその粘性を増大させる特定の能力を発揮するヒドロゲルは、これらは、“熱感応性の／熱応答性の／擬似熱可塑性の／熱ゲル化するヒドロゲル”とも呼ばれるが、応用の場所における増大された定住時間と結合した促進された応用を持つことが証明されており、それゆえ、薬物送達、あるいは、細胞組織増大のために、有利に使用されることができる。

１９９９年の、“制御された薬物配達の百科事典”、Ｏ．フェルト等、から知られるように、前記熱感受性ヒドロゲルは、自然資源のポリマーに、たとえば、セルロースの後の、第２の最も豊富な多糖であるキチンから導出される、商業的に利用可能な高価でないポリマーであるキトサンに、有利に基づいている。

キトサンは、自然に生成するバイオポリマーである、ポリ（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）とも言われるキチンの、部分的な、から実質的な、アルカリ Ｎ−脱アセチル化により得られるキチン派生物として知られる。

キトサンは、自由アミン（−ＮＨ₂）基を含み、かつ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位と、Ｄ−グルコサミン単位との比について特徴づけられており、これは、十分にアセチル化されたポリマーキチンの、脱アセチル化度（ＤＤ）として表現される。
可溶性、および粘性等の重要な特性に影響を与えるキトサンのパラメータは、脱アセチル化されたモノマーのパーセンテージを表すものと理解される脱アセチル化度（ＤＤ）、およびモル量（Ｍｗ）である。

キトサンは、生物分解性、生物適合性、生体接着性、静菌性を持つもので、さらに、創治癒、薬物吸収、組織復興を促進するものとして知られている。
その上記した本質的な特性により、キトサンは、多くの化粧品としての、および薬剤活性を持つことが知られており、かつ、ゲルを通しての多くの応用について、広く開拓されてきた。

それゆえ、キトサンの有利な特徴を考慮して、まだより広い範囲の生物医学応用に大変見込みがあると考慮される、公知の熱感受性キトサンヒドロゲルの特性を改善することについての、連続的な要求がある。

国際公開第９９／０７４１６号パンフレット（バイオシンテック）は、それが、低温度では低い粘性を持ち、体温ではゲルを持つように、中性のｐＨで熱感受性特性を持つ、ｐＨ依存性の温度制御されたキトサンヒドロゲルを、開示している。

この熱感受性キトサンヒドロゲルは、ポリオルのモノフォスフェート二塩基塩、または、特に、β−グリセロリン酸塩（β−ＧＰ）が代表例とされる砂糖により、約８０％の脱アセチル化度を持つ商業的なキトサンを中性化することにより、準備される。

しかしながら、ヒドロゲルにおけるβ−ＧＰの存在は、以下の欠点を導く。
β−ＧＰは、正に帯電された生体活性要素と反応することのできる負に帯電された実体であり、これは、その沈澱、あるいはヒドロゲルからのその自由化の妨害、を生じるものである。
それゆえ、β−ＧＰの存在は、キトサン／β−ＧＰヒドロゲルを多くの薬物とともに使用することを不適切とする。

さらに、このヒドロゲルの、氷結時間および粘性等の特性は、β−ＧＰの濃度に依存し、それゆえ、β−ＧＰの可溶性により制限される。
特に、高濃度のβ−ＧＰは、ヒドロゲルのその投与後の急速な削減を避ける、低い氷結時間を持つことが必要とされる。

しかしながら、高濃度のβ−ＧＰは、また、ヒドロゲルの機械的特性をも低下させる。
それゆえ、前記氷結時間は、ヒドロゲルの一貫性とバランスしなければならず、特性の望ましい結合であろう、低い氷結時間と高い粘性との両方を持つゲルを得ることは、不可能である。

また、あまりに高濃度のβ−ＧＰは、ヒドロゲルのその投与サイトでの沈澱を引き起し得る。
さらに、前記熱感受性キトサン／β−ＧＰヒドロゲルは、濁っていることが見出されており、これにより、眼科の、または局所性の投与等の応用については、それらの使用を、不適切なものとしている。

さらに、リン酸塩を含む材料は、生体学的互換性の点で、不適切であろう（Ｇ．モリナロ等、生体材料、23: 2717- 2722 (2002) ）。

キトサン／β−ＧＰヒドロゲルの不利を克服するために、国際公開第２００５／０９７８７１号パンフレット（ジュネーブ大学）において、５°Ｃより高い温度で、リン酸塩のない透明ヒドロゲルを形成する熱可塑性中性化キトサン化合物が提案されており、該化合物は、２００ｋＤａより小さくない分子量を持つ、同質的に再アセチル化されたキトサンよりなり、かつ、これは、水酸化基で中性化されて、３０−６０％の脱アセチル化度を持つ。

国際公開第２００５／０９７８７１号パンフレットは、また、前記化合物は、該ヒドロゲルの粘弾性特性を修飾するよう、さらに１，３プロパンジオールを備える、ことを開示している。

しかしながら、１，３プロパンジオールは、“一般に安全と認識される”（ＧＲＡＳ）と言われるものでなく、また、米国薬局方、ヨーロッパ薬局方、または日本薬局方において添加剤として認識されるものでもなく、その使用は、生体医学的応用において制限されている。

さらに、１，３プロパンジオールを含む熱可塑性の中性化されたキトサン化合物は、凍結乾燥によりそれらの熱応答特性を緩める。

生体医学的応用のために改善された熱感受性キトサンヒドロゲルを提供する継続的な必要に鑑み、本発明者らは、公知の熱感受性ヒドロゲルの不利を克服するために、彼らの研究を続けてきた。

