EP1817322A2 - Agents de silanisation a groupement saccharidique terminal et leurs utilisations, notamment pour la fonctionnalisation de supports solides - Google Patents
Agents de silanisation a groupement saccharidique terminal et leurs utilisations, notamment pour la fonctionnalisation de supports solidesInfo
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- EP1817322A2 EP1817322A2 EP05817494A EP05817494A EP1817322A2 EP 1817322 A2 EP1817322 A2 EP 1817322A2 EP 05817494 A EP05817494 A EP 05817494A EP 05817494 A EP05817494 A EP 05817494A EP 1817322 A2 EP1817322 A2 EP 1817322A2
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Classifications
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- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
Definitions
- the present invention relates to silanizing agents comprising a terminal saccharide group and to their use for the functionalization of solid supports.
- the present invention also relates to the solid supports functionalized by these silanisation agents (sugar chips), as well as to their use, in particular for the biological analysis and in particular for the screening of saccharide molecules or protein ligands of interest .
- silanisation agents sucrose chips
- the development of microarray technologies has led to a significant advance in programs related to functional genomics. Indeed, the miniaturization of DNA deposition or synthesis techniques has led to the realization of parallelized analyzes, thus multi-parameterizable, of DNA on chips. More recently, the emergence of proteomics has given rise to the concept of protein chips (Zhu and Sydner, Current Op, in Chem Biol., 2003, 7, 55-63). These allow parallel analysis of protein / ligand interactions.
- glycoconjugates that is to say any molecule having a glycan-type domain, such as glycoproteins, glycolipids, proteoglycans, and more generally any molecule containing carbohydrates
- these carbohydrates are molecules formed by the assembly of simple monomeric blocks. These assemblages can be of natural origin, and possibly fractionated, or of synthetic origin.
- the various functions of molecules belonging to the carbohydrate family rely on the ability of carbohydrate structures to interact with a very large number of molecules. The analysis of the mechanisms of recognition between carbohydrates and other molecules is a field of research in full emergence.
- sugar chips are either the result of a deposit on a given substrate of a natural or synthetic saccharide substance (ex situ synthesis), or the result of a supported multiparallel synthesis (combinatorial chemistry) of different oligosaccharide sequences (synthesis in vitro). situ), representative of the molecular diversity of some large families of endogenous glycoconjugates such as heparans for example.
- ex situ synthesis or the result of a supported multiparallel synthesis (combinatorial chemistry) of different oligosaccharide sequences (synthesis in vitro). situ), representative of the molecular diversity of some large families of endogenous glycoconjugates such as heparans for example.
- the invention which will be described below is part of this technology being particularly well suited to the manufacture of sugar chips, including allowing the attachment of saccharide molecules on solid supports in a preparation process easier to put than the known methods of the prior art.
- a spacer arm makes the link between the surface of the solid support and the terminal functional unit characterizing the biochip: oligopeptides, oligonucleotides (Osborn HMI et al, Tetrahedron, 1999, 55, 1807-1850; Stetsenko DA et al, Bioconjugate Chemistry, 2001, 12, 576-586), or oligosaccharides (U.S. Patent No. 6,579,725).
- This spacer can play several roles at once: it is a binding molecule, that is to say that it makes it possible to connect the surface of the solid support with a functional molecule (probe);
- the inventors have therefore set themselves the goal of providing new silanization agents which make it possible to overcome all the disadvantages set out above.
- they aimed to provide new silanization agents for functionalizing, in a single step, the surface of a solid support with molecules of saccharide nature and this in a simple, reliable, flexible method as to the nature and length of the spacer arm and finally less expensive than the methods of the prior art. It is on this occasion that the Inventors have developed what is the subject of the present invention.
- the present invention therefore firstly relates to a silanization agent with a saccharide terminal function, characterized in that it corresponds to the following formula (I): A-X-B (I) in which:
- A represents a probe molecule of saccharide nature
- X represents a spacer arm consisting of a carbon or heterocarbon chain comprising two ends, one of its two ends connecting, covalently, said spacer arm X to A and the other end covalently connecting said arm; spacer X to B, said chain having at least one ethylenic unsaturation between its two ends; it being understood that said chain can not contain several acetylenic unsaturations;
- the present invention thus provides a silanized saccharide molecule, which can act as a modular spacer arm, the different structures of which influence the reactivity of the arm, that is to say its chemical, electrochemical and / or steric behavior.
- the probe molecule of saccharide nature constituting unit A of the compounds of formula (I) above may be of natural or synthetic origin, and may optionally be protected by one or more protective groups.
- This probe molecule may in particular be chosen from all the saccharide molecules to be fixed on a support, for example for reasons
- Elte ⁇ may in particular " be -synthetized in order to represent a molecule or biomolecule saccharide biological interest such as a heparan sulfate for example, or for the purpose of representing a saccharide chain acting itself as a spacer between a surface and a molecule or biomolecule of biological interest.
- the probe molecule of saccharide nature has a molecular weight of between 180 and 10 000 g / mol and even more preferably between 360 and 900 g / mol. It is preferably chosen from: i) monosaccharides and in particular from glucosamine, azidoglucosamine, D-ribose, D-xylose, L-arabinose, D-glucose, D-galactose, D-mannose , 2-deoxyribose, L-fucose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine, N-acetylneuraminic acid, D-glucuronic acid, acid
- One, or more than one, of the hydroxyl and / or amine functions of the saccharide moieties of the probe molecule may be protected by one or more protective groups.
- These protecting groups are well known to those skilled in the art and are amply described in TW Greene et al, "Protective Groups in Organic Chemistry", Second Edition, A Wiley-Interscience Publication 1991.
- these protective groups are chosen from acetyl groups; benzyl; aryl and in particular aryl groups substituted with a radical R chosen from alkyl chains having from 1 to 40 carbon atoms; 2,2,2-trichloroethyloxycarbonyl (Troc); benzyloxycarbonyl (Z); trichloroacetamidate (TCA); tert-butyloxycarbonyl (BOC) and fluoranylmethoxycarbonyl (Fmoc).
- one or more of the hydroxyl and / or amine functions of the saccharide entities of the probe molecule may be substituted by one or more hydrophobic groups making it possible to make the spacer arm more specific and / or more selective towards the target molecule that will be fixed on the probe molecule and / or its role during the use of the spacer arm.
- the saccharide part can be rendered more or less hydrophobic.
- the anomeric part of the saccharide entities may be functionalized, like any glycosidic donor, by a group which will preferably be chosen according to the nature of the covalent bond ensuring the attachment of the Saccharide-type probe molecule at one of the two ends of the spacer arm X.
