EP1937823A1 - Method for determining l-serine, gene sequence, vectors and micro-organisms - Google Patents

Method for determining l-serine, gene sequence, vectors and micro-organisms

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Publication number
EP1937823A1
EP1937823A1 EP06805376A EP06805376A EP1937823A1 EP 1937823 A1 EP1937823 A1 EP 1937823A1 EP 06805376 A EP06805376 A EP 06805376A EP 06805376 A EP06805376 A EP 06805376A EP 1937823 A1 EP1937823 A1 EP 1937823A1
Authority
EP
European Patent Office
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seq
folic acid
gene
genes
serine
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06805376A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Lothar Eggeling
Petra Peters-Wendisch
Michael Stolz
Hermann Sahm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP1937823A1 publication Critical patent/EP1937823A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/13—Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of L-serine and to suitable gene sequences, vectors and microorganisms. 5
  • the amino acid L-serine is used in human medicine, in the pharmaceutical industry, in the food industry and in animal nutrition. 10
  • EP 0931833A2 it is described in EP 0931833A2 that increasing the biosynthetic enzyme phosphoserine phosphatase and phosphoserine transaminase is advantageous for L-serine formation. It is also described that a gene coding for D-3-phosphoglycerate dehydrogenase can be used for L-serine formation (EP 0931833A2, PCT WO 93/12235).
  • coryneform bacteria produce L-serine in an improved manner after modification or elimination of the genes coding for folic acid synthesis.
  • the bacteria according to the invention and the gene sequences according to the invention for enzymes or regulators which catalyze folic acid synthesis or are involved in the regulation of folic acid synthesis it is now possible to produce L-serine in a yield which is considerably higher than that of the strains not modified according to the invention.
  • the L-serine production as well as the production of cysteine, tryptophan and methionine is increased by reducing the folic acid concentration in an amino acid-producing organism.
  • the organism already produces L-serine before the modification according to the invention.
  • the reduction in folic acid concentration can be achieved by reducing the synthesis of folic acid or its degradation.
  • Folic acid can be obtained by targeted or undirected mutation of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
  • mutations leading to a reduction or elimination of folic acid production are the deletion mutation, insertion mutation, substitution mutation or point mutation of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
  • genetically modified or unaltered genes of proteins involved in the biosynthesis of folic acid may reduce or eliminate folic acid production by reducing or preventing the expression of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
  • Reduction or elimination of expression of genes involved in the biosynthetic pathway of folic acid may be achieved by altering, preferably attenuating, more preferably eliminating promoters, such as signal structures, repressor genes, activators, operators, attenuators, ribosome binding sites or start codons, terminators, or further - tion, preferably attenuation, particularly preferably elimination or attenuation of regulators or the stability of the transcripts can be achieved.
  • promoters such as signal structures, repressor genes, activators, operators, attenuators, ribosome binding sites or start codons, terminators, or further - tion
  • attenuation particularly preferably elimination or attenuation of regulators or the stability of the transcripts can be achieved.
  • Farther regulatable promoters in particular attenuated promoters, can be used.
  • the activity of the enzymes involved in the biosynthesis of folic acid can be achieved by reducing or eliminating the catalytic activity and the stability of the enzymes. The same effect can be achieved by altering the allosteric center or a feedback inhibition of the enzymes.
  • a typical way to reduce or eliminate the activity of the enzymes is by protein modification, for example by phosphorylation or adenylation. It is also possible to increase the proteolytic degradation of enzymes involved in the biosynthesis pathway of folic acid.
  • Typical enzymes whose activity can be reduced or eliminated in the manner described are GTP cyclohydrolase, neopterin triphosphate pyrophosphatase, neopterinololase, ⁇ -hydroxymethylpterin pyrophosphokinase, 4-amino-4-deoxy-chorismate synthase, 4-amino-4-deoxybenzoyl chorismate lyase, pteroate synthase, folate synthase and dihydrofolate reductase.
  • the invention is also a vector, the one
  • the vectors according to the invention contain tools which are suitable for the gene for the synthesis of 4-amino-4- deoxy-chorismate synthase and or 4-amino-4-deoxy-chorismate lyase.
  • Seq. No. 1 The sequence for the deletion of the 4-amino-4-deoxy-chorismate synthase gene is shown in Seq. No. 1 shown.
  • Seq. No. 2 shows the structure of a vector containing the Seq. No.1 carries.
  • Seq. No. 4 shows the structure of a vector containing the Seq. No. 3 carries.
  • Seq. No. 5 shows the structure of a vector containing the Seq. No. 5 for the deletion of the 4-amino-4-deoxy- chorismatsynthasegens and the 4-amino-4deoxy-chorismat lyasegens carries.
  • Seq. No. 7 is a plasmid which is suitable for additionally increasing L-serine production. It corresponds to the plasmid shown in FIG. 4 with the designation pEC-T18mob2-serA fbr CB-.
  • the structures responsible for the deletion can also be incorporated into other vector scaffolds which are suitable for the corresponding organism. Ren as vectorial 'come in addition to the commonly used vectors cyclic and linear vectors or phages in question.
  • the figures show vectors which can be used by way of example for the changes according to the invention of the L-serine producing organisms. It shows :
  • Fig.2 pK19mobsacB_pabC according to Seq. No. 4.
  • the tools of sequences 1, 3 and 5 are introduced into vectors in L-serine production organisms which already produce L-serine prior to alteration.
  • Suitable organisms are, for example, Corynebacteria, such as Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium. Enterobacteria, bacillaceae or hay species, which have a reduced folic acid concentration, can also be used as production organisms.
  • Corynebacteria such as Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium.
  • Enterobacteria, bacillaceae or hay species, which have a reduced folic acid concentration can also be used as production organisms.
  • the invention will be described in more detail:
  • the invention relates to a process for the production of L-serine by fermentation using coryneform bacteria, in which the genes coding for folic acid synthesis are modified, switched off or altered in their expression or in Folic acid bacteria naturally a folic acid deficiency is induced or the regulation of folic acid synthesis is influenced in such a way that folic acid deficiency arises. Since the folic acid synthesis starts from an intermediate of the nucleotide synthesis as well as an intermediate of the synthesis of aromatic amino acids, these corresponding reactions can in principle also be modified or eliminated, provided that nucleotides and aromatic amino acids themselves are still sufficiently available, as for example by external supplementation the case is. In addition, folic acid deficiency may also be induced by deletion or modification of regulators that control the expression of genes of folic acid or its associated metabolic pathways.
  • the strains used preferably produce L-serine before the folic acid synthesis is modified.
  • the term modification includes the attenuation of folic acid synthesis genes and the complete deletion of polysynthetic genes. These include non-directed mutagenesis and directed recombinant DNA techniques. With the help of these methods, for example, genes of folic acid synthesis in the chromosome can be deleted. Suitable methods are described in Shufer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) or also Link et al. (J. Bacteriology (1998) 179: 6228-6237). Also, only parts of the gene can be deleted or mutated fragments of genes can be exchanged.
  • An advantageous embodiment of the method according to the invention is, for example, the inventively modified C. glutamicum strain ATCC13032DpykDsdaADpabABpserABC, which, inter alia, carries a deletion in the pabAB gene.
  • mutagenesis methods include undirected methods involving chemical reagents such as. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine or UV irradiation for mutagenesis use, with subsequent search of the desired microorganisms for reduction or loss of folic acid synthesis activity.
  • genes of folic acid synthesis can be reduced by altering the signal structures for gene expression.
  • Signal structures are, for example, repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon and terminators. Information on this is the expert z. In Patent Application WO 96/15246, Boyd and Murphy (J. Bacteriol 1988: 170: 5949), Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Res. 1998. 26: 3548, Jensen and Hammer (Biotechnol. 1998 58: 191), in Patek et al.
  • a regulation of the translation is possible by, for example, the stability of the m-RNA is reduced. This can be achieved by weakening the stability by additional and / or altered sequences at the 5 'end or 3' end of the gene. Examples are for genes from Bacillus subtilis (Microbiology (2001) 147: 1331-41) or yeast (Trends Biotechnol., 1994, 12: 444-9). It is also possible to influence enzyme activity by intrinsic proteolytic activity as described (Mol Microbiol. (2005) 57: 576-91).
  • genes coding for the corresponding enzyme of low activity folic acid synthesis can be used. Mutations that lead to a change or reduction of the catalytic activity of enzyme proteins are known. Examples can be found in the work of Qiu and Goodman (J Biological Chemistry (1997) 272: 8611-8617), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry (1997) 61: 1760-1762) and Möckel ("The threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum: abolition of the allosteric regulation and structure of the enzyme", Reports from the Jülich Research Center, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich , Germany, 1994).
  • Patent 4,601,893, Schwarzer and Pühler Bio / Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid et al (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993) ) and in patent application WO 96/15246.
  • genes of the folic acid synthesis of C. glutamicum can be reduced expressed or deleted or the enzyme activities can be reduced.
  • L-serine in addition to the induced deficiency of folic acid, one or more of the genes selected from the group, • the serA gene coding for the 3-phosphoglycerate dehydrogenase,
  • the serB gene coding for the phosphoserine phosphatase in particular to overexpress or alleles of these genes, in particular
  • metC gene coding for cystathionin lyase The metC gene coding for cystathionin lyase, the sdaA gene coding for serine dehydratase,
  • the microorganisms according to the invention comprise bacteria of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, which are modified by classical and / or molecular genetic methods such that their metabolic flux increasingly proceeds in the direction of the biosynthesis of amino acids or their derivatives.
  • the present invention encompasses all known amino acid production strains.
  • those production strains are included, which the skilled person can produce by analogy with findings from other microorganisms, for example enterobacteria, bacillaceae or yeast species, by the conventional method.
  • such amino acid production strains are also included in which the degradation of L-serine is altered or attenuated.
  • the present invention also relates to a pabAB and pabC gene sequence Nos. 1, 3 and 5, which is characterized in that a portion of the sequence was cut out by means of a defined deletion, so that only inactivated or attenuated Aminodeoxy- chorismatsynthase or Aminodeoxychorismatlyase activity can result ,
  • the pabAB and pabC gene sequences are preferably isolated from microorganisms of the genus Corynebacterium or Brevibacterium. By way of example, a few more specific microorganisms are listed here:
  • the pabAB gene of C. glutamicum is replaced by known methods in the chromosome by a pABAB gene shortened by 1734 bp (J. Bacteriol. (1997) 179: 6228-37, Gene (1994) 145: 69-73).
  • the following primers were synthesized derived from the publicly available genome sequence (NCBI Accession Number YP_225287; NC_006958):
  • the primer pabAB-del-A starts 522 bp before the start of translation and pabAB-del-D 436 bp behind the translation stop of the pabAB gene.
  • the primer pabAB-del-B is 21 bp behind the translation start
  • the primer pabAB-del-C is 66 bp before the translation stop and both have complementary linker regions, as in Link et al. (J. Bacteriol. (1997) 179: 6228-37).
  • PCR amplifications were carried out with the primer combination pabAB-del-A and pabAB-del-B and the primer combination pABAB-del-B and pabAB-del-C with chromosomal DNA of C.
