DE69934222T2 - Zellulare anordnungen für schnelle molekulare profilidentifizierung - Google Patents

Zellulare anordnungen für schnelle molekulare profilidentifizierung Download PDF

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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die mikroskopische, histologische und/oder molekulare Analyse von Gewebe- oder anderen Zellproben.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Biologische Mechanismen vieler Krankheiten wurden durch mikroskopische Untersuchung von Gewebeproben geklärt. Histopathologische Untersuchung ermöglichte ebenfalls die Entwicklung von effizienten medizinischen Behandlungen für eine Reihe von Krankheiten. In der normalen anatomischen Pathologie wird eine Diagnose auf Grund der Zellmorphologie und Färbungscharakteristiken gemacht. Tumorproben können zum Beispiel untersucht werden, um die Tumorart zu charakterisieren und die Aggressivität des Tumors vorherzusagen. Obwohl diese mikroskopische Untersuchung und Klassifizierung von Tumoren die medizinische Behandlung verbessert hat, kann das mikroskopische Aussehen einer durch Standardverfahren (wie zum Beispiel Hematoxylin und Eosin) gefärbten Gewebeprobe oft nur eine begrenzte Menge an diagnostischer oder molekularer Information offen legen.
  • Kürzliche Fortschritte in der Molekularmedizin haben eine noch größere Gelegenheit bereitgestellt, um die zellulären Mechanismen von Krankheit zu verstehen und geeignete Behandlungen mit der größten Erfolgswahrscheinlichkeit auszuwählen. Zum Beispiel weisen einige hormonabhängige Brustkrebszellen eine erhöhte Expression von Östrogenrezeptoren auf ihren Zelloberflächen auf, was anzeigt, dass der Patient, von dem der Krebs genommen wurde, wahrscheinlich auf bestimmte Anti-Östrogen-Arzneistoff-Behandlungen reagieren wird. Andere diagnostische und prognostische Zellveränderungen enthalten das Vorhandensein von tumorspezifischen Zelloberflächenantigenen (wie bei einem Melanom), die Produktion von embryonischen Proteinen (wie zum Beispiel a-Fetoproteine bei Leberkrebs und karzinoembryonisches Glykoprotein-Antigen, welches durch gastrointestinale Krebserkrankungen produziert wird), und genetische Missbildungen (wie zum Beispiel aktivierte Onkogene bei Krebserkrankungen). Es sind eine Reihe von Methoden entstanden, um das Vorhandensein dieser zellulären Missbildungen zu erkennen, welche Immunphänotypisierung mit monoklonalen Antikörpern, In-Situ-Hybridisierung mit Sonden und DNA-Amplifikation unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) enthalten.
  • Die Entwicklung neuer Molekularmarker von klinischer Wichtigkeit wurde von dem langsamen und langwierigen Prozess der Evaluierung von Biomarkern in großer Anzahl von klinischen Proben behindert. Es müssen zum Beispiel Hunderte von Gewebeproben, welche unterschiedliche Stufen der Krebsprogression repräsentieren, ausgewertet werden, bevor die Wichtigkeit eines gegebenen Markers bewertet werden kann. Da die Anzahl von Antikörpern, als auch Sonden für mRNA- oder DNA-Targets schnell zunimmt, kann nur ein kleiner Bruchteil von diesen jemals in großer Anzahl klinischer Proben getestet werden.
  • Battifora et al. schlugen in Lab. Invest. 55:244-248 (1986) und in der US-Patenschrift Nr. 4,820,504 vor, dass mehrere Gewebeproben auf einem einzigen Objektträger zusammen gruppiert werden könnten, um zu ermöglichen, dass die Proben gleichzeitig durch die Anwendung eines einzigen Tropfens von Hybridomüberstand überprüft werden können. Die Proben wurden unter Verwendung einer in der Hand gehaltenen Rasierklinge erstellt, um deparaffinisierte und dehydrierte Gewebeproben in Scheiben zu schneiden, welche dann wahllos zusammengebündelt wurden, in eine Wursthaut gewickelt wurden und wieder in Paraffin eingebettet wurden. Diese Methode erforderte einen hohen Grad an manueller Geschicklichkeit und inkorporierte Prüfgüter in einem zusammengesetzten Block auf eine Art und Weise, die es schwierig machten, bestimmte Proben von Interesse zu finden und zu identifizieren.
  • Eine Modifizierung dieses Prozesses wurde von Wan et al.; J. Immunol. Meth. 103:121-129 (1987), und Furmanski et al. in der US-Patentschrift Nr. 4,914,022 offenbart, wobei Kerne von in Paraffin eingebettetem Gewebe von Standard-Gewebeblocks erhalten wurden. Die Kerne wurden weich und gerade gemacht, indem man sie auf einer warmen Oberfläche rollte, und wurden dann im Inneren eines herkömmlichen Strohhalms gebündelt. Es wurde behauptet, dass dieses Verfahren für das gleichzeitige histologische Testen von mehreren Gewebeproben geeignet sei, zum Beispiel bei der Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern. Die Methode von Miller und Groothuis, A.J.C.P. 96:228-232 (1991) rollte auf ähnliche Weise Gewebestreifen in „Stämme", von welchen Quersektionen genommen wurden, um in Paraffin eingebettet zu werden. Die Strohhalm- und Stammmethoden waren jedoch arbeitsintensiv, erforderten einen hohen Grad an manueller Geschicklichkeit und ordneten die Prüfgüter auch wahllos auf eine Art und Weise an, welche die Identifizierung von Proben von Interesse kompliziert machte.
  • Battifora und Mehta, Lab. Invest. 63:722-724 (1990) und US-Patentschrift Nr. 5,002,377 versuchten, einige der Probleme der wahllosen Platzierung zu überwinden, indem sie Proben in eine Vielzahl von schmalen Streifen schnitten, welche in parallelen rechteckigen Rillen in einer Form individuell platziert wurden. Die Gewebestreifen wurden in Agar-Gel eingebettet, welches in die Rillen gegossen wurde, um ein tellerähnliches Element mit einer Reihe von Rippen zu produzieren. Mehrere der gerippten Teller wurden zusammen gestapelt und in Paraffin eingebettet, um einen Gewebeblock zu bilden. Eine ähnliche Vorgehensweise wurde von Sundblad, A.J.C.P. 102:192-193 (1993) vorgeschlagen, wobei die Gewebestreifen in dreieckigen Keilen anstatt von rechteckigen Rillen platziert wurden. Das in Scheiben Schneiden des Gewebes, dessen Anordnung in Reihen und dessen Einbetten in etlichen Schritten, um den Block zu bilden, war ein zeitaufwendiges Verfahren, welches die Effizienz des Untersuchens einer großen Anzahl von Gewebeproben reduzierte.
  • Alle diese Methoden waren für die effiziente Erstellung eines Arrays von Gewebeproben, welches für eine schnelle Parallelanalyse einer Reihe von unabhängigen Molekularmarkern verwendet werden kann, unzureichend. Die Anzahl an Geweben, welche in einem Block positioniert werden können, ist bei den vorher erwähnten Methoden sehr eingeschränkt, und die Konfiguration des Gewebes in dem Gewebeblock ist nicht standardisiert, was es schwierig macht, automatisierte Analyseverfahren zu entwickeln, als auch das gleiche Gewebe durch mehrere aufeinander folgende Sektionen zu verfolgen. Weiterhin wurden diese Methoden lediglich auf das Testen von Antikörpern angewandt, welche normalerweise in den frühen Phasen des Screenings neuer Gene nicht verfügbar sind. Diese Ineffizienz stellte ein bedeutendes Problem dar in Bereichen wie zum Beispiel Krebsforschung, da die Krebsentwicklung und -progression ein mehrstufiger Prozess ist, welcher sequenzielle Verluste, Neuanordnungen und Amplifikationen etlicher Chromosomenregionen und mehrerer Gene einbezieht. Diese Vorgänge führen zu einer Dysregulation ausschlaggebender Signaltransduktionswege für das Zellwachstum, Tod und Differenziation. Die Details dieses komplexen Prozesses bleiben unvollständig verstanden, teilweise weil Hochdurchsatz-Strategien und Methoden für die Analyse solcher genetischer Veränderungen in einer großen Anzahl unkultivierter humaner Tumore nicht verfügbar waren.
  • Zum Beispiel kann die gleichzeitige Analyse etlicher Gene innerhalb des gleichen oder zugehörigen Signaltransduktionsweges notwendig sein, um ausschlaggebende, geschwindigkeitsbeschränkende Schritte bei der Dysregulation von Krebszellenwachstum genau festzulegen. Außerdem kann die Analyse struktureller und zahlenmäßiger Veränderungen, welche etliche Chromosomen, Loci und Gene zur gleichen Zeit betreffen, notwendig sein, um die Muster der Anhäufung genetischer Veränderungen bei unterschiedlichen Stufen der Krebsprogression zu verstehen. Schließlich ist, nachdem neue Gene und genetische Veränderungen von potenzieller Wichtigkeit für Krebs identifiziert wurden, normalerweise wesentliche zusätzliche Forschung erforderlich, um die diagnostische, prognostische und therapeutische Bedeutung dieser Molekularmarker in der klinischen Onkologie zu bestimmen.
  • Da die Menge an Gewebe für solche Studien oft geschwindigkeitsbeschränkend wird, ist die Fähigkeit wichtig, effizient Gewebe für die Molekularanalyse auf eine Art und Weise zur Verfügung zu stellen, zu fixieren, zu lagern und zu verteilen, welche den Verbrauch von oft einzigartigen, wertvollen Tumorproben minimiert.
  • Während das Konzept der Nukleinsäure-Hybridisierung nicht neu ist und routinemäßig in biomedizinischen Labors seit einigen Jahren verwendet wird, hat eine neue Technologie, die als DNA-Mikroarray-Technologie oder Gen-Chip-Technologie bezeichnet wird, die Geschwindigkeit erhöht, bei der Information von Zellen, Geweben oder anderen Experimenten erhalten werden kann. Eine derartige informationelle Hochdurchsatz-Biotechnologie wurde zum Beispiel beschrieben in Schena et al., Science, 270:467-470, 1995; Schena, BioEssays, 18(5):427-431, 1996; Soares, Cur. Opp in Biotechnol., 8:542-546, 1997; Ramsay, Nature Biotechnology, 16:14-44, 1998; Service, Science; 282:396-399, 1998 und in US-Patentschrift Nr. 5,700,637.
  • Schena et al., 1995 beschreibt ein Mikroarray, welches aus 45 geklonten Arabidopsis cDNAs zusammengesetzt ist, welches verwendet wurde, um die Expression korrespondierender Gene unter Verwendung von fluoreszierend gekennzeichneten Arabidopsis mRNA-Sonden quantitativ zu messen. Schena, 1996 betrachtet erneut cDNA-Arrays, welche mit fluoreszierend gekennzeichneten mRNA-Sonden sondiert sein können und erläutert die Messung differenzieller Expression unter Verwendung zweier unterschiedlicher Prüfgüter, welche mit zwei verschiedenfarbigen fluoreszierenden Kennzeichnungen gekennzeichnet wurden. Soares, 1997, erläutert DNA-Mikroarrays, welche für die Identifizierung von nach oben regulierten und nach unten regulierten Genen, die bei Krebs wichtig sind, verwendet werden, und die Verwendung solcher Arrays, um Gen-Therapie-Targets zu identifizieren. Ramsay, 1998, und Service, 1998, prüfen verschiedene Mikro-Arrays, welche für verschiedene diagnostische und therapeutische Zwecke benutzt werden, wie zum Beispiel für die Identifikation amplifizierter Gene, Polymorphismus-Screening, Kartierung von genomischen DNA-Klonen und komparative genomische Hybridisierung.
  • Diese Referenzschriften identifizieren zwei grundlegende Array-Arten, diejenigen, bei denen Prüfgut-DNA (zum Beispiel ganze Genome oder repräsentative Sequenzen von diesen Genomen) auf einer Unterlage immobilisiert werden und gekennzeichneten Sonden ausgesetzt werden; und diejenigen, bei denen Target-Sequenzen, zum Beispiel ein Array von Oligonukleotiden, synthetisiert oder auf einer Unterlage immobilisiert und gekennzeichneter Prüfgut-DNA ausgesetzt werden. In jedem Fall kann die Sonde eine bekannte Kopien-Anzahl eines bekannten Gens enthalten, und die Prüfgut-DNA bindet die Sonde so, dass der Grad des Bindens ein Indikator für das Vorhandensein oder Fehlen eines bestimmten Gens ist, oder die Regulierung nach oben oder die Regulierung nach unten des Gens. US-A-5700537 offenbart ein Verfahren für das Erzeugen von Oligonukleotid-Arrays.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Hochdurchsatz-Molekularprofilierung in großem Umfang von Gewebeproben (wie zum Beispiel Tumoren), mit minimalen Gewebeerfordernissen, auf eine Art und Weise, welche eine schnelle Parallelanalyse biologischer Charakteristiken, wie zum Beispiel molekularer Charakteristiken (zum Beispiel Gen-Dosierung und -Expression) von Hunderten von morphologisch kontrollierten Tumorproben, ermöglicht, bereit. Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren von Parallelanalyse von Gewebeproben erreicht, bei dem eine Vielzahl von Donorproben an zugeordneten Orten in einem Rezipienten-Array platziert werden, und eine Vielzahl von Sektionen von dem Rezipienten-Array erhalten werden, so dass jede Sektion eine Vielzahl von Donorproben, welche ihre zugeordneten Orte beibehalten, enthält.
  • Eine unterschiedliche Gewebeanalyse (wie zum Beispiel histologische, immunologische oder molekulare Analyse) wird an jeder Sektion durchgeführt, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen den Ergebnissen der unterschiedlichen Analysen an korrespondierenden Orten des Arrays gibt. Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Donorprobe durch das Bohren eines länglichen Prüfguts, wie zum Beispiel eines zylindrischen Kerns, aus Donorgewebe, und Platzieren der Donorprobe in einem Aufnahmebehälter komplementärer Gestalt, wie zum Beispiel einem zylindrischen Kern, in dem Rezipienten-Array erhalten. Analysen, welche an den Donorproben durchgeführt werden können, enthalten alle Arten von histologischen, klinikopathologischen und molekularen Analysen, wie zum Beispiel histochemische oder immunologische Analysen, Nukleinsäure-Hybridisierung oder die Extraktion von Proteinen, und DNA- und RNA-Molekularanalysen, einschließlich PCR-Analysen, wie zum Beispiel In-Situ-PCR und In-Situ-RT-PCR.
  • In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens wird ein Rezipienten-Block aus einem festen Einbettungsmedium, wie zum Beispiel Paraffin, gebildet, welches mit einem Ausstanzer oder Mikrotom geschnitten werden kann, und ein separater Donorblock wird auch gebildet, indem eine biologische Probe in dem Einbettungsmedium eingebettet wird. Zylindrische Aufnahmebehälter-Kerne werden in dem Rezipientenblock gebohrt, um ein Array von Aufnahmebehältern an festgelegten Positionen zu bilden, und zylindrische Donorprüfgut-Kerne werden von der eingebetteten biologischen Probe in dem Donorblock erhalten. Die Donorprüfgut-Kerne werden dann in den zylindrischen Aufnahmebehälter an zugeordneten Stellen in dem Array platziert, und der Rezipientenblock wird in Scheiben geschnitten, um einen Querschnitt der Donorprüfgut-Kerne in dem Array zu erhalten, ohne die zugeordneten Array-Orte zu stören. Eine unterschiedliche biologische Analyse kann an jeder Sektion durchgeführt werden, zum Beispiel durch das Verwenden unterschiedlicher monoklonaler Antikörper, welche bestimmte Antigene erkennen, oder einer Kombination von antigenisch verschiedenen monoklonalen Antikörpern und Nukleinsäure-(z.B. RNA und DNA)Sonden an sequenziellen Sektionen.
  • Das Ergebnis jeder verschiedenen Gewebeanalyse an jeder Position des Arrays wird verglichen, zum Beispiel um zu bestimmen, ob ein Gewebe, welches einen Östrogenrezeptor exprimiert, auch aufzeigt, dass ein bestimmtes Onkogen aktiviert wurde. Das Vorhandensein oder Fehlen des Östrogenrezeptors und Onkogens kann dann mit klinischer oder pathologischer Information über das Gewebe (wie zum Beispiel das Vorhandensein einer metastatischen Krankheit oder der histologische Grad eines Tumors) korreliert werden. Diese simultane parallele Analyse von mehreren Proben hilft dabei, die Beziehung von mehreren molekularen und klinischen Charakteristiken des Gewebes untereinander zu klären.
  • Es ist auch ein Verfahren zum Erhalt kleiner länglicher Prüfgüter von Gewebe aus einer Gewebeprobe, wie zum Beispiel einem Tumor, und zum Unterziehen der Probe einer laboratorischen Analyse, wie zum Beispiel einer histologischen oder molekularen Analyse, offenbart. Das längliche Gewebeprüfgut kann von einer Region von Interesse der Gewebeprobe genommen werden. In einer offenbarten Ausführungsform ist das Prüfgut ein zylindrisches Prüfgut, welches aus der Gewebeprobe ausgestanzt wurde, wobei die zylindrische Gewebeprobe ungefähr 1-4 mm lang ist und einen Durchmesser von ungefähr 0,1-4 mm aufweist, zum Beispiel ungefähr 0,3-2,0 mm. In bestimmten Ausführungsformen beträgt der Zylinderdurchmesser weniger als ungefähr 1,0 mm, zum Beispiel 0,6 mm. Das Prüfgut kann auf eine Art und weise konserviert werden (zum Beispiel Ethanol-Fixierung), welche die Analyse von Nukleinsäuren nicht beeinträchtigt, und daher kann das Prüfgut jeder Art molekularer Analyse, wie zum Beispiel jeder Art von molekularer Analyse basierend auf isolierter DNA- oder RNA-Einbettung, unterzogen werden. Routinemäßig fixierte archivalische Gewebeproben können auch für die meisten Analysen, einschließlich immunologische und In-Situ-Hybridisierung, verwendet werden.
  • In einer alternativen Ausführungsform können Zellen von einer Zelllinie von Interesse in dem Array platziert werden und auf die gleiche Art und Weise wie die Gewebeproben analysiert werden.
  • Die Offenbarung beinhaltet auch ein Gerät für die Erstellung von Proben für die parallele Analyse von Sektionen von Arrays mit biologischem Material. Das Gerät enthält eine Plattform, einen Gewebedonorblock auf der Plattform und einen Ausstanzer, welcher eine Gewebeprobe aus dem Donorblock ausstanzt oder bohrt. Die Plattform kann auch einen Rezipientenblock tragen, bei dem der Ausstanzer ein Array von Aufnahmebehältern an ausgewählten Positionen bildet. Jeder Aufnahmebehälter kann so positioniert sein, dass eine Gewebeprobe von dem reziproken Ausstanzer in den Aufnahmebehälter ausgestoßen wird. Eine x-y Positionierungsvorrichtung bewegt den Ausstanzer oder Rezipientenblock inkremental hinsichtlich des jeweils anderen, während der Ausstanzer sich hin- und herbewegt, um das Aufnahmebehälter-Array zu bilden. Die x-y Positionierungsvorrichtung richtet auch sequenzielle Aufnahmebehälter des Rezipientenblocks auf den Ausstanzer aus, um Gewebeproben von dem Ausstanzer in den Aufnahmebehälter zu liefern. Ein Instrument kann in den Ausstanzer eingeführt werden, um den Inhalt des Ausstanzers auszustoßen, was entweder Material (wie zum Beispiel Paraffin) von dem Rezipientenblock oder Gewebe von dem Donorblock sein kann. Regionen von Interesse der Gewebeprobe werden lokalisiert, indem man einen gefärbten Sektions-Objektträger (wie zum Beispiel einen mit Hematoxylin und Eosin gefärbten Objektträger), welcher aus dem Originalblock geschnitten wurde, über dem Donorblock positioniert, um Strukturen von Interesse auf dem dünnen Sektionsobjektträger auf korrespondierende Gewebeprobenregionen im Donorblock auszurichten.
  • Die Offenbarung enthält außerdem ein computerimplementiertes System zur parallelen Analyse von aufeinander folgenden Sektionen von Gewebe-Arrays, wobei eine x-y Positionierungsplattform eine Ablage (oder einen Ausstanzer) zu einer Vielzahl von Koordinaten, welche Positionen in einem Rezipientenblock-Array entsprechen, bewegt. Ein Aufnahmebehälter-Ausstanzer stanzt dann einen Aufnahmebehälterkern aus einem Rezipientenblock auf der Positionierungsplattform, und ein Instrument stößt den Aufnahmebehälter-Kern von dem Aufnahmebehälter-Ausstanzer aus. Ein Donor-Ausstanzer (welcher der gleiche oder ein vom Rezipienten-Ausstanzer verschiedener sein kann) stanzt eine Donorprobe aus einem Donorblock auf der Positionierungsplattform, und ein Instrument stößt die Donorprobe von dem Donor-Ausstanzer in den Aufnahmebehälter aus, während der Donor-Ausstanzer in den Aufnahmebehälter eingeführt wird. Die Donorprobe weist geeigneterweise einen Durchmesser auf, welcher im Wesentlichen der gleiche ist, wie der Durchmesser des Aufnahmebehälters, so dass die Donorprobe sicher in den Aufnahmebehälter passt. Das Computersystem identifiziert das Gewebe durch dessen Anordnung in dem Rezipienten-Array, so dass, wenn der Donorblock sektioniert ist, eine korrespondierende Position in jedem Sektions-Array Gewebe von der identischen Donorprobe enthalten wird.
  • Die Erfindung enthält auch Verfahren, welche die Gewebe-Mikroarray-Technologie mit anderen Technologien kombinieren, wie zum Beispiel Hochdurchsatz-Genome, um molekulare Charakteristiken zu identifizieren, wie zum Beispiel strukturelle Veränderungen in Genen oder Proteinen, Kopienanzahl oder Expressionsveränderungen von Genen, mit Krankheitsprognosen oder Therapieergebnissen, um neue Targets für Genprävention, frühe Diagnose, Krankheitseinstufung oder Prognose zu identifizieren, und um therapeutische Mittel zu identifizieren. Solche Hochdurchsatz-Technologien beinhalten cDNA- und genomische Sequenzierung, die Serienanalyse von Genexpression (SAGE), repräsentative Differenzanalyse (RDA), die Differential-Display-Methode und ähnliche PCR-basierte Technologien, auf Hybridisierung basiertes Sequenzieren, subtraktive cDNA- oder genomische Hybridisierungen, cDNA-Arrays, CGH-Arrays, elektrophoretische oder andere Separationsverfahren für DNA oder Protein, Hefe-Zweihybrid-Technologie oder ähnliche Techniken der Molekularbiologie. Auf ähnliche Weise können Informationen, welche von elektronischen Datenbanken erhalten oder hergeleitet werden, wie zum Beispiel diejenigen, welche DNA- oder Protein-Sequenz-Informationen enthalten, verwendet werden, um Sonden oder Reagenzien zu entwickeln, welche mit der Gewebearraytechnologie getestet werden können.
  • Die Verwendung von Gewebearrays alleine oder in Kombination mit anderen Array-Methoden kann Informationen über die Häufigkeit einer Menge an genetischen Veränderungs- oder Genexpressionsmustern (einschließlich normaler Genexpressionsmuster) in einer Reihe von Gewebearten (wie zum Beispiel unterschiedliche Arten von Tumoren), und in Gewebe einer besonderen histologischen Art (wie zum Beispiel ein Tumor einer besonderen Art, wie zum Beispiel intraduktaler Brustkrebs), als auch die Gewebeverteilung von getesteten Molekularmarkern bereitstellen.
  • In einer besonderen Ausführungsform der kombinierten DNA und Gewebearrays kann das DNA-Array eine cDNA- oder ein genomischer Mikroarray-Chip sein, was ermöglicht, dass eine Vielzahl (Hunderte, Tausende oder sogar noch mehr) unterschiedlicher Nukleinsäuresequenzen auf der Oberfläche einer Unterlage zur Bildung eines Arrays angebracht werden können. Ein derartiger Chip könnte zum Beispiel ein Array von cDNA-Klonen, Oligonukleotiden oder Large-Insert genomischen P1-, BAC- oder PAC-Klonen tragen. Diese Arrays ermöglichen die Analyse Hunderter von Genen oder genomischer Fragmente auf einmal, um deren Expressions- oder Kopienanzahl in einer Testprobe festzustellen.