- the covalent bonds ensuring the attachment of each of the ends of the chain constituting the spacer arm X to the units A and B are derived from the reaction between a chemical function initially carried by the precursor of the spacer arm X and a complementary chemical function carried, on the one hand, by the probe-A molecule and on the other hand by the group silanized B.
- a chemical function initially carried by the precursor of the spacer arm X and a complementary chemical function carried, on the one hand, by the probe-A molecule and on the other hand by the group silanized B.
- the spacer arm X of the compounds of formula (I) according to the invention may be of variable length and structure. As has been seen above, it nevertheless still comprises at least one ethylenic unsaturation on the chain directly connecting A and B.
- the spacer arm X represents a linear or branched C 2 -C 40 alkyl or C 6 -C 40 aryl chain, said chain comprising at least one ethylenic unsaturation and which may optionally be interrupted by one or more heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, sulfur and silicon, and / or one or more functions such as amide, oximes and tertiary amine functions and / or optionally substituted by one or more substituents ( preferably from 1 to 10 substituents) chosen from linear or branched C 2 -C 20 alkyl or C 6 -C 20 aryl chains, said chains optionally possibly being also interrupted by one or more heteroatoms chosen from oxygen, nitrogen, sulfur and silicon.
- the silanized group B is preferably chosen from the groups -Si (Ri) 3 , -SiRi (R 2 ) 2 and -SiRiR 2 R 3 in which the radicals R], R 2 and R 3 , independently of each other, represent a halogen atom such as fluorine or chlorine, Ci-C 4 alkoxy radical, a Ci-C 4 alkyl, amino or an ester radical.
- the methoxy and ethoxy radicals are particularly preferred and the alkyl radicals defined for the radicals R 1, R 2 and R 3 , the methyl and ethyl radicals are most particularly preferred.
- ester functions defined for the radicals R 1 , R 2 and R 3 mention may in particular be made of the acetoxy radical.
- silanized terminal unit B there may be mentioned trimethoxysilyl, triethoxysilyl, trimethylsilyl and triethylsilyl groups.
- A is chosen from monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides, and even more particularly from oligomers such as Glc-Glc-Glc; Lac-Lac or Gal-Gal-Gal-Gal-Gal in which the abbreviations GIc, Lac and GaI respectively denote glucose, lactose and galactose;
- X represents a carbon chain having from 2 to 40 carbon atoms, comprising at least one ethylenic unsaturation, said chain being linear or branched, and optionally interrupted by one or more rings and / or one or more functions such as the amide functions, oximes and tertiary amines;
- B represents a trimethoxysilyl or triethoxysilyl group.
- formula (I) there may be mentioned the compounds corresponding to formulas (1-1) and (1-2) below:
- silanizing agents of formula (I) above can be easily prepared according to the principles of organic synthesis well known to those skilled in the art depending on the nature of the units A, X and B.
- these silanizing agents can generally be prepared by a simple assembly of the units A, X and B, said units being either previously prepared or commercially available, it being understood that said units contain the chemical functions suitable for the formation of a covalent bond on the one hand between the unit A and one end of the spacer arm X and, on the other hand, between the unit B and the other end of the spacer arm X.
- the reactions used are generally conventional glycosylation reactions of A on X followed by hydrosilylation reactions (of Karstedt for example) to hang B.
- the silanizing agents of formula (I) according to the invention can be used to the functionalization of solid supports.
- the present invention therefore relates to the use of at least one silanizing agent of formula (I) as defined above, for the functionalization of solid supports, and in particular for the manufacture of sugar chips.
- silanization agents of formula (I) advantageously makes it possible to rapidly modify the surface of solid supports by a stable layer carrying easily sacrificial saccharide-type probe molecules of the support, given the presence of at least one ethylenic unsaturation on the spacer arm "X of the compounds of formula (I) according to the invention.
- the compounds of formula (I) according to the invention have the following advantages:
- the unit X of the compounds of formula (I) according to the invention allows in particular the connection with a very wide range of saccharides, oligosaccharides or polysaccharides.
- the compounds of formula (I) can be used either as spacer arm of a first saccharide unit, for example an oligosaccharide unit, which will be attached to unit X and then it is possible to grow (combinatorial chemistry on solid support) or for the attachment of presynthesized saccharide probe molecules (attachment to the X unit, in the anomeric position of their reducing part).
- the spacer arm is cleavable: thanks to the presence of at least one ethylenic unsaturation on the unit X compounds of formula (I) that can be easily opened and targeted to isolate the sugar from the solid phase, and this under conditions that do not alter the integrity of the saccharide probe molecule.
- ozonolysis, Grubbs metathesis or dihydroxylation followed by oxidative cleavage of diol-osmylation (OsO 4 , NaIO 4 ) as well as other known mild chemical cleavage reactions can be used as the cleavage method. the skilled person.
- the present invention also relates to a method for preparing a solid support functionalized by probe molecules of saccharide nature, characterized in that it comprises at least one step of silanization of at least one surface of a -solid support -with a solution of at least one silanizing agent of formula (I) in an organic solvent.
- the organic solvent is preferably chosen from trichlorethylene, toluene, and lower alcohols such as ethanol or methanol, these solvents optionally being supplemented with a basic compound such as triethylamine or N 5 N-diisopropylethylamine (DIEA). ).
- the contacting of the solid support with the solution of the silanizing agent of formula (I) is preferably carried out at a temperature of between 4 and 80 ° C., for about 1 to 48 hours.
- the substrate is then rinsed with the reaction solvent or with chloroform and dried, preferably with nitrogen.
- This method has the advantage of being simple to implement and to combine the silanization step with the step of functionalization of the solid support, whereas the methods known from the prior art required at least three successive steps; that is to say a first step of silanization of the surface of the solid support with a molecule having a functional group allowing the attachment of a spacer arm in a second step and finally the attachment of a saccharide probe molecule in a third step, for example according to a glycosylation reaction.
- a step of inactivation (“capping" non-glycosylated sites) was then necessary, which is not the case according to the method of the present invention.
- the solid supports that can be functionalized with the silanizing agents of formula (I) according to the invention are preferably chosen from glass, silica or other materials known to those skilled in the art as being capable of being used. silanized.
- These solid supports have at least one flat surface or not, smooth or structured, and may be for example in the form of blade, flat or well plate, capillary or porous ball or not.
- the present invention therefore also relates to solid supports characterized in that they comprise at least one functionalized surface with one or more silanizing agents of formula (I) as defined above.
- Such carriers constitute sugar chips which are for example capable of being used for the identification, by screening, of saccharide molecules and in particular oligosaccharide sequences recognizing a particular protein of interest, for example using the method described in international application WO-A-03/008927.
- sugar chips according to the present invention can also be used for the identification, by screening, of ligands, for example protein ligands recognizing a saccharide of interest.