  • the PCR reaction was carried out in 30 cycles in the presence of 200 ⁇ M deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), each 600 nM of the corresponding oligonucleotides,
  • the amplification was carried out in 35 cycles in the presence of 200 ⁇ M deoxynucleotide triphosphates, 600 nM each of the corresponding oligonucleotide, 20 ng each of the isolated template DNA from the first PCR, 1/10 volume 10-fold Reaction buffer and 2.6 units of the Taq / Pwo ⁇ DNA polymerase mixture under the following conditions:
  • the vector pK19mobsacBDpabC suitable for gene replacement was constructed for the deletion of the pabC gene of C. glutamicum.
  • the primers required for PCR amplification were in turn derived from the publicly available genome sequence (NCBI accession number YP_225288.1, NC_006958). They are listed below:
  • pabC-del-A 5'-GAGGATCCAATCATTGCTGAGCTGCGCAG-3 ' pabC-del-B:
  • pabC-del-C 5 '-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTCGGTGAAGCCCTGGAATGAA-3'
  • the primer pabC-del-A starts 500 bp before the start of translation and pabC-del-D 500 bp behind the translation stop of the pabC gene.
  • the primer pabC-del-B is 51 bp behind the translation start and pabC-del-C 48 bp before the translation stop.
  • the last two primers each have complementary linker regions.
  • the primer combination pabC-del-A and pabC-del-B became a 602 bp 5 'flanking region and the primer combination pabC-del-C and pabC-del-D a 597 bp 3' flanking region of deletierenden fragment amplified.
  • the PCR reaction was carried out according to the standard methods, such as in example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032. After the PCR reaction, the DNA fragments obtained were isolated with the QIAExII gel extraction kit (Qiagen) and both fragments were isolated as
  • the vector pK19mobsacBDpabABC suitable for gene replacement was constructed for the deletion of the pabABC gene of C. glutamicum.
  • the PCR amplification primers required for this derived from the publicly available genome sequence (NCBI accession number YP_225287; YP_225288.1; NC_006958), are indicated below:
  • the primer pabABC-del-A starts 500 bp before the start of translation and pabABC-del-D 500 bp behind the translation stop of the pabABC gene.
  • Primer pabABC-del-B is 51 bp beyond the translation start of pabAB and pabABC-del-C 48 bp before the translation stop of pabC.
  • the latter two primers each have complementary linker regions.
  • the pabABC-del-A and pabABC-del-B pri- mary combination resulted in a 593 bp 5 'flanking region and, with the primer combination pabABC-del-C and pabABC-del-D, a 597 bp 3' flanking area of the to be deleted
  • the PCR reaction was carried out according to standard methods such as in Example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032. After the PCR reaction, the DNA fragments obtained were isolated with the QIAExII gel extraction kit (Qiagen), and both fragments were used as template in another PCR. The primers pabABC-del-A and pabABC-del-D were used as primers.
  • the PCR reaction was carried out by the standard methods such as, for example, in Example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032.
  • the resulting 1169 bp DNA fragment containing the inactivated pabABC gene with a 2475 bp central deletion was isolated from a 0.8% agarose gel and ligated with the vector pK19mobsacB (Schäfer et Gene 145: 69-73 (1994). Escherichiae was used with the ligation mixture coli strain DH5 ⁇ mcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1990) 87: 4645-4649). The resulting plasmid pK19mobsacBDpabC (FIG. 3) was checked for its accuracy by restriction digestion and sequencing.
  • EXAMPLE 4 Construction of folic acid auxotrophic strains C. glutamicum DsdaADpabAB, C. glutamicum DsdaADpabC, C. glutamicum DsdaADpabABC.
  • pabAB-del-pr-u2 5'-TGGCTCACTTCGCTGGTCTTGTTG-S 'pabAB-del-pr-12 5'-GAATGGTTGCGGCGAGTGTCA-S'
  • pabC-del-pr-u2 5 '-GTTGGGGGAGCAGGACGAGTGGT-3' pabC-del-pr-12 5'-TACGCGCATCTGGAAGCCTGGTTA-B '
  • pabABC-del -pr-u2 5 '-CGTTCCGGCATCATTCTGGCTAAG-3'
  • pabABC-del-pr-12 5 '-GCGACTCCGGGTTGTTCCTGATAA-3'
  • the successful deletion gave a band of 1426 bp for the pabAB locus, a band of 1663 bp for the pabC genort, and a band of pabABC for the gene locus
  • strains were designated as C. glutamicum DsdaADpabAB, C. glutamicum DsdaADpabC, and C. glutamicum DsdaADpabABC, respectively.
  • the plasmid (FIG. 4) is composed of the vector pEC-T18mob2 (Curr. Microbiol. (2002) 45, 362-367), the corynebacterial genes serAfbr (Appl Microbiol Biotechnol. (2002) 60: 437-41) and serC and serB (German Patent Application 100 44 831.3).
  • Tetracycline-resistant clones were tested by known standard methods for the presence and integrity of the plasmid pEC-T18mob2-serAfbrserCserB (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory Press) and a clone designated C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC ,
  • the strain C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC was grown in complex medium (CgIII with 2% glucose, 5 ⁇ g / l tetracycline) and the fermentation cationsraedium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603).
  • the fermentation medium CGXII contained 0.1 or 1 mM folic acid.
  • the strain C. glutamicum DsdaA pserABC was cultivated in the same way. At least two independent fermentations were ever carried out. After culturing for 30 hours at 30 0 C on a rotary shaker at 120 rpm accumulated in the medium L-serine quantity was determined.
  • the analysis of the amino acid concentration was carried out by means of high pressure liquid chromatography (J Chromat)
  • the plasmid pK19mobsacBDpyk (Arch Microbiol. (2004) 182: 354-63) was introduced into the strain C. glutamicum 13032DsdaADpabABC and selected for kanamycin resistance. Only such
  • Clones in which the plasmid was integrated into the chromosomal pyk gene locus via homologous recombination were kanamycin resistant. A clone was excluded. which, when checked, showed the plasmid-mediated sucrose sensitivity and cultured in 50 ml of BHI medium (Brain Heart Infusion Medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) without kanamycin and sucrose. Subsequently, 100 ⁇ l each of a 10-2,
  • the parent strain C. glutamicum DpykDsdaADpabAB could be obtained from the starting strain.
  • This strain was transformed with pEC-T18mob2-serAfbrserCserB as described in Example 5, thereby obtaining the strain C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC.
  • This strain was used for L-serine formation as described in Example 5 in comparison with C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC. The result is shown in Table 3.

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Abstract

According to the invention, the folic acid concentration in amino acid producing organisms is reduced or completely removed in order to the increase the production of L-serine. The enzymes and genes, which are involved in the biosynthesis of the folic acid, can be completely excluded or at least reduced in the activity thereof. In a preferred embodiment, the sequence numbers 1 7 are used.

Description

Be s chre ibung Description
Verfahren zur Herstellung von L-Serin, Gensequenz, Vektoren sowie MikroorganismusProcess for the preparation of L-serine, gene sequence, vectors and microorganism
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin sowie dafür geeignete Gensequenzen, Vektoren und Mikroorganismen. 5The invention relates to a process for the preparation of L-serine and to suitable gene sequences, vectors and microorganisms. 5
Stand der TechnikState of the art
Die Aminosäure L-Serin findet in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung. 10The amino acid L-serine is used in human medicine, in the pharmaceutical industry, in the food industry and in animal nutrition. 10
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebac- terium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Her- IS'' stellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation oder die Aufarbeitung 20 zur Produktform durch z. B. Ionenaustauschchromato- graphie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.It is known that amino acids are produced by fermentation of strains of coryneform bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum. Because of the great importance is constantly working on the improvement of the her-IS '' setting process. Process improvements can fermentation measures, such. B. stirring and supply of oxygen or the composition of the nutrient media, such. B. the sugar concentration during the fermentation or the work-up 20 to the product form by z. B. ion exchange chromatography or the intrinsic performance characteristics of the microorganism itself concern.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mik- 5 roorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind, und L- Aminosäuren wie L-Serin produzieren. So ist ein coryneformes Bakterium beschrieben, das eine Resistenz gegenüber Azaserin oder beta- (2-Thienyl) -DL-Alanin aufweist und L-Serin produziert (EP0943687) . Ferner ist es Stand der Technik, dass mittels gentechnischer Methoden Aktivitäten des Biosynthesewegs erhöht werden können und dies zu erhöhter Aminosäurebildung führt . So ist zum Beispiel in EP 0931833A2 beschrieben, dass eine Erhöhung des Biosyntheseenzyms Phosphoserin-Phosphatase und Phosphoserin-Transaminase vorteilhaft für die L-Serinbildung ist. Ferner ist beschrieben, dass ein Gen, das für die D-3 -Phosphoglycerat-Dehydrogenase ko- diert, für die L-Serinbildung genutzt werden kann (EP 0931833A2, PCT WO 93/12235) .To improve the performance characteristics of these microorganisms, methods of mutagenesis, selection and mutant selection are used. In this way receives strains resistant to antimetabolites or auxotrophic for metabolites of regulatory importance, and L-amino acids such as L-serine. Thus, a coryneform bacterium is described which has resistance to azaserine or beta- (2-thienyl) -DL-alanine and produces L-serine (EP0943687). Furthermore, it is state of the art that by means of genetic engineering activities of the biosynthetic pathway can be increased and this leads to increased amino acid formation. For example, it is described in EP 0931833A2 that increasing the biosynthetic enzyme phosphoserine phosphatase and phosphoserine transaminase is advantageous for L-serine formation. It is also described that a gene coding for D-3-phosphoglycerate dehydrogenase can be used for L-serine formation (EP 0931833A2, PCT WO 93/12235).
Es ist darüber hinaus bekannt, dass neben einer Erhöhung der Aktivität von Enzymen des L-Aminosäuresyn- thesewegs auch die Verminderung oder sogar die Ausschaltung von Enzymen, die an Abbaureaktionen der L-Aminosäure beteiligt sind, zu einer Verbesserung der L-Aminosäureakkumulation führen können. So ist gefunden, dass die Ausschaltung des Enzyms L-Serindehy- dratase zu höheren L-Serin-Akkumulationen führt (PCT/DE 2004/000248) . Ferner führt auch eine Verminderung der Aktivität des Enzyms Serinhydroxymethyltransferase zu einem verringerten L-Serinabbau (US-Patent 6,596,516; Simic et al . (2002) Appl . Environ Microbiol . 68:3321- 3327) . Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und einen dafür geeigneten Mikroorganismus sowie Vektoren zur Verfügung zu stellen, mit denen die Produktion von L-Serin gesteigert werden kann. Weiterhin sollen ein Verfahren sowie Mikroorganismen und Vektoren zur Verfügung gestellt werden, mit denen eine Steigerung der Produktion von Cystein, Tryptophan und Methionin erzielt werden kann.It is also known that in addition to increasing the activity of enzymes of the L-amino acid synthesis pathway, the reduction or even the elimination of enzymes involved in L-amino acid degradation reactions may lead to an improvement in L-amino acid accumulation. It has thus been found that the elimination of the enzyme L-serine dehydratase leads to higher L-serine accumulations (PCT / DE 2004/000248). Furthermore, a reduction in the activity of the enzyme serine hydroxymethyltransferase also leads to a decrease in L-serine breakdown (US Patent 6,596,516, Simic et al., (2002) Appl. Environ Microbiol., 68: 3321-3327). It is the object of the invention to provide a method and a microorganism suitable therefor, as well as vectors, with which the production of L-serine can be increased. Furthermore, a method and microorganisms and vectors are provided, with which an increase in the production of cysteine, tryptophan and methionine can be achieved.
