EP1926828A2 - Verfahren zur quantitativen bestimmung der kopienzahl einer vorbestimmten sequenz in einer zelle - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung der kopienzahl einer vorbestimmten sequenz in einer zelle

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Publication number
EP1926828A2
EP1926828A2 EP06776654A EP06776654A EP1926828A2 EP 1926828 A2 EP1926828 A2 EP 1926828A2 EP 06776654 A EP06776654 A EP 06776654A EP 06776654 A EP06776654 A EP 06776654A EP 1926828 A2 EP1926828 A2 EP 1926828A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pcr
different
homologous sequences
predetermined sequence
biological sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06776654A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Gauer
Wolfgang Mann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beckman Coulter Inc
Original Assignee
Advalytix AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Advalytix AG filed Critical Advalytix AG
Publication of EP1926828A2 publication Critical patent/EP1926828A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for the quantitative determination of the number of a predetermined sequence and optionally of the predetermined sequence homologous sequences in a biological Pro, in particular for determining the absolute copy number of alleles per cell, a kit for the quantitative determination of the number one predetermined sequence in a biological sample as well as a device suitable in particular for carrying out the method according to the invention.
  • trisomy 18 Eras syndrome
  • trisomy 13 Patau syndrome
  • trisomy 21 Down's syndrome
  • the copy number of the corresponding chromosome is 18, 13 and 21 per cell, respectively, whereas healthy individuals have only two copies of the aforementioned chromosomes per cell.
  • increasing the copy number of the chromosome in question leads to the most serious anomalies.
  • carriers of trisomy 21 are drastically inhibited in their development and sometimes have severe malformations
  • carriers of trisomy 18 and trisomy 13 usually die within the first year of life.
  • Huntington's disease a progressive neurodegenerative disease characterized by abnormal, involuntary movements with increasing decay of mental and physical abilities, is said to be the cascade of more than 37 copies of a particular subject (CAG), with the predisposition for disease education increases with the number of repetitions of this motif in the genome.
  • CAG a particular subject
  • Other examples of unstable trinucleotide sequences in humans include Kennedy syndrome and spinocrebral ataxia 1.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the biological sample to be examined after appropriate pretreatment ie denaturing with formamide and prehybridization, with one or more different probes, which were previously labeled with different fluorescent dyes, respectively, incubated under conditions which hybridize the probes to homologous Enable sequences in the biological sample.
  • the samples are washed, eliminating nonspecific hybridization signals.
  • the fluorescence signals of the preparation are evaluated with a fluorescence microscope.
  • any fluorescence signal present indicates the presence of the sequence corresponding to the probe provided with the corresponding fluorescent label.
  • the intensity of the fluorescence may allow a limited inference to the number of sequence copies in the biological sample. If, however, at the wavelength of one of the fluorescence-labeled probes used no signal or only below a defined threshold signal lying obtained, it can be concluded that the sequence corresponding to the corresponding probe in the biological sample. However, the absence of a corresponding fluorescence signal may also be due to the fact that a mutation and / or microdeletion has taken place in the corresponding binding site of the sequence to be detected, for which reason the probe no longer binds to the predetermined sequence under the selected hybridization conditions.
  • Another disadvantage of the aforementioned method is that unwanted cross-hybridization leading to incorrect results can never be completely ruled out.
  • this method is relatively expensive, on the one hand because it is imperative to use fluorescent dyes and, on the other hand, because it requires expensive equipment, such as fluorescence microscopes.
  • the significance of this method depends to a very considerable extent on the quality of the probes used; reliable results are only obtained if the probes hybridize with an efficiency of more than 90% to the corresponding binding sites. It follows that a wrong choice of probes, but also inadequate hybridization conditions lead to a false result.
  • Another disadvantage of this method is that a minimum amount of biological sample must be used in order to obtain an evaluable fluorescence signal at all. In addition, the sequence must not fall below a minimum length. Furthermore, for a valid result, it is necessary to analyze a variety of cells that were susceptible to hybridization. For this reason, FISH analysis is not adequate for single cell diagnostics.
  • CGH analysis comparative genomic hybridization
  • the nucleic acid of the sample to be analyzed is completely mixed with a dye of 1 kiert.
  • the same amount of nucleic acid of a reference sample is labeled with a dye 2.
  • Both reaction mixtures are hybridized together on a sprouted metaphase chromosome set, wherein the sequences contained in both reaction mixtures compete for the binding parts on the spread chromosomes. Essentially, a ratio of dye 1 to dye 2 will be 1: 1 at all hybridization sites. If the sample to be analyzed contains amplified regions (more than the usual copy number of the reference), then dye 1 will predominate at this hybridization site. In the case of a deletion in the sample to be examined, only dye 2 will be detected at this hybridization site.
  • the reference measurement allows a relative statement about the frequency of sequences in the sample to be analyzed.
  • a special variant is the array CGH, which hybridizes not to chromosomes but to immobilized sequences whose physical address is known in the genome.
  • Another known method for quantifying nucleic acid sequences is the real-time PCR method, in which a PCR (polymerase chain reaction) is performed with fluorescently labeled primers and the increase of the fluorescence signal is observed as a function of the number of cycles.
  • the threshold PCR cycle (also known as the threshold cycle) is assigned to the reaction time at which the fluorescence signal is significantly different from the background fluorescence and the PCR product formation proceeds exponentially. This correlates with the initial copy number of the DNA sequence to be amplified. In this way, DNA samples can be relatively quantified by comparison with a series of DNA dilutions.
  • a disadvantage of this method is that the amount of starting can not be arbitrarily reduced, since with a few starting molecules, for example 10 to 100 copies, as a starting material, the stochastic error due to the exponential amplification becomes very large, which no longer allows quantitative statements. Furthermore, this method also requires expensive and expensive equipment for measuring the fluorescence intensity.
  • a more recent method for the quantitative determination of a nucleic acid sequence is the QF-PCR (quantitative fluorescence PCR), in which several PCRs are carried out in parallel in a PCR approach using different fluorescently labeled primers and the fluorescently labeled PCR products are subsequently treated with an automatic DNA PCR. Scanner laserdensitometrisch be analyzed.
  • this method is a relative quantitation method because a comparison is made for two PCR products amplified in parallel in a PCR experiment.
  • the two partial PCR reactions must proceed with equal efficiency and the fluorescence intensities of the reaction products should be quantitatively analyzed at the time of exponential product amplification.
  • a method based on QF-PCR methodology for the detection of possible numerical aberrations of chromosomes 21, 18, 13, X and Y in amniotic fluid samples is described by Lucchini et al. in Scientific Information, September 2004.
  • This method is based on the in vitro PCR amplification of repetitive and polymorphic STR (short tandem repeats) sequences with fluorescently labeled primers. After completion of the PCR, the amplified PCR products are quantitated by capillary electrophoresis. If chromosomal Sense-specific STR systems are used, it can be inferred from the number of different PCR products obtained conclusions about the copy number of the corresponding chromosome.
  • this method does not allow any statement about the presence or absence of a trisomy, since this result is obtained both in the case of a monoallelic trisomy and in the case of a monoallelic disomy.
  • a method based on this technology for the detection of trisomy 13 is also disclosed in DE 101 02 687 A1.
  • this method also has the disadvantage that fluorescently labeled primers must be used.
  • WO 2004/027089 discloses a method for amplifying genetic information from genetic material comprising a plurality of mutually definable subsets of genetic material by means of PCR and for determining the copy number of different chromosomes per cell, wherein in PCR with fluorescently labeled primers for each chromosome to be determined specific target sequences of predetermined length are amplified.
  • the fluorescence intensity of the PCR products obtained for the respective chromosomes is determined and the intensities obtained for the target sequences of each chromosome are compared with one another.
  • this method also necessarily requires the use of fluorescently labeled primers and requires for evaluation the quantitative detection of the fluorescence intensities of the individual amplification products obtained. Again, this method works only in a narrow PCR window with some reliability, since only in this window, the peak heights are proportional to the ratio of the starting material.
  • the object of the present invention is to provide a method for the quantitative determination of the number of a predetermined sequence in a biological sample, in particular for the quantitative determination of the number of a predetermined sequence and homologous sequences, for example the number of alleles in a cell. which is simple and inexpensive to carry out and which provides reliable results even with a small number of predetermined sequences present in the biological sample to be examined, for example 10 or less.
  • this object is achieved by a method for quantitatively determining the number of a predetermined sequence and optionally homologous sequences in a biological sample, in particular for determining the absolute number of copies of alleles per cell, comprising the following steps:
  • the at least one amplification reaction is adapted to amplify at least two mutually non-homologous sequences encompassed by the predetermined sequence
  • step c) determining the number of different amplification products obtained and d) comparing the number of different amplification products obtained having at least one frequency distribution, which is carried out by separately carrying out the same reaction under the same reaction conditions as in step b) at least one amplification reaction, wherein in the amplification reactions the same as in step a) said amount of starting material has been / is used, with at least two different reference samples, said at least two different reference samples each having a known, mutually different copy number of the predetermined sequence, and then determining the number of different amplification products obtained per reference sample was / is obtained ,
  • Homologous sequences in the sense of the present invention are understood to be sequences which can be amplified under the same amplification conditions with a primer pair from a sample, whereas non-homologous sequences are those which are not amplifiable under the same amplification conditions with a primer pair from a sample.
  • the absolute fluorescence intensity of PCR products is not determined, as in the case of FISH and CGH compared with the fluorescence intensity of a control or reference sample, but only the number of different PCR products obtained and compared this number with a frequency distribution. In this respect, no fluent oreszenzmark believing primer can be used.
  • the fluorescence intensity of the fluorescence-labeled PCR products obtained does not have to be determined in a complex manner, but only evaluated if a fluorescence, if present above a defined threshold, is present in one of the fluorescent dyes used corresponding wavelength is present or not. Therefore, the inventive method is simple and inexpensive to carry out without expensive equipment for the quantitative detection of fluorescence.
  • the principle of the method according to the invention is based on the comparison of the number of different amplification products obtained in the at least one amplification reaction with a frequency distribution obtained from at least two reference samples having a known, mutually different copy number at the predetermined sequence, the at least two reference samples for the Recording the frequency distribution in the same amount as provided in step a) of the method according to the invention, separately under exactly the same conditions as in step b) of the inventive method were subjected to an amplification reaction and the number of different amplification products obtained with each amplification reaction was determined.
  • a frequency distribution is used for whose recording the amplification reaction carried out for each of the at least two reference samples is performed several times, for example ten or one hundred times. Since starting material with a known copy number of the predetermined sequence is used in the amplification reactions for recording the frequency distribution, it is possible to reliably depend on the number of samples from this comparison. pien of the predetermined sequence in the biological sample to be investigated.
  • Another advantage of the method according to the invention is that it is largely independent of the amplification conditions and the amount of starting material of the biological sample. Even if-for example in the case of a PCR amplification reaction-due to insufficient amplification conditions, such as a low number of cycles in the PCR, or when using primers binding insufficiently to the primer binding sites, only a fraction of the theoretically available with the at least one Amplif ⁇ kationsre force PCR products, this does not distort the resulting copy number result, because the same parameters were also applied when the at least one frequency distribution was recorded.
  • the inventive method is particularly suitable for very small amounts of starting material.
  • the method according to the invention is suitable for the quantitative determination of the number of a predetermined sequence in a biological sample, independently of the type of the predetermined sequence.
  • the predetermined sequence is a nucleic acid sequence, but in principle it is also conceivable to detect different sequence variants of proteins or peptides with the method according to the invention. Particularly good results are obtained when the predetermined sequence is a chromosome, a gene or a gene segment.
  • the method according to the invention is also not limited with regard to the nature of the at least one amplification reaction, but rather all conceivable amplification reactions with which sequence variants can be detected can be used.
  • a PCR as at least one amplification reaction, since a PCR can be carried out simply and comparatively quickly and with little technical outlay, and any nucleic acid sequences from the biological sample can be amplified by selecting suitable primer pairs.
  • step b) in the method according to the invention, in the at least one amplification reaction according to step b), which is adapted to amplify at least two mutually non-homologous sequences, which are encompassed by the predetermined sequence, such a small one Amount of biological starting material used, which leads to an "allelic dropout" when carrying out a PCR.
  • the predetermined sequence such as a small one Amount of biological starting material used
  • the term "allelic dropouf” to mean the loss of an allelic DNA fragment after a PCR amplification, caused by too small amounts of DNA starting material.
  • a heterogeneous DNA mixture such as a sample of chromosomal DNA, certain alleles are represented in varying numbers.
  • a biological sample which contains less than 100 pg of DNA, for example chromosomal DNA. More preferably, in the at least one amplification reaction, less than 50 pg of DNA, more preferably less than 10 pg of DNA and most preferably less than 5 pg of DNA is used as the starting material, with the principle that the fewer base pairs contain the nucleic acid in the biological sample, the less DNA can and should be used. Converted into cells, the abovementioned DNA amounts correspond to the use of less than 100 cells, preferably less than 10 cells and more preferably less than 5 cells in the at least one amplification reaction. In particular, even when using a single cell as a biological starting material good results are obtained.
  • the method according to the invention is based on a statistical approach in which it is not at all desirable that in the at least one amplification reaction each of the at least two mutually non-homologous sequences is actually amplified. Rather, precisely by setting the parameters of the amplification reaction, namely the use of a very small amount of DNA as starting material and optionally a correspondingly small number of cycles and / or very stringent hybridization conditions of the primers used to the primer binding sites, should be achieved that only a certain percentage of the at least two mutually non-homologous sequences are actually amplified.
  • the method according to the invention is intended, for example, to determine whether a particular chromosome, for example chromosome 21, is present in a cell in a copy number of 0, 1 or greater than or equal to 2.
