EP1651669A1 - Perfusionsverfahren für die produktion von erythropoietin - Google Patents

Perfusionsverfahren für die produktion von erythropoietin

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EP1651669A1
EP1651669A1 EP04763207A EP04763207A EP1651669A1 EP 1651669 A1 EP1651669 A1 EP 1651669A1 EP 04763207 A EP04763207 A EP 04763207A EP 04763207 A EP04763207 A EP 04763207A EP 1651669 A1 EP1651669 A1 EP 1651669A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
epo
bioreactor
cells
smif7
perfusion
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04763207A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Staerk
Klaus Scharfenberg
Norbert Schulze
Kathrin Baumeister
Wilhelm Beltz
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Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of erythropoietin (EPO), in which eukaryotic cells which are suitable for the expression of EPO are adapted in a suitable bioreactor to SMIF7 medium, the cells obtained are transferred to a larger bioreactor and treated with SMIF7- Medium are expanded further, and a "steady state" state with regard to cell concentration is achieved by means of continuous perfusion and cell bleeding strategy.
  • EPO erythropoietin
  • EPO Human erythropoietin
  • the protein has three N-glycosylation sites at Asn24, Asn 38 and Asn83 and one O-glycosylation site at Ser126, which are sialylated to a high degree.
  • the importance of sialylation for the in vivo activity of EPO has been known for a long time and has been proven by many studies. Lowy et al. (1960, Nature 185: 102-103) were able to show that the desialylation of EPO leads to a complete loss of in vivo activity.
  • cross-flow filters Depending on the cell line and the special requirements, cross-flow filters (Prostak), spin filters, ultrasonic separators, centrifuges and included setters are used as cell retention systems for the implementation of such strategies (Woodside et al. 1998, Mammalina cell retention devices for stirred perfusion bioreactors, Cytotechnology 28: 163-175; Castilho, LR, Medronho, RA 2002, Cell retention devices for suspended-cell perfusion cultures, Adv Biochem Eng Biotechnol. 74: 129-169).
  • the Prostak module used in the cell retention process in this production process which is based on cross flow filtration (tangential flow filtration), is also well documented in the literature.
  • the invention relates to a process for the production of erythropoietin (EPO), in which
  • eukaryotic cells which are suitable for the expression of EPO, are adapted in a suitable bioreactor to SMIF7 medium and expanded to such a cell density, so that in the subsequent step (b) a cell density of 2 ⁇ 1 () 5 ml -1 to 5 x $ 10 ml -1 is obtained,
  • step (b) the cells obtained in step (a) are transferred to a larger bioreactor and cultivated with SMIF7 medium,
  • the cells cultured in the larger bioreactor are expanded to a cell density of 1 x 1 ⁇ 6 ml - ' ' to 1 x 10 ml ⁇ 1,
  • a cell density of 1 x 10 ⁇ mM to 1 x 10? ml "1 is kept constant (steady state) and the expressed EPO is continuously removed, isolated and purified from the larger bioreactor,
  • the eukaryotic cells which are initially in frozen form, are revitalized with the medium DMEM / F12 1: 1, and preferably like the SMIF7 medium per liter with 1.5 to 2.5 g NaHC0 3 , particularly preferably 2.0 to 2.3 g, very particularly preferably 2.16 g of NaHCO 3 ; 0.2 to 5 g, particularly preferably 0.5 to 2 g, very particularly preferably 1 g BSA; 0.2 to 5 mg, particularly preferably 0.5 to 2 mg, very particularly preferably 1 mg human
  • Transferrin 1 to 30 mg, particularly preferably 5 to 15 mg, very particularly preferably 10 mg of human insulin; 1 to 3 mg, particularly preferably 2 mg of hydrocortisone; 0.01 to 0.1 mg, particularly preferably 0.025 to 0.045 mg, very particularly preferably 0.039 mg of dexamethasone; 0.08 to 3 mg, particularly preferably 1.5 to 3 mg, very particularly preferably 2 mg putrescine, 40 to 100 mg, particularly preferably 50 to 80 mg, very particularly preferably 60 mg ethanolamine; 200 to 500 mg, particularly preferably 250 to 400 mg, very particularly preferably 292 mg glutamine and 50 to 100 mg, particularly preferably 70 to 90 mg, very particularly preferably 80 mg serine, are supplemented.
