JP7198482B2 - 糖化合物、糖化合物の製造方法、ENGase活性検出用組成物、新規ENGaseのスクリーニング方法、及びENGase活性阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
する酵素は限定されている。特に抗体上の糖鎖に多く見られるフコース残基が結合した糖鎖に作用するENGaseは限られており、効率的かつ様々な非還元末端側糖鎖構造に対応したフコースつき糖鎖を切断する新規のENGase探索が求められている。しかしENGaseの活性測定は、糖タンパク質や糖プペプチドを基質として糖鎖切断反応をSDS-PAGEやHPLCによって追跡する必要があり、網羅的な酵素探索は困難であった。また、ENGaseの基質特異性をタンパク質工学的に拡張する試み(非特許文献3参照)においても同様に、変異体スクリーニングが問題となっていた。
〔2〕前記蛍光基と前記消光基の組合せが、下記(i)~(iv)の何れかである、〔1〕に記載の糖化合物。
(i)下記式(d-1)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(ii)下記式(d-2)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(iii)下記式(d-3)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(iv)下記式(d-4)で表される蛍光基と下記式(a-2)で表される消光基の組合せ
〔3〕〔1〕又は〔2〕に記載の糖化合物を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)活性検出用組成物。
〔4〕下記式(IV)で表される化合物から下記式(I)で表される化合物を生成する反応工程を含む、糖化合物の製造方法。
〔5〕下記式(II-1)で表される化合物と下記式(III-1)で表される化合物を反応させて下記式(IV-1)で表される化合物を生成する糖転移反応工程を含む、糖化合物の製造方法。
前記被検化合物を接触させたエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)の候補に下記式(I)で表される糖化合物を接触させて、前記糖化合物の分解活性を確認する活性確認工程
を含む、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)のスクリーニング方法。
含んでいてもよい炭素原子数1~6の2価の炭化水素基を、Z1及びZ2は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。)
〔7〕被検化合物をエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)に接触させる接触工程、及び
前記被検化合物を接触させたエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)に下記式(I)で表される糖化合物を接触させて、前記糖化合物の分解活性を確認する活性確認工程
を含む、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)活性阻害剤のスクリーニング方法。
〔8〕下記式(I´)で表される糖化合物。
特にフコースが結合した糖鎖に作用するENGase活性を簡易的に検出することができ、フコースが結合した糖鎖に作用する新規のENGaseや、フコースが結合した糖鎖に作用するENGaseの活性阻害剤等を効率的にスクリーニングすることができる。
また、本明細書では六糖構造の糖化合物を例にして記載する部分もあるが、それは一例に過ぎず、七糖構造の糖化合物や八糖構造の糖化合物、九糖構造の糖化合物、十糖構造の糖化合物であってもよい。例えば、後述する式(I´)で表される化合物が挙げられる。
本発明の一態様である糖化合物(以下、「本発明の糖化合物」と略す場合がある。)は、下記式(I)で表される化合物である。
ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、tert-ブチルジフェニルシリル基等のシリルエーテル系保護基等が挙げられる。
炭化水素基としては、メチル基(-CH3、-Me)、エチル基(-C2H5、-Et)、n-プロピル基(-nC3H7、-nPr)、i-プロピル基(-iC3H7、-iPr)、n-ブチル基(-nC4H9、-nBu)、t-ブチル基(-tC4H9、-tBu)、n-ペンチル基(-nC5H11)、n-ヘキシル基(-nC6H13,-nHex)、シクロヘキシル基(-cC6H11,-Cy)、フェニル基(-C6H5,-Ph)等が挙げられる。
アミノ基の保護基としては、t-ブトキシカルボニル基(Boc)、ベンジルオキシカルボニル基(Cbz)、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル基(Troc)、アリルオキシカルボニル基(Alloc)等のアルコキシカルボニル系保護基;アセチル基、トリフルオロアセチル基(Tfa)等のアシル系保護基;p-トルエンスルホニル基(Ts)、2-ニトロベンゼンスルホニル基(Ns)等のアルキル(アリール)スルホニル基等が挙げられる。
(i)下記式(d-1)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(ii)下記式(d-2)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(iii)下記式(d-3)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(iv)下記式(d-4)で表される蛍光基と下記式(a-2)で表される消光基の組合せ
なお、式(d-1)~(d-4)及び式(a-1)及び(a-2)中のRとR’としては、前述のものと同様のものが挙げられる。
本発明の糖化合物の製造方法は、特に限定されず、公知の有機合成反応、化学酵素法等を組み合せて製造してもよいが、下記式(IV)で表される化合物から下記式(I)で表される化合物を生成する反応工程を含む方法によって製造することが好ましい。
また、上記反応工程の詳細としては、例えば、式(IV)で表される化合物として下記化合物18を、式(I)で表される化合物として下記化合物1を想定した場合、例えば、化合物18をDMSOに溶解し、DMAPを加えた後、N-メチルアントラニル酸、HATUを加え室温で撹拌し、洗浄、精製等をして化合物1を得ることができる。
本発明の一態様は、下記式(II-1)で表される化合物と下記式(III-1)で表される化合物を反応させて下記式(IV-1)で表される化合物を生成する糖結合反応工程を含む、糖化合物の製造方法である。
