EP1718947A1 - Verfahren zur untersuchung einer gewebeprobe - Google Patents

Verfahren zur untersuchung einer gewebeprobe

Info

Publication number
EP1718947A1
EP1718947A1 EP05715532A EP05715532A EP1718947A1 EP 1718947 A1 EP1718947 A1 EP 1718947A1 EP 05715532 A EP05715532 A EP 05715532A EP 05715532 A EP05715532 A EP 05715532A EP 1718947 A1 EP1718947 A1 EP 1718947A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tissue
examination
sample
tissue sample
histological
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05715532A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Axel Niendorf
Klaus Bendrat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1718947A1 publication Critical patent/EP1718947A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/04—Devices for withdrawing samples in the solid state, e.g. by cutting
    • G01N1/06—Devices for withdrawing samples in the solid state, e.g. by cutting providing a thin slice, e.g. microtome
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining a tissue sample according to the preamble of claim 1.
  • a large number of diseases are based on morphologically detectable tissue changes. These diseases include benign and malignant tissue proliferation, cancer, inflammation or neurodegenerative diseases.
  • tissue samples are diagnosed using histological methods as standard to diagnose such diseases. These methods are now so well established that they offer a high level of diagnostic certainty for many diseases, and are therefore valid e.g. in tumor diagnostics as the "gold standard”.
  • Diseased tissues differ from healthy tissues in certain molecular-biologically detectable sizes, such as, for example, genomic sequences, mRNA sequences, the proteome, the methylation of the genomic DNA, the presence of viral or bacterial nucleic acids, and / or the presence of pathogenic molecules.
  • Some disease types are even characterized by characteristic gene sequence patterns, gene expression profiles or DNA methylation patterns, which can be recorded on a molecular biological basis and used to diagnose these diseases.
  • microarrays are particularly suitable for this.
  • a major problem with the molecular biological examination of a tissue sample is that the results obtained are difficult to interpret. For example, it is conceivable that a certain gene Y is typically overexpressed in a known tumor X. A pure tumor sample would immediately be noticed in the molecular biological examination due to a greatly increased gene expression value. However, if the examined sample contains only a small part of tumor tissue, the gene expression value of the total sample would only be slightly increased and it would be difficult to correctly interpret such a gene expression value. It is also conceivable that a known tumor X 'has a specific gene expression profile Y', that is to say a characteristic pattern of gene expression values of two or more genes. In this case, the contamination of the examined sample by non-tumor tissue would distort the tumor-specific gene expression profile Y 'and thus make a diagnosis impossible.
  • a frozen tissue sample is placed in a microtome, where a sequence of cuts is made.
  • One or more sections from the section sequence are stained with hematoxylin and eosin and examined histologically. The proportion of tumor cells in the individual sections is determined. If this is over 50%, corresponding cuts from the same cut sequence are used for the molecular biological examination. If the proportion of tumor cells in the section is below 50%, the entire section sequence is discarded.
  • the knowledge about the composition of the sample obtained through the preceding histological examination is therefore only used to decide whether the sample fulfills a certain exclusion criterion or not.
  • the method mentioned is used in basic research, for example to build up gene expression databases, and uses tissue with relatively large tissue samples.
  • tissue bank In the event that the sample to be examined does not meet the exclusion criterion, a new sample is taken from the tissue bank, histologically examined again for its proportion of tumor tissue and then possibly subjected to the molecular biological examination.
  • the object of the present invention is to provide a method suitable for diagnosis for examining a tissue sample for pathological tissue components and / or other relevant components and their relationship to one another, in which individual samples are subjected to a histological and a non-morphological analysis examination.
  • Demach is a method for examining a tissue sample, its genomic and / or proteomic and / or epigenomic and / or biophysical Properties essentially preserved are provided on diseased tissue.
  • sections are made from the tissue sample in the usual way, at least one of which is subjected to a histological-cytological and at least one further to a non-morphological analysis examination.
  • non-morphological analysis examination means in particular molecular biological studies.
  • molecular biological studies is used predominantly.
  • non-morphological analysis examinations are also biophysical examinations, e.g. Method for measuring the redox potential, the pH value, the temperature, the oxygen partial pressure or for the determination of metabolites such as lactate or pyruvate.
  • At least the quantitative proportion of the pathological tissue or pathological cells and / or another morphological aspect in the tissue sample is determined from the histological-cytological examination by means of an image processing system and then used as a reference variable for evaluating the results of the non-morphological analysis examination.
  • the histological-cytological examination e.g. the proportion of necrotic tissue, inflammatory cells or non-pathological connective tissue is also determined and taken into account when evaluating the results of the non-morphological analysis.
  • the quantitative proportion of the diseased tissue or diseased cells can be determined, for example, by first staining a section and then examining it using a computer-aided image processing system, in particular.
  • a computer-aided image processing system usually consists of an optical system (e.g. Microscope), an image acquisition system (e.g. CCD camera and image acquisition card), a computer and suitable software. With the help of such a system, a large number of sizes can be determined automatically and reproducibly from histological specimens in a short time.
  • At least the quantitative proportion of tumor tissue and / or another morphological aspect in the tissue sample is determined with the image acquisition system by means of the image processing system, which with appropriate histological pretreatment of the sample e.g. by counting stained cells and / or cell nuclei or integrating stained tissue areas (to name just two examples) is reliably possible.
  • the assessment is e.g. the quantitative proportion of pathological tissue in the sample is determined by counting the cell nuclei and as a reference value - e.g. in the form of a percentage - noted.
  • a reference value e.g. in the form of a percentage - noted.
  • the experimentally recorded expression pattern can now be corrected and then compared directly with the patterns stored in the database. Consequently, the gene expression pattern of such samples that have a high proportion of non-pathological tissue can also be meaningfully evaluated and interpreted diagnostically.
  • Another variant of the method according to the invention provides that a sample is taken from the tissue sample and that at least one partial sample of the sample is subjected to a histological-cytological and at least one further non-morphological analysis examination.
  • samples can also be taken from the tissue sample, at least one of which is subjected to a histological-cytological and at least one further non-morphological analysis examination. With this configuration, it is also conceivable that only partial samples of the individual samples are fed to the various examinations.
  • the quantitative proportion of the pathological tissue or pathological cells in the tissue sample or the sample is determined from the histological-cytological examination, and the quantitative proportion determined is used as the reference variable for evaluating the results of the molecular biological examination.
  • This variant differs from the aforementioned only in that one or more samples are made instead of cuts. What has been said about the aforementioned variant also applies analogously to the random samples or their subsamples.
  • Another preferred embodiment of the method provides for the sample to be taken from a tissue sample taken from a patient. With this method of ex-v / vo random sampling, the random samples or the partial samples can be taken, for example, with the aid of a drill core probe or by aspiration with a fine needle. This has the advantage that the tissue sample is not destroyed and, for example, the tumor edges remain unaffected.
  • the scratch preparation obtained in this way can be divided directly into two partial samples, one of which according to the invention can be used for histological-cytological and the other for molecular biological examination.
  • a suspension can first be produced from the scratch material obtained, which is then only divided into two partial samples. The latter method ensures a better randomization of the composition of the individual subsamples.
  • the scraping material is first washed and centrifuged, the pellet obtained is resuspended and then in a centrifuge again with a density gradient. At least one of the fractions obtained in this way is then divided, and according to the invention a partial sample is then fed to the histological-cytological and the other to the non-morphological analysis examination.
  • the scraping material can also be processed using any other suitable enrichment and / or fractionation technique.
  • the non-malignant tissue remains on the cut surface of the tissue sample treated by means of the scratching technique while largely preserving its tissue structure, while the areas in which the tumor cell aggregates were previously located are missing and are therefore recognizable as depressions in the supervision.
  • the tissue sample can now e.g. be cut in a conventional manner with a microtome.
  • the first cut corresponds to the cut sequence of the cut surface of the tissue sample that has been removed by the scratch preparation.
  • This cut can e.g. are examined histologically for remaining tumor cell aggregates and thus provide information about the success of the sampling.
  • the cut can thus serve as a negative control for the assessment of the examination results of the scratch sample.
  • sections of the section sequence consist both of non-malignant tissue and of tumor tissue and, as already described, can therefore, according to the invention, be subjected to a histological-cytological and, on the other hand, a non-morphological analysis examination. It is particularly promising to compare the histological, cytological and molecular biological results obtained with those of the scratch preparation.
  • At least two cuts or random samples eg core samples, fine needle aspirates, scratch preparations
  • at least two partial samples of a random sample are taken from a tissue sample. sample prepared and a histological-cytological or a non-morphological analysis examination.
  • the histological-cytological examination determines at least the quantitative proportion of the pathological tissue or Icranky cells in the tissue sample or the sample and then uses this as a reference for the evaluation of the results of the non-morphological analysis examination.
  • the individual cuts, samples and their subsamples are summarized below where it makes sense under the term "subsamples”.
  • both cuts and e.g. Core samples are made.
  • the sections could be used for the histological-cytological examination and the core samples taken from the same sample could be subjected to a molecular biological examination.
  • both cuts and scratch preparations are produced from a tissue sample in one process.
  • Embodiments in which different types of obtaining sections, random samples or their partial samples are combined with one another are therefore expressly also to be covered by the present invention.
  • An important aspect of the invention is that, in the histological-cytological examination, in addition to the quantitative part, the appearance and / or the distribution pattern of the diseased tissue or Icranky cells or other components in the tissue sample is also determined and the results of the non- morphological analysis examination can be used as a basis.
  • Conceivable parameters in this context by the image acquisition system in addition to the cell numbers or areas already mentioned can be determined, for example, the distance of stained cells and cell nuclei to one another or to other structures, in particular, for example, blood vessels, or the appearance of individual cells (outer contour) etc., to name just a few examples.
  • all suitable and morphological parameters can be determined that are suitable for the additional qualification or quantification of pathological cells or tissues.
  • an appearance that manifests itself in numerous outgrowths of a tumor into the surrounding tissue an indication of an increased malignancy of the tumor.
  • Another tumor whose molecular biological characteristics are similar to that of the first tumor, but which has a different appearance, can be less malignant. In such a case, the appearance would provide important clues for the interpretation of the results of the molecular biological investigation. The same applies to the distribution pattern of the pathological tissue or cells in the tissue sample.
  • the cuts or the random samples are made directly from the fresh tissue sample. This procedure ensures that the genomic, proteomic and / or epigenomic properties of the sample are best preserved.
  • cuts e.g. a vibratome is used.
  • the tissue sample is frozen before the cuts or the random samples are made. This procedure also ensures the preservation of the genomic, proteomic and / or epigenomic properties. shade the sample.
  • a micro- or a cryotome can be used to produce sections.
  • tissue sample may be preserved before the cuts are made or before the samples are taken and then embedded in a suitable medium.
  • a suitable medium can e.g. Paraffin or other suitable embedding medium.