- the subject of the present invention is finally a method for screening saccharide molecules, and in particular oligosaccharide sequences, or, respectively, protein ligands, characterized in that it comprises at least one contacting step of a solid support comprising at least one surface functionalized with at least one silanizing agent of formula (I) as defined previously with a solution containing one or more potential oligosaccharide molecules or, respectively, one or more potential protein ligands.
- the functionalized solid supports in accordance with the present invention make it possible to optimize the screening methods and thus to dispose more efficiently and more rapidly of molecules for therapeutic or biotechnological purposes.
- the invention also comprises other provisions which will emerge from the description which follows, which refers to an example of preparation of a compound of formula (I) according to the invention as well as an example of functionalization of a solid support with a compound of formula (I) according to the invention.
- the spacer arm (3) is obtained in two successive steps: 2-vinyl-3-chloro-tetrahydrofuran (2) is accessible from 2,3-dichlorotetrahydrofuran (1) by treatment with a Grignard reagent according to the method described by L. Crombie, and RD
- the compound (3) is obtained in a yield of 93%.
- the preparation of the glucose derivative (5) is carried out according to the following reaction scheme B:
- the glucose derivative (5) (thioglycoside) is obtained from D-Glucose in two successive stages which are conventional reactions of the chemistry of sugars:
- This glycosylated spacer arm is prepared according to the following Reaction Scheme C:
- the coupling of these two molecules is a glycosylation reaction of a protected glucose on an unsaturated chain.
- the thioglycoside (5) 500 mg, 1.13 mmol, 1 eq.
- the unsaturated spacer arm (3) 127 mg, 1.13 mmol, 1 eq.
- Molecular 630 mg. This mixture is stirred for 30 minutes at room temperature, then the reaction medium is brought to a temperature of -30 ° C.
- N-iodosuccinimide (NIS) 510 mg, 2.26 mmol, 2 eq.
- NIS trifluoromethanesulfonic acid
- the substrate then . It was washed with deionized water and then soaked for 1 hour in 0.2 N hydrochloric acid. was again washed with deionized water and then dried in an oven at a temperature of 80 ° C. for 30 minutes
- the rehydrated substrate was soaked in 10 ml of a solution of trichlorethylene (TCE) containing 10 mM (21 mg) of compound of formula (I-1) as prepared in Example 1 above. After 1 night at ambient temperature, the substrate was silanized with the compound of formula (I-1) according to the invention.
- TCE trichlorethylene
- the thus functionalized substrate was then washed with TCE, with ethanol and finally with chloroform. It was then dried in an oven for 30 minutes at a temperature of 50 ° C.
- the functionalized substrate was stored under an inert atmosphere (argon or nitrogen).
- This substrate can then be used for the preparation of a sugar chip (growth of oligosaccharides on the silanized substrate thus prepared) or of any other molecule chip or biomolecule (in this case, the sweet silane which functions the substrate becomes a spacer for the attachment of any new molecule or biomolecule, natural or synthetic).
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Abstract
La présente invention est relative à des agents de silanisation comportant un groupement saccharidique terminal et à leur utilisation pour la fonctionnalisation de supports solides. La présente invention est également relative aux supports solides fonctionnalisés par ces agents de silanisation (puces à sucres), ainsi qu'à leur utilisation, notamment pour l'analyse biologique et en particulier pour le criblage de molécules saccharidiques ou de ligands protéiques d'intérêt.
Description
AGENTS DE SILANISATION A GROUPEMENT SACCHARIDIQUE
TERMINAL ET LEURS UTILISATIONS, NOTAMMENT POUR LA
FONCTIONNALISATION DE SUPPORTS SOLIDES
La présente Invention est relative à des agents de silanisation comportant un groupement saccharidique terminal et à leur utilisation pour la fonctionnalisation de supports solides. La présente Invention est également relative aux supports solides fonctionnalisés par ces agents de silanisation (puces à sucres), ainsi qu'à leur utilisation, notamment pour l'analyse biologique et en particulier pour le criblage de molécules saccharidiques ou de ligands protéiques d'intérêt. Le développement des technologies des puces à ADN a permis une avancée notable des programmes liés à la génomique fonctionnelle. En effet, la miniaturisation des techniques de dépôt ou de synthèse d'ADN a conduit à la réalisation d'analyses parallélisées, donc multi paramétrables, d'ADN sur des puces. Plus récemment, l'émergence de la protéomique a donné naissance au concept de puces à protéines (Zhu and Sydner, Current Op.; in Chem. Biol., 2003, 7, 55-63). Celles-ci permettent l'analyse parallélisée d'interactions de type protéines/ligands.
De façon encore plus récente, la recherche en biologie s'est intéressée à la "glycomique", c'est-à-dire à l'étude systématique des interactions carbohydrates/protéines. En effet, les glycoconjugués (c'est-à-dire toute molécule possédant un domaine de type glycane, comme les glycoprotéines, les glycolipides, les protéoglycanes, et plus généralement toute molécule contenant des carbohydrates), ont un répertoire fonctionnel particulièrement large. Chimiquement, ces carbohydrates sont des molécules constituées par l'assemblage de blocs monomériques simples. Ces assemblages peuvent être d'origine naturelle, et éventuellement fractionnés, ou d'origine synthétique. Les diverses fonctions des molécules appartenant à la famille des carbohydrates reposent sur la capacité des structures carbohydrates à interagir avec un très grand nombre de molécules. L'analyse des mécanismes des reconnaissances entre les carbohydrates et les autres molécules est un domaine de la recherche en pleine émergence. Elle devrait notamment ,permettre..d'aboutir à la conception de nouvelles molécules thérapeutiques et à une meilleure appréciation des risques toxicologiques de certaines molécules. A l'heure
actuelle, il existe peu de méthodes systématiques permettant de produire des molécules saccharidiques. De ce fait, la détermination des caractéristiques structurales impliquées dans une interaction entre une molécule et un carbohydrate, ainsi que la caractérisation de l'interaction elle-même supposent d'entreprendre des travaux longs et fastidieux. II est donc nécessaire, pour progresser dans la connaissance des mécanismes d'interaction entre des molécules de type saccharidique et leurs ligands, de pouvoir cribler des banques de molécules de type saccharidiques vis-à-vis d'un ligand particulier par exemple.
C'est pourquoi, on constate aujourd'hui qu'un nouveau type de biopuce émerge : différents types de puces à sucres ou "Glycochip", "carbohydrate array" ou bien encore "oligosaccharide array" en anglais, qui constituent une évolution de la puce à ADN ou à protéines dont il a été question ci-dessus, ont donc été proposés par différents auteurs.