尚、本製造方法の好ましい一態様は、前記<糖化合物の製造方法1>に記載した、化合物2と化合物3を反応させて化合物16を生成する糖結合反応工程を含む、糖化合物の製造方法である。すなわち、当該製造方法で製造される糖化合物は、本発明の糖化合物を製造する際の中間生成物ということもできる。
ENGase活性阻害剤は、抗体医薬品の糖鎖モデリングを行う際、ENGaseで抗体上の糖鎖を切断、反応が進行したのち、残った酵素活性を完全に阻害するのに有用である。。本発明の糖化合物は、ENGase活性を簡易的に検出することができるため、被検化合物に接触させたENGaseを本発明の糖化合物と接触させて、本発明の糖化合物の分解活性を確認することで、ENGase活性阻害剤を効率的にスクリーニングすることができる。なお、被検化合物をENGaseに接触させる接触工程(以下、「接触工程」と略す場合がある。)、及び被検化合物を接触させたENGaseに式(I)で表される糖化合物を接触させて、糖化合物の分解活性を確認する活性確認工程(以下、「活性確認工程」と略す場合がある。)を含むENGase活性阻害剤のスクリーニング方法も本発明の一態様である。
と判断することができる。
が挙げられ、具体的にはEndo-F3やEndo-MW251N等のフコースが結合した抗体上の糖鎖などに作用するENGaseが挙げられる。
本発明の一態様は、被検化合物をエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)の候補に接触させる接触工程、及び前記被検化合物を接触させたエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)の候補に式(I)で表される糖化合物を接触させて、前記糖化合物の分解活性を確認する活性確認工程を含む、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)のスクリーニング方法である。
その他、本態様における接触工程及び活性確認工程の態様については、前記<エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)活性阻害剤のスクリーニング方法>における接触工程及び活性確認工程の態様を援用する。ただし、活性確認工程における式(I)で表される糖化合物の分解活性の確認方法としては、例えば、被検化合物を接触させたENGaseの候補の糖化合物の分解活性を測定し、対照に対して有意な活性を示した場合には、ENGaseとして有用である、新規のENGaseであるなどと判断することができる。
チルグルコサミン、N-アセチルラクトサミン、又はシアリルラクトサミンを、R2は水素原子、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルラクトサミン、又はシアリルラクトサミンを、Z1及びZ2は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。)
また、上記式(I´)の糖化合物として、例えば10糖の糖化合物としては、下記式で表されるものが挙げられる。
(Methoxyphenyl 4,6-O-benzylidene-3-O-pivaloyl-2-O-tert-butyldimethylsilyl-α-D-
mannopyranosyl-(1-3)-[4,6-O-benzylidene-3-O-pivaloyl-2-O-tert-butyldimethylsilyl-α-D-mannopyranosyl-(1-6)]-β-D-galactopyranosyl-(1-4)-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside (9)の合成)
2糖受容体(50 mg, 0.066 mmol)と単糖供与体(81 mg, 0.145 mmol)をジクロロメタ
ン(8 mL)に溶解させ、-78 ℃でキャノラーを用いて乾燥モルキュラーシーブズ(4A, 0.5 g)、N-ヨードコハク酸イミド(49 mg, 0.218 mmol)、トリフルオロメタンスルホン酸銀(19 mg, 0.073 mmol)へ加えた。-78 ℃で4時間撹拌した後、温度を0 ℃に上げ16時間撹拌し、トリエチルアミンを用いて反応を終了させた。反応液を酢酸エチルで希釈し、不要物をセライト濾過により除去後、チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水、1 M塩酸、
飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶液を減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル = 4/1 → 1/1 gradient)により精製し、化合物9(56.1 mg, 0.034 mmol, 51 %)を得た。構造決定のため、化合物9をアセチル化した。得られた化合物の1HNMRの測定結果(NMRチャート)を図1、図2に示す。また、得られた化合物の13CNMRの測定結果(NMRチャート)を図3、図4に示す。
Rf = 0.45(ヘキサン/酢酸エチル = 2/1)
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.66-7.30 (m, 17H), 7.05-7.04 (m, 2H), 6.93-6.79 (m, 5H), 6.69-6.65 (m, 2H), 5.60 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.57 (s, 2H), 5.44-5.40 (m, 1H), 5.30 (dd, J = 10.3, 3.1 Hz, 1H), 5.19-5.12 (m, 2H), 4.87 (d, J = 1.4 Hz, 1H),
4.77 (dd, J = 34.5, 12.2 Hz, 2H), 4.62-4.58 (m, 1H), 4.50 (dd, J = 12.4, 3.4 Hz, 2H), 4.40 (dd, J = 10.8, 8.4 Hz, 1H), 4.34-4.29 (m, 4H), 4.14-4.00 (m, 4H), 3.91-3.75 (m, 8H), 3.65-3.63 (m, 1H), 3.44 (q, J = 4.9 Hz, 1H), 2.97 (t, J = 9.6 H
z, 1H), 2.11 (d, J = 49.8 Hz, 6H), 1.71-1.60 (m, 3H), 1.32-1.18 (m, 18H), 0.93 (d, J = 9.3 Hz, 19H), 0.12 (s, 3H), 0.07 (s, 3H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H)