In überraschender Weise wurde gefunden, dass corynefor- me Bakterien nach Modifizierung oder Ausschaltung der für die Folsäuresynthese kodierenden Gene in verbesserter Weise L-Serin produzieren. Mit den erfindungsgemäßen Verfahren sowie den erfindungsgemäßen Bakterien und den erfindungsgemäßen Gensequenzen für Enzyme oder Regulatoren, die die Folsäuresynthese katalysieren bzw. an der Regulation der Folsäuresynthese beteiligt sind, ist es nunmehr möglich, L-Serin mit einer Ausbeute herzustellen, die erheblich höher liegt, als die der nicht erfindungsgemäß veränderten Stämme. Der Umfang derSurprisingly, it has been found that coryneform bacteria produce L-serine in an improved manner after modification or elimination of the genes coding for folic acid synthesis. With the method according to the invention and the bacteria according to the invention and the gene sequences according to the invention for enzymes or regulators which catalyze folic acid synthesis or are involved in the regulation of folic acid synthesis, it is now possible to produce L-serine in a yield which is considerably higher than that of the strains not modified according to the invention. The scope of
Steigerung der L-Serin-Produktion ist in Tabelle 2 dargestellt.Increase in L-serine production is shown in Table 2.
Im Folgenden soll die Erfindung in der allgemeinen Form beschrieben werden:In the following, the invention will be described in the general form:
Erfindungsgemäß wird die L-Serinproduktion sowie die Produktion von Cystein, Tryptophan und Methionin dadurch gesteigert, dass die Folsäurekonzentration in einem Aminosäure produzierenden Organismus verringert wird. Vorzugsweise produziert der Organismus bereits vor der erfindungsgemäßen Veränderung L-Serin. Beispielsweise kann die Verringerung der Folsäurekon- zentration durch Verringerung der Synthese von Folsäure oder deren Abbau erreicht werden.According to the invention, the L-serine production as well as the production of cysteine, tryptophan and methionine is increased by reducing the folic acid concentration in an amino acid-producing organism. Preferably, the organism already produces L-serine before the modification according to the invention. For example, the reduction in folic acid concentration can be achieved by reducing the synthesis of folic acid or its degradation.
Die Verringerung oder Verhinderung der Synthese vonThe reduction or prevention of the synthesis of
Folsäure kann durch gerichtete oder ungerichtete Mutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, erreicht werden.Folic acid can be obtained by targeted or undirected mutation of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
Beispiele für Mutationen, die zu einer Verringerung oder Ausschaltung der FolSäureproduktion führen, sind die Deletionsmutation, Insertionsmutation, Substitutionsmutation oder eine Punktmutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind.Examples of mutations leading to a reduction or elimination of folic acid production are the deletion mutation, insertion mutation, substitution mutation or point mutation of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
Weiterhin kann bei genetisch veränderten oder unveränderten Genen von Proteinen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, eine Verringerung oder Ausschaltung der Folsäureproduktion erfolgen indem die Ex- pression von an der Biosynthese von Folsäure beteiligten Genen verringert oder verhindert wird.Furthermore, genetically modified or unaltered genes of proteins involved in the biosynthesis of folic acid may reduce or eliminate folic acid production by reducing or preventing the expression of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
Eine Verringerung oder Ausschaltung der Expression von Genen, die am Biosyntheseweg von Folsäure beteiligt sind, kann durch Veränderung, vorzugsweise Abschwächung, besonders bevorzugt Ausschaltung von Promotoren, wie Signalstrukturen, Repressorgenen, Aktivatoren, Operatoren, Attenuatoren, Ribosomenbindestellen oder Startkodons, Terminatoren oder weiterhin durch Verände- rung, vorzugsweise Abschwächung, besonders bevorzugt Ausschaltung oder Schwächung von Regulatoren oder der Stabilität der Transskripte erreicht werden. Weiterhin können regulierbare Promotoren, insbesondere abgeschwächte Promotoren, eingesetzt werden.Reduction or elimination of expression of genes involved in the biosynthetic pathway of folic acid may be achieved by altering, preferably attenuating, more preferably eliminating promoters, such as signal structures, repressor genes, activators, operators, attenuators, ribosome binding sites or start codons, terminators, or further - tion, preferably attenuation, particularly preferably elimination or attenuation of regulators or the stability of the transcripts can be achieved. Farther regulatable promoters, in particular attenuated promoters, can be used.
Auf der Enzymebene kann die Aktivität der an der Bio- synthese der Folsäure beteiligten Enzyme durch Reduzierung oder Ausschaltung der katalytischen Aktivität und der Stabilität der Enzyme erreicht werden. Die gleiche Wirkung kann durch Veränderung des allosterisehen Zentrums bzw. einer Feedback-Inhibierung der Enzyme er- reicht werden. Eine typische Möglichkeit, die Aktivität der Enzyme zu vermindern oder auszuschalten, ist die Proteinmodifikation beispielsweise durch Phosphorylierung oder Adenylierung. Es kann auch der proteolytische Abbau von am Biosyntheseweg der Folsäure beteiligten Enzymen gesteigert werden.At the enzyme level, the activity of the enzymes involved in the biosynthesis of folic acid can be achieved by reducing or eliminating the catalytic activity and the stability of the enzymes. The same effect can be achieved by altering the allosteric center or a feedback inhibition of the enzymes. A typical way to reduce or eliminate the activity of the enzymes is by protein modification, for example by phosphorylation or adenylation. It is also possible to increase the proteolytic degradation of enzymes involved in the biosynthesis pathway of folic acid.
Typische Enzyme, deren Aktivität auf die beschriebene Art verringert oder ausgeschaltet werden kann, sind GTP-Cyclohydrolase , Neopterintriphosphatpyrophosphata- se, Neopterinaldolase, β-Hydroxymethylpterinpyro- phosphokinase, 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthase, 4- Amino-4-deoxy-chorismatlyase, Pteroatsynthase, Folat- synthase und Dihydrofolatreduktase .Typical enzymes whose activity can be reduced or eliminated in the manner described are GTP cyclohydrolase, neopterin triphosphate pyrophosphatase, neopterinololase, β-hydroxymethylpterin pyrophosphokinase, 4-amino-4-deoxy-chorismate synthase, 4-amino-4-deoxybenzoyl chorismate lyase, pteroate synthase, folate synthase and dihydrofolate reductase.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Vektor, der einThe invention is also a vector, the one
Tool beinhaltet, welches geeignet ist, erfindungsgemäße genetische Veränderungen in einem Produktionsorganismus herbeizuführen.Tool which is suitable to bring about genetic alterations of the invention in a production organism.
Die erfindungsgemäßen Vektoren beinhalten Tools, welche geeignet sind, das Gen für die Synthese von 4-Amino-4- deoxy-chorismatsynthase und oder 4-Amino-4-deoxy~ chorismatlyase zu deletieren.The vectors according to the invention contain tools which are suitable for the gene for the synthesis of 4-amino-4- deoxy-chorismate synthase and or 4-amino-4-deoxy-chorismate lyase.
Die Sequenz für die Deletion des 4-Amino-4-deoxy- chorismatsynthasegens ist in Seq. Nr. 1 dargestellt. Seq. Nr. 2 zeigt die Struktur eines Vektors, welcher die Seq. Nr.1 trägt.The sequence for the deletion of the 4-amino-4-deoxy-chorismate synthase gene is shown in Seq. No. 1 shown. Seq. No. 2 shows the structure of a vector containing the Seq. No.1 carries.
Die Sequenz für die Deletion des 4-Amino-4-deoxy- chorismatlyasegens ist in Seq. Nr. 3 dargestellt.The sequence for the deletion of the 4-amino-4-deoxy-chorismatlyase gene is shown in Seq. No. 3 shown.
Seq. Nr. 4 zeigt die Struktur eines Vektors, welcher die Seq. Nr. 3 trägt.Seq. No. 4 shows the structure of a vector containing the Seq. No. 3 carries.
Sequenz für die Deletion des 4-Amino-4-deoxy-choris- matsynthasegens und des 4 -Amino-4-deoxy-chorismatlyasegens ist in Seq. Nr. 5 dargestellt. Seq. Nr. 6 zeigt die Struktur eines Vektors, welcher die Seq. Nr. 5 für die Deletion des 4-Amino-4deoxy- chorismatsynthasegens und des 4-Amino-4deoxy-chorismat- lyasegens trägt .Sequence for the deletion of the 4-amino-4-deoxy-choris- matsynthasegens and the 4-amino-4-deoxy-chorismatlyasegens is shown in Seq. No. 5 shown. Seq. No. 6 shows the structure of a vector containing the Seq. No. 5 for the deletion of the 4-amino-4-deoxy- chorismatsynthasegens and the 4-amino-4deoxy-chorismat lyasegens carries.
In Seq. Nr.7 ist ein Plasmid dargestellt, welches geeignet ist, die L-Serin-Produktion zusätzlich zu steigern. Es entspricht dem in Figur 4 dargestellten Plas- mid mit der Bezeichnung pEC-T18mob2-serAfbrCB- .In Seq. No. 7 is a plasmid which is suitable for additionally increasing L-serine production. It corresponds to the plasmid shown in FIG. 4 with the designation pEC-T18mob2-serA fbr CB-.
Die für die Deletion verantwortlichen Strukturen können auch in andere Vektorgerüste eingebaut werden, die für den entsprechenden Organismus geeignet sind. Als Vekto-' ren kommen neben den häufig verwendeten cyclischen Vektoren auch lineare Vektoren oder Phagen in Frage. Die Figuren zeigen Vektoren, die beispielhaft für die erfindungsgemäßen Veränderungen der L-Serin produzierenden Organismen herangezogen werden können. Es zeigt :The structures responsible for the deletion can also be incorporated into other vector scaffolds which are suitable for the corresponding organism. Ren as vectorial 'come in addition to the commonly used vectors cyclic and linear vectors or phages in question. The figures show vectors which can be used by way of example for the changes according to the invention of the L-serine producing organisms. It shows :
Fig.l: pK19mobsacB_pabAB entsprechendFig.l: pK19mobsacB_pabAB accordingly
Seq. Nr. 2.Seq. No. 2.
Fig.2: pK19mobsacB_pabC entsprechend Seq. Nr 4.Fig.2: pK19mobsacB_pabC according to Seq. No. 4.
Fig.3: pK19mobsacB_pabABC entsprechend Seq. Nr 6.3: pK19mobsacB_pabABC corresponding to Seq. No. 6.
Fig . 4 : pEC-T18mob2 - serAfbrCB entsprechendFig. 4: pEC-T18mob2 - serA fbr CB accordingly
Seq . Nr 7 .Seq. No. 7.
