EP2101753A2 - Verwendung von cytohesin-inhibitoren zur chemischen induktion von langlebigkeit - Google Patents

Verwendung von cytohesin-inhibitoren zur chemischen induktion von langlebigkeit

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EP2101753A2
EP2101753A2 EP07822588A EP07822588A EP2101753A2 EP 2101753 A2 EP2101753 A2 EP 2101753A2 EP 07822588 A EP07822588 A EP 07822588A EP 07822588 A EP07822588 A EP 07822588A EP 2101753 A2 EP2101753 A2 EP 2101753A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
alkyl
compounds
insulin
indicated below
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07822588A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Famulok
Markus Hafner
Anton Schmitz
Bernhard Fuss
Ingo Zinke
Michael Hoch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
Original Assignee
Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
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Filing date
Publication date
Application filed by Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn filed Critical Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
Publication of EP2101753A2 publication Critical patent/EP2101753A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention relates to the use of compounds according to the general formulas (1), (2), (3) and (4) for the treatment and / or prophylaxis of diseases and pathological conditions associated with regulation of insulin and / or IGF. (Insulin-like growth factor) signaling pathway, and / or for the chemical induction of longevity.
  • IGF Insulin-like growth factor
  • Each cell function including cell aging and cell death, is controlled by a variety of cell signaling pathways.
  • the development of some diseases also depends on cell aging and the likelihood of dying from disease increases with age.
  • Another common problem associated with today's lifestyle is obesity, also called obesity. This is a key factor in the development of many chronic diseases as well as some cancers.
  • the object of the present invention was to provide compounds which overcome at least one of the disadvantages of the prior art. Especially The task was to provide means that allow influencing the insulin signaling pathway.
  • R is the same or each independently selected from the group comprising hydrogen, OH, COOH, COO (Cl -C 10 -alkyl), CONH 2 , CONH (Cl-ClO-alkyl), CON (Cl -C 10 -alkyl) 2 , NHCO (C 1 -C 10 -alkyl), NHCOCHCl 2 , halogen, preferably selected from the group comprising Cl, Br, F, CF 3 , amine, C 1 -C 10 -alkyl, C 1 -C 10 -alkoxy and / or a structural element ( Al), (B1), (C1), (D1), (E1), (F1), (G1), (H1), (II), (Y1), (L1), (M1) as indicated below: Wonn: - A -
  • R 4 is the same or each independently selected from the group comprising hydrogen, OH, COOH, COO (C 1 -C 10 -alkyl), CONH 2 , CONH (C 1 -C 10 -alkyl), CON (C 1 -C 10 -alkyl ) 2 , NHCO (C 1 -C 10 -alkyl), NHCOCHCl 2 , halogen, preferably selected from the group comprising Cl, Br, F, CF 3 , amine, C 1 -C 10 -alkyl and / or C 1 -C 10 -alkoxy,
  • the compounds which can be used according to the invention can show an influence on the insulin and / or IGF (insulin-like growth factor) signaling pathway.
  • IGF insulin-like growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • the compounds which can be used according to the invention preferably have at least one, preferably two, more preferably three identical and / or different structural elements (A1), (B1), (C1), (D1) and / or (E1).
  • the compounds which can be used according to the invention have at least one structural element selected from the group comprising (E1), (F1), (G1), (III), (II), (II), (C1), (II), ( Ml) and / or (Ol).
  • the structural element R 4 is the same or each independently selected from the group comprising hydrogen, NHCOCHCb, Cl, CF 3 , and / or F.
  • a particular advantage of the compounds which can be used according to the invention is that the compounds can also be used in particular for prophylactic use. This not only gives the possibility to use the compounds which can be used according to the invention for the treatment of already existing pathological conditions but also their prophylactic use in the prevention, for example of age-related cell damage or obesity.
  • prophylactic treatment is understood in particular to mean that the compounds which can be used according to the invention can be administered prophylactically, for example, before age-related cell damage occur.
  • prophylactic treatment it is advantageous that, for example, obesity can be prevented by a prophylactic treatment.
  • the compounds are selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3) and / or (4) selected from the group comprising compounds of the general formulas (5), (6), (7 ) and / or (8) as indicated below and / or their enantiomers, diastereomers, derivatives and their pharmaceutically acceptable salts:
  • Ri is the same or each independently selected from the group comprising R 2 , R 3 and / or a structural element (A2), (B2), (C2), (D2), (N2) as indicated below:
  • R h R 3 is the same or each independently selected from the group comprising R h R 3 and / or a structural element (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2), (L2 ), (M2), (02) as indicated below:
  • R 3 is the same or each independently selected from the group comprising Ri, R 2 , and / or selected from the group comprising hydrogen, OH, COOH, COO (Cl -C 10 -alkyl), CONH 2 , CONH (Cl -C 10-alkyl), CON (C 1 -C 10 -alkyl) 2 , NHCO (C 1 -C 10 -alkyl), NHCOCHCl 2 , halogen, preferably selected from the group comprising Cl, Br, F, CF 3 , amine, C 1 -C 10 -Alkyl and / or Cl-Cl O-alkoxy.
  • At least one or more of the structural elements Ri, R 2 and / or R 3 are the same or in each case independently selected from the sulfur-containing structural elements (A2), (B2), (C2) and / or (D2).
  • the compounds which can be used according to the invention can have a plurality of identical and / or different structural elements (A2), (B2), (C2) and / or (D2).
  • the compounds which can be used according to the invention preferably have at least one, preferably two, more preferably three identical and / or different structural elements (A2), (B2), (C2) and / or (D2).
  • the compounds which can be used according to the invention have at least one Structural element selected from the group comprising (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2), (L2), (M2) and / or (02).
  • the structural element R 3 of the structural elements (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2), (L2), (M2) and / or (02) is hydrogen ,
  • the compounds which can be used according to the invention are selected from the group comprising compounds of the general formulas (5), (6), (7) and / or (8) as indicated below and / or their enantiomers, diastereomers, derivatives and their pharmaceuticals compatible salts:
  • Ri is the same or each independently selected from the group comprising R 2 , R 3 and / or a structural element (A3), (B3), (C3), (D3), (N3) as indicated below:
  • R h R 3 is the same or each independently selected from the group comprising R h R 3 and / or a structural element (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3), (L3 ), (M3), (03) as indicated below:
  • R 3 is the same or each independently selected from the group comprising Ri, R 2 , and / or selected from the group comprising hydrogen, OH, COOH, COO (Cl -C 10 -alkyl), CONH 2 , CONH (Cl -C 10-alkyl), CON (C 1 -C 10 -alkyl) 2 , NHCO (C 1 -C 10 -alkyl), NHCOCHCl 2 , halogen, preferably selected from the group comprising Cl, Br, F, CF 3 , amine, C 1 -C 10 -Alkyl and / or Cl-Cl O-alkoxy.
  • At least one or more of the structural elements Ri, R 2 and / or R 3 of the compounds (5), (6), (7) and (8) is the same or in each case independently selected from the sulfur-containing structural elements (A3), (B3 ), (C3) and / or (D3).
  • the compounds which can be used according to the invention can have a plurality of identical and / or different structural elements (A3), (B3), (C3) and / or (D3).
  • the compounds which can be used according to the invention preferably have at least one, preferably two, more preferably three identical and / or different structural elements (A3), (B3), (C3) and / or (D3).
  • the Compounds which can be used according to the invention are at least one structural element selected from the group comprising (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3), (L3), (M3) and / or ( 03).
  • At least one structural element R, R 1 , R 2 , R 3 and / or R 4 preferably at least one structural element R of the compounds (1), (2), (3) and (4), in particular R 3 of the compounds (5), (6), (7) and (8), each independently selected from the group comprising C 1 -C 5 -alkyloxy, preferably selected from the group comprising -O-methyl, -O-ethyl, - O-isopropyl and / or -O-tert-butyl.
  • Particularly preferred among the C 1 -C 5 alkoxy groups are methoxy and / or ethoxy groups, very particularly preferred are methoxy groups.
  • the compounds which can be used according to the invention have a significantly improved effect, the smaller the alkoxy groups are.
  • a significant increase in the effectiveness of the use of the compounds can be achieved when the alkoxy group R 3 , in particular the compounds (5), a Cl-C2-alkoxy group, and achieved a further increase in the effectiveness of the compound can be when the alkoxy group R 3 is a methoxy group.
  • the compounds 1,2,4-triazoles which can be used according to the invention are selected from the group comprising compounds of the formulas (1) and / or (5).
  • Ri of the compounds according to formula (5) is a structural element (A3), (B3), (C3), (D3) or (N3)
  • R 2 is a structural element (E3), (F3), (G3), (H3 ), (13), (J3), (K3), (L3), (M3) or (03) and / or R3 is a C 1 -C 5 alkoxy group, preferably a methoxy or ethoxy group.
  • Ri of the compounds of the formula (5) is preferably a structural element (A3) or (B3), R 2 is a structural element (E3), (F3) or (K3) and / or R 3 is a methoxy or ethoxy group.
