EP1789542A1 - Plasmide portant un gene codant pour la glutamate deshydrogenase de lactococcus lactis - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à un plasmide portant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase (GDH) de Lactococcus lactis, ainsi qu'audit gène de la GDH, et à leurs utilisations dans l'industrie fromagère.

Description

PLASMIDE PORTANT UN GENE CODANT POUR LA GLUTAMATE DESHYDROGENASE DE LACTOCOCCUS LACTIS.

L'invention est relative au domaine des levains lactiques et à leur utilisation pour intensifier la flaveur des fromages et des spécialités fromagères. Elle est tout particulièrement destinée à des fromages de type pâte pressée sans flore de surface, dont la flore est essentiellement composée de bactéries lactiques, tels que le St Paulin, le Gouda et le Cheddar. Ces fromages ont très peu d'arôme lorsqu'ils sont jeunes et ils acquièrent leurs qualités aromatiques seulement après un affinage très long qui peut aller de 6 à 12 mois. Les industriels fromagers cherchent donc des moyens d'intensifier la flaveur des fromages jeunes ou à raccourcir les durées d'affinage pour l'obtention de fromages "matures" ou "plus typés".

Ces dernières années, il a été montré que le catabolisme des acides aminés était une voie majeure de formation de molécules aromatiques dans les fromages. Les bactéries lactiques et plus particulièrement les lactocoques qui sont largement utilisés comme levain dans l'industrie, ont les activités enzymatiques nécessaires à la transformation des acides aminés en composés d'arôme (pour revue, cf. YVON et RIJNEN, International Dairy Journal, 11 : 185-201, 2001) mais ne produisent pas suffisamment d'α-cétoglutarate, un cosubstrat nécessaire à cette transformation, ce qui limite fortement la formation d'arômes à partir des acides aminés. Ainsi, les inventeurs ont précédemment montré que l'addition d'α-cétoglutarate dans les caillés fromagers avant l'affinage permettait une nette intensification de la flaveur des fromages, laquelle résultait directement d'une augmentation du catabolisme des acides aminés par les lactocoques (PCT WO 98/48645 ; YVON et al, International Dairy Journal, 8 : 889-898, 1999). L'α-cétoglutarate peut être produit à partir du glutamate, qui est présent en quantité importante dans les caillés fromagers, par désamination oxydative, selon la réaction suivante : L-glutamate + H2O + NAD(P)+ <-> α-cétoglutarate + NH4⁺ + NAD(P)H. Cette réaction est catalysée par une glutamate déshydrogénase (GDH ; EC 1.4.1.3). La production d'α-cétoglutarate à partir du glutamate, par des bactéries lactiques utilisées dans la fabrication des fromages, constituerait donc une alternative à l'addition d'α-cétoglutarate.

Il a été montré qu'une souche de Lactococcus lactis génétiquement modifiée, exprimant Ia glutamate déshydrogénase (GDH) de Peptostreptococcus asaccharolyticus, était capable de produire suffisamment d'α-cétoglutarate pour intensifier fortement la transformation des acides aminés en composés d'arôme (RIJNEN et al, Applied and Environmental Microbiology, 66 : 1354-1359, 2000). Toutefois, l'utilisation de souches génétiquement modifiées dans l'industrie agroalimentaire pose actuellement de nombreux problèmes, notamment réglementaires.

Récemment, différentes souches de bactéries lactiques possédant naturellement une activité GDH ont été décrites. (TANOUS et al., Antonie Van Leeuwenhoek 82: 271-278, 2002; HELINK et al., Applied and Environmental

Microbiology, 70: 3855-3861, 2004). Toutes les souches de bactéries lactiques GDH positives sont capables de transformer les acides aminés en molécules aromatiques dans un milieu contenant du glutamate, tandis que les souches GDH négatives ne le sont pas.

L'activité GDH semble être assez fréquente dans les souches de Lactobacillus plantarwn, de Streptococcus thermophilus et Lactobacillus paracasei et beaucoup plus rare dans les souches de Lactococcus lactis. En outre, la plupart des souches de L. lactis dans lesquelles une activité GDH a été détectée ne poussent pas dans le lait et ne sont donc pas utilisables comme levain ; elles peuvent uniquement être utilisées comme adjoint de culture. La sélection de souches de L. lactis naturelles se développant dans le lait et possédant une activité GDH permettrait leur utilisation comme levain. Cependant, à l'heure actuelle, la seule méthode disponible pour identifier de telles souches implique la détection de l'activité GDH dans des extraits de cellules bactériennes en dosant les cofacteurs réduits (NADH, NADPH) produits par désamination oxydative du glutamate. Ce dosage s'effectue par réaction enzymatique, suivie du dosage colorimétrique du produit de la réaction. Cette méthode est relativement longue et délicate à mettre en œuvre, et est donc difficilement applicable au criblage d'un grand nombre de souches.

Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que l'activité GDH observée chez certaines souches de L. lactis était liée à la présence d'un ou plusieurs gène(s) absent(s) ou incomplet(s) chez les souches GDH négatives. La connaissance de ce ou de ces gène(s) permettrait notamment de développer une méthode de sélection par PCR beaucoup plus rapide que la méthode enzymatique, et de transférer ce gène chez des souches de L. lactis utilisables en industrie fromagère. Les Inventeurs sont parvenus à identifier un gène responsable de l'activité GDH à partir de 3 souches possédant cette activité, et ont constaté que ce gène, qui sera dénommé ci-après gdh était le même dans les trois souches.

Ils ont ensuite inactivé ce gène dans une des souches, ce qui leur a permis de montrer que ce gène était responsable de la totalité de l'activité GDH de cette souche, et que son inactivation diminuait considérablement la capacité de la souche à convertir les acides aminés en composés d'arôme dans un milieu contenant du glutamate. Ils ont ensuite utilisé des oligonucléotides déduits de la séquence du gène gdh pour vérifier la présence ou l'absence de ce gène dans une vingtaine de souches possédant ou non une activité GDH. Cette étude a permis de démontrer que ce gène était présent dans toutes les souches possédant l'activité GDH, et absent des souches GDH négatives.

Un fragment d'ADN de L. lactis contenant la séquence codant pour la GDH est représenté sur la Figure 1, ainsi que dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1. La séquence polypeptidique déduite de la séquence codante est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2. Les Inventeurs ont en outre observé que dans toutes les souches contenant le gène gdh, celui-ci est porté par un plasmide d'environ 60 à 70Kb, dénommé ci-après pGDH442. Un échantillon du plasmide pGDH442, hébergé par la souche TIL 504 de L. lactis qui ne contient aucun autre plasmide, a été déposé auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25, rue du Docteur Roux, Paris) le 30 août 2004, sous le numéro 1-3280.

Le plasmide pGDH442 peut également être défini par son profil d'amplification, qui fait apparaître les fragments suivants : un fragment de 3670pb après amplification à l'aide des amorces SEQ ID NO: 25 et 26, un fragment de 1610pb après amplification à l'aide des amorces SEQ ID NO: 27 et 28, un fragment de 2991pb après amplification à l'aide des amorces SEQ ID NO: 29 et 30, un fragment de 2503pb après amplification à l'aide des amorces SEQ ID NO: 31 et 32, un fragment de 2236pb après amplification à l'aide des amorces SEQ ID NO: 33 et 34, un fragment de 1515pb après amplification à l'aide des amorces SEQ ID NO: 35 et 36, un fragment de 955pb après amplification à l'aide des amorces SEQ ID NO: 37 et 38, , un fragment de 820pb après amplification à l'aide des amorces SEQ ID NO: 39 et 40.

Les Inventeurs ont en outre montré que le transfert du plasmide pGDH442 dans une souche dépourvue d'activité GDH lui conférait cette activité, ainsi que la capacité à transformer des acides aminés en molécules aromatiques dans un milieu contenant du glutamate. La présente invention a pour objet une glutamate déshydrogénase

(GDH), isolée caractérisée en ce que sa séquence peptidique possède au moins 70%, de préférence au moins 75%, de manière tout à fait préférée au moins 80%, et par ordre de préférence croissante, au moins 85, 90, ou 95% d'identité, avec la séquence SEQ ID NO: 2. Les pourcentages d'identité auxquels il est fait référence ici sont établis, sur une fenêtre de comparaison comprenant la totalité de la séquence SEQ ID NO:2, à l'aide du logiciel Fasta version 2.0 disponible sur Ie site Infobiogen (www.infobiogen.fr), en utilisant les paramètres BLOSUM50 matrix, gap penalities of-12, -2 par défaut.