  • Another object of the invention is a method as described above, wherein the bioreactor from step (a) has a volume of 5 to 50 liters, and / or the larger bioreactor from step (b) has a volume of 50 to 200 liters.
  • Another object of the invention is a method as described above, wherein the eukaryotic cells in step (a) and / or step (c) up to a cell density of 1 x 10 6 to 1 x 10 7 ml _1 , preferably 1 x 10 6 to 3 x 10 ⁇ ml -1 are expanded, and preferably the eukaryotic cells are GA-EPO HT 1080 cells.
  • the GA-EPO HT 1080 cells revitalized from a cryocell bank are dissolved in DMEM / F12 1: 1 (Invitrogen) containing 2.16 g NaHC0 3 (Merck), 1 g BSA (Sigma), 1 mg human transferrin (Chiron ), 10 mg human recombinant insulin (Aventis), 2 mg hydrocortisone (Sigma), 0.039 mg dexamethasone (Sigma), 2 mg putrescin (Sigma), 60 mg ethanolamine (Sigma), 1 g Pluronic F68 (Sigma), 292 mg glutamine (Fluka) and 80 mg serine (Fluka) was expanded in T-bottles and spinners and inoculated into a 20L bioreactor.
  • the cells are re-adapted to SMIF7 medium (Invitrogen), which was supplemented 1: 1 analogously to DMEM F12 with the same chemicals and amounts. After an adaptation time of approx. 14 days, the cells are transferred to the 100L bioreactor with a cell density of 3 x E 5 ml "1. The minimum production parameters (cell density greater than or equal to 1 E 6 ml " 1 are achieved after approx. 9 days ( Tab. 1, start of the production phase).
  • SMIF7 medium Invitrogen
  • Tab. 1 Cultivation of GA-EPO cells with a perfusion / bleeding strategy.
  • the stable production phase is 32 days. 4530 L of culture supernatant are produced which contain 46.64 g EPO (CEPO between 6.3-17.7 mg ml "1 ). The quality of EPO is assessed by analyzing the Z number.
  • HPAE chromatography high pH anion-exchange chromatography
  • the N-glycans are separated on the basis of their charge (non sialo, mono sialo etc.) multiplied the respective peak areas by their corresponding charge and added up the individual results.
  • the Z number thus provides important information regarding the sialylation status and the antennae of N-glycans.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin (EPO), bei dem eukaryontische Zellen, die zur Expression von EPO geeignet sind, in einem geeigneten Bioreaktor an SMIF7-Medium adaptiert, die erhaltenen Zellen in einen grösseren Bioreaktor überführt und mit SMIF7-Medium weiter expandiert werden, und bei ständigem Bleeding und ständiger Perfusion das exprimierte EPO aus dem grösseren Bioreaktor isoliert und gereinigt wird.

Description

Perfusionsverfahren für die Produktion von Erythropoietin
Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin (EPO), bei dem eukaryontische Zellen, die zur Expression von EPO geeignet sind, in einem geeigneten Bioreaktor an SMIF7-Medium adaptiert, die erhaltenen Zellen in einen größeren Bioreaktor überführt und mit SMIF7-Medium weiter expandiert werden, und ein „steady State" - Zustand hinsichtlich Zellkonzentration durch kontinuierliche Perfusion und Zellbleeding Strategie realisiert wird.