  • the compounds which can be used according to the invention are selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (22), (23) as indicated below and / or their enantiomers, diastereomers, derivatives and their pharmaceuticals compatible salts:
  • the compounds which can be used according to the invention are selected from the group comprising compounds (12), (14), (20), (21) as indicated below and / or their enantiomers, diastereomers, derivatives and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • the compounds which can be used according to the invention may be derivatized, for example phosphorylated, glycosylated, acetylated, ubiquitinylated, farnesylated, palmitoylated, geranylgeranylated and / or biotinylated.
  • biotinylated compound particularly preferred is, for example, compound (24) as indicated below and / or their enantiomers, diastereomers and their pharmaceutically acceptable salts
  • An advantage of the compounds which can be used according to the invention can be realized by the fact that they can exert an inhibitory effect on cytohesin-dependent signal cascades of the insulin and / or IGF (insulin-like growth factor) signaling pathway.
  • the compounds which can be used according to the invention can, for example, show in vivo in the mouse and in the fly that insulin resistance can be effected.
  • the compounds which can be used according to the invention can furthermore be shown in in vitro experiments in human liver cells to also be able to develop insulin resistance. An insulin resistance can lead to an increase in longevity and longevity and there are applications in the treatment of age-related diseases.
  • a particular advantage of the compounds which can be used according to the invention can be provided by the fact that they can allow a chemically induced longevity in the context of a therapeutic and / or prophylactic treatment.
  • the term "chemically induced longevity" in the context of this invention is understood to mean that the life of an organism and / or of a tissue or organ can be prolonged by the administration of the compounds which can be used according to the invention.
  • An extension of the life of an organism and / or a tissue or organ can advantageously be achieved by administering a compound which can be used according to the invention without the need for medical intervention or genetic modification of the organism, ie a longevity can be induced chemically, in particular by administering a substance.
  • the compounds which can be used according to the invention advantageously make it possible to influence the insulin and / or IGF (insulin-like growth factor) signaling pathway, and to use the compounds which can be used according to the invention for the therapeutic and / or prophylactic treatment of diseases and pathological conditions associated with regulation insulin and / or IGF (insulin-like growth factor) signaling pathway.
  • the regulation of the insulin-like and / or IGF (insulin-like growth factor) signaling pathway is influenced by a large number of hormones and messenger substances that are in a complex equilibrium. A disturbed regulation can lead to a variety of diseases, such as obesity.
  • these are diseases and pathological conditions associated with a disorder of insulin and / or IGF (insulin-like growth factor) signaling pathway, particularly diseases and pathological conditions caused by an increase in insulin and / or insulin. or IGF signaling.
  • the compounds which can be used according to the invention can bring about an inhibition of the insulin and / or IGF (insulin-like growth factor) signaling pathway.
  • Preferred treatable diseases and pathological conditions associated with regulation of the insulin and / or IGF signaling pathways are selected from the group consisting of obesity, cell aging, cell damage caused by aging, especially in the liver and / or pancreas, age-related pathological conditions of liver - and / or pancreatic cells, age-related dysfunctions, such as a reduced ability to regenerate liver and / or pancreas, cell stress, especially oxidative stress, in particular by increased metabolism of sugar-induced stress, and / or apoptosis, in particular ß-cell apoptosis.
  • use of the compounds which can be used according to the invention can lead to the prolongation of the life of animals, for example mammals, in particular in humans.
  • the compound according to the formula (9) has been shown to have a positive effect on the life span in vivo.
  • the compound according to the formula (9) was able to prolong the life span of flies in vivo.
  • a chemically induced prolongation of life or of age is a very particular advantage that can be provided by the compounds useful in this invention.
  • the compounds which can be used according to the invention in particular the compound according to the formula (9), can have a positive effect on the immune system.
  • the compounds which can be used according to the invention, in particular the compound according to the formula (9) can bring about an activation of the immune system.
  • the compounds which can be used according to the invention may have a low or negligible toxicity during administration. This allows, for example, long-term administration. This also allows prophylactic administration, especially to humans.
  • the compounds which can be used according to the invention can be administered in accordance with customary methods.
  • Preferred is oral or parenteral administration, more preferred is oral administration.
  • the compounds useful in the invention are formulated for oral or intravenous administration.
  • Preferred auxiliaries and / or solvents are selected from the group comprising DMSO (dimethyl sulfoxide), glycerol and / or oil.
  • solvents are selected from the group comprising DMSO and / or vegetable oil, in particular olive oil.
  • An advantage of using oil, such as olive oil, is that it can provide an improvement in compatibility.
  • Human HepG2 cells were cultured in EMEM medium (Cambrex) with the addition of 10% fetal calf serum. 10 5 cells were seeded in 2 ml of medium in 6 well plates and cultured at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 for 1 to 3 days before being used for experiments.
  • mice C57BL / 6 mice (Charles River Laboratories) which were maintained in a pathogen-free animal facility for a 12-hour light / dark cycle. The animals received standard mouse food (19% protein, 3.3% fat, 41.3% carbohydrates, ssniff Spezialdi decisiven GmbH) ad libitum. Male animals were used between the ages of 8 and 12 weeks.
  • Drosophila flies (strain # 6326 from the Bloomington Public Collection, genotype: white 1118 , URL http://flybase.Org/.bin/fbidq.html7FBst0006326) were used in groups of 20 flies with male to female ratios of 1 : 1 at 25 ° C on standard fly food (0.53% (w / v) Fadenagar (company "GeBruzmühle Brecht"), 1.1% (w / v) brewer's yeast (company “GeBruzmühle Brecht”), 5.43 % (w / v) maize flour; 6.6% (v / v) sugar beet syrup (Grafschafter); 0.13% (w / v) nipagin (methyl-4-hydroxybenoate sodium salt, Merck); 1.3% (v (v) Ethanol (Roth), 0.3% DMSO (Roth) Adult flies were used for the experiments zero to four hours after hatching, and the animals were given
  • IGFBPl insulin-like growth factor binding protein
  • Human HepG2 cells (ECACC) were removed from the medium for 24 hours, cells were incubated for an additional 12 hours at concentrations of 1.5625 ⁇ M, 3.125 ⁇ M, 6.25 ⁇ M, 12.5 ⁇ M, 25 ⁇ M or 50 ⁇ M of the compound of the formula (9) and incubated with 10 nM insulin. Control cells received DMSO in the same concentration as the treated cells.
  • IGFBPl insulin-like growth factor binding protein
  • Serum HepG2 cells (ECACC) were removed from the medium for 90 minutes, cells were incubated for an additional 60 minutes with 5 ⁇ M, 10 ⁇ M and 15 ⁇ M of the compound of formula (9), 200 nM Wortmannin or DMSO (dimethylsulfoxide). incubated at the appropriate concentration before the cells were stimulated for 10 minutes with 100 nM insulin. The cells were then incubated in lysis buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM ⁇ -glycerophosphate, 1 mM sodium vanadate, 1% Triton X. -100) and protease inhibitor mix HP (Serva).
  • lysis buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2.5 mM sodium pyrophosphat
  • the compound according to the formula (9) inhibited the insulin-dependent phosphorylation of both proteins Akt and FoxOlA in a concentration-dependent manner.
  • application of 10 ⁇ M resulted in a 50% reduction in Akt phosphorylation compared to phosphorylation following insulin stimulation
  • 15 ⁇ M of Formula (9) compound reduced Akt phosphorylation to approximately 25% phosphorylation Insulin stimulation resulted.
  • mice received standard mouse feed mixed with 0.9 ⁇ mol / g of compound of formula (9) for 3 days, while a control group of 6 animals received standard mouse feed. Subsequently, the animals were intraperitoneally injected with 100 ⁇ l of physiological saline (control) or saline with 40 ⁇ g of recombinant human insulin (Sigma).
  • mice were anesthetized, the liver was removed and placed in lysis buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM ⁇ -glycerophosphate , 1 mM sodium vanadate, 1% Triton X-100) and protease inhibitor mix HP (Serva).
  • lysis buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM ⁇ -glycerophosphate , 1 mM sodium vanadate, 1% Triton X-100
  • protease inhibitor mix HP Serva
  • RNA from 15 mg of mouse liver each was isolated by means of the Absolutely RNA kit (Stratagene) and the cDNA was prepared by reverse transcription of 2 ⁇ g of RNA using the High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions.
  • Quantitative PCR was performed in 10 ⁇ l batches in an iQ5 cycler (BioRad) using the TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) using primers (Applied Biosystems) against Igfbpl, Fbp2, Pckl, Pck2, G6pc, Hk2, PkIr, Gck, Gckr carried out according to manufacturer's instructions. The data were normalized to ⁇ 2-microglobulin expression.
  • Gck glucokinase
  • Gckr its regulator
  • PkIr liver pyruvate kinase
  • Hk2 hexokinase 2
  • Formula (9) in vivo in flies Three groups of 100 Drosophila larvae received 10 mg of the compound of the formula (9) mixed with 1 g of autoclaved and powdered rearing yeast (Brewferm) while three control groups of 100 animals received the ragged rearing yeast. This feed was administered on water-saturated filters (Macherey-Nagel) for 3 days at 25 ° C.