Ces puces à sucres sont soit le résultat d'un dépôt sur un substrat donné d'une substance saccharidique naturelle ou synthétique (synthèse ex situ), soit le résultat d'une synthèse multiparallèle supportée (chimie combinatoire) de différentes séquences oligosaccharidiques (synthèse in situ), représentatives de la diversité moléculaire de certaines grandes familles de glycoconjugués endogènes tels que les héparanes par exemple. L'Invention qui va être décrite ci-après s'inscrit dans cette technologie en étant particulièrement bien adaptée à la fabrication de puces à sucres, en permettant notamment la fixation de molécules saccharidiques sur des supports solides selon un procédé de préparation plus simple à mettre en œuvre que les procédés connus de l'art antérieur. En effet, dans la majorité des biopuces, un bras espaceur fait le lien entre la surface du support solide et l'unité fonctionnelle terminale caractérisant la biopuce : oligopeptides, oligonucléotides (Osborn H. M. I. et al, Tetrahedron, 1999, 55, 1807-1850 ; Stetsenko D. A. et al, Bioconjugate Chemistry, 2001, 12, 576-586), ou qligosaccharides (brevet américain Λ° 6,579,725).- Cet espaceur -peut jouer plusieurs rôles à la fois :
- c'est une molécule liante, c'est-à-dire qu'il permet de relier la surface du support solide avec une molécule fonctionnelle (sonde) ;
- c'est un bras d'éloignement spatial, c'est-à-dire qu'il permet d'éloigner la molécule sonde de la surface du support solide. La proximité du support solide avec les sites de reconnaissance des molécules cibles par les molécules sondes peut en effet gêner ou empêcher la reconnaissance sonde/cible d'avoir lieu, et donc nuire à la finesse et à la qualité analytique des biopuces. Ceci est particulièrement vrai lorsque les molécules sondes sont de petite taille, notamment dans le cas des puces à sucres.
De nombreux bras espaceurs ont été proposés jusqu'à ce jour, mais ceux-ci ne donnent pas entièrement satisfaction sur le plan pratique car ils présentent un certain nombre d'inconvénients non résolus :
- leur structure implique souvent une limitation sévère quant au choix des procédés chimiques permettant leur fixation sur la surface du support solide,
- ils ne permettent pas tous de fixer des molécules sondes de nature saccharidique,
- ils sont généralement tellement stables après fixation sur la surface du support solide que leur clivage pour récupérer la molécule biologique ne peut pas se faire facilement et peut entraîner la détérioration de cette dernière ou du support,
- les étapes nécessaires à leur synthèse chimique, leur accrochage à la surface du support solide et leur fonctionnalisation sont multiples, parfois difficiles à réaliser et par conséquent souvent d'un coût élevé.
Le brevet américain n° 6,579,725 décrit en particulier un bras espaceur apte à fixer des molécules sondes de nature oligosaccharidiques. Cependant ce bras espaceur, bien que plus efficace que ceux présentés dans un art antérieur encore plus ancien, ne permet pas de résoudre en même temps tous les inconvénients cités précédemment. On peut notamment noter que sa longueur, sa fonctionnalité, sa réactivité et son encombrement ne peuvent pas toujours être générés à volonté.
Les Inventeurs se sont donc donnés pour but de pourvoir à de nouveaux agents.._de silanisation permettant de palier l'ensemble des inconvénients exposés précédemment. Ils se sont en particulier donnés pour but de pourvoir à de nouveaux
agents de silanisation permettant de fonctionnaliser, en une seule étape, la surface d'un support solide par des molécules de nature saccharidique et ce selon un procédé simple, fiable, souple quant à la nature et la longueur du bras espaceur et enfin moins onéreux que les procédés de l'art antérieur. C'est à cette occasion que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de la présente Invention.
La présente Invention a donc pour premier objet un agent de silanisation à fonction terminale saccharidique, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule (I) suivante : A-X-B (I) dans laquelle :
- A représente une molécule sonde de nature saccharidique ;
- X représente un bras espaceur constitué d'une chaîne carbonée ou hétérocarbonée comportant deux extrémités, l'une de ses deux extrémités reliant, de façon covalente, ledit bras espaceur X à A et l'autre extrémité reliant, de façon covalente, ledit bras espaceur X a B, ladite chaîne comportant au moins une insaturation éthylénique située entre ses deux extrémités ; étant entendu que ladite chaîne ne peut pas contenir plusieurs insaturations acétyléniques ;
- B est un groupement silanisé. La présente Invention fournit donc une molécule saccharidique silanisée, pouvant jouer le rôle d'un bras espaceur modulable, dont les différentes structures influencent la réactivité du bras, c'est-à-dire son comportement chimique, électrochimique et/ou stérique.
Selon l'Invention, la molécule sonde de nature saccharidique constituant l'unité A des composés de formule (I) ci-dessus peut être d'origine naturelle ou synthétique, et être éventuellement protégée par un ou plusieurs groupements protecteurs.
Cette molécule sonde peut en particulier être choisie parmi toutes les molécules saccharidiques devant être fixées sur un support, par exemple pour des raisons
- analytiques- ou diagnostiques. ~Elte~ peut notamment " être -synthétisée dans le but de représenter une molécule ou biomolécule saccharidique à intérêt biologique tel qu'un
héparane sulfate par exemple, ou dans le but de représenter une chaîne saccharidique jouant elle-même le rôle d'espaceur entre une surface et une molécule ou biomolécule d'intérêt biologique.
Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, la molécule sonde de nature saccharidique présente un poids moléculaire compris entre 180 et 10 000 g/mol environ et encore plus préférentiellement entre 360 et 900 g/mol environ. Elle est de préférence choisie parmi : i) les monosaccharides et en particulier parmi la glucosamine, l'azidoglucosamine, le D-ribose, le D-xylose, le L-arabinose, le D-glucose, D-galactose, le D-mannose, le 2-désoxy-ribose, le L-fucose, la N-acétyl-D-glucosamine, la N-acétyl-D- galactosamine, l'acide N-acétylneuraminique, l'acide D-glucuronique, l'acide
L-iduronique, le D-sorbitol, le D-mannitol, etc.. ii) les oligosaccharides et en particulier parmi le saccharose, le lactose, les fragments d'héparanes sulfates, les fragments saccharidiques de l'héparine, de chondroïtine et de dermatanes sulfates, les antigènes de Lewis, etc..., iii) les poly-oligosaccharides et en particulier parmi les fractions saccharidiques des héparanes sulfates, de l'héparine et de la chondroïtine, les dermatanes sulfates, etc., iv) les glycoconjugués, et en particulier parmi les héparanes sulfates, l'héparine, la chondroïtine, les dermatanes sulfates, etc..., v) les glycoprotéines telles que l'immunoglobuline G, l'acide hyaluronique, etc., vi) les glycolipides tels que les galactosyl-céramides, les gangliosides et les cérébrosides, etc., viii) les glycolipoprotéines telles que la glycoprotéine G90 extraite de tissus du lombric Eisenia foetida (Famille des Lumbricidae) ou bien la glycoprotéine MPB83 fournie par le laboratoire "Veterinary Laboratories Agency" (VLA, Weybridge, UK).
