EP1879934A1 - Nanoskalige fluoreszierende melaminpartikel - Google Patents

Nanoskalige fluoreszierende melaminpartikel

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EP1879934A1
EP1879934A1 EP06724440A EP06724440A EP1879934A1 EP 1879934 A1 EP1879934 A1 EP 1879934A1 EP 06724440 A EP06724440 A EP 06724440A EP 06724440 A EP06724440 A EP 06724440A EP 1879934 A1 EP1879934 A1 EP 1879934A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
particles
nanoscale
streptavidin
melamine
formic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06724440A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Armin Kuebelbeck
Juliane Riedel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1879934A1 publication Critical patent/EP1879934A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent
    • C09K11/02—Use of particular materials as binders, particle coatings or suspension media therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B1/00—Nanostructures formed by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G12/00—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen
    • C08G12/02—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen of aldehydes
    • C08G12/26—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen of aldehydes with heterocyclic compounds
    • C08G12/30—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen of aldehydes with heterocyclic compounds with substituted triazines
    • C08G12/32—Melamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G12/00—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen
    • C08G12/02—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen of aldehydes
    • C08G12/40—Chemically modified polycondensates
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    • C08J3/12—Powdering or granulating
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    • C09K11/00—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2361/00—Characterised by the use of condensation polymers of aldehydes or ketones; Derivatives of such polymers
    • C08J2361/20—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Definitions

  • the invention relates to nanoscale melamine-formaldehyde particles (MF particles) having a particle diameter of 10 to 95 nm, which may contain fluorescent dyes and are preferably monodisperse and a process for their preparation.
  • MF particles nanoscale melamine-formaldehyde particles
  • Fluorescent substances have numerous applications, especially in biochemistry.
  • a fluorescent chemical group can be attached to biomolecules by a chemical reaction, which then serves as a very sensitive marker for this molecule.
  • antibodies are provided with a fluorescent chemical group so that the sites to which the antibodies bind are recognizable by fluorescence. The antigen concentration can thus even be determined quantitatively.
  • fluorescent markers it is possible to detect different biomolecules in a cell. The markers fluoresce in different colors and thus the fluorescence distribution can be determined e.g. in the tissue, observe under the fluorescence microscope.
  • the object of the present invention was to produce fluorescently labeled nanoparticles with the smallest possible diameter ( ⁇ 100 nm). Streptavidin should then be immobilized on these particles in order to detect biotin-labeled proteins.
  • the nanoparticles should be so small that they can be used in microarrays. A monodisperse size distribution and the largest possible fluorescence should be the goal of the particle synthesis. Streptavidin labeled with fluorescent dyes already exists, but the resulting measurement signal is very small. In contrast, a nanoparticle (diameter ⁇ 100 nm) may contain many fluorescent dye molecules. Thus, a highly sensitive method for protein detection would be available.
  • biotin-streptavidin is particularly well suited for such verifications, as it is well studied and the Affinity between biotin (vitamin H) and streptavidin is very high.
  • the binding between biotin and streptavidin is very strong, so that the binding partners do not dissociate before the measurement is complete.
  • fluorescent melamine-formaldehyde particles are used in diagnostics as support materials and are also marketed by a number of companies, for example Sigma-Aldrich or MicroParticles.
  • the offered MF-particles are in the range of 1 to 15 ⁇ m. So far unknown are MF particles, which have a particle diameter significantly smaller than 1 ⁇ m.
  • polystyrene-based fluorescent microspheres are predominantly known (for example from Merck Estapor), which however have the disadvantage that the smallest diameters of about 0.1 ⁇ m are not monodisperse.
  • melamine-based nanoparticles still have some other advantages over polystyrene-based materials.
  • fluorescent dyes can be easily incorporated into the MF particles (see WO 03/074614). They can not be washed out. It is believed that dyes in the particles are not covalently bound, such as in silica particles, but only included.
  • DD-224 602 discloses a process for preparing monodisperse melamine-formaldehyde latices having particle sizes in the range from 0.1 to 15 ⁇ m, the MF particles being obtained by polycondensation of melamine and formaldehyde in aqueous medium with weakly concentrated formic acid (0.87%). getting produced. Furthermore, the functionalization of these latexes and the incorporation of dyes, in particular fluorescent dyes, is described. The functionalization of MF particles can be done in two ways.