  • a frequency distribution is recorded using three different reference samples, the first reference sample used being a cell which does not contain a copy of chromosome 21, whereas the second reference sample is a cell containing a copy of chromosome 21 and the third reference sample is a cell. containing two identical copies of chromosome 21.
  • Each of the reference samples is subjected to a PCR with the same primer pairs and under the same PCR conditions, wherein eight different primer pairs are used in each of the PCRs, the eight primer pairs being adapted to each amplify a different specific sequence from chromosome 21.
  • Each PCR is carried out under exactly the same conditions, with 100 experiments being carried out for each of the three reference samples. After each PCR, the number of different PCR products obtained is determined, giving, for example, the following frequency distribution: Table 1
  • n number of copies of the predetermined sequence in the reference sample
  • the method according to the invention can now be carried out with a biological sample having an unknown copy number of the chromosome 21.
  • a cell is first provided, then this used in a PCR, which is carried out under exactly the same conditions as the PCR's in the recording of the frequency distribution before, for example, by capillary electrophoresis, the number of different PCR products obtained in the PCR with the biological sample is determined. Finally, the determined number of different PCR products obtained is compared with the frequency distribution given in Table 1.
  • the copy number in the sample is more than 95% more than 0. If two or three different PCR products are obtained in the PCR, the copy number of chromosome 21 in the sample to be examined is 1 with the required safety, whereas the copy number in the case that 5 or more PCR products are obtained , with the required safety is two.
  • the frequency distribution consists of three reference samples having a defined, mutually differing copy number at the predetermined sequence, in this case chro- mosom 21, where each of the three frequency distribution curves indicates the probability of obtaining each number of different PCR products for a defined copy number between O and the theoretically possible maximum number.
  • the frequency distribution may include only two frequency distribution curves obtained, for example, with reference samples having 0 and 1 copies of the predetermined sequence, or even 4 frequency distribution curves or more. Particularly good results are obtained if, for the determination of the frequency distribution, 4 to 20 and particularly preferably 4 to 10 reference samples having a known, mutually differing copy number are used in the predetermined sequence.
  • the frequency distribution can also consist of specifying the average values of the number of different PCR products obtained with the individual reference samples during the multiple determination. For the aforementioned case described in relation to Table 1, this would be:
  • n number of copies of the predetermined sequence in the reference sample
  • the standard deviation is also indicated around the mean value.
  • the method according to the invention is a statistical method in which it is desired that not all of the theoretically possible different amplification products are actually obtained, and the evaluation is carried out by comparing the result obtained with the biological sample to be examined with a statistical frequency distribution
  • the at least one amplification reaction per reference sample is preferably carried out 2 to 1000 times, more preferably 10 to 250 times, most preferably 50 to 150 times and most preferably about 100 times. The higher the number of amplification reactions performed per reference sample of the frequency distribution, the higher the statistical reliability, but the higher the experimental effort.
  • the at least one amplification reaction per reference sample which has a known number of the predetermined sequence, is carried out 50 to 150 times, since this ensures a high statistical certainty and, on the other hand, the experimental effort is comparatively low ,
  • the determination of the frequency distribution can be carried out either before the execution of method steps a) to c) or also in parallel thereto.
  • the method according to the invention is not only suitable for determining the number of a predetermined sequence, for example of a specific gene or chromosome, in a biological sample, but in particular also for determining the number of a predetermined sequence.
  • sequence and homologous sequences per cell, wherein the homologous sequences are preferably alleles.
  • the at least one amplification reaction in step b) is preferably designed such that the at least two mutually non-homologous sequences are amplified from the non-coding DNA region.
  • the non-coding DNA region is substantially more polymorphic than the coding region, so that the probability of amplifying allele-specific sequences is high there.
  • STR or short tandem repeat sequences are highly polymorphic sequences consisting of only 2 to 4 bp repeating units and have high variability between individuals.
  • VNTR or variable lamber of tandem repeat sequences are composed of repetitive DNA sections of about 15 to 30 bp in length, the total length of which is determined by the number of repeats of this repeat unit.
  • VNTR sequences are usually highly polymorphic, that is, the number of respective repeating units is very different between the different individuals.
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • the at least one amplification reaction is adapted to amplify at least two mutually non-homologous sequences which occur only once in the genome of the donor per each allele.
  • the at least one amplification reaction is adapted to amplify between 2 and 100 mutually non-homologous sequences, in particular when matched to amplify from 2 to 20 mutually non-homologous sequences, more preferably 3 to 15 mutually non-homologous sequences and most preferably between 5 and 12 mutually non-homologous sequences, particularly good results are obtained.
  • the number of mutually non-homologous sequences to be amplified is, for example, between 5 and 8
  • Frequency distribution curves can be obtained, which allow a good distinction of a copy number of the predetermined sequence per cell of 0, 1 or greater than 2
  • the adaptation to 8 to 12 mutually non-homologous sequences provides a reliable statement whether the predetermined sequence, for example a particular chromosome or gene is present per cell in a copy number of 0, 1, 2 or greater equal to 3.
  • the inventive concept it is proposed to select the number of copies of the predetermined sequence to be determined in the biological sample between 0 and 100, preferably between 0 and 25, particularly preferably between 0 and 10 and very particularly preferably between 0 and 5.
  • step b) of the method according to the invention only one PCR is carried out, wherein in PCR one of the number of at least two mutually non-homologous sequences corresponding number of primer pairs, which are adapted to the at least two not to each other is used to amplify homologous sequences.
  • An example of a suitable process procedure is a multiplex PCR, although any other amplification reaction in which the at least two mutually non-homologous sequences to be amplified can be simultaneously amplified in one reaction can also be used.
  • a separate PCR is carried out for each of the at least two sequences to be amplified, which are not homologous to one another, so that only one primer pair is used in each PCR.
  • a number of subsets of a biological sample corresponding to the number of at least two mutually non-homologous sequences is provided in step a), each subset containing the same amount of biological material before the subsets into the individual PCR's are used.
  • An advantage of this procedure is that the individual amplifications can not influence one another.
  • the reference samples for recording the frequency distribution must be equally pre-amplified and portioned into subsets.
  • a particular advantage of the method according to the invention is that in step c) two information per amplification batch are taken into account in determining the number of different PCR products per amplification batch, namely the presence or absence of the corresponding PCR product and the Others, the information on a second, the individual PCR products from each other different parameters, eg. The length or sequence of the PCR products, why compared to a corresponding method in which only the presence and absence of the individual PCR products considered is obtained, a surprisingly sharp frequency distribution.
  • any method that is suitable for this purpose can be used, for example only gel electrophoresis, conventional hybridization techniques, for example hybridization methods on a DNA array, a bead System, as well as other optical, electrical or electrochemical measurements are mentioned.
  • the nature of the second parameter individualizing the individual PCR products depends essentially on the nature of the at least two sequences to be amplified which are not homologous to one another.
  • the length or length of the individual PCR products is preferably the second parameter or distinguishing feature of the individual PCR products, so that the determination of the number of different amplification products obtained in step c) the test
  • the presence or absence of PCR products and the determination of the length of the individual PCR products comprises, wherein the number of different amplification products obtained corresponds to the number of obtained amplification products of differing length.
  • a suitable method for this is, for example, the capillary electrophoresis.
  • the second distinguishing feature or the second parameter is preferably the determination of the differing sequence S NP-Ab cut usually limited to one nucleotide.
  • all methods known to the person skilled in the art for this purpose can be used, wherein only, for example, DNA sequencing or known hybridization methods are mentioned.
  • the number of different amplification products obtained corresponds to the number of differing sequence amplification products obtained.
  • the present invention relates to a method for the quantitative determination of the copy number of a predetermined nucleic acid sequence and homologous sequences in a cell, which comprises the following steps:
  • step d) comparing the number of different amplification products obtained having at least one frequency distribution which is carried out by in each case performing the same and under the same reaction conditions as the one used in step b) at least one PCR, wherein in the PCR the same as in step a) Amount of starting material was used, with at least two different reference samples, wherein the at least two different reference samples each have a known, mutually different copy number of the predetermined sequence, and then determining the number of different amplification products obtained per reference sample was obtained.
  • the method according to the invention is a statistical method, it is advantageous to set the starting quantity and the PCR conditions, in particular with regard to the temperature control, number of cycles and the binding affinity of the primers, such that the individual PCR reactions carried out in parallel with a relative frequency for a positive result greater than 0 but less than 1 expire. This ensures that a statistical evaluation with the highest possible reliability and reliability of the result obtained is achieved with minimal experimental effort.
  • the binding affinity of the individual PCR primers for their primer binding sites and the other parameters of the PCR in particular the number of cycles and temperature control, such that the relative frequency for a positive amplification reaction of the at least one amplification reaction for each of the at least two to be amplified non-homologous sequences between 0.2 and less than 1, more preferably between 0.4 and 0.6, and most preferably about 0.5.
  • the frequency distribution was recorded before the steps a) to c) of the method according to the invention, it has proven expedient to carry out an amplification reaction under the same conditions with a control sample parallel to the at least one amplification reaction according to step b). preferably leads to a known number of different amplification products. It can thus be determined in a simple manner whether the at least one amplification reaction according to step b) has proceeded correctly or possibly has not taken place at all or only insufficiently due to a defect in the thermocycler.
  • a polar body preferably a polar body, after the first age division as biological sample. Since the method according to the invention in particular for the quantitative determination of a copy number of a predetermined sequence and homologous sequences per cell, in particular for the quantitative determination of the copy number of alleles per cell of 0, 1 or greater equal to 2 or 0, 1, 2 or greater 3 is suitable, this is perfectly suited to infer by polar body analysis on the genome of the corresponding egg from which the polar body was taken.
  • the chromosome set of the initial diploid oocyte is reduced to a haploid chromosome set. While the first maturation division, the homologous chromosomes are separated, with one haploid set of chromosomes remaining in the oocyte and the other is discharged in the form of the polar body, carried out at the second maturity division, the separation of the individual chromatids of remaining in the oocyte chromosomes, where a sentence Chromatids in the form of the second polar body is removed from the egg cell, while the other set of chromatids remains in the oocyte.
  • the two polar bodies transferred from the ovum into the perivitelline cleft of the egg during the two stages of maturation thus correspond in their genetic structure to one cell, but have only a minimal proportion of cytoplasm. While the first polar body is formed during ovulation, the second polar body is discharged into the egg cell only three to four hours after the sperm has penetrated. Since polar bodies have no function and are resorbed in early embryonic development anyway, the removal of a polar body from the egg is on the one hand without damaging the egg and no risk of negatively influencing the further development possible and also according to the German Embryo Protection Act for the polar body after the first Maturity division permitted.
  • the polar body investigation therefore offers the possibility to diagnose possible chromosomal maldistribution in the oocyte at a very early stage, namely before fertilization of the oocyte.
  • a single polar body can be subjected to a PCR, wherein the PCR is designed as a multiplex PCR in which, for example, eight different primer pairs are used which are adapted to eight mutually non-homologous STR sequences on the chromosome to be examined , for example, chromosome 21, are to be amplified.
  • the cell contains three different alleles (triallelic trisomy), 4) the cell contains two equal alleles (monoallelic disomy
  • the cell contains two different alleles (biallelic disomy [healthy heterozygous cell]) or
  • the cell does not contain any allele of chromosome 21.
  • a frequency distribution is first of all created with at least two different reference samples, with each reference sample being carried out, for example, 100 times each PCR with the primer pairs suitable for amplification of, for example, 8 mutually non-homologous STR sequences.
  • reference samples for example, six different polar bodies, each having one of the aforementioned genetic features, are used. If only a distinction is made between a monoallelic disomy and a biallelic disomy, it is of course sufficient to use only two corresponding reference samples to generate the frequency distribution.
  • a polar body to be examined can then be subjected to the same multiplex PCR and the copy number determined by comparison of the number of different PCR products obtained with the frequency distribution.
  • the resolution of the frequency distribution can be set to a desired value so that overlaps of the frequency distribution curves in the one of interest Area can be avoided.
  • this frequency distribution can be used to unambiguously determine the number of sequence copies for each result obtained for the sample to be examined.
  • the number of non-homologous sequences to be amplified from 8 to 12
  • spreading of the individual frequency distribution curves was achieved while avoiding partial superimposition of the individual frequency distribution curves, as in the thought experiment described with reference to Table 1 for one or four different results PCR products is the case.
  • Another important parameter that influences the resolution of the frequency distribution is the number of cycles used in the at least one PCR. If, for example, the number of cycles of the PCR is reduced from 30 to 25 in the above-mentioned thought experiment described with reference to Table 3 with otherwise identical reference samples and PCR conditions, the frequency distribution shown in Table 4 is obtained, for example: Table 4
  • the width of the frequent PCR can be adjusted by adjusting the PCR conditions and determining the number of at least two sequences which are not homologous to each other. keitsver Ecuadorskurven and the distance of the various frequency distribution curves to each other almost arbitrary.
  • Another object of the present invention is a kit for the quantitative determination of the number of a predetermined sequence and possibly homologous sequences in a biological sample, which is suitable for carrying out the method according to the invention.
  • this kit comprises:
  • the at least two primer pairs are adapted to amplify in the at least one PCR at least two mutually non-homologous sequences from the non-coding DNA region.
  • the at least two primer pairs are adapted to amplify from the non-homologous sequences selected from the group consisting of STR sequences, VNTR sequences, SNP sequences, and any combinations thereof.
  • the at least two primer pairs and / or the protocol are adapted such that 2 to 100, particularly preferably 2 to 20, very particularly preferably 3 to 15 and most preferably 5 to 12 to one another in the PCR non-homologous sequences are amplified.
  • the at least two primer pairs and / or the protocol to the fact that the relative frequency of the at least one PCR for each of the at least two mutually non-homologous sequences is between 0.2 and less than 1, more preferably between 0.4 and 0.6 and most preferably about 0.5.