13C-NMR (151 MHz, CDCl3) δ 178.08, 177.92, 170.28, 169.49, 155.65, 151.19, 138.87, 138.23, 137.91, 137.86, 134.11, 129.08, 129.01, 128.87, 128.47, 128.41, 128.28, 128.21, 128.03, 127.44, 126.33, 126.22, 123.70, 118.97, 114.66, 102.57, 101.84, 101.70, 100.90, 97.89, 97.66, 78.01, 77.57, 77.36, 77.15, 76.94, 76.89, 76.82, 75.43, 74.74, 73.90, 72.93, 71.06, 70.86, 70.69, 70.63, 70.51, 70.45, 69.34, 69.18, 68.12, 65.20, 65.11, 64.99, 55.94, 55.90, 39.26, 39.23, 27.63, 27.60, 26.19, 26.12, 21.33, 21.04, 18.31, 0.34
化合物(1.09 g, 0.66 mmol)をジクロロメタン(10 mL)に溶解させ、ピリジン(1.6 mL, 19.8 mmol)を加えた後、0 ℃でトリフルオロメタンスルホン酸無水物(1.1 mL, 6.6
mmol)を加え2.5時間撹拌させた。反応の終了はTLCにより確認した。反応液を酢酸エチ
ルにより希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル = 7/3 → 酢酸エチルonly gradient)を用いて精製し、得られた化合物をトルエンで共沸、真空乾燥後、トルエン(25 mL)に溶解させ、0 ℃でテトラ
ブチルアンモニウムアジド(0.181 g, 0.726 mmol)を加え室温で4時間反応させた。反応の終了はTLCにより確認した。反応液を酢酸エチルにより希釈し、飽和食塩水、飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル = 7/3 → 酢酸エチルonly gradient)を用いて精製し、得られた化合物をトルエンで共沸、真空乾燥後、トルエン(26 mL)に溶解させ、セシウムアセテート(1.32 g, 6.60 mmol)、18-crown-6(1.92 g, 6.60 mmol)を加え、超音波をかけ一晩反応させた。反応の終
了はTLCにより確認した。反応液を酢酸エチルにより希釈し、飽和食塩水、飽和炭酸水素
ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル = 4/1 → 酢酸エチルonly gradient)を用いて精製し化合物0.950 g(0.56 mmol, 85 %)を得た。得られた化合物の1HNMRの測定結果(NMRチャート)を図5、図6に示す。また、得られた化合物の13CNMRの測定結果(NMRチャート)を図7、図8に示す。
Rf = 0.40(トルエン/酢酸エチル = 8/1)
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.65 (m, 17H), 6.97-6.66 (m, 9H), 5.54 (t, J = 8.4 Hz, 3H), 5.34-5.32 (m, 1H), 5.31-5.23 (m, 2H), 4.93 (s, 1H), 4.78 (d, J = 2.4
Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.51-4.47 (m, 2H), 4.36 (dd,
J = 10.1, 8.8 Hz, 1H), 4.32-4.23 (m, 4H), 4.18-4.04 (m, 4H), 3.95-3.72 (m, 9H),
3.65-3.60 (m, 2H), 3.32 (dd, J = 10.1, 3.3 Hz, 1H), 3.02 (dt, J = 10.0, 2.7 Hz,
1H), 2.24 (s, 3H), 1.66 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 1.20 (s, 9H), 1.14 (s, 9H), 0.98 (s, 9H), 0.84 (s, 9H), 0.14-0.09 (m, 6H), -0.09 (d, J = 5.8 Hz, 6H)
13C-NMR (151 MHz, CDCl3) δ 177.91, 177.78, 170.54, 155.61, 151.12, 138.65, 138.29, 137.93, 137.80, 133.96, 131.94, 128.95, 128.85, 128.56, 128.37, 128.34, 128.23, 128.20, 127.44, 126.46, 126.33, 123.62, 118.85, 114.64, 104.29, 101.72, 101.68, 100.21, 97.81, 80.30, 78.55, 77.57, 77.36, 77.15, 76.74, 76.53, 74.93, 74.82, 73.94, 73.65, 71.14, 70.80, 70.69, 70.41, 69.15, 69.04, 68.51, 66.62, 65.63, 65.18, 59.82, 55.93, 55.88, 39.26, 39.18, 27.64, 27.57, 26.06, 25.96, 21.34, 18.34, 18.15, 0.34, -4.20, -4.51, -4.71
酢酸エチル = 18/7 → 21/29 gradient)により精製し、化合物13(0.267 g, 0.180 mmol)を収率62 %で得た。得られた化合物の1HNMRの測定結果(NMRチャート)を図9
、図10に示す。また、得られた化合物の13CNMRの測定結果(NMRチャート)を図11、図12に示す。
Rf = 0.37(トルエン/酢酸エチル = 2/1)
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.65-6.68 (m, 28H; aromatic H), 5.61 (d, J= 8.2 Hz, 1
H; H-1a), 5.56 (d, J = 5.2 Hz, 2H; -CHPh), 5.31 (d, J = 3.4 Hz, 1H; H-2b), 5.29-5.25 (m, 2H; H-3c, H-3d), 5.08 (d, J = 1.2 Hz; 1H, H-1c), 5.01 (d, J = 1.4 Hz, 1H; H-1d), 4.87 (d, J = 12.7 Hz, 1H; -CH2Ph), 4.80 (d, J=12.0, 1H; -CH2Ph), 4.54