  • Ein Hochdurchsatz-DNA-Chip kann zusammen mit der Hochdurchsatz-Gewebearray-Technologie verwendet werden. Solche hybride Erfindungen beinhalten das Verwenden eines DNA-Arrays für das Screening einer begrenzten Anzahl von Tumorprüfgütern in Bezug auf Expression oder Kopienanzahl eines oder mehrerer (zum Beispiel Tausender) spezifischer Gene oder DNA-Sequenzen. Sonden, welche das Gen von Interesse enthalten, können dann verwendet werden, um ein Gewebemikroarray, welches viele unterschiedliche Gewebeproben enthält (zum Beispiel eine Reihe von Brusttumoren oder Prostatatumoren) zu überprüfen, um festzustellen, ob das identifizierte Gen oder der genetische Locus bei diesen Tumoren auf ähnliche Weise verändert ist. Zum Beispiel kann ein cDNA-Chip verwendet werden, um eine humane Brustkrebs-Zelllinie zu überprüfen, um eines oder mehr Gene zu identifizieren, welche in diesem bestimmten Brustkrebs überexprimiert oder amplifiziert sind. Eine Sonde, welche dem identifizierten Gen entspricht, würde dann verwendet werden, um ein Gewebearray zu sondieren, welches eine Vielzahl von Gewebeprüfgütern von unterschiedlichen Brustkrebsarten oder sogar Tumoren unterschiedlicher Art (wie zum Beispiel Lungen- oder Prostatakrebs) enthält. Eine derartige Sonde könnte hergestellt werden, indem man den identischen Klon, welcher in dem DNA-Array verwendet wurde, kennzeichnet (zum Beispiel mit einen fluoreszierenden oder radioaktiven Marker). Das Vorhandensein des Gens in ähnlichen (oder nicht ähnlichen) Tumoren würde durch das Hybridisierungsmuster der Sonde zum Gewebearray offen gelegt.
  • Eine andere Offenbarung beinhaltet ein Verfahren zum Erstellen eines diagnostischen tumorspezifischen Gen-Arrays.
  • Die vorangehenden und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung besonderer Ausführungsformen ersichtlicher werden, welche mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen fortfährt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine schematische Perspektivansicht einer ersten Ausführungsform der Ausstanzvorrichtung der vorliegenden Erfindung, welche die Ausrichtung des Ausstanzers über einer Region von Interesse von Donorgewebe in einem Donorblock zeigt.
  • 2 ist eine der 1 ähnliche Ansicht, jedoch wurde hier der Ausstanzer vorgerückt, um ein Donorproben-Prüfgut zu erhalten.
  • 3 ist eine schematische Perspektivansicht eines Rezipientenblocks, in den die Donorprobe platziert wurde.
  • 4-8 stellen Schritte der Erstellung dünner Sektionsarrays von dem Rezipientenblock dar.
  • 9 ist eine Perspektivansicht einer Verschlussvorrichtung, um eine auf einem Objektträger aufgebrachte Probe über dem Gewebe in dem Donorblock zu halten, um eine Region von Interesse zu lokalisieren.
  • 10A ist eine Ansicht eines H&E gefärbten, dünnen Sektionsgewebes, welches für eine mikroskopische Untersuchung auf einem Objektträger aufgebracht ist.
  • 10B ist eine vergrößerte Ansicht eines Abschnitts des Objektträgers in 10A, welche die Ergebnisse von erbB2 mRNA In-Situ-Hybridisierung auf einem Gewebearray von der Region in dem kleinen Rechteck in 10A zeigt.
  • 10C ist ein Elektrophorese-Gel, welches zeigt, dass DNA und RNA mit einem hohen Molekulargewicht von den Brustkrebsproben, welche in kaltem Ethanol fixiert wurden, extrahiert werden können.
  • 10D ist eine vergrößerte Ansicht eines der Gewebeprüfgüter des Arrays in 10A, welche eine Immunperoxidase-Färbung für das erbB2 Antigen zeigt.
  • 10E ist eine der 10D ähnliche Ansicht, welche hochgradige erbB2-Rmplikation zeigt, welche durch fluoreszierende In-Situ-Hybridisierung (FISH) von Gewebe in dem Array durch eine erbB2 DNA-Sonde ermittelt wurde.
  • 11A, 11B, 11C und 11D sind schematische Ansichten, welche ein Beispiel paralleler Analyse von Arrays, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, zeigt.
  • 12 ist eine vergrößerte Ansicht eines Abschnitts aus 11.
  • 13 ist eine Draufsicht einer zweiten Ausführungsform einer Vorrichtung zur Bildung der Arrays der vorliegenden Erfindung.
  • 14 ist eine Vorderansicht der in 13 gezeigten Vorrichtung, welche die Bildung eines Aufnahmebehälters in einem Rezipientenblock mit einem Rezipientenausstanzer zeigt.
  • 15 ist eine der 14 ähnliche Ansicht, zeigt jedoch das Ausstoßen eines Stöpsels von dem Rezipienten-Aussstanzer in eine Auswurfablage.
  • 16 ist eine Ansicht, welche einen Donorausstanzer zeigt, welcher eine Gewebeprobe aus einem Donorblock erhält.
  • 17 ist eine Ansicht, welche das Einführen des Donorgewebes in einen Aufnahmebehälter des Rezipientenblocks zeigt.
  • 18 ist eine vergrößerte Ansicht des Donorausstanzers, welcher über einer Struktur von Interesse in dem Donorblock ausgerichtet ist, welche im Querschnitt gezeigt ist.
  • 19 ist eine vergrößerte Querschnittsansicht des Rezipientenausstanzers, während 20 eine ähnliche Ansicht des Donorausstanzers ist, welche die relativen Querschnittsdurchmesser der zwei Ausstanzer darstellt.
  • 21 ist eine Querschnittsansicht des Rezipientenblocks, wobei die Donorproben in dem Rezipientenarray angeordnet sind, und wobei Linien von Mikrotom-Sektionen des Rezipientenblocks gezeigt werden.
  • 22 ist eine schematische Ansicht eines Computersystems, in dem das Verfahren der vorliegenden Erfindung implementiert werden kann.
  • 23 ist ein Algorhythmus, welcher ein Beispiel des computerimplementierten Verfahrens der vorliegenden Erfindung darstellt.
  • 24 ist eine schematische Repräsentation eines gCGH-Mikroarrays, welches 31 Target-Loci enthält, von denen berichtet wurde, dass sie bei Krebs Amplifikation erfahren. Kreise um Target-Loci zeigen Amplifikationen an, welche in den Brustkrebs-Zelllinien, die in dieser Studie getestet wurden, gefunden wurden.
  • 25 ist eine digitale Repräsentation der Ergebnisse einer chromosomalen CGH-Analyse, welche hochgradige Amplifikationen in Sum-52 Brustkrebszellen bei 10q25-q26 und bei 7q21-q22 zeigt, einer Genosensor CGH-Analyse, welche Amplifikationen auf hohem Niveau der MET (7q21)- und FGFR2 (10q25)- Onkogene anzeigt, und einer FISH-Analyse, welche die Amplifikation von FGFR2 (bei 10q25) zeigt.
  • 26 ist ein schematisches Diagramm eines Brustkrebs-Gewebemikroarrays, als auch eine digitale Abbildung einer Hybridisierung, welche zeigt, dass FGFR2 bei 4,5% der Tumorprüfgüter in dem Brustkrebs-Gewebemikroarray amplifiziert wurde.
  • 27 ist eine schematische Repräsentation der Kombination des DNA-Arrays und des Gewebearrays, welche zeigt, dass das DNA-Array einen einzigen Tumor mit Hunderten von Sonden sondieren kann, während die Gewebearraytechnologie umgekehrt Proben von Hunderten von Tumoren mit einer einzigen Sonde sondieren kann.
  • 28 ist ein schematisches Diagramm, welches die Kombination der Gewebearraytechnologie mit cDNA und/oder CGH-Arrays repräsentiert.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG MEHRERER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Definitionen
  • „Polypeptid" bezeichnet eine Kette von Aminosäuren, unabhängig von der Länge oder post-translationalen Modifikationen (z.B. Glykosylation oder Phosphorylation).
  • Eine „Gen-Amplifikation" ist eine Zunahme der Kopienanzahl eines Gens, im Vergleich zu der Kopienanzahl in normalem Gewebe. Ein Beispiel einer genomischen Amplifikation ist eine Zunahme in der Kopienanzahl eines Onkogens.
  • Eine „Gen-Deletion" ist eine Deletion von einer oder mehreren Nukleinsäuren, die normalerweise in einer Gen-Sequenz vorhanden sind, und kann in extremen Beispielen die Deletion ganzer Gene oder sogar von Abschnitten von Chromosomen beinhalten.
  • Eine „genomische Target-Sequenz" ist eine Sequenz von Nukleotiden, welche sich in einer bestimmten Region in dem humanen Genom befindet, welche einem oder mehreren spezifischen Loci entspricht, einschließlich genetische Missbildungen, wie zum Beispiel nukleotider Polymorphismus, eine Deletion oder eine Amplifikation.
  • Eine „genetische Funktionsstörung" ist jegliche Krankheit, Erkrankung oder jegliche unnormale physische oder mentale Zustand, welche durch eine Veränderung eines oder mehrerer Gene oder regulativer Sequenzen (wie zum Beispiel eine Mutation, Deletion oder Translokation) verursacht wird.
  • Ein „Nukleinsäure-Array" betrifft die Anordnung von Nukleinsäure (wie zum Beispiel DNA oder RNA) an zugeordneten Orten auf einer Matrix, wie zum Beispiel die, die in cDNA oder CGH-Arrays gefunden wird.
  • Ein „Mikroarray" ist ein Array, welches verkleinert ist, so dass es zur visuellen Auswertung eine mikroskopische Untersuchung erfordert.
  • Ein „DNA-Chip" ist ein DNA-Array, bei dem mehrere DNA-Moleküle (wie zum Beispiel cDNAs) bekannter DNA-Sequenzen auf einem Substrat, normalerweise in einem Mikroarray, aufgereiht sind, so dass die DNA-Moleküle mit Nukleinsäuren (wie zum Beispiel cDNA oder RNA) einer Probe von Interesse hybridisieren können. DNA-Chips werden ferner in Ramsay, Nature Biotechnology 16: 40-44, 1998 beschrieben, welches durch Bezugnahme inkorporiert ist.
  • „Komparative genomische Hybridisierung" oder „CGH" ist eine Methode des differenziellen Kennzeichnens von Test-DNA und normaler Referenz-DNA, welche gleichzeitig zu Chromosomenverteilungen hybridisiert werden, wie in Kallioniemi et al., Science 258:818-821, 1992 beschrieben, welches durch Bezugnahme inkorporiert ist.
  • „Genexpressions-Mikroarrays" betrifft mikroskopische Arrays von cDNAs, welche auf einem Substrat aufgedruckt sind, welche als Hybridisierungs-Target mit hoher Dichte für RNA-Sonden dienen, wie in Schena, BioEssays 18:427-431, 1996 beschrieben, welches durch Bezugnahme inkorporiert ist.
  • „Serienanalyse von Genexpression" oder „SAGE" betrifft die Verwendung von Kurzsequenz-Tags, um die quantitative und gleichzeitige Analyse einer großen Anzahl von Transkripten in Gewebe zu ermöglichen, wie in Velculescu et al., Science 270:484-487, 1995 beschrieben, welches durch Bezugnahme inkorporiert ist.
  • „Hochdurchsatz-Genome" betrifft die Anwendung von genomischen oder genetischen Daten oder Analysemethoden, welche Mikroarrays oder andere genomische Technologien verwenden, um große Anzahlen von Genen oder Proteinen schnell zu identifizieren oder ihre Struktur, Expression oder Funktion von normalen oder unnormalen Zellen oder Gewebe zu unterscheiden.
  • Ein „Tumor" ist ein Neoplasma, das bösartig oder gutartig sein kann. „Tumore der gleichen Gewebeart" betrifft Primärtumore, welche in einem bestimmten Organ (wie zum Beispiel Brust, Prostata, Blase oder Lunge) ihren Ursprung haben. Tumore der gleichen Gewebeart können in Tumore verschiedener Unterarten aufgeteilt werden (ein klassisches Beispiel dafür sind bronchogene Karzinome (Lungentumore), welche ein Adenokarzinom, Kleinzellen-, Stachelzellen- oder Großzellentumor sein können).
  • Eine „zelluläre" Probe ist eine Probe, welche ganze Zellen enthält, und beinhaltet Gewebe (was Aggregationen ähnlich spezialisierter Zellen sind, die zur Durchführung einer bestimmten Funktion vereint sind). Beispiele beinhalten Zellen von der Haut, Brust, Prostata, Blut, Hoden, Eierstock und Endometrium.
  • Eine „zelluläre Suspension" ist eine Flüssigkeit, in welcher Zellen dispergiert sind, und kann eine einheitliche und eine nicht einheitliche Suspension sein. Beispiele zellulärer Suspensionen sind die, welche durch feine Nadelaspiration von Tumorstellen, zytologischen Proben (wie zum Beispiel Vaginalflüssigkeit zur Erstellung von Pap-Abstrichen), Spülungen (wie zum Beispiel Bronchialspülungen), Urin, der Zellen enthält (zum Beispiel bei der Erkennung von Blasenkrebs), Asziten (zum Beispiel durch Bauchhöhlenpunktion) oder anderen Körperflüssigkeiten erhalten werden.
  • Ein „zytologisches Präparat" ist eine pathologische Probe, wie zum Beispiel Vaginalflüssigkeiten, bei der eine zelluläre Suspension in einen Abstrich oder in eine andere Form einer pathologischen Untersuchung oder Analyse umgewandelt werden kann.
  • Alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, welche hier verwendet werden, haben die gleiche Bedeutung, wie sie der Durchschnittsfachmann in dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, allgemein verstehen würde. Obwohl Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent zu diesen sind, in der Praxis oder beim Test der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind geeignete Verfahren und Materialien unten beschrieben. Sollte ein Konflikt bestehen, wird diesen die vorliegende Beschreibung, einschließlich der Definitionen, regeln. Zusätzlich dazu sind die Materialien, Verfahren und Beispiele lediglich illustrativ und sollen nicht einschränkend sein.
  • Ausführungsform der 1-12
  • Eine erste Ausführungsform einer Vorrichtung zur Herstellung der Mikroarrays ist in 1-2 gezeigt, in denen ein Donorblock 30 in einem rechteckigen Behältnis 31 gezeigt ist, welches auf einer stationären Plattform 32 befestigt ist, die eine L-förmige Kantenführung 34, welche das Donorbehältnis 31 in einer vorher bestimmten Ausrichtung auf der Plattform 32 hält, aufweist. Ein Ausstanzergerät 38 ist über der Plattform 32 befestigt, und beinhaltet eine senkrechte Führungsplatte 40 und eine waagerechte Positionierungsplatte 42. Die Positionierungsplatte 42 ist auf einem x-y-Gestell (nicht gezeigt) befestigt, welches präzise mit einem Paar digitaler Mikrometer positioniert werden kann.
  • Die senkrechte Führungsplatte 40 weist eine flache Stirnfläche auf, welche eine Präzisionsführungsfläche bereitstellt, gegen die eine reziproke Ausstanzerbasis 44 entlang einer Spur 46 zwischen einer eingefahrenen Position, gezeigt in 1, und einer ausgefahrenen Position, gezeigt in 2, hin- und her geschoben werden kann. Ein elastisches Band 48 hilft dabei, die Bewegung der Basis 44 entlang ihrem Weg zu steuern, und die Grenzen des Vorrückens und Einfahrens von Basis 44 werden durch das Spurelement 46 gesetzt, welches einen Stopper bildet, der die Oszillationsamplitude der Basis 44 einschränkt. Ein dünnwandiger Edelstahlröhren-Ausstanzer 50 mit geschliffenen Leitkanten ist auf der flachen unteren Fläche von Basis 44 befestigt, so dass der Ausstanzer 50 in Bezug auf die Plattform 32 und das Behältnis 31 auf der Plattform vorgerückt und eingefahren werden kann. Das hohle Innere des Ausstanzers 50 ist zusammenhängend mit einer zylindrischen Bohrung durch Basis 44, und die Bohrung öffnet sich bei der Öffnung 51 an einer waagerechten Lippe 53 der Basis 44.
  • 1 zeigt, dass eine dünne Gewebesektion, welche mit Hematoxylin-Eosin oder einer anderen Färbung gefärbt wurde, von dem Donorblock 30 erhalten werden kann und auf einem Objektträger 52 (mit angemessener Zurüstung und Färbung) befestigt werden kann, so dass anatomische und mikroanatomische Strukturen von Interesse in dem Block 30 lokalisiert werden können. Der Objektträger 52 kann über dem Donorblock 30 durch einen beweglichen Armhalter 54 (9) mit einer Klemme 56, welche eine Kante eines transparenten Unterlagen-Objektträgers 58 sicher hält, gehalten werden. Der Armhalter 54 kann bei Gelenk 60 beweglich sein, um zwischen einer ersten Position, in der der Unterlagen-Objektträger 58 in einer Position über dem Behältnis 31 festgestellt ist, und einer zweiten Position, in der der Unterlagen-Objektträger 58 sich waagerecht aus der in 9 gezeigten Position bewegt, um freien Zugang zu dem Ausstanzer 50 zu gewähren, zu schwenken.
  • In Betrieb ist das rechteckige Behältnis 31 auf der Plattform 32 (1) platziert, wobei die Kanten des Behältnisses 31 gegen die Kantenführungen 34 anstoßen, um das Behältnis 31 in einer ausgewählten Position zu halten. Ein Donorblock 30 wird erstellt, indem eine grobe Gewebeprobe (wie zum Beispiel eine dreidimensionale Tumorprobe 62) in Paraffin eingebettet wird. Eine dünne Sektion des Donorblocks 30 wird abrasiert, gefärbt und auf einem Objektträger 52 als dünne Sektion 64 befestigt, und der Objektträger 52 wird dann auf dem Unterlagen-Objektträger 58 platziert und wie in 9 gezeigt, über dem Donorblock 30 platziert. Der Objektträger 52 kann auf dem Unterlagen-Objektträger 58 umherbewegt werden, bis die Kanten der dünnen Sektion 64 auf die Kanten der groben pathologischen Probe 62 ausgerichtet sind, wie durch die gestrichelten Linien in 9 gezeigt. Der Arm 54 wird dann in der ersten Position festgestellt, in die der Arm nach dem Verschieben in eine zweite Position zurückkehren kann.
  • Eine mikroanatomische oder histologische Struktur von Interesse 66 kann dann lokalisiert werden, indem die dünne Sektion durch ein Mikroskop (nicht gezeigt) untersucht wird. Falls die Gewebeprobe zum Beispiel ein Adenokarzinom der Brust ist, dann kann der Ort von Interesse 66 ein Bereich der Probe sein, in dem die zelluläre Bauweise spezifische Merkmale des Krebses andeutet, wie zum Beispiel invasive und nicht invasive Komponenten. Sobald die Struktur von Interesse 66 lokalisiert wurde, wird die entsprechende Region der Gewebeprobe 62, von der die dünne Sektionsstruktur von Interesse 66 erhalten wurde, unmittelbar unter der Struktur von Interesse 66 lokalisiert. Wie in 1 gezeigt, kann die Positionierungsplatte 42 in der x- und y-Richtung (unter der Steuerung eines digitalen Mikrometers oder eines Joysticks) bewegt werden, oder der Donorblock kann über größere Abstände bewegt werden, um den Ausstanzer 50 über der Region von Interesse des Donorblocks 30 auszurichten, und der Unterlagen-Objektträger 58 wird dann horizontal von seiner Position über dem Donorblock 30 um Schwenkgelenk 60 herum (9) weggeschwenkt.
  • Der Ausstanzer 50 wird dann in die Struktur von Interesse in dem Donorblock 30 eingeführt (2), indem die senkrechte Führungsplatte 40 entlang der Spur 46 vorgeschoben wird, bis die Platte 44 ihre Stopp-Position erreicht (die durch Gerät 38 vorher eingestellt ist). Mit dem Vorrücken des Ausstanzers 50 bohrt dessen scharfe Leitkante eine zylindrische Gewebeprobe aus dem Donorblock 30, und die Probe wird innerhalb des Ausstanzers festgehalten, während sich der Ausstanzer in seine eingefahrene Position, in 1 gezeigt, zurück bewegt. Die zylindrische Gewebeprobe kann nachfolgend von dem Ausstanzer 50 entfernt werden, indem ein Instrument (nicht gezeigt) in die Öffnung 51 vorgeschoben wird. Die Gewebeprobe wird zum Beispiel von dem Ausstanzer 50 entfernt und in einen zylindrischen Behälter von komplementärer Gestalt und Größe in einem Array von Behältern in einem Rezipientenblock 70, in 3 gezeigt, eingeführt.
  • Es können ein oder mehrere Rezipientenblocks 70 erstellt werden, bevor die Gewebeprobe von dem Donorblock 30 erhalten wird. Der Block 70 kann erstellt werden, indem ein fester Paraffinblock in dem Behältnis 31 platziert wird und der Ausstanzer 50 verwendet wird, um in dem Block 70 in einem regelmäßigen Muster, welches ein Array von zylindrischen Behältern der in 3 gezeigten Art produziert, zylindrische Ausstanzungen zu machen. Das regelmäßige Array kann erzeugt werden, indem der Ausstanzer 50 an einem Startpunkt über Block 70 positioniert wird (zum Beispiel eine Ecke des zukünftigen Arrays), vorgerückt wird, und indem der Ausstanzer 50 dann zurückgezogen wird, um einen zylindrischen Kern von einer spezifischen Koordinate auf Block 70 zu entfernen, und der Kern dann von dem Ausstanzer entfernt wird, indem ein Instrument in die Öffnung 51 eingeführt wird. Das Ausstanzer-Gerät oder der Rezipientenblock wird dann in regelmäßigen Inkrementen in den x- und/oder y-Richtungen zur nächsten Koordinate des Arrays bewegt, und der Ausstanzschritt wird wiederholt. In der spezifischen, offenbarten Ausführungsform von 3 weisen die zylindrischen Behälter des Arrays Diameter von ungefähr 0,6 mm auf, wobei die Zentren der Zylinder um einen Abstand von ungefähr 0,7 mm voneinander entfernt sind (so dass es einen Abstand von ungefähr 0,05 mm zwischen den benachbarten Kanten der Behälter gibt).
  • In einem bestimmten Beispiel wurden Kerngewebebiopsien mit einem Durchmesser von 0,6 mm und einer Höhe von 3-4 mm von ausgewählten repräsentativen Regionen individueller in Paraffin eingebetter „Donor"-Tumorblöcke genommen und präzise in einem neuen „Rezipienten"-Paraffinblock (20 mm × 45 mm) aufgereiht. H&E-gefärbte Sektionen wurden über den Donorblocks positioniert und verwendet, um Stichproben von morphologisch repräsentativen Stellen in den Tumoren zu führen. Obwohl der Durchmesser des Biopsie-Ausstanzers variiert werden kann, wurde herausgefunden, dass 0,6 mm Zylinder geeignet sind, da sie groß genug sind, um histologische Muster in jedem Element des Tumor-Arrays auszuwerten, und dennoch ausreichend klein sind, um die ursprünglichen Donorgewebeblocks nur minimal zu beschädigen, und um einigermaßen homogene Gewebeblocks zu isolieren. Bis zu 1000 solcher Gewebezylinder oder mehr können in einem 20 × 45 mm Rezipienten-Paraffinblock platziert werden. Spezifische offenbarte Diameter der Zylinder betragen 0,1-4,0 mm, zum Beispiel 0,5-2,0 mm, und insbesondere weniger als 1 mm, zum Beispiel 0,6 mm. Die Automatisierung des Vorgangs, mit computergesteuerter Platzierung der Proben, ermöglicht, dass sehr kleine Proben eng zusammen in dem Rezipienten-Array platziert werden können.
  • 4 zeigt das Array in dem Rezipientenblock, nachdem die Aufnahmebehälter des Arrays mit Gewebeprobenzylindern gefüllt worden sind. Die obere Fläche des Rezipientenblocks wird dann mit einem Klebefilm 74 von einem Klebeband-Sektionierungssystem (Instrumedics) bedeckt, um dabei zu helfen, die Gewebezylindersektionen in dem Array an ihrem Platz zu halten, nachdem es geschnitten wurde. Der Arrayblock kann bei 37 Grad C 15 Minuten lang erwärmt werden, bevor er sektioniert wird, um die Anhaftung der Gewebekerne zu fördern und ein Glätten der Blockoberfläche durch Pressen einer glatten, sauberen Fläche (wie zum Beispiel ein Mikroskop-Objektträger) gegen die Blockoberfläche zu ermöglichen.
