EP1725582A1 - Der faktor reca aus bacillus licheniformis und reca-inaktivierte sicherheitsstämme für die biotechnologische produktion - Google Patents

Der faktor reca aus bacillus licheniformis und reca-inaktivierte sicherheitsstämme für die biotechnologische produktion

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Publication number
EP1725582A1
EP1725582A1 EP05715348A EP05715348A EP1725582A1 EP 1725582 A1 EP1725582 A1 EP 1725582A1 EP 05715348 A EP05715348 A EP 05715348A EP 05715348 A EP05715348 A EP 05715348A EP 1725582 A1 EP1725582 A1 EP 1725582A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reca
gene
nucleic acid
seq
factor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05715348A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg FEESCHE
Friedhelm Meinhardt
Hannes Nahrstedt
Jens Waldeck
Mark Groene
Renee EICHSTÄDT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1725582A1 publication Critical patent/EP1725582A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)

Definitions

  • the present invention relates to the RecA factor from Bacillus Hcheniformis and to microorganisms as security strains for biotechnological production, which are characterized in that they have functional deletions in the associated recA gene. Furthermore, RecA is available for further molecular biological approaches.
  • the present invention is in the field of biotechnology, in particular the production of valuable substances by fermentation of microorganisms which are capable of forming the valuable substances of interest.
  • microorganisms which are capable of forming the valuable substances of interest.
  • These include, for example, the production of low molecular weight compounds, such as food supplements or pharmaceutically relevant compounds, or proteins, for which there is in turn a wide range of technical applications due to their diversity.
  • the metabolic properties of the microorganisms in question are used and / or changed to produce the valuable substances;
  • cells are used which express the genes of the proteins of interest. In both cases, these are mostly genetically modified organisms (GMOs).
  • the application relates to EP 369817 A1 ⁇ / us strains, in particular ⁇ . subtilis, for the production and secretion of proteins in which the genes for extra- and intracellular proteases, namely epr, rp-l, rp-ll, isp-1, apr and / or npr, have been functionally inactivated by point mutations or insertions of inactive gene copies ,
  • the purpose of these genetic modifications is to minimize the protease activities which are harmful to the proteins of interest produced with these strains.
  • the strains in question may additionally have mutations which prevent sporulation and thus the formation of equally harmful sporulation proteases.
  • the application WO 92/16642 A1 pursues the same approach: it discloses that by inactivating the protease genes apr, npr, isp-1, epr, bpr, rsp and mpr from Bacillus, a large part of the extracellular protease activity is switched off, and teaches that this can be further improved by inactivating the newly described gene vpr for the residual protease III.
  • the possibility of inactivating spoOA is pointed out in order to prevent the formation of intracellular proteases.
  • Sporulation of gram-positive bacteria is a development process for the formation of permanent forms, the so-called spores, for surviving adverse environmental influences. It is controlled via a complex regulatory cascade with probably more than 100 genes and with the participation of special sigma factors. The connection of this process with the cell cycle of ß.
  • subtilis describes the publication "Cell cycle and sporulation in Bacillus subtilis” (1998) by PALevin and A.D. Grossmann in Curr. Opin. Microbiol, Volume 1, pages 630 to 635.
  • the transcription factor SpoOA is presented as a control element for initiating sporulation.
  • EP 492274 A2 discloses that the prior art has already succeeded in inactivating sporulation genes via unspecific mutagenesis, as a result of which asporogenic mutants (spo-minus phenotype) have been obtained.
  • EP 492274 A2 itself describes a ⁇ treated by targeted mutagenesis in the early sporulation gene spollD. su // s strain, which with a reversion rate of less than 10 "8 is practically no longer able to form spores.
  • This application teaches that this strain is only leu after inactivation of the other genes (for the leucine synthesis), pyrD1 (for uracil synthesis), apr and npr for the production of valuable materials for biotechnological production, because this is associated with advantages in production as well as safety aspects.
  • the application WO 97/03185 A1 also deals with the inactivation of the sporulation ability of ßac /// us species with the exception of ß. subtilis and use of these strains for the biotechnological production of valuable materials.
  • the early gene spollAC coding for the sigma factor F is to be functionally inactivated, advantageously in combination with deletions in genes of the sporulation gene groups spo2, spo3, which were also activated early.
  • spo2, spo3 which were also activated early.
  • an irreversible inactivation of the relevant chromosomal sections for spollAC is described.
  • the application WO 02/097064 A1 (EP 1391502 A1) relates to microorganisms in which genes from stages II, III, IV or V of sporulation have been deleted or inactivated. These are the genes sigE, sigF, spollE, spollSB and sigG of ß. subtilis that within the locus from spolVCB to spolllC from ß. lie subtilis.
  • SubtiList database accessible via http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi
  • this can range from approx. 2,642,000 kb to approx. 2,700,000 kb of the now known total genome of B to be narrowed down.
  • the gene recA coding for the factor RecA described in prokaryotes is very well known in molecular biology, but so far in particular from a context other than that of the production of safety strains.
  • This factor binds specifically and cooperatively to single-stranded DNA and, under ATP hydrolysis, ensures partial unwinding of double-stranded DNA.
  • This process enables the genetic process of recombination, that is, the strand exchange between similar DNA molecules.
  • It is a common procedure in molecular biology to use the recA gene by inactivating a defective copy of recA via a corresponding genetic construct and thus creating a rec / ⁇ - minus phenotype which is no longer used Recombination is capable.
  • deletion mutants generated by crossing-over are genetically stabilized by subsequent inactivation of recA.
  • references to recA appear in a wide variety of molecular biological contexts.
  • DE 10011358 A1 which deals with L-shaped bacterial strains, also mentions that, in addition to numerous other possible modifications, it is also possible, among other things, to mutate recA in order to achieve improved transformation and plasmid stability.
  • a biochemical description of the RecA from Escherichia coli is provided, for example, by the publication "C-terminal deletions of the Escherichia coli RecA" by SLLusetti et al. (2003; J. Biol. Chem., Volume 278, number 18, pages 16372-16380) It follows that, in particular, the C-terminus of this molecule mediates single-strand binding and that corresponding deletion mutants in this area, in addition to other biochemical properties, have an increased sensitivity to mitomycin, which is known to impair DNA synthesis and thereby have a bactericidal effect.
  • the N-terminal region is more involved in the binding of DNA double strands.
  • RecA The state of the art for RecA can be summarized to the extent that this protein has hitherto been known predominantly from genetic contexts. The use of this factor or the inactivation of the gene in question to generate safety strains of GMOs has so far been rejected due to its physiological importance. Successful described examples of this are only recA-minus mutants of the gram-negative species Sinorhizobium meliloti and the gram-positive Bacillus megaterium, the latter only in combination with three other safety-relevant mutations.
  • the task was therefore to develop a further suitable security system for genetically modified gram-positive bacteria, for which a suitable factor and / or a suitable gene had to be identified as the basis.
  • a partial aspect of this task was the isolation of a genetic element that can be used for this purpose, possibly a gene, and the amino acid sequence of one of these, if applicable encoded factor in order to make this system accessible to corresponding molecular biological constructions for use in production strains, in particular in combination with one or more further safety mechanisms serving for safety purposes.
  • a subtask was to define another such security system to be combined with it, preferably one that would not require any further mutations in addition to these two systems.
  • a maximum of these two mutations should be sufficient to create a gram-positive safety strain that meets extensive requirements for reducing environmental viability, that is, should lead to a minimal reversion rate. Because a lower number than four side-by-side systems means an increasingly lower amount of work to produce these strains.
  • a side aspect of this task was to find such a security system that is not so special that it could not be used in other molecular biological approaches.
  • This task is carried out by the factor RecA with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 2 specified amino acid sequence is at least 96% identical, or by the nucleic acid coding for a factor RecA, the nucleotide sequence of which in SEQ ID NO. 1 specified nucleotide sequence is at least 85% identical.
  • the in SEQ ID NO. Amino acid and nucleotide sequences given in 2 and 1 are those for RecA. All positions from 1 to 1047 code for the protein; the last three represent the stop codon. They are referred to as the gene and protein recA and RecA, respectively. They come from the Bacillus Hcheniformis strain deposited with the number DSM 13 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de). Solutions to the task according to the invention represent all factors or nucleic acids which have sufficient homology for this, as defined by the respective percentages.
  • the corresponding factor can be from ß. amyloliquefaciens can be viewed.
  • the corresponding complete DNA and amino acid sequences are published in the NCBI database of the National Institutes of Health of the USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) under the accession number AJ515542, with a partial sequence located near the C-terminus additionally emerges from the entry AY147924.
  • RecA from ß. Hcheniformis DSM 13 has a homology of 94.0% identity at the amino acid level and an agreement of 81.2% identity at the nucleic acid level. Both comparisons emerge from the alignments of FIGS. 1 and 2, where the sequences of ⁇ . amyloliquefaciens are shown in the second line.
  • the next similar enzymes were RecA from ß. subtilis and RecE from ß. subtilis, each with 93.4% identity. They have homology values of 81.0% and 81.2% identity at the DNA level. They are also published in the NCBI database under registration numbers Z99112 (region 161035 to 162078) and X52132. The amino acid and DNA comparisons with these factors are also shown in FIGS. 1 and 2 (lines 3 and 4, respectively).
  • Example 1 of the present application illustrates how other factors RecA can suitably be obtained which lie within the homology range designated here.
  • a molecular-biological procedure is shown there, according to which genes or gene sections relating to specific PCR primers, in particular the specifically disclosed (SEQ ID NO. 25 to 30) oligonucleotides, can be obtained from chromosomal DNA preparations of the species concerned. If necessary, if these primers cannot be used successfully, similar primers can be used in which - controlled by the reaction conditions in the primer synthesis - individual positions are varied.
  • These PCR products can - if only partial sequences have been obtained when using appropriate primers (cf. FIG. 3B) - can be combined to form coherent DNA sequences by customary methods (using overlaps).
  • the amino acid sequence of that of the obtained RecA-encoded factor RecA gene can be used as probes in order to isolate relevant genes from gene banks by methods known per se.
  • RecA This opens up a wide technological and commercially relevant area for RecA and especially for the associated recA gene, namely the production of valuable substances by fermentation of genetically modified gram-positive bacteria. They can be improved not only in terms of their genetic stability but also in terms of their safety through mutations in recA. As explained further below, this applies in particular to strains which are actually used in biotechnological production, such as, for example, Bacillus hcheniformis.
  • this is preferably done in connection with one and particularly preferably no further security-relevant deletions.
  • This is also preferably done in strains that are as closely related as possible.
  • B. megaterium should not be used, on the one hand because, as described in the introduction, the species-specific recA genes or the mutants deleted therein are already available, and on the other hand because these species, which are characterized in particular by their large cells and thus associated microbiological peculiarities, is generally not used for large-scale fermentation.
  • Objects of the present invention thus lie in the factor RecA (SEQ ID NO. 2) and the associated gene recA (SEQ ID NO. 1) from ⁇ . Hcheniformis DSM 13 or close relatives.
  • recAGens and / or one that is related to SEQ ID NO. 31 is sufficiently related to the functional inactivation of recA in a gram-positive bacterium, preferably in combination with the functional inactivation of a gene active in phase IV of sporulation of gram-positive microorganisms, preferably spolV, yqfD or homologues thereof.
  • a gene active in phase IV of sporulation of gram-positive microorganisms preferably spolV, yqfD or homologues thereof.
  • the gram-positive microorganisms obtained in this way represent a corresponding subject of the present invention; likewise the fermentations carried out with these organisms, in particular for the production of valuable materials.
  • the present application provides a RecA protein which can be used in molecular-biological approaches or for modulating the molecular-biological activities of cells, in particular in connection with DNA polymerization or recombination processes.
  • the first subject matter of the invention includes each factor RecA defined above with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 2 specified amino acid sequence is increasingly preferably at least 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% and very particularly preferably 100% identical.
  • This is preferably a factor RecA, which is encoded by a nucleic acid whose nucleotide sequence corresponds to that in SEQ ID NO. 1 specified nucleotide sequence is at least 85% identical.
  • the relevant factors or genes are available via the nucleic acids for the transformation into other, preferably related species or for modifications. As explained in more detail below, this includes in particular mutations of the genes in question. With an increasing degree of identity to the given sequence, the success with such species should be greater, that too ß. Hcheniformis are increasingly related, especially in the species ß, which is particularly important for biotechnological production. Hcheniformis itself.
  • nucleic acids coding for a factor RecA the nucleotide sequence of which corresponds to that in SEQ ID NO. 1 specified nucleotide sequence is at least 85% identical.
  • nucleic acids whose nucleotide sequence corresponds to that in SEQ ID NO. 1 specified nucleotide sequence is increasingly preferably at least 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% and very particularly preferably 100% identical. This is because these can be used via appropriate constructions for transformation and / or mutagenesis, an increasing similarity making the desired success all the more likely.
  • nucleic acid of this type which codes for a previously described factor RecA.
  • a mutation in a single position is sufficient to switch off the gene or the factor in its natural function via a nonsense mutation.
  • a separate subject of the invention is the use of a nucleic acid coding for a factor RecA for the functional inactivation of the gene recA in a gram-positive bacterium which is not Bacillus megaterium.
  • a gram-positive bacterium which is not Bacillus megaterium.
  • B. megaterium there are already the studies mentioned in the introduction, in which it is proposed to delete recA at the same time as several other mutations in order to arrive at safety strains.
  • other gram-positive bacteria such as those of the genera Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium and Clostridium, are more important host organisms in the prior art for the biotechnological production of valuable substances (see below).
  • functional inactivation means any type of modification or mutation, after which the function of a RecA as a single-strand DNA-binding factor is prevented.
  • the "use" of this factor or gene according to this embodiment which was discussed at the outset, consists in the fact that it does not function naturally in the cell in question. According to this object of the invention, this is achieved on a genetic level in that the The gene in question is switched off, and example 2 of the present application describes one way in which this can be achieved technically.
  • nucleic acid coding for a non-active protein with a point mutation is used.
  • nucleic acids can be generated by methods known per se for point mutagenesis. Such are described, for example, in relevant manuals such as that of Fritsch, Sambrook and Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.
  • oligonucleotides are synthesized with individual exchanges (mismatch primers) and hybridized with the single-stranded gene, followed by DNA polymerization to give corresponding point mutants Due to the high homologies it is possible and particularly advantageous according to the invention to use the reaction with SEQ ID NO provided sequence or possibly the other sequences of related species shown in FIG. 2. These sequences can also be used to design corresponding mismatch primers for related species, in particular on the basis of the conserved regions which can be identified in the alignment of FIG.
  • a nucleic acid with a deletion or insertion mutation is used, preferably comprising the edge sequences of the region coding for the protein each comprising at least 70 to 150 nucleic acid positions.
  • Example 2 Such an approach was chosen in Example 2: As explained there, SEQ ID NO. 31 two flanking regions of approx. 340 bp each were used to ß the part of the recA gene in between. delete licheniformis stem (see FIG. 3B). In example 3 below, the success of this deletion is checked at the genetic level. Figure 4 (A and B) thus shows that the relevant DNA fragment has been shortened accordingly by the deletion. The phenotypic description of the mutants obtained in this way is given in the examples below. Accordingly, recA inactivated strains are significantly more UV-sensitive than those with an intact recAGen (example 6).
  • nucleic acid positions are required in each of the two edge sequences for the mismatched part, the part in between not being important. Accordingly, those embodiments are preferred which only comprise two flanking regions with at least these sizes.
  • nucleic acids with a total of two nucleic acid segments are used, each comprising at least 70 to 150 nucleic acid positions and thus flanking at least partially, preferably completely, the region coding for the protein.
  • the marginal areas of the genes in question are also suitable for this, which naturally perform a different function (promoter, terminator, enhancer etc.) or merely represent non-functional intergenic sections.
  • the functional inactivation can also consist in the deletion of the promoter, for which it is necessary to use flanking, non-coding sections in the case of a deletion mutation of this embodiment. Depending on the individual case, it may also be sensible to select those sections for the flanking regions which partly extend into the protein-coding region and partly lie outside.
  • Such areas can be used for ⁇ .
  • Hcheniformis for example SEQ ID NO. 31 are removed.
  • subtilis can be found in the database entries given above.
  • it is possible to open up the relevant non-coding areas using PCR-based methods from a preparation of the genomic DNA; as illustrated in Example 1. These methods (for example anchored PCR with primers pointing outwards into an unknown region) are established in the prior art.
  • the known gene segments which serve to open up the still unknown regions, serve as starting points for this.
  • the primers required for this can be identified using SEQ ID NO. 1 and 31 also for other species of gram-positive bacteria and in particular for those of the genus Bacillus can be designed, possibly with the introduction of variable positions, as has already been explained above.
  • a corresponding use is accordingly one of the previously described nucleic acids according to the invention and / or a nucleic acid whose nucleotide sequence corresponds to that in SEQ ID NO. 31 indicated nucleotide sequence in positions 369 to 1415 corresponds to at least 1045, preferably at least 1046, very particularly preferably 1047 of these 1047 positions, or around the at least partially non-coding flanking regions for these nucleic acids.
  • SEQ ID NO. 1 is based on the commercially available strain DSM 13; SEQ ID NO. 31 was by reworking the invention based on an arbitrary ß. Hcheniformis strain obtained (Example 1). Since they match in 1044 positions, the embodiment described as successful in the examples can be given an increasing preference for 1045, 1046 and very particularly 1047 corresponding positions to SEQ ID NO. 31 describe.
  • the gram-positive bacterium is preferably one of the genera Clostridium or Bacillus and one which is naturally capable of sporulation, in which a gene from phase IV of the sporulation is functionally inactivated simultaneously with recA.
  • Example 1 shows the procedure for functional inactivation and example 3 shows its success (FIG. 4). The hoped for phenotypic sporulation defects are demonstrated by Example 4 and Figure 5.
  • the inactivated gene from phase IV of sporulation is in the nomenclature of ⁇ . subtilis is one of the genes spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB or yqfD or a gene homologous thereto, preferably in the case of ⁇ . subtilis for the yqfD gene, in the case of Bacillus Hcheniformis for the spolV gene and in any other case for a homologous gene.
  • the ß. subtilis-Ger spolVA codes for phase IV sporulation protein A, which is available in the databases Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) SA, Geneva, Switzerland; http://www.genebio.com/sprot.html) and NCBI ( see above) under number P35149. It plays a role in the formation and assembly of an intact spore shell.
  • the amino acid sequence of the associated SpolVA factor is shown in SEQ ID NO. 8 of the present application, as the translation of the previous DNA sequence generated by the Patentin program.
  • nucleotide sequence can be found in the Subtilist database of the Pasteur Institute, Paris, France (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList genome.cgi) under number BG10275 and is in the sequence listing in SEQ ID NO. 7, together with the 200 nucleotides located before the 5 'end and the 197 nucleotides behind the 3' end. Notwithstanding the fact that these marginal sequences may well contain useful genetic information, in particular regulatory elements or sections of other genes, the complete under SEQ ID NO. 7 indicated nucleotide sequence from 1 to 1876 referred to according to the invention as gene spolVA.
  • the coding area extends from positions 201 to 1679; the first codon, ie positions 201 to 203, are translated in vivo not as leucine but as methionine.
  • the ß. subtilis gene spolVB codes for the phase IV sporulation protein B, which is stored in the Swiss-Prot and NCBI databases under the number P17896. It is important for the sigma factor K-dependent transition point during sporulation or its activation in the mother cell. It plays a role in inter-compartmental signal transmission, probably via the hydrophobic one N-terminus.