  • a hydrophilic substance having the desired functionality can be added. This is integrated into the particles. There will be functional groups on the surface, but some of this substance will be trapped inside the particle. In this type of functionalization, it is difficult to assign the occupancy
  • the particles can be subsequently functionalized.
  • the melamine resin particles are reactive groups. These can be demonstrated, for example, by the
  • nanoscale MF particles with a particle diameter of 10 to 95 nm, which contain one or more hydrophilic organometallic or organic fluorescent dyes.
  • the MF particles preferably have a diameter of 30 to 50 nm and are monodisperse.
  • Melamine resins are based on the 1,3,5-triamino-2,4,6-triazine basic body. With 2-6 moles of formaldehyde per mole of melamine, a methylolated melamine can be prepared. Since the methylolmelamines are less stable in water, they are etherified in commercially available products. Methanol-etherified melamines are readily soluble in water, whereas etherified with butanol are readily soluble in organic solvents.
  • melamine-formaldehyde resin (Madurit SMW 818 Fa. Surface Specialties) is a 75% aqueous solution.
  • the molar ratio of melamine to formaldehyde is in the range from 1: 2.8 to 1: 3.8 and 45-55% of all methylol groups are methanol etherified.
  • the preparation of monodisperse melamine particles is described, for example, in DD-224 602. As already mentioned, they can be easily functionalized during the polycondensation, wherein the polycondensation in the Acid takes place.
  • the size of the particles can be influenced by the type and concentration of the Methylolmelamins used, the pH and the temperature at the acid addition. Higher temperatures, lower pH, melamine resin with many methylol groups and low resin concentration shift the reaction towards smaller particles.
  • the nanoscale MF particles of the invention are prepared by stirring MF resin at temperatures in the range between 60 to 8O 0 C in a sufficiently large amount of water and then mixed with 98 to 100% formic acid, so that particles with a diameter between 10 and 95 nm arise.
  • Formic acid has proven to be a useful condensation initiator because it allows the results to be reproducible.
  • results can not be reproduced with hydrochloric acid - which has a significantly higher pKA value.
  • Preference is given to 15 to 20 wt.% Concentrated formic acid (ie 98 to 100%) to.
  • hydrophilic organometallic or organic fluorescent dyes are added to the MF particles prior to reaction with concentrated formic acid.
  • the dyes need not be modified beforehand because they are included in the particles, but not covalently bound.
  • the dyes need only be hydrophilic.
  • hydrophilic organic dyes for example
  • Fluorescent dyes such as rhodamine B and rhodamine derivatives (red), fluorescein and fluorescein derivatives (yellow), aminomethylcoumarin and coumarin derivatives (blue) can be used.
  • organometallic dyes it is possible to use, for example, terbium 3+ tiron complex (green) and europium tris dipicolinate (red).
  • Streptavidin can be attached to particles by a one-step reaction or a two-step reaction (see GT Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques (1992)).
  • EDC N- (3-dimethylamino-propyl) -N ⁇ ethylcarbodiimide
  • NHS N-Hydroxysuccinimide
  • EDC can react with both a carboxyl group on an MF particle and with one on streptavidin. Therefore, theoretically, two or more streptavidin molecules can be cross-linked with each other, which would then no longer be available for reaction with the MF particle surface.
  • a two-stage reaction can be carried out, as previously mentioned. First, the nanoscale MF particles are reacted with EDC and NHS, and the excess reagents are washed out so that EDC can not react with streptavidin. Only then is the streptavidin solution added. Since only the particle surface is activated, the Streptavidinmoleküle can only react with this.
  • the nanoscale, preferably monodisperse and fluorescent MF particles can be used as carrier material for the production of biomarkers, inkjet inks, as fluorescence markers in and on everyday objects of all kinds (eg documents and / or bills) and / or as adsorption material for chromatographic separations for chromatographic applications also the non-fluorescent MF particles suffice.
  • the particles obtained after purification by ultrafiltration (30 kDalton membrane) have a mean diameter of about 40 nm measured in a scanning electron microscope.
  • Example 2 The particles obtained after purification by ultrafiltration (30 kDalton membrane) have a mean diameter of about 40 nm measured in a scanning electron microscope.
