EP1574259A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von markierten Mikropartikeln - Google Patents

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EP1574259A1
EP1574259A1 EP05450044A EP05450044A EP1574259A1 EP 1574259 A1 EP1574259 A1 EP 1574259A1 EP 05450044 A EP05450044 A EP 05450044A EP 05450044 A EP05450044 A EP 05450044A EP 1574259 A1 EP1574259 A1 EP 1574259A1
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EP
European Patent Office
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microparticles
magnet
conduit
beam path
wall
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05450044A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Brandl
Jens Hartmann
Dieter Falkenhagen
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Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Original Assignee
Christian Doppler Labor fur Spezifische Adsorptionstechnologien In Der Medizin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Christian Doppler Labor fur Spezifische Adsorptionstechnologien In Der Medizin filed Critical Christian Doppler Labor fur Spezifische Adsorptionstechnologien In Der Medizin
Publication of EP1574259A1 publication Critical patent/EP1574259A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/28—Magnetic plugs and dipsticks
    • B03C1/288—Magnetic plugs and dipsticks disposed at the outer circumference of a recipient
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/30—Combinations with other devices, not otherwise provided for
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/24—Details of magnetic or electrostatic separation for measuring or calculating of parameters, e.g. efficiency
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical or biological applications

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of labeled microparticles in a medium flowing through a conduit
  • the invention relates to a device for the detection of magnetic and fluorescently labeled microparticles in a flowing medium
  • Fig. 1 is a for the shown suitable system, also known from EP 0 776 223 B1 has become.
  • a primary extracorporeal circuit 3 is attached to one Patient PAT connected to an arterial line 1 via a blood pump 2 too a filter 5, from which the return flow via a venous line 4 to the patient PAT is done.
  • the second extracorporeal circuit or secondary circuit 7 leads from the filtrate side of the filter 5 via a centrifugal or roller pump 8 back to the filtrate side of the Plasma filter 5.
  • a device 6 for detecting certain Properties of the filtrate flow included.
  • the device shown in Fig. 1 is state of Technique, wherein the invention with the device 6 explained in more detail below and an associated measurement method.
  • microparticles 9 With the help of which toxins specifically bound and so from the Blood are removed.
  • microparticles or microspheres have a diameter of less than 20 .mu.m, in particular 1 to 7 .mu.m, which corresponds to the diameter of the Blood cells is comparable.
  • Special characteristics of microspheres are a big one outer surface and short diffusion paths to inner pores, if any.
  • the whole blood with the filter in a cell portion and a filtrate, z.
  • the filtrate circulates in the secondary circuit at high speed to a high Filtrattransmembraniser to be able to sustain for a powerful treatment.
  • the Flow rate in the secondary circuit 7, which is typically 0.5 to 4 l / min, is also so high, so that no formation of deposits can take place.
  • the Microparticle suspension of secondary circuit 7 is only from the primary blood circulation separated by a thin-walled hollow fiber membrane. In the case of a diaphragm rupture or even a single leak would result in an infusion of microparticles into the patient's bloodstream. To prevent this, the device 6 is arranged to prevent the occurrence of Detecting microparticles in the primary circuit 3. Be microparticles in the Blood circulation detected, can take immediate action, such as switching off the blood pump 2 etc., taken or triggered automatically.
  • EP 0 776 228 B1 also addresses the problem of the detection of microparticles in the bloodstream and suggests ultrasonic sensors as well as optical Sensors, in particular in connection with a coloring of the liquid in Sekudärniklauf with, for example, fluorescent substances.
  • one microparticles which may have arrived in the primary circuit, with the help of a magnetic field, if the particles are magnetically activated Shares included.
  • Such separation of magnetically marked particles, in particular Cells in a high gradient field are also described, for example, in EP 1 019 195 B1 described.
  • FIG. 2 A known device for measuring optical properties in the primary (blood) circle 3 is shown in Fig. 2.