  • Sections can be obtained in the usual way with a microtome. It is again important that the genomic, proteomic and / or epigenomic properties of the sample are preserved.
  • a fine needle aspirate or a scratch sample is first taken from a fresh tissue sample and subjected to a molecular biological analysis.
  • the tissue sample could then be frozen and then sections made on the cryotome for histological-cytological examination.
  • Embodiments in which different types of pretreatment or the preservation of the tissue sample are combined with one another should therefore also be expressly covered by the present invention.
  • the general rule is that all the steps described above must be selected so that they do not impair the nucleic acids (DNA, mRNA), proteins and / or the epigenomic methylation pattern, or impair them as little as possible.
  • a particularly preferred embodiment of the method according to the invention can be usefully used in clinical diagnostics.
  • the tissue sample to be diagnosed which is taken from the patient, is routinely taken as quickly as possible to a pathological laboratory and there to two samples are split, the second sample being fixed and embedded for later, in-depth histological-cytological assessment, while the first sample is applied directly to a support, frozen and cut on the microtome ("quick cut"). Individual sections are then stained histologically and immediately examined by a pathologist who informs the treating doctor of his diagnosis.
  • the preferred embodiment provides that the tissue sample which has been applied to a carrier and frozen immediately after removal from a patient is cut with a microtome, and that, in addition to the cuts which are fed to the histological-cytological examination, other cuts of the same cutting sequence are not -morphological analysis examination.
  • the pathologist can therefore base his diagnosis on molecular biological findings and thus increase the reliability of the diagnosis - a point that is of great importance especially in intraoperative diagnosis.
  • a major advantage of this additional procedural step is that it can be seamlessly integrated into the routine diagnostic procedure without wasting time.
  • a suitable molecular biological examination method such as an array-based mRNA analysis
  • examination results can be obtained in a relatively short time, which can even be forwarded to the treating doctor at the same time as the histological findings.
  • this additional process step the profitable material that is already generated during the quick cut is used profitably.
  • the tissue sample remains on the carrier after the cuts have been made, so that it is available for making new cuts. If a cryotome is used and the procedure is quick, it is ensured that the tissue sample remains frozen during the entire process and can be stored in the freezer again without any significant influence on the temperature. It can also be provided that the sample takes on temperature before or during the cutting and is then frozen again.
  • tissue sample has been preserved in another way, e.g., as already described, by embedding it in a suitable medium, it can of course also be provided that it remains on the carrier after the cuts have been made and is available for the new cuts to be made. In this case, freezing in the meantime is not necessary.
  • the carrier to which the tissue sample is applied is designed in such a way that it can be introduced into the microtome in a reproducible manner, so that the tissue sample has the same relative orientation to the microtome each time sections are made. This ensures that the later re-examined sample largely corresponds to the previous sample and so the histological-cytological and / or molecular biological findings can be compared directly with each other.
  • a sample is usually stained and / or fixed, with the genomic, proteomic and / or epigenomic properties of the sample being impaired. Conversely, a sample is usually homogenized during preparation for molecular biology. All topological information of the sample is lost. The preparation of a tissue sample for one examination makes the sample unusable for the other examination. Different partial samples must therefore be used for the two tests.
  • the partial samples are e.g. two immediately adjacent cuts from a Mil rotom cut sequence can generally be assumed to have essentially the same composition. This assumption is also generally accepted in pathological circles.
  • the composition of the partial samples differ from one another, for example that the tumor tissue in the histological-cytological examined partial sample has a different quantitative proportion than in the molecular biologically examined subsample. This is the case, for example, when the sequence of cuts covers an area of the tumor edge that runs parallel to the cutting plane.
  • a quantitative reference quantity averaged over the histologically-cytologically examined sub-sample would consequently mirror an incorrect tumor tissue portion in the molecular-biologically examined sub-sample and thus lead to an incorrect correction of the experimentally recorded expression pattern.
  • the tumor tissue in the histologically-cytologically examined sub-sample has a different appearance or a different distribution pattern than in the molecular-biologically examined sub-sample.
  • At least two sections are supplied to the histological-cytological examination, these being selected such that it is ensured that the section or sections supplied to the non-morphological analysis examination are in situ between these sections were arranged.
  • the number of cuts used for this is e.g. according to the amount of mRNA required for the analysis.
  • the tissue-specific composition of two flanking sections and, on the other hand, the molecular biological characteristics of one or more sections are known that were arranged between the flanking sections in the original tissue sample.
  • the quantitative proportion, the appearance and / or the distribution pattern of the abnormal tissue or pathological cells in the section or sections examined by molecular biology can thus be determined reliably. For example, if one flanking section has a tumor tissue fraction of 20% and the other flanking section has a tumor tissue fraction of 80%, the pathologist can assume that the tumor tissue fraction in the sections examined in molecular biology, which were in situ between the flanking sections, in the range between 20 and 80%.
  • the average proportion of tumor tissue in the sections examined by molecular biology can also be determined or calculated from the tumor tissue parts of the flanking sections.
  • a reference quantity can also be determined in these cases, with which, for example, the experimentally acquired gene expression pattern can be corrected and then compared directly with the patterns contained in the databases.
  • the partial samples i.e. random samples or their partial samples
  • the method is used in intraoperative clinical-pathological diagnostics.
  • the method can also be used in periopertive diagnostics, i.e. before or shortly after an operation.
  • a method for the detection of genomic DNA, cDNA, mRNA, the epigenomic methylation pattern, proteins, viral or bacterial nucleic acids or other biomolecules is used in the non-morphological analysis examination.
  • Biophysical methods such as e.g. Methods for measuring the redox potential, the pH, the temperature, the oxygen partial pressure or for the determination of metabolites such as lactate or pyruvate can be used.
  • the detection of genomic DNA can, for example, reveal somatic mutations that can be correlated with various tissue diseases.
  • the detection of cDNA, mRNA or proteins can provide information about a disease-specific gene expression pattern.
  • the detection of the epigenomic methylation pattern may provide evidence of a disease-specific gene activation pattern.
  • the detection of viral nucleic acids can, for example, provide information about virus-related tissue proliferation, while the detection of bacterial nucleic acids, for example, can enable the diagnosis of tissue changes caused by bacteria.
  • Other biomolecules, such as infectious prions can indicate a prion-induced tissue change.
  • Other biomolecules can be, for example, nucleic acids or proteins from pathogenic parasites.
  • a size is recorded in the context of the non-morphological analysis examination that makes it possible to determine the proportion of pathological tissue and / or other tissue components in the tissue sample, and that in this way determined proportion is also used quantitatively to evaluate the results of the molecular biological analysis.
  • Such a size can e.g. is the expression level of a gene which is known to be expressed only in healthy tissue, but not in tumor tissue, and which is also known to be the normal expression level.
  • the measure of expression of this gene in the sub-sample examined in terms of molecular biology provides a quantity by means of which one can estimate how high the proportion of non-pathological or pathological tissue in the sample is.
  • Such sizes are known in the literature, among others. known as a "surrogate marker".
  • the determination of the degree of expression of this gene can thus be used in addition to the knowledge of the tissue composition obtained by the histological-cytological examination of the evaluation of the results of the molecular biological examination. The results of the histological-cytological examination can therefore be verified by determining a surrogate marker.
  • such a size can also be a gene expression pattern typical of healthy tissue or an expression ratio known for a specific tumor variant between a tumor-specific gene and a gene which is constantly expressed in healthy as well as in erectile tissue ("housekeeping gene").
  • the method according to the invention also makes it possible to detect possible surrogate markers or to validate their meaningfulness.
  • Microarrays can e.g. are chips on the surface of which molecular probes are immobilized in a matrix-like arrangement (e.g. antibodies, oligonucleotides or polypeptides), whereby the analytes bind to these probes due to hybridization or immunological reactions and can be detected with a scanner.
  • a matrix-like arrangement e.g. antibodies, oligonucleotides or polypeptides
  • Suspension arrays can e.g. are latex balls ("microbeads") on the surface of which molecular probes are immobilized (e.g. antibodies, oligonucleotides or polypeptides), whereby the analytes bind to these probes due to hybridization or immunological reactions and can be detected with a particle counter.
  • molecular probes e.g. antibodies, oligonucleotides or polypeptides
  • microarrays and suspension arrays are suitable both for the detection of nucleotides and for the detection of peptides or proteins.
  • the biomolecules to be detected are subjected to a labeling step and / or the nucleic acids to be detected are subjected to an amplification step.
  • the labeling step can consist, for example, in that the mRNA molecules present in the partial sample are transcribed into labeled cRNA molecules with the aid of a T7 RNA polymerase and Cy3-labeled ribonucleotides.
  • Another example of a labeling step is the labeling of proteins present in the partial sample using fluorescence-labeled antibodies or oligonucleotides. kleotide.
  • other marking steps known according to the current or future state of the art are also conceivable.
  • the amplification step can e.g. consist of a PCR, an rtPCR or another amplification method according to the current or future state of the art.
  • the histological-cytological examination comprises at least one staining step and / or at least one immunohistochemical step and / or t 1 -_./ Yw hybridization step. It can be provided that several sections or core samples are each subjected to different histological-cytological or immunohistochemical examinations in order to record a larger number of parameters. For example, a partial sample is stained with hematoxylin and eosin in order to visualize and quantify the cell nuclei and the frequency of mitoses, while a second partial sample with a tumor-specific antibody (e.g. anti-S-100 against malignant melanoma) and a third partial sample e.g. can be treated by in situ hybridization.
  • a tumor-specific antibody e.g. anti-S-100 against malignant melanoma
  • a method according to one of the preceding claims is used to set up a tumor database, to develop individualized cancer therapies, to adjust a patient to individualized cancer therapy and / or to answer scientific questions.
  • Two tumors of the same type are macroscopically assessed and prepared in a rapid section examination and then frozen on a suitable support, embedded in medium in a freezing microtome.
  • Tumor parenchyma Tumor stroma Tumor A 80% 20% Tumor B 50% 50% Table 1: histologically determined tissue composition of the two tumors
  • the second, third and fourth section (each with a thickness of 30 ⁇ m) is recorded in a reaction vessel with RNA-later in order to preserve the integrity of the mRNA.
  • RNA-later After total RNA extraction with a commercial kit (eg RNeasy from Qiagen), the poly-A RNA is selectively amplified (Wang et al. Nature Biotechnology, April 2001), whereby one or two rounds of amplification can be carried out as required.
  • the amplified RNA or cDNA is prepared and can be analyzed by hybridization on a DNA microarray. In this way, all mRNA molecules present in the examined tissue are determined quantitatively.
  • a quantitative gene expression profile is thus obtained, which can be compared with standard gene expression profiles of different tissue and tumor types, in order to determine the diagnosed tumor more precisely.
  • standard gene expression profiles for a large number of tumor and tissue types are currently being determined in various laboratories worldwide.
  • genes A-1 were examined.
  • the following gene expression profiles (given in arbitrary units) were obtained for the two tumors examined:
  • a comparison of the normalized gene expression profiles with the standard gene expression profiles shows that tumor A is subtype 2 of cancer X, while tumor B is subtype 1 of cancer X.
  • the differentiation of the two tumors is possible solely through the array analysis and the subsequent normalization of the gene expression profiles.
  • the histological examination only enables the tumor to be identified as carcinoma X, but not the differentiation into the subtypes described.