  • the present invention relates to a device suitable in particular for carrying out the method according to the invention, comprising
  • the primer pairs and / or the reference samples are immobilized on the support via non-chemical bonds.
  • the invention will be explained with reference to an inventive concept illustrative, but this non-limiting example.
  • lymphocytes of an individual were deposited under microscopic control as reference samples on the individual amplification anchors of an AmpliGrid glass slide, a glass strip commercially available from Advalytix AG for performing parallel automated PCR reactions, with an amplification anchor e.g. such a pretreated partial surface is that a liquid preferably resides on it. 1 to 6 lymphocytes were deposited per amplification anchor, with negative controls consisting of system fluid without lymphocytes additionally being placed on some anchors.
  • the individual PCR drops were overlaid with 5.2 ⁇ l of mineral oil (Coving Solution, Advalytix AG).
  • mineral oil was first pipetted so that it hung in the form of a drop on the pipette tip before this drop of the PCR drops was touched until it was evenly covered by the mineral oil.
  • each reaction was mixed with 4 .mu.l of water (bidist.). The water mixed with the aqueous phase of the sample. The total reaction volumes, including the mineral oil, were then transferred to various tubes of a microtiter plate.
  • the individual reaction volumes of the microtiter plate were briefly denatured with 19 ⁇ l each of formamide + 1 ⁇ l ILS 600 (internal fluorescence standard, Applied Biosystems) and electrophoretically separated under standard conditions in a capillary sequence analyzer ABI 3100 (Applied Biosystems).
  • the results were stored in the form of Genotyperfiles, whereby the detection of relevant signals and their assignment to the standard was done automatically by Genotyper software (Applied Biosystems).
  • the fluorescence signals are always measured against a background of fluorescence, where, as in any measurement, the signal-to-noise ratio is critical. This is not specified by the software.
  • As the lower limit (threshold value) of a relevant signal 500 relative luminescence units were determined in this experiment.
  • the automatically detected alleles per amplification were counted for all systems and the number of positive reactions was related to the cell number.
  • Lymphocyte cells / anchor the number of cells deposited per amplification anchor. In the case of diploid lymphocytes, this is exactly 2 copies of a homologous sequence per cell. These two copies are available for the PCR as start template and can both be amplified. If the two copies are sequence-identical, exactly one peak is recorded in capillary electrophoresis. If the two copies differ in their length (heterozygous case), two different lengths of a homologous sequence can be amplified. There are therefore two peaks. The groups O, 1, 2, 3, 4, 5, 6 analyzed here thus differ in the number of start copies by 2 copies each (1 cell: 2 copies, 2 cells: 4 copies, etc.).
  • N number of individual reactions started with a defined number of cells. Since the cells were randomly deposited, there are different sample sizes. The case “6 cells” was submitted only twice, the case “5 cells” 17 times, etc. The statistical analysis takes this into account.
  • Mean average of the number of positive signals (peaks found automatically by software), i. Mean value of the number of different PCR products.
  • Standard deviation standard deviation from the aforementioned mean as a measure of the variance around the mean.
  • ANOVA analysis of variance
  • a contamination with human DNA a contamination with human DNA; however, the PowerPlex Kit detects up to 16 different sequence segments in one reaction. Contamination would therefore have a single sequence (physically eg a chromosome), which is very unlikely, or in that b. capillary electrophoresis has erroneously indicated a signal; this may be a voltage pulse during electrophoresis or contamination in the gel by a fluorescent particle of unknown origin that is interpreted as a peak.
  • the mean difference is significant at the .05 level.
  • the group “1 cell” differs from the groups “0 cells”, “3 cells”, “4 cells”, “5 cells” and “6 cells”. On the other hand, a distinction of 1 cell / 2 cells is not possible because the significance between these groups is 0.264.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. von zu der vorbestimmten Sequenz homologen Sequenzen in einer biologischen Probe, bei der eine definierte Menge einer biologischen Probe wenigstens einer Amplifikationsreaktion, welche daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, unterworfen wird, anschließend die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte bestimmt und mit einer Häufigkeitsverteilung verglichen wird. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe sowie eine insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung.

Description

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer Zelle
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. von zu der vorbestimmten Sequenz homologen Sequenzen in einer biologischen Pro- be, insbesondere zur Bestimmung der absoluten Kopienzähl von Allelen pro Zelle, ein Kit zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbe- stimmten Sequenz in einer biologischen Probe sowie eine insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung.
In der molekularen Diagnostik gewinnen Verfahren zum Quantifizieren von Sequenzen, insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Kopien- zahl von Nukleinsäuresequenzen pro Zelle, eine immer bedeutendere Rolle. Da eine Vielzahl von zum Teil schweren Erkrankungen durch Abweichungen von der normalen Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen in dem Genom verursacht werden, lassen sich durch eine zuverlässige Bestimmung der Kopienzahl bestimmter Chromosomen oder bestimmter Ge- nabschnitte entsprechende Krankheiten schon im Frühstadium der Entwicklung zuverlässig diagnostizieren.
Beispiele für zum Teil schwere Anomalien, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, sind die Trisomie 18 (Edward' s Syndrom), Trisomie 13 (Patau- Syndrom) sowie Trisomie 21 (Down-Syndrom). Bei jeder dieser Krankheiten beträgt die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms 18, 13 bzw. 21 pro Zelle drei, wohingegen gesunde Individuen lediglich zwei Kopien der vorgenannten Chromosomen pro Zelle aufweisen. In allen drei Fällen führt die Erhöhung der Kopienzahl des betreffenden Chromosoms zu schwersten Anomalien. Während Träger der Trisomie 21 in ihrer Entwicklung drastisch gehemmt sind und teilweise schwere Fehlbildungen aufweisen, versterben die Träger der Trisomie 18 und Trisomie 13 meistens innerhalb des ersten Lebensjahres.
Neben Krankheiten, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, ist auch eine Vielzahl von Erkrankungen bekannt, welche auf eine veränderte Kopienzahl von Genen oder Genabschnitten beruhen.
Ursache für die Huntington-Krankheit, einer progressiv verlaufenden neu- rodegenerativen Erkrankung gekennzeichnet durch abnormale, unwillkürliche Bewegungen bei zunehmendem Verfall der geistigen und körperlichen Fähigkeiten, soll die Hintereinanderschaltung von mehr als 37 Ko- pien eines bestimmten Motivs (CAG) sein, wobei die Prädisposition zur Krankheitsausbildung mit der Anzahl der Wiederholungen dieses Motivs in dem Genom zunimmt. Weitere Beispiele für instabile Trinukleotidse- quenzen beim Menschen sind das Kennedy- Syndrom und die spinoce- rebrale Ataxie- 1.
Zudem ist bekannt, dass sich bestimmte Protoonkogene durch Genampli- fikation in dem Genom vervielfältigen können. Derartige Amplifikationen sind in dem Chromosomensatz oftmals als so genannte "double minutes" (D.M.) oder als " homogeneously staining regions" (HSR) zu erkennen. Auf- grund der enormen Erhöhung der Gen-Kopienzahl kann das zugehörige Protein in den Zellen in sehr großen Mengen produziert werden, was eine verstärkte Aktivierung der Zellproliferation - ohne Veränderung des Einzelgens an sich - ermöglicht. Insbesondere das myc-Protoonkogen soll von der Amplifikation besonders oft betroffen sein.
Aufgrund des Bedarfs an Verfahren zur Quantifizierung von Sequenzkopien in einer biologischen Probe wurde in der Vergangenheit eine Vielzahl entsprechender Verfahren vorgeschlagen.
Eines der grundlegenden Quantifizierungsverfahren, welches zumindest eine Aussage über die An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuresequenzen und abhängig von der Verfahrensführung auch einen bedingten Rück- schluss auf die Kopienzahl der betreffenden Nukleinsäuresequenzen pro Zelle erlaubt, ist das so genannte FISH-Verfahren [fluorescence in situ hybridization). Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende biologische Probe nach entsprechender Vorbehandlung, d.h. Denaturierung mit Formamid sowie Vorhybridisierung, mit einer oder mehreren verschiedenen Sonden, welche zuvor mit jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, unter Bedingungen inkubiert, welche eine Hybri- disierung der Sonden mit dazu homologen Sequenzen in der biologischen Probe ermöglichen. Nach der Hybridisierung werden die Proben gewaschen, wobei unspezifische Hy bridisierungs Signale eliminiert werden. Abschließend werden die Fluoreszenzsignale des Präparats mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Jedes vorhandene Fluoreszenzsignal weist auf die Anwesenheit der der mit dem entsprechenden Fluoreszenzmarker versehenen Sonde entsprechenden Sequenz hin. Die Intensität der Fluoreszenz kann einen bedingten Rückschluss auf die Anzahl der Sequenzkopien in der biologischen Probe zulassen. Wird hingegen bei der Wellenlänge einer der eingesetzten fluoreszenzmarkierten Sonden kein Signal oder nur ein unterhalb eines definierten Schwellenwerts liegendes Signal erhalten, kann auf die Abwesenheit der zu der entsprechenden Sonde korrespondierenden Sequenz in der biologischen Probe geschlossen werden. Allerdings kann die Abwesenheit eines entsprechenden Fluoreszenzsignals auch darin begründet liegen, dass in der entsprechenden Bindungsstelle der nachzuweisenden Sequenz eine Mutation und/ oder Mikrodeletion stattgefunden hat, weswegen die Sonde unter den gewählten Hybridisie- rungsbedingungen nicht mehr an die vorbestimmte Sequenz bindet. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt darin, dass eine unerwünschte und zu falschen Ergebnissen führende Kreuzhybridisierung niemals vollständig ausgeschlossen werden kann. Zudem ist dieses Verfahren vergleichsweise teuer, zum einen weil zwingend Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden müssen, und zum anderen, weil es aufwändige Apparaturen, wie Fluoreszenzmikroskope, benötigt. Schließlich hängt die Aussagekraft dieses Verfahrens in ganz erheblichem Maße von der Quali- tat der eingesetzten Sonden ab; zuverlässige Ergebnisse werden nur erhalten, wenn die Sonden mit einer Effizienz von mehr als 90 % an die dazu korrespondierenden Bindungsstellen hybridisieren. Daraus folgt, dass eine falsche Wahl der Sonden, aber auch inadäquate Hybridisierungsbedin- gungen zu einem falschen Ergebnis führen. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, dass eine Mindestmenge an biologischer Probe eingesetzt werden muss, um überhaupt ein auswertbares Fluoreszenzsignal zu erhalten. Zudem darf die Sequenz eine minimale Länge nicht unterschreiten. Weiterhin ist es für ein valides Ergebnis notwendig, eine Vielzahl von Zellen zu analysieren, die einer Hybridisierung zugänglich waren. Aus diesem Grund ist die FISH-Analyse für die Einzelzelldiagnostik nicht adäquat.
Ein anderes fluoreszenzbasierendes Verfahren ist die CGH-Analyse (com- parative genomic hybridization) . Bei diesem Verfahren wird die Nuklein- säure der zu analysierenden Probe komplett mit einem Farbstoff 1 mar- kiert. Die gleiche Menge an Nukleinsäuren einer Referenzprobe wird mit einem Farbstoff 2 markiert. Beide Reaktionsansätze werden gemeinsam auf einem gespreiteten Metaphasechromosomensatz hybridisiert, wobei die in beiden Reaktionsansätzen enthaltenen Sequenzen um die Bin- dungssteilen an den gespreiteten Chromosomen kompetieren. Im Wesentlichen wird sich an allen Hybridisierungsstellen ein Verhältnis von Farbstoff 1 zu Farbstoff 2 wie 1: 1 einstellen. Enthält die zu analysierende Probe amplifizierte Bereiche (mehr als die gewöhnliche Kopienzahl der Referenz), so wird der Farbstoff 1 an dieser Hybridisierungsstelle überwiegen. Im Falle einer Deletion in der zu untersuchenden Probe wird man nur den Farbstoff 2 an dieser Hybridisierungsstelle detektieren. Die Referenzmessung erlaubt eine relative Aussage über die Häufigkeit von Sequenzen in der zu analysierenden Probe.
Eine spezielle Variante ist die Array-CGH, in der nicht auf Chromosomen, sondern auf immobilisierte Sequenzen, deren physikalische Adresse im Genom bekannt ist, hybridisiert wird.
Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäure- Sequenzen ist die Real-Time-PCR-Methode, bei der eine PCR (Polymerase chain reaction bzw. Polymerasekettenreaktion) mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt wird und die Zunahme des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Zyklenzahl beobachtet wird. Der Schwellenwert- PCR-Zyklus (auch Threshold-Cycle) wird dem Reaktionszeitpunkt zuge- ordnet, bei dem sich das Fluoreszenzsignal signifikant von der Hintergrundfluoreszenz abhebt und die PCR-Produktbildung exponentiell verläuft. Dieser korreliert mit der Anfangskopienzahl der zu vermehrenden DNA-Sequenz. Auf diese Weise lassen sich DNA-Proben anhand des Vergleichs mit einer DNA- Verdünnungsreihe relativ quantifizieren. Ein Nach- teil dieses Verfahrens liegt jedoch darin, dass die Menge an Ausgangsma- terial nicht beliebig verkleinert werden kann, da mit wenigen Startmolekülen, beispielsweise 10 bis 100 Kopien, als Ausgangsmaterial der stochasti- sche Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation sehr groß wird, was keine quantitative Aussagen mehr zulässt. Des weiteren erfordert auch dieses Verfahren aufwändige und teure Apparaturen zur Messung der Fluoreszenzintensität.