  • the amino acid sequence of the factor SpolVB is shown in SEQ ID NO. 10 of the present application, as the translation of the previous DNA sequence generated by the Patentin program.
  • the associated nucleotide sequence can be found in the database Subtilist under number BG10311 and is in the sequence listing in SEQ ID NO.
  • the complete under SEQ ID NO. 9 specified nucleotide sequence from 1 to 1675 according to the invention referred to as gene spolVB.
  • the coding area extends from positions 201 to 1478.
  • the ß. subtilis gene spolVCA codes for a putative site-specific DNA recombinase, which is stored in the Swiss-Prot and NCBI databases under the number P17867. It probably plays a role in recombining the spolllC and spolVCB genes, from which the sigma factor K emerges.
  • the amino acid sequence of this recombinase is shown in SEQ ID NO. 12 of the previous application, as the translation of the previous DNA sequence generated by the Patentin program.
  • the associated nucleotide sequence can be found in the Subtilist database under number BG10458 and is in the sequence listing in SEQ ID NO.
  • the complete under SEQ ID NO. 11 indicated nucleotide sequence from 1 to 1900 referred to according to the invention as gene spolVCA.
  • the coding area extends from positions 201 to 1703; the first codon, ie positions 201 to 203, are translated in vivo not as valine but as methionine.
  • the ß. subtilis gene spolVCB codes for the RNA polymerase sigma factor K precursor, which is stored in the Swiss-Prot and NCBI databases under number P12254.
  • the rest of this factor is encoded by the gene spolllC, which is approximately 10 kb away on the chromosome, the region in between being referred to as SKIN.
  • the active sigma factor K is obtained, which in turn is called Transcription factor works.
  • the amino acid sequence of the sub-factor SpolVCB is shown in SEQ ID NO. 14 of the present application, as the translation of the previous DNA sequence generated by the Patentin program.
  • nucleotide sequence can be found in the database Subtilist under the number BG 10459 and is in the sequence listing in SEQ ID NO. 13, together with the 200 nucleotides before the 5 'end and the 197 nucleotides behind the 3' end. Notwithstanding the fact that these marginal sequences may well contain useful genetic information, in particular regulatory elements or sections of other genes, the complete under SEQ ID NO. 13 indicated nucleotide sequence from 1 to 868 referred to according to the invention as gene spolVCB. The coding area extends from positions 201 to 671.
  • the ß. subtilis gene spoIVFA codes for the phase IV sporulation protein FA. This factor, which is presumably able to form a heterodimer with SpoIVFB (see below), probably fulfills the task of stabilizing this factor but also inhibiting it at the same time. That is why SpoIVFA is formed earlier, probably in phase II.
  • the amino acid sequence of SpoIVFA is stored in the Swiss-Prot and NCBI databases under number P26936. It is listed in SEQ ID NO. 16 of the present application, as the translation of the previous DNA sequence generated by the Patentin program.
  • the associated nucleotide sequence can be found in the Subtilist database under number BG10331 and is in the sequence listing in SEQ ID NO.
  • SEQ ID NO. 15 indicated nucleotide sequence from 1 to 1192 referred to as gene spoIVFA according to the invention.
  • the coding area extends from positions 201 to 995.
  • the ß. subtilis gene spoIVFB codes for the phase IV sporulation protein FB. It is a membrane-associated metalloprotease that is probably responsible for the processing from Pro-Sigma K to Sigma K; it is also formed in phase II of the sporulation.
  • the amino acid sequence of SpoIVFB is in the Swiss-Prot and NCBI databases stored under number P26937. It is listed in SEQ ID NO. 18 of the present application, as the translation of the previous DNA sequence generated by the Patentin program.
  • the associated nucleotide sequence can be found in the database Subtilist under the number BG 10332 and is in the sequence listing in SEQ ID NO. 17 together with the 200 nucleotides before the 5 'end and the 197 nucleotides behind the 3' end.
  • SEQ ID NO. 17 indicated nucleotide sequence from 1 to 1264 according to the invention referred to as spoIVFB gene.
  • the coding area extends from positions 201 to 1067; the first codon, ie positions 201 to 203, are translated in vivo not as leucine but as methionine.
  • the region of nucleotides 1 to 1792 is referred to as gene spo / V
  • the The actual SpolV coding section comprises positions 140 to 1336.
  • the edge sequences may in turn contain other genetic elements such as regulatory elements or parts of other genes, below which the first codon GTG of positions 140 to 142 is translated in vivo not as valine but as methionine.
  • subtilis which, with a homology of 68% identity at the amino acid level, is regarded as the closest similar protein known to date.
  • This factor is specified in the Swiss-Prot database under number P54469; Both the amino acid sequence and the DNA sequence with both approximately 200 bp flanking regions can be found in the database Subtilist under the number BG11654. The entry there notes that it is an unknown protein, but due to the existing sequence homologies it can be regarded as similar to the phase IV sporulation protein.
  • the associated sequences can be SEQ ID NO. 5 and 6 of the present application.
  • the range of nucleotides 1 to 1594 is referred to as gene yqfD according to the invention, the actual protein-coding section comprising positions 201 to 1397.
  • the first codon GTG of positions 201 to 203 is made as in spolV from ß. Hcheniformis translated in vivo not as valine but as methionine.
  • one of these genes is inactivated simultaneously with recA in the production strain in order to obtain appropriate safety strains therefrom.
  • deletion mutagenesis those in SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 or 17 specified nucleic acids themselves used for inactivation. It is not even necessary to identify the relevant homologous genes from the species used for production. It can be expected that these deletions will be more successful the narrower the species in question with ß. subtilis or ß. Hcheniformis are related. Because this should be associated with an increasing homology of the genes in question. For this reason, the approx.
  • 200 bp marginal sequences are also given in the sequence listing, because in accordance with the statements made for recA, constructs can be formed that completely cover the areas of at least 70 to 150 positions required for a crossing-over Contain areas and can be used with a certain probability of success for the deletion of the relevant sections in microorganisms not characterized in this regard.
  • active systems that prevent viability and are to be regulated accordingly stringently, these also include those that were referred to in the introductory state of the art as "passive" systems for generating GMOs, in particular include inactivating mutations in one or more of the following Gene: epr, rp-l, rp-ll, isp-1, apr, npr, spoOA, bpr, rsp, mpr, vpr, spoOA, spollD, spollAC, spo2, spo3, sigE, sigF, spollE, spollSB, sigG, spolVCB, spolllC, nprM and the gene for isopropylmalate dehydrogenase (leuB).
  • sporulation defects in the genes spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB or yqfD are identified in the nomenclature of ⁇ . subtilis or in the case of Bacillus Hcheniformis in the gene spolV or the genes that are homologous to it depending on the host cell.
  • this homology can be inferred from a sequence comparison.
  • the gene in question can be inactivated in the present microorganism strain intended for biotechnological production and the functional agreement of the genes in question can be checked by restoring the phenotype (rescue). If the parallel provision of a spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD or spo / V copy relevant to the invention converts the knock-out mutant in question into a sporulation-positive phenotype, this would prove that there is a functional interchangeability of the genes under consideration.
  • sporulation genes are therefore understood in particular to be those which are accessible to such a "rescue”. If this is possible, it is a preferably used sporulation gene.
  • This control is possible in particular with a reasonable amount of work because, on the one hand, such a functionally inactive one Mutant is to be generated and, on the other hand, the sequences in question from ß. Subtilis and the particularly preferred thereof from ß. Hcheniformis are made available via the sequence listing for the present application, via which such a rescue can be carried out.
  • the use according to the invention described so far for the functional inactivation of the genes spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD or spolV or the genes which are homologous thereto is carried out using the sequences SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, or 17 or parts thereof, preferably using parts that comprise at least 70 to 150 contiguous nucleic acid positions, particularly preferably using two such parts that enclose an intermediate part of the gene.
  • microorganisms obtained with the methods described are a separate subject of the present invention. In its most general formulation, it is therefore a gram-positive bacterium which is not Bacillus megaterium, in which the recA gene is functionally inactivated.
  • Gram-positive bacteria in which the gene recA has been functionally inactivated by genetic engineering, i.e. artificial work steps, are primarily intended here.
  • gram-positive bacteria are the most important microorganisms for biotechnology, for example due to their ability to secrete valuable substances and / or their comparatively easy fermentability.
  • different species are preferred for the different fields of application, so low-molecular compounds such as amino acids are used to a particularly large extent produced by Corynebacteria; Bacillus and especially ß.
  • Hcheniformis is particularly valued for the production of extracellular proteins. According to the invention, they are all accessible, at least in principle, to functional inactivation of RecA.
  • bacteria according to the invention are distinguished by the recombination defects described and therefore, under natural conditions, in particular in competition with other microorganisms, have disadvantages with regard to their survivability and are therefore suitable as security strains for biotechnological production. For the reasons stated above, this is not Bacillus megaterium.
  • Gram-positive bacteria are also preferred, in which the functional inactivation was carried out via a nucleic acid according to the invention coding for RecA and / or via a nucleic acid whose nucleotide sequence corresponds to that in SEQ ID NO. 31 indicated nucleotide sequence in positions 369 to 1415 corresponds to at least 1045, preferably at least 1046, very particularly preferably 1047 of these 1047 positions, or via the at least partially non-coding flanking regions to these nucleic acids.
  • nucleic acids with the homology values described above are around SEQ ID NO. 1 or, as already explained, to SEQ ID NO. 31 preferred accordingly.
  • Microorganisms in which the functional inactivation using the in SEQ ID NO. 1 or 31 specified nucleic acid or sections thereof are the most preferred microorganisms in this regard.
  • edge sequences of at least 70 to 150 bp each were preferably used, which can be checked by sequencing the relevant chromosomal sections.
  • this includes in particular those genetic defects which have been carried out via biotechnological work steps.
  • Gram-positive bacteria are preferred, among which the inactivated gene from phase IV of sporulation is in the nomenclature of ⁇ . subtilis is one of the genes spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB or yqfD or a gene homologous thereto, preferably in the case of ⁇ . subtilis for the yqfD gene, in the case of Bacillus Hcheniformis for the spolV gene and in any other case for a homologous gene.
  • this is preferably a gram-positive bacterium in which - in addition to the RecA inactivation - exactly one gene from phase IV of the sporulation is functionally inactivated.
  • a gram-positive bacterium is furthermore preferred in which the functional inactivation of the genes spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD or spolV or the genes which are homologous to each other with the aid of one of the sequences SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, or 17 or parts is effected thereof, preferably by means of parts which comprise at least 70 to 150 contiguous nucleic acid positions, particularly preferably by means of two such 'parts of an intermediate part Enclose the gens.
  • the respective flanking sequences can be used as primers for this, the size of the PCR product providing information about the presence and possibly the size of inserts. This procedure is exemplified for spolV in the examples for the present application.
  • those which are representatives of the genera Clostridium or Bacillus are particularly preferred, in particular those of the species Bacillus subtilis, B. Hcheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. globigii , B. clausii or ß. lentus, and especially around strains of ß. Hcheniformis.
  • RecA preferably in combination with the preferred embodiments shown, is not active and the strain in question presents a significantly minimized safety risk in the event of an accidental release into the environment of the plant.
  • Appropriate safety requirements are made for fermentation processes so that they can only be carried out if they meet these requirements.
  • Example 5 shows that such a strain is not fundamentally disadvantageous under the optimal conditions during fermentation; this also applies to the double mutant described there.
  • the inactivation of recA leads however, to a significantly reduced viability under the influence of UV. This is a common environmental factor that bacteria are confronted with when they leave the production plant.
  • UV radiation is a common sterilization method for laboratories and biotechnological production facilities.
  • the inactivation of spolV leads to a drastically reduced sporulation rate.
  • both approaches can be combined with each other in the same bacterial strain.
  • both "passive" systems for the generation of technically usable security strains complement each other due to their different active principles.
  • the low-molecular compound is a natural product, a food supplement or a pharmaceutically relevant compound.
  • compositions include, for example, amino acids or vitamins that are used particularly as food supplements.
  • Pharmaceutically relevant compounds can be preliminary or intermediate stages to medication or even these themselves. In all these cases one speaks of biotransformation, according to which the metabolic properties of the microorganisms are used to completely or at least in individual steps to replace the otherwise complex chemical synthesis.
  • the protein is an enzyme, in particular one from the group of ⁇ -amylases, proteases, cellulases, lipases, oxidoreductases, peroxidases, laccases, oxidases and hemicellulases.
  • Industrial enzymes that are produced using such processes are used, for example, in the food industry.
  • ⁇ -amylases are used to prevent bread from becoming stale or to clarify fruit juices.
  • Proteases are used to break down proteins. All of these enzymes have been described for use in detergents and cleaning agents, with the subtilisin proteases already naturally produced by gram-positive bacteria occupying a prominent place. In particular in the textile and leather industry, they are used to process natural raw materials. Furthermore, all of these enzymes can in turn be used as catalysts for chemical reactions in the sense of biotransformation.
  • the use is preferred for stabilizing single-stranded DNA, in particular in the case of DNA polymerization, in recombination processes taking place in vitro, or for converting double-stranded DNA into single-stranded DNA or vice versa.
  • RecA is a DNA single-strand binding protein which, as explained, also has a certain affinity for double-stranded DNA. This function comes into play in the natural process of crossing over in the course of homologous recombination.
  • RecA can be added to a PCR or a preparation of phage DNA in order to stabilize the single strands. If in vitro RecA processes can be understood, for example when introducing mutations (this also applies to the mutations according to the invention described above), this can be supported by RecA.
  • the conversion of double-stranded DNA into single-stranded DNA or vice versa means a function that supports gyrase or gyrase. This can be used to influence the DNA topology, for example when working with plasmid DNA.
  • Vectors which contain a previously described nucleic acid according to the invention, represent a separate subject of the invention.
  • the present invention is also implemented in this form.
  • This DNA can be processed or stored in the form of molecular biology in the form of cloning vectors.
  • Such a vector is preferably an expression vector. This is because this can be used to produce a RecA according to the invention and to supply it to the mentioned applications of the factor.
  • SEQ ID NO. 1 preferably a corresponding expression vector and more preferably by fermentation of a host containing this nucleic acid or this expression vector.
  • the present invention is achieved in that a cell receives and translates such a gene in the form of a chromosomal copy.
  • a cell receives and translates such a gene in the form of a chromosomal copy.
  • the availability of this gene in the form of a plasmid appears to be easier to control, which may provide for the formation of this factor in several copies.
  • a separate subject of the invention is the use of the nucleic acid according to the invention coding for a factor RecA for the expression of this factor. This is because, in accordance with what has been said above, the present invention is achieved in at least one aspect. This preferably serves to produce this factor yourself, in particular in a method described above. Alternatively, the intracellular expression can also be used to modulate the molecular biological activities of the cells in question, in particular in the case of recombination processes taking place in vivo.
  • the inactivation by an antisense or RNA interference approach is intended, according to which the mRNA coding for RecA is specifically switched off or only partially translatable.
  • the expression of this factor can be modulated in a very targeted manner. This applies both to biotechnological production strains and to laboratory approaches for studying molecular biological aspects.
  • the present invention is also used in the use of the nucleic acid coding for a factor RecA described above according to the invention and / or a nucleic acid coding for a factor RecA, the nucleotide sequence of which corresponds to that in SEQ ID NO. 31 indicated nucleotide sequence in positions 369 to 1415 corresponds to at least 1045, preferably at least 1046, particularly preferably 1047 of these 1047 positions, for inactivating this factor or the recA gene in an in vitro approach, in particular via interaction with an associated nucleic acid.
  • One embodiment of the present invention is thus a nucleic acid coding for a partial sequence of recA or for a partial sequence adjacent to recA in vivo, preferably less than 1,000 bp, particularly preferably less than 500 bp, according to one of SEQ ID NO. 25 to 30. Because these are partial sequences of recA or those that may lie just a few hundred intermediate base pairs away from recA. Increasingly preferred are 1,000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp up to an immediate neighborhood, that is to say a location at the beginning or end of recA, preferably in the areas not yet coding for protein. They can be obtained in accordance with Example 1 for obtaining a recA from a strain not further characterized in this regard, the probability of success increasing with increasing relatives. Hcheniformis increases.
  • a preferred possible use here is to first prepare the most externally binding primers (for example recA6 in combination with recA5 according to FIG. 3B or, if these should not work, recA1 and / or recA4) in order to obtain the area in between. Then, to produce the specific deletion construct, oligonucleotides which bind further to the inside can be used as primers, for example recA2 (for example in combination with recA1) and recA3 (for example in combination with recA4), the nucleotide sequences of the inner primers being optionally based on the sequences obtained by the preceding PCR can be corrected. If this procedure fails, it is also possible, as is known per se and has already been said above, to use PCR primers with sequence variations. The success of this approach is confirmed by the sequencing of the fragment obtained, which corresponds to that in SEQ ID NO. 1 and / or 31 or sequences shown in Figure 2 should have clear homologies if it is a recAGen as desired.
  • This is preferably a use for the amplification of a recA gene, since the aspect of inactivating this gene according to the present invention can thus be realized.
  • these are preferably such uses for producing a gram-positive bacterium which is not Bacillus megaterium, in which the recA gene is functionally inactivated, including the embodiments of this aspect of the invention described above.
  • a nucleic acid coding for a partial sequence of spolV or for a partial sequence adjacent to spolV in vivo preferably less than 1,000 bp, particularly preferably less than 500 bp away according to one of SEQ ID NO. 19 to 24;
  • sequences for rec, 4 and spolV from ⁇ can in principle be given with the sequence listing.
  • Hcheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 1 or 3) can be started. This was started earlier and initially a PCR-based method for isolating these genes from a Bacillus strain was used, as described in the publication “A general method for cloning recA genes of Gram-positive bacteria by polymerase chain reaction” (1992) Duwat et al. In J. Bacteriol., Volume 174 (No. 15), pp. 5171-5175.
  • the coding region comprises positions 140 to 1336 (including the stop codon) shown there, the first three coding for the start codon GTG, which is translated in vivo as methionine.
  • the entire section of 1,792 bp shown here is referred to as the gene spolV because it contains not only the protein-coding part but also regulatory elements which can be assigned to this gene. This gene designation is also made regardless of the fact that sections which are primarily attributable to other genes may extend into it. This seems justified because gene areas are sometimes overlapping. In the case of the recARegion, a DNA with a length of 1,557 bp was obtained, which in the sequence with SEQ ID NO.
  • the two loci spolV and recA obtained in this way were stored in the database GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) under the accession numbers AJ616332 (for spolV) and AJ511368 (for recA).
  • Part A shows the introduction of the deletion in spolV and thus the derivation of the strain ß. Hcheniformis A.1 ( ⁇ .spolV) from ß. Hcheniformis A.
  • Part B shows the further development of ß. Hcheniformis A.1 ( ⁇ spolV) to ß. Hcheniformis A.2 ( ⁇ .spolV, ärecA).
  • the gene location in question, including the genes immediately flanking it, is also designated, as are important restriction sites and the binding regions for the primers listed in Example 1.
  • flank regions from the chromosomal DNA were amplified with the oligonucleotides shown in FIG. 3 and used to construct corresponding deletion cartridges. These were first created in the E. co // vector pUCBM21. This is below http://seq.yeastgenome.org/vectordb/vector_descrip/PUCBM21.html (viewed on January 14, 2005) and commercially available from the company, Röche Diagnostics GmbH, Röche Applied Science, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim (formerly Boehringer) available. They were later cloned into the Bacillus ector pE194.
  • a gene disruption with the help of such integrative vectors is generated by recombination events over the corresponding homologous flank areas.