  • Mit dem Klebefilm an Ort und Stelle wird eine 4-8 μm Sektion des Rezipientenblocks quer zu der Längsachse des Gewebezylinders (5) geschnitten, um eine dünne Mikroarray-Sektion 76 (welche Gewebeproben-Zylindersektionen in der Form von Scheiben enthält) zu produzieren, welche auf einen herkömmlichen Proben-Objektträger übertragen wird. Die Mikroarray-Sektion 76 wird an dem Objektträger 78 festgemacht, zum Beispiel durch Kleber auf dem Objektträger. Der Film 74 wird dann von dem darunter liegenden Mikroarrayelement 76 abgezogen, um dies für die Verarbeitung freizulegen. Eine abgedunkelte Kante 80 des Objektträgers 78 ist zur Kennzeichnung oder Handhabung des Objektträgers geeignet.
  • Brustkrebs-Gewebeproben wurden in kaltem Ethanol fixiert, um dabei zu helfen DNA und RNA mit hohem Molekulargewicht zu konservieren, und 372 dieser Proben wurden auf diese Art und Weise fixiert. Mindestens 200 aufeinander folgende 4-8 μm Tumorarraysektionen können von jedem Block geschnitten werden und stellen Targets für die korrelierte In-Situ-Analyse mehrerer Molekularmarker auf dem DNA-, RNA- oder Protein-Niveau, einschließlich Kopienanzahl oder die Expression mehrerer Gene, bereit. Diese Analyse wird durchgeführt, indem auf unterschiedliche Genmolekulartargets hin (z.B. DNA- oder RNA-Sequenzen oder Antigene, welche durch Antikörper definiert sind) in separaten Arraysektionen getestet wird, und indem die Ergebnisse der Tests an identischen Koordinaten des Arrays (welche Gewebeproben des gleichen Gewebezylinders, die von dem Donorblock erhalten wurden, entsprechen) verglichen werden. Diese Vorgehensweise ermöglicht das Messen von praktisch Hunderten von molekularen Charakteristiken von jedem Tumor, wodurch die Konstruktion großer Serien von korrelierten genotypischen oder phänotypischen Charakteristiken unkultivierter humaner Tumore erleichtert wird.
  • Ein Beispiel eines einzigen Mikroarrays 76, welches 645 Proben enthält, ist in 10A gezeigt. Eine vergrößerte Sektion des Mikroarrays (durch ein Rechteck in 10A hervorgehoben) wird in 10B gezeigt, in welchem ein Autoradiogramm von erbB2 mRNA In-Situ-Hybridisierung darstellt, dass zwei benachbarte Proben in dem Array ein starkes Hybridisierungs-Signal aufzeigen. 10C stellt Elektrophoresegels dar, welche aufzeigen, dass DNA und RNA mit hohem Molekulargewicht von Brustkrebsproben extrahiert werden können, welche über Nacht bei 4°C in Ethanol fixiert wurden.
  • Eine der Gewebeproben, die die fluoreszierenden „positiven" Signale gab, wurde auch durch Immunperoxidase-Färbung analysiert, wie in 10D gezeigt, wo bestätigt wurde (durch den dunklen Fleck), dass das erbB2-Produkt vorhanden war. Eine DNA-Sonde für das erbB2-Gen wurde verwendet, um Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) durchzuführen. 10D zeigt eines der Tumorarrayelemente, welches eine hochgradige erbB2 Genamplifikation aufzeigte. Die Einfügung in 10E zeigt drei Nuklei mit zahlreichen eng aneinander liegenden erbB2 Hybridisierungssignalen und zwei Kopien der zentromerischen Referenzsonde. Zusätzliche Details über die Untersuchungen werden in den Beispielen 1-4 unten gegeben.
  • Das Potenzial der Array-Technologie der vorliegenden Erfindung, schnelle parallele molekulare Analysen mehrerer Gewebeproben durchzuführen, ist in 11A-11D dargestellt, wo die y-Achse der Graphen in 11A und 11C Prozentsätzen von Tumoren in spezifischen Gruppen entsprechen, welche definierte klinikopathologische oder molekulare Charakteristiken aufweisen. Dieses Diagramm zeigt Korrelationen zwischen klinischen und histopathologischen Charakteristiken von Gewebeproben in dem Mikroarray. Jedes kleine Kästchen in den ausgerichteten Reihen von 11B repräsentiert einen Koordinatenort in dem Array. Entsprechende Koordinaten aufeinander folgender dünner Sektionen des Rezipientenblocks werden vertikal übereinander in den sich waagerecht erstreckenden Reihen ausgerichtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gewebeproben in vier Klassifizierungen von Tumoren klassifiziert werden könnten (11A), basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen von Zellmembran-Östrogenrezeptorexpression, und dem Vorhandensein oder Fehlen der p53-Mutation in der zellulären DNA. In 11B ist das Vorhandensein der p53-Mutation durch ein abgedunkeltes Kästchen gezeigt, während das Vorhandensein von Östrogenrezeptoren ebenfalls durch ein abgedunkeltes Kästchen gezeigt ist. Eine Kategorisierung in jede der vier Gruppen (ER-/p53+, ER-/p53-, ER+/p53+, und ER+/p53-) wird durch die gepunkteten Linien zwischen 11A und 11B gezeigt, welche die Kategorien in Gruppen I, II, III und IV entsprechend dem ER/p53-Status aufteilen.
  • 11B zeigt außerdem klinische Charakteristiken, welche mit dem Gewebe an jeder respektiven Koordinate des Arrays assoziiert wurden. Ein abgedunkeltes Kästchen für Alter gibt an, dass der Patient sich noch vor den Wechseljahren befindet, ein abgedunkeltes Kästchen N gibt das Vorhandensein einer metastatischen Krankheit in den regionalen Lymphknoten an, ein abgedunkeltes Kästchen T gibt einen Tumor der Stufe 3 oder 4 an, welcher klinisch weiter fortgeschritten ist, und ein abgedunkeltes Kästchen für Grad gibt einen hochgradigen (mindestens Grad III) Tumor an, welcher mit erhöhter Bösartigkeit assoziiert wird. Die Korrelation des ER/p53-Status kann durchgeführt werden, indem man die oberen vier Linien der klinischen Indikatorkästchen (Alter, N, T, Grad) mit den mittleren zwei Linien von Kästchen (ER/p53-Status) vergleicht. Die Ergebnisse dieser Kreuzkorrelation werden in dem Säulendiagramm in 11A gezeigt, wo man sehen kann, dass die ER-/p53+ (Gruppe I) Tumore dazu neigen, einen höheren Grad zu haben als die anderen Tumore, und einen besonders hohe Häufigkeit von Myc-Amplifikation aufwiesen, während ER+/p53+ (Gruppe III) Tumore eher positive Knoten zur Zeit ihrer chirurgischen Resektion aufwiesen. Die ER-/p53- (Gruppe II) zeigte, dass das am meisten amplifizierte Gen in dieser Gruppe erbB2 war. Es wurde gezeigt, dass die ER-/p53- (Gruppe II) und ER+/p53- (Gruppe IV) Tumore demgegenüber weniger Indikatoren einer ernsthaften Erkrankung aufwiesen, wodurch eine Korrelation zwischen dem Fehlen der p53- Mutation und einer besseren Prognose angedeutet wurde.
  • Dieses Verfahren wurde auch verwendet, um die Kopienanzahl etlicher anderer bedeutender Brustkrebs-Onkogene in den 372 aufgereihten Brustkrebsproben in aufeinander folgenden FISH-Experimenten zu analysieren, und diese Ergebnisse wurden verwendet, um Korrelationen zwischen den ER/p53-Klassifizierungen und der Expression dieser und anderer Onkogene festzustellen. Diese Ergebnisse wurden erhalten, indem Sonden für jedes der separaten Onkogene in aufeinander folgenden Sektionen des Rezipientenblocks verwendet wurden, und die Ergebnisse an den entsprechenden Koordinaten des Arrays verglichen wurden. In 11B wird ein positives Ergebnis für die Amplifikation des spezifischen Onkogens oder Markers (mybL2, 20q13, 17q23, myc, cnd1 und erbB2) durch ein abgedunkeltes Kästchen angezeigt. Das erbB2-Onkogen war bei 18% der 372 aufgereihten Proben amplifiziert, myc bei 25% und cyclin D1 (cnd 1) bei 24% der Tumore.
  • Es stellte sich heraus, dass die zwei kürzlich entdeckten neuen Regionen häufiger DNA-Amplifikation bei Brustkrebs, 17q23 und 20q13, jeweils bei 13% und 6% der Tumore amplifiziert waren. Es stellte sich heraus, dass das Onkogen mybL2, (welches kürzlich zu 20q13.1 lokalisiert wurde und von welchem man herausgefunden hat, dass es in Brustkrebs-Zelllinien überexprimiert ist) bei 7% der selben Gruppe von Tumoren amplifiziert war. MybL2 war in Tumoren mit normaler Kopienanzahl des Haupt-Locus 20q13 amplifiziert, was anzeigt, dass es eine unabhängig gewählt Amplifikationsregion bei 20q definieren könnte. Die gepunkteten Linien zwischen 11B und 11C teilen wiederum die komplexen Co-Amplifikationsmuster dieser Gene in Gruppen I-IV ein, welche ER-/p53+, ER-/p53-, ER+/p53+, und ER+/p53-entsprechen.
  • 11C und 11D zeigen, dass 70% der ER-/p53+ Proben für eines oder mehrere dieser Onkogene positiv waren, und dass myc das vorherrschende Onkogen war, welches in dieser Gruppe amplifiziert war. Im Gegensatz dazu zeigten nur 43% der Proben in der ER+/p53- Gruppe Co-Amplifikation einer dieser Onkogene, und diese Information könnte wiederum mit den klinischen Parametern, in 11A gezeigt, korreliert werden. Daher ermöglicht die Mikroarray-Technologie der vorliegenden Erfindung, dass eine große Anzahl an Tumorproben in geeigneter Weise und schnell auf diese vielen Charakteristiken hin überprüft werden kann und nach Mustern der Genexpression, welche im Zusammenhang mit der klinischen Präsentation des Patienten und der molekularen Evolution der Krankheit stehen könnten, analysiert werden kann. Ohne die Mikroarray-Technologie der vorliegenden Erfindung ist es schwieriger, diese Korrelationen zu erhalten.
  • Ein spezifisches Verfahren für den Erhalt dieser Korrelationen ist in 12 dargestellt, welche eine Vergrößerung des rechten Abschnitts aus 11B ist. Das Mikroarray 76 (10A) ist in Sektionen angeordnet, welche siebzehn Reihen und neun Säulen von kreisförmigen Orten enthalten, welche Querschnitten zylindrischer Gewebeproben von verschiedenen Tumoren entsprechen, wobei jeder Ort in dem Mikroarray durch die Koordinaten (Reihe, Säule) repräsentiert werden kann. Zum Beispiel haben die Proben in der ersten Reihe der ersten Sektion Koordinatenpositionen (1,1), (1,2) ... (1,9), und die Proben in der zweiten Reihe haben Koordinatenpositionen (2,1), (2,2) ... (2,9). Jede dieser Array-Koordinaten kann verwendet werden, um Gewebeproben von entsprechenden Positionen auf sequenziellen Sektionen des Rezipientenblocks zu lokalisieren, um Gewebeproben des Arrays zu identifizieren, welche aus dem gleichen Gewebezylinder geschnitten wurden.
  • 12 stellt eine konzeptionelle Vorgehensweise für das Organisieren und Analysieren des Arrays dar, wobei das rechteckige Array in eine lineare Repräsentation umgewandelt werden kann, bei der jedes Kästchen der linearen Repräsentation einer Koordinatenposition des Arrays entspricht. Jede der Reihe an Kästchen kann so ausgerichtet sein, dass jedes Kästchen, welches einer identischen Array-Koordinatenposition entspricht, über anderen Kästchen der gleichen Koordinatenposition angeordnet ist. Daher können die Kästchen, die durch die gepunktete Linie 1 verbunden sind, den Ergebnissen entsprechen, die erhalten werden können, indem man die Ergebnisse an einer Koordinatenposition [zum Beispiel (1,1)] in aufeinander folgenden dünnen Sektionen des Donorblocks betrachtet, oder klinischen Daten, welche vielleicht nicht von dem Mikroarray erhalten wurden, die jedoch in das System eingegeben werden können, um Gewebe von einem Tumor, welches einer Koordinatenposition entspricht, ferner zu identifizieren. Auf ähnliche Weise entsprechen die Kästchen, die durch die gepunktete Linie 10 verbunden sind, den Ergebnissen, welche bei Koordinatenposition (2,1) des Arrays gefunden werden können, und die Kästchen, welche durch die gepunktete Linie 15 verbunden sind, entsprechen den Ergebnissen der Koordinatenposition (2,6) des Arrays. Die Buchstaben a, b, c, d, e, f, g und h entsprechen aufeinander folgenden Sektionen des Donorblocks, die geschnitten wurden, um das Array zu bilden.
  • Durch einen Vergleich der ausgerichteten Kästchen entlang der Linie 1 in 12 wird ersichtlich, dass ein Tumor von einer Frau, die sich nach den Wechseljahren befindet, mit keiner metastatischen Erkrankung in ihren Lymphknoten zur Zeit der chirurgischen Resektion, wobei der Tumor weniger als Stufe 3 aufwies, jedoch wobei die Histologie des Tumors mindestens Grad III war, erhalten wurde. Ein Gewebeblock wurde von diesem Tumor genommen und ist mit dem Rezipientenarray bei der Koordinatenposition (1,1) assoziiert. Diese Array-Position wurde in acht parallele Sektionen (a, b, c, d, e, f, g und h) sektioniert, von der jede eine repräsentative Sektion des zylindrischen Arrays enthielt. Jede dieser Sektionen wurde mit einer unterschiedlichen Sonde, welche für ein bestimmtes molekulares Kennzeichen spezifisch war, analysiert. Bei Sektion a zeigten die Ergebnisse an, dass diese Gewebeprobe p53+ war; bei Sektion b, dass es ER- war; bei Sektion c, dass es keine Amplifikation des mybL2-Onkogens zeigte; bei den separaten Sektionen d, e, f, g und h, dass sie positiv für die Amplifikation von 20q13, 17q23, myc, cnd1 und erbB2 war.
  • Ähnliche Vergleiche molekularer Charakteristiken des Tumorprobenzylinders, welcher bei Koordinatenposition (2,1) platziert wurde, können angestellt werden, indem man die senkrechte Linie 10 in 12 verfolgt, welche das zehnte Kästchen in jeder Linie verbindet und der zweiten Reihe, ersten Säule (2,1) des Arrays 76 in 10(A) entspricht. Auf ähnliche Weise können die Charakteristiken der Sektionen des Tumorprobenzylinders bei Koordinatenposition (2,6) analysiert werden, indem man die senkrechte Linie 15 hinunter durch das 15. Kästchen jeder Reihe verfolgt. Auf diese Art und Weise können parallele Informationen über die separaten Sektionen des Arrays für alle 372 Positionen des Arrays durchgeführt werden. Diese Informationen können visuell zur Analyse, wie in 12, präsentiert werden, oder zur Analyse und Korrelation verschiedener molekularer Charakteristiken (wie zum Beispiel Muster onkogener Amplifikation und das Entsprechen dieser Amplifikationsmuster mit der klinischen Präsentation des Tumors) in eine Datenbank eingegeben werden.
  • Die Analyse aufeinander folgender Sektionen von den Tumor-Arrays ermöglicht die Co-Lokalisierung Hunderter verschiedener DNA-, RNA-, Protein- oder anderer Targets in den gleichen Zellpopulationen in morphologisch definierten Regionen jedes Tumors, was die Erstellung einer Datenbank einer groben Anzahl von korrelierten genotypischen oder phänotypischen Charakteristiken unkultivierter humaner Tumore erleichtert. Die Auswertung von mRNA In-Situ-Hybridisierungen oder Protein-Immunohistochemischer Färbung wird auch durch die Tumorgewebe-Mikroarrays erleichtert, da Hunderte von Proben in einem einzigen Experiment analysiert werden können. Die Tumorarrays reduzieren außerdem den Gewebeverbrauch, die Reagenzien-Verwendung und den Arbeitsaufwand erheblich, wenn man sie mit der Verarbeitung individueller herkömmlicher Proben nacheinander zur Sektionierung, Färbung und Auswertung vergleicht. Die kombinierte Analyse etlicher DNA-, RNA- und Protein-Targets stellt ein leistungsfähiges Mittel für die Stratifizierung von Tumorproben auf Grund ihrer molekularen Charakteristiken bereit. Solche Muster werden dabei behilflich sein, vorher nicht geschätzte, jedoch wichtige molekulare Merkmale der Tumore zu erkennen, von denen sich herausstellen könnte, dass sie diagnostischen oder prognostischen Nutzen haben könnten.
  • Analysemethoden zur Betrachtung und Auswertung der Experimente, die an Gewebearray-Sektionen durchgeführt werden können, beinhalten ein Hellfeldmikroskop, Fluoreszenzmikroskop, Konfokalmikroskop, ein digitales Abbildungssystem basierend auf einer CCD-Kamera, oder einen Photomultiplizierer oder einen Scanner, wie zum Beispiel diejenigen, welche bei den DNA-Chip-basierten Analysen verwendet werden.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die sehr kleinen Zylinder, die verwendet werden, um Gewebearrays zu erstellen, in den meisten Fällen genaue Informationen bereitstellen können, vor allem, wenn die Stelle für das Gewebe-Sampling von dem Donorblock so ausgewählt wird, dass sie histologische Strukturen enthält, die am repräsentativsten für Tumorregionen sind. Es ist auch möglich, Prüfgüter von mehreren histologisch definierten Regionen in einem einzigen Donorgewebeblock zu sammeln, um eine umfassendere Repräsentation des ursprünglichen Gewebes zu erhalten, und die Korrelation zwischen Phänotyp (Gewebemorphologie) und Genotyp direkt zu analysieren. Zum Beispiel könnte ein Array so aufgebaut sein, dass es Hunderte von Geweben enthält, welche die unterschiedlichen Stufen von Brustkrebsprogression (z.B. normales Gewebe, Hyperplasie, atypische Hyperplasie, intraduktaler Krebs, invasiver und metastatischer Krebs) beinhaltet. Die Gewebearray-Technologie würde dann verwendet werden, um die molekularen Vorgänge zu analysieren, welche der Tumorprogression entsprechen.
  • Ein engeres Zusammenpacken der Zylinder und ein größerer Rezipientenblock können auch eine sogar noch größere Anzahl an Proben pro Array bereitstellen. Gesamte Archive von Pathologie-Laboratorien können in replizierten 500-1000 Proben-Gewebe-Mikroarrays für molekulare Profilerstellung platziert werden. Unter Verwendung von Automatisierung des Vorgangs für das Sampling und die Array-Bildung ist es möglich, Dutzende von replizierten Tumor-Arrays herzustellen, wobei jedes Hunderte von Sektionen für Molekularanalysen bereitstellt. Die gleiche Strategie und Instrumentierung, welche für Tumor-Arrays entwickelt wurde, ermöglicht außerdem die Verwendung von Gewebezylindern für die Isolierung von RNA und DNA mit hohem Molekulargewicht von optimal fixierten, morphologisch definierten Gewebeelementen, wodurch die korrelierte Analyse der gleichen Tumore durch molekulare biologische Techniken (wie zum Beispiel PCR- basierte Techniken) basierend auf RNA und DNA ermöglicht wird. Bei einer geplanten Nukleinsäureanalyse wird die Gewebeprobe vorzugsweise (vor dem Einbetten in Paraffin) in einer auf Alkohol basierten Fixierung, wie zum Beispiel Ethanol oder Molecular Biology Fixative (Streck Laboratories, Inc., Omaha, NE) anstatt von Formalin, fixiert, da sich Formalin vernetzen kann und ansonsten die Nukleinsäure beschädigt. Der Gewebezylinder der vorliegenden Erfindung stellt eine reichliche Menge an DNA oder RNA bereit, an denen eine Reihe von Molekularanalysen durchgeführt werden kann.
  • Das Potenzial dieser Array-Technologie wurde in der FISH-Analyse von Gen-Amplifikationen in Brustkrebs dargestellt. FISH ist ein hervorragendes Verfahren zur Visualisierung und genauen Erkennung genetischer Neuanordnungen (Amplifikationen, Deletionen oder Translokationen) in individuellen, morphologisch definierten Zellen. Die kombinierte Tumorarray-Technologie ermöglicht, dass FISH ein leistungsstarkes Hochdurchsatzverfahren wird, welches die Analyse von Hunderten von Proben pro Tag ermöglicht.
  • Ausführungsform aus 13-23
  • Ein Beispiel für ein automatisiertes System für eine Hochgeschwindigkeits-Erstellung des Mikroarrays ist in 13-23 gezeigt. Das System beinhaltet eine Bühne 100, welche einen x-Antrieb 102 und einen y-Antrieb 104 aufweist, die jeweils eine Antriebswelle 106, 108 rotieren. Die Welle 108 bewegt eine Probenbank 110 in eine y-Richtung, während die Welle 106 eine Ablage 112 auf der Bank 110 in eine x-Richtung bewegt. Auf einer vorderen Reihe der Ablage 112 sind drei Rezipienten-Behältnisse 116, 118 und 120 befestigt, von denen jedes einen Rezipienten-Paraffinblock 122, 124 oder 126 enthält, und ein Donorbehältnis 128, welches einen Donorparaffinblock 130 enthält, in dem eine Gewebeprobe 132 eingebettet ist. In einer hinteren Reihe auf der Ablage befinden sich zwei Multiwell-Donorablagen 132, 134 (welche mehrere Behältnisse zum Halten von Proben in einem flüssigen Medium enthalten) und ein Entsorgungsbehältnis 136.
  • Über der Bühne 100 ist ein Ausstanzergerät 140 angeordnet, welches sich in einer z-Richtung nach oben und unten bewegen kann. Das Gerät 140 beinhaltet einen zentralen, senkrecht angeordneten, Instrumentenantrieb 142, in dem sich ein Instrument 144 hin- und herbewegt. Das Gerät 140 beinhaltet außerdem einen geneigten Rezipienten-Ausstanzer-Antrieb 146 und einen geneigten Donor-Ausstanzer-Antrieb 148. Der Ausstanzer-Antrieb 146 beinhaltet einen reziproken Stößel 150, welcher einen röhrenförmigen Rezipientenausstanzer 154 an seinem distalen Ende trägt, und der Ausstanzer-Antrieb 148 beinhaltet einen reziproken Stößel 152, welcher einen röhrenförmigen Donor-Ausstanzer 156 an seinem distalen Ende trägt. Wenn der Stößel 150 ausgefahren ist (14), ist der Rezipienten-Ausstanzer 154 so positioniert, dass die obere Spitze seiner röhrenförmigen Bohrung mit dem Instrument 144 ausgerichtet ist, und wenn der Stößel 152 ausgefahren ist (16), dann ist der Donor-Ausstanzer 156 so positioniert, dass die obere Spitze seiner röhrenförmigen Bohrung mit dem Instrument 144 ausgerichtet ist.
  • Der sequenzielle Betrieb des Gerätes 140 wird in 13-17 gezeigt. Sobald die Vorrichtung wie in 13 zusammengesetzt ist, kann ein Computersystem verwendet werden, um das Gerät zu betreiben, um eine hohe Effizienz zu erzielen. Daher kann sich das Computersystem selbst initialisieren, indem es den Ort der Behältnisse auf der Ablage 112, in 13 gezeigt, feststellt. Darauf werden die x- und y-Antriebe betätigt, um die Bank 110 und die Ablage 112 zu der in 14 gezeigten Position zu bewegen, so dass die Betätigung von Stößel 150 den Rezipienten-Ausstanzer 154 zu einer Position über Position (1,1) in dem Rezipientenblock 122 ausfährt. Sobald der Ausstanzer 154 in Position ist, bewegt sich das Gerät in der z-Richtung nach unten, um eine zylindrische Bohrung in dem Paraffin des Rezipientenblocks auszustanzen. Dann bewegt sich das Gerät 140 in der z-Richtung nach oben, um den Ausstanzer 154 aus dem Paraffin-Rezipientenblock 122 herauszuheben, jedoch behält der Ausstanzer einen Paraffinkern, welcher einen zylindrischen Aufnahmebehälter in dem Rezipientenblock 122 hinterlässt. Daraufhin werden die x- und y-Antriebe betätigt, um die Bank 110 zu bewegen und das Entsorgungsbehältnis 136 unter dem Ausstanzer 154 zu positionieren. Der Instrumentenantrieb 142 wird dann betätigt, um das Instrument 144 in die offene Spitze des ausgerichteten Ausstanzers vorzuschieben, um den Paraffinkern aus dem Ausstanzer 154 in das Entsorgungsbehältnis 136 zu entfernen.