  • Fig. 2 A known device for measuring optical properties in the primary (blood) circle 3 is shown in Fig. 2.
  • they are with an optically reflective or preferably with labeled with a fluorescent dye.
  • labeled particles become the secondary circuit 7, in addition to the (adsorber) microparticles contained in it.
  • 1 to 10% V / V labeled particles are added to the adsorber particles and the total particle concentration is about 20% V / V.
  • the labeled particles circulate then together with the Adsorberpumblen in the secondary circuit 7. In the case of Filter leakage occur, the labeled particles together with the adsorbent in the Primary circuit 3 via.
  • an occurrence of fluorescently labeled particles in the primary circuit 3 are also recorded quantitatively and it can be calculated from the amount of Indicator particles on the amount of in the adsorber particles in the primary circuit passed Adsorberp once be closed. It is understood that the size distribution the marked particle should be equal to that of the adsorber particles so that this inference sure enough.
  • FIG. 2 also shows the optical principle of a known fluorescence-marked detection device 6 Microparticles.
  • a light source 10, z. As an LED or a laser, provides the Excitation light, in the example shown in the range of 57o to 610 nm.
  • the beam of Light source 10 is focused and / or corrected by means of a lens 11 and then with the help of optical filter 12 from the broadband light, the dominant excitation wavelength of the fluorescent dye, here 590 nm, filtered out.
  • a semitransparent 45 ° beam splitter 13 directs the excitation light to a focusing lens 14 to focus the beam on the liquid volume to be observed, which in the venous line 4 of the primary circuit 3 is located.
  • This line 4 is at least partially and in a known manner z. B. formed as a transparent tube whose material is chosen is that it in the range of excitation and fluorescence wavelength to no optical Impairment for the detector with respect to absorption or autofluorescence results.
  • located in the primary circuit 3 measuring chamber instead of being measured in a tube section.
  • Fluorescent light emitted by labeled microparticles is removed by means of the lens 14 bundled and passes through the beam splitter 13 in the receiving path. From one emitted Spectrum from 610 to 635 nm or any parasitic radiation from the excitation path and ambient light by means of optical filters 15 light of a certain wavelength, filtered out in the present case 620 nm and a focusing lens 16 to a Photodetector 17 out, in a practical design z. B. on the active surface a photomultiplier. The electrical output of the photodetector 17 is proportional the light intensity and also from the signal amplitude can affect the density of fluorescently labeled Particles are closed in the considered liquid volume. Of the shown fluorescence detector is designated here and in further figures with 18.
  • a problem specific to the prior art is the relatively low sensitivity the detection method.
  • the resulting Signal-to-noise ratio due to the high optical absorption of blood at the extraction and emission wavelength of conventional fluorescent dyes a limiting Factor, because it can only ever due to the high optical density of the blood small liquid volume are detected by the detector.
  • the focus of the detector beam path is only on a thin layer within a blood transporting one Hose od.
  • the intensity of the measured fluorescent light is the Particle number in the considered volume proportional.
  • WO 92/14138 shows an examination method including an associated device in which prepares small-volume samples which contain a complex with magnetic particles bound thereto. This sample is then placed in a small sample chamber and there are the Complex particles by means of a magnetic field to a disposed within the chamber Electrode pulled to then, after applying a voltage, an electrochemiluminescence stimulate, which is then detected. This procedure uses electrodes within a special measuring chamber ahead and works discontinuously.
  • JP 9089774 A describes a fluorescence microscope with an annular permanent magnet at the objective lens for concentration of magnetic and fluorescent particles in front of the lens, where again the measurement is discontinuous and in a measuring chamber with a small, defined volume.
  • JP 5264547 discloses an immuno-technological method in which for analysis a sample is labeled enzymatically and magnetically Sample substance is drawn onto a substrate with which it reacts to then analyzed become. Only the reaction with the substrate allows the detection by an absorption or fluorescence analysis.