  • cDNA was prepared from 500 ng total RNA using the QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions including DNasel treatment. PCR was carried out in batches with a total volume of 25 ⁇ l (iQ5 Real-Time PCR Detection System, BioRad). The batches contained 1 .mu.l of the cDNA batch, 200 nM each and 3'- and 5'-primer (Metabion) 12.5 ul 2x iQ5 SYBR Green Supermix (BioRad).
  • the PCR program used consisted of 40 cycles with the following steps: 15 seconds denaturing at 95 0 C, 30 sec annealing at 59 0 C and 30 seconds extension at 72 0 C.
  • the analysis was performed using the iQ5 Optical System Software (Version 1.1. 1442. OCR, BioRad). Actin 5C (Act5C, act) and the ribosomal protein L32 (RpL32, rp49) served as reference genes.
  • DMSO ad 0.5% (v / v) ad was added to the medium and, depending on the experiment for 2 hours before insulin stimulation, the compound according to the formula (9 ad 10 ⁇ M)
  • human insulin Sigma
  • the cells were washed with cold PBS in cold (4 ° C.) lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1.0% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 50 mM NaF, 100 ⁇ M sodium orthovanadate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and EDTA-free protease inhibitor (Roche) according to the manufacturer's instructions, and used for Western blot analysis.
  • Example 4 it was found that the insulin-stimulated phosphorylation of the protein Akt was reduced by half by the administration of the compound of the formula (9).
  • Drosophila Schneider 2 (S2) cells were cultured in Schneider's Medium (PAN) with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS). 2 ⁇ 10 6 cells were grown to 80% confluency in 35 mm tubes at 25 ° C, washed once in phosphate buffered saline (1 ⁇ PBS, Gibco), and transferred to Schneider's medium without FCS for 12 hours. The cells were then preincubated for two hours with Schneider's medium containing 0.5% DMSO without FCS with or without the compound according to formula (9) or formula (25), the final concentrations for the compounds according to formulas (9) and (25) were 1 ⁇ M, 10 ⁇ M and 100 ⁇ M. This was followed by 4-hour stimulation with 10 ⁇ g / ml human insulin (Sigma).
  • PAN Schneider's Medium
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • the PCR was carried out in batches with a total volume of 25 .mu.l, wherein the approaches each 1 ul of the cDNA approach, 200 nM 3'- and 5'-primer (Metabion) and 12.5 ul 2x iQ5 SYBR Green Supermix (BioRad ) contained.
  • the PCR program used comprised 40 cycles with the following steps: 15 seconds denaturation at 95 0 C for 30 seconds annealing at 59 0 C and 30 seconds extension at 72 0 C.
  • the evaluation of the real time data as per manufacturer's specifications with the BIO-RAD iQ5 Optical System Software (Version 1.1.1442.OCR).
  • the activity of the insulin signaling pathway was determined by the transcription rate of the insulin target gene Drosophila eukaryotic initiation factor 4E binding protein (d4EBP, Thor).
  • the genes Actin 5C (Act5C, act) and Ribosomal protein L32 (RpL32, rp49) were used as reference genes.
  • Table 1 shows the sequences of the oligonucleotides used for the real time analysis.
  • control solutions and the solutions containing the compounds of the formula (9) or (25) were each mixed with 450 ml of the stock solution and 4 ml each in polystyrene vessels (height 9.5 cm, diameter 2.3 cm, closed with cotton wool) submitted to the attitude of the flies. After 24 hours, the cooled vessels were closed with cotton wool and stored at 4 0 C.
  • the final concentration of feed components in the control diet was 6.5% (w / v) autolyzed yeast, 6.5% (w / v) ⁇ -D (+) - glucose monohydrate, 2% (w / v) agar, 0 , 3% (w / v) /> hydroxybenzoic acid methyl ester, 2.1% ethanol (v / v), 0.34% (v / v) DMSO.
  • the final concentration of feed components in the feed containing the compound of formula (9) was 6.5% (w / v) autolyzed yeast, 6.5% (w / v) ⁇ -D (+) - glucose monohydrate, 2 % (w / v) agar, 0.3% (w / v) /> hydroxybenzoic acid methyl ester, 2.1% ethanol (v / v), 0.34% (v / v) DMSO, 10 ⁇ M compound of the formula ( 9).
  • the final concentration of feed components in the feed containing the compound of formula (25) 6.5% (w / v) autolyzed yeast, 6.5% (w / v) ⁇ -D (+) - glucose monohydrate, 2% (w / v) agar, 0.3% (w / v) /> hydroxybenzoic acid methyl ester, 2.1% ethanol (v / v), 0.34% (v / v) DMSO, 10 ⁇ M compound according to formula (25 ).
  • the larvae were grown on standard fly feed containing 1.1% (w / v) brewer's yeast (company “GeBruzmühle Brecht”), 5.43% (w / v) maize flour, 0.53% (w / v) Fadenagar (company “ GeBruzmühle Brecht "), 6.6% (v / v) sugar beet syrup (Grafschafter), 1.3% (v / v) ethanol (company Roth), 0.13% (w / v) /> hydroxybenzoic acid methyl ester (Sigma).
  • the values show the average survival time in days ( ⁇ standard error).
  • a further increase in lifespan could be achieved in flies in which the Drosophila cytohesin steppke mutated and the amount of Drosophila cytohesin steppke protein was reduced.
  • Example 7 To show that the increased lifespan of the flies fed with the compound according to the formula (9) shown in Example 7 was not due to these
  • the food intake of flies was measured using the Capillary Feeder Assay (CAFE) and statistically evaluated.
  • CAFE Capillary Feeder Assay
  • the control diet contained 5% (w / v) autolyzed yeast, 5% (w / v) ⁇ -D (+) - glucose monohydrate, 0.3% (w / v) p-hydroxybenzoic acid methyl ester, 2.1% ethanol (v / v), 0.34% (v / v) DMSO.
  • the feed with the compound of formula (9) contained 5% (w / v) autolyzed yeast, 5% (w / v) ⁇ -D (+) - glucose monohydrate, 0.3% (w / v) p- Hydroxybenzoic acid methyl ester, 2.1% ethanol (v / v), 0.34% (v / v) DMSO, 10 ⁇ M compound according to formula (9).

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen und/oder zur chemischen Induktion von Langlebigkeit.

Description

Verwendung von Cytohesin-Inhibitoren zur chemischen Induktion von Langlebigkeit
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen gemäß der allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und (4) zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen, und/oder zur chemischen Induktion von Langlebigkeit.
Verbindungen gemäß der allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und (4) sind aus der Schrift DE 10 2004 055 998 Al bekannt.
Jede Zellfunktion einschließlich der Zellalterung und des Zelltods wird durch eine Vielzahl von Zellsignalwegen kontrolliert. Auch die Entwicklung einiger Krankheiten ist von der Zellalterung abhängig und die Wahrscheinlichkeit, an Erkrankungen zu sterben, steigt mit zunehmendem Alter an.
Ein weiteres weit verbreitetes Problem, das mit dem heutigen Lebensstil verbunden ist, ist Fettleibigkeit, auch Adipositas genannt. Diese ist ein Schlüsselfaktor für die Entwicklung vieler chronischer Erkrankungen sowie einiger Krebsarten.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die wenigsten einen der Nachteile des Standes der Technik überwinden. Insbesondere bestand die Aufgabe, Mittel zur Verfügung zu stellen, die eine Beeinflussung des Insulin- Signalwegs erlauben.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) wie nachstehend angegeben:
worin:
R ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl -C 10-Alkyl), CONH2, CONH(Cl- ClO-Alkyl), CON(Cl -C 10-Alkyl)2, NHCO(Cl -C 10-Alkyl), NHCOCHCl2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF3, Amin, Cl-C10-Alkyl, Cl-C10-Alkoxy und/oder ein Strukturelement (Al), (Bl), (Cl), (Dl), (El), (Fl), (Gl), (Hl), (II), (Jl), (Ll), (Ml) wie nachstehend angegeben: wonn: - A -
R4 ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl -C 10-Alkyl), CONH2, CONH(Cl -C 10-Alkyl), CON(Cl -C 10-Alkyl)2, NHCO(Cl -C 10-Alkyl), NHCOCHCl2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF3, Amin, Cl-C10-Alkyl und/oder Cl-C10-Alkoxy,
und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen und/oder zur chemischen Induktion von Langlebigkeit.
Es wurde überraschend gefunden, dass die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine Beeinflussung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs zeigen können. Insbesondere wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen in Mäusen zu einer Insulin-Resistenz, d.h. einer verminderten Aktivität des Insulinsignalwegs, führen können.
Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass die Beeinflussung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs und die Insulin-Resistenz auf einer Inhibition der Cytohesine, insbesondere von Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und/oder Cytohesin-4, durch die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen beruht.
Es wurde überraschend gefunden, dass Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) zu einer chemisch induzierten Langlebigkeit führen können. Es wurde weiter überraschend gefunden, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) zu einer deutlich verbesserten chemisch induzierten Langlebigkeit, beispielsweise zu einer signifikanten Verlängerung der Lebensspanne bei Fliegen führen kann. Insbesondere ist von Vorteil, dass insbesondere die Verbindung gemäß der Formel (9) eine Aktivierung des Immunsystems bewirken können.
Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (Al), (Bl), (Cl), (Dl) und/oder (El) auf. In weiter bevorzugten Ausführungsformen weisen die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens ein Strukturelement ausgewählt aus der Gruppe umfassend (El), (Fl), (Gl), (Hl), (II), (Jl), (Kl), (Ll), (Ml) und/oder (Ol) auf.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Strukturelement R4 gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, NHCOCHCb, Cl, CF3, und/oder F.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ist, dass die Verbindungen insbesondere auch für die prophylaktische Verwendung verwendbar sind. Hierdurch ergibt sich nicht nur die Möglichkeit die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Behandlung bereits bestehender pathologischer Zustände zu verwenden sondern auch deren prophylaktischer Einsatz in der Vorsorge, beispielsweise von altersbedingten Zellschäden oder Fettleibigkeit.
Unter dem Begriff "prophylaktische Behandlung" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere verstanden, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen prophylaktisch verabreicht werden können, beispielsweise bevor altersbedingte Zellschäden auftreten. Insbesondere ist von Vorteil, dass beispielsweise Fettleibigkeit durch eine prophylaktische Behandlung verhindert werden kann.
In bevorzugten Ausfuhrungsformen sind die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7) und/oder (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
worin:
Ri ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R2, R3 und/oder ein Strukturelement (A2), (B2), (C2), (D2), (N2) wie nachstehend angegeben:
ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Rh R3 und/oder ein Strukturelement (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2), (L2), (M2), (02) wie nachstehend angegeben:
R3 (H2)
R3 ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Ri, R2, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl -C 10-Alkyl), CONH2, CONH(Cl -C 10-Alkyl), CON(Cl- C10-Alkyl)2, NHCO(Cl -C 10-Alkyl), NHCOCHCl2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF3, Amin, Cl-C10-Alkyl und/oder Cl-Cl O-Alkoxy .
Vorzugsweise sind wenigstens eines oder mehrere der Strukturelemente Ri, R2 und/oder R3 gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus den schwefelhaltigen Strukturelementen (A2), (B2), (C2) und/oder (D2). Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen können mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) aufweisen. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) auf. Weiter bevorzugt weisen die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens ein Strukturelement ausgewählt aus der Gruppe umfassend (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2), (L2), (M2) und/oder (02) auf. Vorzugsweise ist das Strukturelement R3 der Strukturelemente (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2), (L2), (M2) und/oder (02) Wasserstoff.
In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen sind die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7) und/oder (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
worin:
Ri ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R2, R3 und/oder ein Strukturelement (A3), (B3), (C3), (D3), (N3) wie nachstehend angegeben:
ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Rh R3 und/oder ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3), (L3), (M3), (03) wie nachstehend angegeben:
(H3)
R3 ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Ri, R2, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl -C 10-Alkyl), CONH2, CONH(Cl -C 10-Alkyl), CON(Cl- C10-Alkyl)2, NHCO(Cl -C 10-Alkyl), NHCOCHCl2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF3, Amin, Cl-C10-Alkyl und/oder Cl-Cl O-Alkoxy .
Bevorzugt sind wenigstens eines oder mehrere der Strukturelemente Ri, R2 und/oder R3 der Verbindungen (5), (6), (7) und (8) gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus den schwefelhaltigen Strukturelementen (A3), (B3), (C3) und/oder (D3). Die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen können mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) auf. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) auf. In weiter bevorzugten Ausführungsformen weisen die erfϊndungsgemäß verwendbaren Verbindungen wenigstens ein Strukturelement ausgewählt aus der Gruppe umfassend (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3), (L3), (M3) und/oder (03) auf.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind wenigstens ein Strukturelement R, R1, R2, R3 und/oder R4, vorzugsweise wenigstens ein Strukturelement R der Verbindungen (1), (2), (3) und (4), insbesondere R3 der Verbindungen (5), (6), (7) und (8), jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl-C5-Alkyloxy, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend -O-Methyl, -O-Ethyl, - O-Isopropyl und/oder -O-tert-Butyl. Besonders bevorzugt unter den Cl-C5-Alkoxygruppen sind Methoxy- und/oder Ethoxygruppen, ganz besonders bevorzugt sind Methoxygruppen.
Es wurde überraschend gefunden, dass die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine wesentlich verbesserte Wirkung aufweisen, je kleiner die Alkoxygruppen sind. So wurde überraschend festgestellt, dass eine erheblich Steigerung der Wirksamkeit bei der Verwendung der Verbindungen erzielt werden kann, wenn die Alkoxygruppe R3, insbesondere der Verbindungen (5), eine Cl-C2-Alkoxygruppe ist, und eine weitere Steigerung der Wirksamkeit der Verbindung erzielt werden kann, wenn die Alkoxygruppe R3 eine Methoxygruppe ist.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen 1,2,4-Triazole ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen gemäß den Formeln (1) und/oder (5). Vorzugsweise ist Ri der Verbindungen gemäß Formel (5) ein Strukturelement (A3), (B3), (C3), (D3) oder (N3), R2 ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3), (L3), (M3) oder (03) und/oder R3 eine C 1-C5 -Alkoxygruppe, bevorzugt eine Methoxy- oder Ethoxygruppe. Bevorzugt ist Ri der Verbindungen gemäß Formel (5) ein Strukturelement (A3) oder (B3), R2 ein Strukturelement (E3), (F3) oder (K3) und/oder R3 eine eine Methoxy- oder Ethoxygruppe. In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (22), (23) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
O' O H N ^1
O
N
(9)
(10)
Es wurde überraschend gefunden, dass insbesondere 1,2,4-Triazole gemäß der allgemeinen Formeln (1) und/oder (5), insbesondere gemäß Formel (9), eine Insulin-Resistenz hervorrufen und/oder zu einer chemisch induzierten Langlebigkeit führen können. In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (12), (14), (20), (21) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Eine andere Ausführungsform der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze weist die nachstehende Formel (25) auf:
In weiterhin bevorzugten Ausfuhrungsformen können die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen derivatisiert sein, beispielsweise phosphoryliert, glykosyliert, acetyliert, ubiquitinyliert, farnesyliert, palmitoyliert, geranylgeranyliert und/oder biotinyliert.
Bevorzugte Derivate sind biotinylierte Verbindung, besonders bevorzugt ist beispielsweise Verbindung (24) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze
(24).
Ein Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen kann dadurch verwirklicht werden, dass diese eine inhibitorische Wirkung auf Cytohesin-abhängige Signalkaskaden des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs ausüben können. Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen können beispielsweise in vivo in der Maus und in der Fliege zeigen, dass eine Insulin-Resistenz bewirkt werden kann. Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen können weiterhin in in vitro-Experimenten in humanen Leberzellen zeigen, dass diese ebenfalls eine Insulin-Resistenz entwickeln können. Eine Insulin-Resistenz kann zu einer Erhöhung der Lebensdauer bzw. Langlebigkeit führen und es ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten in der Therapie von altersbedingten Erkrankungen.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen kann dadurch zur Verfügung gestellt werden, dass diese im Rahmen einer therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung eine chemisch induzierte Langlebigkeit erlauben können. Unter dem Begriff einer „chemisch induzierten Langlebigkeit" wird im Rahmen dieser Erfindung verstanden, dass durch die Verabreichung der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen die Lebensdauer eines Organismus und/oder eines Gewebes oder Organs verlängert werden kann. Eine Verlängerung der Lebensdauer eines Organismus und/oder eines Gewebes oder Organs kann vorteilhafter Weise dadurch erzielt werden, dass eine erfindungsgemäß verwendbare Verbindung verabreicht wird, ohne dass ein medizinischer Eingriff oder eine genetische Veränderung des Organismus notwendig ist, eine Langlebigkeit also chemisch insbesondere durch Verabreichen einer Substanz induziert werden kann.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen ermöglichen vorteilhafter Weise eine Beeinflussung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs, und eine Verwendung der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen. Die Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs wird durch eine Vielzahl von Hormonen und Botenstoffen beeinflusst, die in einem komplexen Gleichgewicht stehen. Eine gestörte Regulation kann zu vielfältigen Erkrankungen führen, beispielsweise zu Fettleibigkeit. Vorzugsweise handelt es sich um Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Störung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen, insbesondere um Erkrankungen und pathologischen Zustände, die durch eine Erhöhung des Insulin- und/oder IGF-Signallings verursacht werden. In bevorzugten Ausführungsformen könne die erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine Inhibierung des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs bewirken.
Bevorzugt behandelbare Erkrankungen und pathologische Zustände, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-Signalwegs in Zusammenhang stehen, sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fettleibigkeit, Zellalterung, alterungsbedingte Zellschäden, insbesondere in Leber und/oder Bauchspeicheldrüse, alterungsbedingte pathologische Zustände von Leber- und/oder Bauchspeicheldrüsen-Zellen, alterungsbedingte Funktionsstörungen, beispielsweise eine verminderte Regenerationsfähigkeit von Leber und/oder Bauchspeicheldrüse, Zellstress, insbesondere oxidativer Stress, insbesondere durch erhöhte Verstoffwechselung von Zucker ausgelöster Stress, und/oder Apoptose, insbesondere ß-Zell-Apoptose.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann eine Verwendung der erfmdungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Verlängerung des Lebensalters von Tieren, beispielsweise Säugetieren, insbesondere bei Menschen führen.