  • Das Instrument 144 wird von dem Rezipienten-Ausstanzer 154 zurückgezogen, der Stößel 150 wird zurückgezogen, und die x- und y-Antriebe bewegen die Bank 110 und die Ablage 112, um ein Donorbehältnis 128 in eine Position (in 16 gezeigt) zu bewegen, so dass das Vorrücken des Stößels 152 den Donorausstanzer 156 zu einem gewünschten Ort über dem Donorblock 130 vorrückt. Das Gerät 140 wird dann in der z-Richtung nach unten bewegt, um einen zylindrischen Gewebekern aus dem Donorblock 130 auszustanzen, und dann wird das Gerät 140 in der z-Richtung bewegt, um den Donor-Ausstanzer 156 zurückzuziehen, wobei die zylindrische Gewebeprobe in dem Ausstanzer behalten wird. Der x-y-Antrieb bewegt daraufhin die Bank 110 und die Ablage 112 zu der in 17 gezeigten Position, so dass eine Bewegung des Geräts 140 nach unten in der z-Richtung den Donor-Ausstanzer 156 in den Aufnahmebehälter an der Koordinatenposition (1,1) in Block 122, von dem der Rezipientenstöpsel entfernt wurde, vorrückt. Der Donor-Ausstanzer 156 wird unter dem Instrument 144 ausgerichtet, und das Instrument wird vorgerückt, um den behaltenen Gewebezylinder aus dem Donorausstanzer 156 zu entfernen, so dass der Donorgewebezylinder in dem Aufnahmebehälter des Rezipientenblocks 122 bleibt, wenn sich das Gerät 140 in der z-Richtung nach oben bewegt, um den Donor-Ausstanzer 156 von dem Rezipienten-Array einzufahren. Der Stößel 152 wird dann eingefahren.
  • Dieser Vorgang kann wiederholt werden, bis eine erwünschte Anzahl von Rezipienten-Aufnahmebehältern geformt und mit zylindrischen Donorgeweben an den gewünschten Koordinatenorten des Arrays gefüllt wurde. Obwohl dieses dargestellte Verfahren die sequenzielle Abwechslung der Bildung jedes Aufnahmebehälters und der Einführung des Gewebezylinders in den gebildeten Aufnahmebehälter zeigt, ist es auch möglich, alle Aufnahmebehälter in den Rezipientenblocks 122, 124 und 126 als einen anfänglichen Schritt zu bilden und dann zu dem Schritt des Erhalts der Gewebeproben und des Einführens dieser in die vorgeformten Aufnahmebehälter weiter zu schreiten. Die gleiche Gewebeprobe 132 kann wiederholt verwendet werden, oder die Probe 132 kann geändert werden, nachdem jede Donorgewebeprobe erhalten wurde, indem ein neuer Donorblock 130 in das Behältnis 128 eingeführt wird. Falls der Donorblock 130 geändert wird, nachdem jeder Gewebezylinder erhalten wurde, kann jede Koordinate des Arrays Gewebe von einer unterschiedlichen Gewebeprobe beinhalten.
  • In 18 ist eine Positionierungsvorrichtung gezeigt, welche dabei hilft, Strukturen von Interesse, von denen Donorproben genommen werden können, zu lokalisieren. Die Positionierungsvorrichtung beinhaltet einen Unterlagen-Objektträger 160, welcher sich zwischen den gegenüberliegenden Wänden des Donorbehältnisses 128 erstreckt, um einen Proben-Objektträger 162 zu tragen, auf dem eine dünne gefärbte Sektion der Probe 132 in dem Donorblock 130 befestigt ist. Unter Verwendung eines Mikroskops, welches auf dem Gerät 140 befestigt ist (das Objektiv des Mikroskops ist bei 166 gezeigt), können mikroanatomische Strukturen von Interesse gefunden werden. Die korrekte senkrechte Höhe des Geräts 140 über der oberen Fläche des Donorblocks 130 kann durch die Verwendung von zwei Positionierungslampen 168, 170, welche an dem Gerät 140 befestigt sind, bestimmt werden. Lichtstrahlen 172, 174 werden von den Lampen 168, 170 in einem Winkel projiziert, so dass die Strahlen an einem einzigen Punkt 176 zusammentreffen, wenn sich die senkrechte Höhe des Geräts 140 über der oberen Fläche des Lichts auf einem gewünschten z-Niveau befindet. Dieses gewünschte z-Niveau wird die Ausstanzer 152, 154 in einer angemessenen Höhe positionieren, so dass sie die Oberfläche von Block 130 an dem gewünschten Ort und in einer gewünschten Tiefe durchdringen.
  • Es ist vorteilhaft, wenn die Gewebezylinder, welche aus dem Block 130 ausgestanzt werden, sicher in die Rezipienten-Aufnahmebehälter, welche gebildet sind, um sie aufzunehmen, hinein passen. Falls der Donor-Ausstanzer 156 die gleichen inneren und äußeren Durchmesser wie der Rezipienten-Ausstanzer 154 aufweist, wird die zylindrische Donorgewebeprobe von dem inneren Durchmesser des Ausstanzers gebildet, und der Rezipienten-Aufnahmebehälter wird von dem äußeren Durchmesser des Ausstanzers gebildet. Diese Diskrepanz wird einen Aufnahmebehälter bereitstellen, welcher einen etwas größeren Durchmesser aufweist, als der Donorgewebezylinder. Daher weist, wie in 19 und 20 gezeigt, der Rezipientenausstanzer 154 vorzugsweise einen kleineren Durchmesser als der Donorausstanzer 156 auf. Der Rezipientenausstanzer wird daher einen zylindrischen Aufnahmebehälter bilden (welcher einen Durchmesser aufweist, der dem äußeren Durchmesser des Ausstanzers 154 entspricht), welcher im Wesentlichen den gleichen Durchmesser wie der Gewebeprobenzylinder 180 aufweist, welcher mit einem Durchmesser gebildet wird, der durch den inneren Durchmesser des Donorausstanzers 156 bestimmt wird.
  • 21 stellt einen Querschnitt durch das Rezipienten-Array dar, nachdem die Aufnahmebehälter 182 gebildet wurden und mit Gewebeprobenzylindern 180 gefüllt wurden. Kleine Trennwände aus Paraffinmaterial 122 trennen die Gewebezylinder 180, und die Aufnahmebehälter 182 sind, wie dargestellt, tiefer als die Probenzylinder 180, so dass ein kleiner Zwischenraum zwischen der Probe und dem Boden der Aufnahmebehälter vorhanden ist. Nachdem das Array gebildet wurde, kann ein Mikrotom verwendet werden, um eine dünne Sektion S von der Spitze des Blocks 122 abzuschneiden, so dass die Sektion S auf einem Proben-Objektträger 162 (18) befestigt werden kann, um dabei zu helfen, Strukturen von Interesse in der Gewebeprobe 132 zu lokalisieren. Das Mikrotom schneidet dann auch dünne parallele Sektionen a, b, c, d, e, f, g und h, die jeweils einer unterschiedlichen Molekularanalyse unterzogen werden können, wie bereits beschrieben.
  • Beispielhafte Betriebsumgebung
  • 22 und die folgenden Erläuterungen sollen eine kurze allgemeine Beschreibung einer geeigneten EDV-Umgebung, in der die Erfindung implementiert werden kann, bereitstellen. Die Erfindung ist in einer Reihe von Programmmodulen implementiert. Im Allgemeinen beinhalten Programmmodule Routinen, Programme, Komponenten, Datenstrukturen usw., welche bestimmte Aufgaben durchführen oder bestimmte abstrakte Datentypen implementieren. Die Erfindung kann mit anderen Computersystemkonfigurationen praktiziert werden, einschließlich tragbaren Vorrichtungen, Multiprozessorsystemen, mikroprozessor-basierter oder programmierbarer Verbraucherelektronik, Minicomputern, Zentralrechnern und dergleichen. Die Erfindung kann auch in verteilten EDV-Umgebungen praktiziert werden, wo Aufgaben durch entfernte Verarbeitungsvorrichtungen, welche durch ein Kommunikations-Netzwerk verbunden sind, durchgeführt werden. In einer verteilten EDV-Umgebung können Programmmodule in sowohl lokalen als auch entfernten Datenspeicherungsvorrichtungen befindlich sein.
  • Mit Bezug auf 22 ist eine Betriebsumgebung für eine dargestellte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Computersystem 220 mit einem Computer 222, welches mindestens eine Hochgeschwindigkeits-Verarbeitungseinheit (CPU) 224 umfasst, in Verbindung mit einem Speichersystem 226, einer Eingabevorrichtung 228 und einer Ausgabevorrichtung 230. Diese Elemente sind durch mindestens eine Bus-Struktur 232 untereinander verbunden.
  • Die dargestellte CPU 224 besitzt einen vertrauten Aufbau und beinhaltet ein Rechenwerk (ALU) 234 zur Durchführung von Rechnungen, eine Sammlung von Registern 236 für die temporäre Speicherung von Daten und Anweisungen, und eine Steuereinheit 238 zur Betriebssteuerung des Systems 220. Die CPU 224 kann ein Prozessor sein, welcher jegliche einer Reihe von Bauweisen, einschließlich Alpha von Digital; MIPS von MIPS Technology, NEC, IDT, Siemens und anderen; ×86 von Intel und anderen, einschließlich Cyrix, AMD, und Nexgen; 680×0 von Motorola; und PowerPC von IBM und Motorola, aufweisen kann.
  • Das Speichersystem 226 beinhaltet im Allgemeinen einen Hochgeschwindigkeits-Hauptspeicher 240 in der Form eines Mediums, wie zum Beispiel Schreib-Lese-Speicher(RAM)- und Lese-Speicher(ROM)-Halbleitervorrichtungen, und einem Sekundärspeicher 242 in der Form von Langzeit-Speichermedien, wie zum Beispiel Disketten, Festplatten, Bändern, CD-ROM, Flash-Speichern etc. und anderen Vorrichtungen, welche Daten unter Verwendung von elektrischen, magnetischen, optischen oder anderen Aufnahmemedien speichern. Der Hauptspeicher 240 kann außerdem einen Videodisplay-Speicher zur Wiedergabe von Bildern über eine Wiedergabevorrichtung beinhalten. Der Fachmann wird erkennen, dass der Speicher 226 eine Reihe alternativer Komponenten mit einer Reihe von Speicherkapazitäten umfassen kann.
  • Die Eingabe- und Ausgabevorrichtungen 228, 230 sind auch vertraut. Die Eingabevorrichtung 228 kann eine Tastatur, eine Maus, einen Scanner, eine Kamera, eine Capture Card, einen Endschalter (wie zum Beispiel Homing-, Sicherheits- oder Zustandsschalter), einen physikalischen Transducer (z.B. ein Mikrofon) usw. umfassen. Die Ausgabevorrichtung 230 kann ein Display, einen Drucker, einen Motorantrieb, einen Solenoid, einen Transducer (z.B. einen Lautsprecher) usw. umfassen. Einige Vorrichtungen, wie zum Beispiel ein Network-Interface oder ein Modem, können als Eingabe- und/oder Ausgabevorrichtungen verwendet werden.
  • Wie dem Fachmann vertraut ist, beinhaltet das Computersystem 220 ferner ein Betriebssystem und mindestens ein Anwendungsprogramm. Das Betriebssystem ist ein Software-Satz, welcher den Betrieb des Computers und die Zuweisung von Ressourcen steuert. Das Anwendungsprogramm ist der Software-Satz, welcher die vom Benutzer gewünschte Aufgabe durchführt, unter Verwendung der durch das Betriebssystem verfügbar gemachten Computer-Ressourcen. Beide sind in dem dargestellten Speichersystem 226 resident.
  • Zum Beispiel könnte die Erfindung mit einem Power Macintosh 8500, erhältlich von Apple Computer, oder einem IBM-kompatiblen Personalcomputer (PC) implementiert werden. Der Power Macintosh verwendet eine PowerPC 604 CPU von Motorola und betreibt ein MacOS-Betriebssystem von Apple Computer, wie zum Beispiel System 8. Eingabe- und Ausgabevorrichtungen können mit der CPU unter Verwendung des wohlbekannten SCSI-Interfaces oder mit Erweiterungskarten unter Verwendung des Peripherkomponenten-Interconnect(PCI)-Bus, gekoppelt werden. Eine typische Konfiguration eines Power Macintosh 8500 weist 72 Megabyte RAM für den Hochgeschwindigkeits-Hauptspeicher und eine 2 Gigabyte Festplatte für den Sekundärspeicher auf. Ein IBM-kompatibler PC könnte eine Konfiguration mit 32 Megabytes RAM für den Hochgeschwindigkeits-Hauptspeicher und eine 2-4 Gigabyte Festplatte für den Sekundärspeicher aufweisen.
  • Gemäß der Praxis von Fachmännern im Bereich der Computerprogrammierung wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf Handlungen und symbolische Repräsentationen von Betriebsschritten, welche durch das Computersystem 220 durchgeführt werden, beschrieben, außer es ist anders angegeben. Solche Handlungen und Betriebsschritte werden manchmal als computerausgeführt bezeichnet. Es wird sich verstehen, dass die Handlungen und symbolisch repräsentierten Betriebsschritte die Verarbeitung durch die CPU 224 von elektrischen Signalen, welche Datenbits repräsentieren, beinhaltet, was zu einer daraus resultierenden Transformation oder Reduktion der Repräsentation der elektrischen Signale führt, und dadurch dazu, dass die Verwaltung von Datenbits an den Speicherorten in dem Speichersystem 226 neu konfiguriert wird oder sich andernfalls der Betrieb des Computersystems, als auch andere Verarbeitung von Signalen verändert. Die Speicherorte, an denen die Datenbits verwaltet werden, sind physikalische Orte, welche besondere elektrische, magnetische oder optische Eigenschaften, welche den Datenbits entsprechen, aufweisen.
  • Beschreibung des Computer-Array-Systems
  • Bei 23 ist ein Blockdiagramm gezeigt, welches ein System zur Durchführung der Erfindung zeigt. Die Hardware wird bei Schritt 250 initialisiert, zum Beispiel indem die Position der Ausstanzer 154, 156, der Bank 110 und der Ablage 112 bestimmt wird. Das System kann dann durch den Betreiber bei Schritt 252 konfiguriert werden, zum Beispiel durch das Eingeben von Daten oder das Auffordern des Systems, den Ort (x-, y-, z-Koordinaten) der oberen rechten Ecke jedes Rezipientenblocks 122-126 zu finden, sowie auch die Orte der Ablagen 130-136. Die Anzahl an Donorblocks, Aufnahmebehältern, die Betriebsgeschwindigkeit usw. können ebenfalls zu diesem Zeitpunkt eingegeben werden.
  • Bei Schritt 254 fordert das System zur Eingabe von identifizierenden Informationen über den ersten Donorblock 130, welcher in Ablage 128 platziert wird, auf. Die identifizierende Information kann Zugangsnummerninformationen, klinische Informationen über die Probe und jegliche/oder weitere Informationen beinhalten, welche für das Analysieren der Tumorarrays nützlich wären. Bei Schritt 256 drückt der Betreiber einen Auswahlfunktionsknopf, welcher die Ausstanzer 154, 156 anhebt und ermöglicht, dass ein Joystick die Proben unter Verwendung der x-y-Antriebe bewegt. Die eingegebenen Daten werden bei Schritt 258 angezeigt und bei 260 bestätigt.
  • Bei Schritt 262 erhält das System dann eine oder mehr Donorproben von dem identifizierten Donorblock und fordert den Benutzer zur Eingabe von Information über den nächsten Donorblock auf. Falls Informationen über einen anderen Block eingegeben werden, kehrt das System zu Schritt 256 zurück und erhält die gewünschte Anzahl von Proben von dem neuen Block. Nachdem ein neuer Donorblock in dem Behältnis 128 platziert wurde, überprüft das System auch die Position der Ausstanzer bei Schritt 268. Falls keine Informationen über einen anderen Block bei Schritt 264 eingegeben werden, bewegt das System die Donorablage zu der Nachladeposition, so dass ein Block 130 in der Donorablage entfernt werden kann. Dieses System kann auch für das Sampling zylindrischer Biopsien von histologisch gesteuerten Stellen von Proben (wie zum Beispiel Tumoren) zur DNA/RNA-Isolierung angepasst werden.
  • Die automatisierte Tumorarray-Technologie ermöglicht leicht das Testen von Dutzenden oder Hunderten von Markern von dem gleichen Satz an Tumoren. Diese Studien können in einem multizentrischen Rahmen durchgeführt werden, indem replizierte Tumorarrayblocks oder Sektionen an andere Laboratorien gesendet werden. Die gleiche Vorgehensweise wäre besonders wertvoll für das Testen neu entdeckter Molekularmarker in Bezug auf deren diagnostischen, prognostischen oder therapeutischen Nutzen. Die Gewebearray-Technologie erleichtert auch die grundlegende Krebsforschung, indem sie eine Plattform für die schnelle Profilerstellung von Hunderten oder Tausenden von Tumoren auf den DNA-, RNA- und Protein-Niveaus bereitstellt, was zum Aufbau einer korrelierten Datenbank von Biomarkern von einer großen Sammlung von Tumoren führt. Zum Beispiel erfordert die Suche nach der Amplifikation von Target-Genen die korrelierte Analyse der Amplifikation und Expression von Dutzenden von Kandidatgenen und Loci in den gleichen Zellpopulationen. Es wäre schwierig, solche extensiven molekularen Analysen einer definierten großen Reihe von Tumoren mit herkömmlichen Technologien durchzuführen.
  • Beispiele von Array-Technologie
  • Die Anwendungen der Gewebearraytechnologie sind nicht auf Krebsstudien beschränkt, obwohl die folgenden Beispiele 1-4 Ausführungsformen ihrer Verwendung in Verbindung mit der Analyse von Neoplasmen offenbaren. Die Arrayanalyse könnte auch für das Verständnis der Expression und des Maßes mehrerer Gene bei anderen Krankheiten, als auch in normalem humanem oder tierischem Gewebe, einschließlich Geweben von unterschiedlichen transgenen Tieren oder kultivierten Zellen behilflich sein.
  • Gewebearrays können auch verwendet werden, um weitere Analysen an Genen und Targets, die zum Beispiel von Hochdurchsatzgenomen, wie zum Beispiel DNA-Sequenzierung, DNA-Mikroarrays, oder SAGE (serielle Analyse von Genexpression) entdeckt werden, durchzuführen (Velculescu et al., Science 270:484-487, 1995). Gewebearrays können auch verwendet werden, um Reagenzien für die Krebsdiagnostik auszuwerten, zum Beispiel spezifische Antikörper oder Sonden, die mit bestimmten Geweben bei unterschiedlichen Stufen der Krebsentwicklung reagieren, und die Progression genetischer Veränderungen sowohl in gleichen als auch unterschiedlichen Krebstypen, oder in anderen Krankheiten als Krebs, zu verfolgen. Gewebearrays können verwendet werden, um prognostische Marker oder Marker, die Therapieergebnisse von Krebserkrankungen vorhersagen, zu identifizieren und zu analysieren. Gewebearrays, welche von Hunderten von Krebserkrankungen zusammengestellt wurden, die von Patienten mit bekannten Ergebnissen stammen, ermöglichen, dass ein oder mehrere DNA-, RNA- und Proteinuntersuchungen an diesen Arrays durchgeführt werden können, um wichtige prognostische Marker oder Marker, welche ein Therapieergebnis vorhersagen, zu bestimmen.
  • Gewebearrays können außerdem verwendet werden, um dabei zu helfen, eine optimale Therapie für bestimmte Patienten, die bestimmte Tumormarkerprofile zeigen, herauszufinden. Zum Beispiel kann ein Array von Tumoren analysiert werden, um zu bestimmen, welche HER-2 amplifizieren und/oder überexprimieren, so dass die Tumorart (oder genauer die Testperson, von der der Tumor genommen wurde) ein guter Kandidat für eine Anti-HER-2 Herceptin-Immuntherapie wäre. In einer anderen Anwendung können Gewebearrays verwendet werden, um neue Targets für eine Gentherapie zu finden. Zum Beispiel können cDNA-Hybridisierungsmuster (wie zum Beispiel auf einem DNA-Chip) die differenzielle Genregulierung in einem Tumor einer besonderen Gewebeart (wie zum Beispiel Lungenkrebs) offenbaren, oder eine besondere histologische Unterart des bestimmten Tumors (wie zum Beispiel ein Adenokarzinom der Lunge). Die Analyse jedes solcher Genkandidaten auf einem großen Gewebearray, welches Hunderte von Tumoren enthält, würde dabei helfen zu bestimmen, welche das erfolgversprechendste Target für die Entwicklung diagnostischer, prognostischer oder therapeutischer Vorgehensweisen für Krebs ist.
  • BEISPIEL 1
  • Gewebeproben
  • Insgesamt 645 Brustkrebsproben wurden für den Aufbau eines Brustkrebs-Tumor-Gewebemikroarrays verwendet. Die Prüfgüter beinhalteten 372 frisch eingefrorene in Ethanol fixierte Tumore, als auch 273 in Formalin fixierte Brustkrebsarten, normale Gewebe und Fixierungskontrollen. Die Untergruppe gefrorener Brustkrebs-Prüfgüter wurde wahllos von der Tumorbank des Instituts für Pathologie, Universität Basel, ausgewählt, welche mehr als 1500 gefrorene Brustkrebse, die durch chirurgische Resektionen während der Jahre 1986-1997 erhalten wurden, beinhaltet. Lediglich Tumore von dieser Tumorbank wurden für die Molekularanalysen verwendet. Diese Untergruppe wurde von einem Pathologen betrachtet, welcher bestimmte, dass die Proben 259 duktale, 52 lobulare, 9 medulläre, 6 muzinöse, 3 kribriforme, 3 tubuläre, 2 papilläre, 1 histiozytisches, 1 Klarzellen- und 1 lipidreiches Karzinom(e) beinhaltete. Es gab auch 15 duktale Karzinome in situ, 2 Karzinosarkomas, 4 primäre Karzinome, die vor der Operation Chemotherapie erhalten hatten, 8 rekurrente Tumore und 6 Metastasen. Eine histologische Gradierung wurde lediglich bei invasiven Primärtumoren, welche keiner vorherigen Chemotherapie unterzogen worden waren, durchgeführt. Von diesen Tumoren waren 24% Grad 1, 40% Grad 2 und 36% Grad 3. Die pT-Stufe war pT1 bei 29%, pT2 bei 54%, pT3 bei 9% und pT4 bei 8%. Achsellymphdrüsen waren bei 282 Patienten untersucht worden (45% pN0, 46% pN1, 9% pN2). Alle vorher noch nicht fixierten Tumore wurden in kaltem Ethanol bei +4°C über Nacht fixiert und dann in Paraffin eingebettet.
  • BEISPIEL 2
  • Immunhistochemie
  • Nach der Bildung des Arrays und Sektionierung des Donorblocks wurden indirekte Standard-Immunperoxidase-Verfahren für die Immunhistochemie verwendet (ABC-Elite, Vector Laboratories). Monoklonale Antikörper von DAKO (Glostrup, Dänemark) wurden für die Erkennung von p53 (DO-7, Maus, 1:200), erbB-2 (c-erbB-2, Hase, 1:4000), und den Östrogen-Rezeptor (ER ID5, Maus, 1:400) verwendet. Eine Mikrowellen-Vorbehandlung wurde für die Wiedergewinnung von p53 (30 Minuten bei 90°C) und erbB-2 Antigen (60 Minuten bei 90°C) durchgeführt. Diaminobenzidin wurde als Chromogen verwendet. Tumore mit bekannter Positivität wurden als positive Kontrollen verwendet. Der Hauptantikörper wurde für negative Kontrollen ausgelassen. Tumore wurden für ER oder p53 als positiv betrachtet, falls eine unmissverständliche nukleare Positivität bei mindestens 10% der Tumorzellen gesehen wurde. Die erbB-2 Färbung wurde subjektiv in 3 Gruppen eingestuft: Negativ (keine Färbung), schwach positiv (schwache membranöse Positivität), stark positiv (starke membranöse Positivität).
  • BEISPIEL 3
  • Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH)
  • Es wurden zweifarbige FISH-Hybridisierungen unter Verwendung von Spektrum-Orange-gekennzeichneten Cyclin D1-, myc- oder erbB2-Sonden zusammen mit entsprechenden FITC-gekennzeichneten zentromerischen Referenzsonden (Vysis) durchgeführt. Einfarbige FISH-Hybridisierungen wurden mit Spektrum-Orange gekennzeichneten 20q13 minimalen gemeinsamen Regionen (Vysis, und vgl. Tanner et al., Cancer Res. 54:4257-4360 (1994)), mybL2 und 17q23 Sonden (Barlund et al., Genes Chrom. Cancer 20:372-376 (1997) gemacht. Vor der Hybridisierung wurden Tumorarraysektionen deparaffinisiert, luftgetrocknet und in 70, 85 und 100% Ethanol dehydriert, gefolgt von der Denaturierung für 5 Minuten bei 74°C in 70% Formamid-2 × SSC-Lösung. Die Hybridisierungsmischung enthielt 30 ng von jeder der Sonden und 15 μg humaner Cot1-DNA. Nach einer Hybridisierung über Nacht bei 37°C in einem befeuchteten Raum, wurden Objektträger gewaschen und mit 0,2 μM DAPI in einer Antifade-Lösung gegengefärbt. FISH-Signale wurden mit einem Zeiss-Fluoreszenz-Mikroskop ausgewertet, welches mit Doppelbandpassfiltern für die gleichzeitige Visualisierung von FITC und Spektrum-Orange Signalen ausgestattet war. Über 10 FISH-Signale pro Zelle oder enge Bündel von Signalen wurden als ein Indikator für Genamplifikation betrachtet.