... Une., ou -plusieurs -des -fonctions hydroxyle et/ou aminé des entités saccharidiques de la molécule sonde peuvent être protégées par un ou plusieurs
groupements protecteurs. Ces groupements protecteurs sont bien connus de l'homme du métier et sont amplement décrits dans l'ouvrage de T. W. Greene et al, "Protective Groups in Organic Chemistry", Second Edition, A Wiley-Interscience Publication 1991.
Selon une forme avantageuse de la présente Invention, ces groupements protecteurs sont choisis parmi les groupements acétyle ; benzyle ; aryle et en particulier les groupements aryle substitués par un radical R choisi parmi les chaînes alkyle ayant de 1 à 40 atomes de carbone ; 2,2,2-trichloroéthyloxycarbonyle (Troc) ; benzyloxycarbonyle (Z) ; trichloroacétamidate (TCA) ; tert-butyloxycarbonyle (BOC) et fluoranylméthoxycarbonyle (Fmoc). Selon une autre forme de réalisation avantageuse de l'Invention, une ou plusieurs des fonctions hydroxyle et/ou aminé des entités saccharidiques de la molécule sonde peuvent être substituées par un ou plusieurs groupements hydrophobes permettant de rendre le bras espaceur plus spécifique et/ou plus sélectif vis-à-vis de la molécule cible qui viendra se fixer sur la molécule sonde et/ou de son rôle lors de l'utilisation du bras espaceur.
On peut en particulier citer le cas où en protégeant les fonctions hydroxyle par des groupements protecteurs tels que les groupements benzyle, acétate, benzylidène, isopropylidène, phtalimide etc., la partie saccharidique peut être rendue plus ou moins hydrophobe. Selon encore une autre forme de réalisation avantageuse de l'Invention, la partie anomérique des entités saccharidiques peut être fonctionnalisée, comme tout donneur glycosidique, par un groupement qui sera de préférence choisi en fonction de la nature de la liaison covalente assurant la fixation de la molécule sonde de nature saccharidique à l'une des deux extrémités du bras espaceur X. Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, les liaisons covalentes assurant la fixation de chacune des extrémités de la chaîne constituant le bras espaceur X aux unités A et B sont issues de la réaction entre une fonction chimique initialement portée par le précurseur du bras espaceur X et une fonction chimique complémentaire portée , d'une part, par ..la molécule sonde-A - et -d'autre- part par le groupement silanisé B. Il existe bien entendu un grand nombre de couples
donneurs/accepteurs possibles bien connus de l'homme du métier dans le domaine de la chimie des sucres (Khan S. H. et al., "Moderne Methods in Carbohydrate Synthesis", Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, California, USA, 1996) et qui peuvent être utilisés pour former ladite liaison covalente. A titre d'exemple, on peut notamment citer les liaisons covalentes résultant de la réaction entre un radical hydroxyle et un groupement choisi parmi les atomes d'halogène tels que le chlore, le brome, l'iode ou le fluor, ainsi que parmi les groupements phosphite, trichloroacétamidate, thioalkyle, phosphate, pentényle, sulfoxyde et xanthate.
Le bras espaceur X des composés de formule (I) conformes à l'Invention peut être de longueur et de structure variables. Ainsi qu'on l'a vu ci-dessus il comporte néanmoins toujours au moins une insaturation éthylénique sur la chaîne reliant directement A et B.
Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'Invention, le bras espaceur X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C40 ou aryle en C6-C40, ladite chaîne comportant au moins une insaturation éthylénique et pouvant éventuellement être interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi l'oxygène, l'azote, le soufre et le silicium, et/ou une ou plusieurs fonctions telles que les fonctions amides, oximes et aminés tertiaires et/ou éventuellement substituée par un ou plusieurs substituants (de préférence de 1 à 10 substituants) choisis parmi les chaînes alkyles linéaires ou ramifiées en C2-C20 ou aryle en C6-C20, lesdites chaînes pouvant éventuellement être également interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi l'oxygène, l'azote, le soufre et le silicium.
Selon l'Invention, le groupement silanisé B est de préférence choisi parmi les groupements -Si(Ri)3, -SiRi (R2)2 et -SiRiR2R3 dans lesquels les radicaux R], R2 et R3, indépendamment les uns des autres, représentent un atome d'halogène tel que le fluor ou le chlore, un radical alkoxy en Ci-C4, un radical alkyle en Ci-C4, un radical amino ou une fonction ester.
Parmi les radicaux alkoxy définis pour les radicaux R1, R2 et R3, on préfère tout_particulièrement les radicaux-méthoxy et éthoxy et parmi les radicaux alkyle-
définis pour les radicaux Rj, R2 et R3, on préfère tout particulièrement les radicaux méthyle et éthyle.
Parmi les fonctions esters définies pour les radicaux R1, R2 et R3, on peut en particulier citer le radical acétoxy. A titre d'unité terminale silanisée B, on peut notamment citer les groupements triméthoxysilyle, triéthoxysilyle, triméthylsilyle et triéthylsilyle.
Parmi les agents de silanisation de formule (I) ci-dessus, on préfère particulièrement ceux dans lesquels :
- A est choisi parmi les monosaccharides, les oligosaccharides et les polysaccharides, et encore plus particulièrement parmi des oligomères tels que Glc-Glc-Glc ; Lac-Lac ou Gal-Gal-Gal-Gal-Gal dans lesquels les abréviations GIc, Lac et GaI signifient respectivement glucose, lactose et galactose ;
- X représente une chaîne carbonée ayant de 2 à 40 atomes de carbone, comportant au moins une insaturation éthylénique, ladite chaîne étant linéaire ou ramifiée, et éventuellement interrompue par un ou plusieurs cycles et/ou une ou plusieurs fonctions telles que les fonctions amides, oximes et aminés tertiaires ;
- B représente un groupement triméthoxysilyle ou triéthoxysilyle. A titre de composé de formule (I) tout particulièrement préféré, on peut citer les composés répondant aux formules (1-1) et (1-2) suivantes :
(M)
dans lesquelles Ac représente le groupe acétyle.
Les agents de silanisations de formule (I) ci-dessus peuvent être facilement préparés selon les principes de synthèse organique bien connus de l'homme du métier suivant la nature des unités A, X et B.