Erfindungsgemäß hat sich für die Verbindung gemäß der Formel (9) gezeigt, dass diese in vivo eine positive Auswirkung auf die Lebensspanne zeigen kann. So konnte experimentell festgestellt werden, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) in vivo eine Verlängerung der Lebensspanne von Fliegen bewirken konnte. Eine chemisch induzierte Verlängerung des Lebens oder des Lebensalters ist ein ganz besonderer Vorteil, der durch die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen zur Verfügung gestellt werden kann.
Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird weiterhin vermutet, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen insbesondere die Verbindung gemäß der Formel (9) einen positiven Effekt auf das Immunsystem haben können. Insbesondere wird vermutet, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen insbesondere die Verbindung gemäß der Formel (9) eine Aktivierung des Immunsystems bewirken können.
Vorteilhafter Weise können die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen eine nur geringe oder vernachlässigbare Toxizität bei der Verabreichung aufweisen. Dies ermöglicht beispielsweise eine langfristige Verabreichung. Dies ermöglicht auch eine prophylaktische Verabreichung, insbesondere an Menschen.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind entsprechend üblichen Methoden verabreichbar. Bevorzugt ist eine orale oder parenterale Verabreichung, besonders bevorzugt ist eine orale Verabreichung. In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen für die orale oder intravenöse Verabreichung formuliert. Bevorzugte Hilfsstoffe und/oder Lösemittel sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend DMSO (Dimethylsulfoxid), Glycerol und/oder Öl. Vorzugsweise sind Lösemittel ausgewählt aus der Gruppe umfassend DMSO und/oder Pflanzenöl, insbesondere Olivenöl. Ein Vorteil der Verwendung von Öl, beispielsweise Olivenöl, liegt darin, dass eine Verbesserung der Verträglichkeit zur Verfügung gestellt werden kann.
Beispiele, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben. Material und Methoden
Zellkultur
Humanen HepG2-Zellen (ECACC) wurden in EMEM Medium (Cambrex) unter Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum kultiviert. 105 Zellen wurden in 2 ml Medium in 6 well-Platten ausgesäht und bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 für 1 bis 3 Tage kultiviert, bevor sie für Experimente benutzt wurden.
Mäuse
Verwendet wurden C57BL/6 Mäuse (Charles River Laboratories), die unter Einhaltung eines 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus in einer pathogenfreien Tieranlage gehalten wurden. Die Tiere erhielten ein Standardmaus-Futter (19% Protein, 3,3% Fett, 41,3% Kohlenhydrate; ssniff Spezialdiäten GmbH) ad libitum. Verwendet wurden männliche Tiere im Alter zwischen 8 und 12 Wochen.
Fliegen
Verwendet wurden Drosophila Fliegen (Stamm # 6326 aus der öffentlichen Bloomington Stammsammlung, Genotyp: white1118,URL http://flybase.Org/.bin/fbidq.html7FBst0006326), die in Gruppen von 20 Fliegen mit einem Verhältnis Männchen zu Weibchen von 1 : 1 bei 25°C auf Standard-Fliegenfutter (0,53 % (w/v) Fadenagar (Firma „Gewürzmühle Brecht"); 1,1 % (w/v) Bierhefe (Firma „Gewürzmühle Brecht"); 5,43 % (w/v) Maismehl; 6,6 % (v/v) Zuckerrübensirup (Grafschafter); 0,13 % (w/v) Nipagin (Methyl-4-Hydroxybenoat Natriumsalz, Firma Merck); 1,3 % (v/v) Ethanol (Firma Roth), 0,3 % DMSO (Roth) gehalten wurden. Für die Versuche wurden adulte Fliegen null bis vier Stunden nach Schlüpfen aus der Puppe verwendet; die Tiere erhielten jeden dritten Tag neues Futter.
Beispiel 1 Untersuchungen der Transkription von IGFBPl (Insulin- like Growth Factor Binding Protein) zur Beeinflussung des Insulin- Signal wegs durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in Leberzellen
Humanen HepG2-Zellen (ECACC) wurde für 24 Stunden Serum aus dem Medium entfernt, die Zellen wurden für weitere 12 Stunde mit Konzentrationen von 1,5625 μM, 3,125 μM, 6,25 μM, 12,5 μM, 25 μM oder 50 μM der Verbindung gemäß der Formel (9) und mit 10 nM Insulin inkubiert. Kontrollzellen erhielten DMSO in entsprechender Konzentration wie die behandelten Zellen.
Gesamt-RNA wurde mittels des Absolutely RNA-Kit (Stratagene) isoliert und die cDNA mittels reverser Transkription von 2 μg RNA mittels des High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) nach Angaben des Herstellers hergestellt. Quantitative PCR wurde in 10 μl Ansätzen in einem iQ5-Cycler (BioRad) mittels des TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) unter Verwendung genspezifischer Primer (Applied Biosystems) gemäß den Herstellervorgaben durchgeführt. Die Daten wurden auf die ß2- Mikroglobulinexpression normalisiert.
Es konnte festgestellt werden, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) die Insulinabhängige Hemmung der Transkription von IGFBPl (Insulin- like Growth Factor Binding Protein), eines prototypischen Insulin-regulierten Gens, nahezu vollständig blockieren konnte. So erreichte die durch 10 nM Insulin deutlich reduzierte Expression in Anwesenheit von 12,5 μM der Verbindung gemäß der Formel (9) nahezu den Wert der unbehandelten Zellen.
Beispiel 2
Untersuchungen der Phosphorylierung von Akt und FoxOlA zur Beeinflussung des Insulin- Signalwegs durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in Leberzellen Die Expression von IGFBPl (Insulin- like Growth Factor Binding Protein) wird durch Insulin mittels der forkhead box-Transkriptionsfaktoren Ol A (FoxOlA) und 03 A (FoxO3A) kontrolliert. Nach Insulin- Stimulation wird die Proteinkinase B/ Akt (PKB/Akt) in Abhängigkeit von der Phosphoinositid-3-kinase (PI3K) durch Phosphorylierung aktiviert gelangt in den Nukleus wo sie den Transkriptionsfaktor Ol A (FoxOlA) phosphoryliert, welches zu einer Verminderung der Genexpression von beispielsweise IGFBPl führt.
Humanen HepG2-Zellen (ECACC) wurde für 90 Minuten Serum aus dem Medium entfernt, die Zellen wurden für weitere 60 Minuten mit 5 μM, 10 μM und 15 μM der Verbindung gemäß der Formel (9), 200 nM Wortmannin oder DMSO (Dimethylsulfoxid) entsprechender Konzentration inkubiert bevor die Zellen 10 Minuten mit 100 nM Insulin stimuliert wurden. Anschließend wurden die Zellen in Lysepuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM ß-Glycerophosphat, 1 mM Natriumvanadat, 1 % Triton X-100) und Proteaseinhibitormix HP (Serva) lysiert.
Normalisierte Mengen an Protein wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose-Membranen transferiert. Für den Proteinnachweis mittels Immunoblotting wurde ein Antikörper gegen das phosphorylierte Protein Akt, pAkt (Thr308) (Cell Signalling) verwendet. Die Visualisierung erfolgte durch das Enhanced Chemielumineszenz System (Millipore) mittels einer VersaDoc 5000 CCD Kamera (BioRad) und die Intensität der Banden wurde mit der Software QuantityOne (BioRad) quantifiziert.
Es konnte festgestellt werden, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) die Insulinabhängige Phosphorylierung beider Proteine Akt und FoxOlA konzentrationsabhängig inhibierte. So führte die Applikation von 10 μM zu einer 50prozentigen Reduktion der Phosphorylierung von Akt verglichen mit der Phosphorylierung nach Insulin-Stimulation, während 15 μM der Verbindung gemäß der Formel (9) zu einer Reduktion der Phosphorylierung von Akt auf ca. 25% der Phosphorylierung nach Insulin-Stimulation führte. Diese Beispiele zeigen, dass die Inhibition der Cytohesine durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in menschlichen Leberzellen zu einer Inhibition des Insulin-Signalwegs im Sinne einer Insulin-Resistenz fuhrt.
Beispiel 3
Untersuchungen zur Erzeugung einer Insulin-Resistenz durch die Verbindung gemäß der
Formel (9) in vivo in der Maus
Eine Gruppe von 6 C57BL/6 Mäusen erhielt für 3 Tage mit 0,9 μmol/g der Verbindung gemäß der Formel (9) vermischtes Standardmaus-Futter, während eine Kontrollgruppe von 6 Tieren Standardmaus-Futter erhielten. Anschließend wurden den Tieren intraperitoneal 100 μl physiologische Kochsalzlösung (Kontrollgruppe) bzw. Kochsalzlösung mit 40 μg rekombinantem humanem Insulin (Sigma) injiziert. Nach 10 Minuten wurden die Mäuse anästhetisiert, die Leber wurde entnommen und in Lysepuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM ß- Glycerophosphat, 1 mM Natriumvanadat, 1 % Triton X-100) und Proteaseinhibitormix HP (Serva) lysiert.