Vorzugsweise werden die Tools nach den Sequenzen 1, 3 und 5 auf Vektoren in L-Serin-Produktionsorganismen eingebracht, welche bereits vor der Veränderung L-Serin produzieren.Preferably, the tools of sequences 1, 3 and 5 are introduced into vectors in L-serine production organisms which already produce L-serine prior to alteration.
Alle angegebenen Sequenzen sollen auch Varianten umfassen, welche 90 %, vorzugsweise 95 % Homologie besitzen.All sequences given are also intended to include variants having 90%, preferably 95%, homology.
Geeignete Organismen sind beispielsweise Corynebacte- rien, wie Corynebacterium glutamicum oder Brevibacteri- um. Es können auch Enterobakterien, Bacillaceen oder Heefearten, die eine verringerte Folsäurekonzentration aufweisen, als Produktionsorganismen eingesetzt werden. Im Folgenden soll die Erfindung genauer beschrieben werden :Suitable organisms are, for example, Corynebacteria, such as Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium. Enterobacteria, bacillaceae or hay species, which have a reduced folic acid concentration, can also be used as production organisms. In the following, the invention will be described in more detail:
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermen- tativen Herstellung von L-Serin unter Verwendung von coryneformen Bakterien, bei denen die Gene, die für die Folsäuresynthese kodieren, modifiziert, ausgeschaltet oder in ihrer Expression verändert werden oder aber bei natürlicherweise Folsäure bedürftigen Bakterien ein FolSäuremangel herbeigeführt wird oder aber die Regulation der Folsäuresynthese derartig beeinflusst wird, dass FolSäuremangel entsteht. Da die Folsäuresynthese von einem Intermediat der Nukleotidsynthese sowie einem Intermediat der Synthese aromatischer Aminosäuren aus- geht, können prinzipiell auch diese entsprechenden Reaktionen modifiziert oder ausgeschaltet werden, vorausgesetzt dass Nukleotide und aromatische Aminosäuren selbst noch ausreichend zur Verfügung stehen, wie es zum Beispiel durch externe Supplementation der Fall ist. Darüber hinaus kann der FolSäuremangel auch durch Deletion oder Modifikation von Regulatoren, die die Expression von Genen der Folsäure oder der damit verknüpften Stoffwechselwege, kontrolliert herbeigeführt werden.The invention relates to a process for the production of L-serine by fermentation using coryneform bacteria, in which the genes coding for folic acid synthesis are modified, switched off or altered in their expression or in Folic acid bacteria naturally a folic acid deficiency is induced or the regulation of folic acid synthesis is influenced in such a way that folic acid deficiency arises. Since the folic acid synthesis starts from an intermediate of the nucleotide synthesis as well as an intermediate of the synthesis of aromatic amino acids, these corresponding reactions can in principle also be modified or eliminated, provided that nucleotides and aromatic amino acids themselves are still sufficiently available, as for example by external supplementation the case is. In addition, folic acid deficiency may also be induced by deletion or modification of regulators that control the expression of genes of folic acid or its associated metabolic pathways.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Unteransprüchen .Preferred embodiments can be found in the subclaims.
Die eingesetzten Stämme produzieren vorzugsweise be- reits vor der Modifizierung der Folsäuresynthese L-Serin. Der Begriff Modifizierung beinhaltet die Abschwächung von Folsäuresynthesegenen und die vollständige Deletion von Polsäuresynthesegenen. Hierzu gehören ungerichtete Mutagenesen sowie gerichtete rekombinante DNA-Tech- niken. Mit Hilfe dieser Methoden können zum Beispiel Gene der Folsäuresynthese im Chromosom deletiert werden. Geeignete Methoden dazu sind bei Schäfer et al . (Gene (1994) 145: 69-73) oder auch Link et al . (J. Bac- teriology (1998) 179: 6228-6237) beschrieben. Auch kön- nen nur Teile des Gens deletiert werden oder auch mutierte Fragmente von Genen ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so der Verlust oder eine Reduktion der Folsäuresynthese-Aktivität erreicht. Eine vorteilhafte Ausführung des erfindungsgemäßen Verfah- rens ist beispielsweise der erfindungsgemäß veränderte C. glutamicum Stamm ATCC13032DpykDsdaADpabABpserABC, der unter anderem eine Deletion im pabAB-Gen trägt .The strains used preferably produce L-serine before the folic acid synthesis is modified. The term modification includes the attenuation of folic acid synthesis genes and the complete deletion of polysynthetic genes. These include non-directed mutagenesis and directed recombinant DNA techniques. With the help of these methods, for example, genes of folic acid synthesis in the chromosome can be deleted. Suitable methods are described in Schäfer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) or also Link et al. (J. Bacteriology (1998) 179: 6228-6237). Also, only parts of the gene can be deleted or mutated fragments of genes can be exchanged. Deletion or replacement results in the loss or reduction of folic acid synthesis activity. An advantageous embodiment of the method according to the invention is, for example, the inventively modified C. glutamicum strain ATCC13032DpykDsdaADpabABpserABC, which, inter alia, carries a deletion in the pabAB gene.
Eine weitere Möglichkeit, die Aktivität der Folsäure- synthese abzuschwächen oder auszuschalten, sind Mutage- neseverfahren. Hierzu gehören ungerichtete Verfahren, die chemische Reagenzien wie z. B. N-Methyl-N-Nitro-N- Nitrosoguanidin oder auch UV-Bestrahlung zur Mutagenese benutzen, mit anschließender Suche der gewünschten Mik- roorganismen auf Verminderung oder Verlust der Folsäuresynthese-Aktivität. Verfahren zur Mutationsauslösung und Mutantensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Ge- netics, A Laboratory Manual and Handbook for Escheri- chia coli and Related Bacteria (CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1992) ) oder im Handbuch "Manual of Me- thods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) nachgelesen werden.Another possibility to attenuate or eliminate the activity of folic acid synthesis are mutagenesis methods. These include undirected methods involving chemical reagents such as. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine or UV irradiation for mutagenesis use, with subsequent search of the desired microorganisms for reduction or loss of folic acid synthesis activity. Methods for mutation induction and mutant screening are well known and can be found, inter alia, in Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) or in the Handbook "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington, DC, USA, 1981).
Darüber hinaus kann auch die Expression von Genen der Folsäuresynthese durch Veränderung der Signalstrukturen zur Genexpression reduziert werden. Signalstrukturen sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungs- stellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hier- zu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (J. Bacteriol . 1988. 170: 5949), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Res . 1998. 26: 3548, bei Jensen und Hammer (Biotechnol . Bioeng. 1998 58: 191), bei Patek et al . (Microbiology (1996) 142: 1297 und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 8. Auflage, Georg Thie- me Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) . Es kann die Promotor- und Regulationsregion, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden.In addition, the expression of genes of folic acid synthesis can be reduced by altering the signal structures for gene expression. Signal structures are, for example, repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon and terminators. Information on this is the expert z. In Patent Application WO 96/15246, Boyd and Murphy (J. Bacteriol 1988: 170: 5949), Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Res. 1998. 26: 3548, Jensen and Hammer (Biotechnol. 1998 58: 191), in Patek et al. (Microbiology (1996) 142: 1297 and in known textbooks of genetics and molecular biology such as, for example, the textbook by Knippers ("Molecular Genetics", 8th Edition, Georg Thiele Verlag, Stuttgart, Germany, 2001) or Winnacker's ("Gene and Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) .The promoter and regulatory region located upstream of the structural gene can be mutated.
Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich mög- lieh, die Expression im Verlaufe der fermentativenDue to regulatable promoters, it is additionally possible, the expression in the course of fermentative
L-Serinbildung zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Dies kann erreicht werden, indem die Stabilität durch zu- sätzliche und/oder veränderte Sequenzen am 5 ' -Ende oder 3 '-Ende des Gens geschwächt wird. Beispiele dazu sind für Gene aus Bacillus subtilis (Microbiology (2001) 147:1331-41) oder Hefe (Trends Biotechnol . 1994, 12:444-9) beschrieben. Es ist ferner möglich, durch intrinsische proteolytische Aktivität, wie beschrieben, die Enzymaktivität zu beeinflussen (Mol Microbiol . (2005) 57:576-91) .To reduce L-serine formation. In addition, however, a regulation of the translation is possible by, for example, the stability of the m-RNA is reduced. This can be achieved by weakening the stability by additional and / or altered sequences at the 5 'end or 3' end of the gene. Examples are for genes from Bacillus subtilis (Microbiology (2001) 147: 1331-41) or yeast (Trends Biotechnol., 1994, 12: 444-9). It is also possible to influence enzyme activity by intrinsic proteolytic activity as described (Mol Microbiol. (2005) 57: 576-91).
Des Weiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym der Folsäuresynthese mit geringer Aktivität kodieren. Mutationen, die zu einer Verände- rung oder Reduktion der katalytischen Aktivität von Enzymproteinen führen, sind bekannt. Beispiele dazu finden sich in den Arbeiten von Qiu and Goodman (J Biolo- gical Chemistry (1997) 272: 8611-8617), Sugimoto et al . (Bioscience Biotechnology and Biochemistry (1997) 61: 1760-1762) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Co- rynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Reports from the Jülich Research Centre, Jül-2906, ISSN09442952 , Jülich, Germany, 1994) . Zusammenfassende Darstellungen können in Textbüchern der Genetik und der Molekularbiologie gefunden werden, wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) . Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression und Aktivität der Folsäuresynthese-Enzyme durch Verän- derung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al . (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al . (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EP 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al . (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) und in der Patentanmeldung WO 96/15246.In addition, genes coding for the corresponding enzyme of low activity folic acid synthesis can be used. Mutations that lead to a change or reduction of the catalytic activity of enzyme proteins are known. Examples can be found in the work of Qiu and Goodman (J Biological Chemistry (1997) 272: 8611-8617), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry (1997) 61: 1760-1762) and Möckel ("The threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum: abolition of the allosteric regulation and structure of the enzyme", Reports from the Jülich Research Center, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich , Germany, 1994). Summary representations can be found in textbooks of genetics and molecular biology, such as: As that of Hagemann ("General Genetics", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Alternatively, reduced expression and activity of the folic acid synthesis enzymes can be achieved by altering the composition of the medium and culture. The expert finds instructions, inter alia, in Martin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)), in Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), European Patent EP 0 472 869, U.S. Patent 4,601,893, Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid et al (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993) ) and in patent application WO 96/15246.