  • BEISPIEL 4
  • mRNA In-Situ-Hybridisierung
  • Für mRNA In-Situ-Hybridisierung wurden Tumorsektionen vor ihrer Hybridisierung deparaffinisiert und getrocknet. Synthetische Oligonukleotid-Sonden, gerichtet gegen erbB2 mRNA (Genbank Zugangsnummer X03363, Nukleotiden 350-396) wurden am 3'-Ende mit 33P-dATP unter Verwendung von Terminal-Deoxynukleotidyltransferase gekennzeichnet. Sektionen wurden in einem befeuchteten Raum bei 42°C 18 Stunden lang mit 1 × 107 CPM/ml der Sonde in 100 μL der Hybridisierungsmischung (50% Formamid; 10% Dextransulfat, 1% Sarkosyl, 0,02M Natriumphosphat, pH 7,0, 4 × SSC, 1 × Denhardt's Lösung und 10 mg/ml ssDNA) hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Sektionen mehrere Male in 1 × SSC bei 55°C gewaschen, um ungebundene Sonde zu entfernen, und kurz dehydriert. Die Sektionen wurden drei Tage lang Phosphorabbildungs-Screens ausgesetzt, um ERBB2- und mRNA-Expression zu visualisieren. Negative Kontrollsektionen wurden vor ihrer Hybridisierung mit RNase behandelt, was alle Hybridisierungssignale beseitigte.
  • Das vorliegende Verfahren ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse von Hunderten von Proben pro Array. Daher stellt diese Technologie ein Ausmaß an Mengenzunahme in der Anzahl der Proben, die analysiert werden können, bereit, im Vergleich zu vorherigen Blöcken, bei denen ein paar Dutzend individueller in Formalin fixierter Proben in einer weniger definierten oder undefinierten Konfiguration vorlagen und für Antikörper-Tests verwendet wurden. Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung beinhalten die geringfügige Zerstörung der ursprünglichen Gewebeblöcke, und ein optimiertes Fixierungsprotokoll, welches die Nützlichkeit dieser Methode zur Visualisierung von DNA- und RNA-Targets ausweitet. Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch eine bessere Beschaffung und Verteilung humaner Tumorgewebe für Forschungszwecke. Gesamte Archive von Zehntausenden von existierenden in Formalin fixierten Geweben von Pathologie-Laboratorien können in ein paar Dutzend Gewebe-Mikroarrays mit hoher Dichte platziert werden, um viele Varianten von Tumorarten, als auch unterschiedliche Stufen der Tumorprogression zu untersuchen. Die Tumorarray-Strategie ermöglicht außerdem das Testen von Dutzenden oder sogar Hunderten von potenziellen prognostischen oder diagnostischen Molekularmarkern von der gleichen Tumorgruppe. Alternativ dazu stellen die zylindrischen Gewebeprüfgüter Proben bereit, die verwendet werden können, um DNA und RNA für Molekularanalysen zu isolieren.
  • BEISPIEL 5
  • Gewebemikroarrays für Genamplifikations-Untersuchungen in vielen unterschiedlichen Tumorarten
  • Um das schnelle Screening auf molekulare Veränderungen in vielen unterschiedlichen bösartigen Tumoren zu erleichtern, wurde ein Gewebemikroarray bestehend aus Prüfgütern von 17 unterschiedlichen Tumorarten, von 397 individuellen Tumoren, in einem einzigen Paraffinblock aufgereiht. Die Amplifikation von drei Onkogenen (CCND1, MYC, ERBB2) wurde in drei Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierungs(FISH)-Experimenten von aufeinander folgenden Sektionen, die von dem Mikroarray abgeschnitten wurden, analysiert. Die Amplifikation von CCND1 wurde bei Brust-, Lungen-, Hals- und Kopf-, und Blasenkrebs, als auch bei Melanomen gefunden. ERBB2 war in Blasen-, Brust-, Dickdarm-, Magen-, Hoden- und den Lungenkrebsen amplifiziert. MYC war in Brust-, Dickdarm-, Nieren-, Lungen-, Eierstock-, Blasen-, Kopf- und Hals- und Endometrialkrebsen amplifiziert.
  • Das Mikroarray wurde aus insgesamt 417 Gewebeprüfgütern, bestehend aus 397 Primärtumoren von 17 unterschiedlichen Tumorarten und 20 normalen Geweben aufgebaut, welche schnellgefroren und bei –70°C gelagert wurden. Die Proben wurden in kaltem Ethanol (+4°C) 16 Stunden lang fixiert und dann in Paraffin eingebettet. Von jedem Block wurde eine H&E-gefärbte Sektion hergestellt, um repräsentative Tumorregionen zu definieren. Gewebezylinder mit einem Durchmesser von 0,6 mm wurden dann von Tumorbereichen jedes „Donor"-Gewebeblocks ausgestanzt und unter Verwendung eines spezialangefertigten Präzisionsinstruments wie beschrieben in einen Rezipienten-Paraffinblock gebracht. Dann wurden 5 µm Sektionen des daraus resultierenden Multitumor-Gewebemikroarray-Blocks auf Glasobjektträger übertragen, unter Verwendung des Paraffinsektionierungs-Hilfssystems (klebstoffbeschichtete Objektträger, (PSA-CS4x), Klebeband, UV-Lampe; Instrumedics Inc., New Jersey), welches die Kohäsion von 0,6 mm Arrayelementen unterstützt.
  • Der Primärtumor bestand aus 96 Brustkrebsen (41 duktale, 28 lobulare, 6 medulläre, 5 muzinöse und 4 tubuläre Karzinome, 7 duktale Karzinome In Situ (DCIS) und 5 phylloide Tumore), 80 Lungenkarzinomen (31 Stachelzellen-, 11 Großzellen-, 2 Kleinzellen- 31 Adeno- und 5 Bronchioalveolarkarzinome), 17 Kopf- und Halskrebsen (12 Stachelzellenkarzinome der Mundhöhle und 5 des Kehlkopfes), 32 Adenokarzinomen des Dickdarms, 4 Karzinoiden (3 der Lunge und eines des Dünndarms), 12 Adenokarzinomen des Magens, 28 Klarzellen-Nierenzellenkarzinomen, 20 Hodenkarzinomen (10 Seminome und 10 Teratome), 37 Übergangszellenkarzinomen der Harnblase (33 invasive (pT1-4) und 4 nicht invasive Tumore), 22 Prostatakrebsen, 26 Eierstockkarzinomen (12 seröse, 12 endometrische und 2 muzinöse Tumore), 13 Karzinomen des Endometriums, 3 Karzinomen der Schilddrüse, 3 Phäochromozytomen und 4 Melanomen. Normales Gewebe aus Brust, Prostata, Pankreas, Dünndarm, Magen, Speicheldrüse, Dickdarm und Nieren wurde als Kontrolle verwendet.
  • Die Gewebemikroarray-Sektionen wurden vor der Hybridisierung gemäß dem Paraffin Pretreatment Reagent Kit protocol (Vysis, Illinois) behandelt. FISH wurde mit Spektrum-Orange gekennzeichneten CCND1-, ERBB2- und MYC-Sonden durchgeführt. Spektrum-Grün gekennzeichnete zentromerische Sonden CEP11 und CEP17 wurden als Referenz verwendet (Vysis, Illinois). Hybridisierungs- und Nachhybridisierungsspülungen geschahen gemäß der „LSI Procedure" (Vysis, Illinois). Daraufhin wurden Objektträger mit 125 ng/ml 4',6-diamin-2-phenylindol in Antifade-Lösung gegengefärbt. FISH-Signale wurden mit einem Zeiss Fluoreszenz-Mikroskop ausgewertet, welches mit Doppelbandpassfiltern zur gleichzeitigen Visualisierung von Spektrum-Grün und Spektrum-Orange-Signalen ausgestattet war (Vysis, Illinois). Eine Amplifikation wurde als das Vorhandensein (bei mindestens 5% der Tumorzellen) von entweder (a) mehr als 10 Gensignalen oder engen Bündeln von mindestens 5 Gensignalen; oder (b) mehr als 3 Mal so vielen Gensignalen als zentromerischen Signalen des jeweiligen Chromosoms definiert.
  • Es wurden zweiundsiebzig Amplifikationen in 968 erfolgreich hybridisierten Tumorprüfgütern gefunden, wobei keines der normalen Gewebe Amplifikation aufzeigte. Amplifikation involvierte normalerweise fast alle Tumorzellen innerhalb eines Array-Elements. CCND1-Amplifikation wurde in 6 von 16 Kopf- und Halskarzinomen (38%), 14 von 62 Brustkarzinomen (23%), 1 von 6 DCIS (17%), 3 von 27 Blasenkrebsen (11%), 7 von 76 Lungenkarzinomen (9%) und 1 von 4 Melanomen gefunden. MYC-Amplifikation wurde bei 2 von 11 endometrialen Krebsen (18%), 9 von 74 Brustkarzinomen (12%), 1 von 5 DCIS (20%), 1 von 17 Kopf- und Halskrebsen (6%) 1 von 22 Tumoren der Niere (5%), 2 von 24 Eierstockkarzinomen (8%), 1 von 17 Tumoren der Hoden (6%), 1 von 30 Dickdarmkarzinomen (3%), 7 von 78 Lungentumoren (9%) und bei 1 von 33 Blasentumoren (3%) beobachtet. ERBB2 war in 4 von 71 Brustkarzinomen (6%), 4 von 6 DCIS (67%), 2 von 11 Magenkrebsen (18%), 1 von 30 Dickdarmkarzinomen (3%), 1 von 17 Tumoren der Hoden (6%) und bei 1 von 75 Karzinomen der Lunge (1%) amplifiziert. Co-Amplifikationen von zwei Genen wurden bei zwei Brustkrebsen (CCND1/MYC und CCND1/ERBB2) und bei einem Hoden-Teratom (MYC und ERBB2) gefunden.
  • Aufeinander folgende Sektionen, die von dem Block geschnitten werden, stellen Ausgangsmaterial für die In-Situ-Erkennung von mehreren DNA-, RNA- oder Protein-Targets in vielen Geweben gleichzeitig, in einer massiv parallelen Art, bereit. Die Gewebearray-Technologie ermöglicht eine erhöhte Kapazität, Automatisierung, geringfügige Beschädigung der ursprünglichen Gewebeblöcke, von denen die Proben genommen werden, die präzise Positionierung von Gewebeproben und die Verwendung dieser Gewebe für unterschiedliche Arten von Molekularanalysen, neben der Immunfärbung. Es ist möglich 10-20 ausgestanzte Prüfgüter (oder mehr) von jedem Donorblock zu entnehmen, ohne diesen bedeutend zu beschädigen. Dies ermöglicht die Erzeugung mehrerer replizierter Array-Blöcke, wobei jeder identische Koordinaten und die gleichen Proben aufweist. Die Anwendung eines Präzisionsinstruments, um die Prüfgüter in einem vordefinierten Format abzulegen, vereinfacht auch die Entwicklung automatisierter Bildanalysestrategien für die aufgereihten Tumore. Abhängig von der Dicke der ursprünglichen Gewebeblöcke können zwischen 150 und 300 Sektionen von jedem Arrayblock geschnitten werden. Diese Technologie ermöglicht die Analyse von sogar kleinen Primärtumoren, wodurch oft einzigartige und wertvolle Tumorproben für eine große Anzahl von Analysen, welche in zukünftigen Untersuchungen von Interesse sein könnten, konserviert werden.
  • Die in diesem Beispiel berichteten Array-Daten stimmten mit der vorherigen Literatur über das Vorhandensein oder Fehlen von Genamplifikation in 73% der Auswertungen überein, obwohl die Anzahl an Prüfgütern pro Tumorart zu gering für eine umfassende Analyse einiger Tumorarten in dieser Pilotstudie war. Vorher beschriebene Amplifikationen wurden auf dem Array bei 9 von 25 Tumorarten, von denen weniger als 25 Prüfgüter untersucht wurden, nicht erkannt. Im Gegensatz dazu wurden, wenn mindestens 25 Fälle pro Tumorart analysiert wurden, 92% der bekannten Amplifikationen (11/12) erkannt.
  • In dieser Studie wurden gefrorene Tumorgewebe in kaltem Ethanol fixiert, da dieses Verfahren die Erhaltung von Nukleinsäuren mit guter Qualität von fixierten Gewebeprüfgütern ermöglicht. Sogar in Formalin fixierte Tumorgewebe, wie zum Beispiel diejenigen, welche bei einer Autopsie erhalten werden, können durch FISH auf DNA-Kopienanzahl-Veränderungen analysiert werden. Dennoch ist die Fixierung in kaltem Ethanol für FISH von Vorteil, da die Prüfgüter weniger Vorbehandlung benötigen, als die Prüfgüter, welche in 4% gepuffertem Formalin fixiert wurden. Eine Fixierung in kaltem Ethanol kann bewirken, dass RNAs in Paraffinblöcken nach nur wenigen Monaten der Lagerung degradieren, daher kann es unter Umständen nicht erwünscht sein, eine große Reihe wertvoller Gewebe in kaltem Ethanol zu fixieren, außer es werden RNA-Inhibitoren hinzugefügt oder die Blöcke auf eine Art und Weise gelagert, welche eine Degradierung verhindert.
  • BEISPIEL 6
  • PDGFB FISH Experimente unter Verwendung eines Multi-Tumor-Gewebearrays
  • In diesem Experiment wurde das Multi-Tumor-Gewebearray aus Beispiel 5 verwendet. Eine von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktor-ß(PDGFB)-Sonde wurde von Vysis Inc. von Downers Grove, IL. erhalten. Die Sonde wurde durch PCR-Screening einer genomischen Large-Insert-Bank unter Verwendung zweier sequenzierter Einzelkopiesequenzen (STS) in der Gensequenz als ein Target für die Entwicklung von PCR-Primern, welche im PCR-basierten Banken-Screening verwendet wurden, erhalten. Die durch das genomische Banken-Screening erhaltenen Treffer wurden ferner durch ihren Gehalt von STS, als auch durch die Hybridisierung ihrer Sonde zu Metaphasen-Chromosomen unter Verwendung von FISH verifiziert. Dies resultierte in einem Signal an dem erwarteten Chromosomenort von PDGFB.
  • PCR/STS-Screening kann unter Verwendung eines PCR- Primer-Satzes, der spezifisch für das Gen von Interesse ist, durchgeführt werden, wie beschrieben von Green & Olson, PNAS USA 87:1213-1217, 1990. Sonden für FISH können von Large-Insert-Banken (z.B. Cosmide, P1-Klone, BACs, PACs usw.) erzeugt werden, unter Verwendung eines PCR-basierten Screenings von aufgereihten und gepoolten Zarge-Insert-Banken. Sowohl Research Genetics (Huntsville, AL) als auch Genome Systems (St. Louis) führen ein derartiges Filter-Screening durch und verkaufen DNA-Pools zur Durchführung von Banken-Screening.
  • Ein Verfahren zur Isolierung des P1-Klons für PDGFB (pVYS309A) wäre das Screeening eines DNA-Pools einer humanen P1-Bank, von Genome Systems, Inc.. Individuelle Klone werden durch das Produzieren der erwarteten DNA-Fragement-Größe auf Gelen nach PCR identifiziert. Bakterienkulturen, welche Kandidaten-PDGFB-Klone enthalten, werden durch das Streichen auf einem Nähragarmedium für einzelne Kolonien gereinigt. Dann werden Kulturen von individuellen Kolonien gezüchtet und DNA mit Hilfe von Standard-Methoden isoliert. Durch PCR und Gel-Elektrophorese wird bestätigt, dass die DNA die gewünschte DNA-Sequenz enthält (STS-Bestätigung). Ein Prüfgut der DNA wird durch Nick-Translation oder wahlloses Priming mit Spektrum-Orange dUTP (Vysis) gekennzeichnet und es wird gezeigt, dass es zu der erwarteten Region von Chromosom 22q normaler Metaphasenchromosome durch FISH hybridisiert.
  • PCR-Primer für PDGFB können von der veröffentlichten Sequenz der cDNA dieses Gens (GenBank Zugang X02811) abgeleitet werden. Die bevorzugte Region für STS-Design ist die 3' nicht translatierte Region der cDNA. Etliche PCR-Primersätze für PDGFB befinden sich in öffentlichen Datenbanken, z.B. die Amplimere (PCR-Primersätze) PDGFB PCR1, PDGFB PCR2, PDGFB PCR3, stPDGFB.b, WI-8985, und können in der Genome-Datenbank (http://gdbwww.gdb.org/gdb/gdbtop.html) gefunden werden. WI-8985 Primersätze können auch in der Datenbank des Whitehead Institute (http://wwwgenome.wi.mit.edu/) und in der NIH Gene Map 98-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap98/) gefunden werden.
  • FISH wurde unter Verwendung von Standard-Protokollen durchgeführt, wie in Beispiel 5, und eine Hybridisierung der Sonde zu Proben des Gewebearrays wurde wie in Beispiel 5 erkannt. Eine Hybridisierung wurde bei den folgenden Tumorarten erkannt:
    Figure 00570001
  • Das Experiment dieses Beispiels stellt den ersten Beweis vorher nicht vermuteter hochgradiger Amplifikationen von PDGFB in bestimmten Arten von bösartigen Krebsen, wie zum Beispiel Brust-, Lungen-, Dickdarm-, Hoden-, Endometrial- und Blasenkrebs, bereit.
  • BEISPIEL 7
  • Genamplifikation während Prostatakrebsprogression
  • In dieser Studie wurden 5 unterschiedliche Genamplifikationen (AR, CMYC, ERBB2, Cyclin D1 und NMYC) durch FISH von aufeinander folgenden in Formalin fixierten Gewebemikroarray-Sektionen, welche Prüfgüter von mehr als 300 unterschiedlichen Prostatatumoren enthielten, untersucht. Aufgabe war es, einen umfassenden Überblick über die Genamplifikation bei unterschiedlichen Stufen der Prostatakrebsprogression, einschließlich von Proben von entfernten Metastasen, zu erhalten. Das Gewebemikroarray enthielt winzige Prüfgüter von 371 Proben.
  • Es wurden in Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete Tumor- und Kontrollproben von den Archiven des Institutes für Pathologie, Universität Basel (Schweiz) und des Tampere Universitätskrankenhauses (Finnland) erhalten. Der am wenigsten differenzierte Tumorbereich wurde als Prüfgut für das Gewebemikroarray ausgewählt. Die winzigen Proben, welche für mindestens eine FISH-Sonde interpretierbar waren, beinhalteten: I) transurethrale Resektionen von 32 Patienten mit gutartiger Prostatahyperplasie (BPH), welche als Kontrollen verwendet wurden; II) 223 Primärtumore, einschließlich 64 Krebse, welche zufällig bei transurethralen Resektionen für BPH festgestellt wurden; Stufe T1a/b, 145 klinisch lokalisierte Krebse von radikalen Prostatektomien, und 14 transurethrale Resektionen von Patienten mit einer primären, lokal extensiven Erkrankung; III) 54 lokale Rekurrenzen nach dem Versagen von Hormontherapie, einschließlich 31 transurethrale Resektionen von lebenden Patienten und 23 Proben, die durch Autopsien erhalten wurden; IV) Zweiundsechzig Metastasen, welche bei der Autopsie von 47 Patienten gesammelt wurden, welche einer Androgendeprivation durch eine Orchiektomie ausgesetzt waren und nachher an metastatischem Prostatakrebs im Endstadium verstorben waren. Metastatisches Gewebe wurde von den Beckenlympfknoten (8), der Lunge (21), der Leber (16), dem Rippenfell (5), den Nebennieren (5), der Niere (2), den mediastinalen Lymphknoten (1), dem Peritoneum (1), dem Magen (1) und dem Harnleiter (1) entnommen. Bei 23 Autopsien war Material von sowohl der primären als auch der metastatischen Stelle verfügbar. Mehr als ein Prüfgut pro Tumorprobe wurde in 44 von 339 Fällen aufgereiht. Ein Tumor wurde als amplifiziert betrachtet, wenn mindestens ein Prüfgut des Tumors Genamplifikation aufzeigte.
  • Das Array beinhaltete außerdem 48 pathologisch repräsentative Prüfgüter, welche beständig bei der Analyse von Sektionen mit allen FISH-Sonden versagten, und die daher von der Analyse ausgeschlossen wurden. Die meisten dieser Prüfgüter waren Autopsie-Prüfgüter. Die Anzahl an Prüfgütern, welche mit den unterschiedlichen Sonden evaluiert werden konnten, war variierbar, da die Hybridisierungs-Effizienz der Sonden sich etwas unterschied, einige Prüfgüter in dem Array gelegentlich während des Sektionierens oder des FISH-Verfahrens verloren gingen, und einige Tumore nur auf der Oberfläche des Blocks repräsentativ waren und sich die Morphologie beim Schneiden mehrerer Sektionen veränderte.
  • Das Prostatagewebe-Mikroarray wurde wie vorher in Beispiel 1 beschrieben, aufgebaut, mit der Ausnahme dass Prostata- anstatt von Brustkrebsproben verwendet wurden.
  • Es wurde eine zweifarbige FISH an Sektionen der aufgereihten in Formalin fixierten Prüfgüter durchgeführt, unter Verwendung von Spektrum-Orange gekennzeichneten AR-, CMYC-, ERBB2- und CyclinD1(CCND1)-Sonden mit entsprechenden FITC gekennzeichneten zentromerischen Sonden (Vysis, Downer's Grove, Illinois). Zusätzlich dazu wurde eine einfarbige FISH mit einer Spektrum-Orange gekennzeichneten NMYC-Sonde gemacht. Die Hybridisierung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Um zu ermöglichen, dass in Formalin fixierte Tumore auf dem Array zuverlässig durch FISH analysiert werden, wurden die Objektträger des Prostata-Mikroarrays zuerst deparaffinisiert, in 0,2 N HCl azetyliert, in 1M Natriumthiocyanat-Lösung bei 80°C 30 Minuten lang inkubiert und 10 Minuten lang bei 37°C in eine Protease-Lösung (0,5 mg/ml in 0,9% NaCl) (Vysis) getaucht. Dann wurden die Objektträger 10 Minuten lang in 10% gepuffertem Formalin nachfixiert, luftgetrocknet, 5 Minuten lang bei 73°C in 70% Formamid/2× SSC-Lösung (SSC ist 0,3M Natriumchlorid und 0,03M Natriumzitrat) denaturiert und in 70, 80 und 100% Ethanol dehydriert, gefolgt von einer Proteinase K-Behandlung (4 μg/ml phosphatgepufferte Saline) (GIBCOBRL, Life Technologies Inc., Rockville, Maryland) für 7 Minuten bei 37°C. Danach wurden die Objektträger dehydriert und hybridisiert.
  • Die Hybridisierungsmischung enthielt 3 μl jeder der Sonden und Cot1-DNA (1 mg/ml; GIBCOBRL, Life Technologies Inc., Rockville, Maryland) in einer Hybridisierungsmischung. Nach einer Hybridisierung über Nacht bei 37°C in einem feuchten Raum wurden die Objektträger gewaschen und mit 0,2 μM DAPI gegengefärbt. FISH-Signale wurden mit einem Zeiss Fluoreszenz-Mikroskop, welches mit einem Doppelbandpassfilter ausgestattet war, unter Verwendung von ×40-×100 Objektiven ausgewertet. Es wurde die relative Anzahl von Gensignalen im Verhältnis zu den zentromerischen Signalen gezählt. Kriterien für die Genamplifikation waren: mindestens 3 Mal mehr Testsonden-Signale als zentromerische Signale pro Zelle bei mindestens 10% der Tumorzellen. Test/Kontrollsignalverhältnisse in einem Bereich zwischen 1 und 3 wurden als Zunahmen mit niedrigem Grad betrachtet und wurden nicht als Beweis einer spezifischen Genamplifikation gezählt. Die Amplifikation von NMYC ohne eine Referenzsonde wurde definiert als mindestens 5 Gensignale bei mindestens 10% der Tumorzellen.