Gesamt-RNA aus jeweils 15 mg Mausleber wurde mittels des Absolutely RNA-Kit (Stratagene) isoliert und die cDNA mittels reverser Transkription von 2 μg RNA mittels des High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) nach Angaben des Herstellers hergestellt. Quantitative PCR wurde in 10 μl Ansätzen in einem iQ5-Cycler (BioRad) mittels des TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) unter Verwendung von Primern (Applied Biosystems) gegen lgfbpl, Fbp2, Pckl, Pck2, G6pc, Hk2, PkIr, Gck, Gckr nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Daten wurden auf die ß2-Mikroglobulinexpression normalisiert. Untersucht wurde die Expression verschiedener Gene, die über den PI3K-abhängigen Pfad des Insulin-Rezeptor-Signalwegs gesteuert werden, das FoxO-regulierte Modellgen Igfbpl, Pyruvatcarboxykinase 1 and 2 (Pckl, Pck2), Fructose-l,6-bisphosphatase 2 (Fbp2), und Glucose-6-phosphatase (G6pc) die an die Glukoneogenese beteiligt sind wie auch der glycolytischen Enzyme Glucokinase (Gck), deren Regulator (Gckr), Leberpyruvatkinase (PkIr) und Hexokinase 2 (Hk2).
Weiterhin wurden normalisierte Mengen an Protein mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose-Membranen transferiert mittels Immunoblotting über einen Antikörper gegen das phosphorylierte Protein Akt, pAkt (Thr308) (Cell Signalling) dieses nachgewiesen. Die Visualisierung und Auswertung erfolgte wie in Beispiel 2 angegeben.
Es konnte festgestellt werden, dass die Expression der untersuchten durch Insulin unterdrückten glukoneogenetischen Gene durch die Verabreichung der Verbindung gemäß der Formel (9) erhöht wurde, während die Expression der durch Insulin induzierten glykolytischen Gene statistisch signifikant verringert wurde. In Übereinstimmung zu diesem Ergebnis wurde ebenfalls festgestellt, dass die durch Insulin stimulierte Phosphorylierung das Proteins Akt durch die Verabreichung der Verbindung gemäß der Formel (9) um ca. 40 % inhibert wurde.
Dies zeigt, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) in vivo eine hepatische Insulin- Resistenz hervorruft.
Beispiel 4
Untersuchungen zur Erzeugung einer Insulin-Resistenz durch die Verbindung gemäß der
Formel (9) in vivo in Fliegen Drei Gruppen von 100 Drosophila Larven erhielten 10 mg der Verbindung gemäß der Formel (9) vermischt mit 1 g autoklavierter und pulverisierter Aufzucht-Hefe (Brewferm) während drei Kontrollgruppen von 100 Tieren die unversetzte Aufzucht-Hefe erhielten. Dieses Futter wurde auf wassergetränkten Filtern (Macherey-Nagel) für 3 Tage bei 25°C verabreicht.
Es wurden jeweils mehr als 10 Tiere der Gruppe gründlich mit Wasser gewaschen, in Lysepuffer (NucleoSpin RNA II kit, Macherey & Nagel) verbracht und 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit (Ultra-Turrax T25basic) homogenisiert. Die Gesamt-RNA wurde mittels des NucleoSpin RNA II Kits (Macherey & Nagel, einschließlich DNase I-Behandlung auf der Säule) isoliert.
cDNA wurde aus jeweils 500 ng Gesamt-RNA mittels des QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben einschließlich DNasel-Behandlung hergestellt. PCR wurde in Ansätzen mit einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt (iQ5 Real-Time PCR Detection System, BioRad). Die Ansätze enthielten 1 μl des cDNA- Ansatzes, jeweils 200 nM und 3'- und 5'-Primer (Metabion) 12,5 μl 2x iQ5 SYBR Green Supermix (BioRad).
Das verwendete PCR-Programm umfasste 40 Zyklen mit den folgenden Schritten: 15 Sekunden Denaturieren bei 95 0C, 30 Sekunden Annealen bei 59 0C und 30 Sekunden Extension bei 72 0C. Die Auswertung erfolgte mittels der iQ5 Optical System Software (Version 1.1.1442. OCR, BioRad). Als Referenzgene dienten Actin 5C (Act5C, act) und das ribosomale Protein L32 (RpL32, rp49).
Es konnte festgestellt werden, dass die Expression der untersuchten durch Insulin reprimierten Gene InR (Insulinrezeptor) und 4E-BP, eines Translationsrepressors, durch die Verabreichung der Verbindung gemäß der Formel (9) im falle von 4E-BP auf mehr als das vierfache und im Fall von InR auf mehr als das doppelte erhöht wurde. Beispiel 5
Untersuchungen der Phosphorylierung von Akt durch die Verbindung gemäß der Formel (9) in der Drosophila S2 Schneiderzelllinie
106 Drosophila S2 Zellen (Schneider, 1972. J. Embryol. Exp. Morphol. 27, 353) wurden in Zellkulturmedium (Firma PAN) mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Streptomycin, Penicillin (Gibco) in 35 mm Zellkulturschalen (Firma Nunc) ausgesät und für 2 Tage bei 25 0C bis zu 70-80% Konfluenz kultiviert. Nach 2 Tagen wurde dem Medium DMSO ad 0,5 % (v/v) zugegeben und je nach Versuch für 2 Stunden vor Insulinstimulation die Verbindung gemäß der Formel (9 ad lOμM. Im Falle einer Insulinstimulation wurde humanes Insulin (Sigma) für 15 Minuten ad 10 μg/ml verwendet. Nach erfolgter Stimulation wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen, in kalten (4°C) Lysepuffer (5OmM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 50 mM NaF, 100 μM Natriumorthovanadat, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und EDTA-freier Proteaseinhibitor (Roche) nach Herstellerangabe lysiert und für die Western Blot Analyse eingesetzt.
Jeweils 10 μg Protein wurde auf einem 12 % igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf 0,22 μm porige Nitrozellulose-Membranen (Amersham) transferiert. Die Membranen wurden mittels 5 % (w/v) Milchpulver (Firma Roth) in TBST (150 mM NaCl; 50 mM Tris pH 7,4; 0,1 % (v/v) Tween-20) blockiert. Die Inkubation mit primärem Antikörper wurde über Nacht in 5 % (w/v) BSA in TBST durchgeführt. Die Primärantikörper Anti-Phospho Akt (Ser505) und Anti-Akt (Cell Signalling) wurden jeweils mit einer Verdünnung von 1 : 1000 verwendet. Die Inkubation mit sekundärem Antikörper wurde mit Peroxidase-gekoppeltem Ziege-anti- Kaninchen-Immunoglobulin (Santa Cruz, Serum ID sc-2004) oder Peroxidase-gekoppeltem Esel-anti-Maus-Immunoglobulin (Santa Cruz, Serum ID sc-2314) in einer Verdünnung von 1 : 15000 durchgeführt. Die Visualisierung erfolgte mittels des ECL Kits (Enhanced Chemolumineszenz, Amersham) unter Verwendung des VersaDoc 5000 Imaging Systems (BioRad) und der Software QuantityOne (BioRad).
In Übereinstimmung zu dem Ergebnis von Beispiel 4 wurde festgestellt, dass die durch Insulin stimulierte Phosphorylierung das Proteins Akt durch die Verabreichung der Verbindung gemäß der Formel (9) um die Hälfte vermindert wurde.
Dies zeigt, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) in vivo in der Fliege eine Insulin- Resistenz hervorruft, die in einer Erhöhung der Langlebigkeit resultieren kann.
Beispiel 6
Untersuchungen zur Beeinflussung des Insulin- Signalwegs durch die Verbindung gemäß der
Formel (9) und der Verbindung gemäß der Formel (25) in vitro in Zellen der Drosophila S2
Schneiderzelllinie
Drosophila Schneider 2 (S2) Zellen wurden in Schneider' s Medium (Firma PAN) mit 10 % Hitze-inaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS) kultiviert. 2 x 106 Zellen wurden in 35 mm Gefäßen bei 25°C auf 80 % Konfluenz gezogen, in Phosphat-gepufferter Salzlösung (Ix PBS, Gibco) einmal gewaschen und für zwölf Stunden in Schneider's Medium ohne FCS überführt. Dann wurden die Zellen für zwei Stunden mit Schneider's Medium enthaltend 0,5 % DMSO ohne FCS mit oder ohne die Verbindung gemäß der Formel (9) bzw. Formel (25) vorinkubiert, wobei die Endkonzentrationen für die Verbindungen gemäß der Formel (9) und (25) 1 μM, 10 μM und 100 μM betrugen. Danach erfolgte eine vierstündige Stimulation mit 10 μg/ml humanem Insulin (Sigma).