本発明の目的は、改善された特性を持ち、かつ生体医学的応用に受け入れ可能である、リン酸塩のない透明ヒドロゲルを形成する水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物を、提供することである。
本発明のもう１つの目的は、容易に貯蔵でき、かつ貯蔵ののちも、その熱ゲル化特性を保持する、水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物を、提供することである。
本発明のまだもう１つの目的は、たとえば、針を用いた注入による、あるいは最小に侵襲的な技術によって、促進された応用を持つ水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物を、提供することである。
これらの目的は、本発明によって達成される。
国際公開第９９／０７４１６号パンフレット 国際公開第２００５／０９７８７１号パンフレット 米国特許第５，７７３，６０８号明細書

発明のサマリー
第１の側面によれば、本発明は、独立請求項１、およびその従属請求項２−１１において定義されたような、水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物（以下、“本発明化合物”とも言う）を、与える。
第２の側面によれば、本発明は、独立請求項１２において定義されるような、第１の側面による、水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物の凍結乾燥体、を与える。
第３の側面によれば、本発明は、独立請求項１３、および従属請求項１４−１５において定義されるような、第１の側面による水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物を生成するための方法を、与える。
第４の側面によれば、本発明は、独立請求項１６において定義されるような、第２の側面による凍結乾燥体を生成するための方法を、与える。
第５の側面によれば、本発明は、独立請求項１７−２０において定義されるような、第１の側面による化合物、または第２の側面による凍結乾燥体、の用途を、与える。

本発明によれば、ポリオス、および、ポリオスより導出されるポリオルから選択される複合化剤を、特定されたキトサン化合物に付加することは、改善された特性を持つリン酸塩のない透明ヒドロゲルであって、生体医学的応用に受け入れ可能であり、かつ、容易に貯蔵され得るものを、有利に与えることを許す。
本発明の他の利点は、以下の記述において、現れるであろう。
本発明は、より詳細な態様で、今、記述される。

本発明の詳細な記述
本発明の記述、および請求項において、本発明の化合物と関連しての、表現“熱可塑性”は、温度は、該化合物の氷結を引き起こさないが、しかし、むしろ、温度が上昇されたときに、該氷結時間を劇的に短くする触媒として動作する、ことにご注意ください。
また、本記述において、“ヒドロゲル”、または、“本発明のヒドロゲル”は、適切なところでは、“本発明の化合物”の代わりに用いられる、ことにご注意ください。
また、本記述および請求項においては、用語“中性化された”は、ｐＨ６．７から７．１を意味します。

本発明によれば、５０°Ｃ以上の温度で、リン酸塩のない透明ヒドロゲルを形成する、水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物は、水酸化基により中性化された再アセチル化されたキトサン、および、ポリオス、およびポリオスより導出されるポリオルより選択された複合化剤よりなる。

本発明の化合物において構成される再アセチル化されたキトサンの平均分子量（Ｍｗ）は、代表的に、１００ｋＤａより小さくない。

キトサンの分子量は、たとえば、クロマトグラフィー ジャーナルA760: 205-215(1997) において、B．ウィットグレン、および、K．−G．ヴァールントにより報告されたように、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）に結合された、非対称フィールドフローフラクショネーション装置（ＡＦＦＦ）により、決定され得る。

代表的に１００ｋＤａより小さくないＭｗを持つ再アセチル化されたキトサンは、本発明における使用において、特に適切である、なぜなら、それは、硬いヒドロゲルを形成する熱可塑性化合物の形成を許すからである。

好ましくは、本発明において用いられる再アセチル化されたキトサンは、２００ｋＤａより小さくないＭｗを持つ。

本発明において用いられる再アセチル化されたキトサンのＭｗの上限は、本発明の化合物において構成される再アセチル化されたキトサンの量に依存し、かつ、選ばれた応用に依存する投与の容易さにより決定される。

本発明において用いられる再アセチル化されたキトサンは、キトサンが、４０％から７０％のＤグルコサミン単位と、６０％から３０％の中性Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位とより、それぞれなることを意味する、４０％から７０％の脱アセチル化度を、持たなければならない。

キトサンの脱アセチル化度は、ラベルツ等、薬学生体医学解析ジャーナル32: 1149-1158 (2003) による文献において記述されたような核磁気共鳴により決定される。

もし、再アセチル化されたキトサンの脱アセチル化度が４０％より低ければ、再アセチル化されたキトサンは、酸の条件において不溶性であるキチンに近いポリマーとなり、したがって、本発明において使用可能ではない。
もし、再アセチル化されたキトサンの脱アセチル化度が７０％より高ければ、該再アセチル化されたキトサンは、リン酸塩のない透明ヒドロゲルを形成する化合物の準備を許さない。
好ましくは、本発明の化合物において構成される再アセチル化されたキトサンの脱アセチル化度は、４５％から６５％である。

代表的に１００ｋＤａより小さくない分子量、および本発明における使用のための４０から７０％の脱アセチル化度を持つ再アセチル化されたキトサンは、たとえば、国際公開第２００５／０９７８７１号パンフレットにおいて開示されたプロセスにしたがって準備でき、あるいは、ノアマトリックス (ノルウェー、オスロ)より得ることができる。

本発明の化合物において構成される再アセチル化されたキトサンの量は、全組成に基づき、０．１から５．０ｗ／ｗ％でなければならない。
０．１ｗ／ｗ％より小さい再アセチル化キトサンの量は、ヒドロゲルの形成を許すものではなく、かつ、５．０ｗ／ｗ％より高い再アセチル化キトサンの量は、注入するのがあまりにも難しい化合物の形成を引き起こす。