  • Solid are weighed into an Eppendorf-Cap, suspended in 1 ml of 50 mM MES buffer (2-morpholinoethanesulfonic acid (Merck) pH 5.5) and then centrifuged off in an ultracentrifuge at 60,000 min -1 The supernatant is discarded and the washing process The particles are then resuspended in 1 ml of protein solution (10 mg / ml streptavidin in MES buffer) and transferred to a sealable glass tube The particles are kept in suspension for 30 minutes by rolling Then 100 ⁇ l of EDC solution (10 mg / ml of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide (Merck) in distilled water or MES buffer, prepared immediately before use) The particles are kept in suspension overnight at room temperature, the EDC reacts with the Carboxyl groups on the particle surface and the streptavidin with the resulting conjugate The sample is centrifuged again and the
  • the particles are resuspended in 1 ml of protein solution and rolled overnight at room temperature.
  • the counterparts are resuspended in 1 ml of MES buffer (no addition of EDC / NHS and protein solution) and rolled overnight.
  • the sample is centrifuged and, after addition of 1 ml of ethanolamine solution, the sample is rolled for one more hour before being centrifuged again.
  • Ethanolamine reacts with the remaining activated esters to form amides. Thereafter, it is washed three times with 1 ml of PBS buffer. Then the particles are resuspended once more in PBS buffer and can be stored at 4 0 C in the refrigerator.
  • Example 5 Example 5:
  • fluorescein-biotin is added to the particle suspension.
  • the samples are transferred to a microtiter plate in order to be able to measure them in the fluorescence spectrometer.
  • 125 ul PBS buffer are placed in each well and then added to 75 ul of the supernatant from the Eppendorf Cap. From each sample, a duplicate determination is made.
  • the zero value is 200 ⁇ l PBS buffer, the maximum value 75 ⁇ l of the biotin fluorescein solution in 125 ⁇ l PBS buffer.
  • the unbound biotin is determined. From this value one can calculate the quantity of the bound Biotins, since one knows by the maximum value, how much Biotin on the sample was given.
  • biotin-coated particles are again washed with 200 ul 1 M NaCl and centrifuged. 2 ⁇ 75 ⁇ l of the supernatant are again measured in 125 ⁇ l PBS buffer. This value must be deducted in the evaluation of the value of the bound biotin.
  • the biotin which can be reconstituted with 1 M NaCl, was only adsorbed nonspecifically on the surface.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung sind nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel, wobei diese einen Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm besitzen und Fluoreszenzfarbstoffe enthalten, ein Verfahren zur deren Herstellung sowie deren Verwendung als Trägermaterial zur Herstellung von Biomarker, Inkjet Tinten, Fluoreszenzmarker und/oder als Adsorptionsmaterial für chromatographische Trennungen.

Description

Nanoskalige fluoreszierende Melaminpartikel
Gegenstand der Erfindung sind nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel (MF-Partikel) mit einem Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm, die Fluoreszenzfarbstoffe enthalten können und vorzugsweise monodispers sind sowie ein Verfahren zur deren Herstellung.
Fluoreszierende Substanzen haben zahlreiche Anwendungen vor allem in der Biochemie. An Biomoleküle kann durch eine chemische Reaktion eine fluoreszierende chemische Gruppe angehängt werden, die dann als sehr sensitiver Marker für dieses Molekül dient. In der Immunologie werden Antikörper mit einer fluoreszierenden chemischen Gruppe versehen, so dass die Orte, an die die Antikörper binden, anhand der Fluoreszenz erkennbar sind. Die Antigen-Konzentration kann damit sogar quantitativ bestimmt werden. Mit fluoreszierenden Markern ist es möglich unterschiedliche Biomoleküle in einer Zelle nachzuweisen. Die Marker fluoreszieren in verschiedenen Farben und so lässt sich die Fluoreszenzverteilung z.B. im Gewebe, unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es fluoreszenzmarkierte Nanopartikel mit einem möglichst kleinen Durchmesser (< 100nm) herzustellen. An diesen Partikeln sollte dann Streptavidin immobilisiert werden, um damit dann biotinmarkierte Proteine nachzuweisen. Die Nanopartikel sollten so klein sein, dass sie in Microarrays eingesetzt werden können. Eine möglichst monodisperse Größenverteilung und eine möglichst große Fluoreszenz sollten das Ziel der Partikelsynthese sein. Mit Fluoreszenzfarbstoffen markiertes Streptavidin gibt es bereits, allerdings ist dabei das resultierende Messsignal sehr klein. In einem Nanopartikel (Durchmesser <100nm) hingegen können viele Fluoreszenzfarbstoff- Moleküle enthalten sein. Somit stünde eine hochempfindliche Methode zum Proteinnachweis zur Verfügung. Das System Biotin-Streptavidin eignet sich besonders gut für solche Nachweise, da es sehr gut untersucht ist und die Affinität zwischen Biotin (Vitamin H) und Streptavidin sehr hoch ist. Die Bindung zwischen Biotin und Streptavidin ist sehr fest, so dass die Bindungspartner nicht dissoziieren, bevor die Messung abgeschlossen ist.