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Quality & Reliability (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Description

Verfahren zur Untersuchung einer Gewebeprobe
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer Gewebeprobe gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Eine Vielzahl von Erkrankungen beruht auf morphologisch erfassbaren Gewebs- veränderungen. Zu diesen Erkrankungen zählen unter anderem gut- und bösartige Gewebeproliferationen, Krebserkrankungen, Entzündungen oder neurodegenera- tive Erkrankungen.
In vielen Fällen werden zur Diagnose solcher Krankheiten Gewebeproben standardmäßig mit histologischen Methoden untersucht. Diese Methoden sind inzwischen so gut etabliert, daß sie für viele Krankheiten eine hohe Diagnosesicherheit bieten, und gelten daher z.B. in der Tumordiagnostik als "Goldstandard".
Sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der klinischen Diagnostik spielt inzwischen jedoch die molekularbiologische Charakterisierung von Erkrankungen eine immer wichtiger werdende Rolle. Erkrankte Gewebe unterscheiden sich von gesunden Geweben in bestimmten molekularbiologisch erfaßbaren Größen, wie z.B. genomischen Sequenzen, mRNA- Sequenzen, dem Proteom, der Methy- lierung der genomischen DNA, der Anwesenheit viraler oder bakterieller Nukleinsäuren, und/oder der Anwesenheit pathogener Moleküle. Einige Krankheitstypen zeichnen sich sogar durch charakteristische Gensequenzmuster, Genexpressionsprofile oder DNA-Methylierungsmuster aus, die molekularbiologisch erfasst und zur Diagnose dieser Krankheiten herangezogen werden können. Viele Krankheiten, so z.B. Varianten verschiedener Tumortypen, die sich häufig in ihrer Virulenz bzw. ihrer Therapierbarkeit wesentlich voneinander unterscheiden, werden durch eine solche Herangehensweise überhaupt erst diagnostizierbar, da sie sich im histologischen Schnitt nicht differenzieren lassen. Die molekularbiologische Charakterisierung ist daher ein vielversprechender Ansatz, um Gewebeerkrankungen genauer zu diagnostizieren und gegebenenfalls individualisierte Therapien zu ermöglichen. Hierzu eignen sich im besonderen die in jüngerer Zeit entwickelten molekularbiologischen Methoden der Hoch- Durchsatz-Analytik mit Nukleinsäure- oder Proteinarrays ("Mikroarrays").
Die Vorteile einer molekularen Herangehensweise in der Gewebediagnostik sind in der Schrift "Microarray and histopathological analysis of tumors: The future and the past ?" von S.R. Lahkani und A. Ashworth (Nature Reviews 2001, 151) skizziert.
Wesentliches Problem bei der molekularbiologischen Untersuchung einer Gewebeprobe ist, daß die erhaltenen Ergebnisse schwer zu interpretieren sind. Es ist z.B. denkbar, daß in einem bekannten Tumor X ein bestimmtes Gen Y typischer Weise überexprimiert wird. Eine reine Tumorprobe würde bei der molekularbiologischen Untersuchung sofort durch einen stark erhöhten Genexpressionswert auffallen. Wenn die untersuchte Probe jedoch nur zu einem geringen Teil Tumorgewebe enthält, wäre der Genexpressionswert der Gesamtprobe lediglich gering erhöht und es wäre schwierig, einen solchen Genexpressionswert korrekt zu interpretieren. Es ist auch denkbar, daß ein bekannter Tumor X' ein bestimmtes Genexpressionsprofil Y' aufweist, also ein charakteristisches Muster von Genexpressionswerten zweier oder mehrerer Gene. In diesem Fall würde die Verunreinigung der untersuchten Probe durch Nicht-Tumorgewebe das tumorspezifische Genexpres- sionsprofil Y' verzerren und damit eine Diagnose unmöglich machen.
Aus der Schrift "A Gene-Expression Signature as a Predictor of Survival in Breast Cancer" von de Vijver et al. (The New England Journal of Medicine 2002, Vol. 347, 1999) ist ein Verfahren zur Untersuchung einer Gewebeprobe auf krankhafte Gewebeanteile bekannt, bei dem aus der Gewebeprobe Schnitte hergestellt werden, von denen mindestens einer einer histologischen und mindestens ein weiterer einer nicht-morphologischen Analyseuntersuchung, nämlich einer molekularbiologischen Mikroarray- Analyse, unterzogen werden.
Dabei wird eine eingefrorene Gewebeprobe in ein Mikrotom gebracht, wo eine Schnittfolge hergestellt wird. Ein oder mehrere Schnitte aus der Schnittfolge werden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und histologisch begutachtet. Dabei wird der Anteil der Tumorzellen in den einzelnen Schnitten bestimmt. Liegt dieser über 50 %, so werden korrespondierende Schnitte aus derselben Schnittfolge für die molekularbiologische Untersuchung verwendet. Liegt der Anteil der Tumorzellen in dem Schnitt unter 50 %, so wird die gesamte Schnittfolge verworfen.
Das über die vorgeschaltete histologische Untersuchung gewonnene Wissen über die Zusammensetzung der Probe wird also lediglich dafür verwendet, zu entscheiden, ob die Probe ein bestimmtes Ausschlußkriterium erfüllt oder nicht.
Das erwähnte Verfahren kommt in der Grundlagenforschung zum Einsatz, z.B. zum Aufbau von Genexpressionsdatenbanken, und greift dazu auf Gewebeban- ken mit relativ großen Gewebeproben zurück. Im Fall, dass die zu untersuchende Probe das Ausschlußkriterium nicht erfüllt, wird eine neue Probe aus der Gewebebank genommen, erneut histologisch auf ihren Anteil an Tumorgewebe untersucht wird und dann gegebenenfalls der molekularbiologischen Untersuchung zugeführt.
In der klinischen Diagnostik dagegen, wo häufig nur wenig Probenmaterial eines individuellen Patienten zur Verfügung steht und es in der Regel - insbesondere bei der intra und perioperativen Diagnostik - auf ein scruαelles Untersuchungsergebnis ankommt, ist dieses Vorgehen nicht praktizierbar. Würde sich bei der histologischen Voruntersuchung einer patientenspezifischen Probe nämlich heraus stellen, dass der Anteil an Tumorzellen zu gering ist und die Probe somit das Ausschlußkriterium nicht erfüllt, müßte auf die molelcularbiologische Analyse völlig verzichtet werden, da das zur Verfügung stehende Probenmaterial bereits verbraucht und/oder keine Zeit mehr vorhanden wäre, eine neue Probe zu entnehmen bzw. zu untersuchen. Die beschriebene Methode würde in der klinischen Diagnostik also nicht bei allen Gewebeproben zusätzlich zu der histologischen Untersuchung auch eine molekularbiologische Untersuchung ermöglichen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein für die E iagnose geeignetes Verfahren zur Untersuchung einer Gewebeprobe auf krankhafte Gewebeanteile und/oder weitere relevante Komponenten sowie deren B eziehung zueinander bereitzustellen, bei dem einzelne Proben einer histologischen und einer nicht- morphologischen Analyseuntersuchung unterzogen werden.
Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen der Ansprüche 1 und 2 gelöst.
Demach ist ein Verfahren zur Untersuchung einer Gewebeprobe, deren genomische und/oder proteomische und/oder epigenomische und/oder biophysikalische Eigenschaften im wesentlichen erhalten sind, auf krankhafte Gewebeanteile vorgesehen. Wie in bekannten Verfahren werden dabei aus der Gewebeprobe in üblicher Weise Schnitte hergestellt, von denen mindestens einer einer histologisch- zytologischen und mindestens ein weiterer einer nicht-morphologischen Analyseuntersuchung Untersuchung unterzogen werden.
Unter dem Begriff "nicht-morphologische Analyseuntersuchung" werden im folgenden insbesondere molekularbiologische Untersuchungen verstanden. Dabei wird überwiegend der Begriff "molekularbiologische Untersuchungen" verwendet. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind nicht-morphologische Analyseuntersuchungen jedoch auch biophysikalische Untersuchungen, wie z.B. Verfahren zur Messung des Redoxpotentials, des pH- Werts, der Temperatur, des Sauerstoffpartialdrucks oder zur Bestimmung von Metaboliten wie Lactat oder Pyruvat.
Aus der histologisch-zytologischen Untersuchung wird erfindungsgemäß mindestens der quantitative Anteil des krankhaften Gewebes bzw. krankhafter Zellen und/oder ein anderer morphologischer Aspekt in der Gewebeprobe mittels eines Bildverarbeitungssystems ermittelt und dann als Bezugsgröße der Auswertung der Ergebnisse der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugrunde gelegt. Während der histologisch-zytologischen Untersuchung kann z.B. auch der Anteil von nekrotischem Gewebe, Entzündungszellen oder nicht-krankhaftem Bindegewebe bestimmt und bei der Auswertung der Ergebnisse der nichtmorphologischen Analyseuntersuchung berücksichtigt werden.
Die Bestimmung des quantitativen Anteils des krankliaften Gewebes bzw. krankhafter Zellen kann z.B. erfolgen, indem ein Schnitt zunächst gefärbt und dann mithilfe eines insbesondere computergestützten Bildverarbeitungssystems begutachtet wird. Ein solches System besteht i.d.R. aus einem optischen System (z.B. Mikroskop), einem Bilderfassungssystem (z.B. CCD-Kamera und Bilderfassungskarte), einem Computer sowie einer geeigneten Software. Mit Hilfe eines solchen Systems lassen sich aus histologischen Präparaten automatisiert und reproduzierbar in kurzer Zeit eine Vielzahl von Größen ermitteln.
Mit dem Bilderfassungssystem wird erfindungsgemäß mindestens der quantitative Tumorgewebsanteil und/oder ein anderer morphologischer Aspekt in der Gewebeprobe mittels des Bildverarbeitungssystems ermittelt, was bei entsprechender histologischer Vorbehandlung der Probe z.B. durch Auszählen von gefärbten Zellen und/Zellkernen bzw. Integration von gefärbten Gewebebereichen (um nur zwei Beispiele zu nennen) zuverlässig möglich ist.
Damit läßt sich z.B. die Bezugsgröße ermitteln, mit der ein experimentell erfass- tes Genexpressionsmuster korrigiert werden kann, um es mit den in entprechen- den Datenbanken gespeicherten Mustern zu vergleichen.