本発明の化合物において構成された再アセチル化されたキトサンの量は、キトサンのＭｗ、および、目的とされた応用に基づいて選択されるであろう。
好ましくは、本発明の化合物において構成された再アセチル化されたキトサンの量は、全組成に基づき、０．５から３．０ｗ／ｗ％である。

本発明の化合物において構成される複合化剤の量は、全組成に基づき、１から３０ｗ／ｗ％でなければならず、かつ、再アセチル化キトサンの濃度、および分子量に、ばかりでなく、要求される氷結時間、およびヒドロゲルの一貫性の度合に、依存する。
本発明の化合物において構成される複合化剤の量は、好ましくは、全組成に基づき、５から１５ｗ／ｗ％である。

本発明の化合物において構成される、ポリオス、およびポリオスより導出されるポリオルから選択される前記複合化剤は、ヒドロゲルの氷結時間、および粘性等の、ヒドロゲルの特性を修飾することを許す。

本発明の１つの好ましい実施形態において、本発明において使用され得る複合化剤は、ポリオスであり、より好ましくは、単糖類、および二糖類から選択されたポリオスである。

本発明において使用され得る、単糖類の好ましい例として、ヨーロッパ、米国、および日本薬局方による医薬化合物の賦形剤として知られる、Ｄ−グルコース（デキシトロース、とも言われる）、果糖、および、タガトース、が引用される。
本発明において用いられる二糖類の好ましい例として、ヨーロッパ、米国、および日本薬局方による医薬化合物の賦形剤として知られる、トレハロース、蔗糖、麦芽糖、乳糖、が引用され、トレハロースが、特に、好まれる。

本発明において使用され得る他の例として、医薬化合物の賦形剤として知られる、ポリデキシトーズ、およびアミロースから選択される多糖類、が引用される。
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、本発明において使用され得る複合化剤は、米国、ヨーロッパ、または日本薬局方による医薬化合物のための賦形剤として知られる、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリトリトール、ラクチトール、およびマルチトール、の中から選択されたポリオス（糖アルコールとも言われる）から導出されるポリオルであり、この中では、グリセロールが、特に好まれる。

本発明の化合物は、それらの熱ゲル化特性を維持しながら、貯蔵のために凍結され得るものであり、かつ、それらの使用の前に４°Ｃで解凍されなければならない。
さらに、本発明の化合物は、複合化剤としてグリセロールよりなるものを除いて、促進された貯蔵、および送達のための凍結乾燥体を得るよう、有利に凍結−乾燥されるものであり、かつ、該凍結乾燥体に対して、それらの使用の前に、４°Ｃでかき混ぜながら冷水を加えることにより再構築されることができ、その間、それらの熱ゲル化特性を保持することができる。

本発明の化合物は、本発明のプロセス形成部分により、準備されることができる。
前記プロセスのステップa) において、代表的に１０ｋＤａより小さくない、好ましくは、２００ｋＤａより小さくない分子量を持ち、４０−７０％の、好ましくは４５−６５％の脱アセチル化度を持つ再アセチル化されたキトサンは、水溶性のＨＣｌ媒体内に溶かされ、かつ、キトサンの完全な溶解の後に、該キトサン溶液の温度は、たとえば、氷浴内で、５°Ｃより低い温度に冷却される。
そののち、上記プロセスのステップb) において、冷却されたキトサン溶液のｐＨは、あらかじめ、５°Ｃ以下の温度で、攪拌しながら、あらかじめ５°Ｃ以下の温度に冷却された水酸化基を含む所要の量の水溶液を、滴下により加えることにより、ｐＨ６．７−７．１にまで、好ましくは、ｐＨ６．８にまで、中性化される。
より高いｐＨは、それはキトサンの沈澱を引き出すこととなるので、適切ではない。
上記プロセスによれば、中性化のために使用される水酸化基は、好ましくは、ＮａＯＨである。
水溶性の水酸化基の不十分な攪拌、またはあまりに早い添加は、キトサンの沈澱を引き起こす。
上記プロセスのステップc) において、ポリオス、およびポリオスより導出されるポリオルスの中から選択された複合化剤は、上記溶解ステップa) の間、またはその後に、あるいは、上記中性化ステップb) の前、その間、またはその後に、添加される。

本発明の化合物に関連しての、キトサン、複合化剤、およびそれらの量、についての記述は、本発明のプロセスに関しても適用される、ことが指摘される。
本発明の化合物を準備するためのプロセスは、さらに、もし必要であれば、溶解のステップa) の前の、再アセチル化されたキトサンを滅菌するステップを含む。滅菌ヒドロゲルを得るために、準備は、無菌状態の下で（たとえば、層流の下で）なされ、あらゆる添加された溶液は、前もって、０．２２μｍのフィルターを通され、あるいは、熱滅菌される。
たとえば、滅菌は、放射により、あるいは、理想的には、イエン（Yen S．F．等、米国特許第５，７７３，６０８号明細書）により記述されたように、水内に懸濁された再アセチル化されたキトサンの熱滅菌によりなされることができる。