La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi : a) un polynucléotide codant pour une GDH conforme à l'invention, tel que définie ci-dessus ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; Dans le cadre de la présente invention, le terme : « polynucléotide codant pour une GDH », englobe notamment la séquence codante (cadre ouvert de lecture) qui est traduite en GDH, ainsi que l'ADNc ou PARNm, ou les fragments de ceux-ci, comprenant ladite séquence codante.

La présente invention inclut également tout polynucléotide constituant un fragment d'au moins 15 pb, de préférence au moins 18 pb, avantageusement au moins 20 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 50 pb consécutives d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ainsi que tout polynucléotide d'au moins 15 pb, de préférence au moins 18 pb, avantageusement au moins 20 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 50 pb, capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus.

Des exemples non limitatifs de polynucléotides conformes à l'invention, sont représentés par le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1, ou toute portion de celui-ci comprenant le cadre ouvert de lecture codant pour le polypeptide SEQ ID NO: 2, ainsi que par leurs complémentaires. D'autres exemples de polynucléotides conformes à l'invention sont représentés par : i) les fragments du polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1, et notamment du cadre ouvert de lecture codant pour le polypeptide SEQ ID NO: 2 , ou de leurs complémentaires; ii) les polynucléotides capables de s'hybrider sélectivement avec le polynucléotide SEQ ID NO: 1, et notamment avec le cadre ouvert de lecture codant pour le polypeptide SEQ ID NO: 2 ,ou avec leurs complémentaires.

On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) conforme à l'invention, tout polynucléotide qui lorsqu'il est hybride en conditions stringentes avec l'ADN total d'une souche de L. lactis (par exemple une banque d'ADN génomique ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucléotide a) ou b), si celui-ci est présent chez ladite souche, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque. Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métier en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5⁰C à 10°C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé dans un mélange d'hybridation de composition identique, par ce polynucléotide et son complémentaire.

Des polynucléotides conformes à l'invention peuvent notamment être utilisés en tant que sondes d'acide nucléique ou amorces d'amplification permettant l'identification de souches de L. lactis GDH positives par détection de la présence dans ces souches d'une séquence codant pour une GDH conforme à l'invention.

Pour une utilisation en tant que sondes d'acide nucléique, on choisira avantageusement des polynucléotides d'au moins 20 pb, de préférence au moins 50 pb, et de manière préférée au moins 100 pb. Dans ce cadre, des polynucléotides particulièrement préférés sont ceux dérivés des portions de la séquence SEQ ID NO: 1 qui ne figurent pas dans d'autres régions du génome de L. lactis. L'homme du métier peut aisément identifier les portions concernées de la séquence SEQ ID NOrI par simple comparaison de cette séquence avec la séquence complète publiée de L. lactis (AE005176 ; BOLOTIN et al., Génome Res., 11 : 731-753, 2001).

Pour une utilisation en tant qu'amorces d'amplification, on choisira avantageusement des polynucléotides de 15 à 30 pb. Dans ce cadre, la présente invention englobe également tout couple d'amorces permettant l'amplification spécifique d'une séquence codant pour une GDH conforme à l'invention, ou d'une portion de ladite séquence, à partir de l'ADN total d'une souche de L. lactis contenant ladite séquence.

A titre d'exemples non limitatifs de couples d'amorces conformes à l'invention, on citera notamment :

- les amorces gdhl3F (SEQ ID NO : 11) et gdh22R (SEQ ID NO : 12) ;

- les amorces gdh3F (SEQ ID NO : 3) et gdh8R (SEQ ID NO : 4) ;

- les amorces gdh37F (SEQ ID NO : 9) et gdhlδR (SEQ ID NO : 13) ;

- les amorces gdh4F (SEQ ID NO : 16) et gdh9R (SEQ ID NO : 17) . Ces amorces sont décrites ci -après, dans le Tableau IL La présente invention a également pour objet une cassette d'expression comprenant un polynucléotide codant pour une GDH conforme à l'invention, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.

Un promoteur approprié pour une utilisation dans une cassette d'expression conforme à l'invention peut être tout promoteur fonctionnel chez L. lactis.

A titre d'exemples non-limitatifs, on citera notamment les promoteurs lac A ou lacR, le promoteur lacA/Yl, le promoteur dnaJ, le promoteur sodA, les promoteur prtP ou prtM, le promoteur trpE, le promoteur nisA ou nisF, le promoteur ZitR. Cette liste n'est pas exhaustive. D'autres exemples de promoteurs fonctionnels chez L. lactis sont décrits dans l'article de revue de KUIPERS et al, (Trends In Biotechunology, 15 : 135-140,

1997).

La présente invention englobe également tout vecteur d'acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour une GDH conforme à l'invention.

Ceci inclut notamment ; - tout vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression conforme à l'invention ;

- le plasmide pGDH442 mentionné ci-dessus.

La présente invention a également pour objet un procédé de sélection de souches de L. lactis GDH positives, caractérisé en ce qu'il comprend la recherche, dans les souches à tester, de la présence d'une séquence codant pour une GDH conforme à l'invention, et la sélection des souches contenant ladite séquence.

La recherche de la présence d'une séquence codant pour une GDH conforme à l'invention peut s'effectuer soit directement, à l'aide de sondes d'acide nucléique ou d'amorces conformes à l'invention, s'hybridant sélectivement avec cette séquence ou son complémentaire, soit indirectement par détection de la présence du plasmide pGDH442.

La présence de ce plasmide peut avantageusement être détectée par criblage des souches sur la base de la résistance au cadmium conférée par ce plasmide ou par amplification PCR à l'aide d'amorces choisies dans la séquence du plasmide. A titre d'exemples non-limitatifs, on citera les couples d'amorces suivants :

- les amorces IF (SEQ ID NO : 25) et 3R (SEQ ID NO : 26) ;

- les amorces 8F (SEQ ID NO : 29) et 9R (SEQ ID NO : 30) ;

- les amorces 10F (SEQ ID NO : 31) et 1 IR (SEQ ID NO : 32) ; - les amorces 12F (SEQ ID NO : 33) et 13R (SEQ ID NO : 34) .

- les amorces 14F (SEQ ID NO : 35) et 15R (SEQ ID NO : 36) .

- les amorces 16F (SEQ ID NO : 37) et 17R (SEQ ID NO : 38) . - les amorces 18F (SEQ ID NO : 39) et 19R (SEQ ID NO : 40) .

Ces amorces sont également décrites ci-après, dans le Tableau VI.

Que la détection de la séquence codant pour une GDH conforme à l'invention soit effectuée directement, ou indirectement, le procédé de sélection conforme à l'invention peut en outre comprendre une étape supplémentaire de vérification, chez les souches sélectionnées, de la présence d'une activité GDH. La mesure de cette activité peut s'effectuer notamment comme décrit par TANOUS et al., (2002, précité).

La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une souche de L. lactis GDH positive, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une souche de L. lactis GDH négative par un polynucléotide codant pour une GDH conforme à l'invention.

On entend ici par « transformation » d'une souche bactérienne par un polynucléotide, la modification du patrimoine génétique de ladite souche par l'introduction dans celle-ci de l'information génétique portée par ledit polynucléotide, indépendamment de la méthode utilisée, et indépendamment du fait que l'information génétique introduite soit intégrée dans le chromosome bactérien ou qu'elle demeure extra-chromosomique.

Selon un mode de mise en œuvre préféré d'un procédé conforme à l'invention, la transformation de ladite souche GDH négative est effectuée à l'aide du plasmide pGDH442.

Le plasmide ρGdh442 apparaît mobilisable en présence d'un facteur sexuel de type 712/ML3 (GASSON et DAVIES, J. Bacteriol., 143, 1260-1264, 1980 ; MCKAY et al., Appl. Environ. Microbiol., 40, 84-89, 1980 ; GODON et al, Lait, 76, 41-49, 1996; GODON et al., Dev Biol Stand, 85, 423-430, 1995).