Bei der Begutachtung wird wie oben gesagt z.B. durch Auszählung der Zellkerne der quantitative Anteil an krankhaftem Gewebe in der Probe ermittelt und als Bezugsgröße - z.B. in Form einer Prozentzahl - notiert. Bei der molekularbiologischen Untersuchung eines weiteren Schnitts wird dann z.B. das Expressionsmuster von 10 lσankheitstypischen Genen quantitativ erfasst.
Um das erfasste Expressionsmuster zu interpretieren, muß dieses mit einer Datenbank verglichen werden, in der bekannte standardisierte Expressionsmuster einer Mehrzahl von Krankheiten gespeichert sind. Solche Standard- Genexpressionsprofile werden zur Zeit in verschiedenen Labors weltweit für eine Vielzahl von Tumor- und Gewebsarten ermittelt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann hierzu, wie weiter unten beschrieben, einen Beitrag leisten. Standardisierte Expressionsmuster sind jedoch nicht unmittelbar mit dem experimentell erfassten Expressionsmuster vergleichbar, da sie sich auf standardisierte Proben beziehen, die z.B. ausschließlich krankhaftes Gewebe enthalten haben.
Mit Hilfe der zuvor ermittelten Bezugsgröße kann nun das experimentell erfasste Expressionsmuster korrigiert und dann unmittelbar mit den in der Datenbank gespeicherten Mustern verglichen werden. Folglich kann auch das Genexpressionsmuster von solchen Proben, die einen hohen Anteil an nicht krankhaftem Gewebe aufweisen, sinnvoll ausgewertet und diagnostisch interpretiert werden.
In einer anderen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass aus der Gewebeprobe eine Stichprobe entnommen wird, und mindestens eine Teilprobe der Stichprobe einer histologisch-zytologischen und mindestens eine weitere einer nicht-morphologischen Analyseuntersuchung unterzogen wird. Ebensogut können der Gewebeprobe mehrere Stichproben entnommen werden, wobei mindestens eine davon einer histologisch-zytologischen und mindestens eine weitere einer nicht-morphologischen Analyseuntersuchung unterzogen wird. Bei dieser Ausgestaltung ist ebenfalls denkbar, dass nur Teilproben der einzelnen Stichproben den verschiedenen Untersuchungen zugeführt werden.
Dabei wird ebenfalls aus der histologisch-zytologischen Untersuchung mindestens der quantitative Anteil des krankhaften Gewebes bzw. krankhafter Zellen in der Gewebeprobe oder der Stichprobe ermittelt, und der ermittelte quantitative Anteil als Bezugsgröße der Auswertung der Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchung zugrunde gelegt. Diese Variante unterscheidet sich von der vorgenannten also lediglich dadurch, dass anstelle von Schnitten eine oder mehrere Stichproben angefertigt werden. Das zu der vorgenannten Variante Gesagte gilt also analog auch für die Stichproben bzw. deren Teilproben. In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens ist vorgesehen, dass die Stichprobe einer einem Patienten entnommenen Gewebeprobe entnommen wird. Bei diesem Verfahren der ex-v/vo-Stichprobe können die Stichproben bzw. die Teilproben z.B. mit Hilfe einer Bohrkemsonde oder durch Aspiration mit einer Feinnadel entnommen werden. Dies hat den Vorteil, daß die Gewebeprobe nicht zerstört wird und z.B. die Tumorränder unbeeinträchtigt bleiben.
Ebenso ist es möglich, die ex-vz'vo-Stichprobe bzw. die Teilproben mit Hilfe der sogenannten Kratzprobentechnik zu gewinnen. Diese Technik ist unter dem Begriff "Epithelial Aggregate Separation and Isolation" bekamit. Dabei wird z.B. ein angekanteter Objektträger mit leichtem Druck über die Schnittfläche einer entnommenen und durchgeschnittenen Gewebeprobe geführt. Bei festeren Geweben kann auch die Klinge eines Skalpells oder eines anderen geeigneten Instruments über die Oberfläche geführt werden. Tumorzellaggregate, die im Gegensatz zu dem umgebenden nicht-malignen Gewebe in Inseln organisiert sind und leicht aus der Schnittfläche herausragen, werden dabei gezielt auf dem Objektträger bzw. der Skalpellklinge angereichert.
Das dergestalt erhaltene Kratzpräparat kann direkt in zwei Teilproben aufgeteilt werden, von denen erfindungsgemäß die eine der histologisch-zytologischen und die andere der molekularbiologischen Untersuchung zugeführt werden kann. Aus dem erhaltenen Kratzmaterial kann aber auch zunächst eine Suspension hergestellt werden, die erst dann in zwei Teilproben aufgeteilt wird. Bei dem letzteren Verfahren ist eine bessere Randomisierung der Zusammensetzung der einzelnen Teilproben gewährleistet.
Ebenso kann jedoch vorgesehen sein, das Kratzmaterial zunächst zu waschen und zu zentrifugieren, das erhaltene Pellet zu resuspendieren und anschließend in ei- nem Dichtegradienten erneut zu zentrifugieren. Mindestens eine der dabei erhaltenen Fraktionen wird dann aufgeteilt, und erfindungsgemäß wird dann eine Teilprobe der histologisch-zytologischen und die andere der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugeführt. Das Kratzmaterial kann jedoch auch mit jeder anderen geeigneten Anreicherungs- und/oder Fraktionierungstechnik aufbereitet werden.
Auf der Schnittfläche der mittels Kratztechnik behandelten Gewebeprobe bleibt das nicht-maligne Gewebe unter weitestgehender Bewahrung seiner Ge- websstruktur zurück, während die Bereiche, in denen zuvor die Tumorzellaggregate angesiedelt waren, fehlen und damit in der Aufsicht als Vertiefungen erkennbar sind. Die Gewebeprobe kann nun z.B. in herkömmlicher Weise mit einem Mikrotom geschnitten werden. Dabei entspricht der erste Schnitt der Schnittfolge der durch die Kratzpraparation entreicherten Schnittfläche der Gewebeprobe. Dieser Schnitt kann z.B. histologisch auf verbliebene Tumorzellaggregate untersucht werden und gibt damit Auskunft über den Erfolg der Probenahme. Der Schnitt kann so als Negativkontrolle für die Beurteilung der Untersuchungsergebnisse der Kratzprobe dienen.
Weitere Schnitte der Schnittfolge bestehen dagegen sowohl aus nicht-malignem Gewebe als auch aus Tumorgewebe und können daher, wie bereits beschrieben, erfindungsgemäß einerseits einer histologisch-zytologischen und andererseits einer nicht-morphologischen Analyseuntersuchung unterzogen werden. Dabei ist es besonders erfolgversprechend, die erhaltenen histologisch-zytologischen und molekularbiologischen Ergebnisse mit denen des Kratzpräparats abzugleichen.
Wesentlich bei all den beschriebenen Verfahren ist es durchweg, dass von einer Gewebeprobe mindestens zwei Schnitte oder Stichproben (z.B. Bohrkernproben, Feinnadelaspirate, Kratzpräparate) bzw. mindestens zwei Teilproben einer Stich- probe hergestellt und einer histologisch-zytologischen bzw. einer nichtmorphologischen Analyseuntersuchung zugeführt werden.
Weiterhin ist es durchweg wesentlich, dass aus der histologisch-zytologischen Untersuchung mindestens der quantitative Anteil des krankhaften Gewebes bzw. Icrankhafter Zellen in der Gewebeprobe oder der Stichprobe ermittelt wird und dann als Bezugsgröße der Auswertung der Ergebnisse der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugrunde gelegt wird. Die einzelnen Schnitte, Stichproben bzw. deren Teilproben werden im folgenden da, wo es sinnvoll ist, unter dem Begriff "Teilproben" zusammengefaßt.
Es ist natürlich denkbar, dass in einem Verfahren aus einer Gewebeprobe sowohl Schnitte als auch z.B. Bohrkernproben angefertigt werden. So könnten die Schnitte der histologisch-zytologischen Untersuchung zugeführt und die aus der selben Probe entnommenen Bohrkernproben einer molekularbiologischen Untersuchung unterzogen werden. Ebensogut ist es denkbar, dass, wie bereits beschrieben, in einem Verfahren aus einer Gewebeprobe sowohl Schnitte als auch Kratzpäparate hergestellt werden. Ausgestaltungen, bei denen verschiedene Arten der Gewinnung von Schnitten, Stichproben bzw. deren Teilproben miteinander kombiniert werden, sollen daher ausdrücklich ebenfalls von der vorliegenden Erfindung abgedeckt werden.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist,, dass bei der histologisch-zytologischen Untersuchung neben dem quantitativen Anteil zusätzlich das Erscheinungsbild und/oder das Verteilungsmuster des krankhaften Gewebes bzw. Icrankhafter Zellen bzw. weiterer Komponenten in der Gewebeprobe ermittelt und der Auswertung der Ergebnisse der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugrundegelegt werden kann. Denkbare Parameter, die in diesem Zusammenhang durch das Bilderfassungssystems neben den bereits erwähnten Zellzahlen bzw Flächen ermittelt werden könnnen, sind z.B. der Abstand von gefärbten Zellen und Zellkernen zueinander bzw. zu anderen Strukturen, insbesondere z.B. Blutgefäße, bzw das Erscheinungsbild einzelner Zellen (Außenkontur) etc., um nur einige Beispiele zu nennen. Grundsätzlich können alle geeigneten und morphologisch Parameter ermittelt werden, die für die ergänzende Qualifizierung bzw. Quantifizierung von krankhaften Zellen bzw Gewebe geeignet sind.
So kann z.B. ein Erscheinungsbild, das sich in zahlreichen Auswachsungen eines Tumors in das umgebende Gewebe darstellt, ein Hinweis auf eine erhöhte Mali- ginität des Tumors sein. Ein anderer Tumor, dessen molekularbiologische Charakteristik der des ersten Tumors ähnlich ist, der aber ein anderes Erscheinungsbild aufweist, kann dagegen weniger maligne sein. Das Erscheinungsbild würde in einem solchen Fall also wichtige Anhaltspunkte für die Interpretation der Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchung liefern. Ähnliches gilt für das Verteilungsmuster des krankhaften Gewebes bzw. krankhafter Zellen in der Gewebeprobe.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Schnitte bzw. die Stichproben direkt aus der frischen Gewebeprobe hergestellt werden. Dieses Vorgehen gewährleistet, dass die genomischen, proteomischen und/oder epigenomischen Eigenschaften der Probe bestmöglich erhalten sind. Für die Herstellung von Schnitten kann dabei z.B. ein Vibratom zum Einsatz kommen.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Gewebeprobe vor Herstellung der Schnitte bzw. der Stichproben eingefroren wird. Auch dieses Vorgehen gewährleistet die Erhaltung der genomischen, proteomischen und/oder epigenomischen Eigen- schatten der Probe. Für die Herstellung von Schnitten kann dabei z.B. ein Mikro- oder ein Kryotom verwendet werden.
