EP1937823A1 - Verfahren zur herstellung von l-serin, gensequenz, vektoren sowie mikroorganismus - Google Patents

Verfahren zur herstellung von l-serin, gensequenz, vektoren sowie mikroorganismus

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Publication number
EP1937823A1
EP1937823A1 EP06805376A EP06805376A EP1937823A1 EP 1937823 A1 EP1937823 A1 EP 1937823A1 EP 06805376 A EP06805376 A EP 06805376A EP 06805376 A EP06805376 A EP 06805376A EP 1937823 A1 EP1937823 A1 EP 1937823A1
Authority
EP
European Patent Office
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seq
folic acid
gene
genes
serine
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06805376A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Lothar Eggeling
Petra Peters-Wendisch
Michael Stolz
Hermann Sahm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1937823A1 publication Critical patent/EP1937823A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/13—Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of L-serine and to suitable gene sequences, vectors and microorganisms. 5
  • the amino acid L-serine is used in human medicine, in the pharmaceutical industry, in the food industry and in animal nutrition. 10
  • EP 0931833A2 it is described in EP 0931833A2 that increasing the biosynthetic enzyme phosphoserine phosphatase and phosphoserine transaminase is advantageous for L-serine formation. It is also described that a gene coding for D-3-phosphoglycerate dehydrogenase can be used for L-serine formation (EP 0931833A2, PCT WO 93/12235).
  • coryneform bacteria produce L-serine in an improved manner after modification or elimination of the genes coding for folic acid synthesis.
  • the bacteria according to the invention and the gene sequences according to the invention for enzymes or regulators which catalyze folic acid synthesis or are involved in the regulation of folic acid synthesis it is now possible to produce L-serine in a yield which is considerably higher than that of the strains not modified according to the invention.
  • the L-serine production as well as the production of cysteine, tryptophan and methionine is increased by reducing the folic acid concentration in an amino acid-producing organism.
  • the organism already produces L-serine before the modification according to the invention.
  • the reduction in folic acid concentration can be achieved by reducing the synthesis of folic acid or its degradation.
  • Folic acid can be obtained by targeted or undirected mutation of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
  • mutations leading to a reduction or elimination of folic acid production are the deletion mutation, insertion mutation, substitution mutation or point mutation of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
  • genetically modified or unaltered genes of proteins involved in the biosynthesis of folic acid may reduce or eliminate folic acid production by reducing or preventing the expression of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
  • Reduction or elimination of expression of genes involved in the biosynthetic pathway of folic acid may be achieved by altering, preferably attenuating, more preferably eliminating promoters, such as signal structures, repressor genes, activators, operators, attenuators, ribosome binding sites or start codons, terminators, or further - tion, preferably attenuation, particularly preferably elimination or attenuation of regulators or the stability of the transcripts can be achieved.
  • promoters such as signal structures, repressor genes, activators, operators, attenuators, ribosome binding sites or start codons, terminators, or further - tion
  • attenuation particularly preferably elimination or attenuation of regulators or the stability of the transcripts can be achieved.
  • Farther regulatable promoters in particular attenuated promoters, can be used.
  • the activity of the enzymes involved in the biosynthesis of folic acid can be achieved by reducing or eliminating the catalytic activity and the stability of the enzymes. The same effect can be achieved by altering the allosteric center or a feedback inhibition of the enzymes.
  • a typical way to reduce or eliminate the activity of the enzymes is by protein modification, for example by phosphorylation or adenylation. It is also possible to increase the proteolytic degradation of enzymes involved in the biosynthesis pathway of folic acid.
  • Typical enzymes whose activity can be reduced or eliminated in the manner described are GTP cyclohydrolase, neopterin triphosphate pyrophosphatase, neopterinololase, ⁇ -hydroxymethylpterin pyrophosphokinase, 4-amino-4-deoxy-chorismate synthase, 4-amino-4-deoxybenzoyl chorismate lyase, pteroate synthase, folate synthase and dihydrofolate reductase.
  • the invention is also a vector, the one
  • the vectors according to the invention contain tools which are suitable for the gene for the synthesis of 4-amino-4- deoxy-chorismate synthase and or 4-amino-4-deoxy-chorismate lyase.
  • Seq. No. 1 The sequence for the deletion of the 4-amino-4-deoxy-chorismate synthase gene is shown in Seq. No. 1 shown.
  • Seq. No. 2 shows the structure of a vector containing the Seq. No.1 carries.
  • Seq. No. 4 shows the structure of a vector containing the Seq. No. 3 carries.
  • Seq. No. 5 shows the structure of a vector containing the Seq. No. 5 for the deletion of the 4-amino-4-deoxy- chorismatsynthasegens and the 4-amino-4deoxy-chorismat lyasegens carries.
  • Seq. No. 7 is a plasmid which is suitable for additionally increasing L-serine production. It corresponds to the plasmid shown in FIG. 4 with the designation pEC-T18mob2-serA fbr CB-.
  • the structures responsible for the deletion can also be incorporated into other vector scaffolds which are suitable for the corresponding organism. Ren as vectorial 'come in addition to the commonly used vectors cyclic and linear vectors or phages in question.
  • the figures show vectors which can be used by way of example for the changes according to the invention of the L-serine producing organisms. It shows :
  • Fig.2 pK19mobsacB_pabC according to Seq. No. 4.
  • the tools of sequences 1, 3 and 5 are introduced into vectors in L-serine production organisms which already produce L-serine prior to alteration.
  • Suitable organisms are, for example, Corynebacteria, such as Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium. Enterobacteria, bacillaceae or hay species, which have a reduced folic acid concentration, can also be used as production organisms.
  • Corynebacteria such as Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium.
  • Enterobacteria, bacillaceae or hay species, which have a reduced folic acid concentration can also be used as production organisms.
  • the invention will be described in more detail:
  • the invention relates to a process for the production of L-serine by fermentation using coryneform bacteria, in which the genes coding for folic acid synthesis are modified, switched off or altered in their expression or in Folic acid bacteria naturally a folic acid deficiency is induced or the regulation of folic acid synthesis is influenced in such a way that folic acid deficiency arises. Since the folic acid synthesis starts from an intermediate of the nucleotide synthesis as well as an intermediate of the synthesis of aromatic amino acids, these corresponding reactions can in principle also be modified or eliminated, provided that nucleotides and aromatic amino acids themselves are still sufficiently available, as for example by external supplementation the case is. In addition, folic acid deficiency may also be induced by deletion or modification of regulators that control the expression of genes of folic acid or its associated metabolic pathways.
  • the strains used preferably produce L-serine before the folic acid synthesis is modified.
  • the term modification includes the attenuation of folic acid synthesis genes and the complete deletion of polysynthetic genes. These include non-directed mutagenesis and directed recombinant DNA techniques. With the help of these methods, for example, genes of folic acid synthesis in the chromosome can be deleted. Suitable methods are described in Shufer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) or also Link et al. (J. Bacteriology (1998) 179: 6228-6237). Also, only parts of the gene can be deleted or mutated fragments of genes can be exchanged.
  • An advantageous embodiment of the method according to the invention is, for example, the inventively modified C. glutamicum strain ATCC13032DpykDsdaADpabABpserABC, which, inter alia, carries a deletion in the pabAB gene.
  • mutagenesis methods include undirected methods involving chemical reagents such as. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine or UV irradiation for mutagenesis use, with subsequent search of the desired microorganisms for reduction or loss of folic acid synthesis activity.