本発明の化合物を準備するためのプロセスは、さらに、もし必要であれば、促進された貯蔵のために、前記化合物を冷凍するステップを、備えてもよい。この場合、該冷凍された化合物は、その使用の前に、４°Ｃで解凍されなければならない。
特に好ましい実施形態においては、本発明によるプロセスは、本発明の化合物がグリセロールを複合化剤として含むことを除いて、本発明の化合物をさらに凍結−乾燥することにより完了することができ、本発明の凍結乾燥体形成部を得ることができる。
上記凍結乾燥体は、医学的用途のために、便利に、貯蔵され、配達されることができ、かつ、４°Ｃで攪拌しながらの冷水の添加により、再構築されることができる。

本発明の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物の温度が、たとえば、投与後に、上昇されたとき、熱氷結が起こり、リン酸塩のない、透明な硬いヒドロゲルの形成に至る。温度がより高いほど、氷結時間はより短い。

本発明によれば、本発明の化合物は、薬物送達システムとして、および、その特定の特性に鑑み、注入可能な製剤設計の準備のために、有利に利用されることができる。
さらに、本発明の凍結乾燥体は、その再構成の後に、その熱ゲル化特性を維持するので、それは、薬物送達システムの準備のために、かつ、注入可能な製剤設計のために、有利に使用されることができる。

本発明の、リン酸塩のない透明なキトサンヒドロゲルの改善された弾性特性を証明するために、本発明による種々のヒドロゲル、および比較例のヒドロゲルの流動学的測定が、他の方法が示されない限り、以下の方法にしたがってなされた。

ヒドロゲルの粘性特性は、レオストレス１（ハーケ、カールスルーエ、ドイツ）を用いたヒドロゲルの準備の後に、コーン／プレートデバイス（直径６０ｍｍ、角度４度）を用いて、直ちに決定された。温度は、血流計と結合された、熱安定浴 ハーケ DC 30、および冷却デバイス ハーケK10 (ハーケ、カールスルーエ、ドイツ) により制御された。ヒドロゲルは、コーンとプレートの間に（４°Ｃに冷却されて）置かれ、１０分後に測定された。すべての測定は、線形粘弾性範囲内でなされ、Ｇ’（貯蔵係数）、およびＧ”（損失係数）は、一定変形（γ＝０．０５）の下で、１８０分間にわたって、１．００Ｈｚで決定された。該温度は、最初の５分間の間に、６．６°Ｃ／分で、４から３７°Ｃに上昇され、つづく１７５分間にわたって、３７°Ｃに維持された。ヒドロゲルの乾燥に至る水の蒸発は、コーン／プレートデバイスを囲むカバーを用いることにより最小化された。

以下のヒドロゲルが、テストされた：
（1）例１において得られる本発明のヒドロゲルは、ノヴァマトリクスから得られるキトサン２ｗ／ｗ％（ＤＤ＝４７％）、およびトレハロース８ｗ／ｗ％を含み、比較例のヒドロゲルは、トレハロースを含まない（図２参照）；
（2）例１において得られる本発明のヒドロゲルは、ノヴァマトリクスから得られるキトサン２ｗ／ｗ％（ＤＤ＝４７％）、およびトレハロース８ｗ／ｗ％を含み、例２による、準備後、および、凍結−解凍後のものである（図３Ａ、および３Ｂ参照）；
（3）例１において得られる本発明のヒドロゲルは、ノヴァマトリクスから得られるキトサン２ｗ／ｗ％（ＤＤ＝４７％）、およびトレハロース８ｗ／ｗ％を含み、例３による、凍結−乾燥後、および、再構築後のものであり、比較例のヒドロゲルは、トレハロースを含まない（図４参照）；
（4）例４において得られる本発明のヒドロゲルは、準備例１により得られる０．９ｗ／ｗ％キトサン（ＤＤ＝６１％）、および５ｗ／ｗ％トレハロースを含み、比較例のヒドロゲルは、トレハロースを含まない（図６参照）；
（5）例５（比較例）において得られる比較例のヒドロゲルは、準備例２により得られる１ｗ／ｗ％キトサン（ＤＤ＝４７％）、および１０ｗ／ｗ％１，３プロパンジオールを含み、準備後、および、凍結−乾燥および再構築後のものである（図６Ａおよび６Ｂ参照）；
（6）例６において得られる本発明のヒドロゲルは、準備例１により得られる０．９ｗ／ｗ％キトサン（ＤＤ＝６１％）、および５ｗ／ｗ％マンニトールを含み、凍結−乾燥および再構築後のものである（図７参照）；
（7）例７において得られる本発明のヒドロゲルは、ノヴァマトリクスより得られる２ｗ／ｗ％キトサン（ＤＤ＝４７％）、および１０％グリセロールを含み、比較例のヒドロゲルは、グリセロールを含まない（図８参照）；
図２ないし図８は、テストされたヒドロゲルの、温度が４°Ｃから３７°Ｃまで上昇するときの時間関数としての、弾性係数Ｇ’（蓄積係数）、および粘性係数Ｇ”の、漸進的変化を示す。氷結時間を定義する、ゲルネットワークの初期形成の開始は、Ｇ’とＧ”のクロスオーバーの時間により与えられる。

図２に示されるように、本発明によるトレハロースのようなポリオスの添加は、トレハロースのない、同じヒドロゲルと比較して、ヒドロゲルのＧ’およびＧ”値を、増大させる。

図３Ａは、ヒドロゲルの、ちょうどその準備の後（図２に報告されるように）の粘弾性特性を示し、一方、図３Ｂは、同じヒドロゲルの、凍結および氷結後の、粘弾性特性を示す。
図３Ｂに示されるように、本発明の化合物の熱ゲル化特性は、凍結、および氷結後に、維持される。