  • microparticles are used which, on the one hand, are magnetically activatable On the other hand, at least one other detectable Have marker, and the microparticles using a magnetic field in the flowing Medium captured and accumulated and stored at the collection point as a deposit at the Inner wall of the line continuously detected based on their further mark become.
  • a device of the type indicated above which Is characterized by a line with an optically transparent Wall for guiding the medium flow, at least one magnet for generating a magnetic field is arranged in the interior of the conduit on the outside thereof, wherein the Magnetic field in the presence of the labeled microparticles to a deposition of Particles on the inner wall of the conduit leads, and a fluorescence detector whose Beam path through the wall of the line in the interior to the area of a possible deposition of microparticles.
  • the further marking an optical fluorescent label and the microparticles at the collection site optically be detected.
  • the invention is particularly suitable for a blood purification system whose extracorporeal Blood flow forms the flowing medium to increase safety for the patient.
  • the medium in a line with optically permeable Wall flows and the magnetic field with the help of at least one outside the line generated magnet is generated.
  • a conventional, used in the infusion technique Hose serve as a conduit and there are no sterilization problems.
  • the at least one magnet a permanent magnet.
  • a well-detectable capture of microparticles results when a magnet near the line, is arranged immediately upstream of the entrance of the beam path in the line.
  • the north-south axis of the magnet being at an angle to the beam path of the magnet Fluorescence detector, but essentially in a common plane normal to Line is.
  • the angle between north-south direction of the magnet and Beam path of the detector expediently between 70 ° and 100 °.
  • the invention provides, in addition to a first mark - in the shown embodiments a fluorescent label - another marker, namely a magnetic marker to use.
  • a fluorescent label - another marker namely a magnetic marker to use.
  • eligible microparticles own z For example, a microspherical cellulosic matrix having an iron (II, III) oxide core.
  • the dye cresyl violet (9-diamino-benzophenoxazonium perchlorate) with 1,4-glycidyloxypropyltrimethoxylsilane on the particle surface be fixed, with a preferred diameter of the thus marked Particles between 5 and 15 microns.
  • the mark to be detected could also another kind, z.
  • As a radioactive but has the fluorescent label in the Practice as particularly suitable as cheap, safe and with reasonable effort detectable, exposed.
  • the invention further provides the microparticles to be detected using a magnetic field to capture and collect them to the collection point to detect on the basis of their fluorescent label.
  • a magnetic field to capture and collect them to the collection point to detect on the basis of their fluorescent label.
  • the invention shown is in the vicinity of a tube portion of the venous line 4 .
  • a permanent magnet 19 arranged in the vicinity of a tube portion of the venous line 4 .
  • the magnetic field of the magnet 19 is strong enough - the magnet 19 or the magnets
  • these and the other embodiments can also be used as electromagnets be formed - remain all magnetically marked particles in the region of the magnet 19 adhere to the inner hose wall. This deposit of 21 labeled particles becomes pulled along by the flow of part of the magnet 19 downstream. In the practical One realizes that there is a significant area of deposit 21 in the Focus of the beam path 20 is located.
  • the fluorescence detector 18 measures the intensity of the fluorescence radiation emitted by the starting with the excitation wavelength irradiated microparticles.
  • the technology - to be measured in the flow past can practically the entire Amount of the marked in the bloodstream 3 tagged particles are determined. Measurements have shown that the intensity of the fluorescent light is substantially proportional to the total amount of the transferred into the primary circuit 3 particles.
  • two magnets 19a, 19b are aligned radially and around one Angle of z. B. 60 ° to 120 °, preferably 90 ° offset from each other with respect to the (Venous) line 4 is arranged.
  • the beam path 20 of the detector 18 expediently by the angular symmetry of the magnets 19a, 19b.
  • the deposits are in one free optical path for the detector 18 and the particles can be directly at the collection point be irradiated with the excitation light.