  • genes of folic acid synthesis can be reduced by altering the signal structures for gene expression.
  • Signal structures are, for example, repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon and terminators. Information on this is the expert z. In Patent Application WO 96/15246, Boyd and Murphy (J. Bacteriol 1988: 170: 5949), Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Res. 1998. 26: 3548, Jensen and Hammer (Biotechnol. 1998 58: 191), in Patek et al.
  • a regulation of the translation is possible by, for example, the stability of the m-RNA is reduced. This can be achieved by weakening the stability by additional and / or altered sequences at the 5 'end or 3' end of the gene. Examples are for genes from Bacillus subtilis (Microbiology (2001) 147: 1331-41) or yeast (Trends Biotechnol., 1994, 12: 444-9). It is also possible to influence enzyme activity by intrinsic proteolytic activity as described (Mol Microbiol. (2005) 57: 576-91).
  • genes coding for the corresponding enzyme of low activity folic acid synthesis can be used. Mutations that lead to a change or reduction of the catalytic activity of enzyme proteins are known. Examples can be found in the work of Qiu and Goodman (J Biological Chemistry (1997) 272: 8611-8617), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry (1997) 61: 1760-1762) and Möckel ("The threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum: abolition of the allosteric regulation and structure of the enzyme", Reports from the Jülich Research Center, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich , Germany, 1994).
  • Patent 4,601,893, Schwarzer and Pühler Bio / Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid et al (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993) ) and in patent application WO 96/15246.
  • genes of the folic acid synthesis of C. glutamicum can be reduced expressed or deleted or the enzyme activities can be reduced.
  • L-serine in addition to the induced deficiency of folic acid, one or more of the genes selected from the group, • the serA gene coding for the 3-phosphoglycerate dehydrogenase,
  • the serB gene coding for the phosphoserine phosphatase in particular to overexpress or alleles of these genes, in particular
  • metC gene coding for cystathionin lyase The metC gene coding for cystathionin lyase, the sdaA gene coding for serine dehydratase,
  • the microorganisms according to the invention comprise bacteria of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, which are modified by classical and / or molecular genetic methods such that their metabolic flux increasingly proceeds in the direction of the biosynthesis of amino acids or their derivatives.
  • the present invention encompasses all known amino acid production strains.
  • those production strains are included, which the skilled person can produce by analogy with findings from other microorganisms, for example enterobacteria, bacillaceae or yeast species, by the conventional method.
  • such amino acid production strains are also included in which the degradation of L-serine is altered or attenuated.
  • the present invention also relates to a pabAB and pabC gene sequence Nos. 1, 3 and 5, which is characterized in that a portion of the sequence was cut out by means of a defined deletion, so that only inactivated or attenuated Aminodeoxy- chorismatsynthase or Aminodeoxychorismatlyase activity can result ,
  • the pabAB and pabC gene sequences are preferably isolated from microorganisms of the genus Corynebacterium or Brevibacterium. By way of example, a few more specific microorganisms are listed here:
  • the pabAB gene of C. glutamicum is replaced by known methods in the chromosome by a pABAB gene shortened by 1734 bp (J. Bacteriol. (1997) 179: 6228-37, Gene (1994) 145: 69-73).
  • the following primers were synthesized derived from the publicly available genome sequence (NCBI Accession Number YP_225287; NC_006958):
  • the primer pabAB-del-A starts 522 bp before the start of translation and pabAB-del-D 436 bp behind the translation stop of the pabAB gene.
  • the primer pabAB-del-B is 21 bp behind the translation start
  • the primer pabAB-del-C is 66 bp before the translation stop and both have complementary linker regions, as in Link et al. (J. Bacteriol. (1997) 179: 6228-37).
  • PCR amplifications were carried out with the primer combination pabAB-del-A and pabAB-del-B and the primer combination pABAB-del-B and pabAB-del-C with chromosomal DNA of C.
  • the PCR reaction was carried out in 30 cycles in the presence of 200 ⁇ M deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), each 600 nM of the corresponding oligonucleotides,
  • the amplification was carried out in 35 cycles in the presence of 200 ⁇ M deoxynucleotide triphosphates, 600 nM each of the corresponding oligonucleotide, 20 ng each of the isolated template DNA from the first PCR, 1/10 volume 10-fold Reaction buffer and 2.6 units of the Taq / Pwo ⁇ DNA polymerase mixture under the following conditions:
  • the vector pK19mobsacBDpabC suitable for gene replacement was constructed for the deletion of the pabC gene of C. glutamicum.
  • the primers required for PCR amplification were in turn derived from the publicly available genome sequence (NCBI accession number YP_225288.1, NC_006958). They are listed below:
  • pabC-del-A 5'-GAGGATCCAATCATTGCTGAGCTGCGCAG-3 ' pabC-del-B:
  • pabC-del-C 5 '-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTCGGTGAAGCCCTGGAATGAA-3'
  • the primer pabC-del-A starts 500 bp before the start of translation and pabC-del-D 500 bp behind the translation stop of the pabC gene.
  • the primer pabC-del-B is 51 bp behind the translation start and pabC-del-C 48 bp before the translation stop.
  • the last two primers each have complementary linker regions.
  • the primer combination pabC-del-A and pabC-del-B became a 602 bp 5 'flanking region and the primer combination pabC-del-C and pabC-del-D a 597 bp 3' flanking region of deletierenden fragment amplified.
  • the PCR reaction was carried out according to the standard methods, such as in example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032. After the PCR reaction, the DNA fragments obtained were isolated with the QIAExII gel extraction kit (Qiagen) and both fragments were isolated as
  • the vector pK19mobsacBDpabABC suitable for gene replacement was constructed for the deletion of the pabABC gene of C. glutamicum.
  • the PCR amplification primers required for this derived from the publicly available genome sequence (NCBI accession number YP_225287; YP_225288.1; NC_006958), are indicated below:
  • the primer pabABC-del-A starts 500 bp before the start of translation and pabABC-del-D 500 bp behind the translation stop of the pabABC gene.
  • Primer pabABC-del-B is 51 bp beyond the translation start of pabAB and pabABC-del-C 48 bp before the translation stop of pabC.
  • the latter two primers each have complementary linker regions.
  • the pabABC-del-A and pabABC-del-B pri- mary combination resulted in a 593 bp 5 'flanking region and, with the primer combination pabABC-del-C and pabABC-del-D, a 597 bp 3' flanking area of the to be deleted
  • the PCR reaction was carried out according to standard methods such as in Example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032. After the PCR reaction, the DNA fragments obtained were isolated with the QIAExII gel extraction kit (Qiagen), and both fragments were used as template in another PCR. The primers pabABC-del-A and pabABC-del-D were used as primers.
  • the PCR reaction was carried out by the standard methods such as, for example, in Example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032.
  • the resulting 1169 bp DNA fragment containing the inactivated pabABC gene with a 2475 bp central deletion was isolated from a 0.8% agarose gel and ligated with the vector pK19mobsacB (Schäfer et Gene 145: 69-73 (1994). Escherichiae was used with the ligation mixture coli strain DH5 ⁇ mcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1990) 87: 4645-4649). The resulting plasmid pK19mobsacBDpabC (FIG. 3) was checked for its accuracy by restriction digestion and sequencing.
  • EXAMPLE 4 Construction of folic acid auxotrophic strains C. glutamicum DsdaADpabAB, C. glutamicum DsdaADpabC, C. glutamicum DsdaADpabABC.