Ce type de facteur sexuel est très répandu chez L. Jadis ssp. lactis et cremoris (GASSON et al., Mol. Microbiol., 6, 3213-3223, 1992) ; il est présent sur le chromosome de nombreuses souches (par exemple la souche MG 1363), et peut également être porté par certains plasmides (GASSON et al., 1992, précité), par exemple le plasmide pRSOl (ANDERSON et MCKAY, J. Bacteriol., 158, 954-962, 1984 ; MILLS et al., Appl. Environ. Microbiol., 60, 4413-4420, 1994).

Le plasmide pGdh442 est donc transférable naturellement, à partir de toute souche, qu'elle soit naturelle ou recombinante, qui contient ce plasmide et contient en outre un facteur sexuel de type 712/ML3 ; il porte en outre des gènes de résistance au cadmium fonctionnels, qui constituent un marqueur de sélection « food- grade » permettant de sélectionner les bactéries dans lesquelles le plasmide a été transféré. Le plasmide pGdh442 peut être transféré chez de très nombreuses souches de L. lactis. Les Inventeurs ont toutefois observé une incompatibilité entre ce plasmide et le plasmide pSK08 de L. lactis NCDO 763 (également appelé ML3), qui porte des gènes impliqués dans la protéolyse de la caséine et dans l'utilisation du lactose. Cette incompatibilité apparaît due à la quasi-identité entre pSK08 et pGdb.442 au niveau de la région impliquée dans la réplication et la maintenance du plasmide, qui contient l'origine de réplication (Ori), et les séquences codant pour la réplicase (RepA), et les protéines (ParA et ParB) impliquées dans la répartition plasmidique. Au niveau de cette région, la séquence de pGdh442 possède en effet 95% d'identité avec celle du plasmide pSK08 (numéro d'accès: AF300944).

Pour obtenir des souches transformées de façon stable par pGdh442, on choisira donc une souche hôte ne contenant pas le plasmide pSK08, ni d'autre plasmide possédant la même origine de réplication que pSK08. On choisira, si l'on souhaite utiliser une souche-hôte capable de croître sur du lait en culture pure, une souche de L. lactis chez laquelle ces gènes sont portés par le chromosome telle que les souches décrites par NI S SEN-MEYER et al. (Appl. Environ. Microbiol ., 58, 750-753, 1992) et LEENHOUTS et al. (Appl. Environ. Microbiol., 57, 2568-2575, 1991), ou par un plasmide possédant une origine de réplication différente.

Le plasmide pGdh442 comprend en outre des gènes, codant pour les sous-unités (OppA, OppB, OppC, OppD, and OppF) d'un transporteur ABC (ATP- binding cassette) impliqué dans le transport intracellulaire d'oligopeptides (TYNKKYNEN et al., J. Bacteriol, 175, 7523-7532, 1993), ainsi qu'un gène codant pour une endopeptidase intracellulaire (PepO).

Le plasmide pGdh442 contient donc l'information génétique nécessaire au transport et à l'utilisation des oligopeptides résultant de la dégradation de la caséine, et peut donc être utilisé pour conférer cette capacité à une souche hôte qui en est dépourvue, ou, le cas échéant, pour l'augmenter chez une souche hôte qui la possède.

Dans le cas de souches qui ne possèdent pas les gènes impliqués dans la protéolyse de la caséine et dans l'utilisation du lactose, et ne sont donc pas capables de croître de manière satisfaisante sur du lait, le plasmide pGdh442 peut permettre d'améliorer cette croissance, lorsqu'elles sont associées à des souches capables d'effectuer la protéolyse de la caséine et d'utiliser le lactose.

Les souches contenant le plasmide pGdh442 peuvent donc avantageusement être utilisées, dans le cadre de la préparation de levains lactiques en association avec des souches possédant une activité de protéolyse de la caséine, et capables d'utiliser le lactose. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'identification et le clonage d'une séquence codant pour une GDH de L. lactis, l'isolement et la caractérisation du plasmide pGDH442 portant cette séquence, et l'utilisation de cette séquence et de ce plasmide pour l'obtention et la sélection de souches GDH positives.

EXEMPLES

I- MATERIEL ET METHODES GENERAUX

Souches bactériennes, plasmides et milieux de culture

Toutes les souches bactériennes et plasmides utilisés dans les exemples ci-après sont listés dans le Tableau I ci-dessous.

TABLEAU I

Souches ou

Caractéristique(s) Référence ou source plasmides

Souches

F^" mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC)

Φ80/acZΔM15 Δ/acX74 recA1 cteoR E co// TOP 10 INVITROGEN, Paisley, UK araD139 Δ(ara-leu)7697 galϋ galK rpsL

(Str^R) endA1 nupG

L. lactis TIL442 NCDO 1867

L lactis TIL 446 NCDO 2633

L /acte TIL 447 NCDO 2146

L lactis MG 1363 NCDO 763 curée des plasmides

MONNET et al., 1994,

L lactis Tl L 46 NCDO 763 curée du plasmide de 2 Kb Journal of Biological

Chemistry, 268, 32070-76.

TIL 442 avec pGhost9 intégré dans le L lactis TIL 487 Cette étude gène gdh, Ery^r

MG 1363 contenant plasmide pGDH442

L lactis TIL 489 avec pGhostθ intégré dans le gène gdh_r Cette étude

Er/

L /acte TIL 504 MG 1363 avec plasmide pGDH442 Cette étude TIL 46 contenant pMSP3545 avec le L lactis TIL 488 Cette étude gène gdh, Ery^r

L/acfe TIL 875 TIL46 contenant pMSP3545, Ery^r Cette étude L lactis Tl L 193 MG 1363 avec plasmide pGhost 8 Cette étude

Plasmides

Vecteur de clonage de fragment PCR, Topo® XL INVITROGEN, Paisley, UK Kan^r, Zeo^r, pGhost 8 Vecteur thermosensible, Tet^r BISWAS ef al, 1993, Journal of Bacteriology 175, 3628- pGhost 9 Vecteur thermosensible, Ery^r 3635.

Vecteur de fusion transcriptionnelle avec BRYAN ef a/.,2000, pMSP3545 nisA, Ery^r Plasmid, 44, 183-190.

Plasmide portant le gène gdh, isolé de pGDH442 Cette étude TIL442

Les souches de L. lactis sont généralement cultivées à 30⁰C dans le milieu M 17 (Laboratoires DIFCO, Détroit, Mich.), supplémenté avec 0,5% (poids/vol.) de glucose (M17-G). Esherichia coli est cultivé dans le milieu LURIA -BERTANI à 37⁰C avec aération. Les milieux solides contiennent 0,1% d'agar. Le milieu sélectif contient du chlorure de cadmium (SIGMA) à une concentration finale de 0,1 raM. Lorsque nécessaire, de l'érythromycine (5μg. ml^"1 pour L. lactis et 150μg. ml^"1 pour E. coli) ou de la kanamycine (50 μg.ml^'1 pour E.coli) est ajoutée au milieu de culture. Techniques générales de biologie moléculaire

Toutes les manipulations d'ADN sont effectuées comme décrit par SAMBROOK et RUSSEL (Molecular cloning: a laboratory manual, 3^rd Ed, CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001). Les enzymes de restriction et de modification sont fournies par GIBCO-BRL (Cergy-Pontoise, France) ou par EUROGENTEC (Seraing, Belgique) et utilisées comme conseillé par le fournisseur.

Les cellules électrocompétentes de L. lactis sont préparées et transformées selon la méthode d'HOLO et NESS (Applied and Environmental Microbiology, 55 : 3119-3123, 1989). L'ADN plasmidique est préparé avec le kit de purification de plasmide de Qiagen Inc. (Chatswoth, Calif.) pour E.coli et par la méthode de O'SULLIVAN et KLAENHAMMER pour L. lactis (Applied and Environmental Microbiology, 59 : 2730-2733, 1993). L'ADN total de L lactis est préparé comme décrit par SAMBROOK et al. et TARN est préparé par la méthode de GLATRON et RAPOPORT (Biochimie 54 : 1291-1301, 1972).

Les amplifications PCR sont effectuées a l'aide d'un ADN Thermal cycler modèle 2400 (Perkin Elmer) en utilisant le cycle suivant : dénaturation de FADN à 95°C pendant 1 min., hybridation à la température optimale des oligonucléotides utilisés pendant 1 min et amplification à 72°C pendant 2 ou 3 min avec la Taq DNA polymerase (Appligène, Illkirch, France). Ce cycle est répété 30 fois avant une amplification finale à 72⁰C pendant 10 min. Les caractéristiques des amorces utilisées sont listées dans le Tableau

II ci-dessous.