  • Hochqualitäts-Hybridisierungssignale mit sowohl zentromerischen als auch genzspezifischen Sonden wurden bei 96% der BPH-Prüfgüter für das Chromosom X/AR-Gen, bei 84% für Chromosom 8/CMYC, 81% für Chromosom 17/ERBB2 und 83% für Chromosom 11/Cyclin D1 erhalten. Bei den auswertbaren BPH-Prüfgütern betrug der Durchschnittsprozentsatz von Epithelialzellen mit zwei Signalen für Autosomalsonden 75%, wobei 20% ein Signal und 5% keine Signale zeigten. Der Prozentsatz an Zellen mit einem oder keinem Signal ist, wie man annimmt, auf die Trunkierung von Nuklei beim Sektionieren zurückzuführen. Bei den ausgestanzten (Einfach-Array-Element) Prüfgütern von Biopsie-Krebsproben, AR, CMYC, ERBB2 und CCND1 konnten FISH-Daten von jeweils 92%, 78%, 82% und 86% der Fälle erhalten werden. Die Erfolgsquote von FISH war niedriger bei Ausstanzungen von Autopsie-Tumoren (44-58%). Amplifikationen wurden nur dann als vorhanden gezählt, wenn die Kopienanzahl der Testsonde die der chromosomenspezifischen Zentromer-Referenzsonde 3-fach in 10% oder mehr der Tumorzellen übertraf. Dieses Kriterium wurde gewählt, da es wahrscheinlich ist, dass eine Amplifikation mit niedrigem Grad weniger relevant ist, und da locusspezifische Sonden oft etwas höhere Kopienanzahlen aufweisen als zentromerische Sonden, auf Grund von Signalspaltungen oder dem Vorhandensein von G2/M-Phasen-Zellen.
  • FISH mit der AR-Sonde offenbarte Amplifikation bei 23,4% der 47 hormonrefraktären lokalen Rekurrenzen. Amplifikation wurde genauso oft (22,0%) bei 59 Metastasen von hormonrefraktären Tumoren beobachtet. Der starke Zusammenhang zwischen AR-Amplifikation und hormonrefraktärem Prostatakrebs ist aus der Tatsache ersichtlich, dass nur zwei der 205 auswertbaren Primärtumore (1%) und keine der 32 BPH-Kontrollen eine AR-Amplifikation zeigte. Die zwei Ausnahmen beinhalteten einen Patienten mit lokal fortgeschrittenem und metastatischem Prostatakrebs, und einen anderen Patienten mit einer klinisch lokalisierten Erkrankung. Gepaarte Tumore von der Primärstelle des Krebses und von einer entfernten Metastase von 17 Patienten wurden erfolgreich auf AR-Amplifikation analysiert. Bei 11 dieser Patienten konnte an keiner der beiden Stellen AR-Amplifikation gesehen werden. Von den sechs verbleibenden Patienten zeigten 3 Patienten Amplifikation in sowohl der lokalen Tumormasse als auch in den entfernten Metastasen. In zwei Fällen wurde Amplifikation lediglich in dem Prüfgut von der Primärstelle gefunden, während in einem anderen Fall lediglich die entfernte Metastase Amplifikation zeigte.
  • Hochgradige CMYC-Amplifikationen wurden bei 5 von 47 auswertbaren metastatischen Ablagerungen (10,6%), bei 2 von den 47 lokalen Rekurrenzen (4,3%, beides metastatische Krebse), jedoch bei keinem der 168 auswertbaren Primärkrebse oder 31 BPH-Kontrollen gefunden. Der Vergleich zwischen unterschiedlichen Genamplifikationen innerhalb der Tumorzellen, definiert durch einzelne Ausstanz-Prüfgüter (Arrayelemente), zeigte, dass es einen bedeutenden Zusammenhang zwischen AR- und CMYC-Amplifikationen gab. CMYC war in 11,1% von 27 auswertbaren Ausstanzprüfgütern mit AR-Amplifikationen amplifiziert, jedoch lediglich in 1,7% von 235 Prüfgütern ohne AR-Amplifikationen (p=0,0041, Kontingenztabellenanalyse). AR war unabhängig davon in 24 Prüfgütern amplifiziert, während lediglich 4 Prüfgüter CMYC-Amplifikation aufwiesen, jedoch keine AR-Amplifikation.
  • Auf einer Tumor- um Tumorbasis gab es einen bedeutenden Zusammenhang zwischen AR und CMYC-Amplifikationen. CMYC war in 12,5% von 24 auswertbaren Tumoren mit AR- Amplifikationen amplifiziert, jedoch lediglich in 1,8% von 219 Tumoren ohne AR-Amplifikationen (p=0,003, Kontingenztabellenanalyse). AR war unabhängig davon in 21 Tumoren amplifiziert, während lediglich 4 Tumore CMYC-Amplifikation aufwiesen, jedoch keine AR-Amplifikation.
  • CCND1-Amplifikationen wurden bei 2 (1,2%) der 172 auswertbaren Primärtumore, bei 3 (7,9%) der 38 lokalen Rekurrenzen und bei 2 (4,7%) der 43 Metastasen gefunden. CCND1-Amplifikation erschien unabhängig von AR- oder CMYC-Amplifikation, wobei 4/7 CCND1-amplifizierte ausgestanzte Tumor-Prüfgüter keine Amplifikation für irgendwelche anderen getesteten Gene zeigten. Es gab keine ERBB2-Amplifikationen unter irgendwelchen der 262 auswertbaren Tumore oder 31 BPH-Kontrollen. Schließlich wurde eine Untergruppe der Tumore mit der NMYC-Sonde in einer Einfarben-FISH-Analyse analysiert. Von den 164 verfügbaren Tumoren zeigte keiner Amplifikation, wie durch das Fehlen von 5 oder mehr Signalen pro Zelle in >10% der Tumorzellen definiert.
  • Für diese Studie wurde ein Tumorarray aufgebaut, welches die Untersuchung des Musters von Amplifikationen von mehreren Genen in Prüfgütern, welche das gesamte Spektrum der Prostatakrebsprogression, einschließlich entfernter Metastasen, repräsentierten, ermöglichte. Die Tumorarray-Strategie erleichtert die standardisierte Analyse von mehreren Genen in den gleiche Tumoren, sogar in den gleichen spezifischen Tumorstellen unter Verwendung der gleichen Technologie, mit der gleichen Art von Sonden und ähnlichen Interpretationskriterien. In nur fünf FISH-Experimenten wurden 371 Proben auf fünf Gene überprüft, was in insgesamt mehr als 1400 auswertbaren FISH-Ergebnissen resultierte. Die Fähigkeit, eine zuverlässige Feststellung von Genamplifkationen bei in Formalin fixierten Geweben zu erreichen, weitet den Bereich möglicher Anwendungen für die Tumorarray-Technologie wesentlich aus.
  • Viele symptomatische Prostatakrebse werden sowohl hormonrefraktär als auch metastatisch, und es ist schwierig, zwischen diesen beiden klinischen Merkmalen zu unterscheiden, oder den molekularen Mechanismen, welche einen Beitrag zu jedem dieser Vorgänge leisten. Die Ergebnisse des vorliegenden Beispiels zeigen, dass eine AR-Amplifikation enger mit der Entwicklung von hormonrefraktärem Zellwachstum zusammenhängt, während CMYC-Amplifikation mit metastatischer Progression zusammenhängt. Die häufigste Genamplifikation bei Prostatakrebsen ist die des AR-Gens, welches normalerweise unabhängig von sowohl CMYC als auch Cyclin D1 amplifiziert wird. In dieser Studie traten CMYC-Amplifikationen häufiger bei den entfernten Metastasen (11%) als in den lokal rekurrenten Geweben (4%; beides von Patienten mit metastatischen Krebsen im Endstadium) auf, während AR-Amplififkationen genauso häufig bei beiden anatomischen Stellen auftraten (jeweils 22% und 23%). Dies legt die Vermutung nahe, dass AR einen Vorteil für ein hormomrefraktäres Wachstum mit sich bringt, und nicht für metastatische Dissemination, wobei das Gegenteil für CMYC gelten könnte.
  • Dieses Beispiel zeigt, dass das AR-Gen das häufigste Target ist, und oft das erste Target, welches für eine Amplifikation während der Prostatakrebsprogression ausgewählt wird. Zweitens scheinen, im Gegensatz zu AR, die Amplifikationen des CMYC-Onkogens hauptsächlich mit metastatischer Dissemination in Verbindung zu stehen. Schließlich amplifizieren Prostatakrebse gelegentlich auch das Cyclin D1-Gen, während es unwahrscheinlich ist, dass ERBB2- und NMYC-Amplifikationen eine bedeutende Rolle bei irgendeiner Stufe der Progression von Prostatakrebs spielen.
  • BEISPIEL 8
  • Schnelles Screening auf prognostische Marker bei Nierenzellkarzinomen (RCC) durch Kombinieren der cDNA-Array- und Tumor-Array-Technologien
  • Dieses Beispiel verwendet zuerst cDNA-Arrays, um Gene zu identifizieren, welche eine Rolle beim Nierenzellkarzinom (RCC) spielen, und analysiert danach sich abzeichnende Kandidatengene auf einem Tumor-Array auf ihre potenzielle klinische Bedeutung. Die Ergebnisse zeigen, dass die Kombination von Nukleinsäurearrays und Tumorarrays eine leistungsstarke Vorgehensweise ist, um Gene, die bei der RCC-Biologie eine Rolle spielen, schnell zu identifizieren und ferner auszuwerten.
  • Es wurde cDNA synthetisiert und radioaktiv gekennzeichnet, unter Verwendung von 50 μg von gesamter RNA von einer normalen Niere (Invitrogen) und einer Nierenkrebs-Zelllinie (CRL-1933) (ATCC, VA, USA) gemäß standardisierten Protokollen (Research Genetics; Huntsville, AL). Release I der humanen Genfilter von Research Genetics wurde für das differenzielle Expressionsscreening verwendet. Eine einzige Membran enthielt 5184 Punkte, von denen jeder 5 ng von cDNA bekannter Gene oder von ESTs (Expressed Sequence Tags) repräsentierte. Nach der separaten Hybridisierung wurden die beiden cDNA-Array-Filter (Research Genetics) drei Tage lang einem hochauflösenden Bildschirm (Packard) ausgesetzt. Das Genexpressionsmuster von 5184 Genen in normalem Gewebe und der Tumorzelllinie wurde auf einem Phosphorimager (Cyclone, Packard) analysiert und verglichen. Um Gene/ESTs als über- oder unterexprimiert zu definieren, war sowohl ein mindestens zehnfacher Expressionsunterschied zwischen normalem Gewebe und der Zelllinie unter Verwendung der Pathfinder Software (Research Genetics, Huntsville, AL), als auch die visuelle Bestätigung eines unmissverständlichen Unterschieds in der Färbungsintensität auf den Filtern erforderlich.
  • Für den Aufbau des Nierentumor-Mikroarrayblocks wurde eine Sammlung von 615 Nierentumoren nach einer Nephrektomie auf die Verfügbarkeit von repräsentativen in Paraffin eingebetteten Gewebeproben hin überprüft. Tumorproben von 532 Nierentumoren und Gewebe von 6 normalen Lungen wurden für das Tumor-Array ausgewählt. Die Tumore wurden von einem Pathologen gemäß TNM-Klassifizierung eingestuft, gemäß Thoenes gestaffelt (Pathol. Res. Pract. 181:125-143, 1986) und histologisch gemäß den Empfehlungen des UICC (Bostwick et al., Cancer 80:973-1001, 1997) subtypisiert. Kerngewebe-Biospsien (Durchmesser 0,6 mm) wurden von ausgewählten morphologisch repräsentativen Regionen individueller, in Paraffin eingebetteter Nierentumore (Donorblocks) ausgewählt und präzise in einem neuen Rezipienten-Paraffinblock (45 mm × 20 mm) unter Verwendung eines spezialangefertigten Instruments aufgereiht. Danach wurden 5 μm Sektionen des resultierenden Tumorgewebe-Mikroarrayblocks auf Glasobjektträger unter Verwendung des Paraffinsektionierungs-Hilfssystems (klebstoffbeschichtete Objektträger, (PSA-CS4x), Klebeband, UV-Lampe; Instrumedics Inc., New Jersey), welches die Kohäsion von 0,6 mm Arrayelementen unterstützt, übertragen.
  • Es wurden indirekte Standard-Immunperoxidase-Verfahren für die Immunohistochemie (ABC-Elite, Vectra Laboratories) verwendet, wie zum Beispiel in Moch et al., Hum. Pathol. 28:1255-1259, 1997 beschrieben. Ein monoklonaler Antikörper wurde für die Vimentinerkennung eingesetzt (Anti-Vimentin; Boehringer Mannheim, Deutschland, 1:160). Tumore wurden als positiv für Vimentin betrachtet, wenn eine unmissverständliche zytoplasmische Positivität in den Tumorzellen gesehen wurde. Eine Vimentin-Positivität in Endothelialzellen diente als innere Kontrolle. Die Vimentin-Positivität in Epithelialzellen wurde als negativ (keine Färbung) oder positiv (jegliche zytoplasmische Färbung) definiert.
  • Es wurde die Kontingenztabellenanalyse verwendet, um die Beziehung zwischen Vimentinexpression, Grad, Stufe und Tumorart zu analysieren. Das Gesamtüberleben wurde als die Zeit zwischen der Nephrektomie und dem Tod des Patienten definiert. Überlebensraten wurden unter Verwendung des Kaplan-Meier-Verfahrens aufgezeichnet. Überlebensunterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Log-Rang-Test bestimmt. Eine Cox'sche proportionale Gefahrenanalyse wurde verwendet, um einen Test auf unabhängige prognostische Information durchzuführen.
  • Zwei cDNA-Array-Membranen wurden mit radioaktiv gekennzeichneter cDNA von der normalen Niere und der Tumorzelllinie CRL-1933 hybridisiert. Das Experiment resultierte in 89 differenziell exprimierten Genen/ESTs. Eine Überexpression in CRL-1933 wurde für 38 Sequenzen gefunden, einschließlich 26 genannte Gene und 12 ESTs, während 51 Sequenzen (25 genannte Gene, 26 ESTs) unterexprimiert in der Zelllinie waren. Die Sequenz eines der nach oben regulierten Gene in der Zelllinie war identisch zu Vimentin.
  • Das Vorhandensein von epithelialen Tumorzellen wurde für jeden Gewebezylinder unter Verwendung eines H&E-gefärbten Objektträgers getestet. Vimentinexpression konnte auf den Gewebezylindern bei 483 Tumoren und allen 6 normalen Nierengeweben ausgewertet werden. Vimentinexpression war häufig bei Klarzellen-(51%) und papillarem RCC (61%), jedoch selten bei 23 chromophobem RCC (4%). Nur 2 von 17 Onkozytomen zeigten eine schwache Vimentinexpression (12%). Normale Nierentubuli exprimierten kein Vimentin. Der Zusammenhang zwischen Vimentinexpression und histologischem Grad und Tumorstufe wurde lediglich für Klarzellen-RCC ausgewertet. Vimentinexpression war häufiger bei Grad II-(44%) und Grad-III (42%) als bei Grad I-(13%) RCC (p<0,0001). Die Vimentinexpression war häufiger bei höheren Tumorstufen (60% bei Stufe pT1/2 gegen 40% bei Stufe pT3/4), jedoch war dieser Unterschied nicht bedeutend (p = 0,09).
  • Es bestand eine durchschnittliche Nachverfolgung von 52,9±51,4 Monaten (durchschnittlich 37, Minimum 0,1, Maximum 241 Monate). Ein schlechtes Gesamtüberleben stand in starkem Bezug zu einem hohen histologischen Grad (p<0,0001) und einer hohen Tumorstufe (p<0,0001). Der Zusammenhang zwischen Patientenprognose und Vimentinexpression wurde für Patienten mit Klarzellen-RCC ausgewertet. Vimentinexpression stand in starkem Zusammenhang mit einem kurzen Gesamtüberleben (p=0,007). Die proportionale Gefahrenanalyse mit den Variablen Tumorstufe, histologischer Grad und Vimentinexpression zeigt an, dass die Vimentinexpression ein unabhängiger Prädiktor der Prognose war, wobei das relative Risiko 1,6 (p=0,01) bei Klarzellen-RCC war.
  • Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, dass die Kombination von cDNA und Tumorarrays eine leistungsstarke Vorgehensweise für die Identifikation und weitere Auswertung von Genen, welche eine Rolle in humanen bösartigen Krebsen spielen, ist. Dieses Beispiel stellt dar, dass cDNA-Arrays verwendet werden können, um nach Genen zu suchen, die in Tumorzellen (wie zum Beispiel Nierenkrebs) im Vergleich zu normalem Gewebe (Nierengewebe in diesem Beispiel) differenziell exprimiert werden. Die Auswertung aller Kandidatgene, welche aus einem cDNA-Experiment an einem repräsentativen Satz unkultivierter Primärtumore hervorgehen würden, würde Jahre dauern, wenn traditionelle Verfahren der Molekularpathologie verwendet werden würden. Die Tumor-Mikroarraytechnologie erleichtert jedoch solche Studien merklich. Gewebearrays ermöglichen die gleichzeitige In-Situ-Analyse von Hunderten von Tumoren auf dem DNA-, RNA- und Proteinniveau, und ermöglicht sogar die Korrelation mit klinischen Nachverfolgungsdaten.
  • Diese Hochdurchsatzanalyse ermöglichte, dass merkliche Unterschiede in der Vimentinexpression zwischen Subtypen von Nierentumoren dargestellt werden konnten. Vimentin wurde häufig in papillarem und Klarzellen-RCC festgestellt, jedoch selten bei Onkozytomen und chromophobem RCC. Angesichts der hohen Rate an Vimentinpositivität bei Klarzellen-RCC, welche in diesem Beispiel festgestellt wurde, kann das Vorhandensein von Vimentinexpression als ein diagnostisches Merkmal verwendet werden, um eine Diagnose von Klarzellen-RCC von chromophobem RCC zu unterscheiden.
  • Dieses Beispiel stellt ferner dar, dass Tumorgewebearrays die Übertragung von Erkenntnissen aus grundlegenden Forschungen in klinische Anwendungen erleichtern kann. Die Geschwindigkeit der Analyse ermöglicht eine mehrstufige Strategie. Zuerst werden Molekularmarker oder Gene von Interesse auf einem Master-Multi-Tumor-Array, welches Prüfgüter von vielen (oder allen) möglichen humanen Tumortypen enthält, untersucht. In einem zweiten Schritt werden alle Tumorarten, welche im anfänglichen Experiment Veränderungen gezeigt haben, ferner auf Tumorartspezifischen Arrays (zum Beispiel Blasenkrebs) untersucht, welche viel höhere Anzahlen von Tumoren der gleichen Gewebeart enthalten, mit klinischer Nachverfolgungsinformation über das Überleben oder die Reaktion auf bestimmte Therapien. In einem dritten Schritt wird die Analyse von herkömmlichen (großen) diagnostischen histologischen und zytologischen Proben dann auf die Marker beschränkt, für die vielversprechende Daten während den anfänglichen auf das Array basierten Analysen hervorgingen. Zum Beispiel kann die Vimentinexpression nun an größeren Gewebeproben untersucht werden, um ihre prognostische Bedeutung beim Klarzellen-RCC zu bestätigen. Falls die Array-Daten bestätigt werden, so kann die Vimentin-Immunohistochemie in zukünftigen Studien, welche prognostische Marker bei RCC erforschen, eingeschlossen werden.
  • BEISPIEL 9
  • DNA Array-Technologie
  • Anstelle eine einzige Sonde zu verwenden, um auf eine spezifische Sequenz auf der Prüfgut-DNA hin zu testen, inkorporiert ein Gen- oder DNA-Chip viele unterschiedliche „Sonden". Obwohl eine „Sonde" sich normalerweise darauf bezieht, was zu einem Target gekennzeichnet und hybridisiert wird, so sind in dieser Situation die Sonden an einem Substrat festgemacht. Viele Kopien einer einzigen Art von Sonde sind an die Chip-Oberfläche in einem kleinen Punkt, der zum Beispiel ungefähr 0,1 mm oder weniger im Querschnitt sein kann, gebunden. Die Sonde kann vielerlei Art sein, einschließlich DNA, RNA, cDNA oder Oligonukleotide. Bei Variationen der Technologie können spezifische Proteine, Polypeptide oder Immunoglobuline oder andere natürliche oder synthetische Moleküle als ein Target für das Analysieren von DNA, RNA, Protein oder anderen Bausteinen von Zellen, Geweben oder anderen biologischen Proben verwendet werden. Viele Punkte, wobei jeder ein unterschiedliches molekulares Target enthält, werden dann in der Form eines Gitters aufgereiht. Die Oberfläche für das Aufreihen kann ein Glas- oder anderes solides Material, oder ein Filterpapier oder eine andere ähnliche Substanz, welche für das Festmachen von Biomolekülen nützlich ist, sein. Wird der Chip mit einem gekennzeichneten Prüfgut abgefragt, so zeigt er das Vorhandensein oder Fehlen von vielen unterschiedlichen Sequenzen oder Molekülen in dieser Probe an. Zum Beispiel kann eine gekennzeichnete cDNA, welche von einem Gewebe isoliert wird, auf einen DNA-Chip angewandt werden, um die Expression vieler unterschiedlicher Gene gleichzeitig zu untersuchen.
  • Die Kraft dieser Chips liegt nicht nur in der Anzahl von unterschiedlichen Sequenzen oder anderen Biomolekülen, die gleichzeitig sondiert werden können, wie unten für Nukleinsäurechips erklärt. Bei der Analyse von Nukleinsäuren ist eine relativ kleine Menge von Prüfgut-Nukleinsäure für eine solche Analyse erforderlich (normalerweise weniger als ein Millionstel eines Gramms Nukleinsäure). Die Bindung von Nukleinsäure an den Chip kann visualisiert werden, indem das Prüfgut zuerst mit fluoreszierenden Molekülen oder einer radioaktiven Kennzeichnung gekennzeichnet werden. Das abgegebene fluoreszierende Licht oder Radioaktivität kann durch sehr empfindliche Kameras, konfokale Scanner, Bildanalysevorrichtungen, radioaktiven Film oder einen Phosphorimager festgestellt werden, welche die Signale von dem Chip (wie zum Beispiel das Farbbild) einfangen. Ein Computer mit Bildanalysesoftware erkennt dieses Bild und analysiert die Intensität des Signals für jeden Sondenort in dem Array. Das Feststellen von differenzieller Genexpression mit einem radioaktiven cDNA-Array wurde bereits in Beispiel 8 beschrieben. Normalerweise werden Signale von einem Testarray mit einer Referenz (wie zum Beispiel einem normalen Prüfgut) verglichen.
  • DNA-Chips können in ihrer Struktur, ihrem Aufbau und ihrer vorgesehenen Funktionalität bedeutend variieren, jedoch ist ein gemeinsames Merkmal oft die kleine Größe des Sondenarrays, normalerweise in einer Größenordnung von einem Quadratzentimeter oder weniger. Ein solcher Bereich ist groß genug, um über 2500 individuelle Sondenpunkte zu enthalten, wenn jeder Punkt einen Durchmesser von 0,1 mm aufweist und die Punkte 0,1 mm voneinander getrennt liegen. Eine zweifache Reduzierung des Punktdurchmessers und der Trennung kann Platz für 10.000 solche Punkte in dem gleichen Array machen, und eine zusätzliche Halbierung dieser Dimensionen würde Platz für 40.000 Punkte schaffen. Unter Verwendung von Mikrofabrikations-Technologien, wie zum Beispiel Photolithographie, der durch die Computer-Industrie der Weg bereitet wurde, sind Punktgrößen von weniger als 0,01 mm realisierbar, wodurch potenziell über eine Viertel Millionen unterschiedliche Sondenstellen bereitgestellt werden.
  • Targets auf dem Array können aus Oligomeren oder längeren DNA-Fragmenten hergestellt sein. Oligomere, welche zwischen 8 und 20 Nukleotide enthalten, können einfach durch chemische Verfahren synthetisiert werden. Photolithographische Methoden ermöglichen die Synthese von Hunderttausenden von unterschiedlichen Arten von Oligomeren zu deren Teilung in individuelle Punkte auf einem einzigen Chip, in einem Vorgang, der als In-Situ-Synthese bezeichnet wird. Lange DNA-Stücke wiederum enthalten bis zu einigen Tausend Nukleotide und können durch chemische Verfahren nicht synthetisiert werden. Stattdessen werden sie von dem humanen Genom herausgeschnitten und durch Genmanipulations-Methoden in bakteriellen Zellen eingefügt. Diese Zellen, oder Klone, dienen als eine geeignete Quelle für diese DNAs, welche durch Fermentierung in großen Mengen produziert werden können. Nach der Extraktion und angemessenen chemischen Präparation wird die DNA jedes Klons mittels eines Roboters, welcher entweder mit sehr feinen Spritzen oder mit einem Inkjet-System ausgestattet ist, auf dem Chip abgelegt.