  • pabAB-del-pr-u2 5'-TGGCTCACTTCGCTGGTCTTGTTG-S 'pabAB-del-pr-12 5'-GAATGGTTGCGGCGAGTGTCA-S'
  • pabC-del-pr-u2 5 '-GTTGGGGGAGCAGGACGAGTGGT-3' pabC-del-pr-12 5'-TACGCGCATCTGGAAGCCTGGTTA-B '
  • pabABC-del -pr-u2 5 '-CGTTCCGGCATCATTCTGGCTAAG-3'
  • pabABC-del-pr-12 5 '-GCGACTCCGGGTTGTTCCTGATAA-3'
  • the successful deletion gave a band of 1426 bp for the pabAB locus, a band of 1663 bp for the pabC genort, and a band of pabABC for the gene locus
  • strains were designated as C. glutamicum DsdaADpabAB, C. glutamicum DsdaADpabC, and C. glutamicum DsdaADpabABC, respectively.
  • the plasmid (FIG. 4) is composed of the vector pEC-T18mob2 (Curr. Microbiol. (2002) 45, 362-367), the corynebacterial genes serAfbr (Appl Microbiol Biotechnol. (2002) 60: 437-41) and serC and serB (German Patent Application 100 44 831.3).
  • Tetracycline-resistant clones were tested by known standard methods for the presence and integrity of the plasmid pEC-T18mob2-serAfbrserCserB (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory Press) and a clone designated C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC ,
  • the strain C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC was grown in complex medium (CgIII with 2% glucose, 5 ⁇ g / l tetracycline) and the fermentation cationsraedium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603).
  • the fermentation medium CGXII contained 0.1 or 1 mM folic acid.
  • the strain C. glutamicum DsdaA pserABC was cultivated in the same way. At least two independent fermentations were ever carried out. After culturing for 30 hours at 30 0 C on a rotary shaker at 120 rpm accumulated in the medium L-serine quantity was determined.
  • the analysis of the amino acid concentration was carried out by means of high pressure liquid chromatography (J Chromat)
  • the plasmid pK19mobsacBDpyk (Arch Microbiol. (2004) 182: 354-63) was introduced into the strain C. glutamicum 13032DsdaADpabABC and selected for kanamycin resistance. Only such
  • Clones in which the plasmid was integrated into the chromosomal pyk gene locus via homologous recombination were kanamycin resistant. A clone was excluded. which, when checked, showed the plasmid-mediated sucrose sensitivity and cultured in 50 ml of BHI medium (Brain Heart Infusion Medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) without kanamycin and sucrose. Subsequently, 100 ⁇ l each of a 10-2,
  • the parent strain C. glutamicum DpykDsdaADpabAB could be obtained from the starting strain.
  • This strain was transformed with pEC-T18mob2-serAfbrserCserB as described in Example 5, thereby obtaining the strain C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC.
  • This strain was used for L-serine formation as described in Example 5 in comparison with C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC. The result is shown in Table 3.

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Abstract

Erfindungsgemäß wird zur Steigerung der L-Serinproduktion die Folsäurekonzentration in Aminosäure produzierenden Organismen verringert oder vollständig entfern. Hierzu können die an der Biosynthese der Folsäure beteiligten Enzyme und Gene in ihrer Aktivität vollständig ausgeschaltet oder mindestens verringert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Seq. Nr. 1 bis 7 verwendet.

Description

Be s chre ibung
Verfahren zur Herstellung von L-Serin, Gensequenz, Vektoren sowie Mikroorganismus
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin sowie dafür geeignete Gensequenzen, Vektoren und Mikroorganismen. 5
Stand der Technik
Die Aminosäure L-Serin findet in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung. 10
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebac- terium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Her- IS'' stellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation oder die Aufarbeitung 20 zur Produktform durch z. B. Ionenaustauschchromato- graphie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mik- 5 roorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind, und L- Aminosäuren wie L-Serin produzieren. So ist ein coryneformes Bakterium beschrieben, das eine Resistenz gegenüber Azaserin oder beta- (2-Thienyl) -DL-Alanin aufweist und L-Serin produziert (EP0943687) . Ferner ist es Stand der Technik, dass mittels gentechnischer Methoden Aktivitäten des Biosynthesewegs erhöht werden können und dies zu erhöhter Aminosäurebildung führt . So ist zum Beispiel in EP 0931833A2 beschrieben, dass eine Erhöhung des Biosyntheseenzyms Phosphoserin-Phosphatase und Phosphoserin-Transaminase vorteilhaft für die L-Serinbildung ist. Ferner ist beschrieben, dass ein Gen, das für die D-3 -Phosphoglycerat-Dehydrogenase ko- diert, für die L-Serinbildung genutzt werden kann (EP 0931833A2, PCT WO 93/12235) .
Es ist darüber hinaus bekannt, dass neben einer Erhöhung der Aktivität von Enzymen des L-Aminosäuresyn- thesewegs auch die Verminderung oder sogar die Ausschaltung von Enzymen, die an Abbaureaktionen der L-Aminosäure beteiligt sind, zu einer Verbesserung der L-Aminosäureakkumulation führen können. So ist gefunden, dass die Ausschaltung des Enzyms L-Serindehy- dratase zu höheren L-Serin-Akkumulationen führt (PCT/DE 2004/000248) . Ferner führt auch eine Verminderung der Aktivität des Enzyms Serinhydroxymethyltransferase zu einem verringerten L-Serinabbau (US-Patent 6,596,516; Simic et al . (2002) Appl . Environ Microbiol . 68:3321- 3327) . Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und einen dafür geeigneten Mikroorganismus sowie Vektoren zur Verfügung zu stellen, mit denen die Produktion von L-Serin gesteigert werden kann. Weiterhin sollen ein Verfahren sowie Mikroorganismen und Vektoren zur Verfügung gestellt werden, mit denen eine Steigerung der Produktion von Cystein, Tryptophan und Methionin erzielt werden kann.
In überraschender Weise wurde gefunden, dass corynefor- me Bakterien nach Modifizierung oder Ausschaltung der für die Folsäuresynthese kodierenden Gene in verbesserter Weise L-Serin produzieren. Mit den erfindungsgemäßen Verfahren sowie den erfindungsgemäßen Bakterien und den erfindungsgemäßen Gensequenzen für Enzyme oder Regulatoren, die die Folsäuresynthese katalysieren bzw. an der Regulation der Folsäuresynthese beteiligt sind, ist es nunmehr möglich, L-Serin mit einer Ausbeute herzustellen, die erheblich höher liegt, als die der nicht erfindungsgemäß veränderten Stämme. Der Umfang der
Steigerung der L-Serin-Produktion ist in Tabelle 2 dargestellt.
Im Folgenden soll die Erfindung in der allgemeinen Form beschrieben werden:
Erfindungsgemäß wird die L-Serinproduktion sowie die Produktion von Cystein, Tryptophan und Methionin dadurch gesteigert, dass die Folsäurekonzentration in einem Aminosäure produzierenden Organismus verringert wird. Vorzugsweise produziert der Organismus bereits vor der erfindungsgemäßen Veränderung L-Serin. Beispielsweise kann die Verringerung der Folsäurekon- zentration durch Verringerung der Synthese von Folsäure oder deren Abbau erreicht werden.
Die Verringerung oder Verhinderung der Synthese von
Folsäure kann durch gerichtete oder ungerichtete Mutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, erreicht werden.