TABLEAU II

EXEMPLE 1 : CARACTERISATION ET DETECTION DU GENE GDH DE L. LACTIS

Le gène codant pour la GDH chez L. lactis TIL 442 a été-cloné et séquence comme suit :

Clonage et séquençage du gène gdh

Un fragment d'ADN d'environ 1 Kb a été amplifié à partir de l'ADN total de la souche de L. lactis GDH positive TIL442, en utilisant des oligonucléotides partiellement dégénérés (gdh3F et gdh8R, Tableau II). Les fragments PCR provenant de 2 amplifications différentes ont été clones dans le vecteur de clonage TOPO-XL pour être séquences. Le reste du gène et les régions avoisinantes ont été ensuite amplifiés par PCR inverse en utilisant le kit TAKARA (TAKARA SHUZO Co., Japan) et des oligonucléotides choisis dans le fragment de 1 Kb séquence (gdh24R et gdh23R pour l'amont et gdh25F et gdh26F pour l'aval, Tableau II). Les fragments ainsi amplifiés ont été séquences.

Les gènes gdh de 2 autres souches de L. lactis (TIL 446 et TIL 447) ont été ultérieurement amplifiés par PCR en utilisant des oligonucléotides déduits de la séquence du gène de la souche TIL442 (gdh37F et gdh38R, Tableau II). Pour chaque souche les gènes, amplifiés par 3 PCR différentes, ont été purifiés avec le kit d'extraction QIAQUIK (Qiagen Inc.) et utilisés comme matrice pour le séquençage.

Les séquençages ont été effectués au moins 2 fois pour chaque brin en prenant pour le 1^er séquençage les plasmides contenant l'insert comme matrice et les oligonucléotides du vecteur Topo-XL comme amorces (Ml 3F et M13R, Tableau II). Pour les autres séquences, les fragments amplifiés par PCR (directe ou inverse) et purifiés sont utilisés comme matrice, et des oligonucléotides du gène comme amorces. Les échantillons pour le séquençage sont préparés avec le kit de séquençage PRISM Ready Reaction Dye Deoxy terminator cycle (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France ou Warrington, United Kingdom). Les séquences sont déterminées à l'aide s'un séquenceur d'ADN automatique 370A (Applied Biosystems). Les séquences nucléotidiques et protéiques sont analysées avec le logiciel GCG (Genetic Computer Group Inc., Madison, Wis.). Les recherches d'homologie sont effectuées dans les banques de données GenBank et Swissprot avec le logiciel Fasta version 2.0 (PEARSON and LIPMAN, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85 : 2444-2448, 1988) disponible sur le site Infobiogen (www.infobiogen.fr), en utilisant les paramètres BLOSUM50 matrix, gap penalities of-12, -2 par défaut. La séquence codant pour la GDH, et celle des parties adjacentes est présentée dans la Figure 1. Cette séquence révèle un cadre de lecture ouverte de 1344 pb codant pour une protéine de 448 résidus d'acides aminés. En amont du cadre de lecture, se trouvent un site de fixation des ribosomes (AATAGGAGG, en gras et souligné sur la Figure 1) se terminant 7 pb avant le codon d'initiation ATG (en gras sur la Figure 1) et 2 séquences consensus -10 de fixation de la RNA polymérase (soulignées sur la Figure 1) situées dans la région 220 à 330 pb avant le codon ATG. En aval du cadre de lecture on trouve une séquence palindromique (soulignée sur la figure 1) commençant 10 pb après le codon stop (TAA, en gras sur la Figure 1), pouvant être le terminateur de transcription. La séquence protéique déduite de la séquence ADN montre 54 à 70,8

% d'identité avec les séquences de GDH connues. En particulier elle exhibe l'

respectivement 65,6% et 70,8 % d'identité avec les séquences protéiques des GDH de Streptococcus pneumoniae (AAK99984) et de Lactobacillus plantarum (NP_784837).

Localisation et transcription du gène gdh :

La localisation du gène et sa fréquence dans les souches de L. lactis ont été déterminées par transfert et hybridation de Southern sur l'ADN plasmidique des souches, préparé par la méthode de O'SULLIVAN et KLAENHAMMER (1993, précité). Les plasmides ont été séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 0,5 % et migration pendant une nuit à 30V.

La taille du transcrit contenant le gène gdh a été déterminée par transfert et hybridation de Northern à partir de ARN total préparé selon la méthode de GLATRON et RAPOPORT (1972, précité).

Les transferts et hybridations de Southern et Northern ont été respectivement réalisés comme décrit par SAMBROOK et al. (2001, précité) et par le fournisseur du kit ECL (AMERSHAM, Buckinghamshire, United Kingdom). La sonde d'ADN gdh est préparée en utilisant le kit ECL (AMERSHAM) à partir d'un fragment de 939 pb du gène gdh amplifié par PCR avec les oligonucléotides gdhl3F et gdh22R (cette sonde correspond à la région 764-1702 de la séquence SEQ ID NO : 1).

L'analyse des ARN effectuée par transfert et hybridation de Northern avec la sonde gdh montre que le gène gdh est exprimé dans un transcrit d'environ 1,6 kb, en accord avec un début de transcription 220 ou 330 pb en amont du codon ATG.

Les hybridations de Southern avec la sonde gdh sur la préparation d'ADN plasmidique de L. lactis TIL 442 montrent une hybridation avec un gros plasmide à peine visible en électrophorèse sur gel d'agarose dont la taille a été estimée à environ 65 kb (Figure T). Cette souche renferme par ailleurs plusieurs autres plasmides qui n'hybrident pas avec la sonde gdh.

Corrélation entre l'activité GDH et Ia présence du gène εdh chez L. lactis

Le gène gdh a été recherché dans 18 souches de L. lactis d'origines diverses. Cette recherche a été faite sur l'ADN total et l'ADN plasmidique des souches, d'une part par transfert et hybridation de Southern avec la sonde du gène gdh et d'autre part par amplification par PCR d'un fragment de 723 pb avec les oligonucléotides gdhl3F et gdhlδ R spécifiques du gène gdh.

Parallèlement, l'activité GDH a été mesurée chez les mêmes souches (comme décrit ci-après à l'Exemple 2). Les résultats sont résumés dans le Tableau III ci-dessous. TABLEAU III

Ces résultats montrent que le gène gdh est présent dans l'ADN plasmidique de toutes les souches GDH positives tandis qu'il est absent dans les souches GDH négatives. La séquence du gène gdh fournit donc un outil pour sélectionner les souches GDH positives.

EXEMPLE 2 : EFFET DE L'INACTIV ATION DU GENE GDH SUR L'ACTIVITE GDH ET SUR LE CATABOLISME DES ACIDES AMINES.

Inactivation du gène gdh;

Le gène gdh a été interrompu dans la souche TIL 442 par simple recombinaison homologue. Pour cela un fragment interne du gène gdh a été amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides gdh58F et gdhlO23R (Tableau II) dans lesquels les sites de restriction Xhol et Psil ont été introduits par ajout ou substitution d'un nucléotide (en gras dans le Tableau II) par rapport à la séquence du gène. Le fragment ainsi amplifié est digéré avec Xhol et Pstl et religué avec le vecteur thermosensible pGhost9 également digéré avec ces 2 enzymes. Le mélange de ligation est ensuite utilisé pour transformer la souche TIL442 par électroporation. Les cellules sont ensuite cultivées à 28°C pendant une nuit dans le milieu M17-G contenant de l'érythromycine (5μg ml^'1), puis la culture est diluée 1000 fois dans le même milieu et de nouveau incubée à 28⁰C pendant 2 heures. Pendant cette étape, le plasmide se réplique dans les cellules. Ensuite les cultures sont transférées à 37,5⁰C pendant une nuit pour provoquer l'intégration du vecteur thermosensible dans le gène gdh par simple recombinaison homologue. Les intégrants sont ensuite sélectionnés sur boite de M17-G-érythromycine à 37°C et toujours cultivés ultérieurement à cette température.