Ein neueres Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Nukleinsäure- sequenz ist die QF-PCR (quantitative fluorescence PCR), bei der in einem PCR-Ansatz parallel mehrere PCR's unter Einsatz unterschiedlich fluoreszenzmarkierter Primer durchgeführt werden und die fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte anschließend mit einem automatischen DNA-Scanner laserdensitometrisch analysiert werden. Auch bei diesem Verfahren handelt es sich um eine relative Quantifizierungsmethode, da ein Vergleich für zwei PCR-Produkte, die parallel in einem PCR- Versuch amplifiziert werden, gezogen wird. Um einen aussagenkräftigen quantitativen Vergleich zwischen zwei nebeneinander amplifizierten PCR-Produkten treffen zu können, müssen die beiden PCR-Teilreaktionen mit gleicher Effizienz ablaufen und die Fluoreszenzintensitäten der Reaktionsprodukte zum Zeit- punkt der exponentiellen Produktamplifikation quantitativ analysiert werden.
Ein auf der QF-PCR-Methodik basierendes Verfahren zur Feststellung möglicher numerischer Aberrationen der Chromosomen 21, 18, 13, X und Y in Fruchtwasserproben ist von Lucchini et al. in Wissenschaftliche Informationen, September 2004 beschrieben worden. Dieses Verfahren basiert auf der in-yitro-PCR-Amplifikation von repetitiven und polymorphen STR (short tandem repeats) -Sequenzen mit fluoreszenzmarkierten Primern. Nach Abschluss der PCR werden die amplifizierten PCR-Produkte mittels Kapillarelektrophorese quantifiziert. Werden bei diesen Verfahren chromo- somenspezifische STR-Systeme eingesetzt, so lassen sich aus der Anzahl der erhalten unterschiedlichen PCR-Produkte Rückschlüsse auf die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms schließen. Werden beispielsweise bei der Reaktion mit einem chromosomspezifischen STR-System bei der Kapillarelektrophorese drei Peaks erhalten, wobei die Peakhöhen untereinander 1: 1: 1 betragen, so enthält das untersuchte Individuum drei verschiedene Allele des entsprechenden Chromosoms (triallelische Trisomie). Werden hingegen bei dem Verfahren zwei Peaks erhalten, wobei das Verhältnis der Peaks untereinander 2:1 beträgt, so weist das untersuchte Individuum pro Zelle zwei gleiche Allele des Chromosoms sowie ein anderes Allel des Chromosoms (diallelische Trisomie) auf. Im Falle, dass nur zwei Peaks mit identischer Peakhöhe erhalten werden, weist das Individuum zwei Allele auf, so dass keine Trisomie vorliegt (heterozygoter Fall). Allerdings lässt dieses Verfahren in dem Fall, dass lediglich ein Peak er- halten wird, keine Aussage über die An- oder Abwesenheit einer Trisomie zu, da dieses Ergebnis sowohl im Falle einer monoallelischen Trisomie als auch im Falle einer monoallelischen Disomie erhalten wird. Ein auf dieser Technologie beruhendes Verfahren zum Nachweis von Trisomie 13 wird auch in der DE 101 02 687 Al offenbart. Um auch zwischen einer mono- allelischen Disomie und einer monoallelischen Trisomie unterscheiden zu können, wird bei diesem Verfahren vorgeschlagen, mit der PCR drei verschiedene, für das Chromosom 13 spezifische STR-DNA-Bereiche zu amplifizieren. Allerdings weist auch dieses Verfahren den Nachteil auf, dass fluoreszenzmarkierte Primer eingesetzt werden müssen. Zudem er- fordert auch dieses den Einsatz einer Mindestmenge an DNA, da andernfalls der stochastische Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation sehr groß wird und keine quantitative Aussage mehr möglich ist. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt schließlich darin, dass dieses nur in einem engen PCR-Fenster mit einiger Zuverlässigkeit funkti- oniert, da nur in diesem Fenster die Peakhöhen proportional zum Ver- hältnis des Ausgangsmaterials sind. Des weiteren weist auch dieses Verfahren den Nachteil auf, dass die absolute Fluoreszenzintensität bestimmt werden muss.
In der WO 2004/027089 wird ein Verfahren zur Amplifikation genetischer Informationen aus genetischem Material umfassend mehrere voneinander abgrenzbare Teilmengen genetischen Materials mittels PCR und zur Bestimmung der Kopienzahl verschiedener Chromosomen pro Zelle offenbart, wobei in der PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern für jedes zu be- stimmende Chromosom spezifische Zielsequenzen mit vorbestimmter Länge amplifiziert werden. Um eine Aussage über die Kopienzahl der zu detek- tierenden Chromosomen zu erhalten, wird die Fluoreszenzintensität der für die jeweiligen Chromosomen erhaltenen PCR-Produkte bestimmt und werden die für die Zielsequenzen jedes Chromosom erhaltenen Intensitä- ten miteinander verglichen. Wenn bspw. die mit den für das Chromosom 21 spezifischen PCR-Produkten erhaltene Intensität gleich oder zumindest annähernd gleich wie die mit den für das Chromosom 1 spezifischen PCR- Produkten erhaltene Intensität ist, wird die Aussage getroffen, dass die beiden vorgenannten Chromosomen in der biologischen Probe in gleicher Kopienzahl vorliegen. Auch dieses Verfahren setzt daher zwingend den Einsatz fluoreszenzmarkierter Primer voraus und benötigt zur Auswertung die quantitative Erfassung der Fluoreszenzintensitäten der einzelnen erhaltenen Amplifikationsprodukte. Auch dieses Verfahren funktioniert daher nur in einem engen PCR-Fenster mit einiger Zuverlässigkeit, da nur in diesem Fenster die Peakhöhen proportional zum Verhältnis des Ausgangsmaterials sind.
Mit keinem der oben genannten Verfahren ist es möglich, die exakte absolute Kopienzahl einer bspw. in 10 Kopien oder weniger in einer biologi- sehen Probe vorliegenden vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homolo- ger Sequenzen, bspw. die absolute exakte absolute Kopienzahl von Allelen pro Zelle, zu bestimmen. Abgesehen davon müssen in diesen Verfahren zwingend fluoreszenzmarkierter Primer bzw. Sonden eingesetzt werden, weswegen zur Auswertung teure Apparaturen notwendig sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und von dazu homologen Sequenzen, bei- spielsweise die Anzahl von Allelen in einer Zelle, bereitzustellen, welches einfach und kostengünstig durchführbar ist und welches auch bei einer geringen Anzahl an in der zu untersuchenden biologischen Probe vorhandenen vorbestimmten Sequenzen, beispielsweise 10 oder weniger, zuverlässige Ergebnisse liefert.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur Bestimmung der absoluten Anzahl an Kopien von Allelen pro Zelle, gelöst, welches die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellen einer definierten Menge einer biologischen Probe,
b) Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren,
c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Ampli- fikationsprodukte sowie d) Vergleichen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifϊka- tionsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Amplifikationsreaktionen die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde/wird, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei ver- schiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde/wird.
Unter homologen Sequenzen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen verstanden, welche unter gleichen Amplifikationsbedingungen mit einem Primerpaar aus einer Probe amplifizierbar sind, wohingegen nicht homologe Sequenzen solche sind, welche unter gleichen Amplifikati- onsbedingungen mit einem Primerpaar aus einer Probe nicht amplifizierbar sind.
Im Unterschied zu den Verfahren nach dem Stand der Technik wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht, wie beispielsweise bei der quan- titativen PCR, QF-PCR, FISH und CGH, die absolute Fluoreszenzintensität von PCR-Produkten bestimmt sowie wie im Falle der FISH und CGH mit der Fluoreszenzintensität einer Kontroll- bzw. Referenzprobe verglichen, sondern lediglich die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR- Produkte bestimmt und diese Anzahl mit einer Häufigkeitsverteilung ver- glichen. Insofern müssen in dem erfindungsgemäßen Verfahren keine flu- oreszenzmarkierten Primer eingesetzt werden. Sofern diese zur Detektion der Anzahl an erhaltenen verschiedenen PCR-Produkten dennoch eingesetzt werden, muss nicht aufwendig die Fluoreszenzintensität der erhaltenen Fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten bestimmt werden, sondern lediglich evaluiert werden, ob eine ggf. über einem definierten Schwellenwert liegende Fluoreszenz bei einer den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen entsprechenden Wellenlänge vorhanden ist oder nicht. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren ohne kostenaufwändige Apparaturen zur quantitativen Detektion von Fluoreszenz einfach und kostengünstig durchzuführen .
Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht auf dem Vergleich der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten mit einer anhand von wenigs- tens zwei Referenzproben mit einer bekannten, voneinander verschiedenen Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz erhaltenen Häufigkeitsverteilung, wobei die wenigstens zwei Referenzproben für die Aufnahme der Häufigkeitsverteilung in der gleichen wie in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellten Menge, getrennt voneinander unter ex- akt den gleichen Bedingungen wie in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens einer Amplifikationsreaktion unterworfen wurden und die Anzahl der mit jeder Amplifikationsreaktion erhaltenen verschiedenen Ampli- fikationsprodukte bestimmt wurde. Erfindungsgemäß wird eine Häufigkeitsverteilung verwendet, für deren Aufnahme die für jede der wenigstens zwei Referenzproben durchgeführte Amplifikationsreaktion mehrfach, bspw. zehn- oder hundertfach, durchgeführt wird. Da in den Amplifikati- onsreaktionen für die Aufnahme der Häufigkeitsverteilung Ausgangsmaterial mit einer bekannten Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz eingesetzt wird, kann aus diesem Vergleich zuverlässig auf die Anzahl der Ko- pien der vorbe stimmten Sequenz in der zu untersuchenden biologischen Probe geschlossen werden.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass es weitgehend von den Amplifikationsbedingungen und der Menge an Ausgangsmaterial der biologischen Probe unabhängig ist. Selbst wenn - bspw. im Falle einer PCR als Amplifϊkationsreaktion - aufgrund unzureichender Amplifikationsbedingungen, wie beispielsweise einer zu geringen Zyklenzahl in der PCR, oder bei Einsatz von ungenügend an die Primerbin- dungsstellen bindenden Primern, nur ein Bruchteil der mit der wenigstens einen Amplifϊkationsreaktion theoretisch erhältlichen PCR-Produkte erhalten wird, so verfälscht dies nicht das erhaltene Kopienzahlergebnis, weil dieselben Parameter auch bei der Aufnahme der wenigstens einen Häufigkeitsverteilung angewandt wurden. Deshalb kann bei dem erfϊndungsge- mäßen Verfahren auch bei Einsatz geringster DNA- Ausgangsmengen kein das quantitative Ergebnis verfälschender stochastischer Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation auftreten, da derartige etwaige Effekte durch die Häufigkeitsverteilung nivelliert werden. Deshalb ist das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere auch für sehr kleine Mengen an Ausgangsmaterial geeignet.
Grundsätzlich ist das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe unabhängig von der Art der vorbestimmten Sequenz geeignet. Vor- zugsweise handelt es sich bei der vorbestimmten Sequenz um eine Nuk- leinsäuresequenz, dennoch ist es grundsätzlich auch denkbar, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unterschiedliche Sequenzvarianten von Proteinen oder Peptiden nachzuweisen. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn die vorbestimmte Sequenz ein Chromosom, ein Gen oder ein Genabschnitt ist. Auch bezüglich der Art der wenigstens einen Amplifikationsreaktion ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht limitiert, vielmehr können alle denkbaren Amplifikationsreaktionen, mit denen Sequenzvarianten nach- gewiesen werden können, eingesetzt werden. Dennoch hat es sich als vorteilhaft erwiesen, als wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR durchzuführen, da eine PCR einfach und vergleichsweise schnell und mit geringem technischen Aufwand durchzuführen ist und durch die Auswahl geeigneter Primerpaare beliebige Nukleinsäuresequenzen aus der biologi- sehen Probe amplifiziert werden können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b), welche daran angepasst ist, wenigs- tens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, ein derart geringe Menge an biologischem Ausgangsmaterial eingesetzt, welche bei Durchführung einer PCR zu einem "allelic dropouf führt. Unter einem "allelic dropouf versteht der Fachmann den Verlust eines allelischen D NA- Fragmentes nach einer PCR-Amplifikation, verursacht durch zu geringe Mengen an DNA- Ausgangsmaterial. In einem heterogenen DNA-Gemisch, wie beispielsweise einer Probe chromosomaler DNA, sind bestimmte Allele unterschiedlich häufig vertreten. Da die PCR exponentiell amplifiziert, kann diese Ungleichverteilung so sehr verstärkt werden, dass das geringer konzentrierte Allel im Verhältnis zu dem höher konzentrierten Allel so gering vertreten ist, dass es nicht mehr detektiert werden kann. Um einen "allelic dropouf zu vermeiden, wird z.B. bei forensischen Untersuchungen immer eine gewisse, im Nanogrammbereich liegende Ausgangsmenge an DNA-Material eingesetzt, um überhaupt zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Im Unter- schied dazu ist es bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie nachstehend näher begründet, sogar vorteilhaft, unterhalb einer solchen Mindestmenge an Ausgangsmaterial zu arbeiten.
Besonders gute Ergebnisse werden bei dieser Ausführungsform erhalten, wenn in die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine biologische Probe eingesetzt wird, welche weniger als 100 pg DNA, beispielsweise chromosomale DNA, enthält. Insbesondere bevorzugt werden in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion weniger als 50 pg DNA, besonders bevorzugt weniger als lO pg DNA und ganz besonders bevorzugt weniger als 5 pg DNA als Ausgangsmaterial eingesetzt, wobei grundsätzlich gilt, dass je weniger Basenpaare die Nukleinsäure in der biologischen Probe enthält, desto weniger DNA eingesetzt werden kann und sollte. Umgerechnet in Zellen entsprechen die vorgenannten DNA-Mengen dem Einsatz von weniger als 100 Zellen, bevorzugt weniger als 10 Zellen und besonders bevor- zugt weniger als 5 Zellen in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion. Insbesondere auch bei Einsatz einer einzelnen Zelle als biologisches Ausgangsmaterial werden gute Ergebnisse erhalten.