Beispiele für Mutationen, die zu einer Verringerung oder Ausschaltung der FolSäureproduktion führen, sind die Deletionsmutation, Insertionsmutation, Substitutionsmutation oder eine Punktmutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind.
Weiterhin kann bei genetisch veränderten oder unveränderten Genen von Proteinen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, eine Verringerung oder Ausschaltung der Folsäureproduktion erfolgen indem die Ex- pression von an der Biosynthese von Folsäure beteiligten Genen verringert oder verhindert wird.
Eine Verringerung oder Ausschaltung der Expression von Genen, die am Biosyntheseweg von Folsäure beteiligt sind, kann durch Veränderung, vorzugsweise Abschwächung, besonders bevorzugt Ausschaltung von Promotoren, wie Signalstrukturen, Repressorgenen, Aktivatoren, Operatoren, Attenuatoren, Ribosomenbindestellen oder Startkodons, Terminatoren oder weiterhin durch Verände- rung, vorzugsweise Abschwächung, besonders bevorzugt Ausschaltung oder Schwächung von Regulatoren oder der Stabilität der Transskripte erreicht werden. Weiterhin können regulierbare Promotoren, insbesondere abgeschwächte Promotoren, eingesetzt werden.
Auf der Enzymebene kann die Aktivität der an der Bio- synthese der Folsäure beteiligten Enzyme durch Reduzierung oder Ausschaltung der katalytischen Aktivität und der Stabilität der Enzyme erreicht werden. Die gleiche Wirkung kann durch Veränderung des allosterisehen Zentrums bzw. einer Feedback-Inhibierung der Enzyme er- reicht werden. Eine typische Möglichkeit, die Aktivität der Enzyme zu vermindern oder auszuschalten, ist die Proteinmodifikation beispielsweise durch Phosphorylierung oder Adenylierung. Es kann auch der proteolytische Abbau von am Biosyntheseweg der Folsäure beteiligten Enzymen gesteigert werden.
Typische Enzyme, deren Aktivität auf die beschriebene Art verringert oder ausgeschaltet werden kann, sind GTP-Cyclohydrolase , Neopterintriphosphatpyrophosphata- se, Neopterinaldolase, β-Hydroxymethylpterinpyro- phosphokinase, 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthase, 4- Amino-4-deoxy-chorismatlyase, Pteroatsynthase, Folat- synthase und Dihydrofolatreduktase .
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Vektor, der ein
Tool beinhaltet, welches geeignet ist, erfindungsgemäße genetische Veränderungen in einem Produktionsorganismus herbeizuführen.
Die erfindungsgemäßen Vektoren beinhalten Tools, welche geeignet sind, das Gen für die Synthese von 4-Amino-4- deoxy-chorismatsynthase und oder 4-Amino-4-deoxy~ chorismatlyase zu deletieren.
Die Sequenz für die Deletion des 4-Amino-4-deoxy- chorismatsynthasegens ist in Seq. Nr. 1 dargestellt. Seq. Nr. 2 zeigt die Struktur eines Vektors, welcher die Seq. Nr.1 trägt.
Die Sequenz für die Deletion des 4-Amino-4-deoxy- chorismatlyasegens ist in Seq. Nr. 3 dargestellt.
Seq. Nr. 4 zeigt die Struktur eines Vektors, welcher die Seq. Nr. 3 trägt.
Sequenz für die Deletion des 4-Amino-4-deoxy-choris- matsynthasegens und des 4 -Amino-4-deoxy-chorismatlyasegens ist in Seq. Nr. 5 dargestellt. Seq. Nr. 6 zeigt die Struktur eines Vektors, welcher die Seq. Nr. 5 für die Deletion des 4-Amino-4deoxy- chorismatsynthasegens und des 4-Amino-4deoxy-chorismat- lyasegens trägt .
In Seq. Nr.7 ist ein Plasmid dargestellt, welches geeignet ist, die L-Serin-Produktion zusätzlich zu steigern. Es entspricht dem in Figur 4 dargestellten Plas- mid mit der Bezeichnung pEC-T18mob2-serAfbrCB- .
Die für die Deletion verantwortlichen Strukturen können auch in andere Vektorgerüste eingebaut werden, die für den entsprechenden Organismus geeignet sind. Als Vekto-' ren kommen neben den häufig verwendeten cyclischen Vektoren auch lineare Vektoren oder Phagen in Frage. Die Figuren zeigen Vektoren, die beispielhaft für die erfindungsgemäßen Veränderungen der L-Serin produzierenden Organismen herangezogen werden können. Es zeigt :
Fig.l: pK19mobsacB_pabAB entsprechend
Seq. Nr. 2.
Fig.2: pK19mobsacB_pabC entsprechend Seq. Nr 4.
Fig.3: pK19mobsacB_pabABC entsprechend Seq. Nr 6.
Fig . 4 : pEC-T18mob2 - serAfbrCB entsprechend
Seq . Nr 7 .
Vorzugsweise werden die Tools nach den Sequenzen 1, 3 und 5 auf Vektoren in L-Serin-Produktionsorganismen eingebracht, welche bereits vor der Veränderung L-Serin produzieren.
Alle angegebenen Sequenzen sollen auch Varianten umfassen, welche 90 %, vorzugsweise 95 % Homologie besitzen.
Geeignete Organismen sind beispielsweise Corynebacte- rien, wie Corynebacterium glutamicum oder Brevibacteri- um. Es können auch Enterobakterien, Bacillaceen oder Heefearten, die eine verringerte Folsäurekonzentration aufweisen, als Produktionsorganismen eingesetzt werden. Im Folgenden soll die Erfindung genauer beschrieben werden :
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermen- tativen Herstellung von L-Serin unter Verwendung von coryneformen Bakterien, bei denen die Gene, die für die Folsäuresynthese kodieren, modifiziert, ausgeschaltet oder in ihrer Expression verändert werden oder aber bei natürlicherweise Folsäure bedürftigen Bakterien ein FolSäuremangel herbeigeführt wird oder aber die Regulation der Folsäuresynthese derartig beeinflusst wird, dass FolSäuremangel entsteht. Da die Folsäuresynthese von einem Intermediat der Nukleotidsynthese sowie einem Intermediat der Synthese aromatischer Aminosäuren aus- geht, können prinzipiell auch diese entsprechenden Reaktionen modifiziert oder ausgeschaltet werden, vorausgesetzt dass Nukleotide und aromatische Aminosäuren selbst noch ausreichend zur Verfügung stehen, wie es zum Beispiel durch externe Supplementation der Fall ist. Darüber hinaus kann der FolSäuremangel auch durch Deletion oder Modifikation von Regulatoren, die die Expression von Genen der Folsäure oder der damit verknüpften Stoffwechselwege, kontrolliert herbeigeführt werden.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Unteransprüchen .
Die eingesetzten Stämme produzieren vorzugsweise be- reits vor der Modifizierung der Folsäuresynthese L-Serin. Der Begriff Modifizierung beinhaltet die Abschwächung von Folsäuresynthesegenen und die vollständige Deletion von Polsäuresynthesegenen. Hierzu gehören ungerichtete Mutagenesen sowie gerichtete rekombinante DNA-Tech- niken. Mit Hilfe dieser Methoden können zum Beispiel Gene der Folsäuresynthese im Chromosom deletiert werden. Geeignete Methoden dazu sind bei Schäfer et al . (Gene (1994) 145: 69-73) oder auch Link et al . (J. Bac- teriology (1998) 179: 6228-6237) beschrieben. Auch kön- nen nur Teile des Gens deletiert werden oder auch mutierte Fragmente von Genen ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so der Verlust oder eine Reduktion der Folsäuresynthese-Aktivität erreicht. Eine vorteilhafte Ausführung des erfindungsgemäßen Verfah- rens ist beispielsweise der erfindungsgemäß veränderte C. glutamicum Stamm ATCC13032DpykDsdaADpabABpserABC, der unter anderem eine Deletion im pabAB-Gen trägt .