Anschließend wurde die Gesamt-RNA nach zweimaligem Waschen der Zellen mit PBS unter Verwendung des Kits NucleoSpin RNA II (Macherey & Nagel) nach Herstellerangaben aus den Zellen isoliert. Die Erststrang cDNA Synthese erfolgte mit je 500 ng RNA unter Benutzung des QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) nach Hersteller- Angaben. Die real time PCR-Reaktion wurde mit dem SYBR Green Supermix (BIO-RAD) nach Hersteller- Angaben im iQ5 Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD) durchgeführt. Hierbei wurde die PCR in Ansätzen mit einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt, wobei die Ansätze jeweils 1 μl des cDNA-Ansatzes, 200 nM 3'- und 5'-Primer (Metabion) und 12,5 μl 2x iQ5 SYBR Green Supermix (BioRad) enthielten. Das verwendete PCR-Programm umfasste 40 Zyklen mit den folgenden Schritten: 15 Sekunden Denaturieren bei 95 0C, 30 Sekunden Annealen bei 59 0C und 30 Sekunden Extension bei 72 0C. Die Auswertung der real time Daten erfolgte nach Hersteller- Angaben mit der BIO-RAD iQ5 Optical System Software (Version 1.1.1442.OCR).
Die Aktivität des Insulin-Signalwegs wurde durch die Transkriptionsrate des Insulin-Zielgens Drosophila eukaryotic initiation factor 4E binding protein (d4EBP, Thor) bestimmt. Die Gene Actin 5C (Act5C, act) und Ribosomal protein L32 (RpL32, rp49) wurden als Referenzgene verwendet. Tabelle 1 zeigt die Sequenzen der für die real time Analyse verwendeten Oligonukleotide.
Tabelle 1 Oligonukleotid-Sequenzen
Gen Sequenz Vorwärts-Primer Sequenz Rückwärts-Primer (Metabion) (Metabion)
Act5C GTGCACCGCAAGTGCTTCTAA TGCTGCACTCCAAACTTCCAC (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2)
RpL32 GCTAAGCTGTCGCACAAATG GTTCGATCCGTAACCGATGT (SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 4) d4EBP CATGCAGCAACTGCCAAATC CCGAGAGAACAAACAAGGTGG (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) Es wurde festgestellt, dass in Drosophila Schneider 2 (S2) Zellen, die mit Insulin behandelt wurden, d4EBP transkriptionell auf weniger als 35% der Transkriptionsrate der Kontrollen gehemmt wurde. Dieser hemmende Effekt wurde durch die Verbindungen gemäß der Formel (9) und (25) bei einer Konzentration von 100 μM unterdrückt, wobei die Transkriptionsrate von d4EBP durch Inkubation mit 100 μM der Verbindung gemäß der Formel (9) wieder auf über 85% und durch Inkubation mit 100 μM der Verbindung gemäß der Formel (25) auf über 95% der unbehandelten Kontrollen anstieg.
Somit konnte gezeigt werden, dass beide Verbindungen gemäß der Formel (9) und (25) den Insulin-Signalweg bei einer Konzentration von 100 μM beeinflussten und in vitro zu einer Insulin-Resistenz führten.
Beispiel 7
Untersuchungen zur Beeinflussung der Lebensspanne von adulten Drosophila melanogaster-
Fliegen durch die Verbindungen gemäß der Formel (9) und (25)
Fliegen
Die Untersuchungen wurden durchgeführt an isogenen Fliegen (Drosophila melanogaster) des Genotyps white1118, auch white" oder w" genannt, und Mutanten (w1118 ; stepk08110 / stepSH0323) (Stamm # 10770 aus der öffentlichen Bloomington Stammsammlung, Genotyp: stepk08U0 / CyO, URL http://flybase.bio.indiana.edu/reports/FBst0010770.html; Stamm # FBst0103734 aus der öffentlichen Szeged Stammsammlung, Genotyp: stepSH0323 / CyO, URL http://flybase.bio.indiana.edu/reports/ FBst0103734.html), bei denen das Drosophila- Cytohesin steppke mutiert und dadurch defekt ist.
Durch achtmalige Rückkreuzung der beiden steppke Allele kO8110 und SH0323 mit white - Fliegen wurde ein isogener genetischer Hintergrund geschaffen, der einen Vergleich der Lebensspanne zwischen den Genotypen des Typs white und der Mutanten (w ; stepk08U0 / stepSH0323) zulässt. Die durchschnittliche Lebensspanne des Wildtyps betrug ca. 25 Tage, die der Mutanten (w1118 ; stepk08U0 / stepSH0323) betrug ca. 30 Tage.
Spezialfutter
Zur Herstellung des Spezialfutters wurden 32,5 g autolysierte Hefe (Fluka (Katalog-Nr. 73145)) und 10 g Agar (Difco (Katalog-Nr. 281230)) mit 300 ml Wasser (demineralisiert, Roth (Katalog-Nr. 3175)) gemischt und bei 120 0C für 20 Minuten autoklaviert. Die Lösung wurde auf 60 0C abgekühlt und 32,5 g α-D(+)-Glucose Monohydrat (Roth (Katalog-Nr. 6887)) unter Rühren dazugemischt. Dann wurden 15 ml 10 %ige (w/v) in 70 % (v/v) Ethanol (Roth (Katalog-Nr. 9065)) gelöste p-Hydroxybenzoesäuremethylester (Sigma (Katalog-Nr. H3647))-Lösung und 1,35 ml Dimethylsulfoxid (DMSO, Roth (Katalog-Nr. A994)) dazugegeben. Anschließend wurde diese Stamm-Lösung auf ein Volumen von 450 ml mit Wasser aufgefüllt und bei einer Temperatur von 60 0C gehalten. Für das Kontrollfutter wurden 50 ml einer 0,7 %igen (v/v) DMSO-Lösung in Wasser hergestellt. Für das die Verbindungen gemäß der Formel (9) oder (25)-enthaltende Futter wurden zu 49,8 ml einer 0,3012 %igen DMSO-Lösung in Wasser 0,2 ml einer 25 mM Lösung der Verbindungen gemäß der Formel (9) oder (25) in 100 % DMSO gegeben.
Diese 50 ml der Kontroll-Lösungen und der Lösungen enthaltend die Verbindungen gemäß der Formel (9) oder (25) wurden je mit 450 ml der Stammlösung gemischt und je 4 ml in Polystyren-Gefäße (Höhe 9,5 cm, Durchmesser 2,3 cm, verschlossen mit Baumwoll- Watte) zur Haltung der Fliegen vorgelegt. Nach 24 Stunden wurden die abgekühlten Gefäße mit Baumwoll-Watte verschlossen und bei 4 0C gelagert.
Die Endkonzentration der Futter-Komponenten im Kontrollfutter betrug 6,5 % (w/v) autolysierte Hefe, 6,5 % (w/v) α-D(+)-Glucose Monohydrat, 2 % (w/v) Agar, 0,3 % (w/v)/> Hydroxybenzoesäuremethylester, 2,1 % Ethanol (v/v), 0,34 % (v/v) DMSO. Die Endkonzentration der Futter-Komponenten im Futter enthaltend die Verbindung gemäß der Formel (9) betrug 6,5 % (w/v) autolysierte Hefe, 6,5 % (w/v) α-D(+)-Glucose Monohydrat, 2 % (w/v) Agar, 0,3 % (w/v)/>Hydroxybenzoesäuremethylester , 2,1 % Ethanol (v/v) , 0,34 % (v/v) DMSO, 10 μM Verbindung gemäß der Formel (9).
Die Endkonzentration der Futter-Komponenten im Futter enthaltend die Verbindung gemäß der Formel (25) 6,5 % (w/v) autolysierte Hefe, 6,5 % (w/v) α-D(+)-Glucose Monohydrat, 2 % (w/v) Agar, 0,3 % (w/v)/>Hydroxybenzoesäuremethylester , 2,1 % Ethanol (v/v) , 0,34 % (v/v) DMSO, 10 μM Verbindung gemäß der Formel (25).
Fliegenhaltung
Die Larvenhaltung erfolgte auf Standard-Fliegenfutter enthaltend 1,1 % (w/v) Bierhefe (Firma „Gewürzmühle Brecht"), 5,43 % (w/v) Maismehl, 0,53 % (w/v) Fadenagar (Firma "Gewürzmühle Brecht"), 6,6 % (v/v) Zuckerrübensirup (Grafschafter), 1,3 % (v/v) Ethanol (Firma Roth), 0,13 % (w/v)/>Hydroxybenzoesäuremethylester (Sigma).
24 Stunden nach dem Schlüpfen der Imagines, der ausgewachsenen Fliegen, wurden Weibchen und Männchen unter kurzer, weniger als 2 Minuten dauernder, Cθ2-Betäubung getrennt. Während der 24 Stunden nach dem Schlüpfen wurden die Tiere auf Standard- Fliegenfutter gehalten. Weibchen und Männchen wurden dann getrennt und die Weibchen in je 10 Gruppen von je ca. 20 Tieren in Polystyren-Gefäßen, Höhe 9,5 cm, Durchmesser 2,3 cm, verschlossen mit Baumwoll- Watte, auf 4 ml Spezialfutter mit oder ohne die Verbindungen gemäß der Formeln (9) oder (25) gehalten. Das Spezialfutter wurde jede zweite Woche frisch hergestellt. Die Fliegen wurden an jedem zweiten oder dritten Tag auf frisches Spezialfutter umgesetzt, dabei wurden die toten Tiere gezählt. Die Analyse der Lebensspanne erfolgte mit der Kaplan- Meier-Analyse unter Zuhilfenahme einer Statistik Software (XLSTAT).