  • the beam path 20 of the fluorescence detector 18 slightly downstream of the axes of the magnets 19a, 19b the wall of the conduit 4 run to the "smearing" of the deposit 19 (see Fig. 2) due to the flow to correct.
  • FIGS. 5 and 6 A third variant with respect to the relative position of the beam path of the detector 19, magnet 19 and line 4 is shown in FIGS. 5 and 6.
  • magnet 19 and line 4 lies the north-south magnetic axis of a Permanent magnet 19 at an angle of 60 ° to 120 °, preferably normal with respect the beam path 20 of the detector 18 and also with respect to the axis of the line 4.
  • Magnetic labeled microparticles accumulate on the magnet 19 facing inside the line 4 and are illuminated laterally by the detector beam.
  • the lateral position The detector beam is adjusted during operation so that a maximum output signal results.
  • the measurement results shown in FIG. 7 clearly illustrate the achievable with the invention Improve sensitivity and increase signal-to-noise ratio.
  • the Line 22 shows the output of photodetector 17 in the absence of fluorescently labeled Particles, thus the background noise.
  • On the ordinate is the height of the output signal plotted on the abscissa, the particle volume, more precisely the particle volume, which has already passed the measuring point.
  • the line 23 relates to a measurement with fluorescence-labeled and also ferromagnetic marked particles in an arrangement such. B. of Fig. 3 with the magnet removed 19. Es results in a detectable, but only slightly above the noise floor Output signal, regardless of the total flowed past the measuring point Particle volume is. A similar line results when the particles are only fluorescently labeled are, whether a magnet 19 is present or not.
  • the curve 24 shows a measurement result when using the invention, wherein can be seen clearly the increase of the signal / noise ratio, which on an average Doubling of the output signal is due.
  • the standard deviation of the output signals for five measurements located. The marked particles are captured by the magnet and held. The number of retained particles increases with the total amount of the magnetic trap entered particles and causes an increase in fluorescence intensity.

Landscapes

  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion von markierten Mikropartikeln in einem eine Leitung (4) durchströmenden Medium, wobei Mikropartikel eingesetzt werden, welche einerseits magnetisch aktivierbare Markierungsanteile aufweisen und die andererseits zumindest eine weitere detektierbare Markierung besitzen, und die Mikropartikel mit Hilfe eines Magnetfeldes in dem strömenden Medium eingefangen und angesammelt und an der Sammelstelle als Ablagerung (21) an der Innenwandung der Leitung auf Basis ihrer weiteren Markierung kontinuierlich detektiert werden. Eine Leitung (4) mit einer optisch durchlässigen Wandung dient zur Führung des Mediumstromes, zumindest ein Magnet (19; 19a, 19b) zur Erzeugung eines Magnetfeldes im Inneren der Leitung (4) und ein Fluoreszenzdetektor (18), dessen Strahlengang (20) durch die Wandung der Leitung (4) in deren Innenraum zu dem Bereich einer möglichen Ablagerung (21) von Mikropartikeln verläuft, zur Detektion. <IMAGE>

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion von markierten Mikropartikeln in einem eine Leitung durchströmenden Medium
Ebenso bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zur Detektion von magnetisch und fluoreszenzmarkierten Mikropartikeln in einem strömenden Medium