Es ist jedoch auch denkbar, dass die Gewebeprobe vor Herstellung der Schnitte bzw. vor Entnahme der Stichproben gegebenenfalls konserviert und dann in einem geeigneten Medium eingebettet wird. Ein solches Medium kann z.B. Paraffin oder ein anderes geeignetes Einbettungsmedium sein. In diesem Fall können z.B. Schnitte in üblicher Weise mit einem Mikrotom gewonnen werden. Wichtig dabei ist wiederum, dass die genomischen, proteomischen und/oder epigenomischen Eigenschaften der Probe erhalten bleiben.
Natürlich kann z.B. auch vorgesehen sein, dass von einer frischen Gewebeprobe zunächst ein Feinnadelaspirat oder eine Kratzprobe entnommen und einer molekularbiologischen Untersuchung unterzogen wird. Anschließend könnte die Gewebeprobe eingefroren werden und dann am Kryotom Schnitte angefertigt werden, die der histologisch-zytologischen Untersuchung zugeführt werden. Ausgestaltungen, bei denen verschiedene Arten der Vorbehandlung bzw. der Konservierung der Gewebeprobe miteinander kombiniert werden, sollen also ausdrücklich ebenfalls von der vorliegenden Erfindung abgedeckt werden.
Generell gilt also, dass alle zuvor geschilderten Schritte so gewählt sein müssen, dass sie die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren (DNA, mRNA), Proteine und/oder das epigenomische Methylierungsmuster nicht oder möglichst wenig beeinträchtigen.
Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren ist gerade in der klinischen Diagnostik sinnvoll einsetzbar. Routinemäßig wird in der kilinischen Diagnostik die dem Patienten entnommene, zu diagnostizierende Gewebeprobe möglichst schnell in ein pathologisches Labor gebracht und dort in zwei Proben aufgeteilt, wobei die zweite Probe für eine spätere, eingehende hi- stologisch-zytologische Begutachtung fixiert und eingebettet wird, während die erste Probe unmittelbar auf einen Träger aufgebracht, eingefroren und am Mikrotom geschnitten wird ("Schnellschnitt"). Einzelne Schnitte werden dann hi- stologisch gefärbt und sofort von einem Pathologen begutachtet, der dem behandelnden Arzt seine Diagnose mitteilt. Gerade in der intraoperativen Diagnostik, bei der der operierende Chirurg das weitere operative Vorgehen - z.B. eine nach der Entnahme eines Mammakarzinoms gegebenenfalls noch erforderliche Excisi- on der axillaren Lymphknoten - von der telefonisch mitgeteilten Diagnose des Pathologen abhängig macht, hat dieses Verfahren eine große Bedeutung, und entsprechend muß auf eine Optimierung der Zeitabläufe geachtet werden.
Die bevorzugte Ausgestaltung sieht vor, dass die unmittelbar nach der Entnahme aus einem Patienten auf einen Träger aufgebrachte und eingefrorene Gewebeprobe mit einem Mikrotom geschnitten wird, und dass zusätzlich zu den Schnitten, die der histologisch-zytologischen Untersuchung zugeführt werden, andere Schnitte derselben Schnittfolge der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugeführt werden. Der Pathologe kann daher seine Diagnose zusätzlich auf molekularbiologische Befunde stützen und somit die Diagnosesicherheit erhöhen - ein Punkt, der gerade in der intraoperativen Diagnostik von großer Bedeutung ist.
Ein großer Vorteil dieses zusätzlichen Verfahrensschritts ist es, dass er sich nahtlos und ohne Zeitverlust in das routinemäßige Diagnoseprocedere integrieren läßt. Bei Verwendung eines geeigneten molekularbiologischen Untersuchungsverfahrens, wie z.B. einer arraybasierten mRNA- Analyse, können in relativ kurzer Zeit Untersuchungsergebnisse gewonnen werden, die gegebenenfalls sogar zeitgleich mit den histologischen Befunden an den behandelnden Arzt weitergeleitet werden können. Überdies wird bei diesem zusätzlichen Verfahrensschritt das ohnehin beim Schnellschnitt anfallende überflüssige Material gewinnbringend genutzt.
Dabei ist in einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens vorgesehen, dass die Gewebeprobe nach der Anfertigung der Schnitte auf dem Träger verbleibt, so dass sie für die erneute Anfertigung von Schnitten zur Verfügung steht. Bei Verwendung eines Kryotoms und schneller Vorgehensweise ist dabei gewährleistet, daß die Gewebeprobe während des gesamten Prozesses gefroren bleibt und ohne wesentliche Temperaturbeeinflussung wieder im Gefrierschrank eingelagert werden kann. Es kann auch vorgesehen sein, daß die Probe vor oder während des Schneidens Temperatur annimmt und dann wieder eingefroren wird.
Beide Vorgehensweisen schaffen z.B. die Möglichkeit, eine einmal histologisch- zytologisch und/oder molekularbiologisch untersuchte Probe zu einem späteren Zeitpunlct erneut zu untersuchen, um dabei z.B. Methoden anzuwenden, die zu dem früheren Zeitpunkt noch nicht existierten, oder die Probe im Rahmen einer Studie erneut zu untersuchen. Sollte die Gewebeprobe auf andere Weise konserviert worden sein, z.B., wie bereits beschrieben, durch Einbettung in ein geeignetes Medium, kann natürlich ebenso vorgesehen sein, dass sie nach Anfertigung der Schnitte auf dem Träger verbleibt und für die erneute Anfertigung von Schnitten zur Verfügung steht. In diesem Fall kann auf das zwischenzeitige Einfrieren verzichtet werden.
Diese Ausgestaltung ist besonders vorteilhaft in Verbindung mit der im folgenden beschriebenen Ausgestaltung. Demnach ist vorgesehen, dass der Träger, auf den die Gewebeprobe aufgebracht ist, so gestaltet ist, dass er in reproduzierbarer Weise in das Mikrotom eingebracht werden kann, so dass die Gewebeprobe bei jeder Anfertigung von Schnitten die gleiche relative Orientierung zum Mikrotom aufweist. Auf diese Weise ist gewährleistet, daß die zu einem späteren Zeitpunkt erneut untersuchte Probe weitestgehend der früheren Probe entspricht und so die histologisch-zytologischen und/oder molekularbiologischen Befunde unmittelbar miteinander verglichen werden können.
Die Berücksichtigung des quantitativen Anteils des krankhaften Gewebes bzw. krankhafter Zellen in der Gewebeprobe bei der Auswertung der Ergebnisse der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung macht nur Sinn unter der Annahme, dass die Schnitte, Stichproben bzw. Teilproben der Stichproben, die der histologisch-zytologischen bzw. der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugeführt werden, im wesentlichen gleich zusammengesetzt sind.
Idealerweise wäre dies der Fall, wenn für beide Untersuchungen dieselbe Probe verwendet werden könnte. Bei der Aufbereitung für die Histologie wird eine Probe in der Regel gefärbt und/oder fixiert, wobei die genomischen, proteomischen und/oder epigenomischen Eigenschaften der Probe beinträchtigt werden. Umgekehrt wird eine Probe bei der Aufbereitung für die Molekularbiologie in der Regel homogenisiert. Dabei gehen sämtliche topologischen Informationen der Probe verloren. Die Aufbereitung einer Gewebeprobe für die eine Untersuchung macht die Probe also für die jeweils andere Untersuchung unbrauchbar. Es müssen also für die beiden Untersuchungen verschiedene Teilproben verwendet werden.
Wenn es sich bei den Teilproben z.B. um zwei unmittelbar benachbarte Schnitte aus einer Mil rotom-Schnittfolge handelt, kann im Allgemeinen davon ausgegangen werden, dass diese im wesentlichen gleich zusammengesetzt sind. Diese Annahme wird auch in pathologischen Fachkreisen allgemein akzeptiert.
Es ist jedoch denkbar, dass die Teilproben in ihrer Zusammensetzung voneinander abweichen, dass z.B. in der histologisch-zytologisch untersuchten Teilprobe das Tumorgewebe einen anderen quantitativen Anteil hat als in der molekular- biologisch untersuchten Teilprobe. Dies ist z.B. dann der Fall, wenn die Schnittfolge einen Bereich des Tumorrands erfasst, der parallel zur Schnittebene verläuft. Ein über die histologisch-zytologisch untersuchte Teilprobe ennittelter quantitativer Bezugsgröße würde folglich einen falschen Tumorgewebsanteil in der molekularbiologisch untersuchten Teilprobe vorspiegeln und so zu einer fehlerhaften Korrektur des experimentell erfassten Expressionsmusters fuhren. Ähnliches gilt, wenn in der histologisch-zytologisch untersuchten Teilprobe das Tumorgewebe ein anderes Erscheinungsbild oder ein anderes Verteilungsmuster aufweist als in der molekularbiologisch untersuchten Teilprobe.
Daher ist in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen, dass der histologisch-zytologischen Untersuchung mindestens zwei Schnitte zugeführt werden, wobei diese so gewählt sind, dass sichergestellt ist, dass der oder die der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugeführten Schnitte in situ zwischen diesen Schnitten angeordnet waren. In der Praxis sieht dies so aus, dass zwei nicht unmittelbar benachbarte Schnitte einer Mikrotomschnittfolge gefärbt und histologisch-zytologisch begutachtet werden, während weitere, dazwischenliegende Schnitte der Mikrotomschnittfolge homogenisiert und z.B. einer arraybasierten mRNA- Analyse unterzogen werden. Die Anzahl der hierfür verwendeten Schnitte richtet sich in diesem Fall z.B. nach der für die Analyse erforderlichen mRNA-Menge.