  • the original plasmid-localized, in vitro mutated copy of the gene to be disrupted is replaced by the native, intact copy in the bacterial chromosome by means of two successive single crossover events. Since the Bacillus effector has a temperature-sensitive origin of replication, the plasmid parts can be removed from the cells later after the disruption under non-permissive conditions (42 ° C.), which enables the establishment of a stable mutant line.
  • the oligonucleotides spo3 and spo4 as well as spo7 and spo6 were used to construct the spo / V deletion cartridge; both sides are approximately 450 bp in size and frame an area of 740 bp (size of the later deletion).
  • the oligonucleotides recA " ⁇ and rec.42 as well as recA3 and recA ⁇ were used to construct the recADeletion cartridge; both flanks are approx. 340 bp in size and frame an area of 852 bp (size of the later deletion).
  • the transformant was subcultured at 42 ° C over several cultivation passages, with a corresponding ⁇ recA mutant ( ⁇ spo / V / ⁇ recA double mutant, referred to as B. Hcheniformis A.2) with the aid of a screening for mitocyc C sensitivity (0, 03 ⁇ g / ⁇ l) could be identified.
  • this phenotypic finding was verified by a PCR using the oligonucleoCde recAS and recA5.
  • the three strains were subjected to a Souf ⁇ ern analysis.
  • 2 ⁇ g each of chromosomal DNA was cut with the restriction endonuclease C / al and after gel electrophoretic separation according to standard methods with a DIG-labeled PCR product (created with the primers spo3 and spo4 based on the starting DNA) hybridized.
  • the larger of the two detected C / al fragments appeared in both strain A.1 and strain A.2 at a height which was lower than the original strain A by an amount corresponding to the deletion (FIG. 4B, left part).
  • the DNA was digested with the restriction endonuclease Sspl and hybridized in an analogous manner with a DIG-labeled PCR product (prepared in an analogous manner with the primers recA and rec> 42).
  • the corresponding Sspl fragment was located in strain A.2 due to the Deletion also at a correspondingly lower height than in parental strain A.1 or wild-type strain A (FIG. 4B right part).
  • the sporulation tests were grown in 200 ml Schaeffer's sporulation medium (16.0 g LB medium, 2.0 g KCI, 0.5 g MgSO 4 x 7 H 2 O, ad 993.0 ml distilled water; pH 7.0; the solution is autoclaved and then supplemented with the following components: 1 ml Ca (NO 3 ) 2 (0.1 M), 1 ml MnCl 2 (0.1 M), 1 ml FeSO 4 (1 mM) , 4 ml glucose (20% (w / v)) in 500 ml two-chicane flasks, for each of the three strains to be tested, three flasks were inoculated 0.25% from an LB preculture and at 30 ° C and about 120 rpm (Innova 4230, New Brunswick Scientific, Edison, NY, USA).
  • the cells were diluted to the one shown in Figure 6 the time of the logarithmic growth phase for a quantitative comparison of their UV-sensitivity each with 15 mM NaCl solution to a level of 10 "4 and 100 ul aliquots of the dilutions on
  • the remaining LB plates were subsequently irradiated with UV light of wavelength 254 nm for different lengths: the plates were placed under a UV lamp, whose power was 100 ⁇ W / cm 2 , placed, covered after various irradiation times and wrapped in aluminum foil to protect against further exposure to light.
  • Figure 1 Amino acid sequence alignment of SEQ ID NO. 2 with those of the closest similar rec factors described in the prior art.
  • Mean RecA factor from ß. Hcheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 2) factor RecA from ß. amyloliquefaciens (AJ515542 in NCBI) factor RecA from ß. subtilis (Z99112 in NCBI; region 161035 to 162078) factor RecE from ß. subtilis (X52132 in NCBI)
  • Figure 2 Nucleic acid sequence alignment of SEQ ID NO. 1 with those of the closest similar rec genes described in the prior art. Here mean: gene recA from ß. Hcheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 1) gene recA from ß. amyloliquefaciens (AJ515542 in NCBI) gene recA from ß. subtilis (Z99112 in NCBI; region 161035 to 162078) gene recE from ß. subtilis (X52132 in NCBI)
  • Figure 3 Schematic representation of the genetic organizations of the wild-type and mutant loci of spolV (A) and recA (B), including the binding sites for the SEQ ID NO. 19 to 30 specified primers.
  • Figure 4 Genotypic investigation of the mutant strains A.1 and A.2 in comparison with the parent strain ß. Hcheniformis A using PCR (A) and Southern analysis (B) (see Example 3).
  • Figure 5 Graphical plot of the living cell numbers and the spore titer of the ß. licheniformis cultivation. Each culture was examined in three parallel experiments. Each experiment was statistically verified by four-fold determination (see example 4). Mean:
  • Figure 6 Growth curve of a cultivation of the three ß. licheniformis strains in minimal medium (see example 5).

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist der Faktor RecA aus Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 2), zusammen mit dem zugehörigen Gen recA (SEQ ID NO. 1), einschließlich verwandten Proteinen und Genen hierzu, darunter der unter SEQ ID NO. 31 beziehungsweise 32 angegebenen Variante. Das Gen recA wird erfindungsgemäß unter anderem zur Konstruktion von grampositiven bakteriellen Sicherheitsstämmen für die biotechnologische Produktion eingesetzt, indem es in den betreffenden Stämmen inaktiviert wird. Diese weisen, sofern sie natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, in einer speziellen Ausführungsform zusätzliche funktionelle Deletionen in Phase-IV-Sporulationsgenen auf, vorzugsweise im Gen spolV (bei Bacillus licheniformis), im Gen yqfD (bei B. subtilis) beziehungsweise in dem hierzu jeweils homologen Gen. Des weiteren steht mit diesem RecA ein Protein zur Verfügung, das in molekularbiologischen Ansätzen oder zur Modulation der molekularbiologischen Aktivitäten von Zellen gebraucht werden kann, insbesondere im Zusammenhang mit DNA-Polymerisations- oder Rekombinationsvorgängen.

Description

Der Faktor RecA aus Bacillus Hcheniformis und recΛ-inaktivierte Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion
Die vorliegende Erfindung betrifft den Faktor RecA aus Bacillus Hcheniformis sowie Mikroorganismen als Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie funktionelle Deletionen in dem zugehörigen Gen recA aufweisen. Ferner steht RecA damit für weitere molekularbiologische Ansätze zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von Mikroorganismen, die zur Bildung der interessierenden Wertstoffe in der Lage sind. Hierzu zählen beispielsweise die Herstellung niedermolekularer Verbindungen, etwa von Nahrungsmittelergänzungsstoffen oder pharmazeutisch relevanten Verbindungen, oder von Proteinen, für welche aufgrund ihrer Diversität wiederum ein großes technisches Einsatzgebiet besteht. Im ersten Fall werden die Stoffwechseleigenschaften der betreffenden Mikroorganismen zur Herstellung der Wertstoffe ausgenutzt und/oder verändert; im zweiten Fall werden Zellen eingesetzt, die die Gene der interessierenden Proteine exprimieren. In beiden Fällen handelt es sich zumeist also um gentechnisch veränderte Organismen (GVO).
Zur Fermentation von Mikroorganismen besteht ein reichhaltiger Stand der Technik, insbesondere auch im großtechnischen Maßstab; er reicht von der Optimierung der betreffenden Stämme hinsichtlich der Bildungsrate und der Nährstoffausnutzung über die technische Gestaltung der Fermenter bis hin zur Gewinnnung der Wertstoffe aus den betreffenden Zellen selbst und/oder dem Fermentationsmedium. Hierfür kommen sowohl genetische und mikrobiologische als auch verfahrenstechnische und biochemische Ansätze zu tragen. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diesen Prozeß hinsichtlich der sicherheitsrelevanten Aspekte der eingesetzten Mikroorganismen zu verbessern, und zwar auf der Ebene der genetischen Eigenschaften der betrachteten Stämme.
Dies steht vor dem Hintergrund, daß die Verwendung gentechnisch veränderter Organismen im allgemeinen strengen gesetzlichen Richtlinien bezüglich der biologischen Sicherheit unterliegt. In den meisten Ländern sind die Betreiber von Anlagen mit GVO gehalten, dafür zu sorgen, daß nach Möglichkeit keine GVO in die Umgebung gelangen. Zusätzlich sollen für die Produktion verwendete GVO Eigenschaften aufweisen, die es ihnen - falls sie doch in die Umgebung gelangen sollten - erschweren oder je nach Gefahrenpotential sogar unmöglich machen sollen, sich dort zu vermehren („Containmenf-Konzept).
Dem Übersichtsartikel „Suicidal genetic elements and their use in biological Containment of bacteria" von S.Molin et al. (Annu. Rev. Microbiol., 1993, Band 47, Seiten 139 bis 166) zufolge wird dabei zwischen den beiden grundsätzlichen Strategien differenziert, als „aktive" Komponenten kontrollierte Suizidsysteme in die Zellen einzuführen oder über „passive" Systeme die Zelleigenschaften so zu verändern, daß ihre Überlebenschancen unter Streßbedingungen sinken. Die zweite, für die vorliegende Anmeldung relevante Strategie wird darin auch als „Disablement approach" bezeichnet.
Stämme von GVO mit einem verminderten Risiko für Mensch und Umwelt im Falle einer unbeabsichtigten Freisetzung werden als Sicherheitsstämme bezeichnet. Je nach den grundsätzlichen Eigenschaften der Mikroorganismen werden zunehmend mehrere Eigenschaften gefordert, von denen jede für sich einen Sicherheitsaspekt darstellt. Somit ist es vorteilhaft, verschiedene Instrumente zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen zur Verfügung zu haben. Hiervon sind einige „passive" Systeme bereits im Stand der Technik beschrieben.
So betrifft die Anmeldung EP 369817 A1 ßac///us-Stämme, insbesondere ß. subtilis, zur Herstellung und Sekretion von Proteinen, bei denen die Gene für extra- und intrazelluläre Proteasen, nämlich epr, rp-l, rp-ll, isp-1, apr und/oder npr durch Punktmutationen oder Insertionen inaktiver Genkopien funktioneil inaktiviert worden sind. Der Sinn dieser gentechnischen Veränderungen besteht darin, die für die mit diesen Stämmen hergestellten, interessierenden Proteine schädlichen Protease-Aktivitäten zu minimieren. Die betreffenden Stämme können zusätzlich über Mutationen verfügen, die die Sporulation und damit eine Bildung ebenso schädlicher Sporulationsproteasen verhindern. Hierunter wird das in Phase Null der Sporulation (siehe unten) von B. subtilis aktive Gen spoOA genannt, um durch dessen Inaktivierung die mit der Sporulation verbundene Bildung intrazellulärer Proteasen zu verhindern. Die Anmeldung WO 92/16642 A1 verfolgt den gleichen Lösungsansatz: sie offenbart, daß durch Inaktivierung der Proteasegene apr, npr, isp-1, epr, bpr, rsp und mpr von Bacillus ein Großteil der extrazellufären Protease-Aktivität ausgeschaltet wird, und lehrt, daß dies durch die Inaktivierung des neu beschriebenen Gens vpr für die Rest- Protease III noch verbessert werden kann. Auch hier wird auf die Möglichkeit der Inaktivierung von spoOA hingewiesen, um die Bildung intrazellulärer Proteasen zu verhindern.
Bei der Sporulation von grampositiven Bakterien handelt es sich um einen Entwicklungsprozeß zur Bildung von Dauerformen, den sogenannten Sporen, zum Überdauern widriger Umwelteinflüsse. Sie wird über eine komplexe Regulationskaskade mit vermutlich mehr als 100 Genen und unter Beteiligung von speziellen Sigma-Faktoren gesteuert. Den Zusammenhang dieses Prozesses mit dem Zelizyklus von ß. subtilis beschreibt beispielsweise die Publikation „Cell cycle and sporulation in Bacillus subtilis'' (1998) von PALevin und A.D.Grossmann in Curr. Opin. Microbiol, Band 1, Seiten 630 bis 635. Hier wird vor allem der Transkriptionsfaktor SpoOA als Kontrollelement zum Einleiten der Sporulation dargestellt. Die sequentielle Aktivierung der phasenspezifischen Gene durch verschiedene Sigmafaktoren faßt beispielsweise der Übersichtsartikel „Control of sigma factor activity during Bacillus subtilis sporulation" (1999) von L.Kroos et al. in Mol. Microbiol., Band 31., Seiten 1285 bis 1294 zusammen. Bei diesem Vorgang werden ihrer Reihenfolge nach die aufeinanderfolgenden Stadien Null und dann I bis VII beobachtet. Diese Numerierung findet sich auch in den Bezeichnungen der beteiligten Gene und Faktoren wieder.
Die Anmeldung EP 492274 A2 offenbart, daß im Stand der Technik bereits über unspezifische Mutagenese die Inaktivierung von Sporulationsgenen gelungen sei, wodurch asporogene Mutanten (spo-Minus-Phänotyp) erhalten worden seien. EP 492274 A2 selbst beschreibt einen durch gezielte Mutagenese in dem frühen Sporulationsgen spollD behandelten ß. su //s-Stamm, der mit einer Reversionsrate von weniger als 10"8 praktisch nicht mehr in der Lage ist, Sporen zu bilden. Diese Anmeldung lehrt, diesen Stamm erst nach Inaktivierung der weiteren Gene leu (für die Leucin- Synthese), pyrD1 (für die Uracil-Synthese), apr und npr für die Herstellung von Wertstoffen für die biotechnologische Produktion zu verwenden, weil hiermit Vorteile in der Produktion sowie Sicherheitsaspekte verbunden seien. Die Anmeldung WO 97/03185 A1 befaßt sich ebenfalls mit der Inaktivierung der Sporulationsfähigkeit von ßac///us-Spezies mit Ausnahme von ß. subtilis und Verwendung dieser Stämme zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen. Dieser Anmeldung zufolge soll das frühe, für den Sigmafaktor F codierende Gen spollAC funktionell inaktiviert werden, vorteilhafterweise in Kombination mit Deletionen in Genen der ebenfalls früh aktivierten Sporulationsgengruppen spo2, spo3. Hierfür wird eine irreversible Inaktivierung der betreffenden chromosomalen Abschnitte für spollAC beschrieben.
Die Anmeldung WO 02/097064 A1 (EP 1391502 A1) betrifft Mikroorganismen, bei denen Gene aus den Stadien II, III, IV oder V der Sporulation deletiert oder inaktiviert worden sind. Hierbei handelt es sich um die Gene sigE, sigF, spollE, spollSB und sigG von ß. subtilis, die innerhalb des Genorts von spolVCB bis spolllC von ß. subtilis liegen. Dieser kann anhand der Datenbank SubtiList (zugänglich über http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi) auf den Bereich der Positionen von ca. 2.642.000 kb bis ca. 2.700.000 kb des inzwischen bekannten Gesamtgenoms von B. subtilis eingegrenzt werden. Dieser Anmeldung hatte die Aufgabe zugrundegelegen, überflüssige oder schädliche Aktivitäten von ßac///us-Stämmen auszuschalten, um die biotechnologische Produktion zu verbessern. Durch die genannten Modifikationen der mittleren bis späten Sporulationsgene würde bei Einsatz der betreffenden Stämme für die biotechnologische Produktion die Sporenbildung unterdrückt; dies wirke sich vorteilhaft auf die Nährstoff- und Energieverwertung aus; gleichzeitig könne die Dauer der Fermentation erhöht werden, um darüber die Gesamtausbeute an interessierendem Wertstoff zu erhöhen.
Der Übergang grampositiver Bakterien in die Dauerform der Spore wird also durch ungünstige Umweltbedingungen ausgelöst. Genau dies dürfte auch dann geschehen, wenn Bakterien aus den optimalen Wachstumsbedingungen der Fermentation unbeabsichtigt aus der Anlage austreten und in die Umgebung gelangen sollten. Demgegenüber ist, wie soeben dargelegt, über die Unterbindung der Fähigkeit zur Sporulation zur Erzeugung sicherer GVO bislang erst wenig nachgedacht worden. Der einschlägige Stand der Technik scheint lediglich nahezulegen, daß die Sporulation grampositiver Bakterien (a) wegen der damit verbundenen Proteaseaktivitäten und/oder (b) zur Verlängerung der Fermentationsdauer frühzeitig und vollständig unterbunden werden sollte, um letztlich die Fermentationsausbeute der so erhaltenen asporogenen Stämme zu steigern. Zur Verfolgung von Sicherheitsaspekten werden dagegen nur mehrere, zusätzlich einzuführende Mutationen offenbart.
Das für den in Prokaryonten beschriebenen Faktor RecA codierende Gen recA ist in der Molekularbiologie sehr bekannt, bislang insbesondere jedoch aus einem anderen Zusammenhang als dem der Herstellung von Sicherheitsstämmen. Dieser Faktor bindet spezifisch und kooperativ an einzelsträngige DNA und sorgt unter ATP-Hydrolyse für eine teilweise Entwindung doppelsträngiger DNA. Dieser Vorgang ermöglicht den genetischen Vorgang der Rekombination, das heißt den Strangaustausch zwischen ähnlichen DNA-Molekülen. So ist es in der Molekularbiologie ein übliches Vorgehen, das recA-Gen, dadurch zu verwenden, daß es über ein entsprechendes genetisches Konstrukt mit einer defekten recA-Kopie inaktiviert und somit ein rec/\-Minus-Phänotyp erzeugt wird, welcher nicht mehr zur Rekombination in der Lage ist. Beispielsweise nach dem Patent US 4713337 werden durch Crossing-over erzeugte Deletionsmutanten durch anschließende Inaktivierung von recA genetisch stabilisiert.
So tauchen Hinweise auf recA in den verschiedensten molekularbiologischen Zusammenhängen auf. Beispielsweise DE 10011358 A1, welche sich mit L-förmigen Bakterienstämmen befaßt, erwähnt zusätzlich, neben zahlreichen anderen möglichen Modifizierungen sei es unter anderem möglich, auch recA zu mutieren, um eine verbesserte Transformation und Plasmidstabilität zu erreichen.
Eine biochemische Beschreibung des RecA aus Escherichia coli liefert beispielsweise die Publikation „C-terminal deletions of the Escherichia coli RecA" von S.L.Lusetti et al. (2003; J. Biol. Chem., Band 278, Heft 18, Seiten 16372-16380). Daraus geht hervor, daß insbesondere der C-Terminus dieses Moleküls die Einzelstrangbindung vermittelt und entsprechende Deletionsmutanten in diesem Bereich neben anderen biochemischen Eigenschaften eine erhöhte Mitomycin-Sensitivität aufweisen. Mitomycin ist dafür bekannt, daß es die DNA-Synthese beeinträchtigt und dadurch bakterizid wirkt. Der N- terminale Bereich ist dagegen stärker an der Bindung von DNA-Doppelsträngen beteiligt.
Der bereits zitierte Übersichtsartikel von S. Molin et al. verweist ebenfalls auf Arbeiten, bei denen eine rec/4-Minus-Mutation als Markergen für den gramnegativen Escherichia coli verwendet wird. Es wird die Vermutung geäußert, diese Mutation allein könne schon ausreichen, um jegliches Umweltrisiko durch diesen Stamm auszuschließen. Anderer- seits werden zwei Nachteile dieses Ansatzes diskutiert, nämlich zum einen sei es technisch schwierig, diese Mutanten herzustellen und zum anderen würden die betreffenden Stämme auch in ihrem erwünschten Einsatz („short-term competitive properties") derart behindert sein, daß man andere die Lebensfähigkeit beschränkende und im betreffenden Artikel erwähnte Mutationen vorziehen würde. Auch in Kombination mit dem grundsätzlich anderen Ansatz zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen, nämlich dem Einführen von Suizidsystemen, habe sich die Inaktivierung von RecA als nachteilhaft herausgestellt.