Es gibt gewisse Blutreinigungsverfahren, wie Plasmapheresis und Hämoperfusion/Plasmaperfusion, bei welchen ein Entgiften durch Entfernung proteingebundener oder hydrophober Substanzen aus dem Blut erfolgt. Leider wird die Wirksamkeit dieser Verfahren häufig durch technische Probleme, niedrige Selektivität und geringe Leistungsfähigkeit begrenzt. Andererseits können Symptome von Patienten, die unter Leberversagen oder anderen hepatischen Funktionsstörungen leiden, mit der Beseitigung der Giftstoffe und anderer nicht erwünschter Substanzen, die mit herkömmlichen Dialysebehandlungen (Hämodialyse, Hämofiltration) nicht beseitigt werden können, verbessert werden. In Fig. 1 ist ein für die genannten Zwecke geeignetes System gezeigt, das auch aus der EP 0 776 223 B1 bekannt geworden ist. Bei diesem System oder Gerät ist ein primärer extrakorporaler Kreis 3 an einen Patienten PAT angeschlossen, wobei eine arterielle Leitung 1 über eine Blutpumpe 2 zu einem Filter 5 führt, von welcher der Rückfluss über eine venöse Leitung 4 zu dem Patienten PAT erfolgt. Der zweite extrakorporale Kreis oder Sekundärkreis 7 führt von der Filtratseite des Filters 5 über eine Zentrifugal- oder Rollenpumpe 8 wieder zurück zur Filtratseite des Plasmafilters 5. In dem Primärkreis ist überdies eine Vorrichtung 6 zur Detektion bestimmter Eigenschaften des Filtratflusses enthalten. Die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung ist Stand der Technik, wobei sich die Erfindung mit der im weiteren noch näher erläuterten Vorrichtung 6 und einem zugehörigen Messverfahren beschäftigt.
Auf Fig. 1 zurückkommend, ist zu erläutern, dass durch die Relativbewegung der Flüssigkeiten von Primär- und Sekundärkreislauf ein Transmembrandruck im Filter 5 entsteht, der einen Flüssigkeitsaustausch zwischen den Kreisläufen zur Folge hat. Im Sekundärkreis 7 zirkulieren Mikropartikel 9, mit deren Hilfe Toxine spezifisch gebunden und so aus dem Blut entfernt werden. Derartige Mikroteilchen oder Mikrosphären weisen einen Durchmesser von weniger als 20 µm, insbesondere 1 bis 7 µm auf, was mit dem Durchmesser der Blutzellen vergleichbar ist. Besondere Eigenschaften der Mikrosphären sind eine große äußere Oberfläche und kurze Diffusionswege zu inneren Poren, falls solche vorhanden sind.
Um einen direkten Kontakt zwischen den Blutzellen und den Partikeln zu verhindern, wird das Vollblut mit dem Filter in einen Zellanteil und ein Filtrat, z. B. Plasma aufgeteilt, wobei das Filtrat im Sekundärkreis mit hoher Geschwindigkeit zirkuliert, um einen hohen Filtrattransmembranfluss für eine leistungsfähige Behandlung aufrecht erhalten zu können. Die Fließgeschwindigkeit im Sekundärkreis 7, die typisch bei 0,5 bis 4 l/min liegt, ist auch deshalb so hoch, damit keine Bildung von Ablagerungen erfolgen kann.
Um die Patientensicherheit so hoch wie möglich zu halten, ist die Implementierung verschiedener Sicherheitssysteme in einem System, wie in Fig. 1 gezeigt, erforderlich. Die Mikropartikel-Suspension des Sekundärkreises 7 ist von dem primären Blutkreislauf nur durch eine dünnwandige Hohlfasermembran getrennt. Im Falle eines Membranbruchs oder auch nur einer Leckage käme es zu einer Infusion von Mikropartikeln in den Patientenblutkreislauf. Um dies zu verhindern ist die Vorrichtung 6 dazu eingerichtet, das Auftreten von Mikropartikeln in dem primären Kreislauf 3 festzustellen. Werden Mikropartikel in dem Blutkreislauf festgestellt, können sofortige Maßnahmen, wie Abschalten der Blutpumpe 2 etc., ergriffen bzw. automatisch ausgelöst werden.