Im Unterschied zu den beispielsweise in der Forensik eingesetzten Verfah- ren basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf einem statistischen Ansatz, bei dem es gar nicht erwünscht ist, dass in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion jede der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen tatsächlich amplifiziert wird. Vielmehr soll gerade durch die Einstellung der Parameter der Amplifikationsreaktion, nämlich den Einsatz einer sehr geringen DNA-Menge als Ausgangsmaterial sowie gegebenenfalls einer entsprechend kleinen Zyklenzahl und /oder sehr stringen- ten Hybridisierungsbedingungen der eingesetzten Primer zu den Primer- bindungsstellen, erreicht werden, dass nur ein bestimmter Prozentsatz der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen tatsächlich amplifiziert wird. Indem die Häufigkeitsverteilung durch mehrmaliges Durchführen einer Amplifikationsreaktion unter denselben Amplifikati- onsbedingungen für wenigstens zwei Referenzproben mit bekannter Kopienzahl durchgeführt wird, wird eine statistische Verteilung erhalten, aus der man zuverlässig auf die Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in der zu untersuchenden biologischen Probe schließen kann. Dieser statistische Ansatz wird nachfolgend am Beispiel einer PCR näher erläutert.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren soll beispielsweise bestimmt werden, ob ein bestimmtes Chromosom, beispielsweise Chromosom 21, in ei- ner Zelle in einer Kopienzahl von 0, 1 oder größer gleich 2 vorliegt. Hierzu wird unter Einsatz von drei verschiedenen Referenzproben eine Häufigkeitsverteilung aufgenommen, wobei als erste Referenzprobe eine Zelle eingesetzt wird, welche keine Kopie des Chromosoms 21 enthält, hingegen als zweite Referenzprobe eine Zelle, die eine Kopie des Chromosoms 21 enthält und als dritte Referenzprobe eine Zelle, die zwei gleiche Kopien des Chromosoms 21 enthält. Jede der Referenzproben wird jeweils mit denselben Primerpaaren und unter den gleichen PCR-Bedingungen einer PCR unterworfen, wobei in jeder der PCR's acht verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, wobei die acht Primerpaare dazu angepasst sind, jeweils eine unterschiedliche spezifische Sequenz aus dem Chromosom 21 zu amplifizieren. Alle PCR's werden jeweils unter exakt den gleichen Bedingungen durchgeführt, wobei für jede der drei Referenzproben jeweils 100 Experimente durchgeführt werden. Nach jeder PCR wird die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte bestimmt, wobei beispielswei- se die folgende Häufigkeitsverteilung erhalten wird: Tabelle 1
(Beispiel für eine Häufigkeitsverteilung gemäß einer ersten Ausführungsform)
n = Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe
Da in den einzelnen PCR's jeweils acht verschiedene Primerpaare eingesetzt wurden, welche daran angepasst sind, acht unterschiedliche spezifϊ- sehe Sequenzen aus dem Chromosom 21 zu. amplifizieren, liegt die theoretisch mögliche Maximalzahl an erhaltenen unterschiedlichen PCR- Produkten für den Fall n=0, d.h. einer Zelle ohne Chromosom 21, bei 0, für den Fall n=l, d.h. einer Zelle mit einem Chromosom 21, bei 8 und für den Fall n=2, d.h. einer Zelle mit zwei gleichen Kopien (homozygoter Fall) des Chromosoms 21, ebenfalls bei 8. Im heterozygoten Fall läge die theoretisch mögliche Maximalzahl an Amplifikaten bei einer diploiden Zelle bei 16, wodurch mit dem System ein erheblicher Informationsgewinn erhalten wird. Da jedoch in diesem Gedankenbeispiel bei der Aufnahme der Häufigkeitsverteilungsaufnahme in jeder PCR lediglich eine Zelle eingesetzt wurde, also eine bei Durchführung einer PCR zu einem "allelic dropouf führende Menge, werden einige der in den biologischen Referenzproben enthaltenden Allele nicht amplifiziert. Zudem wurde durch die Auswahl der Primersequenzen sowie der Zyklenzahl die Effizienz jeder einzelnen PCR auf einen Wert unterhalb der theoretisch erreichbaren Grenze von 1 eingestellt. Aus diesen Gründen wird in der in der Tabelle 1 wiedergegebe- nen Häufigkeitsverteilung weder bei der Probe mit einer Kopie des Chromosoms 21 (n=l) noch bei der Probe mit zwei Kopien des Chromosoms 21 (n=2) die theoretisch maximal mögliche Anzahl an unterschiedlichen Ampliflkaten erhalten. Vielmehr werden für den Fall n=l, d.h. eine Refe- renzprobe mit einer Kopienzahl von 1, in 2 von der hundert durchgeführten PCR's gar kein Amplifikationsprodukt erhalten, in 13 von 100 PCR's nur 1 PCR-Produkt, in 24 von 100 PCR's 2 unterschiedliche PCR- Produkte, in 57 von 100 von PCR's 3 unterschiedliche PCR-Produkte, in 3 von 100 PCR's vier unterschiedliche PCR-Produkte und in 1 von 100 PCR's 5 unterschiedliche PCR-Produkte anstelle der theoretisch maximal 8 verschiedenen PCR-Produkten erhalten. Es ergibt sich somit für diesen Fall (n=l) eine einer Gauss- Verteilung ähnliche Häufigkeitsverteilungskurve mit einem Maximalwert von 3 unterschiedlichen PCR-Produkten. Eine ähnliche Häufigkeitsverteilungskurve wird auch für den Fall erhalten, dass Referenzproben mit zwei Kopien des Chromosoms (n=2) eingesetzt wurden, wobei das Maximum der Häufigkeitsverteilungskurve jedoch zu höheren Werten verschoben ist, nämlich von drei verschiedenen Amplifi- katen für den Fall n=l auf 5 bis 6 verschiedene PCR-Produkte für den Fall n=2. Für den dritten Fall, in dem eine Referenzprobe mit 0 Kopien des Chromosoms 21 eingesetzt wurde, werden in 98 % der Fälle auch keine Amplifikate und nur in 2 % der Fälle ein Amplifikat erhalten. Da in dem letztgenannten Fall in den Proben kein Chromosom 21 enthalten war, muss es sich bei diesen 2 %, in denen ein PCR-Produkt erhalten wurde, um Artefakte handeln.
Im Anschluss an die Aufnahme der Häufigkeitsverteilung kann das erfindungsgemäße Verfahren nun mit einer biologischen Probe mit unbekannter Kopienzahl des Chromosoms 21 durchgeführt werden. Hierzu wird zunächst eine Zelle bereitgestellt, anschließend diese in eine PCR eingesetzt, welche unter exakt den gleichen Bedingungen durchgeführt wird wie die PCR's bei der Aufnahme der Häufigkeitsverteilung, bevor beispielsweise mit Kapillarelektrophorese die Anzahl der in der PCR mit der biologischen Probe erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte bestimmt wird. Abschließend wird die ermittelte Anzahl an erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkten mit der in Tabelle 1 wiedergegebenen Häufigkeitsverteilung verglichen.
Wird mit der zu untersuchenden Zelle in der PCR kein PCR-Produkt erhalten, so lässt sich aus der Häufigkeitsverteilung gemäß Tabelle 1 entneh- men, dass die Kopienzahl in der Probe mit einer Wahrscheinlichkeit von mehr als 95% bei 0 liegt. Sofern in der PCR zwei oder drei verschiedene PCR-Produkte erhalten werden, liegt die Kopienzahl des Chromosoms 21 in der zu untersuchenden Probe mit der geforderten Sicherheit bei 1, wohingegen die Kopienzahl in dem Fall, dass 5 oder mehr PCR-Produkte er- halten werden, mit der geforderten Sicherheit zwei beträgt. Lediglich in dem Fall, dass in der PCR ein oder vier unterschiedliche PCR-Produkte erhalten werden, kann in diesem konkreten Gedankenbeispiel nicht mit der geforderten Konfidenz entschieden werden, wie viele Kopien an Chromosomen 21 in der Probe enthalten sind, sondern es lässt sich lediglich die Aussage treffen, dass im Falle von einem PCR-Produkt entweder 0 oder eine Kopie und im Falle von 4 unterschiedlichen PCR-Produkten ein oder zwei Kopien des Chromosoms 21 vorliegen. Möchte man auch diese Fälle mit der geforderten Sicherheit entscheiden können, so kann man durch Veränderung des PCR-Protokolls oder durch eine Erhöhung der Anzahl an unterschiedlichen PCR's die einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven voneinander trennen.
In der vorgenannten Ausführungsform besteht die Häufigkeitsverteilung aus mit drei Referenzproben mit definierter, sich voneinander unterschei- dender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz, in diesem Fall Chro- mosom 21, erhaltenen Häufigkeitsverteilungskurven, wobei jede der drei Häufigkeitsverteilungskurven die Wahrscheinlichkeit für den Erhalt jeder zwischen O und der theoretisch möglichen Maximalzahl liegenden Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten für eine definierte Kopienzahl an- gibt. Wie der Fachmann erkennt, kann die Häufigkeitsverteilung auch nur zwei Häufigkeitsverteilungskurven umfassen, welche bspw. mit Referenzproben mit 0 und 1 Kopie der vorbestimmten Sequenz, erhalten wurde oder auch 4 Häufigkeitsverteilungskurven oder mehr. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn für die Bestimmung der Häufigkeitsver- teilung 4 bis 20 und besonders bevorzugt 4 bis 10 Referenzproben mit bekannter, sich jeweils voneinander unterscheidender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz eingesetzt werden.
Alternativ zu der vorgenannten Ausführungsform kann die Häufigkeitsver- teilung auch aus der Angabe der Mittelwerte der mit den einzelnen Referenzproben bei der Mehrfachbestimmung erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten bestehen. Für den vorgenannten, in Bezug auf die Tabelle 1 geschilderten Fall wäre dies:
Tabelle 2
(Beispiel für eine Häufigkeitsverteilung gemäß einer zweiten Ausführungsform)
n = Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe Vorzugsweise wird bei der Häufigkeitsverteilung gemäß dieser Ausführungsform auch die Standardabweichung um den Mittelwert angegeben.
Da es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein statistisches Verfahren handelt, bei dem erwünscht ist, dass nicht alle der theoretisch möglichen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte tatsächlich erhalten werden, und die Auswertung durch Vergleich des mit der zu untersuchenden biologischen Probe erhaltenen Ergebnisses mit einer statistischen Häufigkeitsverteilung erfolgt, wird zum Aufnehmen der wenigstens einen Häufigkeitsverteilung gemäß Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens die wenigstens eine Amplifikationsreaktion pro Referenzprobe vorzugsweise 2 bis 1.000 mal, besonders bevorzugt 10 bis 250 mal, ganz besonders bevorzugt 50 bis 150 mal und höchst bevorzugt etwa 100 mal durchgeführt. Je höher die Anzahl der pro Referenzprobe der Häufigkeits- Verteilung durchgeführten Amplifikationsreaktionen, desto höher die statistische Sicherheit, desto höher allerdings auch der experimentelle Aufwand. Bevorzugt wird daher für die Erstellung der in Schritt d) eingesetzten Häufigkeitsverteilung die wenigstens eine Amplifikationsreaktion pro Referenzprobe, welche eine bekannte Anzahl der vorbestimmten Sequenz aufweist, 50 bis 150 mal durchgeführt, da dies eine hohe statistische Sicherheit gewährleistet und andererseits der experimentelle Aufwand vergleichsweise gering ist.
Die Bestimmung der Häufigkeitsverteilung kann entweder vor der Durch- führung der Verfahrensschritte a) bis c) erfolgen oder auch parallel dazu.
Wie dargelegt ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur dazu geeignet, die Anzahl einer vorbestimmten Sequenz, bspw. eines speziellen Gens oder Chromosoms, in einer biologischen Probe zu bestimmen, sondern insbesondere auch zur Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Se- quenz sowie dazu homologer Sequenzen pro Zelle, wobei es sich bei den homologen Sequenzen vorzugsweise um Allele handelt. Bei der letztgenannten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es notwendig, in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) wenigstens eine allelspezifische Sequenz zu amplifizieren, worunter eine Sequenz verstanden wird, welche zwischen zwei Allelen zwar hochgradig ähnlich bzw. homolog, aber nicht identisch ist. Da in Schritt c) die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte bestimmt wird und dadurch die Anzahl der unterschiedlichen Allele das Ergebnis beeinflussen, kann durch Vergleich mit der Häufigkeitsverteilung die Kopienzahl der einzelnen Allele bestimmt werden. Daher wird die wenigstens eine Amplifikationsreaktion in Schritt b) vorzugsweise derart ausgelegt, dass die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen aus dem nicht-kodierenden DNA- Bereich amplifiziert werden. Bekanntermaßen ist der nicht-kodierenden DNA-Bereich wesentlich polymorpher als der kodierende Bereich, so dass die Wahrscheinlichkeit dort allelspezifische Sequenzen zu amplifizieren groß ist.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die we- nigstens eine Amplifikationsreaktion dazu anzupassen, dass wenigstens zwei zueinander nicht homologe hochpolymorphe Sequenzen amplifiziert werden.