Auf diese Weise sind einerseits die gewebsspezifische Zusammensetzung zweier flankierender Schnitte und andererseits die molekularbiologischen Charakteristi- ka einer oder mehrerer Schnitte bekannt, die in der ursprünglichen Gewebeprobe zwischen den flankierenden Schnitten angeordnet waren. Der quantitative Anteil, das Erscheinungsbild und/oder das Verteilungsmuster des l__rankhaften Gewebes bzw. krankhafter Zellen in der oder den molekularbiologisch untersuchten Schnitten kann so verläßlich bestimmt werden. Wenn z.B. der eine flankierende Schnitt einen Tumorgewebsanteil von 20 % und der andere flankierende Schnitt einen Tumorgewebsanteil von 80 % aufweist, kann der Pathologe annehmen, dass der Tumorgewebsanteil in den molekularbiologisch untersuchten Schnitten, die in situ zwischen den flankierenden Schnitten gelegen haben, im Bereich zwischen 20 und 80 % gelegen hat. Gegebenenfalls kann - unter Annahme einer gradientenartigen Änderung der gewebs- spezifischen Zusammensetzung von einem Schnitt zum nächsten - aus den Tumorgewebsanteilen der flankierenden Schnitte auch der mittlere Tumorgewebsanteil der molekularbiologisch untersuchten Schnitte bestimmt oder berechnet werden. Auf diese Weise kann auch in diesen Fällen eine Bezugsgröße ermittelt werden, mit der z.B. das experimentell erfasste Genexpressionsmuster korrigiert und dann unmittelbar mit den in den Datenbanken enthaltenen Mustern verglichen werden kann.
Dies ist insbesondere dann möglich, wenn neben den flankierenden Schnitten noch ein oder mehrere weitere Schnitte, die in situ zwischen den molekularbiologisch untersuchten Schnitten angeordnet waren, auf ihre gewebsspezifische Zusammensetzung untersucht werden. Die zuvor beschriebene Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens soll ausdrücklich auch eine solche Ausgestaltung umfassen.
Ähnliche Vorteile gelten für eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren, demzufolge die Teilproben (also Stichproben bzw. deren Teilproben) die der histologisch-zytologischen Untersuchung zugeführt werden, so gewählt sind, dass sichergestellt ist, dass die der nichtmorphologischen Analyseuntersuchung zugeführte mindestens eine Teilprobe in situ zwischen diesen Teilproben angeordnet war. In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens ist vorgesehen, dass, wie schon angedeutet, das Verfahren in der intraoperativen klinisch-pathologischen Diagnostik eingesetzt wird. Ebenso kann das Verfahren in der periopertiven Diagnostik eingesetzt werden, also vor oder kurz nach einem operativen Eingriff.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen des Verfahrens ist vorgesehen, dass bei der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung ein Verfahren zur Detektion von genomischer DNA, cDNA, mRNA, des epigenomischen Methylierungsmu- sters, Proteinen, viraler oder bakterieller Nukleinsäuren oder anderer Biomoleküle verwendet wird. Ebenso können bei der nicht-morphologischen Analyseuntersuchungen auch biophysikalische Verfahren, wie z.B. Verfahren zur Messung des Redoxpotentials, des pH- erts, der Temperatur, des Sauerstoffpartialdrucks oder zur Bestimmung von Metaboliten wie Lactat oder Pyruvat verwendet werden.
Die Detektion von genomischer DNA kann z.B. somatische Mutationen aufdek- ken, die mit verschiedenen Gewebserkrankungen korreliert sein können. Die Detektion von cDNA, mRNA oder Proteinen kann Aufschluß über ein krankheitspezifisches Genexpressionsmuster liefern. Die Detektion des epigenomischen Me- thylierungsmusters liefert u.U. Hinweise auf ein krankheitsspezifisches Genaktivierungsmuster. Die Detektion viraler Nukleinsäuren kann z.B. Auskunft über eine virusbedingte Gewebeproliferation liefern, während die Detektion bakterieller Nukleinsäuren z.B. die Diagnose bakteriell verursachter Gewebeveränderungen ermöglichen kann. Andere Biomoleküle, wie z.B. infektiöse Prionen, können auf eine prionenverursachte Gewebsveränderung hinweisen. Weitere Biomoleküle können z.B. Nukleinsäuren oder Proteine von pathogenen Parasiten sein. In einer anderen, ebenfalls bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass im Rahmen der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung eine Größe erfaßt wird, die es ermöglicht, den Anteil an krankhaftem Gewebe und/oder anderer Gewebskomponenten in der Gewebeprobe zu ermitteln, und dass der solchermaßen ermittelte Anteil zusätzlich quantitativ der Auswertung der Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchung zugrunde gelegt wird.
Eine solche Größe kann z.B. das Expressionsmaß eines Gens sein, von dem man weiß, das es ausschließlich in gesundem Gewebe exprimiert wird, nicht jedoch in Tumorgewebe, und bei dem man überdies das normale Expressionsmaß kennt. Das Expressionsmaß dieses Gens in der molekularbiologisch untersuchten Teilprobe liefert eine Größe, anhand derer man abschätzen kann, wie hoch der Anteil an nicht-krankhaftem bzw. krankhaftem Gewebe in der Probe ist.
Solche Größen sind in der Literatur u.A. als "Surrogatmarker" bekannt. Die Bestimmung des Expressionsmaßes dieses Gens kann somit zusätzlich zu der durch die histologisch-zytologische Untersuchung gewonnenen Kenntnis über die Ge- webszusammensetzung der Auswertung der Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchung zugrunde gelegt werden. Die Ergebnisse der histologisch- zytologischen Untersuchung könne durch die Bestimmung eines Surrogatmarkers also verifiziert werden.
Eine solche Größe kann aber auch ein für gesundes Gewebe typisches Genexpressionsmuster oder ein für eine bestimmte Tumorvariante bekanntes Expressionsverhältnis zwischen einem tumorspezifischen Gen und einem sowohl in gesunden als auch in ericrankten Geweben konstant exprimierten Gen ("housekeeping gene") sein. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es überdies, mögliche Surrogat- marker zu detektieren bzw. ihre Aussagefähigkeit zu validieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung ist vorgesehen, dass im Rahmen der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung ein Mikroarray bzw. ein Suspensionsarray verwendet wird. Bei Mikroarrays kann es sich z.B. um Chips handeln, auf deren Oberfläche in einer matrixartigen Anordnung molekulare Sonden immobilisiert sind (z.B. Antikörper, Oligonukleotide oder Polypeptide), wobei die Analyte aufgrund von Hybridisierungs- oder immunologischen Reaktionen an diese Sonden binden und mit einem Scanner nachgewiesen werden können. Mikroarrays werden häufig auch als Biochips bezeichnet.
Bei Suspensionsarrays kann es sich z.B. um Latexkugeln ("microbeads") handeln, auf deren Oberfläche molekulare Sonden immobilisiert sind (z.B. Antikörper, Oligonukleotide oder Polypeptide), wobei die Analyte aufgrund von Hybridisierungs- oder immunologischen Reaktionen an diese Sonden binden und mit einem Partikelzähler nachgewiesen werden können. Mikroarrays und Suspensionsarrays eigenen sich je nach Ausgestaltung sowohl für den Nachweis von Nukleotiden als auch für den Nachweis von Peptiden oder Proteinen.
Darüber hinaus ist in weiteren bevorzugten Ausgestaltungen vorgesehen, dass die zu detektierenden Biomoleküle einem Markierungsschritt und/oder die zu detek- tierenden Nukleinsäuren einein Amplifikationsschritt unterzogen werden. Der Markierungsschritt kann z.B. darin bestehen, daß die in der Teilprobe vorhandenen mRNA-Moleküle mit Hilfe einer T7-RNA-Polymerase und Cy3 -markierten Ribonukleotiden in markierte cRNA-Moleküle umgeschrieben werden. Ein anderes Beispiel für einen Markierungsschritt ist die Markierung von in der Teilprobe vorhandenen Proteinen mit Hilfe fluoreszenzgelabelter Antikörper oder Oligonu- kleotide. Es sind jedoch auch andere nach dem derzeitigen oder dem zukünftigen Stand der Technik bekannte Markierungsschritte denkbar.
Der Amplifikationsschritt kann z.B. in einer PCR, einer rtPCR oder einem anderen Amplifikationsverfahren nach dem derzeitigen oder dem zukünftigen Stand der Technik bestehen.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen ist vorgesehen, dass die histologisch- zytologische Untersuchung mindestens einen Färbeschritt und/oder mindestens einen immunhistochemischen Schritt und/oder t«-_./Yw-Hybridisierungsschritt um- fasst. Dabei kann vorgesehen sein, dass mehrere Schnitte bzw. Bohrkernproben jeweils unterschiedlichen histologisch-zytologischen bzw. immunhistochemischen Untersuchungen unterzogen werden, um eine größere Anzahl von Parametern zu erfassen. So kann z.B. eine Teilprobe mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt werden, um die Zellkerne und die Häufigkeit von Mitosen sichtbar zu machen und quantitativ zu erfassen, während eine zweite Teilprobe mit einem tumorspezifischen Antikörper (z.B. anti-S-100 gegen maligne Melanome) und eine dritte Teilprobe z.B. mittels in-situ-Hybridisierung behandelt werden kann.
Es ist überdies vorgesehen, ein Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zum Aufbau einer Tumordatenbank, zur Entwicklung von individualisierten Krebstherapien, zur Einstellung eines Patienten auf eine individualisierte Krebstherapie und/oder zur Beantwortung wissenschaftlicher Fragestellungen zu verwenden.
Eine mögliche Ausführungsform der Erfindung soll im folgenden durch ein nicht ausschließliches Beispiel beschrieben werden. Zwei Tumoren gleichen Typs werden in einer Schnellschnittuntersuchung makroskopisch beurteilt und präpariert und anschließend auf einem geeigneten Träger, eingebettet in Medium in einem Gefriermikrotom aufgefroren.
Anschließend werden 6μm dicke Schnitte angefertigt, wobei der erste und der fünfte Schnitt auf einem Objektträger aufgenommen werden und einem Standardprotokoll entsprechend mit Hämatoxilin-Eosin gefärbt werden. Die Schnitte werden zunächst histologisch begutachtet. Beide werden als Karzinom des Typs X identifiziert. Anschließend wird mittels digitaler Bildverarbeitung die Gewebs- zusammensetzung für jeden Schnitt quantitativ bestimmt. Das Ergebnis der morphologischen Untersuchung der Hämatoxilin-Eosin-gefärbten Präparate ergibt folgendes Bild:
Tumorparenchym Tumorstroma Tumor A 80 % 20 % Tumor B 50 % 50 % Tab. 1: histologisch ermittelte Gewebszusammensetzung der beiden Tumoren