Fluoreszierende Melamin-Formaldehyd-Partikel werden, wie vorher erwähnt, in der Diagnostik als Trägermaterialien verwendet und von einer Reihe von Firmen auch vertrieben, z.B. von Sigma-Aldrich oder MicroParticles. Die dabei angebotenen MF-Partikel sind im Bereich von 1 bis 15 μm. Unbekannt sind bisher MF-Partikel, die einen Partikeldurchmesser deutlich kleiner als 1μm besitzen. Für den Bereich 0.1 bis 3 μm sind vorwiegend Polystyrolbasierende fluoreszierende Mikrokugeln bekannt (z.B. von Merck Estapor), die allerdings den Nachteil haben, dass die kleinsten Durchmesser von etwa 0.1 μm nicht monodispers sind. Melamin-basierende Nanopartikel weisen jedoch gegenüber Polystyrol- basierenden Materialien noch einige andere Vorteile auf. Sie haben z.B. eine höhere Dichte (1.51 g/cm3), sind sehr stabil, können unbegrenzt gelagert werden, können in Wasser resuspendiert werden, sind hitzebeständig bis 2000C und liegen in Wasser monodispers vor. Außerdem können fluoreszierende Farbstoffe in die MF-Partikel einfach eingebaut werden (siehe WO 03/074614). Sie lassen sich nicht auswaschen. Es wird angenommen, dass Farbstoffe in den Partikeln nicht kovalent gebunden werden wie z.B. in Silicapartikeln, sondern nur eingeschlossen werden.
Aus der DD-224 602 ist ein Verfahren zur Herstellung monodisperser Melamin-Formaldehyd-Latices mit Teilchengrößen im Bereich von 0.1 bis 15 μm bekannt, wobei die MF-Partikel durch Polykondensation von Melamin und Formaldehyd in wässrigem Medium mit schwach konzentrierter Ameisensäure (0.87 %) hergestellt werden. Weiterhin ist die Funktionalisierung dieser Latices und der Einbau von Farbstoffen, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffen, beschrieben. Die Funktionalisierung von MF-Partikeln kann auf zwei Wegen erfolgen.
Zum einen kann bei der Polykondensation eine hydrophile Substanz mit der gewünschten Funktionalität zugegeben werden. Diese wird in die Partikel integriert. Es werden sich funktionelle Gruppen auf der Oberfläche befinden, allerdings wird ein Teil dieser Substanz im Partikelinneren eingeschlossen sein. Bei dieser Art der Funktionalisierung ist es schwierig, die Belegung der
Oberfläche zu steuern.
Zum anderen können die Partikel nachträglich funktionalisiert werden. Auf der Oberfläche der Melaminharzpartikel befinden sich reaktive Gruppen. Diese lassen sich beispielsweise dadurch nachweisen, indem man die
Oberfläche mit einem langkettigen Carbonsäurechlorid modifiziert, so dass die Partikel anschließend hydrophob sind.
Überraschenderweise konnten nun nanoskalige MF-Partikeln mit einem Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm entwickelt werden, die einen oder mehrere hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe enthalten. Bevorzugt besitzen die MF-Partikel einen Durchmesser von 30 bis 50nm und sind monodispers.