(s, 1H; H-1b), 4.44 (d, J = 12.0 Hz, 1H; -CH2Ph), 4.38-4.28 (m, 4H; H-2a, H-6c, H-6d, -CH2Ph), 4.25-4.24 (m, 1H; H-2c), 4.22-4.17 (m, 2H; H-3a, H-6c), 4.12 (q, J = 9.6 Hz, 2H; H-4c, H-4d), 4.06-4.05 (m, 1H; H-2d), 4.00-3.89 (m, 2H; H-5c, H-5d), 3.86-3.69 (m, 10H; H-5a, H-6a, H-4b, H-6b, H-6c, H-6d, -OCH3), 3.63-3.62 (d, J = 8.6 Hz, 1H; H-4a), 3.36 (dd, J = 10.0, 3.1 Hz, 1H; H-3b), 3.05-3.02 (m, 1H; H-5b), 2.34 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 2.22 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 2.20 (s, 3H; -COCH3), 1.23 (s, 9H; -CO(CH3)3), 1.19 (s, 9H; -CO(CH3)3)
13C-NMR (151 MHz, CDCl3) δ 177.26, 176.99, 170.02, 167.98, 155.43, 150.84, 138.47, 137.87, 137.51, 137.44, 133.83, 129.13, 128.87, 128.78, 128.27, 128.19, 128.09, 128.02, 127.29, 126.16, 126.04, 125.39, 123.43, 118.69, 114.44, 102.72 (C-1c), 101.63 (-CHPh), 101.47 (-CHPh), 100.81 (C-1d), 98.76, 97.59 (C-1a), 79.03 (C-3b), 76.91 (C-3a), 76.22, 75.94 (C-4c,d), 74.77(C-2a), 74.54 (C-4a), 73.73 (-CH2Ph), 73.69 (C-5b), 70.27 (C-3d), 70.14 (C-3c), 69.99 (C-2c), 69.93 (C-2b), 69.65
(C-2d), 68.90 (C-6c), 68.68 (C-5a), 68.26 (C-6a), 66.31 (C-6b), 64.91, 64.52 (C-5c,d), 58.99 (C-4b), 55.71 (C-6d), 55.66, 39.12, 39.03, 27.24 (-CO(CH3)3), 27.22 (-CO(CH3)3), 21.07 (-COCH3), 0.10
応液を酢酸エチルで希釈し、1 M塩酸、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水の順に洗浄
した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル = 91/9 → 3/1 gradient)により精製し、化合物14(0.467 g, 0.298 mmol)を収率96 %で得た。得られた化合物の1HNMRの測定結
果(NMRチャート)を図13、図14に示す。また、得られた化合物の13CNMRの測定結果(NMRチャート)を図15、図16に示す。
Rf = 0.61(トルエン/酢酸エチル = 3/1)
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.77-6.62 (m, 28H; aromatic H), 5.58 (d, J = 17.9 Hz,
2H -CHPh), 5.56 (d, J = 8.6 Hz, 1H; H-1a), 5.45 (q, J = 1.7 Hz, 1H; H-2c), 5.39-5.35 (m, 3H; H-3c, H-2d), 5.31 (d, J = 3.1 Hz, 1H; H-2b), 5.01 (d, J = 1.4 Hz, 1H; H-1c), 4.94 (d, J = 1.0 Hz, 1H; H-1d), 4.79 (d, J = 12.0 Hz, 1H; -CH2Ph), 4.71 (d, J = 12.7 Hz, 1H; -CH2Ph), 4.56 (s, 1H; H-1b), 4.42 (dd, J = 16.2, 12.4 Hz, 2H; -CH2Ph), 4.36-4.31 (m, 3H; H-2a, H-6c, H-6d), 4.22-4.18 (m, 2H; H-3a), 4.07 (t, J = 9.8 Hz, 1H; H-3d), 4.01 (td, J = 9.6, 2.7 Hz, 2H; H-4c, H-4d), 3.94 (td, J = 9.8, 4.5 Hz, 1H; H-6d), 3.85-3.75 (m, 7H; H-5a, H-6a, H-4b, H-6b, H-5c, H
-5d), 3.70 (s, 3H; -OCH3), 3.60-3.62 (m, 1H; H-4a), 3.32 (dd, J = 10.3, 3.1 Hz, 1H; H-3b), 2.99 (dt, J = 10.2, 2.7 Hz, 1H; H-5b), 2.24 (s, 3H; -COCH3), 2.20 (s,
3H; -COCH3), 1.78 (s, 3H; -COCH3), 1.16 (s, 9H; -CO(CH3)3), 1.09 (s, 9H; -CO(CH3)3)
13C-NMR (151 MHz, CHLOROFORM-D) δ 176.95, 176.90, 170.67, 169.85, 169.56, 155.62, 151.13, 138.51, 138.12, 137.62, 137.60, 133.97, 129.15, 129.08, 128.99, 128.65, 128.44, 128.27, 127.57, 126.44, 126.30, 123.61, 118.84, 114.65, 101.88 (-CHPh), 101.72 (-CHPh), 100.69 (C-1c), 99.32 (C-1b,1d), 97.84 (C-1a), 79.32 (C-3a), 79.07 (C-3b), 76.68 (C-4c), 76.49 (C-3d), 76.36 (C-6), (74.85, 74.81, 74.64)( C-4a, C-5b, -CH2Ph), 73.87, 70.44 (C-2c), 70.04 (C-2d), 69.94 (C-2b), 69.00 (C-2a),
68.92 (C-5a), 68.51, 68.13 (C-6a), 67.79 (C-3c), 66.42, 65.12, 64.51, 58.91 (C-4b), 55.89, 39.15, 39.04, 27.31 (-CO(CH3)3), 27.23 (-CO(CH3)3), 21.23 (-COCH3), 21.18 (-COCH3), 20.69 (-COCH3), 0.34