Der zweite, dritte und vierte Schnitt (jeweils mit einer Dicke von 30μm) wird in einem Reaktionsgefäß mit RNA-later aufgenommen, um die Integrität der mRNA zu bewahren. Nach total-RNA Extraktion mit einem kommerziellen Kit (z.B. RNeasy von Qiagen) wird die poly-A RNA selektiv amplifiziert (Wang et al. Nature Biotechnology, April 2001), wobei je nach Bedarf eine bzw. zwei Ampli- fikationsrunden durchgeführt werden können. Nach einem abschließenden Markierungsschritt mit einem kommerziellen Markierungskit ist die amplifizierte RNA bzw. cDNA vorbereitet und kann durch Hybridisierung auf einem DNA- Microarray analysiert werden. Auf diese Weise werden alle in dem untersuchten Gewebe vorhandenen mRNA- Moleküle quantitativ bestimmt. Man erhält also ein quantitatives Genexpressi- onsprofil, das mit Standard-Genexpressionsprofilen verschiedener Gewebe- und Tumorarten erstellten verglichen werden kann, um den diagnostizierten Tumor genauer zu bestimmen. Zur Zeit werden in verschiedenen Labors weltweit solche Standard-Genexpressionsprofile für eine Vielzahl von Tumor- und Gewebsarten ermittelt.
Im vorliegenden Beispiel wurde die Expression der Gene A - 1 untersucht. Man erhielt für die beiden untersuchten Tumoren die folgenden Genexpressionsprofile (Angaben in willkürlichen Einheiten):
Gen A B C D E F G H I Tumor A 2,4 4 0 0 0,8 2,4 3,2 2,4 1,6 Tumor B 1 2,5 1,5 2 0 1,5 1,5 1 0,5 Tab. 2: mittels Array-Experiment ermittelte Genexpressionsprofile der beiden Tumoren
Das Wissen über die Gewebszusammensetzung der beiden Tumoren wird nun für die Korrektur der Ergebnisse der Array-Experimente verwendet. Dabei wird unterstellt, dass das Gewebe in den Schnitten 2, 3 und 4 eine vergleichbare Struktur aufweist wie das Gewebe in den "Randschnitten" 1 und 5.
Unter Berücksichtigung der Kenntnis, dass Tumor A einen Parenchymanteil von 80 % und Tumor B einen Parenchymanteil von 50 % aufweist, erhält man die folgenden normierten Genexpressionsprofile:
Gen A B C D E F G H I Tumor A 3 5 0 0 1 3 4 3 2 Tumor B 2 5 3 4 0 3 3 2 1 Tab. 3 : normierte Genexpressionsprofile der beiden Tumoren Aus der Literatur seien die Standard-Genexpressionsprofile dreier Subtypen des Karzinoms X bekannt:
Gen A B C D E F G H I Subtyp 1 2 5 3 4 0 3 3 2 1 Subtyp 2 3 5 0 0 1 3 4 3 2 Subtyp 3 2 4 2 1 3 5 3 2 3 Tab. 4: Standard-Genexpressionsprofile dreier Subtypen des Karzinoms X
Ein Vergleich der normierten Genexpressionsprofile mit den Standard- Genexpressionsprofilen ergibt, dass es sich bei Tumor A um den Subtyp 2 des Karzinoms X handelt, während es sich bei Tumor B um den Subtyp 1 des Karzinoms X handelt.
Die Differenzierung der beiden Tumoren ist allein durch die Array-Analyse und die anschließende Normierung der Genexpressionsprofile möglich. Die histolo- gische Untersuchung ermöglicht lediglich die Identifizierung des Tumors als Karzinom X, nicht jedoch die Differenzierung in die beschriebenen Subtypen.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Untersuchung einer einem Patienten entnommenen Gewebeprobe, deren genomische und/oder proteomische und/oder epigenomi- sche und/oder biophysikalische Eigenschaften im wesentlichen erhalten sind, auf krankhafte Gewebeanteile, bei dem a) aus der Gewebeprobe Schnitte hergestellt werden, b) von denen mindestens einer einer histologisch-zytologischen und mindestens ein weiterer einer nicht-morphologischen Analyseuntersuchung unterzogen werden, dadurch gekennzeichnet, dass c) bei der histologisch-zytologischen Untersuchung mindestens der quantitative Anteil des krankhaften Gewebes bzw. der krankhaften Zellen und/oder ein anderer morphologischer Aspekt in der Gewebeprobe mittels eines Bildverarbeitungssystems ermittelt wird, und d) mindestens der ermittelte quantitative Anteil und/oder ein anderer morphologischer Aspekt als Bezugsgröße der Auswertung der Ergebnisse der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugrunde gelegt wird. Verfahren zur Untersuchung einer einem Patienten entnommenen Gewebeprobe, deren genomische und/oder proteomische und/oder epigenomi- sehe und/oder biophysikalische Eigenschaften im wesentlichen erhalten sind, auf krankhafte Gewebeanteile, bei dem a) aus der Gewebeprobe eine oder mehrere Stichproben entnommen werden, b) und mindestens eine Teilprobe der Stichprobe einer histologisch- zytologischen und mindestens eine weitere einer nichtmorphologischen Analyseuntersuchung unterzogen werden, dadurch gekennzeichnet, dass c) bei der histologisch-zytologischen Untersuchung mindestens der quantitative Anteil des krankhaften Gewebes bzw. der krankhaften Zellen und/oder ein anderer morphologischer Aspekt in der Gewebeprobe bzw. der Stichprobe mittels eines Bildverarbeitungssystems ermittelt wird, und d) mindestens der ennittelte quantitative Anteil und/oder ein anderer morphologischer Aspekt als Bezugsgröße der Auswertung der Ergebnisse der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugrunde gelegt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Stichprobe der Gewebeprobe mit Hilfe einer Bohrkernsonde, durch Aspiration oder durch Kratzpräparation entnommen wird.
4. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der histologisch-zytologischen Untersuchung zusätzlich das Erscheinungsbild und/oder das Verteilungsmuster des krankhaften Gewebes bzw. Icrankhafter Zellen in der Gewebeprobe ermittelt und der Auswertung der Ergebnisse der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugrunde gelegt wird.
5. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schnitte bzw. die Sichproben direkt aus der frischen Gewebeprobe hergestellt bzw. entnommen werden.
6. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobe vor Herstellung der Schnitte bzw. vor Entnahme der Stichproben eingefroren wird.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1- 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobe unmittelbar nach der Entnahme aus einem Patienten auf einen Träger aufgebracht und eingefroren wird und von der gefrorenen Gewebeprobe mit einem Mikrotom Schnitte angefertigt werden, die dann der histologisch-zytologischen bzw. der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugeführt werden.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobe nach der Anfertigung der Schnitte auf dem Träger verbleibt, so dass sie für die erneute Anfertigung von Schnitten zur Verfügung steht.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger, auf den die Gewebeprobe aufgebracht ist, so gestaltet ist, dass er in reproduzierbarer Weise in das Mikrotom eingebracht werden kann, so dass die Gewebeprobe bei jeder Anfertigung von Schnitten die gleiche relative Orientierung zum Mikrotom aufweist.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, dass der histologisch-zytologischen Untersuchung mindestens zwei Schnitte zugeführt werden, wobei diese so gewählt sind, dass sichergestellt ist, dass der oder die der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugeführten Schnitte in situ zwischen diesen Schnitten angeordnet waren.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 - 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilproben, die der histologisch-zytologischen Untersuchung zugeführt werden, so gewählt sind, dass sichergestellt ist, dass die der nichtmorphologischen Analyseuntersuchung zugeführte Teilprobe mindestens eine Teilprobe in situ zwischen diesen Teilproben angeordnet war.
12. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in der intraoperativen oder der perioperativen klinisch bzw. experimentellenpathologischen Diagnostik bzw. Analytik eingesetzt wird.
13. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das bei der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung verwendete Verfahren ein Verfahren zur Detektion von genomischer DNA, cDNA, mRNA, des epigenomischen Methylierungsmusters, Proteinen, viralen oder bakteriellen Nukleinsäuren oder anderer Biomoleküle oder ein Verfahren zur Bestimmung der biophysikalischen Eigenschaften einer Probe ist.
14. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung eine Größe erfaßt wird, die es ermöglicht, den Anteil an krankhaftem Gewebe und/oder anderer Gewebskomponenten in der Gewebeprobe zu ermitteln, und dass der solchermaßen ermittelte Anteil zusätzlich quantitativ der Auswertung der Ergebnisse der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zugrunde gelegt wird.
15. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung ein Mikroarray bzw. ein Suspensionsarray verwendet wird.
16. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die im Rahmen der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zu detektierenden Biomoleküle einem Markierungsschritt unterzogen werden.
17. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die im Rahmen der nicht-morphologischen Analyseuntersuchung zu detektierenden Nukleinsäuren einem Amplifikationsschritt unterzogen werden.
18. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die histologisch-zytologische Untersuchung mindestens einen Färbeschritt umfasst.
19. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die histologisch-zytologische Untersuchung mindestens einen immunhistochemischen Schritt und/oder z'w-sz'tw-Hybridisierungsschritt umfasst.
20. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Schnitte jeweils unterschiedlichen histologisch- zytologischen Untersuchungen unterzogen werden.
21. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zum Aufbau einer Tumordatenbank.
22. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Entwicklung von individualisierten Krebstherapien.
23. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Einstellung eines Patienten auf eine individualisierte Krebstherapie.
EP05715532A 2004-02-26 2005-02-25 Verfahren zur untersuchung einer gewebeprobe Withdrawn EP1718947A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004009934A DE102004009934A1 (de) 2004-02-26 2004-02-26 Verfahren zur Untersuchung einer Gewebeprobe
PCT/EP2005/001984 WO2005083388A1 (de) 2004-02-26 2005-02-25 Verfahren zur untersuchung einer gewebeprobe