Die Publikation „Freisetzung gentechnisch veränderter Bakterien" von Selbitschka et al. (2003; Biologie in unserer Zeit, Band 33, Heft 3, Seiten 162-175) beschreibt die Freisetzung von gramnegativen, mit einem Luciferase-Gen modifizierten Bakterien der Spezies Sinorhizobium meliloti in einem mehrjährigen Freilandversuch. Sie trugen zusätzlich eine Inaktivierung des recA-Gens, welche dazu geführt hat, daß Zellen dieser Klone unter natürlichen Bedingungen letztlich nicht überleben konnten.
K.-D. Wittchen hat im Zuge seiner bei der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster eingereichten Dissertation (1995) mit dem Titel „Entwicklung eines Sicherheitsstammes von Bacillus megaterium DSM 319 und molekulargenetische Charakterisierung des Gens für die extrazelluläre neutrale Metalloprotease (nprM)" einen Stamm des grampositiven B. megaterium erzeugt, der nach gezielter Gendisruption Deletionen in der im Titel genannten neutralen Metalloprotease, der der Isopropylmalat- Dehydrogenase, und eines nicht näher bezeichneten SpolV-Proteins enthält. Anschließend wurde an diesem Stamm eine recA-Mutation vorgenommen, welche in bezug auf die UV-Sensitivität des Stammes im Vergleich zum Wildtyp allerdings keine wesentlichen Unterschiede verursachte, wohl aber bei Wachstum auf Mitomycin C- haltigen Agarplatten. Diese Vierfachmutante wurde als Sicherheitsstamm vorgeschlagen, ohne jedoch dessen Realisierbarkeit oder sogar die konkreten Auswirkungen dieser Modifikationen auf einen Produktionsprozeß mit entsprechend modifizierten Bakterienstämmen zu untersuchen.
Die in derselben Arbeitsgruppe angefertigte Diplomarbeit von H. Nahrstedt (2000) mit dem Titel „Molekulargenetische Charakterisierung des recA-Gens von Bacillus megaterium DSM 319 und Konstruktion einer Deletionsmutante" schlägt folgende, nebeneinander vorliegende vier Mutationen in zum Teil Gruppen von Genen vor: recA- Minus, Protease-Minus, Leucin-Auxotrophie und Sporulations-Defizienz. Es wird diskutiert, eine recA-Defizienz als eine Sicherheitsmarke neben anderen in Produktionsstämme einzuführen, weil sich dadurch zum einen unerwünschte Rekombinationsprozesse unterdrücken ließen und zum anderen die betreffenden Mutanten eine erhöhte Sensitivität gegenüber DNA-schädigenden Agenzien aufweisen, das heißt in der Umwelt eine geringere Überlebenschance besitzen sollten. Auch dieser Vorschlag wurde nicht weiterverfolgt.
Den Stand der Technik zu RecA kann man dahingehend zusammenfassen, daß dieses Protein bisher überwiegend aus genetischen Zusammenhängen bekannt ist. Der Einsatz dieses Faktors beziehungsweise die Inaktivierung des betreffenden Gens zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen von GVO wird aufgrund seiner physiologischen Bedeutung bislang eher abgelehnt. Erfolgreiche beschreibene Beispiele hierfür sind lediglich recA- Minus-Mutanten der gramnegativen Spezies Sinorhizobium meliloti und des grampositiven Bacillus megaterium, letztere jeweils nur in Kombination mit drei weiteren sicherheitsrelevanten Mutationen.
Insgesamt bleibt festzuhalten, daß zur Herstellung von Sicherheitsstämmen für die biotechnologische Produktion verschiedene alternative genetische Systeme nach einem „passiven" Wirkmechanismus etabliert sind, wie die Inaktivierung von Proteasegenen, die Ausschaltung von verschiedenen Stoffwechselgenen zur Erzeugung von Aminosäure- oder Nukleobasenauxotrophien. Bei sporenbildenden grampositiven Bakterien ist die Unterbindung der Sporulation beschrieben, insbesondere zu einem frühen Zeitpunkt, vor allem aber um zusätzliche Vorteile in der Fermentation zu erzielen. Dabei wird es als vorteilhaft angesehen, über mehrere, unterschiedlich wirkende Systeme zu verfügen, um sie nebeneinander auf einen bestimmten Stamm anzuenden, damit dieser als besonders sicher eingestuft werden kann.
Es stellte sich somit die Aufgabe, ein weiteres geeignetes Sicherheitssystem für gentechnisch veränderte grampositive Bakterien zu entwickeln, wofür als Grundlage zunächst ein geeigneter Faktor und/oder ein geeignetes Gen zu identifizieren waren.
Einen Teilaspekt dieser Aufgabe stellte nach Feststellung der grundsätzlichen Eignung eines solchen Systems die Isolierung eines hierfür verwendbaren genetischen Elements, eventuell eines Gens, und der Aminosäuresequenz eines hiervon gegebenenfalls codierten Faktors dar, um dieses System entsprechenden molekularbiologischen Konstruktionen für den Einsatz in Produktionsstämmen zugänglich zu machen, insbesondere in Kombination mit einem oder mehreren weiteren der Sicherheit dienenden Regulationsmechanismen.
Ein weiterer Teilaspekt der Aufgabe bestand darin, daß dieses System mit anderen Sicherheitssystemen kombinierbar sein sollte.
Somit lag eine Teilaufgabe darin, ein weiteres derartiges, hiermit zu kombinierendes Sicherheitssystem zu definieren, vorzugsweise eines, das neben diesen beiden Systemen keine weiteren Mutationen erforderlich machen würde. Mit anderen Worten: maximal diese zwei Mutationen sollten ausreichen, um einen grampositiven Sicherheitsstamm zu erzeugen, der weitgehende Anforderungen an die Verminderung der Lebensfähigkeit in der Umwelt erfüllen, das heißt zu einer minimalen Reversionsrate führen sollte. Denn eine niedrigere Zahl als vier nebeneinander wirksame Systeme bedeutet einen zunehmend geringeren Arbeitsaufwand zur Herstellung dieser Stämme.
Ein Nebenaspekt dieser Aufgabe bestand darin, ein derartiges Sicherheitssystem zu finden, das nicht so speziell ist, daß es nicht auch in anderen molekularbiologischen Ansätzen Verwendung finden könnte.
Diese Aufgabe wird durch den Faktor RecA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96% identisch ist, beziehungsweise durch die für einen Faktor RecA codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist, gelöst.
Die in SEQ ID NO. 2 und 1 angegebenen Aminosäure- und Nukleotidsequenzen sind die für RecA. Dabei codieren alle Positionen von 1 bis 1047 für das Protein; die letzten drei stellen dabei das Stop-Codon dar. Sie werden als Gen und Protein recA beziehungsweise RecA bezeichnet. Sie stammen aus dem bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) unter der Nummer DSM 13 hinterlegten Stamm Bacillus Hcheniformis. Erfindungsgemäße Lösungen der Aufgabe stellen alle Faktoren beziehungsweise Nukleinsäuren dar, die hierzu eine hinreichend Homologie aufweisen, wie sie mit den jeweiligen Prozentangaben definiert ist.
Als nächster Stand der Technik kann der entsprechende Faktor aus ß. amyloliquefaciens angesehen werden. Die zugehörigen vollständigen DNA- und Aminosäuresequenzen sind in der Datenbank NCBI der National Institutes of Health der USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) unter der Zugangsnummer AJ515542 veröffentlicht, wobei eine nahe dem C-Terminus gelegene Teilsequenz zusätzlich aus dem Eintrag AY147924 hervorgeht. RecA aus ß. Hcheniformis DSM 13 weist zum vollständigen Faktor auf Aminosäureebene eine Homologie von 94,0% Identität und auf Nukleinsäureebene eine Übereinstimmung von 81 ,2% Identität auf. Beide Vergleiche gehen aus den Alignments der Figuren 1 und 2 hervor, wo die Sequenzen von ß. amyloliquefaciens jeweils in der zweiten Zeile dargestellt sind.
Als nächstähnliche Enzyme wurden RecA aus ß. subtilis und RecE aus ß. subtilis mit jeweils 93,4% Identität ermittelt. Sie weisen auf DNA-Ebene Homologiewerte von 81 ,0% beziehungsweise 81 ,2% Identität auf. Sie sind ebenfalls in der NCBI-Datenbank, und zwar unter den Eintragungsnummern Z99112 (Region 161035 bis 162078) beziehungsweise X52132 veröffentlicht. Die Aminosäure- und DNA- Vergleiche mit diesen Faktoren sind ebenfalls in den Figuren 1 und 2 (jeweils Zeilen 3 beziehungsweise 4) dargestellt.
Wie weitere Faktoren RecA geeigneterweise erhalten werden können, die innerhalb des hier bezeichneten Homologiebereichs liegen, wird durch Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung illustriert. Dort ist ein molekularbiologisches Vorgehen gezeigt, wonach mithilfe bestimmter PCR-Primer, insbesondere den dort konkret offenbarten (SEQ ID NO. 25 bis 30) Oligonukleotiden, betreffende Gene beziehungsweise Genabschnitte aus chromosomalen DNA-Präparationen der betreffenden Spezies gewonnen werden können. Gegebenenfalls können, sofern diese Primer nicht erfolgreich eingesetzt werden können, ähnliche Primer eingesetzt werden, bei denen - gesteuert über die Reaktionsbedingungen bei der Primer-Synthese - einzelne Positionen variiert werden. Diese PCR-Produkte lassen sich - falls bei Einsatz entsprechender Primer (vergleiche Figur 3B) nur Teilsequenzen erhalten worden sind - nach üblichen Methoden (Ausnutzung von Überlappungen) zu zusammenhängenden DNA-Sequenzen zusammensetzen. Hieraus ergibt sich unmittelbar die Aminosäuresequenz des von dem erhaltenen Gens recA codierten Faktors RecA. Alternativ hierzu können auch die in SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 31 offenbarten Sequenzen als Sonden verwendet werden, um nach an sich bekannten Methoden relevante Gene aus Genbanken zu isolieren.
Die hohen, beanspruchten Homologiewerte um den konkret hier beschriebenen Faktor lassen erwarten, daß derselbe Faktor RecA besonders in verwandten Stämmen oder Spezies, wahrscheinlich aber auch in weniger verwandten Spezies, wahrscheinlich sogar gramnegativen Organismen die zugehörige Funktion übernimmt. Diese liegt erfindungsgemäß in der eingangs erläuterten DNA-Einzelstrangbindung und der damit verbundenen Rolle für Rekombinationsvorgänge von Nukleinsäuren. Vergleichbare Wirkungen sollten auch mit Deletionen des recAGens verbunden sein, nämlich die Unterbindung von DNA-Rekombinationen und eine dadurch verminderte Lebensfähigkeit. Gleichzeitig sollte ein recA-Gen aus dem einen Stamm geeignet sein, diese Funktion in einem anderen zu übernehmen; dies wird mit zunehmender Ähnlichkeit zunehmend besser gelingen. Hierdurch wird der Einsatz des betreffenden Gens für die Herstellung von Deletionsmutanten der verschiedensten grampositiven Mikroorganismen möglich.
Dadurch wird für RecA und vor allem für das zugehörige Gen recA ein weites technologisches und kommerziell relevantes Gebiet eröffnet, nämlich die Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von genetisch veränderten grampositiven Bakterien. Sie können über Mutationen in recA nicht nur hinsichtlich ihrer genetischen Stabilität sondern auch ihrer Sicherheit verbessert werden. Dies gilt, wie unten weiter ausgeführt, insbesondere für Stämme, die in der biotechnologischen Produktion tatsächlich eingesetzt werden, wie beispielsweise Bacillus Hcheniformis.
Wie unten ebenfalls detaillierter ausgeführt geschieht dies vorzugsweise im Zusammenhang mit einer und besonders bevorzugt keinen weiteren sicherheitsrelevanten Deletionen. Ebenso bevorzugt geschieht dies in möglichst nahe verwandten Stämmen. Hierbei ist jedoch von B. megaterium abzusehen, zum einen weil hierfür, wie einleitend beschrieben, bereits die Spezies-eigenen recA-Gene beziehungsweise die hierin deletierten Mutanten zur Verfügung stehen und zum anderen weil diese Spezies, die sich insbesondere durch ihre großen Zellen und damit verbundene mikrobiologische Eigenheiten auszeichnet, im allgemeinen nicht für die großtechnische Fermentation genutzt wird. Gegenstände der vorliegenden Erfindung liegen somit in dem Faktor RecA (SEQ ID NO. 2) und dem zugehörigen Gen recA (SEQ ID NO. 1) aus ß. Hcheniformis DSM 13 beziehungsweise nahen Verwandten hierzu. Ebenso stellt die Verwendung eines solchen recAGens und/oder eines, das zu SEQ ID NO. 31 hinreichend verwandt ist, zur funktionellen Inaktivierung von recA in einem grampositiven Bakterium einen Erfindungsgegenstand dar, vorzugsweise in Kombination mit der funktioneilen Inaktivierung eines in der Phase IV der Sporulation grampositiver Mikroorganismen aktiven Gens, vorzugsweise spolV, yqfD beziehungsweise Homologen hierzu. Dies geschieht vorteilhafterweise mithilfe der in der vorliegenden Anmeldung zusätzlich beschriebenen Gene spolV und yqfD. Einen entsprechenden Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellen die hierdurch erhaltenen grampositiven Mikroorganismen dar; ebenso die mit diesen Organismen durchgeführten Fermentationen, insbesondere zur Herstellung von Wertstoffen. Des weiteren steht mit der vorliegenden Anmeldung ein RecA-Protein zur Verfügung, das in molekularbiologischen Ansätzen oder zur Modulation der molekularbiologischen Aktivitäten von Zellen verwendet werden kann, insbesondere im Zusammenhang mit DNA-Polymerisations- oder Rekombinationsvorgängen.
Zum ersten Erfindungsgegenstand gehört jeder oben definierte Faktor RecA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
Denn wie erläutert ist mit zunehmender Ähnlichkeit eine zunehmende Übereinstimmung der Funktionen und damit eine Austauschbarkeit der Faktoren zu erwarten.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen Faktor RecA, der von einer Nukleinsäure codiert ist, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.
In bevorzugten Ausführungsformen sind das Faktoren, die von einer Nukleinsäure codiert sind, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. Denn über die Nukleinsäuren stehen die betreffenden Faktoren beziehungsweise Gene für die Transformation in andere, vorzugsweise verwandte Spezies oder für Modifikationen zur Verfügung. Hierzu gehören, wie unten detaillierter erläutert, insbesondere Mutationen der betreffenden Gene. Mit einem zunehmenden Maß an Identität zur angegebenen Sequenz sollte der Erfolg bei solchen Spezies umso größer sein, die zu ß. Hcheniformis zunehmend verwandt sind, insbesondere bei der für die biotechnologische Produktion besonders wichtigen Spezies ß. Hcheniformis selbst.
Die Gewinnung derartiger Nukleinsäuren geht wie oben erläutert aus Beispiel 1 hervor; auch auf die Isolierung aus Genbanken wurde bereits verwiesen.
Wie erläutert dienen der Verwirklichung der vorliegenden Erfindung vor allem die für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäuren, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.
Dies gilt um so mehr für derartige Nukleinsäuren, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. Denn diese können über entsprechende Konstruktionen zur Transformation und/oder zur Mutagenese verwendet werden, wobei eine zunehmende Ähnlichkeit den erwünschten Erfolg umso wahrscheinlicher werden läßt.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich dabei um eine derartige Nukleinsäure, die für einen zuvor beschriebenen Faktor RecA codiert. Dies gilt beispielsweise für Strategien, bei denen ein funktioneller Faktor RecA hergestellt werden soll, etwa für die unten ausgeführten molekularbiologischen Versuchsansätze, oder für die Erzielung einer maximalen Übereinstimmung mit dem jeweils endogenen tatsächlich für RecA codierenden Gen, welches modifiziert und/oder ausgeschaltet werden soll. Denn in vielen Fällen reicht eine Mutation in einer einzigen Position, um etwa über eine nonsense-Mutation das Gen beziehungsweise den Faktor in seiner natürlichen Funktion auszuschalten.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung einer für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure zur funktionellen Inaktivierung des Gens recA in einem grampositiven Bakterium dar, welches nicht Bacillus megaterium ist. Denn zum einen gibt es für B. megaterium bereits die einleitend erwähnten Studien, in denen vorgeschlagen wird, gleichzeitig mit mehreren anderen Mutationen auch recA zu deletieren, um zu Sicherheitsstämmen zu gelangen. Zum zweiten stellen andere grampositive Bakterien wie beispielsweise solche der Gattungen Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium und Clostridium im Stand der Technik wichtigere Wirtsorganismen für die biotechnologische Produktion von Wertstoffen (siehe unten) dar.
Unter der funktionellen Inaktivierung ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung jede Art von Modifikation oder Mutation zu verstehen, wonach die Funktion eines RecA als Einzelstrang-DNA-bindenden Faktors unterbunden wird. Dazu gehört die Ausführungsform, daß ein praktisch vollständiges, aber inaktives Protein gebildet wird, daß inaktive Teile eines RecA in der Zelle vorliegen, bis hin zu den Möglichkeiten, daß das Gen recA nicht mehr translatiert wird oder sogar vollständig deletiert ist. Somit besteht die eingangs diskutierte „Verwendung" dieses Faktors oder dieses Gens dieser Ausführungsform nach darin, daß er beziehungsweise es von der betreffenden Zelle eben nicht mehr auf seine natürliche Weise zur Wirkung kommt. Dies wird diesem Erfindungsgegenstand zufolge auf genetischer Ebene dadurch erreicht, daß das betreffende Gen ausgeschaltet wird. Eine Möglichkeit, wie dies technisch erreicht werden kann, beschreibt Beispiel 2 der vorliegenden Anmeldung.
Nach einer Ausführungsform dieser Verwendung wird eine für ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt.
Derartige Nukleinsäuren können über an sich bekannte Verfahren zur Punktmutagenese erzeugt werden. Solche sind beispielsweise in einschlägigen Handbüchern wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis, „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, dargestellt. Zudem stehen hierfür inzwischen zahlreiche kommerzielle Baukästen zur Verfügung, etwa das QuickChange®- Kit der Firma Stratagene, La Jolla, USA. Das Prinzip besteht darin, daß Oligonukleotide mit einzelnen Austauschen (Mismatch-Primer) synthetisiert und mit dem einzelsträngig vorgelegten Gen hybridisiert werden; anschließende DNA-Polymerisation ergibt dann entsprechende Punktmutanten. Hierfür können die jeweiligen Spezies-eigenen recA Sequenzen verwendet werden. Aufgrund der hohen Homologien ist es möglich und erfindungsgemäß besonders vorteilhaft, diese Reaktion anhand der mit SEQ ID NO. 1 zur Verfügung gestellten Sequenz oder etwa den anderen aus Figur 2 hervorgehenden Sequenzen verwandter Spezies durchzuführen. Diese Sequenzen können auch dazu dienen, entsprechende Mismatch-Primer für verwandte Spezies zu entwerfen, insbesondere anhand der im Alignment der Figur 2 identifizierbaren konservierten Bereiche.
Nach einer Ausführungsform dieser Verwendung wird eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs.