Die bereits genannte EP 0 776 228 B1 geht auch auf das Problem der Detektion von Mikropartikeln im Blutkreislauf ein und schlägt Ultraschallsensoren ebenso vor, wie optische Sensoren, insbesondere in Zusammenhang mit einem Einfärben der Flüssigkeit im Sekudärkreislauf mit beispielsweise fluoreszierenden Stoffen. Andererseits wird auch darauf hingewiesen, dass man Mikropartikel, welche allfällig in dem Primärkreislauf gelangt sind, mit Hilfe eines Magnetfeldes absondern kann, falls die Partikel magnetisch aktivierbare Anteile enthalten. Ein solches Abtrennen magnetisch gekennzeichneter Teilchen, insbesondere Zellen, in einem Hochgradientenfeld ist beispielsweise auch in der EP 1 019 195 B1 beschrieben.
Eine bekannte Vorrichtung zur Messung optischer Eigenschaften in dem Primär(blut)kreis 3 ist in Fig. 2 gezeigt. Um die Mikropartikel von den sie umgebenden Blutbestandteilen unterscheiden zu können, werden sie mit einer optisch reflektierenden oder vorzugsweise mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert. Solche markierten Partikel werden dem Sekundärkreis 7, zusätzlich zu den in ihm enthaltenen (Adsorber)mikropartikeln zugesetzt. Typischerweise sind den Adsorberpartikeln 1 bis 10 % V/V markierte Partikel zugesetzt und die gesamte Partikelkonzentration beträgt etwa 20 % V/V. Die markierten Partikel zirkulieren dann gemeinsam mit den Adsorberpartikeln in dem Sekundärkreislauf 7. Im Falle einer Filter-Leckage treten die markierten Partikel gemeinsam mit den Adsorberpartikeln in den Primärkreislauf 3 über.
Mit Hilfe der Detektionsvorrichtung 6 kann ein Auftreten von fluoreszenzmarkierten Partikeln im Primärkreislauf 3 auch quantitativ erfasst werden und es kann aus der Menge der Indikatorpartikel auf die Menge der in den Adsorberpartikel in den Primärkreislauf übergetretenen Adsorberpartikel geschlossen werden. Es versteht sich, dass die Größenverteilung der markierten Partikel jener der Adsorberpartikel gleichen sollte, damit dieser Rückschluss sicher genug ist.
Fig. 2 zeigt auch das optische Prinzip einer bekannten Detektionsvorrichtung 6 für fluoreszenzmarkierte Mikropartikel. Eine Lichtquelle 10, z. B. eine LED oder ein Laser, liefert das Anregungslicht, bei dem gezeigten Beispiel im Bereich von 57o bis 610 nm. Der Strahl der Lichtquelle 10 wird mittels einer Linse 11 gebündelt und/oder korrigiert und sodann wird mit Hilfe optischer Filter 12 aus dem breitbandigen Licht die dominante Anregungswellenlänge des fluoreszierenden Farbstoffes, hier 590 nm, ausgefiltert.
Ein halbdurchlässiger 45°-Strahlteiler 13 lenkt das Anregungslicht zu einer Fokussierungslinse 14, um den Strahl auf das zu beobachtende Flüssigkeitsvolumen zu fokussieren, das in der venösen Leitung 4 des Primärkreises 3 liegt. Diese Leitung 4 ist zumindest teilweise und in bekannter Weise z. B. als transparenter Schlauch ausgebildet, dessen Material so gewählt wird, dass es im Bereich der Anregungs- und Fluoreszenzwellenlänge zu keinen optischen Beeinträchtigungen für den Detektor hinsichtlich Absorption oder Eigenfluoreszenz führt. Natürlich kann auch in einer besonderen, in dem primären Kreis 3 gelegenen Messkammer statt in einem Schlauchabschnitt gemessen werden.