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1718947A1 true EP1718947A1 (de) 2006-11-08

Family

ID=34877205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP05715532A Withdrawn EP1718947A1 (de) 2004-02-26 2005-02-25 Verfahren zur untersuchung einer gewebeprobe

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20070184430A1 (de)
EP (1) EP1718947A1 (de)
JP (1) JP2007534319A (de)
AT (1) ATE535795T1 (de)
DE (1) DE102004009934A1 (de)
WO (1) WO2005083388A1 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120264110A1 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Wachman Elliot S Automated pap screening using a plurality of biomarkers and multi-spectral imaging

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US316248A (en) 1885-04-21 Oscae doebner
EP0782633A4 (de) * 1994-09-23 2002-01-02 Sydney D Finkelstein Topographische genotypisierung
US5533342A (en) * 1995-02-08 1996-07-09 Gordon; Abe Semi-automated cryostat
DE19932032C2 (de) * 1999-07-09 2003-07-24 Eppendorf Ag Vorrichtung zur Mikro-Dissektion von Gewebe
WO2001004828A1 (en) * 1999-07-13 2001-01-18 Chromavision Medical Systems, Inc. Automated detection of objects in a biological sample
US20030049701A1 (en) * 2000-09-29 2003-03-13 Muraca Patrick J. Oncology tissue microarrays
AU2002255525B2 (en) * 2001-02-09 2007-01-04 Pintex Pharmaceuticals, Inc. Pin1 as a marker for prostate cancer
EP1373896A2 (de) * 2001-03-12 2004-01-02 MonoGen, Inc. Auf zellen basierte nachweis und unterscheidung von krankheitszuständen
US6577754B2 (en) * 2001-05-29 2003-06-10 Tissueinformatics, Inc. Robust stain detection and quantification for histological specimens based on a physical model for stain absorption
US20030186248A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-02 Erlander Mark G. Interpreting cytological specimens via molecular histological signatures
DE60200248T2 (de) * 2002-08-01 2005-01-27 Mtm Laboratories Ag Verfahren für Lösung-basierte Diagnose

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2005083388A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
ATE535795T1 (de) 2011-12-15
JP2007534319A (ja) 2007-11-29
US20070184430A1 (en) 2007-08-09
DE102004009934A1 (de) 2005-09-22
WO2005083388A1 (de) 2005-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69934222T2 (de) Zellulare anordnungen für schnelle molekulare profilidentifizierung
DE60200248T2 (de) Verfahren für Lösung-basierte Diagnose
EP2208068B1 (de) Verfahren zur endtiterbestimmung und dessen auswertung mittels indirekten immunfluoreszenz test
US20170116734A1 (en) Examining device for processing and analyzing an image
DE102018001873A1 (de) Molekulare Verfahren zur Beurteilung von Komplikationen nach einer Nierentransplantation
Zikopoulos et al. Opposite development of short-and long-range anterior cingulate pathways in autism
DE112007001907T5 (de) Verfahren für die Zellanalyse
Aguilar-Mahecha et al. The identification of challenges in tissue collection for biomarker studies: the Q-CROC-03 neoadjuvant breast cancer translational trial experience
Mayhew Morphomics: An integral part of systems biology of the human placenta
WO2015032630A1 (de) Mikrodissektionsgerät und verfahren zum isolieren von zellen eines vorbestimmten zelltyps
EP1381846B1 (de) Verfahren zur analyse einer biologischen probe
Norris et al. Imaging mass spectrometry in clinical pathology
EP1718947A1 (de) Verfahren zur untersuchung einer gewebeprobe
CN110959110B (zh) 用于固定生物样品以用于分析目的的方法
WO2022167521A1 (de) Verfahren zur analyse von veränderungen von signaturen von schlüsselmetaboliten in biologischen proben
DE60216045T2 (de) Krebsdiagnoseverfahren
DE202013103215U1 (de) Ein geführtes Scheibenschneidsystem zum Erhalten von histologischen Proben
US20220020452A1 (en) Systems and Methods for Genetic Comparison and Analysis of Typical and Atypical Tissues Using Machine Learning
CN109313196A (zh) 用于推断对象中的信号转导途径的转录因子的活性的方法
US20020182647A1 (en) Histoscreen method
Dzurjašková et al. A method to prepare large resin sections for counting myelinated axons in rodent CNS and PNS structures
WO2020178134A1 (de) Verfahren zum zählen von zelltypen oder zellmarkern in einer probe, insbesondere in einer blutprobe
Parker Introduction to toxicologic pathology
Dunstan A Pathologist's View of Drug and Biomarker Development
Hägerling et al. Light-Sheet Microscopy as a Novel Tool for Virtual Histology

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20060921

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR

17Q First examination report despatched

Effective date: 20061221

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

GRAS Grant fee paid

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR3

GRAA (expected) grant

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009210

PUAC Information related to the publication of a b1 document modified or deleted

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009299EPPU

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: B1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR

REG Reference to a national code

Ref country code: GB

Ref legal event code: FG4D

Free format text: NOT ENGLISH

DB1 Publication of patent cancelled
18W Application withdrawn

Effective date: 20111028

REG Reference to a national code

Ref country code: NL

Ref legal event code: GRER

Effective date: 20111207

REG Reference to a national code

Ref country code: IE

Ref legal event code: FG4D

Free format text: LANGUAGE OF EP DOCUMENT: GERMAN

LTIE Lt: invalidation of european patent or patent extension

Effective date: 20111130

REG Reference to a national code

Ref country code: IE

Ref legal event code: FD4D

BERE Be: lapsed

Owner name: NIENDORF, AXEL

Effective date: 20120228