Insbesondere in den Fällen, in denen die wenigstens eine Amplifikations- reaktion dazu angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche aus der aus STR-Sequenzen, VNTR- Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, werden gute Ergebnisse erhalten. STR- bzw. short tandem repeat- Sequenzen sind hochpolymorphe Sequenzen, welche aus lediglich 2 bis 4 bp langen Wiederholungseinheiten bestehen und zwischen den einzelnen Individuen eine hohe Variabilität aufweisen. Im Unterschied dazu bestehen VNTR- bzw. variable lamber of tandem re- peat Sequenzen aus etwa 15 bis 30 bp Länge aufgebauten repetitiven DNA-Abschnitten, deren Gesamtlänge durch die Anzahl der Wiederholun- gen dieser Grundeinheit bestimmt sind. Auch VNTR-Sequenzen sind in der Regel hochpolymorph, d.h. die Anzahl der jeweiligen Wiederholungseinheiten unterscheidet sich zwischen den verschiedenen Individuen sehr stark. Bei SNPs (single nucleotide polymorphism) handelt es sich um die einfachsten Polymorphismen, bei denen sich die homologen Sequenzen nur durch eine Base unterscheiden. Auch diese eignen sich hervorragend für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Abgesehen davon sind jedoch auch alle anderen hochpolymorphen Sequenzen als Marker für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
Ferner ist es bevorzugt, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche in dem Genom des Spenders jeweils pro Allel nur einmal vorkommen.
Durch die Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen kann die Lage und in gewissem Umfang auch die Breite der einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven der Häufigkeitsverteilung eingestellt werden. Vorzugsweise ist die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst, zwischen 2 und 100 zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, wobei insbesondere bei Anpassung zur Amplifikation von 2 bis 20 zueinander nicht homologen Sequenzen, besonders bevorzugt 3 bis 15 zueinander nicht homologen Sequenzen und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 12 zueinander nicht homologen Sequenzen, besonders gute Ergebnisse erhalten werden. Liegt die Anzahl der zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen beispielsweise zwischen 5 und 8, lassen sich Häufigkeitsverteilungskurven erhalten, welche eine gute Unterscheidung einer Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz pro Zelle von 0, 1 oder größer gleich 2 erlauben, wohingegen die Anpassung an 8 bis 12 zueinander nicht homologen Sequenzen eine zuverlässige Aussage ermög- licht, ob die vorbestimmte Sequenz, beispielsweise ein bestimmtes Chromosom oder ein bestimmtes Gen, pro Zelle in einer Kopienzahl von 0, 1, 2 oder größer gleich 3 vorliegt.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Anzahl der zu bestimmenden Kopien der vorbestimmten Sequenz in der biologischen Probe zwischen 0 und 100, bevorzugt zwischen 0 und 25, besonders bevorzugt zwischen 0 und 10 und ganz besonders bevorzugt zwischen 0 und 5 zu wählen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens nur eine PCR durchgeführt, wobei in der PCR eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Primerpaaren, welche dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren, eingesetzt wird. Ein Vorteil dieser Ausführungsform liegt darin, dass sowohl für die Aufnahme der Häufigkeitsverteilungen) als auch das Durchführen der Amplifϊkationsreaktion in Schritt b) nur eine PCR notwendig ist, so dass das Verfahren schnell und ohne großen Pipettieraufwand durchgeführt werden kann. Ein Bei- spiel für eine geeignete Verfahrensführung ist eine Multiplex-PCR, wobei jedoch auch jede andere Amplifϊkationsreaktion, bei der die wenigstens zwei zueinander nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen gleichzeitig in einer Reaktion amplifϊziert werden können, eingesetzt werden können. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird für jede der wenigstens zwei zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen eine eigene PCR durchgeführt, so dass in jeder PCR nur ein Primerpaar eingesetzt wird. Zur Realisierung dieser Aus- führungsform wird in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Teilmengen einer biologischen Probe bereitgestellt, wobei jede Teilmenge die gleiche Menge an biologischem Material enthält, bevor die Teilmengen in die einzelnen PCR's eingesetzt werden. Ein Vorteil dieser Verfahrensführung liegt darin, dass sich die einzelnen Amplifikationen nicht gegenseitig beeinflussen können. Bei dieser Ausführungsform kann es, insbesondere wenn nur geringe Mengen an biologischer Probe, bspw. nur eine Zelle, zur Verfügung steht, notwendig sein, die biologische Probe vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah- rens mit einer unspezifischen PCR zu amplifizieren und das so erhaltene Reaktionsprodukt in die erforderliche Anzahl an Teilmengen zu unterteilen. Selbstverständlich müssen bei dieser Verfahrensführung die Referenzproben für die Aufnahme der Häufigkeitsverteilung gleichermaßen voramplifiziert und in Teilmengen portioniert werden.
Schließlich ist es gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass ein Teil der wenigstens zwei zueinander nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen in einer PCR und der andere Teil der wenigstens zwei zueinander nicht homologen, zu amplifizierenden Sequenzen jeweils in davon getrennten PCR's, wobei bei diesen PCR's jeweils nur ein Primerpaar eingesetzt wird, zu amplifizieren. Es handelt sich mithin bei dieser Verfahrensführung um eine Mischform der zuvor genannten Verfahrensformen. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass in Schritt c) bei der Bestimmung der Anzahl der unterschiedlichen PCR-Produkte pro Amplifikationsansatz jeweils zwei Informationen pro Amplifikationsansatz berücksichtigt werden, nämlich zum einen die An- bzw. Abwesenheit des entsprechenden PCR-Produktes sowie zum anderen die Information über einen zweiten, die einzelnen PCR-Produkte voneinander unterscheidenden Parameter, bspw. die Länge oder Sequenz der PCR-Produkte, weswegen im Vergleich zu einem entsprechenden Verfahren, bei dem nur die An- und Abwesenheit der einzelnen erhaltenen PCR- Produkte berücksichtigt wird, eine überraschend scharfe Häufigkeitsverteilung erhalten wird. Zur Bestimmung der An- bzw. Abwesenheit der wenigstens zwei zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen kann jedes dem Fachmann zu diesem Zweck geeignete Verfahren eingesetzt werden, wobei lediglich beispielsweise Gelelektrophorese, herkömm- liehe Hybridisierungstechniken, beispielsweise Hybridisierungsverfahren auf einem DNA-Array, einem Bead-System, sowie andere optische, elektrische oder elektrochemische Messungen genannt sind. Dabei kann es in Abhängigkeit von dem eingesetzten Detektionsverfahren zweckmäßig sein, Schwellenwerte zu definieren, oberhalb derer die Anwesenheit eines PCR- Produktes und unterhalb derer die Abwesenheit eines PCR-Produktes angenommen wird. Die Art des zweiten, die einzelnen PCR-Produkte voneinander individualisierenden Parameters hängt im wesentlichen von der Art der wenigstens zwei zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen ab. Werden beispielsweise die PCR-Primer in der wenigstens ei- nen Amplifikationsreaktion so gewählt, dass STR-Ab schnitte und/ oder VNTR-Abschnitte als zueinander nicht homologe Sequenzen amplifiziert werden, wird als zweiter Parameter bzw. Unterscheidungsmerkmal der einzelnen PCR-Produkte vorzugsweise die Länge der einzelnen PCR- Produkte gewählt, so dass die Bestimmung der Anzahl der erhaltenen un- terschiedlichen Amplifikationsprodukte gemäß Schritt c) die Prüfung auf An- bzw. Abwesenheit von PCR-Produkten sowie die Bestimmung der Länge der einzelnen PCR-Produkte umfasst, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Länge entspricht. Ein geeignetes Verfahren hierfür ist bspw. die Kapillarelektrophorese.
Werden hingegen bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion PCR- Primer eingesetzt, welche daran angepasst sind, wenigstens zwei zueinander nicht homologe SNP- Sequenzen zu amplifizieren, so ist das zweite Un- terscheidungsmerkmal bzw. der zweite Parameter vorzugsweise die Bestimmung der sich unterscheidenden Sequenz, die bei S NP-Ab schnitten üblicherweise auf ein Nukleotid beschränkt ist. Hierzu können alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren herangezogen werden, wobei lediglich beispielsweise DNA- Sequenzierung oder bekannte Hybridi- sierungsverfahren genannt seien. Bei dieser Ausführungsform entspricht somit die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Sequenz.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz und dazu homologer Sequenzen in einer Zelle, welches die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellen einer biologischen Probe, wobei die biologische Probe zwischen 1 und 100 Zellen und/oder zwischen 1 pg und 100 pg chromosomale DNA umfasst,
b) Durchführen wenigstens einer PCR, wobei die wenigstens eine PCR daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht ho- mologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst und aus der aus STR-Abschnitten, VNTR-Abschnitten, SNP- Abschnitten und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren,
c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Ampli- fϊkationsprodukte sowie
d) Vergleichen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Ampli- lϊkationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung, welche durch jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen PCR, wobei in der PCR die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde.
Da es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein statistisches Verfahren handelt, ist es vorteilhaft, die Ausgangsmenge und die PCR- Bedingungen, insbesondere hinsichtlich der Temperaturführung, Zyklen- zahl und der Bindungsaffinität der Primer, derart einzustellen, dass die einzelnen parallel vorgenommenen PCR-Reaktionen mit einer relativen Häufigkeit für ein positives Ergebnis von größer 0, aber kleiner 1 ablaufen. Hierdurch wird sichergestellt, dass mit minimalem experimentellen Aufwand eine statistische Auswertung mit höchstmöglicher Sicherheit und Zuverlässigkeit des erhaltenen Ergebnisses erreicht wird. Daher ist es be- vorzugt, die Bindungsaffinität der einzelnen PCR-Primer zu deren Primer- bindungsstellen sowie die sonstigen Parameter der PCR, insbesondere die Zyklenzahl und Temperaturführung, derart einzustellen, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen Amplifikationsreaktion für jede der zu amplifizierenden, wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, besonders bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 sowie ganz besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt.
Insbesondere wenn die Häufigkeitsverteilung vor den Schritten a) bis c) des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgenommen wurde, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, parallel zu der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) eine Amplifikationsreaktion unter den gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe durchzuführen, wobei die Kontroll- probe vorzugsweise zu einer bekannten Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten führt. So kann auf einfache Weise festgestellt werden, ob die wenigstens eine Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) ordnungsgemäß abgelaufen ist, oder möglicherweise durch einen Defekt an dem Thermocycler, gar nicht oder nur unzureichend stattgefunden hat.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, als biologische Probe einen Polkörper, vorzugsweise einen Polkörper nach der ersten Reifeteilung, einzusetzen. Da das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur quantitativen Bestimmung einer Kopienzahl einer vorbe- stimmten Sequenz und dazu homologer Sequenzen pro Zelle, insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl von Allelen pro Zelle, von 0, 1 oder größer gleich 2 bzw. 0, 1, 2 oder größer gleich 3 geeignet ist, ist dieses hervorragend dazu geeignet, durch eine Polkörperanalyse auf das Genom der entsprechenden Eizelle, aus der der Polkörper entnommen wurde, rückzuschließen. Dies ist deshalb von großer Bedeutung in der pränatalen Diagnostik, weil damit etwaige Chromosomenabberationen schon vor der m-wYro-Befruchtung erkannt werden können, wohingegen mit anderen bekannten Verfahren, wie beispielsweise der Amniozentese, entsprechende Chromosomen-Fehlverteilungen erst zu einem viel späteren Zeitpunkt festgestellt werden können.
Während der Eizellreifung wird der Chromosomensatz der anfänglich diploiden Eizelle zu einem haploiden Chromosomensatz reduziert. Während bei der ersten Reifeteilung die homologen Chromosomen getrennt werden, wobei ein haploider Chromosomensatz in der Eizelle verbleibt und der andere in Form des Polkörpers ausgeschleust wird, erfolgt bei der zweiten Reifeteilung die Trennung der einzelnen Chromatiden der in der Eizelle verbliebenen Chromosomen, wobei ein Satz an Chromatiden in Form des zweiten Polkörpers aus der Eizelle ausgeschleust wird, während der andere Satz an Chromatiden in der Eizelle verbleibt. Die beiden während den beiden Reifeteilungen aus der Eizelle in den perivitellinen Spalt der Eizelle transferierten Polkörper entsprechen somit in ihrem genetischen Aufbau einer Zelle, haben jedoch nur einen minimalen Zytoplas- maanteil. Während der erste Polkörper während der Ovulation entsteht, wird der zweite Polkörper erst drei bis vier Stunden nach der Penetration des Spermiums in die Eizelle ausgeschleust. Da Polkörper keinerlei Funktion haben und in der frühen Embryonalentwicklung ohnehin resorbiert werden, ist die Entnahme eines Polkörpers aus der Eizelle zum einen ohne Schädigung der Eizelle und ohne Gefahr einer negativen Beeinflussung der weiteren Entwicklung möglich und zudem nach dem deutschen Embryonenschutzgesetz für den Polkörper nach der ersten Reifeteilung zulässig. Insgesamt bietet die Polkörperuntersuchung demnach die Möglichkeit, schon in einem sehr frühen Stadium, nämlich vor Befruchtung der Eizelle, mögliche Chromosomen-Fehlverteilungen in der Eizelle zu diagnostizieren. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, schnell, einfach und zuverlässig Chromosomenfehlverteilungen in einer Eizelle über die Untersuchung eines daraus entnommenen Polkörpers nach der ersten Reifeteilung zu diagnostizieren. Hierzu kann beispielsweise ein einzelner Polkörper einer PCR unterzogen werden, wobei die PCR als Multiplex-PCR ausgelegt ist, in der bspw. acht verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, welche daran angepasst sind, acht zueinander nicht homologe STR- Sequenzen, die auf dem zu untersuchenden Chromosom, beispielsweise dem Chromosom 21, enthalten sind, zu amplifizieren. Alternativ dazu ist es selbstverständlich auch möglich, die acht zueinander nicht homologen STR-Sequenzen jeweils einzeln in acht verschiedenen PCR's zu amplifizieren. Für die genetische Ausstattung der Eizelle hinsichtlich des Chromosoms 21 sind folgende Möglichkeiten gegeben:
1) die Zelle enthält drei gleiche Allele (monoallelische Trisomie),
2) die Zelle enthält zwei gleiche Allele und ein dazu verschiedenes Allel (biallelische Trisomie),
3) die Zelle enthält drei unterschiedliche Allele (triallelische Trisomie), 4) die Zelle enthält zwei gleiche Allele (monoallelische Disomie
[gesunde homozygote Zelle]),
5) die Zelle enthält zwei unterschiedliche Allele (biallelische Disomie [gesunde heterozygote Zelle]) oder
6) die Zelle enthält kein Allel von Chromosom 21.