化合物14(0.470 g, 0.298 mmol)をトルエン(750 μL)に溶解させ、アセトニトリル(1 mL)、水(750 μL)を加えた後、-10 ℃でCAN(0.563 g, 1.043 mol)を加えた。-10 ℃で2時間撹拌し、TLCにより反応の終了を確認した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水の順に洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル = 17/8 → 1/1 gradient)により精製し化合物15(0.338 g, 0.229 mmol)を収率77 %で
得た。得られた化合物の1HNMRの測定結果(NMRチャート)を図17、図18に示す。
また、得られた化合物の13CNMRの測定結果(NMRチャート)を図19、図20に示す。
Rf = 0.32(トルエン/酢酸エチル = 2/1)
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.74-6.77 (m, 24H; aromatic H), 5.58 (d, J = 12.0 Hz,
2H; -CHPh), 5.44-5.39 (m, 2H; H-2c, H-2d), 5.34 (dd, J = 10.3, 3.8 Hz, 1H; H-3c), 5.28-5.24 (m, 2H; H-1a, H-2b), 5.00 (d, J = 1.4 Hz, 1H; H-1c), 4.90 (d, J = 10.0 Hz, 1H; H-1d), 4.80 (d, J = 12.0 Hz, 1H; -CH2Ph), 4.69 (d, J = 12.0 Hz, 1H; -CH2Ph), 4.50 (s, 1H; H-1b), 4.41 (dd, J = 21.5, 12.2 Hz, 2H; -CH2Ph), 4.32 (td,
2H; H-6c), 4.27 (dd, J = 10.7, 8.9 Hz, 1H; H-3a), 4.15 (t, J = 9.5 Hz, 1H; H-4a
), 4.09-4.05 (m, 2H; H-2a, H-4c), 4.03-3.92 (m, 2H; H-5c, H-3d), 3.84-3.72 (m, 7H; H-4a, H-6a, H-6c, H-4d, H-6d), 3.61 (d, J = 9.6 Hz, 1H; H-5a), 3.29 (dd, J = 10.0, 3.1 Hz, 1H; H-3b), 3.14 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 3.03-3.00 (m, 1H; H-5b), 2.20
(d, J = 1.4 Hz, 6H; -COCH3), 1.84 (s, 3H; -COCH3), 1.16 (s, 9 H; -CO(CH3)3), 1.09 (s, 9 H; -CO(CH3)3)
13C-NMR (151 MHz, CDCl3) δ 177.14, 177.01, 170.58, 169.88, 169.63, 168.21, 138.60, 138.08, 137.62, 133.99, 131.97, 129.38, 129.16, 129.10, 129.06, 128.59, 128.55, 128.53, 128.45, 128.30, 127.58, 126.43, 126.33, 125.64, 123.56, 101.88 (-CHPh), 101.74 (-CHPh), 100.74 (C-1c), 99.27 (C-1d), 98.64 (C-1b), 93.28 (C-1a), 79.21 (C-3b), 78.43 (C-4a), 76.68 (C-3d), 76.45 (C-4c), 75.85 (C-3a), 74.73 (C-5a),
74.60 (C-5b), 73.99 (-CH2Ph), 70.43 (C-2c), 70.09(C-6d), 69.90 (C-2b), 68.96 (C-6c), 68.90 (C-4d), 68.65 (C-6a), 68.24 (C-2d), 67.81 (C-3c), 66.73 (C-6b), 65.14 (C-5d), 64.47 (C-5c), 59.16 (C-4b), 57.72 (C-2a), 39.16, 39.09, 27.31 (-CO(CH3)3), 27.24 (-CO(CH3)3), 21.22 (-COCH3), 21.18 (-COCH3), 20.77(-COCH3), 0.34
化合物15(0.338 g, 229 mmol)をジクロロメタン(5 mL)に溶解させ、-10 ℃でDAST
(21 μL, 0.13 mmol)を加えた。-10 ℃で1.5時間撹拌し、0 ℃でメタノール飽和重曹水を用いて反応を終了させた。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶液を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル = 17/8 →14/11 gradient)により精製し化合物2(0.309 g, 0.209 mmol)を収率91 %で得た。得られた化合物の1HNMRの測定結果(NMRチ
ャート)を図21、図22に示す。また、得られた化合物の13CNMRの測定結果(NMRチャート)を図23、図24に示す。
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.70 (m, 24H), 6.76-7.00 (m, 7H), 5.78 (dd, J = 53.6, 7.6 Hz, 1H), 5.53-5.63 (m, 3H), 5.43-5.45 (m, 1H), 5.32-5.39 (m, 4H), 5.26-5.28 (m, 1H), 4.91-5.02 (m, 3H), 4.79-4.82 (m, 1H), 4.68 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.50 (s, 1H), 4.41-4.44 (m, 2H), 4.15-4.38 (m, 7H), 3.91-4.09 (m, 5H), 3.77-3.85
(m, 8H), 3.56-3.71 (m, 2H), 3.29 (dd, J = 10.1, 3.3 Hz, 1H), 2.96-2.98 (m, 1H),
2.20-2.22 (m, 7H), 1.79 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 1.60 (s, 2H), 1.05-1.16 (m, 24H), -0.00 (s, 2H)
13C-NMR (151 MHz, CDCl3) δ 176.72, 176.68, 170.39, 169.64, 169.34, 167.55, 138.