図４は、凍結−乾燥、および再構成後の、図２に報告されたヒドロゲルの粘弾性特性を示す。
図４に示されるように、本発明の化合物の熱ゲル化特性は、凍結−乾燥、および再構成後に維持される。

図５に示されるように、トレハロースを含む本発明の化合物は、３０分のゲル化点を示し、一方、トレハロースを含まない同じ製剤設計は、１５０分後にゲルを形成する。

図６Ａ、および図６Ｂに示すように、１，３プロパンジオールを含む比較例の化合物は、粘弾性特性がその準備の後に測定されるとき、ヒドロゲルを形成し（図６Ａ）、しかし、図６Ｂにおいてゲル化点がないことにより示されるように、凍結乾燥および再構成の後には、その熱ゲル化特性を維持しない。

図７に示されるように、マンニトールを含む本発明の化合物は、ゲル化点の存在により示されるように、凍結−乾燥および再構成の後に、その熱ゲル化特性を維持する。

図８に示されるように、グリセロールを含む本発明の化合物は、ゲル化点の存在により示されるように、ヒドロゲルを形成し、一方、グリセロールを含まない同じ製剤設計は、１８０分後に、ゲル化点を示さない。

以下の例は、本発明を図解することが意図されている。しかしながら、それらは、どのような場合にも、本発明の範囲を限定するものと考慮されてはならない。

例
以下の例において、キトサンの脱アセチル化度は、ラベルツら、ジャーナル オブ ファーマシューティカル アンド バイオディカル アナリシス32: 1149-1158 (2003) による文献において記述されているように、核磁気共鳴（ＮＭＲ）により決定される。
キトサンの分子量は、以下のように、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）に結合された非対称フィールドフローフラクショネーション装置（ＡＦＦＦ）により決定された：
（酢酸塩バッファーｐＨ４．５内の２ｍｇ／ｍｌの）キトサン液のフラクショネーションは、光消滅Ｆシステム (ワイアット テクノロジー ヨーロッパ、デムバッハ、ドイツ ) に接続された、長さ２６．５ｃｍ、高さ３５０μｍの台形形状チャネルにおいて、遂行される。該チャネルの底は、１０ｋＤａカットオフを有する再生成されたセルロース膜（ミクロディン−ナディアー ゲーエムベーハー、ヴィースバーデン、ドイツ）に揃えられる。溶出媒体は、酢酸塩バッファーｐＨ４．５よりなる。チャネルフローは、１ml／分 にセットされ、注入フローは、０．２ml／分 にセットされる。分離は、３分間にわたる１ml／分 の焦点フローで開始され、１５分間にわたる０．２ml／分 の交差フローがつづく。Dawn EOS多角度光散乱検出器（ワイアットテクノロジー、サンタバーバラ、米国) 、および屈折率（ＲＩ）検出器 ( ウォーターズ 差動屈折率メーター、ミルフォード、マサチューセッツ 米国 ) は、フィールドフローフラクショネーションチャネルとオンラインで結合している。光散乱検出器は、１つのＧａＡｓレーザ（波長：６９０ｎｍ）、および１８個の検出器を備えている。散乱光は、１４度と１６３度との間の複数角で集められる。屈折率検出器は、ＮａＣｌにより校正される。データは、集められ、0.153ml/g の屈折率増分（dn/dc）を用いて、アストラバージョン4.90.08 ソフトウェアにより、解析される。

以下の例において、いくらかの化合物の注入可能性は、図１に示されるように、３°Ｃのヒドロゲルで満たされた１．０ml ルアーロックシリンジのための垂直サポート、および該シリンジのピストン上に休むパンよりなるデバイスにより決定される。１つの２７Ｇ^1/2 ｘ ０．５インチの針は、該サポート内に位置するシリンジ上に形成されている。ある重量（５００グラム、または１ｋｇ）が、このパンの上に置かれ、化合物が、該シリンジから排出されるのに必要な時間が、測定される。

以下の例１−３、および７において、ヒドロゲルの準備のために用いられる再アセチル化されたキトサンは、４７％のＤＤ（ＮＭＲにより測定された）、および３６００ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）（ＡＦＦＦ−ＭＡＬＳにより測定された）を持つ、ノヴァマトリクスより得られる再アセチル化されたキトサン（バッチ FU-507-03 ）である。