Auch diese Verfahren sind dem Fachmann an sich vertraut. Somit ist es möglich, die Bildung eines Faktors RecA durch die Wirtszelle dadurch zu verhindern, daß ein Teil des Gens auf einem entsprechenden Transformationsvektor über Restriktionsendonukleasen herausgeschnitten und der Vektor anschließend in den interessierenden Wirt transformiert wird, wo über die - bis dahin noch mögliche - homologe Rekombination das aktive Gen gegen die inaktive Kopie ausgetauscht wird. In der Ausführungsform der Insertionsmutation kann lediglich das intakte Gen unterbrechend oder anstelle eines recAGenteils ein anderes Gen, beispielsweise ein Selektionsmarker eingefügt werden. Hierüber ist das Mutationsereignis in an sich bekannter Weise genetisch und phänotypisch überprüfbar.
Solch ein Ansatz wurde in Beispiel 2 gewählt: Wie dort erläutert ist, wurden aus SEQ ID NO. 31 zwei flankierende Bereiche von jeweils ca. 340 bp ausgenutzt, um den dazwischenliegenden Teil des Gens recA eines ß. licheniformis-Stam s zu deletieren (vergleiche Figur 3B). Im nachfolgenden Beispiel 3 wird der Erfolg dieser Deletion auf genetischer Ebene überprüft. So belegt Figur 4 (A und B), daß das betreffende DNA- Fragment durch die Deletion entsprechend verkürzt worden ist. Die phänotypische Beschreibung der dadurch erhaltenen Mutanten erfolgt in den nachfolgenden Beispielen. Demnach sind recAinaktivierte Stämme deutlich UV-sensitiver als solche mit einem intakten recAGen (Beispiel 6).
Um diese jeweils notwendigen Rekombinationsereignisse zwischen dem in die Zelle eingeführten defekten Gen und der beispielsweise auf dem Chromosom endogen vorhandenen intakten Genkopie zu ermöglichen, ist nach dem derzeitigen Wissensstand eine Übereinstimmung in jeweils mindestens 70 bis 150 zusammenhängenden Nukleinsäurepositionen, jeweils in den beiden Randsequenzen zu dem nichtübereinstimmenden Teil nötig, wobei es auf den dazwischenliegenden Teil nicht ankommt. Dementsprechend sind solche Ausführungsformen bevorzugt, die lediglich zwei flankierende Regionen mit mindestens diesen Größen umfassen.
Nach einer alternativen Ausführungsform dieser Verwendung werden Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten eingesetzt, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassen und damit den für das Protein codierenden Bereich zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig flankieren.
Denn allein um den Austausch der beiden Genkopien über homologe Rekombination zu ermöglichen, braucht es sich dabei nicht zwangsläufig um proteincodierende Abschnitte zu handeln. Vielmehr eignen sich hierfür auch die Randbereiche der betreffenden Gene, welche natürlicherweise eine andere Funktion (Promotor, Terminator, Enhancer etc.) ausüben oder lediglich nichtfunktionelle intergenische Abschnitte darstellen. So kann die funktioneile Inaktivierung beispielsweise auch in der Deletion des Promotors bestehen, wofür es bei einer Deletionsmutation dieser Ausführungsform notwendig ist, auf flankierende, nichtcodierende Abschnitte zurückzugreifen. Je nach Einzelfall kann es auch sinnvoll sein, für die flankierenden Regionen solche Abschnitte auszuwählen, die zum Teil in den proteincodierenden Bereich hineinreichen und zum Teil außerhalb liegen.
Derartige, wenigstens zum Teil nichtcodierende Bereiche können für ß. Hcheniformis beispielsweise SEQ ID NO. 31 entnommen werden. Die für die Gene recA aus ß. amyloliquefaciens und für recA und recE aus ß. subtilis sind beispielsweise den oben angegebenen Datenbankeinträgen zu entnehmen. Für andere Stämme, beispielsweise auch für recA aus ß. Hcheniformis ist es möglich, die betreffenden nichtcodierenden Bereiche über PCR-basierte Verfahren aus einer Präparation der genomischen DNA zu erschließen; wie dies in Beispiel 1 veranschaulicht ist. Diese Verfahren (beispielsweise anchored PCR mit nach außen, in einen unbekannten Bereich weisenden Primern) sind im Stand der Technik etabliert. Als Ausgangspunkte hierfür dienen die bekannten Genabschnitte, die dazu dienen, um die noch unbekannten Regionen zu erschließen. Sobald diese nach Amplifizierung sequenziert worden sind, können sie ihrerseits zur Synthese weiterer Primer dienen, und so fort. Der vorliegenden Erfindung zufolge können die hierfür benötigten Primer anhand der SEQ ID NO. 1 und 31 auch für andere Spezies grampositiver Bakterien und hierunter insbesondere für solche der Gattung Bacillus entworfen werden, gegebenenfalls unter unter Einführung variabler Positionen, wie dies oben bereits erläutert worden ist.
Bei einer entsprechenden Verwendung handelt es sich demzufolge um eine der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder um eine Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 31 angegebenen Nukleotidsequenz in den Positionen 369 bis 1415 zu mindestens 1045, vorzugsweise mindestens 1046, ganz besonders bevorzugt 1047 dieser 1047 Positionen übereinstimmt, beziehungsweise um die zumindest teilweise nichtcodierenden flankierenden Bereiche zu diesen Nukleinsäuren.
So zeigt beispielsweise ein Vergleich der beiden Nukleinsäuresequenzen von SEQ ID NO. 1 und 31 , daß diese sich innerhalb des für das Protein codierenden Bereichs (Positionen 369 bis 1415 gemäß SEQ ID NO. 31) in drei Positionen unterscheiden. Dies sind die Positionen 282, 283 und 284 gemäß SEQ ID NO. 1 (CAC) beziehungsweise 650, 651 und 652 gemäß SEQ ID NO. 31 (ACA). Beide Seqenzen fallen unter den oben als erfindungsgemaß bezeichneten Homologiebereich und kenzeichnen bevorzugte Ausführungsformen des hier dargestellten Erfindungsaspekts: SEQ ID NO. 1 stützt sich dabei auf den kommerziell erhältlichen Stamm DSM 13; SEQ ID NO. 31 wurde durch Nacharbeiten der Erfindung anhand eines prinzipiell beliebigen ß. Hcheniformis-Stamms erhalten (Beispiel 1). Da sie in 1044 Positionen übereinstimmen, läßt sich die in den Beispielen als erfolgreich beschriebene Ausführungsform über eine zunehmende Bevorzugung von 1045, 1046 und ganz besonders 1047 übereinstimmenden Positionen zu SEQ ID NO. 31 beschreiben.
Die verschiedenen hierunter fallenden Ausführungsformen sind entsprechend den bisherigen Darstellungen bevorzugt.
In bevorzugten Ausführungsformen dieser Verwendungen handelt es sich bei dem grampositiven Bakterium vorzugsweise um eines der Gattungen Clostridium oder Bacillus und um eines, das natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist, bei dem gleichzeitig mit recA ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktioneil inaktiviert wird.
Denn viele grampositiven Bakterien sind wie einleitend beschrieben in der Lage, unter entsprechend ungünstigen Umweltbedingungen den Vorgang der Sporulation einzuleiten. Dies kann erfindungsgemäß insofern für Sicherheitsaspekte ausgenutzt werden, als in Kombination mit der oben dargestellten funktionellen Inaktivierung von recA ein Sporulationsgen aus der vergleichsweise späten Phase IV der Sporulation ebenfalls funktioneil inaktiviert wird. Damit stehen der formulierten Aufgabe entsprechend zwei gleichzeitig und erfindungsgemäß miteinander kombinierbare Systeme für die Herstellung sicherer GVO zur Verfügung. Die Kombination beider Systeme war bislang noch nicht bekannt, insbesondere nicht zu diesem Zweck.
Besonders erfolgreich konnte die Inaktivierung von Sporulationsgenen an Spezies der Gattungen Clostridium und Bacillus realisiert werden, weshalb die hierdurch gekennzeichneten Ausführungsformen entsprechend bevorzugt sind. So folgen die in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung dargestellten Versuche für spolV von B. Hcheniformis konzeptionell demselben molekularbiologischen Vorgehen, wie oben für recA beschrieben ist. So konnten gemäß Beispiel 1 die in SEQ ID NO. 19 bis 24 gezeigten Primer erfolgreich zur Gewinnung eines spo/V-Gens aus einem ß. Hcheniformis-Stamm genutzt werden (vergleiche Figur 3A). Beispiel 2 zeigt das Vorgehen zur funktionellen Inaktivierung und Beispiel 3 dessen Erfolg (Figur 4). Die erhofften phänotypischen Sporulationsdefekte sind durch Beispiel 4 und Figur 5 belegt.
Insbesondere ist es überraschend, daß die Verhinderung der Sporulation erst in einem so späten Stadium für diesen Zweck erfolgreich ist. Zwar werden in spo/V-Mutanten von ß. Hcheniformis unter entsprechenden Bedingungen noch Sporen (die sogenannten „Phase-Grau-Sporen") gebildet, doch sind diese steril und nicht mehr in der Lage auszukeimen. Insofern trägt diese Mutation dem Sicherheitsaspekt Rechnung. Bisher war eine Unterbindung der Sporulation eher zu einem früheren Zeitpunkt favorisiert worden. Die Inaktivierung in Phase IV sorgt zusätzlich jedoch dafür, daß die in den früheren Sporulations-Phasen aktiven Faktoren auch weiterhin in den Mutanten gebildet werden. Ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, kann man vermuten, daß zumindest einige dieser Faktoren von den Zellen auch für die normalen während der Fermentation ablaufenden Stoffwechselvorgänge benötigt werden. Bei dem Ausschalten zu einem frühreren Zeitpunkt stünden sie nicht mehr zur Verfügung. Umgekehrt besteht die vorteilhafte Wirkung der Inaktivierung der Sporulation in Phase IV darin, daß der hierdurch stattfindende Eingriff in die Physiologie der Zellen nicht so gravierend ist und die Fermentation an sich weniger beeinträchtigt wird als bei einem früheren Ausschalten dieser Gene. Den Erfolg dieses Konzepts zeigt die gemäß Beispiel 5 ermittelte und in Figur 6 dargestellte Wachstumskurve.
Bevorzugt ist eine derartige Verwendung, bei der es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von ß. subtilis um eines der Gene spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von ß. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus Hcheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
All diese Gene sind an sich bekannt und für diese Phase der Sporulation beschrieben. Das ß. subtilis-Ger spolVA codiert für das Phase-IV-Sporulationsprotein A, das in den Datenbanken Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) und NCBI (siehe oben) unter der Nummer P35149 hinterlegt ist. Es spielt für die Bildung einer intakten Sporenhülle und deren Zusammenbau eine Rolle. Die Aminosäuresequenz des zugehörigen Faktors SpolVA wird in SEQ ID NO. 8 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentin erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist des Institute Pasteur, Paris, Frankreich (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList genome.cgi) unter der Nummer BG10275 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 7 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukleotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 7 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1876 erfindungsgemäß als Gen spolVA bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 1679; das erste Codon, das heißt die Positionen 201 bis 203 werden in vivo nicht als Leucin sondern als Methionin translatiert.
Das ß. subtilis-Gen spolVB codiert für das Phase-IV-Sporulationsprotein B, das in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P17896 hinterlegt ist. Es ist für den Sigma-Faktor-K-abhängigen Übergangspunkt während der Sporulation beziehungsweise dessen Aktivierung in der Mutterzelle von Bedeutung. Es spielt für die inter- kompartimentelle Signalübertragung eine Rolle, wahrscheinlich über den hydrophoben N-Terminus. Die Aminosäuresequenz des Faktors SpolVB wird in SEQ ID NO. 10 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentin erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG10311 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 9 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukieotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 9 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1675 erfindungsgemäß als Gen spolVB bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 1478.
Das ß. subtilis-Gen spolVCA codiert für eine putative ortsspezifische DNA- Rekombinase, die in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P17867 hinterlegt ist. Sie spielt wahrscheinlich eine Rolle, um die Gene spolllC und spolVCB zu rekombinieren, woraus der Sigmafaktor K hervorgeht. Die Aminosäuresequenz dieser Rekombinase wird in SEQ ID NO. 12 der voriiegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentin erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA- Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG10458 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 11 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5' -Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukieotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 11 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1900 erfindungsgemäß als Gen spolVCA bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 1703; das erste Codon, das heißt die Positionen 201 bis 203 werden in vivo nicht als Valin sondern als Methionin translatiert.
Das ß. subtilis-Gen spolVCB codiert für den RNA-Polymerase-Sigmafaktor-K-Precursor, der in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P12254 hinterlegt ist. Der Rest dieses Faktors wird von dem Gen spolllC codiert, welches auf dem Chromosom ca. 10 kb entfernt ist, wobei der dazwischenliegende Bereich als SKIN bezeichnet wird. Durch Excision dieses Fragments in der unmittelbar vorangehenden Sporulationsphase wird der aktive Sigma-Faktor K erhalten, welcher seinerseits als Transkriptionsfaktor wirkt. Die Aminosäuresequenz des Teilfaktors SpolVCB wird in SEQ ID NO. 14 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentin erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG 10459 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 13 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukieotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 13 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 868 erfindungsgemäß als Gen spolVCB bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 671.
Das ß. subtilis-Gen spoIVFA codiert für das Phase IV-Sporulationsprotein FA. Dieser Faktor, der vermutlich in der Lage ist, mit SpoIVFB (siehe unten) ein Heterodimer zu bilden, erfüllt wahrscheinlich die Aufgabe, diesen Faktor zu stabilisieren aber dadurch gleichzeitig auch zu inhibieren. Deshalb wird SpoIVFA auch schon zu einem früheren Zeitpunkt, vermutlich in Phase II gebildet. Die Aminosäuresequenz von SpoIVFA ist in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P26936 hinterlegt. Sie wird in SEQ ID NO. 16 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentin erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG10331 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 15 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukieotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 15 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1192 erfindungsgemäß als Gen spoIVFA bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 995.
Das ß. subtilis-Gen spoIVFB codiert für das Phase-IV-Sporulationsprotein FB. Dabei handelt es sich um eine membranassoziierte Metalloprotease, die vermutlich für die Prozessierung von Pro-Sigma K zu Sigma K zuständig ist; sie wird ebenfalls bereits in Phase ll der Sporulation gebildet. Die Aminosäuresequenz von SpoIVFB ist in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P26937 hinterlegt. Sie wird in SEQ ID NO. 18 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentin erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG 10332 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 17 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukieotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 17 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1264 erfindungsgemäß als Gen spoIVFB bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 1067; das erste Codon, das heißt die Positionen 201 bis 203 werden in vivo nicht als Leucin sondern als Methionin translatiert.
Auch die beiden bevorzugten Gene gehen an sich aus dem Stand der Technik hervor. Die DNA- und Aminosäuresequenzen von spolV aus ß. Hcheniformis sind in der Datenbank NCBI unter der Nummer AJ616332 hinterlegt. Dieser Faktor wird in der Diplomarbeit „Arbeiten zur Herstellung einer sporulationsnegativen Mutante von Bacillus Hcheniformis" von M.Gröne (2002), im Fachbereich Biologie der Westfälischen Wilhelms- Universität Münster, Deutschland als ein für die Sporulation von ß. Hcheniformis essentieller Faktor beschrieben. Die zugehörigen, zum Teil auch regulatorische Bereiche umfassenden Sequenzen sind in der vorliegenden Anmeldung unter SEQ ID NO. 3 und 4 angegeben. Zu diesen Sequenzen ist zu bemerken, daß erfindungsgemäß der Bereich der Nukleotide 1 bis 1792 als Gen spo/V bezeichnet wird, wobei der eigentliche SpolV- codierende Abschnitt die Positionen 140 bis 1336 umfaßt; die Randsequenzen mögen wiederum andere genetische Elemente wie Regulationselemente oder Teile anderer Gene enthalten. Hierunter wird das erste Codon GTG der Positionen 140 bis 142 in vivo nicht als Valin sondern als Methionin translatiert.
In dieser Arbeit wird auch auf den Faktor beziehungsweise das Gen yqfD aus ß. subtilis hingewiesen, welches mit einer Homologie von 68% Identität auf Aminosäureebene als das nächstähnliche bis dato bekannte Protein angesehen wird. Dieser Faktor ist in der Datenbank Swiss-Prot unter der Nummer P54469 angegeben; sowohl die Aminosäuresequenz als auch die DNA-Sequenz mit beiden ca. 200 bp flankierenden Bereichen gehen aus der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG11654 hervor. Der dortige Eintrag vermerkt, es sei zwar ein unbekanntes Protein, aber aufgrund der bestehenden Sequenzhomologien könne es als Ähnliches zum Phase-IV- Sporulationsprotein angesehen werden. Die zugehörigen Sequenzen können SEQ ID NO. 5 und 6 der vorliegenden Anmeldung entnommen werden. Zu diesen Sequenzen ist ergänzend zu bemerken, daß ungeachtet der ebenfalls angegebenen und möglicherweise andere genetische Elemente enthaltenden Randssequenzen erfindungsgemäß der Bereich der Nukleotide 1 bis 1594 als Gen yqfD bezeichnet wird, wobei der eigentliche proteincodierende Abschnitt die Positionen 201 bis 1397 umfaßt. Hierunter wird das erste Codon GTG der Positionen 201 bis 203 wie bei spolV aus ß. Hcheniformis in vivo nicht als Valin sondern als Methionin translatiert.
Es ist zu erwarten, daß alle anderen grampositiven, natürlicherweise zur Sporulation befähigten Mikroorganismen über Homologe zu den genannten sieben Genen und davon abgeleitete Faktoren vergleichbarer Funktionen verfügen. Sie dürften in an sich bekannter Weise unter Hybridisierung mit den in im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren oder wie oben bereits erwähnt über PCR-basierte Ansätze zur Sequenzierung der zugehörigen chromosomalen Abschnitte dieser Mikroorganismen ohne weiteres identifizierbar sein, insbesondere mithilfe der beiden homologen Sequenzen SEQ ID NO. 3 beziehungsweise 5, womit eine gewisse Varianz über Spezies-Grenzen hinweg ermöglicht wird.
Eines dieser Gene, vorzugsweise yqfD I spolV beziehungsweise dessen Homologes wird im Produktionsstamm erfindungsgemäß gleichzeitig mit recA inaktiviert, um hieraus entsprechende Sicherheitsstämme zu erhalten. Vorteilhafterweise werden hierfür entsprechend den oben gemachten Ausführungen zur Deletionsmutagenese die in SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15 oder 17 angegebenen Nukleinsäuren selbst zur Inaktivierung verwendet. Damit ist es nicht einmal nötig, die betreffenden homologen Gene aus den für die Produktion verwendeten Spezies selbst zu identifizieren. Hierbei ist zu erwarten, daß diese Deletionen umso erfolgreicher sind, je enger die betreffenden Spezies mit ß. subtilis beziehungsweise ß. Hcheniformis verwandt sind. Denn hiermit sollte eine zunehmende Homologie der betreffenden Gene verbunden sein. Aus diesem Grund sind im Sequenzprotokoll jeweils auch die ca. 200 bp umfassenden Randsequenzen angegeben, denn damit können entsprechend den für recA gemachten Ausführungen Konstrukte gebildet werden, die die für ein Crossing-over nötigen mindestens 70 bis 150 Positionen umfassenden Bereiche in vollständig flankierenden Bereichen enthalten und mit einer gewissen Erfolgswahrscheinlichkeit auch für die Deletion der betreffenden Abschnitte in diesbezüglich nicht näher charakterisierten Mikroorganismen eingesetzt werden können.