Auf diese Weise können Gene der Folsäuresynthese von C. glutamicum vermindert exprimiert oder deletiert oder die Enzymaktivitäten reduziert werden.In this way, genes of the folic acid synthesis of C. glutamicum can be reduced expressed or deleted or the enzyme activities can be reduced.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Serin vorteilhaft sein, zusätzlich zum herbeigeführten Mangel an Folsäure, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe, • das für die 3 -Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodierende serA-Gen,Furthermore, it may be advantageous for the production of L-serine, in addition to the induced deficiency of folic acid, one or more of the genes selected from the group, • the serA gene coding for the 3-phosphoglycerate dehydrogenase,
• das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen,The sercosergic gene coding for the phosphoserine transaminase,
• das für die Phosphoserin-Phosphatase kodierende serB-Gen, einzeln oder in Kombinationen zu verstärken insbesondere zu überexprimieren oder Allele dieser Gene, insbesondere• to amplify, in particular or in combinations, the serB gene coding for the phosphoserine phosphatase, in particular to overexpress or alleles of these genes, in particular
• die für feedback-resistente 3-Phosphoglycerat- Dehydrogenase kodierenden serA-Gene einzeln oder in Kombinationen zu verstärken oder zu überexprimieren .• amplify or overexpress the serA genes encoding feedback-resistant 3-phosphoglycerate dehydrogenase, singly or in combination.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Serin vor- teilhaft sein, zusätzlich zum herbeigeführten Mangel an Folsäure eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe ,Furthermore, it may be advantageous for the production of L-serine, in addition to the deficiency caused Folic acid of one or more genes selected from the group,
• das für die Cystathioninlyase kodierende aecD-Gen,The aecD gene coding for cystathionin lyase,
• das für die Cystathioninlyase kodierende metC-Gen, • das für die Serindehydratase kodierende sdaA-Gen,The metC gene coding for cystathionin lyase, the sdaA gene coding for serine dehydratase,
• das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen,The glyA gene encoding serine hydroxymethyltransferase,
• das für die beta-Untereinheit der Tryptophansynthase kodierende trpB-Gen, • das für die Threonindehydratase kodierende ilvA-Gen,The trpB gene coding for the beta subunit of tryptophan synthase, the ilvA gene coding for the threonine dehydratase,
• das für die Pyruvatkinase kodierende pyk-Gen einzeln oder in Kombination zu reduzieren oder zu dele- tieren.• to reduce or delete the pyk gene coding for pyruvate kinase, either individually or in combination.
Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen umfassen im Rahmen der vorliegenden Erfindung Bakterien aus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, die durch klassische und/oder molekulagenetische Methoden derart verändert sind, dass ihr Stoffwechselfluss verstärkt in Richtung der Biosynthese von Aminosäuren oder deren Abkömmlingen verläuft. Die vorliegende Erfindung umfasst hierbei sämtliche bereits bekannten Aminosäure-Produktionsstämme. Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produktionsstämme umfasst, die der Fachmann in Analogie zu Erkenntnissen aus anderen Mikroorganismen, beispielsweise Enterobacterien, Bacillaceen oder Hefe- Arten, nach gängiger Methode herstellen kann. Ferner sind erfindungsgemäß auch solche Aminosäure-Produktionsstamme umfasst, bei denen der Abbau von L-Serin verändert oder abgeschwächt ist. Dies kann beispielsweise durch gezielte gentechnische Veränderungen an L-Serin degradierenden Enzymen oder den korrespondierenden Genen erfolgen. Im Folgenden sollen einige erfindungsgemäß geeignete Mikroorganismen beispielhaft genannt werden. Diese Auswahl gilt jedoch nicht be- schränkend:In the context of the present invention, the microorganisms according to the invention comprise bacteria of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, which are modified by classical and / or molecular genetic methods such that their metabolic flux increasingly proceeds in the direction of the biosynthesis of amino acids or their derivatives. The present invention encompasses all known amino acid production strains. Furthermore, according to the invention, those production strains are included, which the skilled person can produce by analogy with findings from other microorganisms, for example enterobacteria, bacillaceae or yeast species, by the conventional method. Furthermore, according to the invention, such amino acid production strains are also included in which the degradation of L-serine is altered or attenuated. This can be done, for example, through targeted genetic engineering changes L-serine degrading enzymes or the corresponding genes take place. In the following, some microorganisms which are suitable according to the invention are to be mentioned by way of example. However, this selection is not restrictive:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020.Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 or Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls eine pabAB und pabC-Gensequenz Nr. 1, 3 und 5, die dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Teil der Sequenz mittels definierter Deletion herausgeschnitten wurde, so dass nur inaktivierte oder abgeschwächte Aminodeoxy- chorismatsynthase oder Aminodeoxychorismatlyase Aktivität resultieren kann. Die pabAB und pabC-Gensequenzen werden vorzugsweise aus Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium isoliert. Beispielhaft seien hier einige näher spezifizierte Mikroorga- nismen aufgeführt:The present invention also relates to a pabAB and pabC gene sequence Nos. 1, 3 and 5, which is characterized in that a portion of the sequence was cut out by means of a defined deletion, so that only inactivated or attenuated Aminodeoxy- chorismatsynthase or Aminodeoxychorismatlyase activity can result , The pabAB and pabC gene sequences are preferably isolated from microorganisms of the genus Corynebacterium or Brevibacterium. By way of example, a few more specific microorganisms are listed here:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020.Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 or Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Beispiel 1:Example 1:
Konstruktion des Plasmids pK19mobsacBDpabABConstruction of the plasmid pK19mobsacBDpabAB
Das pabAB-Gen von C. glutamicum wird nach bekannten Methoden im Chromosom durch ein um 1734 bp verkürztes pa- bAB-Gen ersetzt (J. Bacteriol . (1997) 179:6228-37; Gene (1994) 145: 69-73). Zur Konstruktion des für den Genaustausch verwendeten Vektors wurden die nachfolgend angegebenen Primer synthetisiert, die von der öffentlich zugänglichen Genom-Sequenz (NCBI Accession-Nummer YP_225287; NC_006958) abgeleitet wurden:The pabAB gene of C. glutamicum is replaced by known methods in the chromosome by a pABAB gene shortened by 1734 bp (J. Bacteriol. (1997) 179: 6228-37, Gene (1994) 145: 69-73). , To construct the vector used for gene replacement, the following primers were synthesized derived from the publicly available genome sequence (NCBI Accession Number YP_225287; NC_006958):
pabAB-del-ApabAB-del-A
5 ' -CGGGATCCTCAGGCTCGCACGTTGGAGGG-3 '5'-CGGGATCCTCAGGCTCGCACGTTGGAGGG-3 '
pabAB-del-B:pabAB-del-B:
5 ' -CCCATCCACTAAACTTAAACAAAACGTGAAAGAATCATAATT-S '5 '-CCCATCCACTAAACTTAAACAAAACGTGAAAGAATCATAATT-S'
pabAB-del-C:pabAB-del-C:
5 ' -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGAGTGGGAGGAAATCCGCGTT-S '5 '-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGAGTGGGAGGAAATCCGCGTT-S'
pabAB-del-D:pabAB-del-D:
5 ' - GTGGATCCGCCCAAAACACCACGGTGGCGT-3 '5 '- GTGGATCCGCCCAAAACACCACGGTGGCGT-3'
Primer pabAB-del-A beginnt 522 bp vor dem Translati- onsstart und pabAB-del-D 436 bp hinter dem Translati- onsstop des pabAB-Gens. Der Primer pabAB-del-B liegt 21 bp hinter dem Translationsstart, der primer pabAB-del-C liegt 66 bp vor dem Translationsstop und beide verfügen über jeweils komplementäre Linker-Regionen, wie bei Link et al . angegeben (J. Bacteriol . (1997) 179:6228- 37) . Parallel wurden mit der Primerkombination pabAB- del-A und pabAB-del-B sowie der Primerkombination pa- bAB-del-B und pabAB-del-C mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 PCR-Amplifikationen durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 μM Deoxynukleotidtriphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , je 600 nM der entsprechenden Oligonukleotide,The primer pabAB-del-A starts 522 bp before the start of translation and pabAB-del-D 436 bp behind the translation stop of the pabAB gene. The primer pabAB-del-B is 21 bp behind the translation start, the primer pabAB-del-C is 66 bp before the translation stop and both have complementary linker regions, as in Link et al. (J. Bacteriol. (1997) 179: 6228-37). In parallel, PCR amplifications were carried out with the primer combination pabAB-del-A and pabAB-del-B and the primer combination pABAB-del-B and pabAB-del-C with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032. The PCR reaction was carried out in 30 cycles in the presence of 200 μM deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), each 600 nM of the corresponding oligonucleotides,
100 ng chromosomaler DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 Volumen 10 -fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten einer hitzestabilen Taq-/Pwo-DNA-Polymerase- Mischung (Expand High Fidelity PCR System der Firma Ro- che Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in einem Ther- mocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) unter folgenden Bedingungen durchgeführt :100 ng of chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 volume 10-fold reaction buffer and 2.6 units of a heat-stable Taq / Pwo DNA polymerase mixture (Expand High Fidelity PCR System from the company Diagnostics, Mannheim, Germany ) in a thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) under the following conditions:
940C für 30 Sekunden, 500C für 30 Sekunden und 720C für 40 Sekunden. Der Elongationsschritt bei 720C wurde nach 10 Zyklen um 5 Sekunden pro Zyklus verlängert. Nach der PCR-Reaktion wurde das erhaltene 563 bp große Fragment des 5 ' -flankierenden Bereichs sowie das 528 bp große Fragment des 3 ' -flankierenden Bereichs mit dem QIAExII Gelextraktionskit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert, und beide Fragmente als Template in die zweite PCR mit den Primern pabAB-del-A und pabAB-del-D eingesetzt. Die Ampli- fikation erfolgte in 35 Zyklen in Gegenwart von 200 μM Deoxynukleotidtriphosphaten, je 600 nM des entsprechenden Oligonukleotids, jeweils 20 ng der isolierten Template-DNA aus der ersten PCR, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten der Taq-/Pwo~DNA- Polymerase-Mischung unter folgenden Bedingungen:94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 40 seconds. The elongation step at 72 ° C. was extended for 5 cycles per cycle after 10 cycles. Following the PCR reaction, the resulting 563 bp fragment of the 5 'flanking region and the 528 bp fragment of the 3' flanking region with the QIAExII Gel Extraction Kit (Qiagen) were prepared according to the manufacturer from a 0.8% agarose Gel isolated, and both fragments used as template in the second PCR with the primers pabAB-del-A and pabAB-del-D. The amplification was carried out in 35 cycles in the presence of 200 μM deoxynucleotide triphosphates, 600 nM each of the corresponding oligonucleotide, 20 ng each of the isolated template DNA from the first PCR, 1/10 volume 10-fold Reaction buffer and 2.6 units of the Taq / Pwo ~ DNA polymerase mixture under the following conditions:
94°C für 30 Sekunden, 500C für 30 Sekunden und 720C für 80 Sekunden. Der Elongationsschritt wurde nach 10 Zyklen um jeweils 5 Sekunden verlängert. Nach der PCR- Reaktion wurde das erhaltene 1122 bp lange DNA- Fragment, dass nun das inaktivierte pabAB-Gen mit einer 1734 bp langen zentralen Deletion beinhaltet, aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert, und in den Vektor pK19mobsacB kloniert (Gene 145: 69-73 (1994). Das daraus resultierende Plasmid pK19mobsacBDpabAB (Figur 1) wurde durch Sequenzierung auf seine Richtigkeit bestätigt.94 ° C for 30 seconds, 50 0 C for 30 seconds, and 72 0 C for 80 seconds. The elongation step was extended by 5 seconds after every 10 cycles. After the PCR reaction, the resulting 1122 bp DNA fragment, which now contains the inactivated pabAB gene with a 1734 bp central deletion, was isolated from a 0.8% agarose gel and cloned into the vector pK19mobsacB ( Gene 145: 69-73 (1994) The resulting plasmid pK19mobsacBDpabAB (Figure 1) was confirmed to be correct by sequencing.