Un mutant, dénommé ci-après TIL 487 a été sélectionné pour la suite de l'étude. L'interruption du gène gdh chez ce mutant a été vérifiée par amplification PCR avec un oligonucléotide (P92) s'hybridant avec le vecteur pGhost9, et un oligonucléotide (gdh37F) s'hybridant avec une région du gène gdh non incluse dans le fragment clone dans le vecteur, et séquençage du fragment amplifié de taille attendue de 1,14 Kb.

Dosage de l'activité GDH.

Les activités GDH dépendantes du NAD et NADP, ont été déterminées dans les extraits cellulaires préparés à partir de cellules récoltées en fin de phase exponentielle de croissance dans le milieu M17-G par centrifugation 15 min à 4100 x g. Les cellules sont lavées 2 fois avec du tampon triéthanolamine 5OmM pH7 (TEA). Après centrifugation les cellules sont reprises dans 5 ml de tampon TEA, puis le lysozyme et le saccharose sont ajoutés à une concentration finale de 1,6 mg par ml et 0,2 g par ml respectivement. Après incubation pendant 2h à 30⁰C, les sphéroplastes sont récupérés par centrifugation 15 min à 4100 x g à 4°C puis éclatés par choc osmotique en les remettant en suspension dans le tampon TEA. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 20000 x g pendant 20 min et le surnageant (extrait cellulaire) est filtré sur filtre MILLIPORE de 0,45 μm de taille de pore (MILLIPORE CORPORATION, Bedford, Mass.). La concentration en protéines de l'extrait cellulaire est déterminée par dosage de BRADFORD, avec la sérum albumine bovine comme standard (BRADFORD, Analytical Biochemistry, 72 : 248-254, 1976).

Les activités GDH ont été mesurées en utilisant un test basé sur le dosage colorimétrique du NADH ou du NADPH. Dans ce test, le cofacteur réduit (NADH ou NADPH) produit par désamination oxydative du glutamate réagit avec l'iodonitrotétrazolium en présence de diaphorase pour produire un composé coloré qui absorbe la lumière à 492nm. Le dosage a été effectué dans des plaques ELISA. Le mélange de réaction (300 μl) est composé de 40μl de tampon TEA-Phosphate de potassium 5OmM pH 9 contenant 1% de triton X-100 (Promega Corporation, Madison, Wis.), 20μl de glutamate à 10OmM, 20μl d'iodonitrotétrazolium à 2mM, 20μl de diaphorase (1,76 LVmL), 20μl de NADP+ (13,8mM) ou de NAD+ (17,33mM), et ISOμl d'eau. La réaction colorimétrique est démarrée par l'addition de 30μl d'extrait cellulaire au milieu de réaction. La quantité de NAD(P)H produit est mesurée après incubation à 37⁰C pendant 1 h, en mesurant l'absorbance à 492nm. Un blanc est effectué en remplaçant le glutamate par de l'eau. La quantification est faite en utilisant une courbe étalon établie avec des quantités connues de NADH et NADPH. Une unité d'activité GDH correspond à la production d'1 nmole de

NAD(P)H par min. de réaction. Les résultats sont les moyennes de 3 essais (plus ou moins l' écart-type).

Les résultats sont illustrés par la Figure 3 : B = Activité GDH avec NADP ; D = Activité GDH avec NAD.

L'interruption du gène gdh dans la souche TIL 487 conduit à une perte totale de l'activité GDH, indiquant que ce gène est le seul responsable de l'activité GDH de la souche TIL 442.

Etude du catabolisme des acides aminés in vitro par HPLC. L'effet de l'inactivation du gène gdh sur le catabolisme de la phénylalanine a été étudié sur des suspensions de cellules non-proliférantes de L. lactis, dans un milieu de réaction contenant : 70 mM de tampon phosphate de potassium (pH 5.5), 1OmM de glutamate, 3mM de phénylalanine et 0.05 μM de phénylalanine tritiée (L-[2,3A5,6 ³H] phénylalanine, 100-140 Ci/mmol) (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH).

Pour la préparation des suspensions de cellules non proliférantes, la souche sauvage TIL 442 et le mutant négatif TIL 487 ont été respectivement cultivés dans du milieu M17-G et M17-G + érythromycine après ensemencement à 2 % avec une préculture effectuée dans le même milieu. Les cellules sont récoltées en fin de phase exponentielle de croissance par centrifugation à 4100 x g, 15 min à 4⁰C et lavées 2 fois avec du tampon β-glycérophosphate 5OmM pH 7. Les cellules sont ensuite remises en suspension dans du tampon β-glycérophosphate 5OmM pH 7 à une concentration cellulaire correspondante à une Dθ4go de 200.

50μL de suspension de cellules non proliférantes (DO₄₈₀ =200) sont ajoutés à 450μL du milieu de réaction et le mélange est incubé à 37°C pendant 40 h. Des prélèvements sont effectués après 0, 10, 20 et 40 h d'incubation et les cellules sont éliminées par centrifugation (5000 x g, 5 min). Les métabolites sont ensuite analysés par HPLC en phase inverse avec une double détection en UV à 214nm et en radioactivité, comme décrit précédemment (YVON et al, International Dairy Journal, 8 : 889-898, 1998). L'identification des métabolites est faite par comparaison des temps de rétention avec ceux de composés standards (SIGMA CHEMICAL Co., St. Louis, Mo). L'analyse quantitative de la dégradation de la phénylalanine a été effectuée en calculant le pourcentage de radioactivité de l'échantillon associé au pic d'acide aminé et à chacun des pics de métabolites.

Les résultats sont illustrés par la Figure 4. (H] : Phényllactate

\2\ "• Phényléthanol 03 : Phénylacétate B : Autres métabolites

Ces résultats montrent que l'interruption du gène entraîne une diminution considérable de la capacité de la souche à convertir la phénylalanine en composés d'arôme dans un milieu contenant du glutamate. En effet les cellules de la souche sauvage TIL 442 transforment environ 15 % de la phénylalanine en différents composés d'arôme après incubation pendant 40 h dans un milieu à pH 8 contenant du glutamate et de la phénylalanine, tandis que les cellules du mutant gdh négatif TIL 487 ne transforment que 1 ou 2 % de la phénylalanine. Ces résultats démontrent le rôle essentiel du gène gdh dans la capacité des souches à cataboliser les acides aminés.

EXEMPLE 3 : IMPACT DE L'EXPRESSION CONTROLEE DU GENE GDH SUR L'ACTIVITE GDH ET LE CATABOLISME DES ACIDES AMINES.

Expression du gène gdh dans L. lactis TIL 46 Pour moduler l'expression du gène gdh dans une souche de L. lactis sans activité GDH (TIL 46), nous avons utilisé le système d'expression inductible à la nisine développé par de RUYTER et al. (Applied and Environmental Microbiology, 62 : 3662-3667, 1996 ; brevet EP 0 712 935 A2), dans lequel le niveau d'expression du gène est fonction de la concentration de nisine ajoutée au milieu de culture. La construction a été faite en utilisant le vecteur de fusion transcriptioπnelle avec le promoteur nisA, pMSP 3545, construit par BRYAN et al. (Plasmid, 44 : 183-190, 2000). Les sites de restriction Ncol et Sphl ont été respectivement introduits au niveau du codon start (ATG) du gène et 30 pb en aval du codon stop par PCR avec des amorces modifiées. Le gène gdh a été amplifié à partir de l'ADN de la souche TIL 442 avec les 2 amorces modifiées Nisl (contenant 3 substitutions [en gras dans le Tableau II] générant le site Ncol [souligné dans le Tableau H]), et Nis2 (contenant 1 inversion [en gras dans le Tableau II] générant le site Sphl [souligné dans le Tableau H]). Le fragment ainsi amplifié par PCR est digéré avec Ncol et Sphl et religué avec le vecteur pMSP3545 également digéré avec Ncol-Sphl. Le mélange de ligation a été directement utilisé pour transformer par électroporation des cellules compétentes de L. lactis TIL46 et créer TIL488. Une souche contrôle (TIL875) a été construite en introduisant pMSP3545 (sans insert) dans TIL46. Les cellules transformées étaient sélectionnées sur boite de M17 contenant de l'érythromycine à 5μg par ml.

Toutes les constructions ont été vérifiées par PCR avec les amorces du plasmide pMSP3545 (pMSPl et pMSP2). Ces amorces amplifiaient un fragment de 2080 pb avec TIL 488 et un fragment de 680 pb avec TIL875, ce qui correspond respectivement à la présence et l'absence du gène gdh dans le vecteur. Le séquençage du fragment de 2 kb confirmait l'insertion du gène gdh dans pMSP3545 au niveau du codon ATG, et la séquence correcte du gène gdh inséré.