以下の、例４、例６において、ヒドロゲルの準備に用いられる再アセチル化されたキトサンは、準備例１により準備される再アセチル化されたキトサンである。

以下の、例５において、ヒドロゲルの準備のために用いられる再アセチル化されたキトサンは、準備例２により準備される再アセチル化されたキトサンである。

準備例１
国際公開第２００５／０９７８７１号パンフレットに開示された方法による、６１％のＤＤを持つ再アセチル化された“Fagal Lot 21”の準備
25.5グラムのキトサンフレーク（シグマ−アルドリッヒ、セントルイス、ミズーリ、米国、製品番号41,941-9、バッチ 14418LB ）が、酢酸１０％およびメタノール（５０／５０）の１リットルの溶液内に、１時間、攪拌下で、溶解される。５５０ｍｌのメタノールが、添加される。２時間の攪拌後、該混合物は、１００μｍフィルターを通ってフィルターされ、不溶性の粒子を削除する。粘性の溶液は、そののち、イオンを除去された水に対して、７２時間の間、水は毎日交換して、透析される（スペクトラ／ポル（登録商標）１ 透析膜、6,000 - 8,000 MWCO、番号132665、スペクトル研究所、ランチョー ドミンゲス、米国）。該水溶液は、その後、５μｍのフィルターを通って、フィルターされる。
攪拌の下で、４００ｍｌのＮＨ₄ＯＨ ０．２ モル／メタノール（５０／５０）が、沈澱を起こすよう添加される。１時間の攪拌の後、該懸濁液は、１００μｍフィルターを通ってフィルターされる。沈殿物は、メタノールにより中性になるまで洗浄される。得られた純化されたキトサンは、シリカゲルの存在下で、真空下で、室温で、光から保護されて、乾燥される。
この純化されたキトサンの１０グラムは、５００ｍｌ酢酸１０％／メタノール（５０／５０）で溶解される。該混合物は、１時間の間、攪拌され、一夜中、そのままとされる。メタノールの４００ｍｌが、添加される。該溶液は、数時間の間、攪拌され、一夜中、そのままとされる。メタノールの１５０ｍｌが添加され、キトサン水溶液は、氷浴を用いて５度より低い温度にまで、冷却される。２．４ｍｌの酢酸無水物と、２００ｍｌのメタノールよりなる溶液が、５°Ｃより低い温度に冷却され、かつ、キトサン水溶液に、激しい機械攪拌の下で、滴下により、添加される。この均質に再アセチル化されたキトサンを含む溶液は、完全な反応を確保するために、１時間の間、５°Ｃより低い温度で攪拌下に保持され、室温で、一夜中、そのままとされる。再アセチル化の間に生成される塩を削減するために、およびさらに不溶性の粒子を削減するために、この粘性溶液は、イオンを除去された水に対して、１２日の間、水は毎日交換して、（上記と同じ透析膜により）透析される。キトサン粘性液は、そののち、５μｍフィルターを通して、フィルターされる。２００ｍｌのＮＨ₄ＯＨ ０．２モル／メタノール（５０／５０）が、キトサンの沈殿を起こすよう、攪拌下で添加される。４時間の攪拌ののち、該キトサンは１００μｍのフィルターを通過し、メタノールにより洗浄される。最後に、均質に再アセチル化されたキトサンは、シリカゲルの存在下で、真空下で、室温で、かつ、光から保護されて、乾燥される。
得られた再アセチル化キトサンは、６１％のＤＤ（ＮＭＲにより測定される）、および７９００ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）（ＡＦＦＦ−ＭＡＬＳにより測定される）を持った。

準備例２
国際公開第２００５／０９７８７１号パンフレットに開示された方法による、４７％のＤＤを持つ、再アセチル化キトサン "Fagal Lot 25" の準備
キトサンフレーク（シグマ−アルドリッヒ、セントルイス、ミズーリ、米国、製品番号41, 941-9、バッチ 14418LB ）が、準備例１におけるように、純化される。キトサンは、そののち、準備例１におけるのと同じ手順により、２．０ｍｌ酢酸無水物、および２００ｍｌメタノールよりなる液により、再アセチル化される。
得られた再アセチル化キトサンは、４７％のＤＤ（ＮＭＲにより測定される）を持った。

例１
ノヴァマトリックスにより提供される２％ｗ／ｗの再アセチル化キトサン（ＤＤ＝４７％ _RMN ）、および８％ｗ／ｗトレハロース７００ｍｇを含む、本発明による化合物の準備
ノヴァマトリックスにより得られる、４７％のＤＤ（ＲＭＮにより測定される）を持つ、再アセチル化キトサン（バッチ FU-507-03 ）を、４％（ｗ／ｗ）の濃度の水内の懸濁液内で加圧滅菌処理した。１４５μｌのＨＣｌが添加され、該懸濁液は、１８時間、室温で、攪拌状態に保たれ、完全なキトサンの溶解を可能とした。３．０９グラムのトレハロースが、６．５ｍｌＮａＯＨ０．１５モル内に溶解された。この溶液は、氷浴内で冷却され、冷却されたキトサン溶液に、攪拌下で、滴下により添加された。該ゲルのｐＨは、そののち、冷却され希釈されたＮａＯＨの滴下による添加により、６．８にまで調整された。最後に、冷水が添加されて、３５ｇの全体質量を得た。得られた透明ヒドロゲルは、図２、および図３Ａに示されるように、３７°Ｃで、その粘弾性行動継続時間の増加を示し、１１１分の氷結時間を持った。注入可能性の測定は、１キログラムの重量につき、３０秒を与えた。

例２
例１で得られたヒドロゲルを、凍結し−氷結する
例１の準備の１０グラムが、液体窒素内で凍結され、−２０°Ｃに保たれた。それは、そののち、そのレオロジー（流体学的）特性が決定される前に、４°Ｃで氷結された。図３Ｂに示されるように、熱ゲル化特性が、維持された。

例３
例１で得られたヒドロゲルを、凍結し−乾燥する
例１の準備の１０グラムが、液体窒素内で凍結され、エドワードモデュリョュロフリーザードライヤー（プレートは−５０°Ｃ、１０^-1ミリバール真空度) によって、２４時間の間、凍結乾燥される前に−２０°Ｃに保たれた。得られた凍結乾燥体は、４°Ｃで、攪拌下での冷水の添加により、再構築された。図４に示されるように、熱ゲル化特性は、維持された。