Erfindungsgemäß ist es möglich, zusammen mit recA mehrere der genannten Phase IV- Gene zu inaktivieren und dadurch Sicherheitsstämme zu erhalten, die neben der Unfähigkeit zur RecA-vermittelten DNA-Rekombination nicht in der Lage sind, reife Sporen zu bilden. Erfindungsgemaß reicht es hierfür jedoch aus, neben recA lediglich eines dieser Gene zu inaktivieren, weshalb in einer bevorzugten derartigen Verwendung genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.
Hierdurch werden Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion erhalten. Diese sind außerhalb der optimalen Fermentationsbedingungen weniger gut überlebensfähig, insbesondere unter Umweltbedingungen, die schlechte Nährstoffversorgung und DNA-schädigende Einflüsse, etwa durch UV-Strahlung oder aggressive chemische Verbindungen, umfassen. Die genannte erste Gruppe von Umwelteinflüssen würde bei natürlicherweise zur Sporulation befähigten grampositiven Bakterien den Übergang in die Dauerform der Sporen induzieren; die zweite Gruppe von Einflüssen kann von Mikroorganismen natürlicherweise über RecA-vermittelte DNA-Reparatur- und Rekombinationsprozesse ausgeglichen werden. Wenn die Zellen zu beidem nicht mehr oder nur noch stark eingeschränkt in der Lage sind, sind sie erfindungsgemäß als Sicherheitsstämme geeignet.
Ferner ist es möglich, zusammen mit recA eines oder mehrere der im Stand der Technik bekannten Gene zu inaktivieren und dadurch Sicherheitsstämme zu erhalten, die neben der Unfähigkeit zur RecA-vermittelten DNA-Rekombination und zur Bildung reifer Sporen auch über diese zusätzlichen Eigenschaften gekennzeichnet sind. Dazu gehören neben „aktiven", die Lebensfähigkeit unterbindenden und entsprechend stringent zu regulierenden Systemen auch jene, die im einleitend dargestellten Stand der Technik als „passive" Systeme zur Erzeugung von GVO bezeichnet worden sind, dazu gehören insbesondere inaktivierende Mutationen in einem oder mehreren der folgenden Gene: epr, rp-l, rp-ll, isp-1, apr, npr, spoOA, bpr, rsp, mpr, vpr, spoOA, spollD, spollAC, spo2, spo3, sigE, sigF, spollE, spollSB, sigG, spolVCB, spolllC, nprM und das Gen für die Isopropylmalat-Dehydrogenase (leuB). Diese Genbezeichnungen sind dem in der Einleitung zur vorliegenden Anmeldung dargestellten Stand der Technik entnommen. Somit sind an dieser Stelle mit diesen Abkürzungen jeweils die in den einleitend genannten Anmeldungen und Publikationen beschriebenen Bedeutungen gemeint. Sollten für dieselben Gene beziehungsweise Gengruppen, codierend für dieselben oder homologe Proteine, im Stand der Technik weitere Namen etabliert sein, insbesondere für die Homologen in anderen Bakterienspezies als denen, die den erwähnten Arbeiten zugrundegelegen haben, so gilt das hier Gesagte entsprechend.
Erfindungsgemäß ist es jedoch nicht unbedingt notwendig, neben recA und gegebenenfalls zusätzlich einem Sporulationsphasen IV-Gen ein weiteres Gen zu inaktivieren, so daß vorzugsweise auf diese weiteren Mutationen weitgehend verzichtet wird. Hiermit ist der in der Aufgabe zur vorliegenden Anmeldung geforderte Vorteil verbunden, möglichst wenige Sicherheitssysteme parallel in derselben Zelle zu etablieren. Hiermit wird der Arbeitsaufwand geringer gehalten, als wenn man, wie in den genannten Arbeiten zu ß. megaterium vorgeschlagen, vier verschiedene Deletionen vornehmen müßte. Das ist insbesondere dann relevant, wenn die betreffenden Zellen zuerst - solange sie noch zur Rekombination in der Lage sind - mit den für die Produktion relevanten Transgenen versehen werden und dann erst in Sicherheitsstämme, insbesondere in einen recAMinus-Phänotyp überführt werden. Nur für sehr kritische Fälle, etwa hochpathogene Stämme, sind derartige weitere Mutationen angezeigt.
Aufgrund der mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Sequenzen werden Sporulationsdefekte in den Genen spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD in der Nomenklatur von ß. subtilis beziehungsweise im Fall von Bacillus Hcheniformis in dem Gen spolV beziehungsweise den je nach Wirtszelle vorhandenen hierzu homologen Genen erzeugt.
Diese Homologie läßt sich in erster Näherung über einen Sequenzvergleich erschließen. Zur Kontrolle kann im vorliegenden, für die biotechnlogische Produktion vorgesehenen Mikroorganismus-Stamm das fragliche Gen inaktiviert und über eine Wiederherstellung des Phänotyps (Rescue) die funktioneile Übereinstimmung der betreffenden Gene überprüft werden. Überführt die parallele Bereitstellung einer erfindungsrelevanten spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD- oder spo/V-Kopie die betreffende Knock-out-Mutante wieder in einen Sporulations-positiven Phänotyp, so wäre damit der Nachweis erbracht, daß auch eine funktionelle Austauschbarkeit der betrachteten Gene besteht. Unter homologen Genen zu den genannten Phase-IV- Sporulationsgenen werden erfindungsgemäß also insbesondere solche verstanden, die einem derartigen „Rescue" zugänglich sind. Wenn das möglich ist, handelt es sich um ein bevorzugt verwendetes Sporulationsgen. Diese Kontrolle ist insbesondere deshalb mit zumutbarem Arbeitsaufwand möglich, weil zum einen erfindungsgemäß eben eine solche funktioneil inaktive Mutante erzeugt werden soll und zum anderen über das Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung die betreffenden Sequenzen aus ß. subtilis und die besonders bevorzugte davon zusätzlich aus ß. Hcheniformis zur Verfügung gestellt werden, über die ein derartiger Rescue vorgenommen werden kann.
In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die erfindungsgemäße, bisher beschriebene Verwendung zur funktionellen Inaktivierung der Gene spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD oder spolV beziehungsweise den hierzu jeweils homologen Genen mithilfe der Sequenzen SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, oder 17 oder Teilen davon, vorzugsweise mithilfe von Teilen, die mindestens 70 bis 150 zusammenhängende Nukleinsäurepositionen umfassen, besonders bevorzugt mithilfe von zwei solchen Teilen, die einen dazwischenliegenden Teil des Gens umschließen.
Denn wie oben beschrieben können über diese konkreten Sequenzen, insbesondere für ß. Hcheniformis und ß. subtilis und nahe mit diesen verwandte Spezies entsprechende molekularbiologische Konstrukte hergestellt werden. Hierfür stehen alle oben zu recA ausgeführten Möglichkeiten zur Verfügung und sind entsprechend bevorzugt.
Einen eigenen Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellen die mit den beschriebenen Verfahren erhaltenen Mikroorganismen dar. In seiner allgemeinsten Formulierung handelt es sich dabei also um ein grampositives Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem das Gen recA funktioneil inaktiviert ist.
Hierbei ist in erster Linie grampositive Bakterien gedacht, bei denen das Gen recA durch gentechnische, das heißt künstliche Arbeitsschritte funktionell inaktiviert worden ist.
Wie bereits gesagt sind grampositive Bakterien, beispielsweise aufgrund ihrer Fähigkeit zur Sekretion von Wertstoffen und/oder ihrer vergleichsweise leichten FermenCerbarkeit die für die Biotechnologie wichtigsten Mikroorganismen. Hierunter werden für die verschiedenen Einsatzgebiete verschiedene Spezies bevorzugt, so werden niedermolekulare Verbindungen wie etwa Aminosäuren in besonders großem Ausmaß mithilfe von Corynebacterien produziert; Bacillus und hierunter insbesondere ß. Hcheniformis wird für die Produktion von extrazellulären Proteinen besonders geschätzt. Sie alle sind erfindungsgemäß, zumindest grundsätzlich einer funktionellen Inaktivierung von RecA zugänglich.
Diese erfindungsgemäßen Bakterien zeichnen sich durch die beschriebenen Rekombinationsdefekte aus und weisen deshalb unter natürlichen Bedingungen, insbesondere in Konkurrenz mit anderen Mikroorganismen Nachteile hinsichtlich ihrer Überlebensfähigkeit auf und eignen sich somit als Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion. Hierbei handelt es sich aus den oben ausgeführten Gründen nicht um Bacillus megaterium.
Den bisherigen Ausführungen entsprechend sind darunter solche grampositiven Bakterien bevorzugt, bei denen die funktionelle Inaktivierung über Punktmutagenese, teilweise Deletion oder Insertion oder vollständige Deletion des für das vollständige Protein codierenden Bereichs erfolgt ist.
Den bisherigen Ausführungen entsprechend sind weiterhin darunter solche grampositiven Bakterien bevorzugt, bei denen die funktionelle Inaktivierung über eine erfindungsgemäße für RecA codierende Nukleinsäure und/oder über eine Nukleinsäure erfolgt ist, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 31 angegebenen Nukleotidsequenz in den Positionen 369 bis 1415 zu mindestens 1045, vorzugsweise mindestens 1046, ganz besonders bevorzugt 1047 dieser 1047 Positionen übereinstimmt, beziehungsweise über die zumindest teilweise nichtcodierenden flankierenden Bereiche zu diesen Nukleinsäuren.
Hierbei sind die Nukleinsäuren mit den oben beschriebenen Homologiewerten um SEQ ID NO. 1 oder, wie bereits erläutert, um SEQ ID NO. 31 entsprechend bevorzugt. Mikroorganismen, bei denen die funktionelle Inaktivierung mithilfe der in SEQ ID NO. 1 oder 31 angegebenen Nukleinsäure beziehungsweise Abschnitten davon erfolgt ist, stellen in dieser Hinsicht die am meisten bevorzugten Mikroorganismen dar.
Entsprechend dem oben gesagten sind im Falle einer Mutagenese über Crossing over vorzugsweise Randsequenzen von jeweils mindestens 70 bis 150 bp verwendet worden, was über eine Sequenzierung der betreffenden chromosomalem Abschnitte überprüft werden kann.
Den bisherigen Ausführungen entsprechend sind weiterhin darunter solche grampositiven Bakterien und hierunter vorzugsweise solche der Gattungen Clostridium oder Bacillus, bevorzugt, die natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind und bei denen gleichzeitig mit recA ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktioneil inaktiviert ist.
Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter insbesondere solche Gendefekte zu verstehen, die über biotechnologische Arbeitsschritte vorgenommen worden sind.
Den bisherigen Ausführungen entsprechend sind weiterhin darunter solche grampositiven Bakterien bevorzugt, bei denen es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von ß. subtilis um eines der Gene spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von ß. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus Hcheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
In besonderen Fällen, etwa beim Einsatz hochpathogener Stämme können auch mehrere der genannten Sporulationsgene oder eines oder mehrere der im Stand der Technik beschriebenen Gene oder Gengruppen spo/V/yq D/Homolog, epr, rp-l, rp-ll, isp- 1, apr, npr, spoOA, bpr, rsp, mpr, vpr, spoOA, spollD, spollAC, spo2, spo3, sigE, sigF, spollE, spollSB, sigG, spolVCB, spolllC, nprM und/oder das Gen für die Isopropylmalat- Dehydrogenase (leuB) funktionell inaktiviert werden. Unter diesen Abkürzungen sind jeweils die in den einleitend genannten Anmeldungen und Publikationen beschriebenen Bedeutungen zu verstehen, wobei eventuelle Synonyme entsprechend eingeschlossen werden.
Den bisherigen Ausführungen entsprechend handelt es sich dabei jedoch bevorzugt jeweils um ein solches grampositives Bakterium, bei dem - neben der RecA- Inaktivierung - genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist. Entsprechend dem oben Gesagten ist weiterhin jeweils ein solches derartiges grampositives Bakterium bevorzugt, bei dem die funktionelle Inaktivierung der Gene spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD oder spolV beziehungsweise den hierzu jeweils homologen Genen mithilfe einer der Sequenzen SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, oder 17 oder Teilen davon erfolgt ist, vorzugsweise mithilfe von Teilen, die mindestens 70 bis 150 zusammenhängende Nukleinsäurepositionen umfassen, besonders bevorzugt mithilfe von zwei solchen ' Teilen, die einen dazwischenliegenden Teil des Gens umschließen.
Dies läßt sich über Präparationen der betreffenden DNA, beispielsweise der chromosomalen DNA eines erfindungsgemäßen Stamms und Restriktionsanalyse oder PCR überprüfen. Als Primer hierfür können die jeweiligen flankierenden Sequenzen verwendet werden, wobei die Größe des PCR-Produkts Aufschluß über das Vorhandensein und gegebenenfalls die Größe von Inserts gibt. Dieses Vorgehen ist beispielhaft für spolV in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung dargestellt.
Entsprechend den bisherigen Ausführungen sind unter den erfindungsgemäßen grampositiven Bakterien besonders solche bevorzugt, bei denen es sich um Vertreter der Gattungen Clostridium oder Bacillus handelt, insbesondere um solche der Spezies Bacillus subtilis, B. Hcheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. globigii, B. clausii oder ß. lentus, und ganz besonders um Stämme von ß. Hcheniformis.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen die Verfahren zur Fermentation eines erfindungsgemäßen grampositiven Bakteriums dar.
Denn diese Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß RecA, vorzugsweise im Zusammenspiel mit den dargestellten bevorzugten Ausführungsformen nicht aktiv ist und der betreffende Stamm im Falle einer versehentlichen Freisetzung in die Umgebung der Anlage ein deutlich minimiertes Sicherheitsrisiko darstellt. Für Verfahren zur Fermentation werden entsprechende Sicherheitsanforderungen gestellt, so daß sie gegebenenfalls nur dann durchführbar sind, wenn sie diese Anforderungen erfüllen.
Daß solch ein Stamm unter den optimalen Bedingungen während der Fermentation nicht grundlegend benachteiligt ist, belegt Beispiel 5 (Figur 6) der vorliegenden Anmeldung; das gilt auch für die dort beschriebene Doppelmutante. Die Inaktivierung von recA führt jedoch zu einer deutlich verringerten Lebensfähigkeit unter UV-Einwirkung. Dabei handelt es sich um einen üblichen Umweltfaktor, mit dem Bakterien bei einem eventuellen Austritt aus der Produktionsanlage in die Umgebung konfrontiert sind. Zudem stellt die UV-Bestrahlung eine übliche Sterilisierungsmethode für Labors und biotechnologische Produktionsstätten dar. Wie die Beispiele ferner belegen, führt die Inaktivierung von spolV zu einer drastisch verringerten Sporulationsrate. Beide Ansatzpunkte sind diesen Beispielen zufolge miteinander im selben Bakterienstamm kombinierbar. Zudem ergänzen sich beide „passiven" Systeme zur Erzeugung von technisch nutzbaren Sicherheitsstämmen aufgrund ihrer unterschiedlichen Wirkprinzipien.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren zur Herstellung eines Wertstoffs, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.
Zwar ist es vorteilhaft, wenn entsprechende Stämme auch im Labormaßstab eingesetzt werden. Doch sind hier die übrigen Rahmenbedingungen im allgemeinen leichter zu erfüllen. Außerdem besteht das Haupeinsatzgebiet der Fermentation von Mikroorganismen in der biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen.
Der Bedeutung dieser Wertstoffe entsprechend sind hierunter solche Verfahren bevorzugt, bei denen es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
Hierunter sind beispielsweise Aminosäuren oder Vitamine zu nennen, die besonders als Nahrungsmittelergänzungsstoffe Verwendung finden. Bei pharmazeutisch relevanten Verbindungen kann es sich um Vor- oder Zwischenstufen zu Medikamenten oder sogar um diese selbst handeln. In all diesen Fällen spricht man auch von Biotransformation, wonach die Stoffwechseleigenschaften der Mikroorganismen ausgenutzt werden, um die ansonsten aufwendige chemische Synthese ganz oder zumindest in einzelnen Schritten zu ersetzen.
In nicht minder bevorzugten Verfahren handelt es sich bei dem Protein um ein Enzym, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen. Industrielle Enzyme, die mit derartigen Verfahren hergestellt werden, finden beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung. So dienen α-Amylasen beispielsweise dazu, um das Altbackenwerden von Brot zu verhindern oder um Fruchtsäfte zu klären. Proteasen werden zum Aufschluß von Proteinen verwendet. All diese Enzyme sind für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben, wobei insbesondere die von grampositiven Bakterien bereits natürlicherweise hergestellten Subtilisin-Proteasen einen prominenten Platz einnehmen. Insbesondere in der Textil- und Lederindustrie dienen sie der Aufarbeitung der natürlichen Rohstoffe. Ferner können all diese Enzyme wiederum im Sinne der Biotransformation als Katalysatoren für chemische Reaktionen eingesetzt werden.
Wie einleitend in der Aufgabe formuliert war es erwünscht, ein solches Sicherheitssystem zu finden, das nicht so speziell ist, daß es nicht auch in anderen molekularbiologischen Ansätzen Verwendung finden könnte. Derartige Ansätze können zu einem weiteren eigenständigen Erfindungsgegenstand zusammengefaßt werden.
Das bedeutet allgemein formuliert die Verwendung des oben beschriebenen Faktors RecA und/oder eines RecA, welches mit der in SEQ ID NO. 32 angegebenen Aminosäuresequenz in mindestens 347, vorzugsweise 348 der dort gezeigten 348 Aminosäurepositionen übereinstimmt, in einem molekularbiologischen Reaktionsansatz.
Hierfür werden dessen natürlicherweise vorhandenen, einleitend angegebenen Aktivitäten ausgenutzt.
Dementsprechend bevorzugt ist die Verwendung zum Stabilisieren einzelsträngiger DNA, insbesondere bei einer DNA-Polymerisation, bei in vitro erfolgenden Rekombinationsvorgängen, oder zum Überführen doppelsträngiger DNA in einzelsträngige DNA oder umgekehrt.
Denn RecA ist ein DNA-einzelstrangbindendes Protein, welches wie erläutert auch eine gewisse Affinität zu doppelsträngiger DNA aufweist. Bei dem natürlichen Prozeß des Crossing over im Zuge der homologen Rekombination kommt diese Funktion zum Tragen. So kann RecA beispielsweise einer PCR oder einer Präparation von Phagen- DNA zugegeben werden, um die Einzelstränge zu stabilisieren. Wenn in vitro Rekombinationsvorgänge nachvollzogen werden, etwa beim Einführen von Mutationen (so auch bei den oben ausgeführten erfindungsgemäßen Mutationen), kann dies von RecA unterstützt werden. Schließlich ist unter dem Überführen doppelsträngiger DNA in einzelsträngige DNA oder umgekehrt eine Gyrase- oder Gyrase-unterstützende Funktion gemeint. Dies kann für die Beeinflussung der DNA-Topologie, etwa bei der Arbeit mit Plasmid-DNA ausgenutzt werden.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Vektoren dar, die eine zuvor beschriebene, erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Denn auch in dieser Form wird die vorliegende Erfindung verwirklicht. So kann diese DNA in Form von Klonierungsvektoren molekularbiologisch bearbeitet oder gelagert werden.