Von markierten Mikropartikeln emittiertes Fluoreszenzlicht wird mit Hilfe der Linse 14 gebündelt und gelangt durch den Strahlteiler 13 in den Empfangspfad. Aus einem emittierten Spektrum von 610 bis 635 nm bzw. allfälliger parasitärer Strahlung aus dem Anregungspfad und Umgebungslicht wird mittels optischer Filter 15 Licht einer bestimmten Wellenlänge, im vorliegenden Fall 620 nm ausgefiltert und über eine Fokussierlinse 16 zu einem Photodetektor 17 geführt, bei einer praxisgerechten Ausführung z. B. auf die aktive Fläche eines Photomultiplers. Das elektrische Ausgangssignal des Photodetektors 17 ist proportional der Lichtintensität und auch aus der Signalamplitude kann auf die Dichte von fluoreszenzmarkierten Partikeln in dem betrachteten Flüssigkeitsvolumen geschlossen werden. Der gezeigte Fluoreszenzdetektor ist hier und in weiteren Figuren mit 18 bezeichnet.
Ein Problem, das für den Stand der Technik spezifisch ist, ist die relativ geringe Empfindlichkeit der Detektionsverfahren. So ist für die Fluoreszenzlicht-Detektion das sich ergebende Signal/Rausch-Verhältnis wegen der hohen optischen Absorbtion von Blut bei der Extiktions- und Emissionswellenlänge üblicher fluoreszierender Farbstoffe ein limitierender Faktor, denn es kann auf Grund der hohen optischen Dichte des Blutes immer nur ein kleines Flüssigkeitsvolumen von dem Detektor erfasst werden. Der Fokus des Detektor-Strahlengangs ist nur auf eine dünne Schicht innerhalb eines das Blut transportierenden Schlauches od. dgl. gerichtet und es werden dementsprechend wenige von allfällig vorhandenen Partikel erfasst. Die Intensität des gemessenen Fluoreszenzlichtes ist jedoch der Partikelzahl im betrachteten Volumen proportional.
Es ist an dieser Stelle anzumerken, dass die Verwendung auch magnetisch markierter Partikel bei Analysenverfahren bekannt ist. So zeigt die WO 92/14138 ein Untersuchungsverfahren samt einer zugehörigen Vorrichtung, bei welchem kleinvolumige Proben vorbereitet werden, welche einen Komplex mit daran gebundenen magnetischen Partikeln enthalten. Diese Probe wird sodann in eine kleine Probenkammer eingebracht und dort werden die Komplexteilchen mit Hilfe eines Magnetfeldes auf eine innerhalb der Kammer angeordnete Elektrode gezogen, um daraufhin, nach Anlegen einer Spannung, eine Elektrochemolumineszenz anzuregen, die dann detektiert wird. Dieses Verfahren setzt Elektroden innerhalb einer speziellen Messkammer voraus und arbeitet diskontinuierlich.
Die JP 9089774 A beschreibt ein Fluoreszenzmikroskop mit einem ringförmigen Permanentmagneten an der Objektivlinse zur Konzentration magnetischer und fluoreszierender Partikel vor dem Objektiv, wobei auch hier die Messung diskontinuierlich und in einer Messkammer mit kleinem, definiertem Volumen erfolgt.
Die JP 5264547 offenbart ein immuntechnologisches Verfahren, bei welchem für eine Analyse eine Probe enzymatisch und magnetisch markiert wird, Durch ein Magnetfeld wird die Probensubstanz auf ein Substrat gezogen, mit welchem sie reagiert, um danach analysiert zu werden. Erst die Reaktion mit dem Substrat ermöglicht die Detektion durch eine Absorptions- oder Fluoreszenzanalyse.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zu schaffen, mit deren Hilfe markierte, insbesondere fluoreszenzmarkierte Mikropartikel in einem strömenden Medium wie z. B. in einem Blutkreislauf, bereits in geringer Konzentration sicher detektiert werden können.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, bei welchem erfindungsgemäß Mikropartikel eingesetzt werden, welche einerseits magnetisch aktivierbare Markierungsanteile aufweisen und die andererseits zumindest eine weitere detektierbare Markierung besitzen, und die Mikropartikel mit Hilfe eines Magnetfeldes in dem strömenden Medium eingefangen und angesammelt und an der Sammelstelle als Ablagerung an der Innenwandung der Leitung auf Basis ihrer weiteren Markierung kontinuierlich detektiert werden.