  • Die Targets auf den DNA-Chip interagieren mit der DNA, welche durch Hybridisierung analysiert wird (die Target-DNA). Die Exaktheitsquote (die Genauigkeit, mit der die Prüfgut-Nukleinsäuresequenzen sich an ihre komplementären aufgereihten Target-Sequenzen binden werden) ist hauptsächlich eine Funktion der Länge der Sonde. Für kurze Oligonukleotid-Sonden können die Bedingungen so gewählt werden, dass eine einzige Punktmutation (die Veränderung eines einzigen Nukleotiden in einem Gen) festgestellt werden kann. Dies könnte so viele wie 65.536 oder sogar mehr unterschiedliche Oligonukleotidsonden auf einem einzigen Chip erfordern, um eindeutig die Sequenz von sogar einer relativ kleinen DNA-Sequenz herzuleiten. Dieser Vorgang, der als Sequenzierung durch Hybridisierung (SbH) bezeichnet wird, erzeugt sehr komplexe Hybridisierungsmuster, welche durch Bildanalyse-Computersoftware interpretiert werden. Zusätzlich dazu ist die zu analysierende Sequenz vorzugsweise kurz, und sie muss von dem Rest des Genoms durch eine Technik, genannt Polymerase-Kettenreaktion (PCR) isoliert und amplifiziert werden, bevor sie zur Sequenzanalyse auf den Chip angewandt wird.
  • Bei der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) wird DNA von einem einzigen Gewebe, wie zum Beispiel einem Tumor, mit normaler menschlicher DNA verglichen. In einem besonderen Beispiel von CGH, welches durch Vysis, Inc. durchgeführt wird, wird dies erreicht, indem die Prüfgut-DNA mit einem fluoreszierenden Färbemittel gekennzeichnet wird und die Referenz(normale)DNA mit einem fluoreszierenden Färbemittel einer anderen Farbe. Beide DNAs werden dann zu gleichen Teilen vermischt und auf einen DNA-Chip hybridisiert. Der Vysis-Chip oder Genosensor enhält ein Array von großen Insert-DNA-Klonen, wobei jeder ungefähr 100.000 Nukleotide menschlicher DNA-Sequenz umfasst. Nach der Hybridisierung bestimmt ein Multicolor-Imaging-System das Verhältnis der Farben (zum Beispiel von grüner zu roter Fluoreszenz) für jeden der Sondenpunkte in dem Array. Falls es keinen Unterschied zwischen der Prüfgut-DNA und der normalen DNA gibt, so sollten alle Punkte eine gleiche Mischung roter und grüner Fluoreszenz aufweisen, was eine gelbe Farbe zum Ergebnis hat. Eine Verschiebung hin zu grün oder rot für einen gegebenen Punkt würde anzeigen, dass entweder mehr grün oder rot gekennzeichnete DNA durch die Sondensequenz an den Chip gebunden wurde. Diese Farbverschiebung gibt einen Unterschied zwischen der Prüfgut- und der Referenz-DNA für diese besondere Region auf dem humanen Genom an, was entweder auf die Amplifikation oder Deletion einer spezifischen Sequenz oder eines spezifischen Gens, die/das in den in dem Array positionierten Klonen enthalten ist, hindeutet. Beispiele genetischer Veränderungen, welche festgestellt werden können, beinhalten Amplifikationen von Genen in Krebs, oder charakteristische Deletionen bei genetischen Syndromen, wie zum Beispiel Cri du chat.
  • Da jede genetische Region, die analysiert werden soll, in nur 1 oder einigen replizierten Punkten repräsentiert sein muss, kann der Genosensor so entworfen sein, dass er das gesamte humane Genom nach großen Deletionen oder Duplikationen in einer einzigen Untersuchung abtastet. Zum Beispiel würde ein Array von nur 3000 unterschiedlichen Klonen, welche mit gleichmäßigem Abstand entlang dem humanen Genom angeordnet sind, ein Niveau an Auflösung bereitstellen, welches mindestens 10 Mal besser ist als das, was mit Metaphasenhybridisierung erreicht werden kann, und zwar mit viel geringerem Kostenaufwand und in viel kürzerer Zeit. Spezialchips können auf die Analyse bestimmter Krebse oder Krankheitssyndrome zugeschnitten sein, und können Ärzten auch viel mehr Information über routinemäßige klinische Analysen bereitstellen, als derzeitig sogar durch die fortgeschrittensten Forschungslaboratorien erhalten werden können.
  • Die Farbverhältnisanalyse der Genosensor CGH (gCGH)-Untersuchung hat den Vorteil, dass die absolute Quantifizierung der Menge einer spezifischen Sequenz in der Prüfgut-DNA nicht notwendig ist. Stattdessen wird nur die relative Menge im Vergleich zur Referenz(normalen)-DNA mit relativ hoher Genauigkeit gemessen. Diese Vorgehensweise ist genauso nützlich für eine dritte Art von Chip-Technologie, bezeichnet als „Expressions-Chips". Diese Chips enthalten Arrays von Sondenpunkten, welche für unterschiedliche Gene in dem humanen Genom spezifisch sind. Sie messen nicht das Vorhandensein oder das Fehlen einer Mutation in der DNA direkt, sondern bestimmen vielmehr die Nachrichtenmenge, welche von einem gegebenen Gen produziert wird. Die Nachricht, oder mRNA, ist ein Intermediärmolekül in dem Vorgang, durch den die genetische Information, welche in der DNA enkodiert ist, in Protein übertragen wird. Der Vorgang, durch den mRNA-Mengen gemessen werden, involviert einen enzymatischen Schritt, welcher die unstabile mRNA in cDNA umwandelt und gleichzeitig eine fluoreszierende Kennzeichnung inkorporiert. cDNA von einem Prüfgut-Gewebe wird in einer Farbe gekennzeichnet, und cDNA von einem normalen Gewebe wird mit einer anderen Farbe gekennzeichnet. Nach komparativer Hybridisierung zu dem Chip legt eine Farbverhältnisanalyse jedes Sondenpunktes die relativen Mengen dieser spezifischen mRNA in dem Prüfgut-Gewebe im Vergleich zu dem normalen Gewebe offen. Expressions-Chips messen die relative Expression jedes Gens, für das es einen Sondenpunkt auf dem Chip gibt.
  • Es gibt ungefähr 100.000 unterschiedliche Gene in dem humanen Genom, und es wird erwartet, dass diese alle innerhalb von ein paar Jahren bekannt sein werden. Da Chips mit Tausenden von unterschiedlichen Sondenpunkten hergestellt werden können, kann die relative Expression jedes Gens in einer einzigen Untersuchung bestimmt werden. Dies hat bedeutende Implikationen für die Krankheitsdiagnose und -Therapie. Expressions-Chips können verwendet werden, um die Auswirkung von Arzneistoffen auf eine begrenzte Anzahl von Genen in Gewebekulturzellen zu testen, indem mRNA von mit Arzneistoffen behandelten Zellen mit der von unbehandelten Zellen verglichen wurde. Die Fähigkeit, die Auswirkung auf die Regulierung aller Gene zu messen, wird ein sehr viel schnelleres und präziseres Entwerfen von Arzneistoffen ermöglichen, da die Wirksamkeit und potenziellen Nebenwirkungen von Arzneistoffen schon früh in deren Entwicklung getestet werden können. Außerdem kann die schnelle Zunahme des Verständnisses der regulatorischen Schalter, welche die Gewebedifferenzierung bestimmen, das Entwerfen von Arzneistoffen ermöglichen, welche diese Vorgänge iniziieren oder modifizieren können. Untersuchungsergebnisse über die differenzielle Expression in CGH können ferner in Gewebearrays analysiert werden, in denen die Expression von mRNA auch bestimmt werden kann.
  • In einer besonderen Ausführungsform von CGH enthält ein DNA-Chip oder Genosensor (gCGH), wie zum Beispiel ein AmpliOncTM-Chip von Vysis, ein Array von P1-, BAC- oder PAC-Klonen, jeweils mit einem Insert humaner genomischer DNA. Die Größe dieser Inserts reicht von 80 bis 150 Kilobasen, und sie sind mit Abstand entlang dem humanen Genom angeordnet, um die Auflösung dieser Technik zu verbessern. Da die Hybridisierungssondenmischung nur eine Größenordnung von 200 ng gesamter humaner DNA von jedem, dem Testgewebe und dem Referenzgewebe, enthält, ist die Gesamtanzahl verfügbarer Sonden für jeden aufgereihten Target-Klon relativ niedrig, was höhere Anforderungen and die Empfindlichkeit des Systems stellt, als für die regulären Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierungstechniken benötigt werden. Diesen Anforderungen wurde entsprochen mit der Entwicklung von verbesserten Chip-Oberflächen, Befestigungschemien und Imaging-Systemen. Die Kombination solcher Merkmale kann eine Empfindlichkeit von < 108 Fluorophoren/cm2 bereitstellen, was durch eine hocheffiziente Hintergrundreduzierung erreicht werden kann.
  • Autofluoreszenz, welche von der Chipoberfläche emaniert, kann reduziert werden, indem der Glaschip mit Chrom beschichtet wird, wie in US-Patentanmeldung Nr. 09/085,625 offenbart. Diese hochreflektierende Oberfläche stellt eine verbesserte Signalsammlungseffizienz bereit und ihre hydrophobische Beschaffenheit reduziert die nicht spezifische Bindung von Sonden. Das wirkungsvolle Lesen von CGH-Chips wird durch ein empfindliches, kompaktes und einfach zu verwendendes Multicolor-Fluoreszenz-Imagingsystem mit hoher Geschwindigkeit erreicht, wie das, welches in US-Patentanmeldung Nr. 09/049,748 beschrieben ist. Seine nicht epifluoreszente Erregungsgeometrie eliminiert Autofluoreszenz von der Sammeloptik, und sammelt lediglich fluoreszierendes Licht von der Chip-Oberfläche. Eine Xenon-Bogenlampe dient als eine sichere und langlebige Lichtquelle, welche sogar eine Beleuchtung über einen groben Bereich von Wellenlängen bereitstellt. Dies ermöglicht die Verwendung vieler unterschiedlicher Fluorophore, welche lediglich durch die Wahl der Erregungs- und Emissionsfilter begrenzt wird. Fluoreszierende Bilder werden von einem 14 mm × 9 mm Prüfgut-Bereich durch eine gekühlte CCD-Kamera ohne Abtasten oder Vergrößerung, erhalten, und sogar die Notwendigkeit von Routine-Fokusieren wurde beseitigt. Die Bilder werden von Software analysiert, welche jedes individuelle Pixel abfragt, um das Verhältnis des Prüfgutes gegenüber der Referenzsonde zu berechnen, welche zu jedem Targetpunkt hybridisiert werden. Eine angemessene statistische Analyse offenbart die relative Konzentration jeder targetspezifischen Sequenz in der Sondenmischung.
  • Dieses System kann für die Expressionsanalyse oder genomische Anwendungen, wie zum Beispiel eine Analyse genetischer Veränderungen bei Krebs, verwendet werden. Zu diesem Zweck wurde ein Mikroarray für die spezifische Analyse aller genetischen Regionen entwickelt, von welchen bisher berichtet wurde, dass sie mit der Tumorbildung durch Amplifikation auf dem Genomniveau in Zusammenhang stehen. Der AmpliOncTM-Chip enthält 33 Targets (zumeist bekannte Onkogene), welche jeweils 5 Mal repliziert sind. Eine schematische Repräsentation eines solchen Chips (und von 31 der Targets) ist in 24 gezeigt.
  • BEISPIEL 10
  • Kombination von Mikroarrays, um die Amplifikation des FGFR2-Gens in der Sum-52-Brustkrebszelllinie zu erkennen
  • Dieses Beispiel zeigt, wie Targetgene für Chromosomengewinne, welche durch komparative genomische Hybridisierung (CGH) gesehen werden, schnell in Bezug auf ihre klinische Relevanz unter Verwendung einer Kombination von neuen Hochdurchsatz-Mikroarraystrategien identifiziert und studiert werden können. CGH an Metaphasen-Distributionen (25, Chromosomen-CGH) zeigte hochgradige DNA-Amplifikation bei den Chromosomenregionen 7q31, 8p11-p12 und 10q25 in der Sum-52 Brustkrebs-Zelllinie. Danach wurde genomische DNA von der Sum-52 Zelllinie auf ein neues CGH-Mikroarray hybridisiert (25, Genosensor CGH, Vysis, Downers Grove, IL), was das gleichzeitige Screening der Kopiennummer an 31 Loci, welche bekannte oder vermutete Onkogene enthielten (die Loci sind in 24 gezeigt), ermöglichte. Diese gCGH-Analyse implizierte spezifische, hochgradige Amplifikationen der MET- (bei 7q31) und FGFR2- (bei 10q25) -Gene, sowie eine niedrig-gradige Amplifikation des FGFR1-Gens (bei 8p11-p12), was die Involvierung dieser drei Gene in den Amplikonen anzeigt, welche durch eine herkömmliche CGH-Analyse gesehen werden. Eine Expressionsuntersuchung in großem Umfang der gleichen Zelllinie unter Verwendung eines cDNA-Mikroarrays (Clonetech Inc.) stellte zusätzliche Informationen bereit. Das FGFR2-Gen war das am meisten überexprimierte Transkript in den SUM-52-Zellen, was dieses Gen als das wahrscheinliche Amplifikations-Targetgen bei 10q25 implizierte. Eine Überexpression von FGFR2 wurde durch Northern analysis und Amplifikationen durch Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) bestätigt. Schließlich zeigte FISH an einem Gewebe-Mikroarray, welches aus 145 Primär-Brustkrebsen bestand (26) die In-Vivo-Amplifikation des FGFR2-Gens in 4,5% der Fälle.
  • Diese drei Mikroarray-Experimente können innerhalb weniger Tage durchgeführt werden, und sie stellen dar, wie leistungsstark die Kombination von Mikroarraybasierten Screening-Methoden für die schnelle Identifikation von Targetgenen für Chromosomen-Neuanordnungen ist, als auch für die Auswertung der Prävalenz solcher Veränderungen bei großen Anzahlen von Primärtumoren. Diese Kraft wird durch die Fähigkeit erzeugt, viele Gene gegen einen Tumor unter Verwendung von DNA-Array-Technologien zu überprüfen (wie zum Beispiel cDNA-Chips oder CGH), um ein Gen von Interesse zu finden, in Kombination mit der Fähigkeit viele Tumore gegen das Gen von Interesse unter Verwendung der Gewebemikroarray-Technologie zu überprüfen. 27 stellt dar, dass der DNA-Chip mehrere Klone (zum Beispiel mehr als 100 Klone) verwenden kann, um einen einzigen Tumor oder eine andere Zelle zu überprüfen, während die komplementäre Gewebemikroarray-Technologie eine einzige Sonde verwenden kann, um mehrere (zum Beispiel mehr als 100) Tumore oder andere Gewebeproben (entweder der gleichen oder unterschiedlicher Gewebeart) zu überprüfen.
  • BEISPIEL 11
  • Gewebearrays für die Bestimmung der Häufigkeit und Verteilung von Genexpressions- und Kopienanzahlveränderungen während der Krebsprogression
  • Gewebearrays können verwendet werden, um Gene und Targets zu verfolgen, die aus, zum Beispiel, Hochdurchsatz-Genomen entdeckt werden, wie zum Beispiel DNA-Sequenzierung, DNA-Mikroarrays oder SAGE (Serienanalyse von Genexpression) (Velculescu et al., Science, 270:484-487, 1995). Die komparative Analyse von Genexpressionsmustern mit cDNA-Array-Technologien (Schena 1995 und 1996) stellt ein Hochdurchsatz-Werkzeug für das Screening expressioneller Veränderungen zum besseren Verständnis molekularer Mechanismen bereit, welche für die Tumorprogression verantwortlich sind, und zielt auch auf das Entdecken neuer prognostischer Marker und potenzieller therapeutischer Targets ab. Gewebearrays stellen genaue Frequenz- und Verteilungsinformationen, die solche Gene sowohl unter pathologischen als auch normalen physiologischen Bedingungen betreffen, bereit.
  • Ein Beispiel ist die Verwendung eines Prostatatumor-Arrays, um zu bestimmen, dass IGFBP2 (Insulin-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2) ein Marker ist, der mit der Progression von humanem Prostatakrebs in Zusammenhang steht. Um Mechanismen aufzuklären, die der Entwicklung und Progression von hormonrefraktärem Prostatakrebs zu Grunde liegen, wurden Genexpressionsprofile für vier unabhängige CWR22R hormonrefraktäre Heterotransplantate zu androgenabhängigen CWR22-Primär-Heterotransplantaten verglichen. Das CWR22-Heterotransplantat-Modell von humanem Prostatakrebs wurde durch die Transplantation humaner Prostatatumorzellen in die Nacktmaus erstellt (Pretlow, J. Natl. Cancer Inst. 3:394-398, 1993]. Dieses Elterntumor-Heterotransplantat ist durch die Sekretion des prostataspezifischen Antigens (PSA) und mit schneller Reduzierung der Tumorgröße in Reaktion auf die Hormonentzugs-Therapie gekennzeichnet. Ungefähr die Hälfte der behandelten Tiere werden rekurrente Tumore innerhalb von ein paar Wochen bis zu einigen Monaten entwickeln. Diese rekurrenten Tumore sind gegen weitere Hormonbehandlungen resistent, wenn sie auf den neuen Wirt übertragen werden. Sie sind außerdem durch einen aggressiveren Phänotyp als Eltern-CWR22-Tumore gekennzeichnet, und führen letztendlich zum Tod des Tieres. Dieses experimentelle Modell ahmt den Verlauf von Prostatakrebsprogression bei humanen Patienten nach.
  • Der Vergleich der Expressionsniveaus von 588 bekannten Genen während der Progression des CWR22-Prostatakrebses in Mäusen wurde mit der cDNA Mikroarray-Technologie durchgeführt. Es wurde RNA von CWR22-Heterotransplantaten erstellt, wie vorher mit geringen Modifikationen beschrieben [Chirgwin, 1979]. Die mRNA wurde unter Verwendung einer Oligo(dT)-Auswahl mit DynaBeads (Dynal) gemäß den Anleitungen des Herstellers auf gereinigt. Die cDNA-Array-Hybridisierungen wurden an AtlasII cDNA-Arrays (Clontech) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Die cDNA-Sonden wurden unter Verwendung von 2 μg polyA+ RNA synthetisiert und mit 32P a dCTP gekennzeichnet.
  • Das Genexpressionsmuster in einem hormonsensitiven CWR22-Heterotransplantat wurde mit dem eines hormonrefraktären CWR22R-Heterotransplantats verglichen. Es wurden expressionelle Veränderungen etlicher Gene festgestellt, von welchen vorher gezeigt wurde, dass sie in der Prostatakrebs-Pathogenese involviert sind. Zusätzlich dazu wurden mehrere Gene mit keiner vorherigen Verbindung zu Prostatakrebs identifiziert, weder wusste man, dass sie von Androgenen reguliert werden. Eines der mit der größten Beständigkeit nach oben regulierten Gene, das dem Insulin ähnliche Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), wurde für die weitere Studie gewählt. Es wurde die Gewebe-Mikroarray-Technologie verwendet, um zu validieren, dass die IGFBP2-Expressionsveränderungen auch In Vivo, während der Progression von Prostatakrebs bei Patienten, die sich einer Hormontherapie unterziehen, stattfinden.
  • In Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete Muster von insgesamt 142 Prostatakrebsen wurden verwendet, um das Prostatakrebs-Gewebemikroarray aufzubauen. Die Tumore beinhalteten 188 nicht hormonrefraktäre Primär-Prostatakrebse, 54 transurethale Resektionsproben von lokal rekurrenten hormonrefraktären Krebsen, welche während 1976-1997 operiert wurden, und 27 transurethale Resektionen für BPH als gutmütige Kontrollen. Die Untergruppe der primären nicht hormonrefraktären Tumore und gutmütigen Kontrollen wurde aus den Archiven des Instituts für Pathologie, Universität Basel (Schweiz), und die Untergruppe hormonrefraktärer Tumore von der Universität Tampere (Finnland) ausgewählt. Die Gruppe primärer nicht hormonrefraktärer Prostatakrebse bestand aus 50 zufällig festgestellten Tumoren in transurethalen Resektionen für vermuteten BPH (pT1a/b), und 138 radikalen Prostatektomieproben von Patienten mit einer klinisch lokalisierten Erkrankung. Die Proben wurden in 4 Prozent Phosphat-gepuffertem Formalin fixiert. Die Sektionen wurden in Paraffin verarbeitet und es wurden Scheiben bei 5 μm abgeschnitten und mit Hämatoxilyn und Eosin (H & E) gefärbt. Alle Sektionen wurden von einem Pathologen überprüft, und der am meisten repräsentative (normalerweise der am wenigsten differenzierte) Tumorbereich wurde auf dem Objektträger abgegrenzt. Es wurde die Gewebemikroarray-Technologie wie vorher beschrieben verwendet, um das Gewebearray auf zubauen.
  • Indirekte Standard-Immunperoxidase-Verfahren wurden für Immunohistochemie verwendet (ABC-Elite, Vector Laboratories). Der polyklonale Ziegen-Antikörper IGFBP-2, C-18 (l:x, Santa Cruz Biotechnologie, Inc., Kalifornien) wurde zur Erkennung von IGFBP-2 nach einer Mikrowellen-Vorbehandlung verwendet. Die Reaktion wurde durch Diaminobenzidin als ein Chromogen visualisiert. Positive Kontrollen für IGFBP-2 bestanden aus normaler Nierenrinde. Der primäre Antikörper wurde für negative Kontrollen ausgelassen. Die Intensität der zytoplasmischen IGFBP-2-Färbung wurde geschätzt und in 4 Gruppen stratifiziert (negative, schwache, mittelmäßige und starke Färbung).
  • Es bestand ein starker Zusammenhang zwischen IGFBP-2-Färbung und der Progression von Krebs in eine hormonrefraktäre Erkrankung mit einer zunehmenden Häufigkeit von hochgradiger Färbung. Eine starke IGFBP-2-Färbung war in keiner der normalen Drüsen vorhanden, bei 30% der nicht hormonrefraktären Primärtumore, aber in 96% der rekurrenten, hormonrefraktären Prostatakrebse (p=0,0001). Daher stellt dieses Beispiel einen weiteren Fall bereit, bei dem eine Hochdurchsatz-Expressions-Untersuchung durch cDNA-Array-Hybridisierung ein spezifisches Gen anzeigte, welches in der Progression der Krankheit involviert sein könnte. Diese Hypothese könnte direkt validiert werden unter Verwendung der Gewebearray-Technologie. Die Ergebnisse haben IGFBP-2 zur Verwendung als Target für die Entwicklung diagnostischer, prognostischer oder therapeutischer Vorgehensweisen für die Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs identifiziert.
  • BEISPIEL 12
  • Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor B bei Brustkrebs
  • Die Brustkrebs-SKBR3-Zelllinie wurde mit dem AmpliOnc-DNA-Array überprüft, und der Blutplättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor B (PDGF B) wurde als amplifiziert identifiziert. Unter Verwendung dieser Information wurde eine PDGF B-Sonde unter Verwendung eines Klons gemacht, welcher zu dem PDGF B-Klon, der in dem AmpliOnc-Array verwendet wurde, identisch war. Diese Sonde wurde verwendet, um ein Brustkrebs-Tumorarray zu überprüfen. Es wurde herausgefunden, dass nur 2% der überprüften Brustkrebse für PDGF B amplifiziert waren. Ein Multi-Tumorarray (in Beispiel 6 beschrieben) wurden dann unter Verwendung dieser Sonde sondiert. Dies legte offen, dass, wider Erwarten, das PDGF B-Gen bei einem großen Prozentsatz von Blasen- und Lungenkrebsen amplifiziert war. Somit wurde unter Verwendung der Erfindung ein neuer Marker mit diagnostischer Wichtigkeit bei diesen und anderen Arten von Tumoren identifiziert.
  • BEISPIEL 13
  • Herceptin-Behandlung
  • Gewebearrays können verwendet werden, um große Anzahlen von Tumorgewebe-Prüfgütern zu überprüfen, um festzustellen, welche Tumore für eine bestimmte Behandlung empfänglich wären. Zum Beispiel kann ein Brustkrebsarray auf die Expression des HER-2-Gens (in Beispiel 1 auch ERBB2 genannt), wie in Beispiel 1 beschrieben, überprüft werden. Tumore, welche das HER-2-Gen überexprimieren und/oder amplifizieren, könnten gute Kandidaten für die Behandlung mit Herceptin sein, welches ein Antikörper ist, dass die Expression von HER-2 hemmt. Das Screening des Multitumor-Gewebearrays mit den HER-2-Antikörpern oder einer DNA-Sonde würde Informationen über andere Krebse als Brustkrebs bereitstellen, die mit der Herceptin-Therapie erfolgreich behandelt werden könnten.