En particulier, ces agents de silanisations peuvent généralement être préparés par un simple assemblage des unités A, X et B, lesdites unités étant soit préalablement préparées soit disponibles commercialement étant entendu que lesdites unités contiennent les fonctions chimiques appropriées à la formation d'une liaison covalente d'une part entre l'unité A et l'une des extrémités du bras espaceur X et, d'autre part, entre l'unité B et l'autre extrémité du bras espaceur X.
Les réactions mises en œuvre sont généralement des réactions de glycosylation classiques de A sur X suivies de réactions d'hydrosilylation (de Karstedt par exemple) pour accrocher B. Les agents de silanisation de formule (I) conformes à l'Invention peuvent être utilisés pour la fonctionnalisation de supports solides.
La présente Invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins un agent de silanisation de formule (I) tel que défini précédemment, pour la fonctionnalisation de supports solides, et en particulier pour la fabrication de puces à sucres. L'utilisation des agents de silanisation de formule (I) permet avantageusement de modifier rapidement la surface de supports solides par une couche stable porteuse de molécules sondes de nature saccharidique facilement clivables du support compte tenu de la présence d'au moins une insaturation éthylénique sur le bras espaceur" X des composés de formule (î) conformes à l'Invention.
Lorsqu'ils sont utilisés en particulier pour la préparation de puces à sucres, les composés de formule (I) conformes à l'Invention présentent les avantages suivants :
- Ils jouent tout d'abord le rôle d'un bras espaceur en permettant d'éloigner la chaîne saccharidique de la surface du support solide qui supporte cette chaîne. L'unité X des composés de formule (I) conformes à l'Invention permet notamment la liaison avec une très grande gamme de saccharides, d'oligosaccharides ou de polysaccharides. En particulier, les composés de formule (I) peuvent être utilisés soit comme bras espaceur d'une première unité saccharidique, par exemple oligosaccharidique, qui va être accrochée à l'unité X et qu'il est ensuite possible de faire croître (chimie combinatoire sur support solide) soit pour l'accrochage de molécules sondes saccharidiques présynthétisées (accrochage à l'unité X, en position anomérique de leur partie réductrice).
- Le bras espaceur est clivable : grâce à la présence d'au moins une insaturation éthylénique sur l'unité X des composés de formule (I) qu'il est possible de d'ouvrir facilement et de manière ciblée pour isoler le sucre de la phase solide, et ce dans des conditions qui n'altèrent en rien l'intégrité de la molécule sonde saccharidique. On peut en particulier utiliser comme méthode de clivage, une ozonolyse, une métathèse de Grubbs ou une dihydroxylation suivie d'une coupure oxydative de diol-osmylation (OsO4, NaIO4), ainsi que d'autres réactions chimiques douces de clivage connues de l'homme du métier.
- Enfin, de part leurs fonctionnalités chimiques et le choix des substituants sur leur squelette saccharidique, les composés de formule (I) conformes à l'Invention restent inertes dans de nombreuses conditions expérimentales lors des réactions réalisées.
La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un support solide fonctionnalisé par des molécules sondes de nature saccharidique, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une étape de silanisation d'au moins une surface ..d'un .support -.solide -avec une-solution d-au-moins un- agent de silanisation de formule (I) dans un solvant organique.
Le solvant organique est de préférence choisi parmi le trichloroéthylène, le toluène, et les alcools inférieurs tels que l'éthanol ou le méthanol, ces solvants étant éventuellement additionnés d'un composé basique tel que la triéthylamine ou la N5N- diisopropyléthylamine (DIEA). La mise en contact du support solide avec la solution de l'agent de silanisation de formule (I) est de préférence réalisée à une température comprise entre 4 et 80°C environ, pendant 1 à 48 heures environ.
Le substrat est ensuite rincé avec le solvant de Ia réaction ou avec du chloroforme, puis séché, de préférence à l'azote. Ce procédé présente l'avantage d'être simple à mettre en œuvre et de conjuguer l'étape de silanisation avec l'étape de fonctionnalisation du support solide alors que les procédés connus de l'art antérieur nécessitaient au moins trois étapes successives, c'est-à-dire une première étape de silanisation de la surface du support solide avec une molécule possédant un groupement fonctionnel permettant l'accrochage d'un bras espaceur dans une deuxième étape et enfin l'accrochage d'une molécule sonde saccharidique dans une troisième étape, par exemple selon une réaction de glycosylation. Dans ce cas, une étape d'inactivation ("capping" des sites non glycosylés) était alors nécessaire, ce qui n'est par contre pas le cas selon le procédé de la présente Invention.
Les supports solides pouvant être fonctionnalisés par les agents de silanisation de formule (I) conformes à l'Invention sont de préférence choisis parmi les supports à base de verre, de silice ou de tous autres matériaux connus de l'homme du métier comme pouvant être silanisés.
Ces supports solides possèdent au moins une surface plane ou non, lisse ou structurée, et peuvent se présenter par exemple sous la forme de lame, de plaque plane ou à puits, de capillaire ou encore de bille poreuse ou non.
La présente Invention a donc également pour objet des supports solides caractérisés par le fait qu'ils comportent au moins une surface fonctionnalisée par un ou plusieurs agents de silanisation de formule (I) tels que définis ci-dessus.
De tels supports constituent des puces à sucres qui sont par exemple susceptibles d'être utilisées pour l'identification, par criblage, de molécules saccharidiques
et en particulier de séquences oligosaccharidiques reconnaissant une protéine particulière d'intérêt, par exemple en utilisant la méthode décrite dans la demande internationale WO-A-03/008927.
A l'inverse, les puces à sucres conformes à la présente Invention peuvent également être utilisées pour l'identification, par criblage, de ligands, par exemple de ligands protéiques reconnaissant un saccharide d'intérêt.
Par conséquent, la présente Invention a enfin pour objet un procédé de criblage de molécules saccharidiques, et en particulier de séquences oligosaccharidiques, ou respectivement, de ligands protéiques, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une étape de mise en contact d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par au moins un agent de silanisation de formule (I) tel que défini précédemment avec une solution renfermant une ou plusieurs molécules oligosaccharidique potentielles ou, respectivement un ou plusieurs ligands protéiques potentiels. Dans ces applications particulières, les supports solides fonctionnalisés conformes à la présente Invention permettent d'optimiser les procédés de criblage et donc de disposer plus efficacement et plus rapidement de molécules à visée thérapeutique ou biotechnologique.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de préparation d'un composé de formule (I) conforme à l'Invention ainsi qu'à un exemple de fonctionnalisation d'un support solide avec un composé de formule (I) conforme à l'Invention.
Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : PREPARATION DU COMPOSE DE FORMULE (1-1)
dans laquelle Ac représente acétyle.