Erfindungsgemäß wird zunächst mit wenigstens zwei unterschiedlichen Referenzproben eine Häufigkeitsverteilung erstellt, wobei mit jeder Referenzprobe bspw. je 100 mal eine PCR mit den zur Amplifizierung von bspw. 8 zueinander nicht homologen STR-Sequenzen geeigneten Primer- paaren durchgeführt wird. Als Referenzproben können bspw. sechs ver- schiedene Polkörper, welche jeweils eine der vorgenannten genetischen Ausstattungen aufweisen, eingesetzt werden. Soll nur zwischen einer mo- noallelischen Disomie und einer biallelischen Disomie unterschieden werden, reicht es selbstverständlich aus, nur zwei entsprechende Referenz- proben zur Erzeugung der Häufigkeitsverteilung einzusetzen. Anschließend oder parallel zu der Aufnahme der Häufigkeitsverteilungskurven kann dann ein zu untersuchender Polkörper derselben Multiplex- PCR unterzogen werden und durch Vergleich der erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten mit der Häufigkeitsverteilung die Kopienzahl festgestellt werden.
Wie bereits angedeutet kann durch die Anpassung der Verfahrensbedingungen, beispielsweise die Anzahl der zu amplifizierenden, zueinander nicht homologen Sequenzen und die Anzahl der PCR-Zyklen, die Auflö- sung der Häufigkeitsverteilung auf einen gewünschten Wert eingestellt werden, so dass Überlappungen der Häufigkeitsverteilungskurven in dem interessierenden Bereich vermieden werden können.
Dies sei am Beispiel des folgenden Gedankenexperiments erläutert. Es wird gleichermaßen wie vorstehend unter Bezugnahme auf die Tabelle 1 erläutert vorgegangen, ausgenommen, dass die PCR mit den Referenzproben und der zu untersuchenden biologischen Probe mit jeweils 12 anstelle von 8 für eine Amplifikation zueinander nicht homologer STR-Sequenzen geeigneten Primerpaaren durchgeführt wird. Es wird bspw. folgende Häu- figkeitsverteilung erhalten: Tabelle 3
(Häufigkeitsverteilung mit 12 STR-Systemen und hoher Zyklenzahl)
n = Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe RP = Referenzprobe
Wie sich der Tabelle 3 entnehmen lässt, kann mit dieser Häufigkeitsverteilung für jedes für die zu untersuchende Probe erhaltene Ergebnis eindeu- tig die Anzahl an Sequenzkopien festgestellt werden. Durch die Erhöhung der Anzahl an zu amplifizierenden nicht homologen Sequenzen von 8 auf 12 wurde somit eine Aufspreizung der einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven erreicht unter Vermeidung einer partiellen Überlagerung der einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven, wie dies bei dem unter Bezugnahme auf Tabelle 1 geschilderten Gedankenexperiment für das Ergebnis ein oder vier unterschiedliche PCR-Produkte der Fall ist.
Ein weiterer wichtiger Parameter, der die Auflösung der Häufigkeitsverteilung beeinflusst, ist die bei der wenigstens einen PCR eingesetzte Zyklenzahl. Wird bspw. in dem vorgenannten unter Bezugnahme auf die Tabelle 3 dargelegten Gedankenversuch bei ansonsten gleichen Referenzproben und PCR-Bedingungen die Zyklenzahl der PCR von 30 auf 25 reduziert, wird bspw. die in der Tabelle 4 wiedergegebenen Häufigkeitsverteilung erhalten: Tabelle 4
(Häufigkeitsverteilung mit 12 STR-Systemen und niedriger Zyklenzahl)
n = Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe RP = Referenzprobe
Im Vergleich zu der in der Tabelle 3 wiedergegebenen Häufigkeitsverteilung liegen die einzelnen Häufigkeitsverteilungskurven in der Tabelle 4 näher zueinander und überschneiden sich zumindest teilweise. So lässt dieses Gedankenexperiment nur in den Fällen eine klare Aussage über die Kopienzahl zu, in denen mit der zu untersuchenden Zelle 0 PCR-Produkte, 2 bis 5 verschiedene PCR-Produkte oder 7 oder mehr PCR-Produkte erhalten werden, wobei bei 0 PCR-Produkten die Kopienzahl an Chromosom 21 in der biologischen Probe mit der erforderlichen Sicherheit bei 0, bei 2 bis 5 verschiedenen PCR-Produkten die Kopienzahl bei 1 und bei 7 oder mehr verschiedenen PCR-Produkten die Kopienzahl bei 2 liegt. Hingegen ist, wenn für die zu untersuchende Probe 1 oder 6 verschiedene PCR- Produkte erhalten werden, keine klare Aussage möglich, wie viele Kopien an Chromosom 21 die Probe tatsächlich enthält.
Wie der Fachmann erkennt, lässt sich durch die Einstellung der PCR- Bedingungen und die Festlegung der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen zu amplifizierenden Sequenzen die Breite der Häufig- keitsverteilungskurven und der Abstand der verschiedenen Häufigkeitsverteilungskurven zueinander nahezu beliebig einstellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur quanti- tativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, welches zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Erfindungsgemäß umfasst dieses Kit:
a) wenigstens zwei Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, b) ggf. PCR-Puffer, c) ein Protokoll für die Durchführung der wenigstens einen PCR und d) wenigstens eine Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in dem Protokoll c) für die zu untersuchende biologische Probe vorgeschriebenen wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Ampli- fikationsreaktionen die gleiche wie in dem Protokoll c) vorgeschriebene Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Kits gemäß der vorliegenden Erfindung sind die wenigstens zwei Primerpaare daran an- gepasst, in der wenigstens einen PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich zu amplifizieren. Insbesondere wenn die zueinander nicht homologen Sequenzen hochgradig polymorph sind, werden gute Ergebnisse erhalten. Besonders bevorzugt sind die wenigstens zwei Primerpaare dazu angepasst, aus der aus STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP- Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, dass die wenigstens zwei Primerpaare und/ oder das Protokoll derart ange- passt sind, dass in der PCR 2 bis 100, besonders bevorzugt 2 bis 20, ganz besonders bevorzugt 3 bis 15 und höchst bevorzugt 5 bis 12 zueinander nicht homologe Sequenzen amplifiziert werden.
Aus den bereits dargelegten Gründen ist es zudem bevorzugt, die we- nigstens zwei Primerpaare und/ oder das Protokoll daran anzupassen, dass die relative Häufigkeit der wenigstens einen PCR für jede der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, besonders bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 und ganz besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt.
Zudem hat es sich als vorteilhaft erwiesen, das Protokoll der PCR und/ oder die wenigstens eine Häufigkeitsverteilung daran anzupassen, um zu bestimmen, ob die biologische Probe die vorbestimmte Sequenz in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1 oder mindestens 2 o- der in einer Kopienzelle pro Zelle von 0, 1 , 2 oder mindestens 3 enthält.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung, umfassend
a) einen festen Träger, vorzugsweise einen Glasträger, b) wenigstens zwei auf dem Träger immobilisierte Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, sowie c) eine bspw. elektronisch gespeicherte Häufigkeitsverteilung, welche durch jeweils mehrmaliges Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe er- haltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsproduk- te erhalten wurde oder d) wenigstens zwei auf dem Träger räumlich getrennt voneinander immobilisierte Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, vonein- ander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen.
Vorzugsweise sind die Primerpaare und /oder die Referenzproben auf dem Träger über nicht-chemische Bindungen immobilisiert. Im Folgenden wird die Erfindung anhand eines den Erfindungsgedanken erläuternden, diesen jedoch nicht einschränkenden Beispiels erläutert.
Beispiel (Erstellung einer Häufigkeitsverteilung)
a) Durchführung der PCR-Reaktionen
Einzelne Lymphozyten eines Individuums wurden unter mikroskopischer Kontrolle als Referenzproben auf den einzelnen Amplifikationsankern eines AmpliGrid-Glasträgers, einem von der Firma Advalytix AG kommerziell vertriebenen Glasstreifens zur Durchführung paralleler automatisierter PCR-Reaktionen, abgelegt, wobei ein Amplifikationsanker z.B. eine derart vorbehandelte Teilfläche ist, dass sich eine Flüssigkeit bevorzugt darauf aufhält. Dabei wurden pro Amplifikationsanker 1 bis 6 Lymphozyten abgelegt, wobei zusätzlich auf einigen Ankern Negativkontrollen bestehend aus Systemflüssigkeit ohne Lymphozyten platziert wurde. Dabei wurden jeweils Mehrfachbestimmungen ausgeführt, wobei 21 Negativkontrollen ohne Lymphozyten, 27 Proben mit je einem Lymphozyten, 42 Pro- ben mit je zwei Lymphozyten, 35 Proben mit je drei Lymphozyten, 31 Proben mit je vier Lymphozyten, 17 Proben mit je fünf Lymphozyten und 6 Proben mit je 2 Lymphozyten, also insgesamt 175 Proben, auf dem Glasträger verteilt wurden.
Anschließend wurde auf die einzelnen mit den Proben versehenen Amplifikationsanker aus einem PCR-Mastermix eine 1 μl Teilmenge der nachfolgenden Zusammensetzung pipettiert.
Danach wurden die einzelnen PCR-Tropfen mit je 5,2 μl Mineralöl (Cove- ring Solution, Fa. Advalytix AG) überschichtet. Hierzu wurde das Mineralöl zunächst so pipettiert, dass es in Form eines Tropfens an der Pipettenspitze hing, bevor mit diesem Tropfen der PCR-Tropfen berührt wurde, bis dieser von dem Mineralöl gleichmäßig überdeckt war.
Daran anschließend wurde mit den einzelnen Proben eine PCR mit den nachfolgenden Temperaturprofil durchgeführt:
600C 30 Min.
20 0C 5 Min.
8° C OO
* 0,5 °C/Sek. + 0,0 0C/ Sek. ** 0,3 0C/ Sek. + 0,0 "C/ Sek.
Nach der Amplifikation wurde das Gesamtvolumen der einzelnen Reaktionen jeweils mit 4 μl Wasser (bidest.) versetzt. Dabei vermengte sich das Wasser mit der wässrigen Phase der Probe. Die gesamten Reaktionsvolumina einschließlich des Mineralöls wurden dann in verschiedene Gefäße einer Mikro titerplatte übertragen.
b) Bestimmung der Anzahl an erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkten
Die einzelnen Reaktionsvolumina der Mikrotiterplatte wurden mit jeweils 19 μl Formamid + lμl ILS 600 (interner Fluoreszenzstandard, Fa. Applied Biosystems) kurz denaturiert und bei Standardbedingungen in einem Ka- pillarsequenzer ABI 3100 (Fa. Applied Biosystems) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Ergebnisse wurden in Form von Genotyperfiles gespeichert, wobei die Erkennung von relevanten Signalen und deren Zuordnung zum Standard automatisch durch die Genotyper Software (Fa. Applied Biosystems) erfolgte. Bekanntermaßen werden die Fluoreszenzsignale immer gegen einen Hintergrund von Fluoreszenz gemessen, wobei wie in jeder Messung das Signal- /Rausch- Verhältnis entscheidend ist. Dieses wird von der Software nicht angegeben. Als untere Grenze (Schwellenwert) eines rele- vanten Signals wurden in diesem Experiment 500 relative Lumineszenzeinheiten festgelegt. Es wurden die automatisch erkannten Allele je Amplifikation für alle Systeme ausgezählt und die Anzahl positiver Reaktionen in Bezug zur Zellzahl gesetzt.
Dabei wurde folgendes Ergebnis erhalten:
In der Tabelle bedeuten:
Lymphozytenzellen /Anker: die Anzahl der pro Amplifikationsanker abgelegten Zellen. Im Fall diploider Lymphozyten sind das je Zelle genau 2 Kopien einer homologen Sequenz. Diese beiden Kopien stehen für die PCR als Starttemplate zur Verfügung und können beide amplifiziert werden. Sind die beiden Kopien sequenzidentisch, so erfasst man bei der Kapillarelektrophorese genau einen Peak. Unterscheiden sich die beiden Kopien in ihrer Länge (heterozygoter Fall), so können zwei verschiedene Längen einer homologen Sequenz amplifiziert werden. Es entstehen daher zwei Peaks. Die hier analysierten Gruppen O, 1, 2, 3, 4, 5, 6 unterscheiden sich in der Anzahl der Startkopien also um jeweils 2 Kopien (1 Zelle: 2 Kopien, 2 Zellen: 4 Kopien etc.).
N: Anzahl der Einzelreaktionen, die mit einer definierten Zellzahl begonnen wurden. Da die Zellen zufällig abgelegt wurden, gibt es unterschiedliche Stichprobengrößen. Der Fall "6 Zellen" wurde nur zweimal vorgelegt, der Fall "5 Zellen" 17-mal usw. Die statistische Analyse berücksichtigt dies.
Mean: Mittelwert der Anzahl positiver Signale (Peaks, die softwaregestützt automatisch gefunden wurden), d.h. Mittelwert der Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten.