Eine weitere Möglichkeit, die Aktivität der Folsäure- synthese abzuschwächen oder auszuschalten, sind Mutage- neseverfahren. Hierzu gehören ungerichtete Verfahren, die chemische Reagenzien wie z. B. N-Methyl-N-Nitro-N- Nitrosoguanidin oder auch UV-Bestrahlung zur Mutagenese benutzen, mit anschließender Suche der gewünschten Mik- roorganismen auf Verminderung oder Verlust der Folsäuresynthese-Aktivität. Verfahren zur Mutationsauslösung und Mutantensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Ge- netics, A Laboratory Manual and Handbook for Escheri- chia coli and Related Bacteria (CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1992) ) oder im Handbuch "Manual of Me- thods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) nachgelesen werden.
Darüber hinaus kann auch die Expression von Genen der Folsäuresynthese durch Veränderung der Signalstrukturen zur Genexpression reduziert werden. Signalstrukturen sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungs- stellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hier- zu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (J. Bacteriol . 1988. 170: 5949), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Res . 1998. 26: 3548, bei Jensen und Hammer (Biotechnol . Bioeng. 1998 58: 191), bei Patek et al . (Microbiology (1996) 142: 1297 und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 8. Auflage, Georg Thie- me Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) . Es kann die Promotor- und Regulationsregion, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden.
Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich mög- lieh, die Expression im Verlaufe der fermentativen
L-Serinbildung zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Dies kann erreicht werden, indem die Stabilität durch zu- sätzliche und/oder veränderte Sequenzen am 5 ' -Ende oder 3 '-Ende des Gens geschwächt wird. Beispiele dazu sind für Gene aus Bacillus subtilis (Microbiology (2001) 147:1331-41) oder Hefe (Trends Biotechnol . 1994, 12:444-9) beschrieben. Es ist ferner möglich, durch intrinsische proteolytische Aktivität, wie beschrieben, die Enzymaktivität zu beeinflussen (Mol Microbiol . (2005) 57:576-91) .
Des Weiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym der Folsäuresynthese mit geringer Aktivität kodieren. Mutationen, die zu einer Verände- rung oder Reduktion der katalytischen Aktivität von Enzymproteinen führen, sind bekannt. Beispiele dazu finden sich in den Arbeiten von Qiu and Goodman (J Biolo- gical Chemistry (1997) 272: 8611-8617), Sugimoto et al . (Bioscience Biotechnology and Biochemistry (1997) 61: 1760-1762) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Co- rynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Reports from the Jülich Research Centre, Jül-2906, ISSN09442952 , Jülich, Germany, 1994) . Zusammenfassende Darstellungen können in Textbüchern der Genetik und der Molekularbiologie gefunden werden, wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) . Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression und Aktivität der Folsäuresynthese-Enzyme durch Verän- derung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al . (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al . (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EP 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al . (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) und in der Patentanmeldung WO 96/15246.
Auf diese Weise können Gene der Folsäuresynthese von C. glutamicum vermindert exprimiert oder deletiert oder die Enzymaktivitäten reduziert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Serin vorteilhaft sein, zusätzlich zum herbeigeführten Mangel an Folsäure, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe, • das für die 3 -Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodierende serA-Gen,
• das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen,
• das für die Phosphoserin-Phosphatase kodierende serB-Gen, einzeln oder in Kombinationen zu verstärken insbesondere zu überexprimieren oder Allele dieser Gene, insbesondere
• die für feedback-resistente 3-Phosphoglycerat- Dehydrogenase kodierenden serA-Gene einzeln oder in Kombinationen zu verstärken oder zu überexprimieren .
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Serin vor- teilhaft sein, zusätzlich zum herbeigeführten Mangel an Folsäure eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe ,
• das für die Cystathioninlyase kodierende aecD-Gen,
• das für die Cystathioninlyase kodierende metC-Gen, • das für die Serindehydratase kodierende sdaA-Gen,
• das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen,
• das für die beta-Untereinheit der Tryptophansynthase kodierende trpB-Gen, • das für die Threonindehydratase kodierende ilvA-Gen,
• das für die Pyruvatkinase kodierende pyk-Gen einzeln oder in Kombination zu reduzieren oder zu dele- tieren.
Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen umfassen im Rahmen der vorliegenden Erfindung Bakterien aus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, die durch klassische und/oder molekulagenetische Methoden derart verändert sind, dass ihr Stoffwechselfluss verstärkt in Richtung der Biosynthese von Aminosäuren oder deren Abkömmlingen verläuft. Die vorliegende Erfindung umfasst hierbei sämtliche bereits bekannten Aminosäure-Produktionsstämme. Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produktionsstämme umfasst, die der Fachmann in Analogie zu Erkenntnissen aus anderen Mikroorganismen, beispielsweise Enterobacterien, Bacillaceen oder Hefe- Arten, nach gängiger Methode herstellen kann. Ferner sind erfindungsgemäß auch solche Aminosäure-Produktionsstamme umfasst, bei denen der Abbau von L-Serin verändert oder abgeschwächt ist. Dies kann beispielsweise durch gezielte gentechnische Veränderungen an L-Serin degradierenden Enzymen oder den korrespondierenden Genen erfolgen. Im Folgenden sollen einige erfindungsgemäß geeignete Mikroorganismen beispielhaft genannt werden. Diese Auswahl gilt jedoch nicht be- schränkend:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls eine pabAB und pabC-Gensequenz Nr. 1, 3 und 5, die dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Teil der Sequenz mittels definierter Deletion herausgeschnitten wurde, so dass nur inaktivierte oder abgeschwächte Aminodeoxy- chorismatsynthase oder Aminodeoxychorismatlyase Aktivität resultieren kann. Die pabAB und pabC-Gensequenzen werden vorzugsweise aus Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium isoliert. Beispielhaft seien hier einige näher spezifizierte Mikroorga- nismen aufgeführt:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Beispiel 1:
Konstruktion des Plasmids pK19mobsacBDpabAB
Das pabAB-Gen von C. glutamicum wird nach bekannten Methoden im Chromosom durch ein um 1734 bp verkürztes pa- bAB-Gen ersetzt (J. Bacteriol . (1997) 179:6228-37; Gene (1994) 145: 69-73). Zur Konstruktion des für den Genaustausch verwendeten Vektors wurden die nachfolgend angegebenen Primer synthetisiert, die von der öffentlich zugänglichen Genom-Sequenz (NCBI Accession-Nummer YP_225287; NC_006958) abgeleitet wurden:
pabAB-del-A
5 ' -CGGGATCCTCAGGCTCGCACGTTGGAGGG-3 '
pabAB-del-B:
5 ' -CCCATCCACTAAACTTAAACAAAACGTGAAAGAATCATAATT-S '
pabAB-del-C:
5 ' -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGAGTGGGAGGAAATCCGCGTT-S '