Humanes Erythropoietin (EPO) besteht aus 165 Aminosäuren und hat aufgrund der Heterogenität der Glycanstrukturen eine apparente Masse von 34 - 39 kDa. Das Protein weist drei N-Glycosylierungsstellen an Asn24, Asn 38 und Asn83 sowie eine O-Glycosylierungsstelle an Ser126 auf, die zu einem hohen Grad sialyliert sind. Die Bedeutung der Sialylierung für die in vivo Aktivität von EPO ist seit langem bekannt und durch vielen Arbeiten belegt. Schon Lowy et al. (1960, Nature 185: 102- 103) konnten zeigen, daß die Desialylierung von EPO zu einem vollkommenen Verlust der in vivo Aktivität führt. Spivak und Hogans ermittelten 1989 (Blood 73: 90-99) eine Halbwertszeit für ein hoch sialyliertes EPO von 53 Minuten. Zum Vergleich zeigte die desialylierte Form lediglich eine Halbwertszeit von 3 Minuten. Für die großtechnische Produktion bzw. für die Etablierung eines Produktionsprozesses für EPO ergibt sich damit die Forderung durch Auswahl geeigneter Parameter einen möglichst hohen Sialylierungsgrad von EPO zu erreichen. Das vorliegende Verfahren bezieht sich auf die Produktion von EPO auf Basis einer Perfusions/Bleeding Strategie mit einer Cross Flow Filtration als Zellrückhaltung.
Perfusionsverfahren für die großtechnische Expression von rekombinanten Proteinen sind seit langem etabliert und in einer Vielzahl von Publikationen beschrieben. Der Nutzen derartiger Herstellungsverfahren besteht generell in sehr hohen
Raum/Zeitausbeuten im Vergleich zu anderen Prozessführungsstrategien (Batch, Fed- Batch). Hierbei werden z.B. die Aufkonzentrierung von toxischen Metaboliten und Substratlimitierungen verhindert, wodurch höhere Zelldichten und höhere Vitalitäten erreicht werden, was letztendlich längere Produktionszeiten und d.h. Raum/Zeitausbeuten gewährleistet. Die Nutzung einer solchen Herstellungsstrategie für die Produktion eines Glycoproteins, z.B. EPO, ist besonders vorteilhaft, da das Produkt kontinuierlich dem , Prozess entzogen wird, wodurch Degradationen durch Glycosidasen und Proteasen etc. minimiert werden können. Aus den oben genannten Gründen ergibt sich, dass ein solches Herstellungsverfahren den für EPO erforderlichen hohen Sialylierunggrad gewährleisten sollte.
Als Zellrückhaltesysteme für die Realisierung solcher Strategien sind in Abhängigkeit von der verwendeten Zellinie und den speziellen Anforderungen Cross-flow Filter (Prostak), Spinfilter, Ultraschallseperatoren, Zentrifugen und Inclined Settier in der Anwendung (Woodside et al. 1998,Mammalina cell retention devices for stirred perfusion bioreactors, Cytotechnology 28: 163-175; Castilho, L.R., Medronho, R.A. 2002, Cell retention devices for suspended-cell perfusion cultures, Adv Biochem Eng Biotechnol. 74: 129-169). Das in dem hier vorliegenden Produktionsverfahren zur Zellrückhaltung zum Einsatz gekommene Prostakmodul, das auf einer Cross Flow Filtration (Tangential Flow Filtration) beruht, ist ebenfalls in der Literatur gut dokumentiert. So sind mit der hier verwendeten Cross Flow Filtration verschiedene Hybidomazellen und Krebszellen kultiviert worden (z.B. Kawahara et al. 1994, Cytotechnology 14: 61 ; de la Broise et al. 1992, Biotechnol Bioeng 40: 25). Obwohl Prostakmodule käuflich erhältlich sind, ist die Verwendung im Pilotmaßstab in der Literatur wenig dokumentiert.
Im folgenden wird eine auf die GA-EPO HT1080 Zelle (Herstellung detailiert beschrieben in „Trial Exhibit No. 20, Amgen Inc. V. Hoechst Marion Roussel, Inc. and Transkaryotic Therapies, Inc; US District Court of Massachusetts CA. 97-10814WGY") adaptierte Perfusions / Bleedingstrategie mit Cross Flow Filtration bis in den 100 L Maßstab beschrieben, die einen robusten Kultivierungsprozeß von bis zu 32
Produktionstagen gewährleistet. Die Zellrückhaltung wird dabei über ein Prostakmodul mit drei hintereinandergeschalteten 10 Stacks (Millipore, Molsheim, Frankreich) realisiert. Die maximale tägliche volumetrische Kapazität der 100 L Perfusionsanlage beträgt mit diesem Setup 2,5 Reaktorvolumina entsprechend 250 L d"1.