06, 137.62, 137.35, 133.89, 131.59, 128.92, 128.88, 128.84, 128.61, 128.43, 128.38, 128.21, 128.07, 127.44, 127.38, 126.18, 126.04, 123.44, 105.55, 104.14, 101.64, 101.46, 100.45, 99.08, 98.74, 78.81, 78.21, 77.33, 77.12, 76.91, 76.40, 76.21, 75.11, 75.04, 74.60, 74.35, 73.82, 70.17, 69.81, 69.59, 68.75, 68.66, 67.91, 67.87, 67.52, 66.28, 64.90, 64.33, 58.67, 55.68, 55.53, 38.90, 38.81, 27.07, 27.03, 26.98, 20.99, 20.94, 20.44, 0.10
ロメタンスルホン酸銀(24 mg, 0.094 mmol)、ハフノセンジクロリド(18 mg, 0.0018 g)へキャノラーを用いて加えた。-40 ℃で4時間撹拌した後、トリエチルアミンを用いて
反応を終了させた。反応液を酢酸エチルで希釈し、不要物をセライト濾過により除去後、飽和重曹水、飽和食塩水の順で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶液を減圧留去した。得られた残渣をゲル濾過クロマトグラフィー(SX-1 トルエン100 %)により6糖画分を分取し、その後シリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル =
43/7 → 33/17 gradient)により精製し、化合物16(37.8 mg, 0.016 mmol, 54 %)を得た。得られた化合物の1HNMRの測定結果(NMRチャート)を図25、図26に示す。また、得られた化合物の13CNMRの測定結果(NMRチャート)を図27、図28に示す。Rf = 0.57(トルエン/酢酸エチル = 4/1)
1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.13-6.52 (m, 48H; aromatic H), 5.60 (s, 1H; -CHPh), 5.47 (s, 1H; -CHPh), 5.43 (q, J = 1.7 Hz, 1H), 5.38-5.27 (m, 5H; H-1c, H-1d, H-3e), 4.99 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 4.95-4.80 (m, 8H; H-1b, H-1f), 4.71 (dd, J = 30.9,
12.0 Hz, 2H), 4.63-4.52 (m, 3H), 4.47 (s, 1H; H-1d), 4.37-4.25 (m, 4H; H-2a), 4.19-3.85 (m, 12H; H-2c H-2b, H-3b,H-4e), 3.82-3.52 (m, 10H; H-4b), 3.49 (d, J = 10.0 Hz, 1H; H-3), c3.29-3.22 (m, 4H), 3.00 (td, J = 6.6, 3.0 Hz, 2H), 2.92-2.88
(m, 1H; ), 2.20 (s, 3H; -COCH3), 2.00 (s, 3H; -COCH3), 1.71 (s, 3H; -COCH3), 1.58-1.48 (m, 2H), 1.20-1.12 (m, 9H), 1.12-1.05 (m, 9H), 1.02-0.94 (m, 3H)
13C-NMR (151 MHz, CDCl3) δ 176.92, 176.86, 170.19, 169.85, 169.46, 168.19, 167.95, 139.37, 139.27, 139.09, 138.99, 138.72, 138.08, 137.68, 137.55, 134.11, 133.99, 132.06, 131.76, 129.11, 129.00, 128.95, 128.80, 128.77, 128.70, 128.55, 128.52, 128.45, 128.42, 128.36, 128.28, 128.23, 128.14, 127.99, 127.80, 127.70, 127.53, 127.20, 126.46, 126.23, 123.68, 123.51, 101.85 (-CHPh), 101.61 (-CHPh), 100.68 (C-1e), 99.36 (C-1d), 99.31 (C-1f), 98.16 (C-1a), 97.25 (C-1c), 97.17, 79.78 (C-3b), 79.51 (C-2a), 79.34, 78.01 (C-4b), 77.57, 77.36, 77.15, 76.83, 76.65, 76.49, 76.35, 75.92, 75.06, 74.90, 74.82, 74.63 (-CH2Ph), 74.18, 74.04, 73.68 (-CH2Ph), 73.49, 73.10, 70.45, 69.96, 69.72, 69.00, 68.92, 68.22, 68.08, 67.79, 66.48, 66.25, 65.78, 65.10, 64.45, 64.08, 59.01, 56.84, 56.01, 48.27, 39.13, 39.01, 29.02, 27.30 (-CO(CH3)3), 27.22 (-CO(CH3)3), 21.18 (-COCH3), 20.83 (-COCH3), 20.62 (-COCH3), 16.75 (C-6b), 0.33
水を(1 mL)加え80 ℃で1時間撹拌した。TLCにより反応の終了を確認した後、溶液を減
圧留去した。トルエン共沸後、残渣をn-ブタノール(1 mL)に溶かした後、エチレンジアミン(1 mL)を加え90 ℃で一晩撹拌させた。TLCにより反応の終了を確認した後、反応液を濃縮、トルエン共沸し真空乾燥させた。その後残渣をピリジン(1 mL)に溶かし、無水酢酸(500 μL)を加え、40 ℃で一晩撹拌させた。反応はメタノールを用いて終了させ、反応溶液をクロロホルムで希釈した後、1 M塩酸、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水
の順に洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶液を減圧留去した。残渣をTHF(500 μL)に溶かし、メタノール(500 μL)、1 Mナトリウムメトキシドを加えた後、室温で一晩撹拌させた。反応はアンバーリスト50により終了させた。反応溶液を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルムonly → クロロホルム/メタノール = 1/1 gradient)、ゲル濾過クロマトグラフィー(SX-1 メタノールonly
)により精製し、化合物(18.2 mg, 0.008 mmol, 43 %)を得た。化合物に水(20 mL)、水酸化パラジウム(20 mg)を加え二晩撹拌させた。セライト濾過にて水酸化パラジウム
を除去し溶液を凍結乾燥した。残渣を水に溶かしISOLUTE 18C(水only → 水/アセトニトリル95/5)により精製後、化合物(5 mg, 0.004 mmol, 50 %)を得た。得られた化合物の1HNMRの測定結果(NMRチャート)を図29、図30に示す。
1H-NMR (600 MHz, D2O) δ 5.05 (s, 1H), 4.92 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.74 (s, 1H), 4.66 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 3.58-4.12 (m, 37H), 3.03-3.08 (m, 3H), 2.01-2.12 (m, 6H),
1.91-1.99 (m, 3H), 1.23 (d, J = 6.5 Hz, 3H)
時間後、水で希釈させた後Et2Oにより洗浄した。凍結乾燥をした後、逆相フラッシュカラム(H2O/CH3CN = 77/23) により精製し化合物18(2.7 mg, 2.1 μmol)を収率47 %で得た
。得られた化合物の1HNMRの測定結果(NMRチャート)を図31、図32に示す。