Melaminharze basieren auf dem 1 ,3,5-Triamino-2,4,6-triazin Grundkörper. Mit 2-6 Mol Formaldehyd pro Mol Melamin kann ein methyloliertes Melamin hergestellt werden. Da die Methylolmelamine in Wasser wenig beständig sind, werden sie in handelsüblichen Produkten verethert. Mit Methanol veretherte Melamine sind gut wasserlöslich, wohingegen mit Butanol veretherte gut in organischen Lösungsmitteln löslich sind.
Das handelsübliche, hier eingesetzte Melamin-Formaldehyd-Harz (Madurit SMW 818 der Fa. Surface Specialties) ist eine 75%ige wässrige Lösung. Das Molverhältnis Melamin zu Formaldehyd liegt im Bereich von 1 :2.8 bis 1 :3.8 und 45-55% aller Methylolgruppen sind methanolverethert. Die Herstellung von monodispersen Melaminpartikeln ist z.B. in DD-224 602 beschrieben. Sie lassen sich, wie schon erwähnt, während der Polykondensation einfach funktionalisieren, wobei die Polykondensation im Sauren stattfindet. Die Größe der Partikel ist beeinflussbar durch Art und Konzentration des eingesetzten Methylolmelamins, den pH-Wert und die Temperatur bei der Säurezugabe. Höhere Temperaturen, niedriger pH-Wert, Melaminharz mit vielen Methylolgruppen und niedrige Harzkonzentration verschieben jeweils die Reaktion zu kleineren Partikeln hin.
Die Polykondensation im Sauren ist auch beschrieben in DE 4019844, wobei als Säurekatalysator Schwefelsäure verwendet wird.
Die erfindungsgemäßen nanoskaligen MF-Partikel werden hergestellt, indem man MF-Harz bei Temperaturen im Bereich zwischen 60 bis 8O0C in einer ausreichend großen Wassermenge aufrührt und anschließend mit 98 bis 100%iger Ameisensäure versetzt, so dass Partikel mit einem Durchmesser zwischen 10 und 95 nm entstehen. Ameisensäure hat sich als anwendbarer Kondensationsinitiator erwiesen, weil mit ihr die Ergebnisse reproduzierbar sind. Mit Salzsäure- die einen deutlich höheren pKA-Wert hat- hingegen lassen sich Ergebnisse nicht reproduzieren. Vorzugsweise setzt man 15 bis 20 Gew.% konzentrierte Ameisensäure (also 98 bis 100%ig) zu.
Um fluoreszierende nanoskalige MF-Partikel zu erhalten, werden den MF- Partikeln vor der Umsetzung mit konzentrierter Ameisensäure hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe zugesetzt. Die Farbstoffe müssen vorher nicht modifiziert werden, da sie in die Partikel eingeschlossen, aber nicht kovalent gebunden werden. Um in die MF- Partikel integriert zu werden, müssen die Farbstoffe lediglich hydrophil sein. Als hydrophile organische Farbstoffe können beispielsweise
Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Rhodamin B und Rhodaminderivate (rot), Fluoreszein und Fluoreszeinderivate (gelb), Aminomethylcoumarin und Coumarinderivate (blau) eingesetzt werden. Als metallorganische Farbstoffe können beispielsweise Terbium3+ Tiron-Komplex (grün) und Europium-tris-dipikolinat (rot) eingesetzt werden.
Bevorzugt wird 8-Hydroxy-1 ,3,6-pyrentrisulfonsäure-Trinatriumsalz eingesetzt, wobei die Partikel dann stark grün fluoreszieren. Je kleiner die Partikel sind, desto größer ist ihre spezifische Oberfläche. Wenn diese Oberfläche dicht mit funktionellen Gruppen belegt ist, kann prinzipiell auch von kleinen MF-Partikeln viel Streptavidin gebunden werden.
Bei der Kopplung von Streptavidin an die nanoskaligen MF-Partikel ist es wichtig, dass die Biotinbindekapazität vom Streptavidin erhalten bleibt. Streptavidin kann durch eine Einstufenreaktion oder eine Zweistufenreaktion an Partikel gebunden werden (siehe GT. Hermanson et al., Immobilized Affinity ligand Techniques (1992)). EDC (N-(3-Dimethylamino-propyl)-N^ ethylcarbodiimid) ist ein gebräuchliches Reagenz, um Proteine an andere Moleküle zu koppeln. In der Einstufenreaktion reagiert EDC mit einer Carboxylgruppe zu einem Esterintermediat, das mit einem primären Amin reagieren kann. Mit NHS (N-Hydroxylsuccinimid) entsteht bei der Zweistufenreaktion ein stabileres Esterintermediat, das anschließend mit dem Protein umgesetzt wird.