Wie sich bei der Entwicklung zeigte, ist es sehr schwierig, einen kontinuierlichen Perfusionsprozeß unter voller Ausnutzung dieser Systemparameter zu etablieren, da bei auftretenden Problemen, wie z.B. der Akkumulation von toxischen Metaboliten, kein Handlungsspielraum besteht (z.B. durch Erhöhung der Perfusionsrate). Des weiteren besteht die Gefahr, daß die Filter der Prostak-Module bedingt durch höhere Zelldichten schneller blockieren, was letztendlich zu einem schnelleren Prozeßabbruch führt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass kontinuierlich hohe Ausbeuten von EPO mit einer Perfusions-/Bleedingstrategie erhalten werden, bei der das Setup nur eine niedrigere Auslastung hat und vorzugsweise spezielle Kulturmedien zum Kultivieren der Zellen benutzt werden. Das hier dargelegte Verfahren beschreibt eine Perfusions / Bleedingstrategie, bei der in der Produktionsphase eine Zelldichte von ungefähr 1-3 E6 ml"1 konstant gehalten wird. Diese Verfahrensweise beinhaltet unter den gewählten Bedingungen eine etwa 50 %-ige Auslastung entsprechend etwa 125 L d"1 Perfundat.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin (EPO), bei dem
(a) eukaryontische Zellen, die zur Expression von EPO geeignet sind, in einem geeigneten Bioreaktor an SMIF7-Medium adaptiert und bis zu einer solchen Zelldichte expandiert werden, so daß im nachfolgenden Schritt (b) eine Zelldichte von 2 x 1 ()5 ml -1 bis 5 x 10$ ml -1 erhalten wird,
(b) die in Schritt (a) erhaltenen Zellen in einen größeren Bioreaktor überführt und mit SMIF7-Medium kultiviert,
(c) die in dem größeren Bioreaktor kultivierten Zellen bis zu einer Zelldichte von 1 x 1θ6 ml-'' bis 1 x 10 ml ~1 expandiert werden, (d) durch eine Perfusions/Bleedingstrategie eine Zelldichte von 1 x 10^ mM bis 1 x 10? ml "1 konstant gehalten wird (steady State) und das exprimierte EPO aus dem größeren Bioreaktor kontinuierlich entfernt, isoliert und gereinigt wird,
wobei vorzugsweise die zunächst in gefrorener Form vorliegenden eukaryontischen Zellen mit dem Medium DMEM/F12 1 :1 revitalisiert werden, und vorzugsweise wie ebenfalls dem SMIF7-Medium pro Liter mit 1 ,5 bis 2,5 g NaHC03, besonders bevorzugt 2,0 bis 2,3 g, ganz besonders bevorzugt 2,16 g NaHCO3; 0,2 bis 5 g, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 g, ganz besonders bevorzugt 1 g BSA; 0,2 bis 5 mg, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 mg, ganz besonders bevorzugt 1 mg humanem
Transferrin; 1 bis 30 mg, besonders bevorzugt 5 bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt 10 mg humanem Insulin; 1 bis 3 mg, besonders bevorzugt 2 mg Hydrocortison; 0,01 bis 0,1 mg, besonders bevorzugt 0,025 bis 0,045 mg, ganz besonders bevorzugt 0,039 mg Dexamethason; 0,08 bis 3 mg, besonders bevorzugt 1 ,5 bis 3 mg, ganz besonders bevorzugt 2 mg Putrescin, 40 bis 100 mg, besonders bevorzugt 50 bis 80 mg, ganz besonders bevorzugt 60 mg Ethanolamin; 200 bis 500 mg, besonders bevorzugt 250 bis 400 mg, ganz besonders bevorzugt 292 mg Glutamin und 50 bis 100 mg, besonders bevorzugt 70 bis 90 mg, ganz besonders bevorzugt 80 mg Serin, supplementiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei der Bioreaktor aus Schritt (a) ein Volumen von 5 bis 50 Litern hat, und / oder der größere Bioreaktor aus Schritt (b) ein Volumen von 50 bis 200 Litern hat.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei die eukaryontischen Zellen in Schritt (a) und / oder Schritt (c) bis zu einer Zelldichte von 1 x 106 bis 1 x 107 ml _1 , vorzugsweise von 1 x 106 bis 3 x 10^ ml -1 expandiert werden, und vorzugsweise die eukaryontischen Zellen GA-EPO HT 1080 - Zellen sind.