1) Première Etape : Préparation d'un bras espaceur (3) et d'un dérivé de glucose (5)
La préparation du bras espaceur (3) est réalisée selon le schéma réactionnel A suivant :
SmI2, THF
SCHEMA A
Le bras espaceur (3) est obtenu en 2 étapes successives : le 2-vinyl 3- chloro-tétrahydrofurane (2) est accessible à partir du 2,3-dichlorotétrahydrofurane (1) par traitement avec un réactif de Grignard selon le procédé décrit par L. Crombie, et R. D.
Wyvill, Journal of the Chemical Society, 1985, Perkin Trans 1, 1971 et références citées. .Le_ composé. (2) est ensuite -traité -à reflux dans Ie tétrahydrofurane en présence de 4-7 équivalents de diiodure de Samarium (SmI2) pendant 5 à 165 heures,
selon le procédé décrit par L. Crombie, et L. J. Rainbow, 1988, Tetrahedron Letters, 29(49), 6517.
Le composé (3) est obtenu avec un rendement de 93%. La préparation du dérivé de glucose (5) est réalisée selon le schéma réactionnel B suivant :
SCHEMA B
Le dérivé de glucose (5) (thioglycoside) est obtenu à partir du D- Glucose en deux étapes successives qui sont des réactions classiques de la chimie des sucres :
- une première étape de peracétylation en milieu anhydride acétique/acétate de sodium (Ac2OZAcONa) à 12O0C pendant lheure (le produit obtenu après précipitation dans l'eau glacée est recristallisé dans l'éthanol à 95%) selon le procédé décrit par K. Takeo, Carbohydrate Research, 1980, 87, 147. Le sous-produit peracétylé est obtenu avec un rendement de 90%, la configuration de la position anomérique est majoritairement β ;
- une deuxième étape d'activation de la position anomérique, dans du dichlorométhane anhydre, en présence de thiophénol et d'un acide de Lewis, en l'occurrence l'éthérate de trifluorure de bore (BF3-Et2O), à température ambiante pendant une heure selon le procédé décrit par A. K Choudhury, N. Roy, Synthetic Communications, 1996, 26, 3937. Cette thioalkylation permet d'atteindre le thioglycoside (5), après recristallisation dans Ie méthanol, et de manière quantitative. Le groupement thiophényle se trouve en position β en raison de la présence d'un groupement participant en position 2.
2) Deuxième étape : Préparation d'un bras espaceur glycosylé (6)
Ce bras espaceur glycosylé est préparé selon le Schéma réactionnel C suivant :
SCHEMA C
Le couplage de ces deux molécules est une réaction de glycosylation d'un glucose protégé sur une chaîne insaturée.
Le thioglycoside (5) (500 mg, 1,13 mmoles, 1 éq.) et le bras espaceur insaturé (3) (127 mg, 1,13 mmoles, 1 éq.) sont dissous dans le dichlorométhane anhydre, en présence de tamis moléculaire (630 mg). Ce mélange est maintenu sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante, puis le milieu réactionnel est amené à une température de -300C. De la N-iodosuccinimide (NIS) (510 mg, 2,26 mmoles, 2 éq.) est alors ajoutée, puis de l'acide trifluorométhanesulfonique (30 μl, 0,34 mmole, 0,15 éq./NIS). Le mélange est alors lentement ramené à température ambiante, sous agitation pendant 30 minutes. Le milieu réactionnel est ensuite neutralisé par une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium puis filtré sur célite. La phase organique est extraite, lavée successivement à l'eau, par une solution aqueuse et saturée de thiosulfate de sodium et par une solution aqueuse et saturée de chlorure de sodium. Les phases organiques réunies sont séchées sur.sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous
vide. Le résidu solide obtenu est purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice. Le produit (6) est obtenu avec un rendement de 70 %. 2) Troisième étape : Préparation du composé de formule fl-l)
Cette étape est réalisée selon le Schéma réactionnel D suivant :
SCHEMA D
Durant cette étape, 100 mg du composé (5) obtenu ci-dessus à l'étape précédente (2,26.10"4 mole, 1 éq.) ont été mis à réagir avec 71 μl (3,62.10"4 mole, 1,6 éq.) de triéthoxysilane en présence de 2,84 μl (4,5.10"4 mole) de catalyseur de Karstedt pendant 3 heures à une température de 500C environ pour conduire à un liquide incolore de composé de formule (6), avec un rendement de 60%.
EXEMPLE 2 : PREPARATION D'UN SUPPORT SOLIDE FONCTIONNALISE AVEC UN AGENT DE SILANISATION DE FORMULE (I)
Dans cet exemple, on a utilisé un substrat plan en SiO2. I) Réhydratation du substrat (réhydratation de Brown)
Un substrat de SiO2 a été mis à tremper pendant 2 heures à température ambiante dans un mélange d'eau désionisée (15 ml) et d'éthanol absolu (20 ml) renfermant 5 g de NaOH.
Le substrat a ensuite. _été,.lavé...à lleau désionisée, -puis il a été mis à tremper pendant 1 heure dans de l'acide chlorhydrique 0,2 N. Après trempage, le substrat
a de nouveau été lavé à l'eau désionisée puis séché à l'étuve à une température de 8O0C pendant 30 minutes
2) Silanisation du substrat par le composé de formule (1-1)
Le substrat réhydraté a été mis à tremper dans 10 ml d'une solution de trichloroéthylène (TCE) renfermant 10 mM (21 mg) de composé de formule (I- 1) tel que préparé à l'exemple 1 ci-dessus. Après 1 nuit à température ambiante, le substrat était silanisé par le composé de formule (I- 1) conforme à l'Invention.
Le substrat ainsi fonctionnalisé a ensuite été lavé au TCE, à l'éthanol et enfin au chloroforme. Il a ensuite été séché à l'étuve pendant 30 minutes à une température de 5O0C.
En vue d'une utilisation ultérieure, le substrat fonctionnalisé a été conservé sous atmosphère inerte (argon ou azote).
Ce substrat peut ensuite être utilisé pour la préparation d'une puce à sucre (croissance d'oligosaccharides sur le substrat silanisé ainsi préparé) ou de toute autre puce à molécule ou biomolécule (dans ce cas, le silane sucré qui fonctionnalise le substrat devient un espaceur pour l'accrochage de toute nouvelle molécule ou biomolécule, naturelle ou synthétique).
Claims
REVENDICATIONS
1. Agent de silanisation à fonction terminale saccharidique, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule (I) suivante : A-X-B (I) dans laquelle :
- l'unité A représente une molécule sonde de nature saccharidique ;
- l'unité X représente un bras espaceur constitué d'une chaîne carbonée ou hétérocarbonée comportant deux extrémités, l'une de ses deux extrémités reliant, de façon covalente, ledit bras espaceur X à A et l'autre extrémité reliant, de façon covalente, ledit bras espaceur X a B, ladite chaîne comportant au moins une insaturation éthylénique située entre ses deux extrémités ; étant entendu que ladite chaîne ne peut pas contenir plusieurs insaturations acétyléniques ;
- B est un groupement silanisé. 2. Agent de silanisation selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la molécule sonde de nature saccharidique présente un poids moléculaire compris entre 180 et 10 000 g/mol.