pabAB-del-D:
5 ' - GTGGATCCGCCCAAAACACCACGGTGGCGT-3 '
Primer pabAB-del-A beginnt 522 bp vor dem Translati- onsstart und pabAB-del-D 436 bp hinter dem Translati- onsstop des pabAB-Gens. Der Primer pabAB-del-B liegt 21 bp hinter dem Translationsstart, der primer pabAB-del-C liegt 66 bp vor dem Translationsstop und beide verfügen über jeweils komplementäre Linker-Regionen, wie bei Link et al . angegeben (J. Bacteriol . (1997) 179:6228- 37) . Parallel wurden mit der Primerkombination pabAB- del-A und pabAB-del-B sowie der Primerkombination pa- bAB-del-B und pabAB-del-C mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 PCR-Amplifikationen durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 μM Deoxynukleotidtriphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , je 600 nM der entsprechenden Oligonukleotide,
100 ng chromosomaler DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 Volumen 10 -fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten einer hitzestabilen Taq-/Pwo-DNA-Polymerase- Mischung (Expand High Fidelity PCR System der Firma Ro- che Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in einem Ther- mocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) unter folgenden Bedingungen durchgeführt :
940C für 30 Sekunden, 500C für 30 Sekunden und 720C für 40 Sekunden. Der Elongationsschritt bei 720C wurde nach 10 Zyklen um 5 Sekunden pro Zyklus verlängert. Nach der PCR-Reaktion wurde das erhaltene 563 bp große Fragment des 5 ' -flankierenden Bereichs sowie das 528 bp große Fragment des 3 ' -flankierenden Bereichs mit dem QIAExII Gelextraktionskit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert, und beide Fragmente als Template in die zweite PCR mit den Primern pabAB-del-A und pabAB-del-D eingesetzt. Die Ampli- fikation erfolgte in 35 Zyklen in Gegenwart von 200 μM Deoxynukleotidtriphosphaten, je 600 nM des entsprechenden Oligonukleotids, jeweils 20 ng der isolierten Template-DNA aus der ersten PCR, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten der Taq-/Pwo~DNA- Polymerase-Mischung unter folgenden Bedingungen:
94°C für 30 Sekunden, 500C für 30 Sekunden und 720C für 80 Sekunden. Der Elongationsschritt wurde nach 10 Zyklen um jeweils 5 Sekunden verlängert. Nach der PCR- Reaktion wurde das erhaltene 1122 bp lange DNA- Fragment, dass nun das inaktivierte pabAB-Gen mit einer 1734 bp langen zentralen Deletion beinhaltet, aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert, und in den Vektor pK19mobsacB kloniert (Gene 145: 69-73 (1994). Das daraus resultierende Plasmid pK19mobsacBDpabAB (Figur 1) wurde durch Sequenzierung auf seine Richtigkeit bestätigt.
Beispiel 2 :
Konstruktion des Plasmids pK19mobsacBDpabC
Analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurde zur Deletion des pabC-Gens von C. glutamicum der für den Genaustausch geeignete Vektor pK19mobsacBDpabC konstruiert. Die dazu erforderlichen Primer zur PCR-Amplifikation wurden wiederum von der öffentlich zugänglichen Genom-Sequenz (NCBI Accession- Nummer YP_225288.1; NC_006958) abgeleitet. Sie sind nachfolgend angegebenen:
pabC-del-A: 5 ' -GAGGATCCAATCATTGCTGAGCTGCGCAG-3 ' pabC-del-B :
5 ' -CCCATCCACTAAACTTAAACAATCAACAACTGTGGGTGTTGA-S '
pabC-del-C: 5 ' -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTCGGTGAAGCCCTGGAATGAA-3 '
pabC-del-D:
5 ' -AGGGATCCGTGATGAGTCCGATCTCGGAA-S '
Primer pabC-del-A beginnt 500 bp vor dem Translationsstart und pabC-del-D 500 bp hinter dem Translati- onsstop des pabC-Gens. Die Primer pabC-del-B liegt 51 bp hinter dem Translationsstart und pabC-del-C 48 bp vor dem Translationsstop . Die letzten zwei Primer ver- fügen jeweils über komplementäre Linker-Regionen. Parallel wurde mit der Primerkombination pabC-del-A und pabC-del-B ein 602 bp großer 5' -flankierender Bereich sowie mit der Primerkombination pabC-del-C und pabC- del-D ein 597 bp großer 3' flankierender Bereich des zu deletierenden Fragments amplifiziert . Die PCR-Reaktion wurde nach den Standardverfahren, wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032, durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurden die erhaltenen DNA-Fragmente mit dem QIAExII Gelextrak- tionskit (Qiagen) isoliert und beide Fragmente als
Template in einer weiteren PCR eingesetzt . Als Primer wurden pabC-del-A und pabC-del-D eingesetzt. Die PCR- Reaktion wurde nach den Standardverfahren wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurde das erhaltene 1178 bp lange DNA-Fragment, das nun das inaktivierte pabC-Gen mit einer 585 bp lan- gen zentralen Deletion beinhaltet, aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert und mit dem Vektor pK19mobsacB Ii- giert (Schäfer et al . Gene 145: 69-73 (1994). Mit dem Ligationsansatz wurde der Escherichia coli Stamm DH5α!mcr (Grant et al . , Proceedings of the National Aca- demy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Das erhaltene Plasmid pK19mobsacBDpabC (Figur 2) wurde durch Restrik- tionsverdau und Sequenzierung auf seine Richtigkeit überprüft.
Beispiel 3 :
Konstruktion des Plasmids pK19mobsacBDpabABC
Analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurde zur Deletion des pabABC-Gens von C. glutamicum der für den Genaustausch geeignete Vektor pK19mobsacBDpabABC konstruiert. Die dazu erforderlichen Primer zur PCR-Amplifikation, abgeleitet von der öffentlich zugänglichen Genom-Sequenz (NCBI Accession- Nummer YP_225287; YP_225288.1 ; NC_006958), sind nachfolgend angegebenen:
pabABC-del-A:
5 ' - CGGGATCCTCAGGCTCGCACGTTGGAGGG-3 '
pabABC-del-B:
5 ' -CCCATCCACTAAACTTAAACAAAACGTGAAAGAATCATAATT-S '
pabABC-del-C:
5 ' -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTCGGTGAAGCCCTGGAATGAA-S ' pabABC-del -D :
5 ' -AGGGATCCGTGATGAGTCCGATCTCGGAA-S '
Primer pabABC-del-A beginnt 500 bp vor dem Translationsstart und pabABC-del-D 500 bp hinter dem Translati- onsstop des pabABC-Gens. Primer pabABC-del-B liegt 51 bp hinter dem Translationsstart von pabAB und pabABC- del-C 48 bp vor dem Translationsstop von pabC. Die letztgenannten zwei Primer verfügen jeweils über komplementäre Linker-Regionen. Parallel wurde mit der Pri- merkombination pabABC-del-A und pabABC-del-B ein 593 bp großer 5 ' -flankierender Bereich sowie mit der Primer- kombination pabABC-del-C und pabABC-del-D ein 597 bp großer 3' flankierender Bereich des zu deletierenden
Fragments amplifiziert . Die PCR-Reaktion wurde nach den Standardverfahren wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurden die erhaltenen DNA- Fragmente mit dem QIAExII Gelextraktionskit (Qiagen) isoliert, und beide Fragmente als Template in einer weiteren PCR eingesetzt. Als Primer wurden die Primer pabABC-del-A und pabABC-del-D eingesetzt. Die PCR- Reaktion wurde nach den Standardverfahren wie bei- spielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Nach der PCR- Reaktion wurde das erhaltene 1169 bp lange DNA- Fragment, das das inaktivierte pabABC-Gen mit einer 2475 bp langen zentralen Deletion beinhaltet, aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert und mit dem Vektor pK19mobsacB ligiert (Schäfer et al . Gene 145: 69-73 (1994) . Mit dem Ligationsansatz wurde der Escherichia coli Stamm DH5αmcr (Grant et al . , Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Das erhaltene Plasmid pK19mobsacBDpabC (Figur 3) wurde durch Restriktionsverdau und Sequenzierung auf seine Richtigkeit überprüft.