Vorzugsweise handelt es sich bei einem solchen Vektor um einen Expressionsvektor. Denn dieser kann dazu ausgenutzt werden, um ein erfindungsgemäßes RecA herzustellen und den genannten Anwendungen des Faktors zuzuführen.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen dementsprechend auch Verfahren zur Herstellung eines zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Faktors RecA dar.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz einer der oben beschriebenen Nukleinsäuren, insbesondere solchen mit zunehmenden Hologiewerten zur SEQ ID NO. 1 erfolgen, vorzugsweise eines entsprechenden Expressionsvektors und weiter bevorzugt durch Fermentation eines diese Nukleinsäure beziehungsweise diesen Expressionsvektor enthaltenden Wirts.
So wird die vorliegende Erfindung dadurch verwirklicht, daß eine Zelle ein solches Gen in Form einer chromosomalen Kopie erhält und translatiert. Leichter steuerbar erscheint demgegenüber die Bereitstellung dieses Gens in Form eines Plasmids, das gegebenenfalls in mehreren Kopien für die Bildung dieses Faktors sorgt.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung der für einen Faktor RecA codierenden, erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Expression dieses Faktors dar. Denn entspechend dem oben Gesagten wird dadurch die vorliegende Erfindung zumindest in einem Aspekt verwirklicht. Vorzugsweise dient das dazu, um diesen Faktor selbst herzustellen, insbesondere in einem oben beschriebenen Verfahren. Alternativ hierzu kann die intrazelluläre Expression auch dazu dienen, um molekularbiologische Aktivitäten der betreffenden Zellen zu modulieren, insbesondere bei in vivo erfolgenden Rekombinationsvorgängen.
Hierbei ist beispielsweise an die Inaktivierung durch einen Antisense- oder RNA- Interferenz-Ansatz gedacht, nach welchem die für RecA codierende mRNA gezielt ausgeschaltet oder nur in einem Teil translatierbar macht. Hierdurch kann die Expression dieses Faktors ganz gezielt moduliert werden. Das gilt sowohl für biotechnologische Produktionsstämme als auch für Laboransätze zum Studium molekularbiologischer Aspekte.
Ferner wird die vorliegende Erfindung auch in der Verwendung der für einen Faktor RecA codierenden, oben als erfindungsgemäß beschriebenen Nukleinsäure und/oder einer für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 31 angegebenen Nukleotidsequenz in den Positionen 369 bis 1415 zu mindestens 1045, vorzugsweise mindestens 1046, besonders bevorzugt 1047 dieser 1047 Positionen übereinstimmt, zur Inaktivierung dieses Faktors oder des Gens recA in einem In vfro-Ansatz, insbesondere über Wechselwirkung mit einer zugehörigen Nukleinsäure, verwirklicht.
Das kann besonders für in-vitro-Transkriptions- oder-Translationsansätze vorteilhaft sein, um Rekombinationsvorgänge zu unterbinden.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus dem molekularbiologischen Aspekt, über den die Gene recA und spolV zugänglich sind. Denn wie in Beispiel 1 dargestellt ist, konnten die zugehörigen DNA-Abschnitte über PCR mithilfe der in SEQ ID NO. 19 bis 30 angegebenen Oligonukleotide aus einem prinzipiell beliebigen ß. Hcheniformis-Siamm erhalten werden, so daß die vorliegende Erfindung darüber besonders leicht nacharbeitbar ist.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist somit eine für eine Teilsequenz von recA codierende oder für eine mit recA in vivo benachbarte Teilsequenz, vorzugsweise weniger als 1.000 bp, besonders bevorzugt weniger als 500 bp entfernt liegende Nukleinsäure gemäß einer der SEQ ID NO. 25 bis 30. Denn dabei handelt es sich um Teilsequenzen von recA oder um solche, die möglicherweise über nur wenige hundert dazwischenliegende Basenpaare von recA entfernt liegend. Zunehmend bevorzugt sind 1.000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp bis hinzu einer unmittelbaren Nachbarschaft, das heißt einer Lage zu Beginn oder zum Ende von recA, vorzugsweise in den gerade noch nicht proteincodierenden Bereichen. Sie können entsprechend Beispiel 1 zur Gewinnung eines recA aus einem dahingehend nicht weiter charakterisierten Stamm erhalten werden, wobei die Erfolgswahrscheinlichkeit mit zunehmender Verwandtschaft zu ß. Hcheniformis zunimmt.
Entsprechend den bisherigen Ausführungen und illustriert durch Beispiel 1 entspricht auch eine Verwendung mindestens einer, vorzugsweise von mindestens zwei einander entgegenorientierten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 25 bis 30 zur Amplifizierung eines in vivo davon umschlossenen DNA-Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Die paarweise Verwendung ergibt sich aus dem PCR-Ansatz, welcher grundsätzlich einander entgegengesetzte Primer verlangt. Die Orientierung der betreffenden Primer kann Figur 3B entnommen werden. Hierbei ist aufgrund der vergleichsweise hohen Homologiewerte grundsätzlich davon auszugehen, daß diese Primer auch in noch nicht charakterisierten recAGenen eine ähnliche Orientierung einnehmen.
Eine hierunter bevorzugte Verwendungsmöglichkeit besteht darin, zunächst die am weitesten außen bindenden Primer herzustellen (etwa recA6 in Kombination mit recA5 gemäß Figur 3B oder, wenn diese nicht funktionieren sollten, recA1 und/oder recA4), um darüber den dazwischenliegenden Bereich zu erhalten. Dann können zur Herstellung des konkreten Deletionskonstrukts weiter innen bindende OligonukleoCde als Primer eingesetzt werden, beispielsweise recA2 (beispielsweise in Kombination mit recA1) und recA3 (beispielsweise in Kombination mit recA4), wobei die Nukleotidsequenzen der inneren Primer anhand der durch die vorangegangene PCR erhaltenen Sequenzen gegebenenfalls korrigiert werden können. Sollte dieses Vorgehen fehlschlagen, können auch, wie das an sich bekannt und oben bereits gesagt worden ist, PCR-Primer mit Sequenzvariationen eingesetzt werden. Den Erfolg dieses Ansatz bestätigt die Sequenzierung des erhaltenen Fragments, welches zu den in SEQ ID NO. 1 und/oder 31 oder in Figur 2 angegebenen Sequenzen deutliche Homologien aufweisen sollte, wenn es sich wie gewünscht um ein recAGen handelt.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um eine Verwendung zur Amplifizierung eines recA Gens, da damit der Aspekt der Inaktivierung dieses Gens gemäß der vorliegenden Erfindung realisierbar wird.
Dementsprechend bevorzugt handelt es sich also um derartige Verwendungen im Rahmen eines oben eingehend beschriebenen Verfahrens zur funktionellen Inaktivierung des Gens rec>A in einem grampositiven Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, einschließlich der oben beschriebenen Ausführungsformen dieses Erfindungsaspekts.
In analoger Weise bevorzugt handelt es sich um derartige Verwendungen zur Erzeugung eines grampositiven Bakteriums, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem das Gen recA funktionell inaktiviert ist, einschließlich der oben beschriebenen Ausführungsformen dieses Erfindungsaspekts.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind durch Inaktivierung des Gens spolV gekennzeichnet. Entsprechend den zuletzt gemachten Ausführungen zu recA handelt es sich bei folgenden Aspekten ebenfalls um Verwirklichungen der vorliegenden Erfindung:
- Eine für eine Teilsequenz von spolV codierende oder für eine mit spolV in vivo benachbarte Teilsequenz, vorzugsweise weniger als 1.000 bp, besonders bevorzugt weniger als 500 bp entfernt liegende Nukleinsäure gemäß einer der SEQ ID NO. 19 bis 24;
- Eine Verwendung mindestens einer, vorzugsweise von mindestens zwei einander entgegenorientierten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 25 bis 30 zur Amplifizierung eines in vivo davon umschlossenen DNA-Bereichs;
- eine derartige Verwendung zur Amplifizierung eines spo/V-Gens;
- eine derartige Verwendung im Rahmen eines Verfahrens zur funktionellen Inaktivierung des Gens recA in einem grampositiven Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, wobei gleichzeitig mit recA ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird, einschließlich der oben beschriebenen Ausführungsformen dieses Erfindungsaspekts;
- eine derartige Verwendung zur Erzeugung eines grampositiven Bakteriums, welches nicht Bacillus megaterium ist, vorzugsweise eines der Gattungen Clostridium oder Bacillus, das natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist und bei dem gleichzeitig mit recy ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist, einschließlich der oben beschriebenen Ausführungsformen dieses Erfindungsaspekts.
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder „Mikrobiologische Methoden: Eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken." von E. Bast (1999) Spektrum, Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Isolierung der spolV- und der #-ecA-Region aus einem B. licheniformis-Laborstamm
Zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung kann grundsätzlich mit den Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen für rec,4 und spolV aus ß. Hcheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 1 beziehungsweise 3) begonnen werden. Hier wurde noch früher begonnen und zunächst ein PCR-basiertes Verfahren zur Isolierung dieser Gene aus einem Bacillus- Stamm angewendet, wie es in der Publikation „A general method for cloning recA genes of Gram-positive bacteria by polymerase chain reaction" (1992) von Duwat et al. in J. Bacteriol., Band 174 (Nr. 15), S. 5171 - 5175, beschrieben ist.
Hierfür wurden anhand der aus verschiedenen grampositiven Bakterien und insbesondere aus ß. Hcheniformis DSM 13 zuvor bekannten DNA-Sequenzen der Gene spolV und recA PCR-Primer synthetisiert, von denen die letztlich erfolgreichen in Tabelle 1 und dem Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung aufgeführt sind. Ihre Bindeorte an die jeweiligen Genorte sind in Figur 3 dargestellt.
Tabelle 1 : Verwendete OligonukleoCde zur Amplifizierung des spolV- sowie des recALocus.
Hiermit wurden überlappende Teile sowohl des spolV- als auch des recALocus mit Hilfe der PCR-Technik aus einer Präparation chromosomaler DNA eines ß. Hcheniformis- Laborstamms isoliert. Dieser, als ß. Hcheniformis A bezeichnete Stamm diente somit als Beispiel für ein beliebiges grampositives Bakterium. Dieser Ansatz ist in analoger Weise auf prinzipiell alle grampositiven Bakterien anwendbar, insbesondere nachdem diese Primer nun bekannt sind.
Nach Sequenzierung der nach Standard-PCR erhaltenen PCR-Fragmente wurden diese jeweils zu einer Gesamtsequenz zusammengesetzt. Diese stimmte im Fall der spolV- Region über die Gesamtlänge von 1.792 bp zu 100% mit der im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 3 angegebenen Sequenz von ß. Hcheniformis DSM 13 überein. Deshalb bezeichnet die dortige Spezies-Angabe in Feld <213> nicht den speziellen Stamm DSM 13 oder A sondern allgemein die Spezies.
Ferner sei zu dieser Sequenzdarstellung ergänzt, daß der codierende Bereich die dort gezeigten Positionen 140 bis 1336 (einschließlich des Stop-Codons) umfaßt, wobei die ersten drei für das Startcodon GTG codieren, welches in vivo als Methionin translatiert wird. Der gesamte gezeigte Abschnitt von 1.792 bp wird hier als Gen spolV bezeichnet, weil er nicht allein den proteincodierenden Teil sondern auch regulatorische Elemente enthält, die diesem Gen zuzuordnen sind. Diese Genbezeichnung erfolgt auch dessen ungeachtet, daß möglicherweise Abschnitte, die primär anderen Genen zuzurechnen sind, hineinreichen mögen. Dies erscheint deshalb gerechtfertigt, weil Genbereiche manchmal überlappend angeordnet sind. Im Fall der recARegion wurde eine DNA mit einer Länge von 1.557 bp erhalten, die in dem mit SEQ ID NO. 1 der vorliegenden Anmeldung homologisierbaren, unmittelbar proteincodierenden Bereich in allen bis auf drei Positionen übereinstimmt. Sie ist in SEQ ID NO. 31 angegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz befindet sich in SEQ ID NO. 32. Die Unterschiede auf DNA-Ebene zu SEQ ID NO. 1 liegen in den Positionen 282-284, wodurch die zugehörigen Codons statt für die Aminosäureabfolge DT für EH kodieren. Wegen dieser Abweichung wurden die Spezies-Angaben zu SEQ ID NO. 1 und 31 im jeweiligen Feld <213> um die Stammbezeichnungen DSM 13 beziehungsweise A ergänzt. Es sei hinzugefügt, daß der codierende Bereich die in SEQ ID NO. 31 gezeigten Positionen 369 bis 1415 (einschließlich des Stop-Codons) umfaßt. Entsprechend der Erläuterungen zu spolV wird der gesamte gezeigte Abschnitt von 1.557 bp als Gen rec>4 bezeichnet.
Die beiden auf diese Weise erhaltenen Loci spolV und recA wurden bei der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) unter den Zugangsnummern AJ616332 (für spolV) und AJ511368 (für recA) hinterlegt.
Beispiel 2
Deletion des spolV- und des recAGens durch gezielte Gendisruption
Mit Hilfe der Technik der gezielten Gendisruption sollte anschließend jeweils ein möglichst großer Bereich aus dem spolV- beziehungsweise dem recAGen deletiert werden. Der Versuchsaufbau ist in Figur 3 skizziert. Teil A zeigt die Einführung der Deletion in spolV und damit die Ableitung des Stamms ß. Hcheniformis A.1 (Δ.spolV) aus ß. Hcheniformis A. Teil B zeigt die Weiterentwicklung von ß. Hcheniformis A.1 (ΔspolV) zu ß. Hcheniformis A.2 (Δ.spolV, ärecA). Der betreffende Genort, einschließlich der jeweils unmittelbar flankierenden Gene ist ebenso bezeichnet wie wichtige Restriktionsschnittstellen und die Bindebereiche für die in Beispiel 1 aufgelisteten Primer.
Für die Deletionen wurden, wie unten noch näher erläutert wird, mit den in Figur 3 gezeigten Oligonukleotiden Flankenbereiche aus der chromosomalen DNA amplifiziert und zur Konstruktion entsprechender Deletionskartuschen verwendet. Diese wurden zunächst im E. co//-Vektor pUCBM21 erstellt. Dieser ist unter http://seq.yeastgenome.org/vectordb/vector_descrip/PUCBM21.html beschrieben (eingesehen am 14.1.2005) und von der Firma, Röche Diagnostics GmbH, Röche Applied Science, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim (ehemals Boehringer) kommerziell erhältlich. Später wurden sie in den BacillusΛ/ektor pE194 umkloniert. Dieser ist unter http://seq.yeastgenome.org/vectordb/vector_descrip/PE194.htmI beschrieben (eingesehen am 14.1.2005) und von der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org) erhältlich.
Die Erzeugung einer Gendisruption mit Hilfe solcher integrativer Vektoren erfolgt durch Rekombinationsereignisse über die entsprechenden homologen Flankenbereiche. Dabei wird durch zwei aufeinanderfolgende Einzel-Crossover-Ereignisse die ursprünglich Plasmid-Iokalisierte, in vitro mutierte Kopie des zu disruptierenden Gens gegen die native, intakte Kopie im Bakterienchromosom ausgetauscht. Da der BacillusA/ektor einen temperatursensitiven Replikationsursprung trägt, lassen sich die Plasmidanteile nach der erfolgten Disruption unter nicht-permissiven Bedingungen (42°C) später wieder aus den Zellen entfernen, was die Etablierung einer stabilen Mutantenlinie ermöglicht.
Zur Konstruktion der spo/V-Deletionskartusche wurden die OligonukleoCde spo3 und spo4 sowie spo7 und spo6 verwendet; beide Flanken sind jeweils ca. 450 bp groß und umrahmen einen Bereich von 740 bp (Größe der späteren Deletion). Zur Konstruktion der recADeletionskartusche wurden die OligonukleoCde recA"\ und rec.42 sowie recA3 und recAΛ verwendet; beide Flanken sind ca. 340 bp groß und umrahmen einen Bereich von 852 bp (Größe der späteren Deletion). Nach Umklonierung der Deletionskartuschen in die singuläre Psfl-Schnittstelle von pE194 (durchgeführt in ß. subtilis DB104; Stamm beschrieben in Kawamura, F. und Doi, R. H. (1984), J. Bacteriol., Band 160, Seiten 442- 444) wurden die beiden Disruptionsvektoren pESpo2 sowie pErec,42 erhalten. Zunächst wurde für eine gezielte Deletion des spo/V-Gens der Vektor pESpo2 in ß. Hcheniformis A via Protoplastentechnik (beschrieben in S. Chang und S.N. Cohen, (1979) Molec. Gen. Genet, Band 168, Seiten 111-115) transformiert. Aus einer entsprechenden Transformantenlinie wurde anschließend unter nicht-permissiven Bedingungen der Vektor wieder aus den Zellen ausgedünnt. Gleichzeitig wurde mittels PCR unter Verwendung der OligonukleoCde spol und spo2 auf das Vorhandensein eines Mutantenamplifikats durchsucht und nach mehreren Kultivierungspassagen eine stabile Δspo/V-Mutantenlinie (bezeichnet mit ß. Hcheniformis A.1) erfolgreich isoliert. Diese Mutantenlinie A.1 wurde für eine weitere Transformation mit dem recA Disruptionsvektor pErecA2 herangezogen. In analoger Weise wurde auch hier über mehrere Kultivierungspassagen die Transformante bei 42°C subkultiviert, wobei eine entsprechende ΔrecAMutante (Δspo/V/ΔrecADoppelmutante, als B. Hcheniformis A.2 bezeichnet) mit Hilfe eines Screenings auf Mito ycin C-Sensitivität (0,03 μg/μl) identifiziert werden konnte. Zusätzlich wurde dieser phänotypische Befund durch eine PCR unter Verwendung der OligonukleoCde recAS und recA5 verifiziert.
Beispiel 3
Genotypische Charakterisierung der Δspo/V-Einzel- und der AspoIVlArecA-
Doppelmutante
Beide Mutantenstämme (ß. Hcheniformis A.1 und A.2) wurden im Vergleich mit dem Ausgangsstamm ß. Hcheniformis A auf DNA-Ebene untersucht, um die Deletionen (Verkürzungen) im entsprechenden Genbereich zu überprüfen. So konnte mit Hilfe der PCR-Technik unter Verwendung der Primer spol und spo2 die 740 bp-Deletion im spo/V-Locus der Stämme A.1 und A.2 eindeutig nachgewiesen werden (Figur 4 A linker Teil). Gleiches gilt für die 852 bp-Deletion im recAGen der Mutante A.2 unter Verwendung des Primerpaares recAS und recA5 (Figur 4 A, rechter Teil).
Desweiteren wurden die drei Stämme einer SoufΛern-Analyse unterzogen. Für den Nachweis der spo/V-Deletion wurden jeweils 2 μg chromosomaler DNA mit der Restriktionsendonuklease C/al geschnitten und nach gelelektrophoretischer Auftrennung nach Standardmethoden mit einem DIG-markierten PCR-Produkt (erstellt mit den Primern spo3 und spo4 anhand der Ausgangs-DNA) hybridisiert. Dabei erschien das größere der beiden detektierten C/al-Fragmente sowohl beim Stamm A.1 als auch beim A.2 auf einer Höhe, die um eine der Deletion entsprechende Größe niedriger als beim Ausgangsstamm A lag (Figur 4 B linker Teil).
Für den Nachweis der recADeletion wurde die DNA jeweils mit der Restriktionsendonuklease Sspl verdaut und in analoger Weise mit einem DIG- markiertem PCR-Produkt (in analoger Weise mit den Primern recA und rec>42 erstellt) hybridisiert. Hier lag das entsprechende Sspl-Fragment beim Stamm A.2 aufgrund der Deletion ebenfalls bei einer entsprechend geringeren Höhe als im Parentalstamm A.1 beziehungsweise dem Wildtypstamm A (Figur 4 B rechter Teil).