Die Kaplan-Meier- Analyse zeigte sowohl für die Kontrolltiere des Wildtyps w1118 als auch für die Mutanten (w1118 ; stepk08U0 / stepSH0323) eine signifikante Verlängerung der mittleren Überlebenszeit, wenn sie mit der Verbindungen gemäß der Formel (9) gefüttert wurden, wie in der Tabelle 2 gezeigt wird.
Tabelle 2: Genotypen, Behandlung und Überlebenszeiten
Wni8 kosiio SH0323 10 μM 20() 29,3 (± 0,7) F *_ Verbindung (25) v '
Die Werte zeigen die durchschnittliche Überlebenszeit in Tagen (± Standardfehler). Die
Überlebenszeit und Signifikanz wurde durch die Kaplan Meier Analyse mit Hilfe der
Software XLSTAT Life berechnet, wobei bedeutet: f P < 0,001 gegen wl 118 (ohne Behandlung).
* P < 0,05 gegen wl 118 (ohne Behandlung). t P < 0,001 gegen wl 118 ; stepkO8110 / stepSH0323 (keine Behandlung). Mit der Verbindungen gemäß der Formel (9) gefütterte Kontrolltiere hatten eine signifikante (P < 0,05) um 11,5 % verlängerte durchschnittliche Überlebenszeit im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren. Während die Mutanten 19 % (Signifikanz P < 0,001) länger lebten als Kontrolltiere, führte die Fütterung mit der Verbindungen gemäß der Formel (9) zu einer weiteren Verlängerung der durchschnittlichen Überlebenszeit von 15,3 % (Signifikanz P < 0,001), so dass diese Mutanten eine um 37,3 % längere Lebensspanne hatten als unbehandelte Kontrolltiere.
Dies zeigt, dass eine Verabreichung der Verbindungen gemäß der Formel (9) zu einer signifikanten Verlängerung der Lebensspanne in Fliegen führen kann.
Eine weitere Erhöhung der Lebensspanne konnte in Fliegen erzielt werden, bei denen das Drosophila-Cytohesin steppke mutiert und die Proteinmenge des Drosophila-Cytohesins steppke reduziert war.
Dies zeigt, dass die Verbindungen gemäß der Formel (9) geeignet ist, eine weiter erhöhte Verlängerung der Lebensspanne zu erzielen. Insbesondere zeigt dies, dass die Verlängerung der Lebensspanne der mutanten Fliegen auf eine Inhibition des Fliegen-Cytohesins steppke zurückgeführt werden kann.
Demgegenüber konnte mit der Verbindungen gemäß der Formel (25) weder in Kontrolltieren noch in den Mutanten eine signifikante Veränderung der Lebensspanne erreicht werden.
Beispiel 8
Messung der Nahrungsaufnahme der Fliegen
Um zu zeigen, dass die in Beispiel 7 gezeigte erhöhte Lebensspanne der mit der Verbindung gemäß der Formel (9) gefütterten Fliegen nicht darauf zurückzuführen war, dass diese Versuchsgruppen aufgrund des Geschmacks oder Geruchs der Verbindung gemäß der Formel (9) weniger Nahrung zu sich nahmen und deshalb länger lebten, wurde die Nahrungsaufnahme von Fliegen mit Hilfe des Capillary Feeder assay (CAFE) gemessen und statistisch ausgewertet.
Dazu wurde wie in Ja et al. (Ja et al., Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. PNAS 2007 May 15;104(20):8253-6) beschrieben vorgegangen. Je fünf Gruppen ä zwei weibliche adulte Fliegen wurden über zehn Tage den verschiedenen Nahrungsbedingungen mit oder ohne die Verbindung gemäß der Formel (9) ausgesetzt. Die Messung der Nahrungsaufnahme pro Stunde und Fliege wurde an Tag 1, 2, 3, 5 ,6, 7, 8, 9 und 10 der zehn Tage vorgenommen.
Das Kontroll-Futter enthielt 5 % (w/v) autolysierte Hefe, 5 % (w/v) α-D(+)-Glucose Monohydrat, 0,3 % (w/v) p-Hydroxybenzoesäuremethylester , 2,1 % Ethanol (v/v) , 0,34 % (v/v) DMSO. Das Futter mit der Verbindung gemäß der Formel (9) enthielt 5 % (w/v) autolysierte Hefe, 5 % (w/v) α-D(+)-Glucose Monohydrat, 0,3 % (w/v) p-Hydroxybenzoe- säuremethylester , 2,1 % Ethanol (v/v) , 0,34 % (v/v) DMSO, 10 μM Verbindung gemäß der Formel (9).
Es konnte festgestellt werden, dass die mit der Verbindung gemäß der Formel (9) gefütterten Tiere zu keinem Zeitpunkt signifikant weniger fraßen als Kontrollfutter-Tiere. Somit ist die festgestellte Verlängerung der Lebensspanne durch die Verbindung gemäß der Formel (9) nicht auf eine geringere Nahrungsmenge zurückzuführen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) wie nachstehend angegeben:
worin:
R ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl -C 10-Alkyl), CONH2, CONH(Cl- ClO-Alkyl), CON(Cl -C 10-Alkyl)2, NHCO(Cl -C 10-Alkyl), NHCOCHCl2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF3, Amin, Cl-C10-Alkyl, Cl-C10-Alkoxy und/oder ein Strukturelement (Al), (Bl), (Cl), (Dl), (El), (Fl), (Gl), (Hl), (II), (Jl), (Ll), (Ml) wie nachstehend angegeben: wonn: R4 ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl -C 10-Alkyl), CONH2, CONH(Cl -C 10-Alkyl), CON(Cl -C 10-Alkyl)2, NHCO(Cl -C 10-Alkyl), NHCOCHCl2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF3, Amin, Cl-C10-Alkyl und/oder Cl-C10-Alkoxy,
und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen und pathologischen Zuständen, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-(Insulin-like growth factor) Signalwegs in Zusammenhang stehen und/oder zur chemischen Induktion von Langlebigkeit.
2. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7) und/oder (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
(V) (8) wonn:
R, ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R2, R3 und/oder ein Strukturelement (A2), (B2), (C2), (D2), (N2) wie nachstehend angegeben:
R7 ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Rh R3 und/oder ein Strukturelement (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2), (L2), (M2), (02) wie nachstehend angegeben:
(E2) (F2)
R. ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R2, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl -C 10-Alkyl), CONH2, CONH(Cl -C 10-Alkyl), CON(Cl- C10-Alkyl)2, NHCO(Cl -C 10-Alkyl), NHCOCHCl2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF3, Amin, Cl-C10-Alkyl und/oder Cl-Cl O-Alkoxy .
3. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
wonn:
R, ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R2, R3 und/oder ein Strukturelement (A3), (B3), (C3), (D3), (N3) wie nachstehend angegeben:
/cι H *CI (N3) R? ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R3 und/oder ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3), (L3), (M3), (03) wie nachstehend angegeben:
R3 ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R2, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl -C 10-Alkyl), CONH2, CONH(Cl -C 10-Alkyl), CON(Cl- C10-Alkyl)2, NHCO(Cl -C 10-Alkyl), NHCOCHCl2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, CF3, Amin, Cl -C 10-Alkyl und/oder Cl-Cl O-Alkoxy .
4. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R, R1, R2, R3 und/oder R4 gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Cl-C5-Alkyloxy, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend -O-Methyl, -O-Ethyl, -O-Isopropyl und/oder -O-tert-Butyl.
5. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (22), (23) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
H3C- (9)
(22)
6. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen (12), (14), (20), (21) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere, Derivate sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
(12)
(21).
7. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat eine biotinylierte Verbindung ist, vorzugsweise Verbindung (24) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze
(24).
8. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankungen und pathologischen Zustände, die mit einer Regulation des Insulin- und/oder IGF-Signalwegs in Zusammenhang stehen, ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Fettleibigkeit, Zellalterung, alterungsbedingte Zellschäden, insbesondere in Leber und/oder Bauchspeicheldrüse, alterungsbedingte pathologische Zustände von Leber- und/oder Bauchspeicheldrüsen-Zellen, alterungsbedingte Funktionsstörungen von Leber und/oder Bauchspeicheldrüse, Zellstress, insbesondere oxidativer Stress, insbesondere durch erhöhten Zuckermetabolismus ausgelöster Stress, und/oder Apoptose, insbesondere ß-Zell-Apoptose.
9. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche zur Verlängerung des Lebensalters von Säugetieren.
10. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel für die orale oder intravenöse Verabreichung formuliert ist.
11. Verwendung von Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösemittel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend DMSO, Glycerol und/oder Öl, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend DMSO und/oder Pflanzenöl, insbesondere Olivenöl.
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