Beispiel 2 :Example 2:
Konstruktion des Plasmids pK19mobsacBDpabCConstruction of plasmid pK19mobsacBDpabC
Analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurde zur Deletion des pabC-Gens von C. glutamicum der für den Genaustausch geeignete Vektor pK19mobsacBDpabC konstruiert. Die dazu erforderlichen Primer zur PCR-Amplifikation wurden wiederum von der öffentlich zugänglichen Genom-Sequenz (NCBI Accession- Nummer YP_225288.1; NC_006958) abgeleitet. Sie sind nachfolgend angegebenen:Analogously to the procedure described in Example 1, the vector pK19mobsacBDpabC suitable for gene replacement was constructed for the deletion of the pabC gene of C. glutamicum. The primers required for PCR amplification were in turn derived from the publicly available genome sequence (NCBI accession number YP_225288.1, NC_006958). They are listed below:
pabC-del-A: 5 ' -GAGGATCCAATCATTGCTGAGCTGCGCAG-3 ' pabC-del-B :pabC-del-A: 5'-GAGGATCCAATCATTGCTGAGCTGCGCAG-3 ' pabC-del-B:
5 ' -CCCATCCACTAAACTTAAACAATCAACAACTGTGGGTGTTGA-S '5 '-CCCATCCACTAAACTTAAACAATCAACAACTGTGGGTGTTGA-S'
pabC-del-C: 5 ' -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTCGGTGAAGCCCTGGAATGAA-3 'pabC-del-C: 5 '-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTCGGTGAAGCCCTGGAATGAA-3'
pabC-del-D:PABC-del-D:
5 ' -AGGGATCCGTGATGAGTCCGATCTCGGAA-S '5'-AGGGATCCGTGATGAGTCCGATCTCGGAA-S '
Primer pabC-del-A beginnt 500 bp vor dem Translationsstart und pabC-del-D 500 bp hinter dem Translati- onsstop des pabC-Gens. Die Primer pabC-del-B liegt 51 bp hinter dem Translationsstart und pabC-del-C 48 bp vor dem Translationsstop . Die letzten zwei Primer ver- fügen jeweils über komplementäre Linker-Regionen. Parallel wurde mit der Primerkombination pabC-del-A und pabC-del-B ein 602 bp großer 5' -flankierender Bereich sowie mit der Primerkombination pabC-del-C und pabC- del-D ein 597 bp großer 3' flankierender Bereich des zu deletierenden Fragments amplifiziert . Die PCR-Reaktion wurde nach den Standardverfahren, wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032, durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurden die erhaltenen DNA-Fragmente mit dem QIAExII Gelextrak- tionskit (Qiagen) isoliert und beide Fragmente alsThe primer pabC-del-A starts 500 bp before the start of translation and pabC-del-D 500 bp behind the translation stop of the pabC gene. The primer pabC-del-B is 51 bp behind the translation start and pabC-del-C 48 bp before the translation stop. The last two primers each have complementary linker regions. In parallel, the primer combination pabC-del-A and pabC-del-B became a 602 bp 5 'flanking region and the primer combination pabC-del-C and pabC-del-D a 597 bp 3' flanking region of deletierenden fragment amplified. The PCR reaction was carried out according to the standard methods, such as in example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032. After the PCR reaction, the DNA fragments obtained were isolated with the QIAExII gel extraction kit (Qiagen) and both fragments were isolated as
Template in einer weiteren PCR eingesetzt . Als Primer wurden pabC-del-A und pabC-del-D eingesetzt. Die PCR- Reaktion wurde nach den Standardverfahren wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurde das erhaltene 1178 bp lange DNA-Fragment, das nun das inaktivierte pabC-Gen mit einer 585 bp lan- gen zentralen Deletion beinhaltet, aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert und mit dem Vektor pK19mobsacB Ii- giert (Schäfer et al . Gene 145: 69-73 (1994). Mit dem Ligationsansatz wurde der Escherichia coli Stamm DH5α!mcr (Grant et al . , Proceedings of the National Aca- demy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Das erhaltene Plasmid pK19mobsacBDpabC (Figur 2) wurde durch Restrik- tionsverdau und Sequenzierung auf seine Richtigkeit überprüft.Template used in another PCR. The primers used were pabC-del-A and pabC-del-D. The PCR reaction was carried out according to the standard methods such as in example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032. After the PCR reaction, the resulting 1178 bp DNA fragment, which now contains the inactivated pabC gene with a 585 bp It is isolated from a 0.8% agarose gel and ligated with the vector pK19mobsacB (Schäfer et al., Gene 145: 69-73 (1994).) Using the ligation mixture, the Escherichia coli strain DH5α! mcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) The resulting plasmid pK19mobsacBDpabC (Figure 2) was purified by restriction digestion and sequencing Correctness checked.
Beispiel 3 :Example 3:
Konstruktion des Plasmids pK19mobsacBDpabABCConstruction of the plasmid pK19mobsacBDpabABC
Analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurde zur Deletion des pabABC-Gens von C. glutamicum der für den Genaustausch geeignete Vektor pK19mobsacBDpabABC konstruiert. Die dazu erforderlichen Primer zur PCR-Amplifikation, abgeleitet von der öffentlich zugänglichen Genom-Sequenz (NCBI Accession- Nummer YP_225287; YP_225288.1 ; NC_006958), sind nachfolgend angegebenen:Analogously to the procedure described in Example 1, the vector pK19mobsacBDpabABC suitable for gene replacement was constructed for the deletion of the pabABC gene of C. glutamicum. The PCR amplification primers required for this, derived from the publicly available genome sequence (NCBI accession number YP_225287; YP_225288.1; NC_006958), are indicated below:
pabABC-del-A:pabABC-del-A:
5 ' - CGGGATCCTCAGGCTCGCACGTTGGAGGG-3 '5'-CGGGATCCTCAGGCTCGCACGTTGGAGGG-3 '
pabABC-del-B:pabABC-del-B:
5 ' -CCCATCCACTAAACTTAAACAAAACGTGAAAGAATCATAATT-S '5 '-CCCATCCACTAAACTTAAACAAAACGTGAAAGAATCATAATT-S'
pabABC-del-C:pabABC-del-C:
5 ' -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTCGGTGAAGCCCTGGAATGAA-S ' pabABC-del -D :5 '-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTCGGTGAAGCCCTGGAATGAA-S' pabABC-del -D:
5 ' -AGGGATCCGTGATGAGTCCGATCTCGGAA-S '5'-AGGGATCCGTGATGAGTCCGATCTCGGAA-S '
Primer pabABC-del-A beginnt 500 bp vor dem Translationsstart und pabABC-del-D 500 bp hinter dem Translati- onsstop des pabABC-Gens. Primer pabABC-del-B liegt 51 bp hinter dem Translationsstart von pabAB und pabABC- del-C 48 bp vor dem Translationsstop von pabC. Die letztgenannten zwei Primer verfügen jeweils über komplementäre Linker-Regionen. Parallel wurde mit der Pri- merkombination pabABC-del-A und pabABC-del-B ein 593 bp großer 5 ' -flankierender Bereich sowie mit der Primer- kombination pabABC-del-C und pabABC-del-D ein 597 bp großer 3' flankierender Bereich des zu deletierendenThe primer pabABC-del-A starts 500 bp before the start of translation and pabABC-del-D 500 bp behind the translation stop of the pabABC gene. Primer pabABC-del-B is 51 bp beyond the translation start of pabAB and pabABC-del-C 48 bp before the translation stop of pabC. The latter two primers each have complementary linker regions. In parallel, the pabABC-del-A and pabABC-del-B pri- mary combination resulted in a 593 bp 5 'flanking region and, with the primer combination pabABC-del-C and pabABC-del-D, a 597 bp 3' flanking area of the to be deleted
Fragments amplifiziert . Die PCR-Reaktion wurde nach den Standardverfahren wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurden die erhaltenen DNA- Fragmente mit dem QIAExII Gelextraktionskit (Qiagen) isoliert, und beide Fragmente als Template in einer weiteren PCR eingesetzt. Als Primer wurden die Primer pabABC-del-A und pabABC-del-D eingesetzt. Die PCR- Reaktion wurde nach den Standardverfahren wie bei- spielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Nach der PCR- Reaktion wurde das erhaltene 1169 bp lange DNA- Fragment, das das inaktivierte pabABC-Gen mit einer 2475 bp langen zentralen Deletion beinhaltet, aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert und mit dem Vektor pK19mobsacB ligiert (Schäfer et al . Gene 145: 69-73 (1994) . Mit dem Ligationsansatz wurde der Escherichia coli Stamm DH5αmcr (Grant et al . , Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Das erhaltene Plasmid pK19mobsacBDpabC (Figur 3) wurde durch Restriktionsverdau und Sequenzierung auf seine Richtigkeit überprüft.Fragments amplified. The PCR reaction was carried out according to standard methods such as in Example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032. After the PCR reaction, the DNA fragments obtained were isolated with the QIAExII gel extraction kit (Qiagen), and both fragments were used as template in another PCR. The primers pabABC-del-A and pabABC-del-D were used as primers. The PCR reaction was carried out by the standard methods such as, for example, in Example 1 with chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13032. After the PCR reaction, the resulting 1169 bp DNA fragment containing the inactivated pabABC gene with a 2475 bp central deletion was isolated from a 0.8% agarose gel and ligated with the vector pK19mobsacB (Schäfer et Gene 145: 69-73 (1994). Escherichiae was used with the ligation mixture coli strain DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1990) 87: 4645-4649). The resulting plasmid pK19mobsacBDpabC (FIG. 3) was checked for its accuracy by restriction digestion and sequencing.
Beispiel 4: Konstruktion der Folsäure auxotrophen Stämme C. gluta- micum DsdaADpabAB, C. glutamicum DsdaADpabC, C. gluta- micum DsdaADpabABC .EXAMPLE 4 Construction of folic acid auxotrophic strains C. glutamicum DsdaADpabAB, C. glutamicum DsdaADpabC, C. glutamicum DsdaADpabABC.