Im folgenden werden die Erfindungsgegenstände anhand eines Beispiels näher erkäutert, ohne sich darauf zu beschränken. Beispiel: Kultivierung einer EPO produzierenden Zellinie
Die aus einer Cryozellbank revitalisierten GA-EPO HT 1080 Zellen werden in DMEM/F12 1 :1 (Invitrogen), das pro Liter mit 2,16 g NaHC03 (Merck), 1 g BSA (Sigma), 1 mg humanen Transferrin (Chiron), 10 mg humanen rekombinanten Insulin (Aventis), 2 mg Hydrocortison (Sigma), 0,039 mg Dexamethason (Sigma), 2 mg Putrescin (Sigma), 60 mg Ethanolamin (Sigma), 1 g Pluronic F68 (Sigma), 292 mg Glutamin (Fluka) und 80 mg Serin (Fluka) supplementiert wurde in T-Flaschen und Spinnern expandiert und in einen 20L Bioreaktor inokuliert. In diesem werden die Zellen auf SMIF7 Medium (Invitrogen) umadaptiert, das analog zu DMEM F12 1 :1 mit den gleichen Chemikalien und Mengen supplementiert wurde. Nach einer Adaptationszeit von ca. 14 Tagen erfolgt der Transfer der Zellen in den 100L Bioreaktor bei einer Zelldichte von 3 x E5 ml"1. Die minimalen Produktionsparameter (Zelldichte größer gleich 1 E6 ml"1 werden nach ca. 9 Tagen erreicht (Tab.1 , Beginn der Produktionsphase).
Tab. 1 : Kultivierung von GA-EPO Zellen mit einer Perfusions/Bleedingstrategie.
Die stabile Produktionsphase beträgt 32 Tage. Dabei werden 4530 L Kulturüberstand erzeugt, die 46,64 g EPO enthalten (CEPO zwischen 6,3-17,7 mg ml"1). Die Beurteilung der Qualität von EPO erfolgt über Analyse der Z-Zahl. Durch HPAE Chromatographie (high-pH anion-exchange chromatography) werden dabei die N-Glycane aufgrund ihrer Ladung (non sialo, mono sialo etc.) getrennt. Zur Berechnung der Z-Zahl werden die jeweiligen Peakflächen mit ihrer korrespondierenden Ladung multipliziert und die Einzelergebnisse aufsummiert. Die Z-Zahl liefert dadurch wichtige Erkenntnisse hinsichtlich des Sialylierungstatus und der Antennärität von N-Glycanen. Hochgereinigte Therapeutika von rhu EPO der Firmen Röche Mannheim, Amgen, Organon Teknika und Merckle besitzen Z-Zahlen von 361 , 367, 286 bzw. 323 (Hermentin et al., (1996), The hypothetical N-glycan Charge: a number that characterizes protein glycosylation.Glycobiology 6: 217-230). Das hier dargelegte Perfusionsverfahren liefert über den gesamten Prozeß Z-Zahlen des kruden, nicht aufgereinigten EPO zwischen 278 und 337 (Mittelwert 315,5). Für ein nicht aufgereinigtes EPO ist das ein hoher Wert und zeigt damit die Machbarkeit der dargelegten Perfusions/Bleedingstrategie.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin (EPO), bei dem a. eukaryontische Zellen, die zur Expression von EPO geeignet sind, in einem geeigneten Bioreaktor an SMIF7-Mediύm adaptiert und bis zu einer Zelldichte von 5 x 10^ bis 5 x 10^ ml -1 expandiert werden, b. die in Schritt (a) erhaltenen Zellen in einen größeren Bioreaktor überführt und mit SMIF7-Medium bis zu einer Zelldichte von 1 x 10^ ml -1 bis 1 x 10^ ml "'' verdünnt werden, c. die in dem größeren Bioreaktor kultivierten Zellen bis zu einer Zelldichte von 5 x 1θ5 bis 5 x 10^ ml "1 expandiert werden, d. bei ständigem Bleeding und ständiger Perfusion das exprimierte EPO aus dem größeren Bioreaktor isoliert und gereinigt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei die zunächst in gefrorener Form vorliegenden eukaryontischen Zellen mit dem Medium DMEM/F12 1 :1 revitalisiert werden.