例４
準備例１により得られた０．９％ｗ／ｗ再アセチル化キトサン"Fagal lot 21" (DD=61 % _RMN )、および５％ｗ／ｗのトレハロースを含む、本発明による化合物の準備
準備例１により準備された、かつ、６１％のＤＤ（ＲＭＮにより測定される）を持つ２７０ｍｇ再アセチル化キトサンを、１５ｍｌＨＣｌ ０．１Ｎ内に、室温での、１８時間にわたる攪拌下で、溶解した。トレハロース二水和物の１．６６グラムは、８ｍｌＮａＯＨ０．１５モル内に、溶解された。この水溶液は、氷浴内で冷却され、冷却されたキトサン溶液に、攪拌下での滴下により、添加された。該ゲルのｐＨは、そののち、冷却されたＮａＯＨの滴下による添加により、６．８にまで調整された。最後に、冷水が添加されて、３０グラムの全重量を得た。該得られた透明ヒドロゲルは、図５に示されるように、３７°Ｃで、その粘弾性行動継続時間の増加を示した。トレハロースを含む製剤設計は、３０分後のゲル化点を示した、一方、トレハロースを含まない製剤設計は、１５０分後にゲルを形成した。注入可能性の測定は、５００グラムの質量で３０秒を与えた。

例５（比較例）
準備例２により得られた１％（ｗ／ｗ）再アセチル化キトサン"Fagal lot 25" (DD=47 % RMN) 、および１０（ｗ／ｗ）％１，３プロパンジオールを含む、比較例化合物の準備
準備例２により準備された、かつ、４７％のＤＤ（ＲＭＮにより測定される）を持つ、２００ｍｇの再アセチル化キトサンを、１０ｍｌＨＣｌ ０．１Ｎ内に、室温での、１８時間にわたる攪拌下で、溶解した。２ｇの冷却された１，３プロパンジオールが、溶解されたキトサンに添加された。該ゲルのｐＨは、そののち、冷却され希釈されたＮａＯＨの滴下による添加により、６．８にまで調整された。最後に、冷水が添加され、２０グラムの全体質量を得た。得られた透明ヒドロゲルは、図６Ａに示されるように、３７°Ｃで、その粘弾性行動継続時間の増加を示した。
（−８０°Ｃで）凍結され、（２４時間にわたって）凍結乾燥され、かつ、４°Ｃでの攪拌下で冷水で再構築されたとき、得られた準備は、注入可能性測定テストにおいては、もはや注入可能ではなかった（２７Ｇ^1/2、１キログラム質量）。さらに、それは、図６Ｂに示すように、何らの熱ゲル化特性を示さなかった。

例６
準備例１により得られた０．９％ｗ／ｗ再アセチル化キトサン"Fagal lot 21" (DD=61 % _RMN ）、および５ｗ／ｗ％マンニトールを含む、本発明による化合物の準備
準備例１により得られた、６３０ｍｇ再アセチル化キトサンを、３５ｍｌＨＣｌ ０．１Ｎ 内に、室温で、１８時間にわたる攪拌下で、溶解した。このキトサン溶液は、３．５グラムのマンニトールを添加する前に、約５°Ｃに冷却される。該ゲルのｐＨは、そののち、冷却され希釈されたＮａＯＨの滴下による添加により、６．８にまで調整された。最後に、冷水が添加され、７０グラムの全質量を得た。この準備の１０グラムは、液体窒素内で凍結され、エドワードモデュリョフリーザードライヤー（プレートは−５０°Ｃ、１０^1/2ミリバール真空度) により２４時間にわたって凍結乾燥される前に、−２０°Ｃに保持された。得られた凍結乾燥体は、４°Ｃで、攪拌下での冷水の添加により、再構成された。得られた透明ヒドロゲルは、図７に図示されるように、１時間の氷結時間をもって、３７°Ｃで、その粘性弾性行動継続時間の増加を示した。

例７
ノヴァマトリックスにより提供される２％ｗ／ｗの再アセチル化キトサン（ＤＤ＝４７％）、および１０ｗ／ｗ％グリセロールを含む、本発明による化合物の準備
ノヴァマトリックスにより得られる、７００ｍｇ再アセチル化キトサンを、４％（ｗ／ｗ）の濃度の水内の懸濁液内で加圧滅菌処理した。該懸濁液を、室温で、冷却したのち、１４５μｌのＨＣｌが添加され、かつ、該混合物は、１８時間にわたって攪拌下に保たれ、完全なキトサンの溶解を可能とした。該キトサン溶液は、氷浴を用いて約５°Ｃにまで冷却され、３．５グラムの冷却されたグリセロールが添加された。該ゲルのｐＨは、そののち、冷却され希釈されたＮａＯＨの滴下による添加により、６．８にまで調整された。最後に、冷水が添加されて３５グラムの全重量を得た。グリセロールを含む該透明ヒドロセルは、図８に示されるように、３７°Ｃでの、その粘弾性行動継続時間の増大を示し、１３５分の氷結時間を持ったが、一方、グリセロールを含まない製剤設計は、１８０分後にも、何らゲル化点を示さなかった。