Beispiel 4: Konstruktion der Folsäure auxotrophen Stämme C. gluta- micum DsdaADpabAB, C. glutamicum DsdaADpabC, C. gluta- micum DsdaADpabABC .
Mittels Elektroporation wurde das Plasmid pK19mobsacBDpabAB, bzw. pK19mobsacBDpabC und pK19mobsacBDpabABC in C. glutamicum DsdaA, der in der Patentanmeldung PCT/DE2004/000248 beschrieben ist, eingebracht und auf Kanamycin-Resistenz selektioniert . Nur solche Klone, bei denen das Plasmid über homologe Re- kombination in das Chromosom integriert war, waren Ka- namycin-resistent . Es wurde jeweils ein Klon ausgewählt, der nach Überprüfung die durch das Plasmid vermittelte Saccharose-Sensitivität zeigte (Gene (1994) 145: 69-73). Dieser wurde in 50 ml BHI-Medium (Brain- Heart-Infusion-Medium , Difco Laboratories, Detroit, USA) ohne Kanamycin und Saccharose kultiviert. Anschließend wurden je 100 μl einer 10-2-, 10-3- bzw. 10- 4-fachen Verdünnung der Kultur auf BHIS-Platten (BHI- Medium mit 0,5 M Sorbitol) mit 10 % (w/v) Saccharose ausplattiert (FEMS Microbiol Lett. (1989) 53:299-303). Die erhaltenen Saccharose resistenten Klone wurden dann auf Kanamycin-Sensitivität überprüft und über PCR- Analyse verifiziert. Dabei wurden folgende Primerkombi- nationen verwendet:
Deletion von pabAB : pabAB-del-pr-u2 5'-TGGCTCACTTCGCTGGTCTTGTTG-S' pabAB-del-pr-12 5 ' -GAATGGTTGCGGCGAGTGTCA-S '
Deletion von pabC: pabC-del-pr-u2 5 ' -GTTGGGGGAGCAGGACGAGTGGT-3 ' pabC-del-pr-12 5'-TACGCGCATCTGGAAGCCTGGTTA-B'
Deletion von pabABC: pabABC-del -pr-u2 5 ' -CGTTCCGGCATCATTCTGGCTAAG-3 ' pabABC-del-pr-12 5 ' -GCGACTCCGGGTTGTTCCTGATAA-3 '
Die erfolgreiche Deletion ergab für den pabAB Genort eine Bande von 1426 bp, für den pabC Genort eine Bande von 1663 bp und für den pabABC Genort eine Bande von
1447 bp. Auf diese Weise konnten vom Ausgangsstamm KIo- ne erhalten werden, die jeweils über spezifische DeIe- tionen in Genen der Folsäuresynthese verfügen.
Diese Stämme wurden als C. glutamicum DsdaADpabAB, C. gluta-micum DsdaADpabC, bzw. C. glutamicum DsdaADpabABC bezeichnet .
Diese drei Stämme wurden auf dem Minimalmedium CGXII (J Bacteriol. (1993) 175:5595-603) ausplattiert sowie auf identischem Medium, das 1 mM Folsäure enthielt. Das
Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 :
Folsäurebedürftigkeit der hergestellten Mutanten von Corynebacterium glutamicum.
Beispiel 5:
Konstruktion und L-Serinbildung des Stammes C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC.
Mittels Elektroporation wurde das Plasmid pEC-T18mob2- serAfbrserCserB in den Stamm C. glutamicum DsdaADpabAB eingebracht. Das Plasmid (Figur 4) setzt sich zusammen aus dem Vektor pEC-T18mob2 (Curr. Microbiol . (2002) 45, 362-367) , den corynebakteriellen Genen serAfbr (Appl Microbiol Biotechnol . (2002) 60:437-41) sowie serC und serB (Deutsche Patentanmeldung 100 44 831.3) . Tetracycline resistente Klone wurden mittels bekannter Standardverfahren auf Anwesenheit und Integrität des Plasmids pEC-T18mob2-serAfbrserCserB geprüft (Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press) und ein Klon als C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC bezeichnet .
Zur L-Serinbildung wurde der Stamm C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC in Komplexmedium (CgIII mit 2 % Glukose, 5 μg/1 Tetracyclin) angezogen und das Fermen- tationsraedium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603) daraus beimpft. Das Fermentationsmedium CGXII enthielt 0,1 oder 1 mM Folsäure. Als Kontrolle wurde der Stamm C. glutamicum DsdaA pserABC in gleicher Weise kulti- viert. Es wurden je mindestens zwei unabhängige Fermentationen durchgeführt. Nach Kultivierung für 30 Stunden bei 300C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Upm wurde die in das Medium akkumulierte L-Serinmenge bestimmt. Die Analyse der Aminosäurekonzentration erfolgte mit- tels Hochdruckflüssigkeitchromatographie (J Chromat
(1983) 266: 471-482). Das Ergebnis der Fermentation ist in Tabelle 2 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass die Nutzung der konstruierten und beschriebenen Mutante in der Folsäuresynthese ein Verfahren darstellt, um die L-Serinbildung entscheidend zu verbessern.
Tabelle 2 :
Akkumulation von L-Serin im Kulturüberstand von C. glu- tamicum DsdaADpabAB pserABC und C. glutamicum DsdaA pserABC .
Beispiel 6:
Konstruktion und L-Serinbildung des Stammes C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC.