1H-NMR (600 MHz, D2O) δ 9.12 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.45 (s, 0H), 8.31 (dd, J = 9.6, 2.7 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.01-5.10 (m, 1H), 4.92 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 4.86 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.68 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.11-3.55 (m, 39H), 2.95 (t, J = 10.1 Hz, 1H), 2.09 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.14 (d, J = 6.5 Hz, 3H)
μmol)を加え室温で撹拌させた。6時間後、水で希釈させた後Et2Oにより洗浄した。凍結乾燥をした後、逆相フラッシュカラム(H2O/CH3CN = 77/23)により精製し化合物1を収率32 %で得た。得られた化合物の1HNMRの測定結果(NMRチャート)を図33、図34に示す。
1H-NMR (600 MHz, D2O) δ 9.13 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.44 (s, 0H), 8.32 (dd, J = 9.6, 2.7 Hz, 1H), 7.49-7.42 (m, 2H), 7.13 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.89-6.77 (m, 2H),
4.96 (s, 1H), 4.87 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.79-4.74 (m, 8H), 4.69 (d, J = 7.9 Hz,
1H), 4.53 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.40 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 4.31 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.07-3.50 (m, 45H), 2.83 (s, 4H), 2.09-1.90 (m, 9H), 1.15 (d, J = 6.5 Hz, 4H)
(方法1:HPLCを用いた天然型6糖-DNPの加水分解反応の活性検出)
5μMの天然型6糖DNP体(Man3GN2(Fuc)-DNP)、酵素Endo-M-W251N 2.4μgのリン酸ナトリウムバッファー(40mM,pH6)溶液100μLを30℃で2時間インキュベートした。反応は、15、30、60、120分ごとに反応液を2μLずつ分注し、8μLのアセトニトリルに加え、反応を停止した。反応混合液を30μLの水で希釈し、HPLC(TOSOH TSK-gel ODS-100V,5μm,4.6mm×15cm,水/アセトニトリル=97/3~60/40,0.1%TFA溶液,流速1mL/min,15分間、島津超高速液体クロマトグラフ Nexera)にて、UV360nmで検出し、分析した。反応混合液のHPLCクロマトグラムの結果を図35に示す。
尚、この加水分解反応は、下記に示される反応である。
5μMの化合物1(MANT-Man3GN2(Fuc)-DNP:MM3FD)、酵素Endo-M-W251N 2.4μgのリン酸ナトリウムバッファー(40mM,pH6)溶液100μLを30℃で2時間インキュベートした。反応は、15、30、60、120分ごとに反応液を2μLずつ分注し、8μLのアセトニトリルに加え、反応を停止した。反応混合液を30μLの水で希釈し、HPLC(TOSOH TSK-gel ODS-100V,5μm,4.6mm×15cm,水/アセトニトリル=97/3~60/40,0.1%TFA溶液,流速1mL/min,15分間、島津超高速液体クロマトグラフ Nexera)にて、UV360nmで検出し、分析した。反応混合液のHPLCクロマトグラムの結果を図36に示す。
尚、この加水分解反応は、下記に示される反応である。
率(%)の関係を図37に示した。
5μMの化合物1(MANT-Man3GN2(Fuc)-DNP:MM3FD)、酵素(Endo-M-W251N 2.4μg(×1)、0.5μg(×1/5)、0.24μg(×1/10))をそれぞれ加えたリン酸ナトリウムバッファー(40mM,pH6)溶液20μLを30℃で2時間インキュベートした。反応は、マイクロプレートリーダー(モレキュラープローブ社 SpectraMaxi3X(登録商標))を使用し、励起波長340nm、蛍光波長440nmにて追跡した。マイクロプレートリーダーにより反応混合液の蛍光強度変化を追跡した結果を図38に示す。酵素反応の進行に伴い、蛍光強度が上昇していることから、基質の切断を確認することができる。
5μM化合物1(MANT-Man3GN2(Fuc)-DNP:MM3FDプローブ)、酵素(Endo-F3:8U、4U、2U)の40mM リン酸ナトリウムバッファー50μLを37 oCで2時間インキュベートした。反応はマイクロプレートリーダー(モレキュラープローブ社 SpectraMaxi3X)を使用し、励起波長340nm、蛍光波長440nmにて追跡した。マイクロプレートリーダーにより反応混合液の蛍光強度変化を追跡した結果を図39に示す。酵素反応に伴い、蛍光強度が上昇していることから、基質の切断を確認することができる。
なスクリーニングに利用することができる。
Claims (7)
- 下記式(I)で表される糖化合物であって、
(式(I)中、Rはそれぞれ独立して水素原子又はヒドロキシル基の保護基を、R’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を、R”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基(-NR’-)、アミド基(-NR’CO-)、オキシ基(-O-)、カルボニル基(-CO-)、オキシカルボニル基(-OCO-)、又は第二級若しくは第三級アミノ基(-NR’-)、オキシ基(-O-)、及びカルボニル基(-CO-)からなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい炭素原子数1~6の2価の炭化水素基を、Z1及びZ2は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。)
前記ヒドロキシル基の保護基は、メチル基、ベンジル基、p-メトキシベンジル基、tert-ブチル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、又はtert-ブチルジフェニルシリル基であり、
前記アミノ基の保護基は、t-ブトキシカルボニル基(Boc)、ベンジルオキシカルボニル基(Cbz)、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル基(Troc)、アリルオキシカルボニル基(Alloc)、アセチル基、トリフルオロアセチル基(Tfa)、p-トルエンスルホニル基(Ts)、又は2-ニトロベンゼンスルホニル基(Ns)であり、
前記蛍光基と前記消光基の組合せが、下記(i)~(iv)の何れかである、糖化合物。
(i)下記式(d-1)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(式(d-1)中、R’は水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又は前記アミノ基の保護基を表す。)
(ii)下記式(d-2)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(式(d-2)中、Rは水素原子又は前記ヒドロキシル基の保護基を表す。)
(iii)下記式(d-3)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(式(d-3)中、Rは水素原子又は前記ヒドロキシル基の保護基を、R’は水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又は前記アミノ基の保護基を表す。)