Beispiel 4
Phänotypische Charakterisierung der Δspo/V-Einzelmutante A.1 und der
Δspo/V/ΔrecA-Doppelmutante A.2: Überlebensrate und Sporenbildung
Die Anzucht für die Sporulationstests erfolgte in 200 ml-Schaeffer'schem Sporulationsmediu (16,0 g LB-Medium, 2,0 g KCI, 0,5 g MgSO4 x 7 H2O, ad 993,0 ml dest. Wasser; pH 7,0; die Lösung wird autoklaviert und anschließend mit nachfolgenden Komponenten supplementiert: 1 ml Ca(NO3)2 (0,1 M), 1 ml MnCI2 (0,1 M), 1 ml FeSO4 (1 mM), 4 ml Glucose (20 % (w/v)), in 500 ml Zwei-Schikane-Kolben. Für jeden der drei zu testenden Stämme wurden je drei Kolben 0,25 %ig aus einer LB-Vorkultur angeimpft und bei 30°C sowie ca. 120 rpm (Fa. Innova 4230, New Brunswick Scientific, Edison, NY, USA) inkubiert. Zum Zeitpunkt der Probennahmen wurden jeweils 1.100 μl Kultur in ein steriles Eppendorfgefäß überführt. 100 μl dieser Aliquots wurden zur Bestimmung der Lebendzellzahl eingesetzt, indem eine Verdünnungsreihe in 15 mM NaCl angelegt wurde. Die jeweiligen Verdünnungsstufen wurden auf je vier LB-Agarplatten ausplattiert und bei 30°C über Nacht inkubiert. Die Anzahl lebensfähiger Zellen wurde durch Auszählen der Kolonien auf jeder der vier Agarplatten bestimmt. Die Lebendzellzahl [colony forming units (cfu)] wurde unter Berücksichtigung des ausplattierten Volumens und der Verdünnungsstufe ermittelt und die Werte eines Plattensatzes gemittelt. Die restlichen 1.000 μl-Proben wurden für 30 min bei 80°C im Wasserbad inkubiert. Jeweils 250 μl der so behandelten Suspension wurden auf vier LB-Agarplatten ausplattiert und bei 30°C inkubiert. Der Sporentiter wurde durch Auszählen der ausgekeimten Sporen, welche eine Einzelkolonie bilden, ermittelt. Die Sporenanzahl der Platten wurde gemittelt und anschließend pro ml Kultur berechnet. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 und Figur 5 dargestellt.
Tabelle 2: Mittelwerte der Lebendzellzahl und der überlebenden Sporen pro ml Kultur. Jeder Stamm wurde in drei parallelen Experimenten (=Anzuchten) untersucht. Jedes Experiment wurde durch Vierfachbestimmung statistisch abgesichert. A = Ausgangsstamm ß. Hcheniformis A; A.1 = ß. Hcheniformis A.1 (AspolV); A.2 = ß. Hcheniformis MD1.2 (AspolV, ArecA).
Man erkennt anhand dieser Ergebnisse, daß lediglich die Zellen des Ausgangsstamms zur Sporenbildung in der Lage sind. Die beiden Mutanten können dies aufgrund der Deletion von spolV nicht mehr. Dabei zeigt die Mutante, die zusätzlich durch Deletion des Gens recA gekennzeichnet ist, einen etwas weniger steilen Abfall in der Lebendzellzahl.
Beispiel 5
Wachstumskurven der ΔspoJV-Einzelmutante A.1 und der AspolVIArecA-
Doppelmutante A.2
Für diesen Test wurden zunächst 10 ml-Kulturen der drei zuvor beschriebenen Stämme in LB-Medium mit jeweils einer Einzelkolonie (von LB-PIatte) inokuliert und über Nacht bei 37°C und 150 rpm inkubiert. Mit diesen Vorkulturen wurden jeweils 50 ml Minimalmedium nach Sambrook et al. 1989 (1% (w/v) Glucose, 0,1 mM CaCI2, 0,01% (w/v) Hefe-Extrakt, 0,02% (w/v) Casaminoacids; pH 7,0) in 250 ml-Zweischikane- Erlenmeyerkolben 2%ig angeimpft. Diese Kulturen wurden bei 37°C und 180 rpm (Schüttler Innova 4230, New Brunswick Scientific, Edison, NY, USA) bis zum Erreichen einer OD5 6 von ca. 1,0 (späte logarhitische Wachstumsphase) angezogen.
Die erhaltene Wachstumskurve bis zum Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase ist in Figur 6 dargestellt. Man erkennt, daß alle drei Stämme hinsichtlich ihrer Verdopplungsrate praktisch gleiche Ergebnisse liefern. Ein Wechsel von einem Stamm auf den anderen geht also mit keiner detektierbaren Beeinträchtigung des Wachtums einher.
Beispiel 6
Phänotypische Charakterisierung der Δspo/V-Einzelmutante A.1 und der
Δspo/V/Δrec.A-Doppelmutante A.2: UV-Sensitivität
Im Anschluß an das vorangegangene Beispiel wurden die Zellen zu dem in Figur 6 gezeigten Zeitpunkt der logarithmischen Wachstumsphase für einen quantitativen Vergleich ihrer UV-Sensitivität jeweils mit 15 mM NaCI-Lösung bis zu einer Stufe von 10"4 verdünnt und 100 μl Aliquots der Verdünnungen auf LB-Platten ausplattiert. Mit Ausnahme von jeweils zwei LB-Platten, welche später als „Kontrollplatten" dienten, wurden die restlichen LB-Platten anschließend unterschiedlich lange mit UV-Licht der Wellenlänge 254 nm bestrahlt: die Platten wurden unter einer UV-Lampe, deren Leistung 100 μW/cm2 betrug, plaziert, nach verschiedenen Bestrahlungszeiten abgedeckt und zum Schutz vor weiterer Lichteinwirkung in Aluminiumfolie eingewickelt. Dabei entsprachen die unterschiedlichen Bestrahlungszeiten von 2 bis 60 s bei obengenannter Leistung der Lampe UV- Strahlungsintensitäten von 2 bis 60 J/m2. „Kontroll-" und „UV- Platten" wurden anschließend für 16 h bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Anhand der Koloniezahlen auf den Kontrollplatten, deren Werte einer Überlebensrate von 100% entspricht, und auf den UV-Platten wurden die prozentualen Überlebensraten in Abhängigkeit von der UV-Strahlungsintensität berechnet. Die Doppelbestimmungen aus insgesamt drei Tests (=Anzuchten) wurden gemittelt (siehe Tabelle 3) und in Form eines Kurvendiagramms dargestellt (Figur 7A). Tabelle 3: Gemittelte, prozentuale Überlebensraten der Stämme A, A.1 und A.2 in Abhängigkeit von der UV-Strahlungsintensität. Jeder Stamm wurde in drei Experimenten (=Anzuchten) untersucht. Jedes Experiment wurde durch Doppelbestimmung statistisch abgesichert. A = ß. Hcheniformis A; A.1 = ß. Hcheniformis A.1 (AspolV); A.2 = ß. Hcheniformis A.2 (AspolV, ArecA).
Für einen qualitativen Vergleich der beiden Stämme A.1 und A.2 hinsichtlich ihrer UV- Sensitivität wurden jeweils 15 μl-Aliquots aus Parallelanzuchten auf vier LB-Platten ausgestrichen. Anschließend wurden die Platten zur Hälfte mit einer Plexiglasscheibe abgedeckt (rechte Seite) und auf der anderen Hälfte (linke Seite) mit UV-Licht bestrahlt. Anschließend wurden sie ähnlich wie oben für 16 h bei 37°C im Dunkeln inkubiert.
Das mit diesem Versuch erhaltene Ergebnis ist in Figur 7B gezeigt. Man erkennt, daß die untersuchte Doppelmutante erheblich UV-sensitiver als die Einfachmutante ist. Beide Versuchsteile belegen also, daß die Deletion von recA, insbesondere in Kombination mit spolV zu unter Umwelteinflüssen in der freien Natur nicht überlebensfähigen Mutanten führt. Dieser Effekt kann wie in der Beschreibung dargestellt zur Verwendung dieser Mutanten als Sicherheitsstämme genutzt werden. Beschreibung der Figuren
Figur 1: Aminosäuresequenz-Alignment von SEQ ID NO. 2 mit denen der im Stand der Technik beschriebenen nächstähnlichen Rec-Faktoren. Dabei bedeuten: Faktor RecA aus ß. Hcheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 2) Faktor RecA aus ß. amyloliquefaciens (AJ515542 in NCBI) Faktor RecA aus ß. subtilis (Z99112 in NCBI; Region 161035 bis 162078) Faktor RecE aus ß. subtilis (X52132 in NCBI)
Figur 2: Nukleinsäuresequenz-Alignment von SEQ ID NO. 1 mit denen der im Stand der Technik beschriebenen nächstähnlichen rec-Gene. Dabei bedeuten: Gen recA aus ß. Hcheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 1) Gen recA aus ß. amyloliquefaciens (AJ515542 in NCBI) Gen recA aus ß. subtilis (Z99112 in NCBI; Region 161035 bis 162078) Gen recE aus ß. subtilis (X52132 in NCBI)
Figur 3: Schematische Darstellung der genetischen Organisationen der Wildtyp- sowie der Mutanten-Loci von spolV (A) und recA (B), einschließlich der Bindestellen für die unter SEQ ID NO. 19 bis 30 angegebenen Primer.
A Funktionelle Inaktivierung (Deletion) von spolV, das heißt Ableitung des Stamms ß. Hcheniformis A.1 aus ß. Hcheniformis A (siehe Beispiel 2).
B Funktionelle Inaktivierung (Deletion) von recA, das heißt Ableitung des Stamms ß. Hcheniformis A.2 aus ß. Hcheniformis A.1 (siehe Beispiel 2).
Figur 4: Genotypische Untersuchung der Mutantenstämme A.1 und A.2 im Vergleich mit dem Ausgangsstamm ß. Hcheniformis A mittels PCR (A) und Southern-Ana\yse (B) (siehe Beispiel 3).
Figur 5: Graphische Auftragung der Lebendzellzahlen sowie des Sporentiters der ß. licheniformis-Anz chten. Jede Kultur wurde in drei parallelen Experimenten untersucht. Jedes Experiment wurde durch Vierfachbestimung statistisch abgesichert (siehe Beispiel 4). Dabei bedeuten:
Schwarzes, ausgefülltes Quadrat: ß. Hcheniformis A; nicht-ausgefüllter Kreis: ß. Hcheniformis A.1 (AspolV); nicht-ausgefülltes Dreieck: ß. Hcheniformis A.2 (AspolV, ArecA); gestrichelte Kurven: Lebendzellzahlen durchgezogene Kurven: jeweiliger Sporentiter
Figur 6: Wachstumskurve einer Anzucht der drei ß. licheniformis-Stämme in Minimalmedium (siehe Beispiel 5).
Figur 7: Ergebnisse der UV-Tests.
A Graphische Auftragung der Überlebensraten nach UV-Bestrahlung. Jede Kultur wurde in drei parallelen Experimenten untersucht. Jedes Experiment wurde durch Doppelbestimung statistisch abgesichert (siehe Beispiel 6). Dabei bedeuten:
Schwarzes, ausgefülltes Quadrat: ß. Hcheniformis A nicht-ausgefüllter Kreis: ß. Hcheniformis A.1 (AspolV) nicht-ausgefülltes Dreieck: ß. Hcheniformis A.2 (AspolV, ArecA).
B Qualitativer UV-Test mit Ausstrichen der Stämme A.1 und A.2 auf Platten, welche während der Bestrahlung halb abgedeckt wurden.

Claims

Patentansprüche
1. Faktor RecA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96% identisch ist.
2. Faktor nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
3. Faktor RecA, codiert von einer Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.
4. Faktor nach Anspruch 3, codiert von einer Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
5. Für einen Faktor RecA codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.
6. Nukleinsäure nach Anspruch 6, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
7. Nukleinsäure nach Anspruch 5 oder 6, codierend für einen Faktor RecA nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
8. Verwendung einer für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure zur funktionellen Inaktivierung des Gens recA in einem grampositiven Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei eine für ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt wird.
10. Verwendung nach Anspruch 8, wobei eine Nukleinsäure mit einer DeleCons- oder Insertionsmutation eingesetzt wird, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs.
11. Verwendung nach Anspruch 8, wobei Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten eingesetzt werden, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassen und damit den für das Protein codierenden Bereich zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig flankieren.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11 , wobei es sich um eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7 und/oder um eine Nukleinsäure handelt, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 31 angegebenen Nukleotidsequenz in den Positionen 369 bis 1415 zu mindestens 1045, vorzugsweise mindestens 1046, ganz besonders bevorzugt 1047 dieser 1047 Positionen übereinstimmt, beziehungsweise um die zumindest teilweise nichtcodierenden flankierenden Bereiche zu diesen Nukleinsäuren.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei das grampositive Bakterium, vorzugsweise eines der Gattungen Clostridium oder Bacillus, natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist und gleichzeitig mit recA ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von ß. subtilis um eines der Gene spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von ß. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus Hcheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.
16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei die funktionelle Inaktivierung der Gene spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD oder spolV beziehungsweise den hierzu jeweils homologen Genen mithilfe der Sequenzen SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, oder 17 oder Teilen davon erfolgt, vorzugsweise mithilfe von Teilen, die mindestens 70 bis 150 zusammenhängende Nukleinsäurepositionen umfassen, besonders bevorzugt mithilfe von zwei solchen Teilen, die einen dazwischenliegenden Teil des Gens umschließen.
17. Grampositives Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem das Gen recA funktionell inaktiviert ist.
18. Grampositives Bakterium nach Anspruch 17, wobei die funktionelle Inaktivierung über Punktmutagenese, teilweise Deletion oder Insertion oder vollständige Deletion des für das vollständige Protein codierenden Bereichs erfolgt ist.
19. Grampositives Bakterium nach Anspruch 17 oder 18, wobei die funktionelle Inaktivierung über eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7 und/oder über eine Nukleinsäure erfolgt ist, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 31 angegebenen Nukleotidsequenz in den Positionen 369 bis 1415 zu mindestens 1045, vorzugsweise mindestens 1046, ganz besonders bevorzugt 1047 dieser 1047 Positionen übereinstimmt, beziehungsweise über die zumindest teilweise nichtcodierenden flankierenden Bereiche zu diesen Nukleinsäuren.
20. Grampositives Bakterium nach einem der Ansprüche 17 bis 19, vorzugsweise eines der Gattungen Clostridium oder Bacillus, das natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist und bei dem gleichzeitig mit recA ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.
21. Grampositives Bakterium nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von ß. subtilis um eines der Gene spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von ß. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus Hcheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
22. Grampositives Bakterium nach Anspruch 20 oder 21, wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.
23. Grampositives Bakterium nach Anspruch 21 oder 22, wobei die funktionelle Inaktivierung der Gene spolVA, spolVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD oder spolV beziehungsweise den hierzu jeweils homologen Genen mithilfe der Sequenzen SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, oder 17 oder Teilen davon erfolgt ist, vorzugsweise mithilfe von Teilen, die mindestens 70 bis 150 zusammenhängende Nukleinsäurepositionen umfassen, besonders bevorzugt mithilfe von zwei solchen Teilen, die einen dazwischenliegenden Teil des Gens umschließen.
24. Grampositives Bakterium nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei es sich um eines der Gattungen Clostridium oder Bacillus handelt, insbesondere um eines der Spezies Bacillus subtilis, B. Hcheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. globigii, B. clausii oder ß. lentus, und ganz besonders um einen Stamm von ß. Hcheniformis.
25. Verfahren zur Fermentation eines grampositiven Bakteriums nach einem der Ansprüche 17 bis 24.
26. Verfahren nach Anspruch 25 zur Herstellung eines Wertstoffs, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
29. Verwendung des Faktors RecA nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder eines RecA, welches mit der in SEQ ID NO. 32 angegebenen Aminosäuresequenz in mindestens 347, vorzugsweise 348 der dort gezeigten 348 Aminosäurepositionen übereinstimmt, in einem molekularbiologischen Reaktionsansatz.
30. Verwendung nach Anspruch 29 zum Stabilisieren einzelsträngiger DNA, insbesondere bei einer DNA-Polymerisation, bei in vitro erfolgenden Rekombinationsvorgängen, oder zum Überführen doppelsträngiger DNA in einzelsträngige DNA oder umgekehrt.
31. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7.
32. Vektor nach Anspruch 31 , wobei es sich um einen Expressionsvektor handelt.
33. Verfahren zur Herstellung eines Faktors RecA nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
34. Verfahren nach Anspruch 33, unter Einsatz einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7, vorzugsweise eines Expressionsvektors nach Anspruch 32, weiter bevorzugt durch Fermentation eines diese Nukleinsäure beziehungsweise diesen Expressionsvektor enthaltenden Wirts.
35. Verwendung der für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure zur Expression dieses Faktors.
36. Verwendung nach Anspruch 35, um diesen Faktor selbst herzustellen, insbesondere in einem Verfahren nach Anspruch 34, oder um molekularbiologische Aktivitäten der betreffenden Zellen zu modulieren, insbesondere bei in vivo erfolgenden Rekombinationsvorgängen.
37. Verwendung der für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7 und/oder einer für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 31 angegebenen Nukleotidsequenz in den Positionen 369 bis 1415 zu mindestens 1045, vorzugsweise mindestens 1046, besonders bevorzugt 1047 dieser 1047 Positionen übereinstimmt, zur Inaktivierung dieses Faktors oder des Gens recA in einem In-vitro- Ansatz, insbesondere über Wechselwirkung mit einer zugehörigen Nukleinsäure.
38. Eine für eine Teilsequenz von recA codierende oder für eine mit recA in vivo benachbarte Teilsequenz, vorzugsweise weniger als 1.000 bp, besonders bevorzugt weniger als 500 bp entfernt liegende Nukleinsäure gemäß einer der SEQ ID NO. 25 bis 30.
39. Verwendung mindestens einer, vorzugsweise von mindestens zwei einander entgegenorientierten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 25 bis 30 zur Amplifizierung eines in vivo davon umschlossenen DNA-Bereichs.
40. Verwendung nach Anspruch 39 zur Amplifizierung eines recAGens.
41. Verwendung nach Anspruch 39 oder 40 im Rahmen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 16.
42. Verwendung nach einem der Ansprüche 39 bis 41 zur Erzeugung eines grampositiven Bakteriums nach einem der Ansprüche 17 bis 24.
43. Eine für eine Teilsequenz von spolV codierende oder für eine mit spolV in vivo benachbarte Teilsequenz, vorzugsweise weniger als 1.000 bp, besonders bevorzugt weniger als 500 bp entfernt liegende Nukleinsäure gemäß einer der SEQ ID NO. 19 bis 24.
44. Verwendung mindestens einer, vorzugsweise von mindestens zwei einander entgegenorientierten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 25 bis 30 zur Amplifizierung eines in vivo davon umschlossenen DNA-Bereichs.
45. Verwendung nach Anspruch 44 zur Amplifizierung eines spolV-Gens.
46. Verwendung nach Anspruch 44 oder 45 im Rahmen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 13 bis 16.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 44 bis 46 zur Erzeugung eines grampositiven Bakteriums nach einem der Ansprüche 20 bis 24.
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