3. Agent de silanisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que la molécule sonde de nature saccharidique est choisie parmi les monosaccharides, les oligosaccharides, les polysaccharides, les glycoconjugués, les glycoprotéines, les glycolipides et les glycolipoprotéines.
4. Agent de silanisation selon la revendication 3, caractérisé par le fait que les monosaccharides sont choisis parmi la glucosamine, l'azidoglucosamine, le D-ribose, le D-xylose, le L-arabinose, le D-glucose, D-galactose, le D-mannose, le 2-désoxy-ribose, le L-fucose, la N-acétyl-D-glucosamine, la N-acétyl-D-galactosamine, l'acide N-acétylneuraminique, l'acide D-glucuronique, l'acide L-iduronique, le D-sorbitol et le D-mannitol.
5. Agent de silanisation selon la revendication 3, caractérisé par le fait _que les. oligosaccharides -sont- choisis -parmi le saccharose, le lactose, les fragments"
d'héparanes sulfates, les fragments saccharidiques de l'héparine, de chondroïtine ou de dermatanes sulfates et les antigènes de Lewis.
6. Agent de silanisation selon la revendication 3, caractérisé par le fait que les poly-oligosaccharides sont choisis parmi les fractions saccharidiques des héparanes sulfates, de l'héparine ou de la chondroïtine et les dermatanes sulfates.
7. Agent de silanisation selon la revendication 3, caractérisé par le fait que les glycoconjugués sont choisis parmi les héparanes sulfates, l'héparine, la chondroïtine et les dermatanes sulfates.
8. Agent de silanisation selon la revendication 3, caractérisé par le fait que les glycoprotéines sont choisies parmi l'immunoglobuline G et l'acide hyaluronique.
9. Agent de silanisation selon la revendication 3, caractérisé par le fait que les glycolipides sont choisis parmi les galactosyl-céramides, les gangliosides et les cérébrosides.
10. Agent de silanisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'une ou plusieurs des fonctions hydroxyle et/ou amîne des entités saccharidiques de la molécule sonde sont protégées par un ou plusieurs groupements protecteurs choisis parmi les groupements acétyle, benzyle et aryle, 2,2,2-trichloroéthyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, trichloroacétamidate, teri- butyloxycarbonyle, et fluoranylméthoxycarbonyle. 11. Agent de silanisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'une ou plusieurs des fonctions hydroxyle et/ou aminé des entités saccharidiques de la molécule sonde sont substituées par un ou plusieurs groupements hydrophobes choisis parmi les groupements benzyle, acétate, benzylidène, isopropylidène et phtalimide . 12. Agent de silanisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les liaisons covalentes assurant la fixation de chacune des extrémités de la chaîne constituant le bras espaceur X aux unités A et B sont issues de la réaction entre une fonction chimique initialement portée par le précurseur du bras espaεeur— X et -une fonction chimique complémentaire portée d'une part par la molécule sonde A et d'autre part par le groupement silanisé B.
13. Agent de silanisation selon la revendication 12, caractérisé par le fait que lesdites liaisons covalentes résultent de la réaction entre un radical hydroxyle et un groupement choisi parmi les atomes d'halogène et les groupements phosphite, trichloroacétamidate, thioalkyle, phosphate, pentényle, sulfoxyde et xanthate. 14. Agent de silanisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le bras espaceur X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C2-C4O ou aryle en C6-C40, ladite chaîne comportant au moins une insaturation éthylénique et pouvant éventuellement être interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi l'oxygène, l'azote, le soufre et le silicium, et/ou une ou plusieurs fonctions choisies parmi les fonctions amides, oximes et aminés tertiaires et/ou éventuellement substituée par un ou plusieurs substituants choisis parmi les chaînes alkyles linéaires ou ramifiées en C2-C2O ou aryle en C6-C20, lesdites chaînes pouvant éventuellement être également interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi l'oxygène, l'azote, le soufre et le silicium.. 15. Agent de silanisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le groupement silanisé B est choisi parmi les groupements -Si(Rj)3, -SiR](R2)2 et -SiRjR2R3 dans lesquels les radicaux R1, R2 et R3, indépendamment les uns des autres, représentent un atome d'halogène, un radical alkoxy en Ci-C4, un radical alkyle en Ci-C4, un radical amino ou une fonction ester. 16. Agent de silanisation selon la revendication 15, caractérisé par le fait que le groupement silanisé est choisi parmi les groupements triméthoxysilyle, triéthoxysilyle, triméthylsilyle et triéthylsilyle.
17. Agent de silanisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les composés de formule (I) dans lesquels :
- A est choisi parmi les monosaccharides, les oligosaccharides et les polysaccharides,
- X représente une chaîne carbonée ayant de 2 à 40 atomes de carbone, comportant -au -moins- une insaturation éthyléniqύë," ladite chaîne étant linéaire ou ramifiée, et éventuellement interrompue par un ou plusieurs
cycles et/ou une ou plusieurs fonctions telles que les fonctions amides, oximes et aminés tertiaires ;
- B représente un groupement triméthoxysilyle ou triéthoxysilyle. 18. Agent de silanisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les composés de formules (I- 1) et (1-2) suivantes :
dans lesquelles Ac représente le groupe acétyle. 10 19. Utilisation d'au moins un agent de silanisation de formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la fonctionnalisation de supports solides.
20. Utilisation d'au moins un agent de silanisation de formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la fabrication de puces à sucres. 15 21. Procédé de préparation d'un support solide fonctionnalisé par des molécules sondes de nature saccharidique, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une étape de silanisation d'au moins une surface d'un support solide avec une solution d'au moins un agent de silanisation de formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18 dans un solvant organique. _ .. 20 - -22-. -Support solide caractérisé par le fait" qu'il comporte au moins une
surface fonctionnalisée par un ou plusieurs agents de silanisation de formule (I) tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 18.
23. Utilisation d'un support solide tel que défini à la revendication 22 pour l'identification, par criblage, de séquences oligosaccharidiques reconnaissant une protéine d'intérêt ou de ligands reconnaissant un saccharide d'intérêt.
24. Procédé de criblage de molécules saccharidiques ou, respectivement, de ligands protéiques, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une étape de mise en contact d'un support solide tel que défini à la revendication 22 avec une solution renfermant une ou plusieurs molécules oligosaccharidique potentielles ou, respectivement un ou plusieurs ligands protéiques potentiels.
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