EDC kann sowohl mit einer Carboxylgruppe auf einem MF-Partikel, als auch mit einer am Streptavidin reagieren. Deshalb können theoretisch auch zwei oder mehr Streptavidinmoleküle miteinander vernetzt werden, diese stünden dann nicht mehr für eine Reaktion mit der MF-Partikeloberfläche zur Verfügung. Um dieser möglichen Quervernetzung vorzubeugen, kann, wie vorher erwähnt, eine Zweistufenreaktion durchgeführt werden. Dabei werden zuerst die nanoskaligen MF-Partikel mit EDC und NHS umgesetzt und die überschüssigen Reagenzien ausgewaschen, so dass EDC nicht mit Streptavidin reagieren kann. Erst danach wird die Streptavidin-Lösung zugegeben. Da nur die Partikeloberfläche aktiviert ist, können die Streptavidinmoleküle auch nur mit dieser reagieren. Nebenbei sei angemerkt, dass es kaum einen Unterschied zwischen der Umsetzung mit EDC (Einstufenreaktion) und der mit EDC/NHS (Zweistufenreaktion) gibt. Mit beiden Methoden wird ungefähr die gleiche Menge Streptavidin an die Oberfläche der nanoskaligen MF-Partikel gebunden. Um zu überprüfen, ob Streptavidin an den Partikeln immobilisiert ist, wird der Partikelsuspension Fluorescein-Biotin zugesetzt. Das ungebundene Fluorescein-Biotin kann in einem Fluoreszenzspektrometer quantitativ bestimmt werden.
Die nanoskaligen, vorzugsweise monodispersen und fluoreszierenden MF- Partikel können als Trägermaterial zur Herstellung von Biomarker, Inkjet- Tinten, als Fluoreszenzmarker in und auf Gebrauchsgegenständen aller Art (z.B. Dokumenten und/oder Geldscheinen) und/oder als Adsorptionsmaterial für chromatographische Trennungen verwendet werden, wobei für chromatographische Anwendungen auch die nicht fluoreszierenden MF- Paritkel genügen.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern ohne sie einzuschränken.
Beispiel 1 :
Farblose nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel
450 g Wasser werden auf 700C erwärmt. Bei 70 0C wird das in 50 g Wasser aufgerührte Melamin-Formaldehyd-Harz (15 g Madurit SMW818) zugegeben. Die Lösung bleibt klar. Wenn die Temperatur wieder auf 7O0C angestiegen ist werden 2 ml 98-100 %ige Ameisensäure zugegeben und es wird noch weitere 20 min bei dieser Temperatur gerührt. Es ist kaum eine Trübung zu erkennen, aber mit Hilfe einer Taschenlampe ist der dem Fac hmann bekannte Tyndalleffekt gut zu beobachten.
Die nach der Aufreinigung per Ultrafiltration (30 kDalton Membran) erhaltenen Partikel haben einen im Rasterelektronenmikroskop ausgemessenen mittleren Durchmesser von ca. 40 nm. Beispiel 2:
Fluoreszierende nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel
450 g Wasser und der 25 mg 8-Hydroxy-1 ,3,6-pyrentrisulfonsäure- Natriumsalz werden auf 700C erwärmt. Bei 70 0C wird das in 50 g Wasser aufgerührte Harz (15 g Madurit SMW818) zugegeben. Die Lösung bleibt klar. Wenn die Temperatur wieder auf 700C angestiegen ist werden 2 ml 98- 100 %ige Ameisensäure zugegeben und es wird noch weitere 20 min bei dieser Temperatur gerührt. Nach ca. 1 min trübt sich der Ansatz leicht. Die nach der Aufreinigung per Ultrafiltration (30 kDalton Membran) erhaltenen Partikel haben einen im Rasterelektronenmikroskop vermessenen Durchmesser von ca. 46 nm.