Mittels Elektroporation wurde das Plasmid pK19mobsacBDpabAB, bzw. pK19mobsacBDpabC und pK19mobsacBDpabABC in C. glutamicum DsdaA, der in der Patentanmeldung PCT/DE2004/000248 beschrieben ist, eingebracht und auf Kanamycin-Resistenz selektioniert . Nur solche Klone, bei denen das Plasmid über homologe Re- kombination in das Chromosom integriert war, waren Ka- namycin-resistent . Es wurde jeweils ein Klon ausgewählt, der nach Überprüfung die durch das Plasmid vermittelte Saccharose-Sensitivität zeigte (Gene (1994) 145: 69-73). Dieser wurde in 50 ml BHI-Medium (Brain- Heart-Infusion-Medium , Difco Laboratories, Detroit, USA) ohne Kanamycin und Saccharose kultiviert. Anschließend wurden je 100 μl einer 10-2-, 10-3- bzw. 10- 4-fachen Verdünnung der Kultur auf BHIS-Platten (BHI- Medium mit 0,5 M Sorbitol) mit 10 % (w/v) Saccharose ausplattiert (FEMS Microbiol Lett. (1989) 53:299-303). Die erhaltenen Saccharose resistenten Klone wurden dann auf Kanamycin-Sensitivität überprüft und über PCR- Analyse verifiziert. Dabei wurden folgende Primerkombi- nationen verwendet:By electroporation, the plasmid pK19mobsacBDpabAB, or pK19mobsacBDpabC and pK19mobsacBDpabABC in C. glutamicum DsdaA, which is described in the patent application PCT / DE2004 / 000248, introduced and selected for kanamycin resistance. Only those clones in which the plasmid was integrated into the chromosome via homologous recombination were kanamycin-resistant. One clone was selected which, when checked, showed the saccharose sensitivity mediated by the plasmid (Gene (1994) 145: 69-73). This was cultured in 50 ml BHI medium (Brain Heart Infusion Medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) without kanamycin and sucrose. Subsequently, 100 μl each of a 10-2, 10-3 or 10 4-fold dilution of the culture was plated out on BHIS plates (BHI medium with 0.5 M sorbitol) with 10% (w / v) sucrose (FEMS Microbiol Lett. (1989) 53: 299-303). The obtained sucrose-resistant clones were then tested for kanamycin sensitivity and analyzed by PCR. Analysis verified. The following primer combinations were used:
Deletion von pabAB : pabAB-del-pr-u2 5'-TGGCTCACTTCGCTGGTCTTGTTG-S' pabAB-del-pr-12 5 ' -GAATGGTTGCGGCGAGTGTCA-S 'Deletion of pabAB: pabAB-del-pr-u2 5'-TGGCTCACTTCGCTGGTCTTGTTG-S 'pabAB-del-pr-12 5'-GAATGGTTGCGGCGAGTGTCA-S'
Deletion von pabC: pabC-del-pr-u2 5 ' -GTTGGGGGAGCAGGACGAGTGGT-3 ' pabC-del-pr-12 5'-TACGCGCATCTGGAAGCCTGGTTA-B'Deletion of pabC: pabC-del-pr-u2 5 '-GTTGGGGGAGCAGGACGAGTGGT-3' pabC-del-pr-12 5'-TACGCGCATCTGGAAGCCTGGTTA-B '
Deletion von pabABC: pabABC-del -pr-u2 5 ' -CGTTCCGGCATCATTCTGGCTAAG-3 ' pabABC-del-pr-12 5 ' -GCGACTCCGGGTTGTTCCTGATAA-3 'Deletion of pabABC: pabABC-del -pr-u2 5 '-CGTTCCGGCATCATTCTGGCTAAG-3' pabABC-del-pr-12 5 '-GCGACTCCGGGTTGTTCCTGATAA-3'
Die erfolgreiche Deletion ergab für den pabAB Genort eine Bande von 1426 bp, für den pabC Genort eine Bande von 1663 bp und für den pabABC Genort eine Bande vonThe successful deletion gave a band of 1426 bp for the pabAB locus, a band of 1663 bp for the pabC genort, and a band of pabABC for the gene locus
1447 bp. Auf diese Weise konnten vom Ausgangsstamm KIo- ne erhalten werden, die jeweils über spezifische DeIe- tionen in Genen der Folsäuresynthese verfügen.1447 bp. In this way, it was possible to obtain clones from the starting strain, each of which has specific deions in genes of folic acid synthesis.
Diese Stämme wurden als C. glutamicum DsdaADpabAB, C. gluta-micum DsdaADpabC, bzw. C. glutamicum DsdaADpabABC bezeichnet .These strains were designated as C. glutamicum DsdaADpabAB, C. glutamicum DsdaADpabC, and C. glutamicum DsdaADpabABC, respectively.
Diese drei Stämme wurden auf dem Minimalmedium CGXII (J Bacteriol. (1993) 175:5595-603) ausplattiert sowie auf identischem Medium, das 1 mM Folsäure enthielt. DasThese three strains were plated on the minimal medium CGXII (J Bacteriol. (1993) 175: 5595-603) and on identical medium containing 1 mM folic acid. The
Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 :Result is shown in Table 1. Table 1 :
Folsäurebedürftigkeit der hergestellten Mutanten von Corynebacterium glutamicum.Folic acid requirement of the produced mutants of Corynebacterium glutamicum.
Beispiel 5:Example 5:
Konstruktion und L-Serinbildung des Stammes C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC.Construction and L-serine formation of the strain C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC.
Mittels Elektroporation wurde das Plasmid pEC-T18mob2- serAfbrserCserB in den Stamm C. glutamicum DsdaADpabAB eingebracht. Das Plasmid (Figur 4) setzt sich zusammen aus dem Vektor pEC-T18mob2 (Curr. Microbiol . (2002) 45, 362-367) , den corynebakteriellen Genen serAfbr (Appl Microbiol Biotechnol . (2002) 60:437-41) sowie serC und serB (Deutsche Patentanmeldung 100 44 831.3) . Tetracycline resistente Klone wurden mittels bekannter Standardverfahren auf Anwesenheit und Integrität des Plasmids pEC-T18mob2-serAfbrserCserB geprüft (Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press) und ein Klon als C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC bezeichnet .By electroporation, the plasmid pEC-T18mob2 serAfbrserCserB was introduced into the strain C. glutamicum DsdaADpabAB. The plasmid (FIG. 4) is composed of the vector pEC-T18mob2 (Curr. Microbiol. (2002) 45, 362-367), the corynebacterial genes serAfbr (Appl Microbiol Biotechnol. (2002) 60: 437-41) and serC and serB (German Patent Application 100 44 831.3). Tetracycline-resistant clones were tested by known standard methods for the presence and integrity of the plasmid pEC-T18mob2-serAfbrserCserB (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory Press) and a clone designated C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC ,
Zur L-Serinbildung wurde der Stamm C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC in Komplexmedium (CgIII mit 2 % Glukose, 5 μg/1 Tetracyclin) angezogen und das Fermen- tationsraedium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603) daraus beimpft. Das Fermentationsmedium CGXII enthielt 0,1 oder 1 mM Folsäure. Als Kontrolle wurde der Stamm C. glutamicum DsdaA pserABC in gleicher Weise kulti- viert. Es wurden je mindestens zwei unabhängige Fermentationen durchgeführt. Nach Kultivierung für 30 Stunden bei 300C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Upm wurde die in das Medium akkumulierte L-Serinmenge bestimmt. Die Analyse der Aminosäurekonzentration erfolgte mit- tels Hochdruckflüssigkeitchromatographie (J ChromatFor L-serine formation, the strain C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC was grown in complex medium (CgIII with 2% glucose, 5 μg / l tetracycline) and the fermentation cationsraedium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603). The fermentation medium CGXII contained 0.1 or 1 mM folic acid. As a control, the strain C. glutamicum DsdaA pserABC was cultivated in the same way. At least two independent fermentations were ever carried out. After culturing for 30 hours at 30 0 C on a rotary shaker at 120 rpm accumulated in the medium L-serine quantity was determined. The analysis of the amino acid concentration was carried out by means of high pressure liquid chromatography (J Chromat
(1983) 266: 471-482). Das Ergebnis der Fermentation ist in Tabelle 2 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass die Nutzung der konstruierten und beschriebenen Mutante in der Folsäuresynthese ein Verfahren darstellt, um die L-Serinbildung entscheidend zu verbessern. (1983) 266: 471-482). The result of the fermentation is shown in Table 2. It can be seen that the use of the constructed and described mutant in folic acid synthesis is a method to significantly improve L-serine formation.
Tabelle 2 :Table 2:
Akkumulation von L-Serin im Kulturüberstand von C. glu- tamicum DsdaADpabAB pserABC und C. glutamicum DsdaA pserABC .Accumulation of L-serine in the culture supernatant of C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC and C. glutamicum DsdaA pserABC.
Beispiel 6:Example 6:
Konstruktion und L-Serinbildung des Stammes C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC.Construction and L-serine formation of the strain C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC.
Mittels Elektroporation wurde das Plasmid pK19mobsacBDpyk (Arch Microbiol . (2004) 182:354-63) in den Stamm C. glutamicum 13032DsdaADpabABC eingebracht und auf Kanamycin-Resistenz selektioniert . Nur solcheBy means of electroporation, the plasmid pK19mobsacBDpyk (Arch Microbiol. (2004) 182: 354-63) was introduced into the strain C. glutamicum 13032DsdaADpabABC and selected for kanamycin resistance. Only such
Klone, bei denen das Plasmid über homologe Rekombination in den chromosomalen pyk-Genlokus integriert war, waren Kanamycin-resistent . Es wurde ein Klon ausge- wählt, der nach Überprüfung die durch das Plasmid vermittelte Saccharose-Sensitivität zeigte und in 50 ml BHI-Medium (Brain-Heart-Infusion-Medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) ohne Kanamycin und Saccharose kultiviert. Anschließend wurden je 100 μl einer 10-2,Clones in which the plasmid was integrated into the chromosomal pyk gene locus via homologous recombination were kanamycin resistant. A clone was excluded. which, when checked, showed the plasmid-mediated sucrose sensitivity and cultured in 50 ml of BHI medium (Brain Heart Infusion Medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) without kanamycin and sucrose. Subsequently, 100 μl each of a 10-2,
10-3- bzw. 10-4 -fachen Verdünnung der Kultur auf BHIS- Platten (BHI-Medium mit 0,5 M Sorbitol) mit 10 % (w/v) Saccharose ausplattiert. Die erhaltenen Saccharose resistenten Klone wurden dann auf Kanamycin-Sensitivitat überprüft und über PCR-Analyse die erfolgreiche Deleti- on verifiziert. Auf diese Weise konnte vom Ausgangsstamm der Stamm C. glutamicum DpykDsdaADpabAB erhalten werden. Dieser Stamm wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, mit pEC-T18mob2-serAfbrserCserB transformiert und es wurde dadurch der Stamm C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC erhalten. Dieser Stamm wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, zur L-Serinbildung im Vergleich mit C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC herangezogen. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt. 10-3- or 10-4-fold dilution of the culture on BHIS plates (BHI medium with 0.5 M sorbitol) with 10% (w / v) sucrose plated. The obtained sucrose-resistant clones were then tested for kanamycin sensitivity and the successful deletion was verified by PCR analysis. In this way, the parent strain C. glutamicum DpykDsdaADpabAB could be obtained from the starting strain. This strain was transformed with pEC-T18mob2-serAfbrserCserB as described in Example 5, thereby obtaining the strain C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC. This strain was used for L-serine formation as described in Example 5 in comparison with C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC. The result is shown in Table 3.
Tabelle 3 :Table 3:
Akkumulation von L-Serin im Kulturüberstand von C. glu- tamicum DpykDsdaADpabAB pserABC und C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC.Accumulation of L-serine in the culture supernatant of C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC and C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e Patent claims
1. Verfahren zur Herstellung von L-Serin, dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration in einem Aminosäure- produzierenden Organismus reduziert wird.1. A process for producing L-serine, characterized in that the folic acid concentration is reduced in an amino acid-producing organism.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration durch Verringerung der Synthese von Folsäure oder durch deren Abbau verringert wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the folic acid concentration is reduced by reducing the synthesis of folic acid or by their degradation.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration durch gerichtete oder ungerichtete Mutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, verringert wird.3. The method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the folic acid concentration is reduced by directed or undirected mutation of genes involved in the biosynthesis of folic acid.