Mittels Elektroporation wurde das Plasmid pK19mobsacBDpyk (Arch Microbiol . (2004) 182:354-63) in den Stamm C. glutamicum 13032DsdaADpabABC eingebracht und auf Kanamycin-Resistenz selektioniert . Nur solche
Klone, bei denen das Plasmid über homologe Rekombination in den chromosomalen pyk-Genlokus integriert war, waren Kanamycin-resistent . Es wurde ein Klon ausge- wählt, der nach Überprüfung die durch das Plasmid vermittelte Saccharose-Sensitivität zeigte und in 50 ml BHI-Medium (Brain-Heart-Infusion-Medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) ohne Kanamycin und Saccharose kultiviert. Anschließend wurden je 100 μl einer 10-2,
10-3- bzw. 10-4 -fachen Verdünnung der Kultur auf BHIS- Platten (BHI-Medium mit 0,5 M Sorbitol) mit 10 % (w/v) Saccharose ausplattiert. Die erhaltenen Saccharose resistenten Klone wurden dann auf Kanamycin-Sensitivitat überprüft und über PCR-Analyse die erfolgreiche Deleti- on verifiziert. Auf diese Weise konnte vom Ausgangsstamm der Stamm C. glutamicum DpykDsdaADpabAB erhalten werden. Dieser Stamm wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, mit pEC-T18mob2-serAfbrserCserB transformiert und es wurde dadurch der Stamm C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC erhalten. Dieser Stamm wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, zur L-Serinbildung im Vergleich mit C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC herangezogen. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 :
Akkumulation von L-Serin im Kulturüberstand von C. glu- tamicum DpykDsdaADpabAB pserABC und C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Herstellung von L-Serin, dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration in einem Aminosäure- produzierenden Organismus reduziert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration durch Verringerung der Synthese von Folsäure oder durch deren Abbau verringert wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration durch gerichtete oder ungerichtete Mutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, verringert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3 , dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung oder Ausschaltung der Folsäu- reproduktion durch Deletionsmutation, Insertionsmu- tation, Punktmutation und/oder Substitutionsmutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression von an der Biosynthese der Folsäure beteiligten Gene verringert oder reduziert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression durch Veränderung bzw. Abschwächung oder Ausschaltung von Promotoren, Signal - Strukturen, Repressorgenen, Aktivatoren, Operatoren, Attenuatoren, Ribosomenbindestellen, Startko- dons, Terminatoren, Regulatoren, die Stabilität der Transkripte verringert wird oder das regulierbare Promotoren eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene kodierend für GTP-Cyclohydrolase, Ne- opterintriphosphatpyrophosphatase, Neopterinaldola- se , 6-Hydroxymethylpterinpyrophosphokinase , 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthase, 4-Amino-4-deoxy- chorismatlyase, Pteroatsynthase, Folatsynthase und Dihydrofolatreduktase verändert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene kodierend für Amino-4-deoxy- chorismatsynthase deletiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mit einer DNS nach Seq. Nr.1 durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor nach Seq. Nr. 2 eingesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gen kodierend für 4-Amino-4-deoxy- chorismatlyase deletiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mit einer DNS nach Seq. Nr. 3 durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass für die Deletion ein Vektor nach Seq. Nr. 4 eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen kodierend für Amino-4-deoxy- chorismatsynthase und 4-Amino-4-deoxy- chorismatlyase deletiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mit einer DNA Sequenz nach Seq. Nr. 5 durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor nach Seq. Mr. 6 eingesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass für die Synthese von L-Serin ein Organismus eingesetzt wird, der bereits vor der Veränderung L-Serin produziert.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus über ein Plasmid nach Seq. Nr . 7 verfügt .
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die katalytische Aktivität der an der Biosynthese der Folsäure beteiligten Enzyme abgeschwächt oder ausgeschaltet wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschwächung oder Ausschaltung durch Verringerung der Stabilität erfolgt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung oder Ausschaltung durch Ver- änderung des allosterischen Zentrums erfolgt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität der Enzyme durch Phosphorylie- rung oder Adenylierung verringert oder ausgeschaltet wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme durch proteolytischen Abbau in ihrer Aktivität verringert oder ausgeschaltet werden.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Enzym aus der Gruppe bestehend aus GTP-Cyclohydrolase, Neopterintriphosphatpy- rophosphatase, Neopterinaldolase, 6-Hydroxymethyl- pterinpyrophosphokinase, 4 -Amino-4-deoxy-chorismat- synthase, 4 -Amino-4-deoxy-chorismatlyase, Pteroat- synthase, Folatsynthase und Dihydrofolatreduktase in seiner Aktivität verringert oder ausgeschaltet wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eins oder mehrere Gene ausgewählt aus der Gruppe
- das für die 3 -Phosphoglycerat -Dehydrogenase kodierende serA-Gen,
- das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen,
- das für die Phosphoserin-Phosphatase kodierende serB-Gen, einzeln oder in Kombinationen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass Allele dieser Gene, insbesondere die für feed- back-resistente 3 -Phosphoglycerat-Dehydrogenase ko- dierenden serA-Gene, einzeln oder in Kombinationen verstärkt oder überexprimiert werden.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
- das für die Cystathioninlyase kodierende aecD-Gen,
- das für die Cystathioninlyase kodierende metC-Gen,
- das für die Serindehydratase kodierende sdaA-Gen,
- das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen,
- das für die beta-Untereinheit der Tryptophan- synthase kodierende trpB-Gen,
- das für die Threonindehydratase kodierende ilvA-Gen,
- das für die Pyruvatkinase kodierende pyk-Gen einzeln oder in Kombination in seiner Aktivität re- duziert oder deletiert wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Corynebakterium, Brevibak- terium, Bacillaceen, Enterobakterium ein Methanol verwertendes Bakterium oder eine Hefe eingesetzt wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020 eingesetzt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass es für die Synthese von Cystein, Trytpophan oder Methionin eingesetzt wird.
31. Gensequenz, die mindestens eine 85 %-ige Homologie zu den Seq. Nr. 1, 3 oder 5 aufweist.
32. Gensequenz nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit den Seq. Nr. 1, 3 oder 5 identisch ist.
33. Vektor, dessen Gensequenz mindestens eine 85 %-ige Homologie zu den Sequenzen Nr. 2, 4 oder 6 aufweist .
34. Vektor nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass er mit den Vektoren der Seq. Nr. 2, 4 oder 6 identisch ist.
35. Vektor, der mindestens eine 85 %-ige Homologie zu der Seq. Nr. 7 aufweist.
36. Vektor nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass er mit der Seq. Nr. 7 identisch ist.
37. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er nach mindestens einem der Schritte des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 27 verändert ist.
38. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Corynebakterium, Brevibakterium, Bacil- lacceen, Enterobakterium oder eine Hefe ist.
39. Mikroorganismus nach Anspruch 38. dadurch gekennzeichnet, dass er ein Organismus aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020 ist .
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3250700T3 (da) * 2015-01-27 2020-07-27 Cysbio Aps Fremgangsmåde til fremstilling af L-serin under anvendelse af genmodificerede mikroorganismer, der mangler serin-nedbrydningspathways
KR102674702B1 (ko) 2016-11-11 2024-06-14 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 세균의 폴레이트 수송의 약화에 의한 세균 병독성의 약독화
KR102869970B1 (ko) * 2023-06-23 2025-10-14 씨제이제일제당 (주) 변이된 rbs 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클리오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 글리신 생산 방법
KR20250133498A (ko) 2024-02-28 2025-09-08 경북대학교 산학협력단 디하이드로폴레이트 환원효소 활성 증가에 의한 l-메티오닌 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 l-메티오닌 생산 방법

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5212273B1 (de) * 1970-05-06 1977-04-06
GB1592499A (en) 1976-11-30 1981-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for production of l-serine
JPS5372893A (en) * 1976-12-08 1978-06-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of l-serine by fermentation
DE3580463D1 (de) * 1984-12-27 1990-12-13 Ajinomoto Kk Verfahren zur herstellung von l-serine.
JP3036912B2 (ja) * 1991-09-02 2000-04-24 協和醗酵工業株式会社 遺伝子発現調節ｄｎａ
TW313589B (de) * 1991-12-12 1997-08-21 Wacker Chemie Gmbh
JPH08107788A (ja) * 1994-10-11 1996-04-30 Mitsubishi Chem Corp セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片
JP3997631B2 (ja) * 1998-01-12 2007-10-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
JP4066543B2 (ja) * 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
JP2001112479A (ja) * 1999-08-12 2001-04-24 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌で自律複製可能な新規プラスミド
DE19959329A1 (de) * 1999-12-09 2001-06-13 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE10154292A1 (de) * 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag Gene die für Stoffwechselweg-Proteine codieren
DE10311399A1 (de) * 2003-03-13 2004-09-23 Forschungszentrum Jülich GmbH Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien codierend für am L-Serinstoffwechsel beteiligte Proteine sowie Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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KR20080049094A (ko) 2008-06-03
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