Standardabweichung: Standardabweichung von dem vorgenannten Mittelwert als Maß für die Streuung um den Mittelwert. Die nachfolgend beschriebene Varianzanalyse (ANOVA) benutzt diese drei Größen, um statistisch signifikante Unterschiede zu berechnen und die Aussage zu treffen, ob sich die Mittelwerte tatsächlich un- terscheiden. Statistisch gesprochen möchte man die Hypothese prüfen, ob es sich z.B. bei den Stichproben "2 Zellen vorgelegt" und "4 Zellen vorgelegt" um verschiedene Grundgesamtheiten handelt.
Für den Fall "0 Kopien vorgelegt" gab es in 21 Experimenten einmal den Fall, dass ein Einzelpeak detektiert wurde. Dies ist ein falsch positives Ergebnis, das zustande kommt durch
a. eine Kontamination mit humaner DNA; allerdings erfasst der Po- werPlex Kit bis zu 16 unterschiedliche Sequenzabschnitte in einer Reaktion. Eine Kontamination hätte also mit einer einzigen Sequenz (physikalisch z.B. einem Chromosom) stattgefunden, was sehr unwahrscheinlich ist, oder dadurch, dass b. die Kapillarelektrophorese fälschlicherweise ein Signal angezeigt hat; dies kann ein Spannungspuls während der Elektrophorese sein oder eine Verunreinigung im Gel durch ein Fluoreszenzpartikel unbekannter Herkunft, dass als Peak interpretiert wird.
Jedenfalls ergibt sich deshalb für den Fall "0 Kopien vorgelegt" ein positiver Wert und eine positive Standardabweichung. Ohne ein falsch positives Signal wären Mittelwert und Standardabweichung 0.
Die Letzte Zeile "Gesamt" summiert die vorgenannten Werte auf.
c) Varianzanalyse über alle Daten
Mit den vorgenannten Daten wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Die Varianzanalyse beruht auf einem Vergleich der Varianzen (oder Standardabweichungen) innerhalb einer Gruppe (within groups) mit den Varianzen zwischen den Gruppen (between groups). Dabei wurde folgendes Ergebnis erhalten:
Dabei bezeichnen:
Sum of Squares die Summen der Abweichungsquadrate,
Df die Anzahl Freiheitsgrade (degrees of freedom) und
Mean Square die mittleren Summen der quadratischen Abweichungen. Der F-Wert schließlich setzt die Abweichungen innerhalb der Gruppen und zwischen den Gruppen ins Verhältnis (1273.035 / 33.33 = 38.194). Ob der Wert für eine bestimmte Anzahl von Freiheitsgraden einen signifi- kanten Unterschied zwischen den Gruppen anzeigt, ist in einer Tabelle nachzuschlagen (z.B. J. Bortz: Statistik für Sozialwissenschaftler, Springer Verlag). In diesem Fall ist der Unterschied hochsignifikannt (P = 0.000).
Dieses Ergebnis zeigt, dass es hochsignifkante Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen von unterschiedlichen Zellzahlen gibt.
d) Scheffe Test
Um eine Aussage zu treffen, zwischen welchen Gruppen die Unterschiede wirklich bestehen, wurde mit den erhaltenen Ergebnissen ein Scheffe Test durchgeführt. Das Ergebnis des Tests nach Scheffe sagt aus, zwischen welchen Gruppen in paarweisen Vergleichen signifikante Unterschiede vorliegen. Dazu werden die mittleren Unterschiede zwischen zwei Gruppen
(mean difference I-J) sowei deren Standardfehler (Std. Error) dargestellt. Es wurde eine Signifikanzgrenze von 0,05 gewählt.
Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
The mean difference is significant at the .05 level.
Die Tabelle ist wie folgt zu interpretieren:
Diejenigen Gruppen, zwischen denen die "significance" weniger als 0,05 beträgt, sind voneinander signifkant verschieden, wohingegen bei den anderen Gruppen keine Unterscheidung auf dem gewählten Signifikanzniveau möglich ist. Beispielsweise ist die Gruppe "O Zellen" ist von allen anderen signifikant verschieden (erster Block). Eine qualitative Entscheidung ist also möglich (0 Kopien gegen alle anderen Fälle).
Die Gruppe " 1 Zelle" unterscheidet sich von den Gruppen "0 Zellen", "3 Zellen", "4 Zellen", "5 Zellen" und "6 Zellen". Eine Unterscheidung 1 Zelle / 2 Zellen ist so hingegen nicht möglich, da die "significance" zwischen diesen Gruppen 0,264 beträgt.
Durch Änderung der PCR-Bedingungen, insbesondere Zyklenzahl, und können die einzelnen Gruppen den Anforderungen entsprechend so voneinander getrennt werden, dass diese voneinander signifikant verschiedenen sind.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. von zu der vorbestimmten Sequenz homologen Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur Bestimmung der absoluten Kopienzahl von Allelen pro Zelle, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen einer definierten Menge einer biologischen Probe, b) Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte sowie d) Vergleichen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsvertei- hing, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Amplifikationsreaktionen die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial einge- setzt wurde/wird, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen An- zahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde /wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die vorbestimmte Sequenz eine Nukleinsäuresequenz, bevorzugt ein Chromosom, ein Gen oder ein Genabschnitt, ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR-Reaktion ist.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) eine bei der Durchführung einer PCR zu einem "allelic dropouf führende Menge an biologischer Probe bereitgestellt wird.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte biologische Probe weniger als 100 pg DNA, bevorzugt weniger als 50 pg DNA, besonders bevorzugt weniger als 10 pg DNA und ganz besonders bevorzugt weniger als 5 pg DNA umfasst.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) eingesetzte biologische Probe weniger als 100 Zellen, bevorzugt weniger als 10 Zellen, besonders bevorzugt weniger als 5 Zellen und ganz besonders bevorzugt 1 Zelle umfasst.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Häufigkeitsverteilung aus mit wenigstens zwei Referenzproben mit definierter, sich voneinander unterscheidender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz erhaltenen Häufigkeitsverteilungskurven besteht, wobei jede der Häufigkeitsverteilungskurven die Wahrscheinlichkeit für den Erhalt jeder zwischen O und der theoretisch möglichen Maximalzahl liegenden Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten für eine definierte Kopienzahl angibt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Häufigkeitsverteilung aus der Angabe der Mittelwerte der mit den einzelnen Referenzproben mit definierter, sich voneinander unterscheidender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz bei der Mehrfachbestimmung erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten und ggf. Angabe der Standardabweichung besteht.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Häufigkeitsverteilung wenigstens 3, bevorzugt wenigstens 4, besonders bevorzugt 4 bis 20 und ganz besonders bevorzugt 4 bis 10 Referenzproben mit bekannter, sich jeweils voneinander unterscheidender Kopienzahl an der vorbestimmten Sequenz eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Erstellung der in Schritt d) eingesetzten Häufigkeitsverteilung die wenigstens eine Amplifikationsreaktion 2 bis 1.000 mal, bevorzugt 10 bis 250 mal, besonders bevorzugt 50 bis 150 mal und ganz besonders bevorzugt etwa 100 mal für jede Referenzprobe durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Häufigkeitsverteilung parallel zu der Durchführung der Schritte a) und c) erfolgt oder bereits vor Schritt a) durchgeführt wurde.
12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu ange- passt ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich zu amplifϊzieren.
13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu ange- passt ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe hochpolymorphe Sequenzen zu amplifϊzieren.
14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu ange- passt ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche aus der aus STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP- Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu ange- passt ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche in dem Genom des Spenders jeweils pro Allel nur einmal vorkommen.
16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu ange- passt ist, zwischen 2 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20, besonders bevorzugt zwischen 3 und 15 und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 12 zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifϊzieren.
17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der zu bestimmenden Kopien der vorbestimmten Sequenz in der biologischen Probe zwischen 0 und 100, bevorzugt zwischen 0 und 25, besonders bevorzugt zwischen 0 und 10 und ganz beson- ders bevorzugt zwischen 0 und 5 beträgt.
18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Art und Durchführung der Amplifikationsreaktion sowie die Menge an eingesetzter biologischer Probe daran angepasst sind, zu bestimmen, ob die biologische Probe die vorbestimmte Sequenz in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1 oder mindestens 2 oder in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1, 2 oder mindestens 3 enthält.
19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass in Schritt b) eine PCR durchgeführt wird, in der eine der
Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Primerpaaren, welche dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren, eingesetzt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) eine der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Teilmengen einer biologischen Probe bereitgestellt wird, wobei jede Teilmenge die gleiche Menge biologisches Material enthält, und in Schritt b) mit jeder der Teilmengen eine PCR, in der jeweils ein Primerpaar eingesetzt wird, durchgeführt wird, wobei die in den verschiedenen PCR's eingesetzten Primerpaare dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) wenigstens zwei, aber eine geringere als die der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Teilmengen einer biologischen Probe bereitge- stellt wird, wobei jede Teilmenge die gleiche Menge biologisches Material enthält, und in Schritt b) mit jeder der Teilmengen eine PCR, in der jeweils wenigstens ein Primerpaar, aber eine geringere als die der Anzahl der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen entsprechende Anzahl an Primerpaaren eingesetzt wird, wobei die in den verschiedenen PCR's eingesetzten Primerpaare dazu angepasst sind, die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zu amplifizieren.
22. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe vor Durchführung des Verfahrens- Schritts a) mit einer unspezifischen PCR amplifiziert wird und ggf. das so erhaltene Reaktionsprodukt in die erforderliche Anzahl an Teilmengen unterteilt wird.
23. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass die An- bzw. Abwesenheit von Amplifikationsprodukte mittels Gelelektrophorese, mittels einer Hybridisierungstechnik auf einem DNA-Array, einem Bead-System oder einer anderen optischen, elektrischen oder elektrochemischen Messung erfolgt.
24. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte nach der Amplifikationsreaktion die An- bzw. Abwesenheit der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen sowie von den erhaltenen Amplifikationsprodukten ein zweiter physikalisch und/ oder chemisch messbarer Parameter bestimmt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen STR-Ab schnitte und/ oder VNTR-Abschnitte sind und als zweiter Parameter die Länge der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt wird, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Länge entspricht.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die
Länge der Amplifikationsprodukte mit Kapillarelektrophorese bestimmt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen SNP- Abschnitte sind und als zweiter Parameter die Sequenz der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt wird, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Sequenz entspricht.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz der Amplifikationsprodukte durch DNA-Sequenzierung oder ein Hybridisierungsverfahren bestimmt wird.
29. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz und dazu homologer Sequenzen in einer Zelle, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer biologischen Probe, wobei die biologische Probe zwischen 1 und 100 Zellen und /oder zwischen 1 pg und 100 pg chromosomale DNA umfasst, b) Durchführen wenigstens einer PCR, wobei die wenigstens eine PCR daran angepasst ist, wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst und aus der aus STR-Abschnitten, VNTR-Abschnitten, SNP-Abschnitten und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen
Amplifikationsprodukte sowie d) Vergleichen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchfüh- ren der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen PCR, wobei in den PCR's die gleiche wie in Schritt a) genannte Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei ver- schiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukte erhalten wurde.
30. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Parameter in der PCR in Schritt b) derart gewählt werden, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion für jede der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen je- weils zumindest im Wesentlichen gleich ist.
31. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Parameter in der PCR in Schritt b) derart gewählt werden, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen Amplifikationsreaktion für jede der wenigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 sowie besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt.
32. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass parallel zu der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) eine Amplifikationsreaktion unter gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe durchgeführt wird.
33. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Probe ein Polkörper, bevorzugt ein Polkörper nach der ersten Reifeteilung, eingesetzt wird.
34. Kit zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 32, umfassend:
a) wenigstens zwei Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz um- fasst sind, zu amplifizieren, b) ggf. PCR-Puffer, c) ein Protokoll für die Durchführung der wenigstens einen PCR und d) wenigstens eine Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in dem Protokoll c) für die zu untersuchende biologische Probe vorgeschriebenen wenigstens einen Amplifikationsreaktion, wobei in den Ampli- fikationsreaktionen die gleiche wie in dem Protokoll c) vorgeschriebene Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wurde.
35. Kit nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Primerpaare dazu angepasst sind, in der wenigstens einen PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich, bevorzugt hochpolymorphe zueinander nicht homologe Sequenzen, welche besonders bevorzugt aus der aus STR- Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren.
36. Kit nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Primerpaare gemäß a) und/ oder das Protokoll gemäß c) daran angepasst ist, in der wenigstens einen PCR zwischen 2 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20, besonders bevorzugt zwischen 3 und 15 und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 12 zueinander nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
37. Kit nach einem der Ansprüche 34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Primerpaare gemäß a) und/ oder das Protokoll gemäß c) daran angepasst ist, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen PCR für jede der we- nigstens zwei zueinander nicht homologen Sequenzen zwischen 0,2 und weniger als 1, bevorzugt zwischen 0,4 und 0,6 sowie besonders bevorzugt etwa 0,5 beträgt.
38. Kit nach einem der Ansprüche 34 bis 37, dadurch gekennzeich- net, dass die wenigstens eine Häufigkeitsverteilung gemäß d) und/oder das Protokoll der PCR gemäß c) daran angepasst sind, zu bestimmen, ob die biologische Probe die vorbestimmte Sequenz in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1 oder mindestens 2 oder in einer Kopienzahl pro Zelle von 0, 1 , 2 oder mindestens 3 enthält.
39. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere geeignet zur Durchführung eines
Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 32, umfassend
a) einen festen Träger, vorzugsweise einen Glasträger, b) wenigstens zwei auf dem Träger immobilisierte Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR wenigstens zwei zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, sowie c) eine gespeicherte Häufigkeitsverteilung, welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Re- ferenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiede- ne Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukte erhalten wurde oder wenigstens zwei auf dem Träger räumlich getrennt voneinander immobilisierte Referenzproben, wobei die wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen.
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