Préparation des cellules et des extraits cellulaires.

Des cellules de L. îactis ont été préparées à partir de cultures induites ou non-induites à la nisine. Les souches de L. Iactis TIL 488 et TIL875 ont été cultivées dans du milieu M17-G contenant l'érythromycine jusqu'à une DOβoo de 0.5 puis elles ont été induites avec différentes concentrations de nisine (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo.). Les cultures étaient poursuivies pendant 3 heures puis les cellules étaient récupérées par centrifugation (6,000 x g, 15 min, 4 ⁰C)₅ lavées 2 fois avec du tampon Tris-HCl 10OmM (pH 8), et remises en suspension dans le même tampon à une densité cellulaire correspondant à une DO_60O de 100. Les suspensions de cellules étaient conservées à -80°C jusqu'à leur utilisation.

Activité GDH et catabolisme des acides aminés

L'activité GDH et le catabolisme de la phénylalanine ont été déterminés comme décrit à l'exemple 2 ci-dessus. Les résultats sont présentés dans le

Tableau IV ci-dessous.

TABLEAU IV

Ces résultats montrent que l'activité GDH de la souche TIL 488 est liée au niveau d'expression du gène gdh. En effet l'induction avec 2,5 μg de nisine par ml de culture induit un niveau d'expression du gène supérieur à celui obtenu avec l'induction à lμg / ml tandis que le gène n'est pas exprimé dans la culture non-induite. Comme attendu, les cultures induites on non induites de la souche contrôle TIL 875, qui ne contient pas le gène gdh, ne montrent aucune activité GDH. L'activité GDH de la souche TIL 488, obtenue avec le niveau maximum d'expression du gène gdh (avec ce système d'expression) est environ 9 à 13 fois supérieure à l'activité GDH de la souche naturelle TIL 442.

Le niveau de catabolisme des acides aminés est aussi en partie lié au niveau d'expression du gène gdh puisque les cellules de TIl 488 non induites ne catabolisent pas ou très peu la phénylalanine tandis que les cellules induites dégradent environ 30 % de la phénylalanine du milieu. Cependant le niveau de catabolisme atteint un optimum avec l'induction à 1 μg / ml. Ceci est probablement du au fait que la concentration en NAD et NADP dans les cellules utilisées pour le test de catabolisme, limite la désamination du glutamate en α-cétoglutarate tandis que pour la mesure de l'activité GDH les co-facteurs oxydés sont ajoutés en large excès dans le milieu. Ces résultats démontrent donc que le catabolisme des acides aminés par L. lactis peut être stimulé en augmentant le niveau d'expression du gène gdh.

EXEMPLE 4: TRANSFERT DU PLASMIDE PGDH442 DANS UNE SOUCHE GDHNEGATIVEETNEPOSSEDANTPASDEPLASMIDES. Le plasmide porteur du gène gdh a été transféré par électroporation dans la souche de L. lactis MG 1363 qui ne possède aucun plasmide, afin de pouvoir d'une part préparer le plasmide pGDH442 pur pour son séquençage et d'autre part évaluer l'impact de ce plasmide sur différentes propriétés de la souche réceptrice (activité GDH, catabolisme des acides aminés, résistance à différents facteurs, etc.). Ce transfert a été effectué en 2 étapes. Dans la l^ere étape, la souche

MG 1363 a été transformée (à 37°C) par électroporation avec la préparation plasmidique totale du mutant TIL 487 décrit à l'exemple 2 ci-dessus. Les cellules transformées sont sélectionnées sur milieu M17-G+ érythromycine, à 37⁰C. Trois clones ont ainsi été obtenus. Le contenu plasmidique de ces 3 clones a été vérifié par électrophorèse, transfert sur membrane et hybridation avec la préparation plasmidique totale de TIL 442 comme sonde. Un seul des 3 clones (TIL 489) ne contient que le plasmide « pGDH442 + pGhost9 », les 2 autres clones contiennent en plus d'autres plasmides présents dans TIL 442.

Dans la seconde étape, le vecteur pGhost9 a été excisé du plasmide « pGDH442 + pGhost9 » du transformant TIL 489 en diluant une culture d' 1 jour (à 37°C) de TIL 489 au 1 :10⁶ dans du milieu M17-G sans antibiotique et en la faisant pousser à 28°C. La culture saturée d'une nuit est étalée sur boites à différentes concentrations et incubée à 37°C avec et sans sélection érythromycine. Les colonies dans lesquelles l'excision de pGhost9 s'est produite sont sensibles à l' érythromycine. Plusieurs clones ont ainsi été sélectionnés et l'intégrité du gène gdh dans ces clones a été vérifié par amplification PCR avec des oligonucléotides situés en amont et en aval du gène (gdh37F et gdh38R) et séquençage des fragments amplifiés. Ultérieurement l'activité GDH de ces clones a été déterminée, et un des clones a été conservé. Ce clone est dénommé ci-après TIL 504.

La Figure 5 montre le résultat de l'hybridation avec la sonde gdh de l'ADN plasmidique des souches TIL 442, TIL 487, TIL 489 et TIL 504, après séparation par électrophorèse en gel d'agarose à 0,5% et transfert sur membrane. Cette photo montre que la taille du plasmide contenant le gène gdh dans le transformant TIL 489 est identique à la taille du plasmide du mutant TIL 487, laquelle est environ supérieure de 5Kb (taille du vecteur pGhost9) à la taille du plasmide de la souche sauvage TIL 442. Par contre, après excision du pGhost9, la taille du plasmide porteur du gène gdh dans la souche TIL 504 est équivalente à celle du plasmide naturel de la souche TIL 442. L'intégrité du gène gdh dans ce plasmide de la souche TIL 504 a été vérifiée par amplification PCR avec des oligonucléotides situés en amont et en aval du gène et séquençage des fragments amplifiés. La Figure 6 représente la comparaison des profils plasmidiques de

TIL 504 et MG 1363 après électrophorèse en gel d'agarose à 0,5 %. Cette figure montre que la souche TIL 504 ne contient que le plasmide pGDH442.

EXEMPLE 5: PROPRIETES CONFEREES AUX SOUCHES RECEPTRICES PARLETRANSFERTDUPGDH442 Activité GDH

L'impact du plasmide pGDH442 sur l'activité GDH a été déterminée en comparant les activités GDH de la souche TIL 504 dans laquelle le plasmide a été introduit avec celle de la souche de départ, sans plasmide, MG 1363 et celle de la souche TIL 442 d'où le plasmide est issu. L'activité GDH est mesurée comme décrit à l'exemple 2 ci-dessus. Les résultats sont illustrés par la Figure 7. B = Activité GDH avec NADP ; Q = Activité GDH avec NAD.

Ces résultats montrent que la souche TIL 504 dans laquelle le plasmide pGDH442 a été transféré a acquis une activité GDH voisine de celle de la souche TIL 442 tandis que la souche de départ MG 1363 ne possédait aucune activité GDH.

Catabolisme des acides aminés

L'impact du plasmide pGDH442 sur le catabolisme des acides aminés a été déterminée comme précédemment en comparant le catabolisme de la phénylalanine par les 3 souches TIL 504, MGl 363 et TIL 442. Le catabolisme de la phénylalanine a été étudié comme décrit à l'exemple 2 ci-dessus. Les résultats sont illustrés par la Figure 8.

[H] : Phényllactate [J : Phényléthanol QD : Phénylacétate

B : Autres métabolites

Ces résultats montrent que le transfert du plasmide pGDH442 dans la souche MG 1363 confère à celle-ci la capacité à cataboliser les acides aminés dans un milieu contenant du glutamate. En effet, les cellules de la souche MGl 363 ne catabolisent que très faiblement la phénylalanine tandis que 12% de la phénylalanine est catabolisée par la souche TIL504 dans laquelle le plasmide a été transféré. Le niveau de catabolisme obtenu avec la souche TIL504 est comparable à celui obtenu avec la souche TIL442 (16%) mais les métabolites formés sont légèrement différents d'une souche à l'autre, puisqu'ils dépendent d'activités enzymatiques autres que la GDH et qui sont spécifiques à chaque souche.