4. Verfahren nach Anspruch 3 , dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung oder Ausschaltung der Folsäu- reproduktion durch Deletionsmutation, Insertionsmu- tation, Punktmutation und/oder Substitutionsmutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, erfolgt. 4. The method according to claim 3, characterized in that the reduction or elimination of Folsäu- reproduction by deletion mutation, insertion mutation, point mutation and / or substitution mutation of genes involved in the biosynthesis of folic acid, takes place.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression von an der Biosynthese der Folsäure beteiligten Gene verringert oder reduziert wird.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the expression of genes involved in the biosynthesis of folic acid is reduced or reduced.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression durch Veränderung bzw. Abschwächung oder Ausschaltung von Promotoren, Signal - Strukturen, Repressorgenen, Aktivatoren, Operatoren, Attenuatoren, Ribosomenbindestellen, Startko- dons, Terminatoren, Regulatoren, die Stabilität der Transkripte verringert wird oder das regulierbare Promotoren eingesetzt werden.6. Method according to claim 5, characterized in that the expression reduces the stability of the transcripts by altering or weakening or eliminating promoters, signal structures, repressor genes, activators, operators, attenuators, ribosome binding sites, start codons, terminators, regulators or the regulatable promoters are used.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene kodierend für GTP-Cyclohydrolase, Ne- opterintriphosphatpyrophosphatase, Neopterinaldola- se , 6-Hydroxymethylpterinpyrophosphokinase , 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthase, 4-Amino-4-deoxy- chorismatlyase, Pteroatsynthase, Folatsynthase und Dihydrofolatreduktase verändert werden.7. The method according to any one of claims 3 to 6, characterized in that the genes encoding GTP cyclohydrolase, opterin triphosphate pyrophosphatase, Neopterinaldola- se, 6-hydroxymethylpterin pyrophosphokinase, 4-amino-4-deoxy-chorismatsynthase, 4-amino-4 -deoxy- chorismate lyase, pteroate synthase, folate synthase and dihydrofolate reductase.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene kodierend für Amino-4-deoxy- chorismatsynthase deletiert werden.8. The method according to claim 7, characterized in that the genes coding for amino-4-deoxy- chorismatsynthase be deleted.
9. Verfahren nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mit einer DNS nach Seq. Nr.1 durchgeführt wird.9. The method according to claim 8, characterized that the deletion with a DNA according to Seq. No.1 is performed.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor nach Seq. Nr. 2 eingesetzt wird.10. The method according to any one of claims 8 or 9, characterized in that a vector according to Seq. No. 2 is used.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gen kodierend für 4-Amino-4-deoxy- chorismatlyase deletiert wird.11. The method according to any one of claims 3 to 10, characterized in that a gene coding for 4-amino-4-deoxy- chorismatlyase is deleted.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mit einer DNS nach Seq. Nr. 3 durchgeführt wird.12. The method according to claim 11, characterized in that the deletion with a DNA Seq. No. 3 is performed.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass für die Deletion ein Vektor nach Seq. Nr. 4 eingesetzt wird.13. The method according to claim 11 or 12, characterized in that for the deletion vector according to Seq. No. 4 is used.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen kodierend für Amino-4-deoxy- chorismatsynthase und 4-Amino-4-deoxy- chorismatlyase deletiert wird.14. The method according to any one of claims 3 to 13, characterized in that the gene coding for amino-4-deoxy- chorismatsynthase and 4-amino-4-deoxy- chorismatlyase is deleted.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mit einer DNA Sequenz nach Seq. Nr. 5 durchgeführt wird. 15. The method according to claim 14, characterized in that the deletion with a DNA sequence according to Seq. No. 5 is performed.
16. Verfahren nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor nach Seq. Mr. 6 eingesetzt wird.16. The method according to claim 14 and 15, characterized in that a vector according to Seq. Mr. 6 is used.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass für die Synthese von L-Serin ein Organismus eingesetzt wird, der bereits vor der Veränderung L-Serin produziert.17. The method according to any one of claims 1 to 16, characterized in that an organism is used for the synthesis of L-serine, which already produces L-serine before the change.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus über ein Plasmid nach Seq. Nr . 7 verfügt .18. The method according to any one of claims 1 to 17, characterized in that the microorganism via a plasmid according to Seq. No . 7 features.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die katalytische Aktivität der an der Biosynthese der Folsäure beteiligten Enzyme abgeschwächt oder ausgeschaltet wird.19. The method according to any one of claims 1 to 18, characterized in that the catalytic activity of the enzymes involved in the biosynthesis of folic acid is attenuated or eliminated.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschwächung oder Ausschaltung durch Verringerung der Stabilität erfolgt.20. The method according to claim 19, characterized in that the attenuation or elimination is effected by reducing the stability.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung oder Ausschaltung durch Ver- änderung des allosterischen Zentrums erfolgt.21. The method according to any one of claims 19 or 20, characterized in that the reduction or elimination by changing the allosteric center takes place.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität der Enzyme durch Phosphorylie- rung oder Adenylierung verringert oder ausgeschaltet wird.22. The method according to any one of claims 19 to 21, characterized in that the activity of the enzymes by phosphorylation or adenylation is reduced or eliminated.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme durch proteolytischen Abbau in ihrer Aktivität verringert oder ausgeschaltet werden.23. The method according to any one of claims 19 to 22, characterized in that the enzymes are reduced or eliminated by proteolytic degradation in their activity.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Enzym aus der Gruppe bestehend aus GTP-Cyclohydrolase, Neopterintriphosphatpy- rophosphatase, Neopterinaldolase, 6-Hydroxymethyl- pterinpyrophosphokinase, 4 -Amino-4-deoxy-chorismat- synthase, 4 -Amino-4-deoxy-chorismatlyase, Pteroat- synthase, Folatsynthase und Dihydrofolatreduktase in seiner Aktivität verringert oder ausgeschaltet wird.24. The method according to any one of claims 19 to 23, characterized in that at least one enzyme selected from the group consisting of GTP cyclohydrolase, Neopterintriphosphatpy- rophosphatase, Neopterinaldolase, 6-hydroxymethylpterinpyrophosphokinase, 4-amino-4-deoxy-chorismat synthase , 4-amino-4-deoxy-chorismatlyase, pteroate synthase, folate synthase and dihydrofolate reductase are reduced or eliminated in its activity.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eins oder mehrere Gene ausgewählt aus der Gruppe25. The method according to any one of claims 1 to 24, characterized in that one or more genes selected from the group
- das für die 3 -Phosphoglycerat -Dehydrogenase kodierende serA-Gen,the serA gene encoding the 3-phosphoglycerate dehydrogenase,
- das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen,the serC gene coding for the phosphoserine transaminase,
- das für die Phosphoserin-Phosphatase kodierende serB-Gen, einzeln oder in Kombinationen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden. the serB gene coding for the phosphoserine phosphatase, amplified individually or in combinations, in particular overexpressed.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass Allele dieser Gene, insbesondere die für feed- back-resistente 3 -Phosphoglycerat-Dehydrogenase ko- dierenden serA-Gene, einzeln oder in Kombinationen verstärkt oder überexprimiert werden.26. The method according to claim 25, characterized in that alleles of these genes, in particular the serA genes coding for feedback-resistant 3-phosphoglycerate dehydrogenase, are amplified or overexpressed individually or in combinations.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe27. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that one or more of the genes selected from the group
- das für die Cystathioninlyase kodierende aecD-Gen,the aecD gene coding for cystathionin lyase,
- das für die Cystathioninlyase kodierende metC-Gen,the metC gene coding for cystathionin lyase,
- das für die Serindehydratase kodierende sdaA-Gen,the sdaA gene encoding serine dehydratase,
- das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen,the glyA gene encoding serine hydroxymethyltransferase,
- das für die beta-Untereinheit der Tryptophan- synthase kodierende trpB-Gen,the trpB gene coding for the beta subunit of tryptophan synthase,
- das für die Threonindehydratase kodierende ilvA-Gen,the ilvA gene coding for threonine dehydratase,
- das für die Pyruvatkinase kodierende pyk-Gen einzeln oder in Kombination in seiner Aktivität re- duziert oder deletiert wird.the pyk gene coding for the pyruvate kinase is reduced or deleted in its activity individually or in combination.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Corynebakterium, Brevibak- terium, Bacillaceen, Enterobakterium ein Methanol verwertendes Bakterium oder eine Hefe eingesetzt wird.28. The method according to any one of claims 1 to 27, characterized in that as a microorganism Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillacea, Enterobacterium a methanol recycling bacterium or yeast is used.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067,29. The method according to claim 28, characterized in that an organism from the group consisting of Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020 eingesetzt wird.Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 or Brevibacterium divaricatum ATCC14020 is used.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass es für die Synthese von Cystein, Trytpophan oder Methionin eingesetzt wird.30. The method according to any one of claims 1 to 29, characterized in that it is used for the synthesis of cysteine, tryptophan or methionine.
31. Gensequenz, die mindestens eine 85 %-ige Homologie zu den Seq. Nr. 1, 3 oder 5 aufweist.31. Gene sequence having at least 85% homology to Seq. No. 1, 3 or 5 has.
32. Gensequenz nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit den Seq. Nr. 1, 3 oder 5 identisch ist.32. Gene sequence according to claim 31, characterized in that it contains the Seq. No. 1, 3 or 5 is identical.
33. Vektor, dessen Gensequenz mindestens eine 85 %-ige Homologie zu den Sequenzen Nr. 2, 4 oder 6 aufweist .33. Vector whose gene sequence has at least 85% homology to sequences Nos. 2, 4 or 6.
34. Vektor nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass er mit den Vektoren der Seq. Nr. 2, 4 oder 6 identisch ist.34. Vector according to claim 33, characterized that he uses the vectors of Seq. No. 2, 4 or 6 is identical.
35. Vektor, der mindestens eine 85 %-ige Homologie zu der Seq. Nr. 7 aufweist.35. Vector having at least 85% homology to the Seq. No. 7 has.
36. Vektor nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass er mit der Seq. Nr. 7 identisch ist.36. Vector according to claim 34, characterized in that it contains the Seq. No. 7 is identical.
37. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er nach mindestens einem der Schritte des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 27 verändert ist.37. microorganism, characterized in that it is changed after at least one of the steps of the method according to claims 1 to 27.
38. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Corynebakterium, Brevibakterium, Bacil- lacceen, Enterobakterium oder eine Hefe ist.38. Microorganism, characterized in that it is a Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillacceen, Enterobacterium or a yeast.
39. Mikroorganismus nach Anspruch 38. dadurch gekennzeichnet, dass er ein Organismus aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020 ist . 39. A microorganism according to claim 38, characterized in that it is an organism from the group consisting of Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 or Brevibacterium divaricatum ATCC14020 ,
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