Beispiel 3:
Konjugation der Nanopartikel mit Streptavidin über EDC-Lösung
(Einstufenreaktion)
1ml einer 10 Gew.% Melaminpartikel enthaltenden Suspension (=100 mg
Feststoff) werden in ein Eppendorf-Cap eingewogen, in 1 ml 50 mM MES- Puffer (2-Morpholinoethansulfonsäure (Merck) pH 5,5) suspendiert und anschließend in einer Ultrazentrifuge bei 60.000 min"1 abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Waschvorgang wird wiederholt. Dann werden die Partikel in 1 ml Proteinlösung (10 mg/ml Streptavidin in MES- Puffer) resuspendiert und in ein verschließbares Glasröhrchen überführt. Die Partikel werden 30 Minuten durch Rollen in Suspension gehalten. Dann werden 100 μl EDC-Lösung (10 mg/ml N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'- ethylcarbodiimid (Merck) in destilliertem Wasser oder MES-Puffer, unmittelbar vor Gebrauch angesetzt) zugegeben. Die Partikel werden über Nacht bei Raumtemperatur in Suspension gehalten. Dabei reagiert das EDC mit den Carboxylgruppen auf der Partikeloberfläche und das Streptavidin mit dem entstehenden Konjugat. Die Probe wird wieder zentrifugiert und der
Überstand verworfen. Nach Zugabe von 1 ml Ethanolamin-Lösung (1 M
Ethanolamin (Merck), pH 9.0, 25 mM tetra-Natriumdiphosphat-Decahydrat
(Merck)) wird die Probe noch eine Stunde gerollt bevor wieder zentrifugiert wird. Ethanolamin reagiert mit den restlichen aktivierten Estern zu Amiden. Danach wird drei mal mit je 1 ml PBS-Puffer (10 mM NaH2PO4 (Merck), pH 7,5, 150 mM NaCI (Merck)) gewaschen. Die Partikel werden ein letztes Mal in PBS-Puffer resuspendiert und können bei 40C im Kühlschrank aufbewahrt werden.
Beispiel 4:
Konjugation der Nanopartikel mit Streptavidin über EDC/NHS
(Zweistufenreaktion) 1 ml einer 10 Gew.% Melaminpartikel enthaltenden Suspension (=100 mg Feststoff) werden in ein Eppendorf-Cap eingewogen, in 1 ml 50 mM MES- Puffer (2-Morpholinoethansulfonsäure (Merck) pH 5.5) suspendiert und anschließend in einer Ultrazentrifuge bei 60.000 min"1 abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Waschvorgang wird wiederholt. Dann werden die Partikel in 1 ml MES-Puffer resuspendiert und in ein verschließbares Glasröhrchen überführt. Es werden 100 μl EDC/NHS- Lösung (100 mg/ml EDC, 16 mg/ml N-Hydroxylsuccinimid (Merck) in MES- Puffer) zugegeben. Die Partikel werden 1 Stunde durch Rollen bei Raumtemperatur in Suspension gehalten, dabei wird das NHS an die Carboxylgruppen auf der Partikeloberfläche gekoppelt. Die Probe wird wieder zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Es wird noch einmal mit 1 ml MES-Puffer gewaschen.