Résistance au cadmium

La fonctionnalité des gènes de résistance au cadmium du pGDH442 (voir exemple 6) a été démontrée en déterminant la concentration de chlorure de cadmium (CdCl₂) inhibant la croissance des souches contenant ou pas le plasmide pGDH442.

La sensibilité des souches de L. lactis au cadmium a été évaluée dans le milieu M17-G contenant de 0 à 0,3 mM de CdCl₂. Les différents milieux sont inoculés avec des précultures en M17-G en phase exponentielle de croissance puis incubés à 30°C pendant 16 h. La croissance est alors estimée par mesure de l'absorbance à 600nm.

Les résultats sont illustrés par la Figure 9, qui montre la densité optique des cultures des souches TIL 442 (x), TIL 504 (B) et MG 1363 (A) après culture pendant 16 heures dans le milieu M17-G contenant des concentrations croissantes de CdCl₂. La croissance de la souche MG 1363, qui ne contient aucun plasmide est totalement inhibée par 0,05mM de CdCl₂, tandis que la souche dérivée de MG 1363 contenant pGDH442 (TIL 504) pouvait pousser en présence de cadmium à une concentration de 0,1 mM, comme la souche TIL 442 dont est issu le plasmide.

De plus, l'utilité des gènes de résistance au cadmium comme marqueur de sélection a été démontrée en transformant la souche MG 1363 avec le plasmide pGDH442 par électroporation et sélection sur boîtes de M17-G contenant 0,1 mM de CdC12. Stabilité du plasmide pGDH442

La stabilité du plasmide pGDH442 dans la souche TIL504 a été évaluée après repiquages successifs sur milieu M17-G, en effectuant des numérations sur M17-G pour évaluer la population totale, et sur milieu sélectif Ml 7-G contenant 0,1 mM de CdC12 pour estimer la population contenant toujours le plasmide. Des repiquages successifs ont été réalisés et les numérations ont été faites après le 6 ^me et le 12^éme repiquage.

Après douze repiquages 100% des colonies sont résistantes au cadmium indiquant que le plasmide est stable dans cette souche. EXEMPLE 6 : SEQUENÇAGE ET DETECTION DU PLASMIDE pGDH442

Le plasmide pGDH442 a été préparé à partir de la souche TIL 504 en utilisant le kit d'extraction « Large-Construct » de Qiagen. Il a ensuite été séquence.

La séquence encore incomplète a été compilée et une carte détaillée a été construite (Figure 10). La partie séquencée est rassemblée en 3 séquences contiguës A, B et C respectivement constituées de 51 571 pb, 5 703 pb et 3 330 pb, soit un total de 60 600 pb. La moyenne du contenu en G + C de cette partie du plasmide est de 34,7%, ce qui est en accord avec le contenu en G + C (35,4%) de la séquence complète du génome de L. lactis IL 1403. La comparaison avec les banques de données montre que certaines régions du plasmide sont presque identiques à des séquences présentes sur d'autres plasmides de lactocoque ou sur le chromosome de L. lactis IL 1403. De plus, ce plasmide renferme 17 séquences codantes (CDS) homologues à des séquences de transposase complètes ou tronquées principalement de L. lactis. Ces similarités indiquent un haut niveau de transfert horizontal entre lactocoques et une grande plasticité du plasmide. En particulier, le gène codant pour la GDH se situe entre 2 transposases.

56 CDS ont été identifiées sur le plasmide. Elles ont été comparées avec les séquences de protéines connues. Les protéines montrant la plus grande homologie sont notées dans le Tableau V ci-après.

Taille Identité

CDS Protéine identifiée par homologie (Pb) I OA Organisme (plasmide)

1 749 Nicotinamide mononucleotide transporteur 39 Lb plantarum \NŒS'\

2 679 Transposase (IS946) 93 L Lactis subsp lactis, plasmide PNZ4000 L Lac lactis,

3 728 Protéine impliquée dans la partition plasmidique (ParB) 85 tis subsp plasmide pSK08 actis subs

4 674 Protéine impliquée dans la partition plasmidique (ParA) 88 L L p lactis, plasmide pSKOδ

5 1352 Protéine de réplication (RepA) 94 L. lactis subsp lactis, plasmide pSK08

6 820 Transposase tronquée (IS-LL6) 95 L. lactis

7 410 Transposase (TnpA) 92 S. pyogenes cremoris

8 227 Transposase tronquée 95 L. lactis subsp plasmide pSK111

9 1862 Protéine de transport du Cadmium (cadA) 55 Lb plantarum WCΨSÎ

10 545 Protéine de liaison à l' ADN 43 Lb plantarum WCFS 1

11 689 Régulateur transcriptionnel type FNR 86 L. lactis MG1363

12 1016 ABC transporteur d'oligopeptides (OppD) 97 L lactis IL1403

13 959 ABC transporteur d'oligopeptides (OppF) 99 L lactis IL1403

14 998 ABC transporteur d'oligopeptides, permease (OppB) 94 L lactis IL1403

15 890 ABC transporteur d'oligopeptides permease (OppC) 94 L lactis IL1403

16 1803 ^^ transporteur d'oligopeptides composant 97 L /acfe lL1403 périplasmique (OppA)

17 1883 Endopeptidase (pepO) 99 L. lactis IL1403

18 233 Transposase tronquée (IS946) 97 L lactis plasmide pMRC01

19 605 Protéine hypothétique 42 StaphylocoGcus epidermidis

20 281 Protéine hypothétique 77 L lactis IL1403

21 1211 Oxydoreductase 70 S. pneumoniae

22 605 Flavoprotéine-oxydoreductase 64 S. pneumoniae

__o __„ Lipoprotéine impliquée dans la biosynthèse de la thiamine

58 S. mutans

^{23 923} (apbE)

24 239 Protéine hypothétique 45 S. pneumoniae

25 671 Régulateur transcriptionnel type CRP/FNR 48 L /acf/s lL1403

26 566 Ribonucléotide réductase (nrdl) 51 S. mutans

27 2231 Ribonucléotide réductase, sous unité alpha (ndrE) 61 Lb plantarum WCFS1

28 964 Ribonucléotide réductase, sous unité beta tronquée (nrdF) 60 S. pyogenes

29 599 Transposase tronquée (IS-LL6) 99 L lactis

30 197 Transposase tronquée 84 L lactis

31 320 Transposase (IS3) 87 S. agalactiae

32 1346 NAD(P) Glutamate déshydrogenase 69 Lb plantarum WCFS1

33 686 Transposase 98 L lactis plasmide pK214

34 2117 Protéine de résistance au cadmium (CadA) 93 L lactis plasmide pAH90

_{QK QKQ} Régulateur transcriptionnel de résistance au cadmium

100 L lactis plasmide pAH90

^{35 359} (CadC)

_Qc L. lactis plasmide

36 554 Resolvase ( tnpR)

⁸⁶ pKR223

CDS Taille Identité

Protéine identifiée par homologie

(Pb) (V Organisme (plasmide)

7.o)

37 338 Protéine hypothétique 75 L lactis plasmide pCI2000 38 836 Régulateur transcriptionnel (AraC) 51 Fusohacterium nucleatum 39 604 Transposase (IS946) 93 L. lactis plasmide pMRCOI 40 1562 Copper oxydase 95 Pediococcus pentosaceus 41 1202 Multidrogue permease 78 Pediococcus pentosaceus 42 710 Transposase (IS946) 99 L. lactis plasmide pMRCOI 43 194 Protéine hypothétique 81 L lactis plasmide pAH82 44 260 Transposase (orf1 de IS981) 100 L lactis IL1403 45 854 Transposase (tra IS981G) 92 L. lactis IL1403 46 854 Transposase (tra IS981G) 91 L lactis IL1403 47 450 Transposase (Tn 1546) 99 L Lactis plasmide pK214 48 281 Protéine hypothétique (bacteriocine potentiel) 74 L. Lactis plasmide pSRQ900 49 1706 D-lactate deshydrogenase, partie C terminale 51 E. coli 50 236 Transposase tronquée (lSLpH) 87 Lb. plantarum 51 512 Relaxase, protéine de mobilisation (MobD El) 94 L. lactis plasmide pAH90 52 368 Protéine hypothétique (Orf9) 95 L. lactis plasmide pAH90 53 347 Transposase tronquée (tra IS981G) 98 L. lactis IL1403 54 1337 Système de transport TrK type K+ 45 Clostridium thermocellum 55 926 Système de transport Na/H 65 L lactis 56 252 Transposase tronquée 75 L. Lactis plasmide pK214