(iv)下記式(d-4)で表される蛍光基と下記式(a-2)で表される消光基の組合せ
(式(d-4)及び(a-2)中、R’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又は前記アミノ基の保護基を表す。) - 請求項1に記載の糖化合物を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)活性検出用組成物。
- 下記式(IV)で表される化合物から下記式(I)で表される化合物を生成する反応工程を含む、糖化合物の製造方法であって、
(式(I)及び(IV)中、Rはそれぞれ独立して水素原子又はヒドロキシル基の保護基を、R’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を、R”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基(-NR’-)、アミド基(-NR’CO-)、オキシ基(-O-)、カルボニル基(-CO-)、オキシカルボニル基(-OCO-)、又は第二級若しくは第三級アミノ基(-NR’-)、オキシ基(-O-)、及びカルボニル基(-CO-)からなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい炭素原子数1~6の2価の炭化水素基を、Z1及びZ2は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。)
前記ヒドロキシル基の保護基は、メチル基、ベンジル基、p-メトキシベンジル基、tert-ブチル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、又はtert-ブチルジフェニルシリル基であり、
前記アミノ基の保護基は、t-ブトキシカルボニル基(Boc)、ベンジルオキシカルボニル基(Cbz)、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル基(Troc)、アリルオキシカルボニル基(Alloc)、アセチル基、トリフルオロアセチル基(Tfa)、p-トルエンスルホニル基(Ts)、又は2-ニトロベンゼンスルホニル基(Ns)であり、
前記蛍光基と前記消光基の組合せが、下記(i)~(iv)の何れかである、糖化合物の製造方法。
(i)下記式(d-1)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(式(d-1)中、R’は水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又は前記アミノ基の保護基を表す。)
(ii)下記式(d-2)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(式(d-2)中、Rは水素原子又は前記ヒドロキシル基の保護基を表す。)
(iii)下記式(d-3)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(式(d-3)中、Rは水素原子又は前記ヒドロキシル基の保護基を、R’は水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又は前記アミノ基の保護基を表す。)
(iv)下記式(d-4)で表される蛍光基と下記式(a-2)で表される消光基の組合せ
(式(d-4)及び(a-2)中、R’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又は前記アミノ基の保護基を表す。) - 被検化合物をエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)の候補に接触させる接触工程、及び
前記被検化合物を接触させたエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)の候補に請求項1に記載の糖化合物を接触させて、前記糖化合物の分解活性を確認する活性確認工程
を含む、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)のスクリーニング方法。 - 被検化合物をエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)に接触させる接触工程、及び
前記被検化合物を接触させたエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)に請求項1に記載の糖化合物を接触させて、前記糖化合物の分解活性を確認する活性確認工程
を含む、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)活性阻害剤のスクリーニング方法。 - 下記式(I´)で表される糖化合物であって、
(式(I´)中、Rはそれぞれ独立して水素原子又はヒドロキシル基の保護基を、R’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を、R”はそれぞれ独立して単結合、第二級若しくは第三級アミノ基(-NR’-)、アミド基(-NR’CO-)、オキシ基(-O-)、カルボニル基(-CO-)、オキシカルボニル基(-OCO-)、又は第二級若しくは第三級アミノ基(-NR’-)、オキシ基(-O-)、及びカルボニル基(-CO-)からなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい炭素原子数1~6の2価の炭化水素基を、R1は水素原子、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルラクトサミン、又はシアリルラクトサミンを、R2は水素原子、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルラクトサミン、又はシアリルラクトサミンを、Z1及びZ2は何れか一方が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が生じる蛍光基を、もう一方が前記蛍光基に対応する消光基を表す。)
前記ヒドロキシル基の保護基は、メチル基、ベンジル基、p-メトキシベンジル基、tert-ブチル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、又はtert-ブチルジフェニルシリル基であり、
前記アミノ基の保護基は、t-ブトキシカルボニル基(Boc)、ベンジルオキシカルボニル基(Cbz)、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル基(Troc)、アリルオキシカルボニル基(Alloc)、アセチル基、トリフルオロアセチル基(Tfa)、p-トルエンスルホニル基(Ts)、又は2-ニトロベンゼンスルホニル基(Ns)であり、
前記蛍光基と前記消光基の組合せが、下記(i)~(iv)の何れかである、糖化合物。
(i)下記式(d-1)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(式(d-1)中、R’は水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又は前記アミノ基の保護基を表す。)
(ii)下記式(d-2)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(式(d-2)中、Rは水素原子又は前記ヒドロキシル基の保護基を表す。)
(iii)下記式(d-3)で表される蛍光基と下記式(a-1)で表される消光基の組合せ
(式(d-3)中、Rは水素原子又は前記ヒドロキシル基の保護基を、R’は水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又は前記アミノ基の保護基を表す。)
(iv)下記式(d-4)で表される蛍光基と下記式(a-2)で表される消光基の組合せ
(式(d-4)及び(a-2)中、R’はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数1~6の炭化水素基、又は前記アミノ基の保護基を表す。)
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