図１は、本発明の化合物の注入可能性を測定するためのデバイスを示す。 図２は、例１において得られる、トレハロースを含む透明ヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（貯蔵係数）、および粘性係数Ｇ”（損失係数）の、トレハロースを含まない同じヒドロゲルと比較しての、温度が４°Ｃから３７°Ｃまで増加するときの時間関数としての、漸進的変化を示す。 図３は、例１において得られる、トレハロースを含む透明ヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（貯蔵係数）、および粘性係数Ｇ”（損失係数）の、準備後（Ａ）、および解凍後（Ｂ）の、温度が４°Ｃから３７°Ｃまで増加するときの時間関数としての、漸進的変化を示す。 図４は、例１において得られる、トレハロースを含む透明ヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（貯蔵係数）、および粘性係数Ｇ”（損失係数）の、トレハロースを含まない同じヒドロゲルと比較しての、凍結−乾燥および再構築後の、温度が４°Ｃから３７°Ｃまで増加するときの時間関数としての、漸進的変化を示す。 図５は、例４において得られる、トレハロースを含む透明ヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（貯蔵係数）、および粘性係数Ｇ”（損失係数）の、トレハロースを含まない同じヒドロゲルと比較しての、温度が４°Ｃから３７°Ｃまで増加するときの時間関数としての、漸進的変化を示す。 図６は、例５（比較例）において得られる、１，３プロパンジオールを含む透明ヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（貯蔵係数）、および粘性係数Ｇ”（損失係数）の、準備後（Ａ）、および凍結乾燥および再構築後（Ｂ）の、温度が４°Ｃから３７°Ｃまで増加するときの時間関数としての、漸進的変化を示す。 図７は、例６において得られる、マンニトールを含む透明ヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（貯蔵係数）、および粘性係数Ｇ”（損失係数）の、凍結−乾燥および再構築後の、温度が４°Ｃから３７°Ｃまで増加するときの時間関数としての、漸進的変化を示す。 図８は、例７において得られる、グリセロールを含む透明ヒドロゲルの弾性係数Ｇ’（貯蔵係数）、および粘性係数Ｇ”（損失係数）の、温度が４°Ｃから３７°Ｃまで増加するときの時間関数としての、漸進的変化を示す。

Claims (20)

1. １．５°Ｃより高くない温度で、リン酸塩のない透明ヒドロゲルを形成する、水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
   該化合物は、１００ｋＤａより小さくない分子量、および、４０から７０％の脱アセチル化度を持つ、水酸化基により中性化された、全組成に基づき０．１から５．０ｗ／ｗ％の再アセチル化キトサン、および、ポリオス、およびポリオスより導出されるポリオールから選択された、全組成に基づき１から３０ｗ／ｗ％の複合化剤、よりなる。
2. 請求項１記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
   前記再アセチル化されたキトサンが、全組成に基づき０．５から３．０ｗ／ｗ％分、含まれている。
3. 請求項１または２に記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
   前記再アセチル化されたキトサンの脱アセチル化度は、４５から６５％である。
4. 請求項１から３のいずれかに記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
   前記再アセチル化されたキトサンの分子量は、２００ｋＤａより小さくない。
5. 請求項１ないし４のいずれかに記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
   前記複合化剤は、全組成に基づき５から１５ｗ／ｗ％分、含まれている。
6. 請求項１ないし５のいずれかに記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
   前記複合化剤は、ポリオスよりなる。
7. 請求項６に記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
   前記ポリオスは、単糖類、および二糖類の中から選択されたものである。
8. 請求項７に記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
   前記複合化剤は、Ｄ−グルコース、果糖、および、蔗糖の中から選択された単糖類である。
9. 請求項７に記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
   前記ポリオスは、トレハロース、サクロース、マルトース、および、ラクトースの中から選択された二糖類である。
10. 請求項９に記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
    前記二糖類は、トレハロースである。
11. 請求項１ないし５のいずれかに記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物であって、
    前記複合化剤は、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリトリトール、ラクチトール、および、マルチトールの中から選択されたポリオスから導出されるポリオルである。
12. グリセロールを前記複合化剤として含む化合物を除く、請求項１ないし１１のいずれかに記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物を、凍結−乾燥することによって得られる凍結乾燥体。
13. 請求項１ないし１１のいずれかに記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物を、生成する方法であって、以下のステップよりなる：
    a) １００ｋＤａより小さくない分子量、および４０から７０％の脱アセチル化度、を持つ、適切な量の再アセチル化キトサンを、水溶性のＨＣｌ媒体内に溶解し、かつ、該酸性のキトサンを、５°Ｃより低い温度にまで冷却する、
    b) 前記ステップa) で得られた冷却されたキトサン液を、該冷却されたキトサン液に、あらかじめ５°Ｃ以下の温度に冷却された水溶性の水酸化基を、該冷却されたキトサン液が６．７から７．１のｐＨを示すに至るまで加えることによって、中性化する、
    c) 前記溶解ステップ a) の間に、あるいはその後に、または、前記中性化ステップb) の前に、その間に、あるいはその後に、ポリオス、およびポリオスより導出されるポリオルから選択された複合化剤の適切な量を、添加する、および、
    d) 任意に、得られた水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物を、凍結する。
14. 請求項１３に記載の方法であって、さらに、前記溶解のステップa) の前に、前記再アセチル化されたキトサンを攪拌するステップを、備える。
15. 請求項１３または１４に記載の方法において、前記ステップb) において、前記水酸化基は、ＮａＯＨである。
16. 請求項１２の凍結乾燥体を生成する方法において、前記請求項１３ないし１５のいずれかによる方法による得られる水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物を、該化合物が、グリセロールを前記複合剤として含まないことを条件として、凍結−乾燥することよりなる。
17. 請求項１ないし１１のいずれかに記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物の、薬物送達システムとしての、使用。
18. 請求項１ないし１１のいずれかに記載の水溶性の熱可塑性の中性化されたキトサン化合物の、注入可能な製剤設計の準備のための使用。
19. 請求項１２による凍結乾燥体の、薬物送達システムの準備のための使用。
20. 請求項１２による凍結乾燥体の、注入可能な製剤設計の準備のための使用。

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