Cette analyse révèle en plus de la présence du gène gdh, la présence de plusieurs autres gènes d'un grand intérêt technologique. On peut noter en particulier la présence de gènes ayant une forte identité avec des gènes codant pour des protéines de résistance au cadmium CadA et CadC précédemment trouvés dans d'autres plasmides de L. lactis (pND302 et pAH90). Ces protéines confèrent une résistance au cadmium utilisable comme marqueur de sélection pour le transfert de pGDH442. Le plasmide renferme également un gène homologue à MobD du plasmide pAH90 de L. lactis, lequel code pour une relaxase impliquée dans la conjugaison des bactéries gram- positives. Il comprend également des gènes homologues à ceux codant pour les sous- unités OppA, OppB, OppC, OppD, and OppF du transporteur ABC (ATP-binding cassette) impliqué dans le transport intracellulaire d'oligopeptides (TYNKKYNEN et al., J. Bacteriol., 175, 7523-7532, 1993), ainsi qu'un gène codant pour une endopeptidase intracellulaire (PepO). Détection du plasmide pGDH442 :

A partir du plasmide pGDH442, il est possible de définir des amorces permettant de rechercher ce plasmide ou un plasmide très similaire dans des souches.

A titre d'exemple, le plasmide a été recherché dans 4 souches possédant l'activité GDH (TIL 442, TIL 446, TIL 443 et TIL 447) et une souche sans activité (MG 1363) par des amplifications PCR avec des oligonucléotides choisis dans la séquence du plasmide. La liste des amorces utilisées, leur localisation sur le plasmide, la température d'hybridation utilisée et la taille du fragment attendue sont présentées dans le Tableau VI ci-dessous.

TABLEAU Vl

Les résultats des amplifications de ces amorces avec l'ADN total des 5 souches sont présentés dans la figure 11. Aucune amplification n'est observée avec l'ADN de la souche MGl 363 qui ne contient pas de plasmide, tandis que les amplifications attendues pour pGDH442 sont observées avec les souches TIL 442, TIL446, TIL 443 et TIL 447, indiquant que ces souches renferment un plasmide identique ou très similaire à pGDH442. EXEMPLE 7 : TRANSFERT DU PLASMIDE PGDH442 DANS UNE SOUCHE GDH-NEGATIVE PAR MECANISME NATUREL

Pour confirmer que le plasmide pGdh442 pouvait être transféré naturellement dans une autre souche de L lactis, des essais de transfert par contacts cellulaires sur surface solide ont été effectués. Un premier essai a été réalisé en utilisant la souche TIL 504 (obtenue comme décrit à l'exemple 4) comme souche donneuse. Dans un second essai, la souche TIL446, naturellement GDH-positive et identifiée comme possédant le plasmide pGDH442 (cf. exemple 6 ci-dessus), a été utilisée comme souche donneuse.

Dans les deux cas, on a utilisé comme souche receveuse la souche TIL 193, qui est une souche dérivée de la souche MG 1363 par introduction du plasmide pGhostδ qui lui confère une résistance à la tétracycline.

Pour chacun des essais, la souche donneuse et la souche receveuse ont été cultivées séparément dans un milieu Ml 7 avec la sélection appropriée ( respectivement cadmium et tétracycline). Les cellules ont été ensuite mélangées avec un rapport donneuse/receveuse de 1/1, concentrées dans lOOμl d'une solution de M17 à 10% et étalées sur boîtes de milieu Ml 7. Après incubation pendant 7h à 3O⁰C les cellules ont été récupérées et des dilutions en série étaient étalées sur boîtes contenant des milieux sélectifs pour la souche donneuse (Ml 7 + cadmium), pour la souche receveuse (M17+Tetracycline) et pour les conjugants (Ml 7 + cadmium + Tetracycline).

Dans les 2 cas, on a observé une fréquence de transfert, calculée comme le nombre de conjugants par cellule réceptrice, de l'ordre de 1 x 10^'7.

Les conjugants respectivement obtenus à partir des souches TIL 504 et TIL 446 sont dénommés TIL 507 et TIL 508.

La présence des deux plasmides pGdh442 et de pGhost8 a été confirmée dans chacun des conjugants TIL 507 et TIL 508, par amplification par PCR avec des oligonucléotides spécifiques de l'un ou de l'autre de ces deux plasmides. Enfin, l'activité GDH déterminée dans les extraits cellulaires de TIL 507 et TIL 508 est similaire à l'activité GDH des souches donneuses, indiquant que l'activité GDH peut être transférée dans des souches GDH-négatives par un mécanisme de transfert naturel.

Claims

REVENDICATIONS

1) Plasraide dénommé pGDH442, dont un échantillon a été déposé le 30 août 2004 auprès de la CNCM sous le numéro 1-3280, caractérisé en ce qu'il a une taille de 60 à 70 Kb, et en ce qu'il contient un gène (gdh), défini par la séquence SEQ ID NO: 1, codant pour une glutamate désydrogénase (GDH).

2) Utilisation du plasmide pGDH442 selon la revendication 1 pour transformer une souche de Lactococcus lactis, afin de lui conférer une activité GDH.

3) Utilisation du plasmide pGDH442 selon la revendication 1 pour transformer une souche de Lactococcus lactis, afin de lui conférer la capacité d'utiliser des oligopeptides résultant de la dégradation de la caséine.

4) Glutamate déshydrogénase (GDH), caractérisée en ce que sa séquence peptidique possède au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 2.

5) Polynucléotide isolé choisi parmi : a) un polynucléotide codant pour une GDH selon la revendication 4 ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ou le polynucléotide b).

6) Polynucléotide selon la revendication 5, défini par la séquence SEQ ID NO: 1 ou son complémentaire.

7) Couple d'amorces permettant l'amplification spécifique d'une séquence polynucléotidique codant pour une GDH selon la revendication 4, et choisi parmi :

- les amorces gdhl3F (SEQ ID NO : 11) et gdh22R (SEQ ID NO : 12) ;

- les amorces gdh3F (SEQ ID NO : 3) et gdh8R (SEQ ID NO : 4) ;

- les amorces gdh37F (SEQ ID NO : 9) et gdhl8R (SEQ ID NO : 13) ;

- les amorces gdh4F (SEQ ID NO : 16) et gdh9R (SEQ ID NO : 17) . 8) Vecteur d'acide nucléique comprenant un polynucléotide codant pour une GDH selon la revendication 4.

9) Procédé d'obtention d'une souche de L. lactis GDH positive, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une souche de L. lactis GDH négative par un polynucléotide codant pour une GDH selon la revendication 4. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite transformation est effectuée en utilisant comme vecteur le plasmide pGDH442 selon la revendication 1.

11) Procédé de sélection de souches de L, lactis GDH positives, caractérisé en ce qu'il comprend la recherche, dans les souches à tester, de la présence d'une séquence codant pour une GDH selon la revendication 4, et la sélection des souches contenant ladite séquence.

12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'amplification par PCR de ladite séquence. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite amplification par PCR est effectuée à l'aide d'un couple d'amorces selon la revendication 7.

14) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence du plasmide pGDH442. 15) Procédé de détection de la présence du plasmide pGDH442 dans une souche de L. lactis, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'amplification par

PCR d'une séquence du plasmide pGDH442.

16) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite amplification par PCR est effectuée à l'aide d'un couple d'amorces choisi parmi : - les amorces IF (SEQ ID NO : 25) et 3R (SEQ ID NO : 26) ;

- les amorces 8F (SEQ ID NO : 29) et 9R (SEQ ID NO : 30) ;

- les amorces 10F (SEQ ID NO : 31) et 1 IR (SEQ ID NO : 32) ;

- les amorces 12F (SEQ ID NO : 33) et 13R (SEQ ID NO : 34) .

- les amorces 14F (SEQ ID NO : 35) et 15R(SEQ ID NO : 36) ; - les amorces 16F (SEQ ID NO : 37) et 17R (SEQ ID NO : 38) ;

- les amorces 18F (SEQ ID NO : 39) et 19R (SEQ ID NO : 40) .