Die Partikel werden in 1 ml Protein-Lösung resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerollt. Die Gegenproben werden in 1 ml MES-Puffer (keine Zugabe von EDC/NHS und Proteinlösung) resuspendiert und über Nacht gerollt. Die Probe wird zentrifugiert und nach Zugabe von 1 ml Ethanolamin-Lösung wird die Probe noch eine Stunde gerollt bevor wieder zentrifugiert wird. Ethanolamin reagiert mit den restlichen aktivierten Estern zu Amiden. Danach wird drei mal mit je 1 ml PBS-Puffer gewaschen. Dann werden die Partikel noch einmal in PBS-Puffer resuspendiert und können bei 40C im Kühlschrank aufbewahrt werden. Beispiel 5:
Nachweis der Bindung des Streptavidins an die Nanopartikel über
Fluorescein-Biotin
Um zu überprüfen, ob Streptavidin an den Partikeln immobilisiert ist, wird der Partikelsuspension Fluorescein-Biotin zugesetzt. Ein Streptavidinmolekül kann 4 Biotinmoleküle binden. Da eine definierte Menge Biotin (M= 244,31 g/mol) zu den mit Streptavidin umgesetzten Partikeln gegeben wird, kann daraus bis auf diesen Faktor 4 die Menge des gebundenen Streptavidins berechnet werden. Von jeder Probe werden 10 μl Suspension (dies entspricht 1 mg Partikel) in ein neues Eppendorf-Cap pipettiert. Den Proben werden nun jeweils 200 μl Biotin-Fluorescein-Lösung (1 gmol/μl in PBS-Puffer) zugesetzt. Sie werden 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend zentrifugiert. Jetzt werden die Proben auf eine Mikrotiterplatte übertragen um sie im Fluoreszenzspektrometer messen zu können. Dazu werden 125 μl PBS- Puffer in jedem Well vorgelegt und dann 75 μl des Überstandes aus dem Eppendorf-Cap zugegeben. Von jeder Probe wird eine Doppelbestimmung durchgeführt. Als Nullwert werden 200 μl PBS-Puffer gemessen, als Maximalwert 75 μl der Biotin-Fluorescein-Lösung in 125 μl PBS-Puffer. Es wird also das nicht gebundene Biotin bestimmt. Aus diesem Wert kann man die Menge des gebundenen Biotins berechnen, da man durch den Maximalwert weiß, wieviel Biotin auf die Probe gegeben wurde. Um zu untersuchen, wie groß die Hintergrundbindung von Biotin ist, werden nach der Messung die mit Biotin belegten Partikel noch einmal mit 200 μl 1 M NaCI gewaschen und zentrifugiert. 2 mal 75 μl des Überstandes werden wieder in 125 μl PBS-Puffer gemessen. Dieser Wert muss bei der Auswertung von dem Wert des gebundenen Biotins abgezogen werden. Das Biotin, was sich mit 1 M NaCI wieder in Lösung bringen lässt, war nur unspezifisch an der Oberfläche adsorbiert.

Claims

Patentansprüche
1. Nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel (MF-Partikel), dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm besitzen.
2. Nanoskalige MF-Partikel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Partikeldurchmesser von 30 bis 50 nm besitzen und monodispers sind.
3. Nanoskalige MF-Partikel nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe enthalten.
4. Nanoskalige MF-Partikel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als hydrophiler Fluoreszenzfarbstoff 8-Hydroxy-1 ,3,6- pyrentrisulfonsäure-Natriumsalz enthalten ist.
5. Nanoskalige MF-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Streptavidin konjugiert sind.
6. Verfahren zur Herstellung nanoskaliger MF-Partikel durch Umsetzung von Ameisensäure mit Melamin-Formaldehyd-Harz in wässrigem Medium, dadurch gekennzeichnet, dass man Melamin-Formaldehyd-Harz bei Temperaturen im Bereich zwischen 60 und 8O0C in einer ausreichend großen Wassermenge aufrührt und anschließend mit 98 bis 100%iger Ameisensäure versetzt, so dass Partikel mit einem Durchmesser zwischen 10 und 95 nm entstehen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass monodisperse MF-Partikel mit einem Durchmesser zwischen 30 und 50 nm entstehen.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 6 und/oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man 15 bis 20 Gew.% konzentrierte Ameisensäure zusetzt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass den MF-Partikeln vor der Umsetzung mit Ameisensäure hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe zugesetzt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als hydrophiler Fluoreszenzfarbstoff 8-Hydroxy-1 ,3,6-pyrentrisulfonsäure- Trinatriumsalz eingesetzt wird.
11.Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Streptavidin über eine Einstufen-Reaktion durch Aktivierung mittels N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid) an die Oberfläche der nanoskaligen MF-Partikel gekoppelt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Streptavidin über eine Zweistufen-Reaktion durch Aktivierung mittels N-(3-Dimethylaminopropyl)-N*-ethylcarbodiimid) und N-Hydroxyl- succinimid an die Oberfläche der nanoskaligen MF-Partikel gekoppelt wird.
13. Verwendung der nanoskaligen MF-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Trägermaterial zur Herstellung von Biomarker, InkJet Tinten, als Fluoreszenzmarker in und auf Gebrauchsgegenständen wie Dokumenten und/oder Geldscheinen und/oder als Adsorptionsmaterial für chromatographische Trennungen.
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