  • BEISPIEL 14
  • Korrelierende Prognose und Überleben mit Markern
  • Tumorgewebe-Arrays, welche aus Tumoren aufgebaut sind, die von Patienten genommen wurden, für welche die Geschichte und das Ergebnis bekannt ist, können verwendet werden, um Marker mit prognostischer Relevanz zu untersuchen. Dieses Beispiel stellt dar, dass prognostische Marker bei Harnblasenkrebs unter Verwendung von Tumorgewebe-Arrays trotz jeglicher Intratumor-Heterogenität ausgewertet werden können.
  • Ein Array mit 315 Blasentumoren wurde durch Immunohistochemie auf nukleare p53-Akkumulation hin analysiert. Die p53-Analyse wurde zweimal durchgeführt; einmal an herkömmlich großen histologischen Sektionen, welche von ganzen Tumorblocks genommen wurden, und einmal an einer Sektion, welche von einem Tumorarray genommen worden war, welche ein Prüfgut von jedem Tumor enthielt. Die Tumorreihe bestand aus 127 pTa, 81 pT1 und 128 pT2.4 Blasenkarzinomen mit klinischen Nachfolgeinformationen (tumorspezifisches Überleben).
  • Es wurde pro Tumor ein Block analysiert. Eine Sektion von jedem Block wurde für Immunohistochemie-Analyse genommen. Dann wurde ein Gewebearray aufgebaut, indem eine „Ausstanz-Biopsie" von jedem Block genommen wurde und in einen leeren Rezipienten-Block gebracht wurde. Der monoklonale Antikörper DO-7 (DAKO, 1:1000) wurde für die Immunfärbung unter Verwendung von Standard-Verfahren angewandt.
  • Bei großen Sektionen wurde ein Tumor als positiv betrachtet, falls eine mäßige oder starke nukleare p53-Färbung bei mindestens 20% der aufgereihten Tumorzellen gesehen wurde. Schwache nukleare und jegliche zytoplasmische p53-Färbung wurde nicht beachtet.
  • Es wurde ein Chi-Square-Test verwendet, um die p53-Ergebnisse zwischen Array- und großen Sektionen zu vergleichen. Überlebenskurven wurden gemäß Kaplan-Meier aufgezeichnet. Ein Log-Rang-Test wurde angewandt, um den Zusammenhang zwischen p53-Positivität und tumorspezifischem Überleben zu untersuchen. Überlebende Patienten wurden zur Zeit ihrer letzten klinischen Kontrolle zensiert. Patienten, welche aus anderen Gründen und nicht wegen ihres Blasentumors starben, wurden zum Zeitpunkt ihres Todes zensiert.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass p53 bei 315 Tumor-Prüfgütern analysiert werden konnte (21 Prüfgüter waren auf der p53-gefärbten Array-Sektion nicht vorhanden). Bei herkömmlichen Sektionen war p53 Immunfärbung bei 105 dieser 315 Tumore, welche auf dem Array auch vorhanden waren, positiv. p35-Positivität, wie sie bei herkömmlichen „großen" Sektionen festgestellt wurde, war erheblich mit schlechter Prognose verbunden (1A, p<0,0001). Nur 69 dieser 105 Tumore (66%), die p53-positiv an großen Sektionen waren, waren auch bei den aufgereihten Tumor-Prüfgütern positiv, während 36 (34%) wahrscheinlich auf Grund ihrer Tumor-Heterogenität negativ blieben. Es bestand trotzdem ein starker Zusammenhang zwischen p53-Immunfärbungsergebnissen bei Arrays und bei großen Sektionen (p<0,0001), und die p53-Positivität bei den Arrays war immer noch erheblich mit schlechter Prognose verbunden (1B, p=0,0064).
  • Die spezifische Anzahl an Biopsien von jedem Tumor, die vorzugsweise erhalten werden, um 90%, 95% oder 100% der Information, die von der Analyse der gesamten Sektion erhalten wird, zu reproduzieren, wird es ermöglichen zu bestimmen, wie viele „Ausstanzungen" mit den Gewebearrays erforderlich sind, um klinisch bedeutende Informationen von den Gewebearray-Experimenten zu ziehen. Diese optimale Anzahl kann in Abhängigkeit von der Tumorart und dem spezifischen biologischen Target, die analysiert werden, variieren.
  • BEISPIEL 15
  • Neue Gen-Targets
  • Gewebearrays können verwendet werden, um neue Targets für Krebstherapien zu finden. Hunderte von unterschiedlichen Genen können in einem gegebenen Krebs differenziert reguliert sein (basierend auf cDNA-, z.B. Mikroarray-, -Hybridisierungen oder anderen Hochdurchsatz-Expressions-Screening-Verfahren, wie zum Beispiel Sequenzierung oder SAGE). Die Analyse jedes Genkandidaten auf einem großen Gewebearray kann helfen zu bestimmen, welches das vielversprechendste Target für die Entwicklung neuer Arzneistoffe, Hemmstoffe usw. ist. Zum Beispiel kann ein Tumorarray, welches Tausende von verschiedenen Tumor-Prüfgütern enthält, mit einer Sonde auf ein Onkogen überprüft werden, oder eine Genkodierung auf ein neues Signal-Transduktions-Molekül. Eine solche Sonde kann sich an einen oder eine Reihe von unterschiedlichen Tumorarten binden. Falls eine Sonde offen legt, dass ein bestimmtes Gen in vielen Tumoren überexprimiert und/oder amplifiziert ist, dann kann das Gen ein wichtiges Target sein, welches eine Schlüsselrolle bei vielen Tumoren einer histologischen Art oder bei unterschiedlichen Tumorarten spielt. Therapien, welche darauf ausgerichtet sind, die Expression dieses Gens oder die Funktion des Genprodukts zu stören, könnten vielversprechende neue Krebsarzneistoffe sein. Insbesondere kann das Gewebearray dabei helfen, die Auswahl von Targets für die Entwicklung von Arzneistoffen zu priorisieren.
  • BEISPIEL 16
  • Gewebearray gefolgt von DNA-Array
  • Obwohl viele der vorangehenden Beispiele beschrieben haben, dass das DNA-Array vor dem Gewebearray verwendet wurde, beinhaltet die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Arrays in beiden Reihenfolgen, oder in Kombination mit anderen Analysetechniken. Daher können Gene von Interesse, die bemerkt werden, wenn mehrere Tumor-Prüfgüter mit einer einzigen Sonde während der Gewebearrayanalyse sondiert werden, danach gewählt werden, um auf einem DNA-Array platziert zu werden, unter Verwendung einer einzigartigen Sequenz des Gens von Interesse als eine der auf dem Array-Substrat befestigten Sonden. Zum Beispiel könnte man einen DNA-Chip zuschneiden, der die meiste diagnostische, prognostische oder therapeutische Relevanz basierend auf Informationen von dem Mikroarray-Experiment aufweist.
  • Einige mögliche Beziehungen zwischen cDNA-Arrays, CGH-Arrays und Gewebearrays sind in 28 gezeigt. Wie in dieser Figur dargestellt, können die verschiedenen Untersuchungen in jeder Reihenfolge oder in jeder beliebigen Kombination durchgeführt werden.
  • BEISPIEL 17
  • Zelllinien-Arrays
  • Kultivierte Zellen oder Zellen, welche von nicht festen Geweben oder Tumoren (wie zum Beispiel Blutprüfproben, Knochenmarkbiopsien, zytologische Proben, die durch Nadelaspiration-Biopsien erhalten werden usw.) isoliert wurden, können ebenfalls mit den Gewebearraytechniken analysiert werden. Dies ist eine wichtige Ausweitung der Gewebearray-Technologie auf die Analyse individueller Zellen, oder Populationen von Zellen, die entweder direkt von Menschen oder Tieren erhalten werden, oder nachdem verschiedene Inkubationen von Zellkulturexperimenten In Vitro durchgeführt wurden (wie zum Beispiel ein spezifischer Hormon- oder Chemotherapie-Test, die oft auf einem Mikrotiter-Ablage-Format zur pharmazeutischen Arzneistoffüberprüfung durchgeführt werden). Bei der Analyse von bösartigen Erkrankungen würde dies die Analyse von Leukämie- und Lymphomgeweben oder anderen flüssigen Tumorarten ermöglichen, wobei man den gleichen Strategien folgen würde wie die, die oben für feste Tumore beschrieben wurden. Unter Verwendung dieser Vorgehensweise wurden Krebszelllinien verwendet, die man von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten hatte. Zellen wurden trypsiniert und die Zellsuspension wurde mit einer Zentrifuge bei 1200 G herunter zentrifugiert. Der Zellniederschlag wurde mit auf Alkohol basierenden Fixiermitteln und Formaldehyd-Fixiermitteln fixiert, und der fixierte Zellniederschlag wurde gemäß den Routineprotokollen, welche in Pathologie-Laboratorien verwendet werden, in Paraffin eingebettet. Die fixierten und eingebetteten Zellsuspensionen können dann als Ausgangsmaterial für die Entwicklung von Zellarrays verwendet werden, unter Verwendung der gleichen Vorgehensweise wie vorher für die fixierten und eingebetteten Gewebeproben beschrieben. Man rechnet damit, dass bis zu oder mindestens 1000 unterschiedliche Zellpopulationen in einem einzigen Paraffinblock mit Standardgröße aufgereiht werden können.
  • Es können sehr kleine Ausstanzgrößen (zum Beispiel weniger als 0,5 mm) verwendet werden, um Arrays aus homogenen kultivierten Zellen zu schaffen. Dies ermöglicht, dass Arrays mit einer großen Dichte aufgebaut werden. Es können zum Beispiel ungefähr 2000 unterschiedliche Zellpopulationen in einem einzigen 40 mm × 25 mm Paraffinblock platziert werden.
  • Das Verfahren der Analyse von Gewebe gemäß der vorliegenden Erfindung kann viele verschiedene Formen neben denen, die speziell in dem obigen Beispiel offenbart wurden, annehmen. Die Gewebeproben müssen nicht anormal sein, sondern können normales Gewebe sein, um die Funktion und Gewebedistribution eines bestimmten Gens, Proteins oder anderen Biomarkers zu analysieren (wobei ein Biomarker eine biologische Charakteristik ist, die Informationen über eine biologische Eigenschaft der Probe gibt). Das normale Gewebe könnte Embryo-Gewebe oder Gewebe von genetisch modifizierten Organismen, wie zum Beispiel einer transgenischen Maus, beinhalten.
  • Die Array-Technologie kann auch verwendet werden, um Krankheiten zu analysieren, die keine genetische Basis aufweisen. Es könnte zum Beispiel ein Profil für die Gen- oder Proteinexpressionsmuster aufgestellt werden, die wahrscheinlich wichtig für die Pathogenese oder Diagnose der Krankheit sind. Die Gewebeproben müssen nicht auf feste Tumore beschränkt sein, sondern können auch mit Zelllinien, hämatologischen oder flüssigen Tumoren, zytologischen Proben oder isolierten Zellen verwendet werden.
  • Zellen von Menschen oder anderen Tieren können in einer Suspension verwendet werden, wie Zellen von Hefe oder Bakterien. Alternativ dazu können Zellen in einer Suspension in einer Zentrifuge herunter zentrifugiert werden, um einen festen oder halbfesten Niederschlag bereitzustellen, fixiert werden und dann in dem Array platziert werden, sehr ähnlich zu einer Gewebeprobe. Flüssige Zellsuspensionen können mit einer Pipette in eine Matrix (zum Beispiel Vertiefungen in einer Objektträger-Oberfläche) platziert werden und dann auch auf die gleiche Weise wie das bereits beschriebene Gewebearray analysiert werden. Die Gewebearrays können auch in Zelllinienexperimenten verwendet werden, wie zum Beispiel Hochdurchsatz-Chemotherapie-Screening von Zellen die auf Mikrotiterplatten gezüchtet wurden. Die Zellen von jeder Einsenkung werden mit einem unterschiedlichen Arzneistoff oder einer unterschiedlichen Konzentration des Arzneistoffs behandelt und werden dann wieder zurückgewonnen und in ein Zelllinien-Mikroarray eingefügt, um ihre funktionellen Charakteristiken, ihre Morphologie, ihre Entwicklungsfähigkeit und die Expression spezifischer Gene, welche durch die Behandlung mit dem Arzneistoff hervorgerufen wurden, zu analysieren.
  • Histologische oder immunologische Analysen, die mit dem Array verwendet werden können, beinhalten ohne Einschränkung eine Nukleinsäure-Hybridisierung, PCR (wie zum Beispiel In Situ PCR), PRINS, Ligase-Kettenreaktion, Padlock-Sonden-Detektion, histochemische In Situ enzymatische Detektion und die Verwendung von molekularen Signalen.
  • Die Gewebearray-Technologie kann verwendet werden, um direkt Proben (Gewebe oder Zellen) von Menschen, Tieren, Zelllinien oder anderen experimentellen Systemen zu sammeln. Wenn zum Beispiel Biopsie-Proben in Pathologie-Laboratorien auf herkömmliche Art und Weise behandelt werden, werden die Proben nach der Fixierung routinemäßig waagerecht in einen Paraffinblock eingeführt. Es ist daher sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, Proben von solchen Geweben in ein Gewebearray zu erwerben. Falls jedoch mehrere Biopsie-Proben, die durch einen chirurgischen Eingriff erhalten werden, direkt fixiert werden (und, falls erforderlich, in einem geeigneten Medium, wie zum Beispiel Paraffin eingebettet werden) und dann direkt senkrecht in eine Matrix eingefügt würden, würde dies den Aufbau eines Gewebearrays aus Biopsie-Proben ermöglichen. Ein solches Array wäre nützlich für Forschungszwecke oder in einer klinischen Umgebung, um z.B. die Progression prämaligner Läsionen zu überwachen, oder Behandlungsreaktionen (mit Molekularmarkern) metatstatischer Tumore, die nicht chirurgisch entfernt werden können, zu überwachen.
  • Zytologische Proben (wie zum Beispiel feine Nadelaspiration, Zervixzytologie, Blutproben, isolierte Blutzellen, Urinzellen usw.) können entweder durch Zentrifugation niedergeschlagen und dann fixiert und eingebettet werden, um sie wie vorher beschrieben aufzureihen. Alternativ dazu können Zellen in einer Suspension fixiert werden und direkt in Löcher in einer Matrix eingefügt werden (z.B. mittels einer Pipette), oder erst eingebettet und dann aufgereiht werden. Dies wird ein Zellarray für die Forschung oder diagnostische Zwecke bereitstellen. Dies würde schnelle zytologische Diagnosen ermöglichen, bei denen mehrere Proben von unterschiedlichen Patienten gleichzeitig von einem einzigen Objektträger überprüft werden, und zwar nicht nur auf ihre Morphologie, sondern auch auf ihre molekularen Charakteristiken. Dies würde außerdem die Automatisierung der Analyse ermöglichen, da eine Anzahl von Proben mit einem Mikroskop, einem automatisierten Image-Analysesystem, einem Scanner oder einem zugehörigen Expertensytem zur gleichen Zeit überprüft werden können. Die Verwendung solcher Zellpräparate ist besonders für die Diagnose hämatologischer Störungen, wie zum Beispiel Leukämien und Lymphome, wichtig. Dies würde auch die Automatisierung der Typisierung von Lymphozyten von vielen Patienten zur gleichen Zeit ermöglichen, deren Proben in einem Array-Format zur Immunphänotypisierung oder zur Analyse durch In-Situ-Hybridisierung eingefügt sind. Das Screening von gespendeten Blutproben auf virale Antigene, virale DNA oder andere Pathogene in einer Blutbank könnte auf ähnliche Weise in einem Array-Format durchgeführt werden.
  • Tumorprogressions-Arrays können auch aufgebaut werden, indem man Proben von einer Testperson bei unterschiedlichen Stufen der Progression des Krebses der Testperson sammelt (wie zum Beispiel die Progression zu hormonrefraktärem Prostatakrebs). Alternativ dazu können Tumore verschiedener Stufen von verschiedenen Testpersonen gesammelt und in dem Array inkorporiert werden. Das Array kann auch verwendet werden, um die Progression von prä-neoplastischen Läsionen (wie zum Beispiel die Entwicklung von Zervixneoplasie) und die Wirkungen von chemopräventiven Mitteln (wie zum Beispiel die Wirkungen von Antiöstrogenen bei der Entwicklung von Brustepithelium oder Brustkrebs) zu verfolgen.
  • In einer anderen Ausführungsform können Proben von einem transgenischen oder Modellorganismus an unterschiedlichen Stufen der Entwicklung des Organismus, wie zum Beispiel unterschiedlichen Embryostufen oder unterschiedlichen Alterstufen nach der Geburt, erhalten werden. Dies ermöglicht die Studie von Dingen wie zum Beispiel normale und unnormale Embryoentwicklung.
  • Die biologischen Analysen, welche an den Mikroarraysektionen durchgeführt werden, können jegliche Analysen sein, welche an normalen Gewebesektionen durchgeführt werden. Die Arrays können auch aus einem oder mehreren Tumoren an unterschiedlichen Stufen der Progression zusammengesetzt sein, wie zum Beispiel normales Gewebe, Hyperplasie, In-Situ-Krebs, invasiver Krebs, rekurrenter Tumor, lokale Lymphknoten-Metastasen oder entfernte Metastasen.
  • Ein „EST" oder „Expressed Sequence Tag" betrifft eine teilweise DNA oder cDNA-Sequenz, typischerweise aus zwischen 50 und 500 aufeinander folgenden Nukleotiden, die von einem Genom einer cDNR-Bank erhalten wurde, welches von einer ausgewählten Zelle, Zellentyp, Gewebe oder Gewebetyp, Organ oder Organismus erstellt wurde, die einer mRNA eines Gens entspricht, welches in der Bank gefunden wurde. Ein EST ist im Allgemeinen ein DNA-Molekül.
  • „Spezifische Hybridisierung" betrifft das Binden, Duplizieren oder Hybridisieren eines Moleküls nur an eine bestimmte Nukleotidsequenz unter strengen Bedingungen, wenn die Sequenz in einer komplexen Mischungs(z.B. gesamt zellulären)-DNA oder -RNA vorhanden ist. Strenge Bedingungen sind Bedingungen unter denen eine Sonde zu ihrer Targetsequenz, jedoch keiner anderen Sequenz, hybridisieren wird. Strenge Bedingungen hängen von der Sequenz ab und sind in unterschiedlichen Verhältnissen unterschiedlich. Längere Sequenzen hybridisieren speziell bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden die strengen Bedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 5°C niedriger als der thermale SchmelzpunktTM für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert liegen.
  • In Anbetracht der vielen möglichen Ausführungsformen, auf die die Prinzipien der Erfindung angewandt werden können, sollte erkannt werden, dass die dargestellten Ausführungsformen Beispiele der Erfindung sind, und sie sollten nicht als Einschränkung des Bereichs der Erfindung gesehen werden. Vielmehr ist der Bereich der Erfindung durch die folgenden Ansprüche definiert.

Claims (19)

  1. Verfahren der parallelen Analyse von identischen Arrays von Gewebeproben, umfassend: Erhalt einer Vielzahl an länglichen Donorprüfgut-Kernen von der biologischen Probe in einem Donorblock, umfassend die biologische Probe, eingebettet in Einbettungsmedium; Aufnahmebehälter-Bohrkerne von einem Rezeptor-Einbettungsmittel zur Bildung eines Arrays von länglichen Aufnahmebehältern; Platzieren der Donorprüfgut-Kerne in den länglichen Aufnahmebehältern an zugeordneten Orten in dem Array; Sektionieren des Rezeptor-Einbettungsmediums quer zu den länglichen Aufnahmebehältern, um einen Querschnitt der Donorprüfgut-Kerne in dem Array zu erhalten, unter Beibehaltung der zugeordneten Orte in dem Array im Folgequerschnitt; Durchführen einer unterschiedlichen biologischen Analyse von jedem Querschnitt; und Vergleichen des Ergebnisses jeder biologischen Analyse an entsprechenden zugeordneten Orten von unterschiedlichen Sektionen, um festzustellen, ob es Korrelationen zwischen den Ergebnissen der unterschiedlichen biologischen Analysen an jedem zugeordneten Ort gibt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der längliche Aufnahmebehälter eine Querschnittsgröße und -gestalt besitzt, die komplementär zu der Querschnittsgröße und -gestalt der länglichen Donorprobe ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Bilden des länglichen Aufnahmebehälters das Bilden einer zylindrischen Bohrung in dem Rezeptorblock umfasst und die Donorprobe durch Bohren einer zylindrischen Gewebeprobe aus einem Donorblock erhalten wird, wobei der Durchmesser des länglichen Aufnahmebehälters praktisch derselbe ist wie der Durchmesser der Donorprobe.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der längliche Donorprüfgut-Kern im Wesentlichen ein zylindrischer Kern ist, welcher einen Durchmesser hat, der kleiner als 1 mm ist.
  5. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Durchführung der biologischen Analysen die Durchführung einer unterschiedlichen biologischen Analyse auf jedem Querschnitt umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die unterschiedlichen biologischen Analysen gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus mindestens einer immunologischen Analyse und einer Nukleinsäure-Hybridisierung.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, weiterhin umfassend die Bestimmung, ob es Korrelationen zwischen klinischen Informationen, die mit jedem der zugeordneten Orte assoziiert sind, und den unterschiedlichen biologischen Analysen gibt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, weiterhin umfassend das Vergleichen der Resultate der unterschiedlichen biologischen Analysen an jedem der zugeordneten Orte mit klinischen Informationen über die biologische Probe an dem zugeordneten Ort.
  9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die biologische Probe eine Gewebeprobe von einem Tumor ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Resultate der unterschiedlichen biologischen Analysen mit klinischen Informationen verglichen werden, die über eine Testperson erhalten wurden, von welcher die biologische Probe erhalten wurde.
  11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die klinischen Informationen unabhängig von der Durchführung der unterschiedlichen biologischen Analyse jeder Kopie des Arrays ermittelt werden; und die Informationen eine oder mehrere aus Patientenalter, Tumorgrad, Tumorgröße, Knotenstatus und Rezeptorstatus sind.
  12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Vergleichen der Resultate die Bestimmung umfasst, ob es eine Veränderung eines Gens gibt, durch Untersuchen eines Markers für die Proteinexpression, vorzugsweise durch eine immunologische Analyse, oder eine andere Genveränderung.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Veränderung eine Überexpression von Vimentin in Nierenzellenkarzinom ist, oder eine Überexpression von IGFBP2 in humanem Prostatakrebs oder eine Überexpression von PDGFB bei Brust-, Lungen-, Dickdarm-, Hoden-, endometrialem oder Blasenkrebs ist.
  14. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine biologische Analyse auf einem Rezeptor-Array einen Biomarker verwendet, welcher vorzugsweise einen Marker für die Genexpression unter Nutzung eines Nukleinsäure-Mikroarrays, vorzugsweise eines cDNA- oder Oligonukleotid-Mikroarrays umfasst.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Biomarker durch eine immunologische oder Genanalyse mit hohem Durchsatz gewählt wird, wobei der Biomarker vorzugsweise eine strukturelle oder zahlenmäßige Veränderung eines Chromosoms, einer chromosomalen Region, eines Gens, Genfragments oder eines Locus, oder eine Genfunktionsveränderung umfasst.
  16. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Resultate der unterschiedlichen biologischen Analysen verwendet werden, um: a. ein Reagens für die Erkrankungsdiagnose oder – behandlung zu evaluieren; b. einen prognostischen Marker für eine Erkrankung zu identifizieren; c. Targets für eine Arzneistoffentwicklung nach Prioritäten zu ordnen; d. eine Therapie für eine Erkrankungsart zu bewerten oder auszuwählen; oder e. ein biochemisches Target für die medizinische Therapie zu finden.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Evaluierung eines Reagens für die Erkrankungsdiagnose oder – behandlung das Evaluieren eines Reagens, gewählt aus der Gruppe von Antikörpern, genetischen Sonden, Anti-Sinn-Molekülen, biologischen Inhibitoren, biologischen Enhancern bzw. Bioverstärkern oder anderen biologischen Modulatoren, umfasst.
  18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Identifizieren eines prognostischen Markers für Krebs das Auswählen eines mit einem schlechten klinischen Ergebnis assoziierten Markers umfasst.
  19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Auswahl einer Therapie für die Testperson die Auswahl einer antineoplastischen Therapie umfasst, die mit einem speziellen biologischen Analyseergebnis, vorzugsweise einer onkogenen Amplifikation, Deletion, Translokation, Mutation oder anderen genetischen Neuanordnung, die mit einer klinischen Antwortreaktion auf eine spezielle Therapie korreliert, umfasst.
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