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das zur Revitalisierung und das SM1F7- Medium pro Liter mit 1 ,5 bis 2,5 g NaHC03; 0,2 bis 5 g BSA; 0,2 bis 5 mg humanen Transferrin; 1 bis 30 mg humanem Insulin; 1 bis 3 mg Hydrocortison; 0,01 bis 0,1 mg Dexamethason; 0,08 bis 3 mg Putrescin, 40 bis 100 mg Ethanolamin; 200 bis 500 mg Glutamin und 50 bis 100 mg Serin supplementiert ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das zur Revitalisierung und das SMIF7- Medium pro Liter mit 2,0 bis 2,3 g NaHC03; 0,5 bis 2 g BSA; 0,5 bis 2 mg humanem Transferrin; 5 bis 15 mg humanem Insulin; 1 bis 3 mg Hydrocortison; 0,025 bis 0,045 mg Dexamethason; 1 ,5 bis 3 mg Putrescin, 50 bis 80 mg Ethanolamin; 250 bis 400 mg Glutamin und 70 bis 90 mg Serin supplementiert ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das zur Revitalisierung und das SMIF7- Medium pro Liter mit 2,16 g NaHC03; 1 g BSA; 1 mg humanem Transferrin; 10 mg humanem Insulin; 2 mg Hydrocortison; 0,039 mg Dexamethason; 2 mg Putrescin, 60 mg Ethanolamin; 292 mg Glutamin und 80 mg Serin supplementiert ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bioreaktor aus Schritt (a) ein Volumen von 5 bis 50 Litern hat.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der größere Bioreaktor aus Schritt (b) ein Volumen von 70 bis 200 Litern hat.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eukaryontischen Zellen in Schritt (a) und / oder Schritt (c) bis zu einer Zelldichte von 8 x 1θ5 bis 2 x 10^ ml ~1 , vorzugsweise von 1 x 10^ ml "^ expandiert werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eukaryontischen Zellen GA-EPO HT 1080 - Zellen sind. Perfusionsverfahren für die Produktion von Erythropoietin
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2538794C (en) 2003-09-12 2016-04-19 Antigenics, Inc. Vaccine for treatment and prevention of herpes simplex virus infection
ES2474573T3 (es) 2006-01-04 2014-07-09 Baxter International Inc Medio de cultivo celular sin oligop�ptidos
US8070989B2 (en) 2007-08-09 2011-12-06 Hallstar Innovations Corp. Photostabilization of retinoids with alkoxycrylene compounds
US7588702B2 (en) 2007-08-09 2009-09-15 Hallstar Innovations Corp. Method of quenching electronic excitation of chromophore-containing organic molecules in photoactive compositions
US20250297036A1 (en) * 2022-04-27 2025-09-25 POSTECH Research and Business Development Foundation Method for constructing hotspot-derived peptide-nucleic acid hybrid molecules on basis of in vitro selection

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2215748C2 (ru) * 1999-04-09 2003-11-10 Сентро Де Инмунология Молекулар Способ получения рекомбинантного эритропоэтина человека и полученный эритропоэтин, фармацевтическая композиция
US6855544B1 (en) * 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
AU2003283174A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-30 Cytos Biotechnology Ag Method for protein production

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2005012345A1 *

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WO2005012345A1 (de) 2005-02-10
WO2005012345A8 (de) 2005-04-07
DE10333675A1 (de) 2005-03-03

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