Ebenso wird die Aufgabe mit einer Vorrichtung der oben angegebenen Art gelöst, welche erfindungsgemäß gekennzeichnet ist durch eine Leitung mit einer optisch durchlässigen Wandung zur Führung des Mediumstromes, zumindest einen Magneten, der zur Erzeugung eines Magnetfeldes im Inneren der Leitung an deren Außenseite angeordnet ist, wobei das Magnetfeld bei Vorhandensein der markierten Mikropartikel zu einer Ablagerung der Partikel an der Innenwandung der Leitung führt, und einen Fluoreszenzdetektor, dessen Strahlengang durch die Wandung der Leitung in deren Innenraum zu dem Bereich einer möglichen Ablagerung von Mikropartikeln verläuft.
Bei einer besonders praxistauglichen Variante ist vorgesehen, dass die weitere Markierung eine optische Fluoreszenzmarkierung ist und die Mikropartikel an der Sammelstelle optisch detektiert werden.
Die Erfindung eignet sich besonders für eine Blutreinigungsanlage, deren extrakorporaler Blutfluss das strömende Medium bildet, um die Sicherheit für den Patienten zu erhöhen.
Zweckmäßig ist es weiters, wenn das Medium in einer Leitung mit optisch durchlässiger Wandung strömt und das Magnetfeld mit Hilfe zumindest eines außerhalb der Leitung gelegenen Magneten erzeugt wird. Dabei kann ein üblicher, in der Infusionstechnik verwendeter Schlauch als Leitung dienen und es treten keine Sterilisationsprobleme auf. Dabei eignet sich besonders eine Ausführung, bei welcher im Bereich des zumindest einen Magneten die Ablagerung von eingefangenen und markierten Mikropartikeln an der Innenwand der Leitung mit Hilfe des Strahlenganges eines Fluoreszenzdetektors detektiert wird.
Zur Vereinfachung der Vorrichtung ist es zweckdienlich, wenn der zumindest eine Magnet ein Permanentmagnet ist.
Ein gut erfassbarer Einfang an Mikropartikeln ergibt sich, wenn ein Magnet nahe der Leitung, unmittelbar stromauf des Eintrittes des Strahlenganges in die Leitung angeordnet ist.
Es führt zu einer kompakten Konstruktion, wenn ein Magnet nahe der Leitung gelegen ist, wobei die Nord-Süd-Achse des Magneten unter einem Winkel zu dem Strahlengang des Fluoreszenzdetektors, jedoch im wesentlichen in einer gemeinsamen Normalebene zur Leitung liegt. Dabei liegt der Winkel zwischen Nord-Süd-Richtung des Magneten und Strahlengang des Detektors zweckmäßigerweise zwischen 70 ° und 100 °.
Wenn zwei Magnete vorgesehen sind, welche in einer Normalebene zur Leitung angeordnet sind, wobei die Nord-Süd-Achsen der Magneten unter 60 ° bis 120 °, vorzugsweise 90 ° gegeneinander geneigt sind und der Strahlengang des Detektors in Richtung der Leitung gesehen im wesentlichen durch die Winkelsymmetrale der Nord-Süd-Achsen verläuft, erhält man einen besonders wirksamen Einfang der Mikroteilchen, wobei es zur bestmöglichsten optischen Erfassung der Ablagerung ratsam sein kann, wenn der Strahlengang des Fluoreszenzdetektors geringfügig stromab der Achsen der Magneten durch die Wandung der Leitung verläuft.
Die Erfindung samt weiteren Merkmalen ist im folgenden an Hand beispielsweiser Ausführungsformen näher erläutert, die in der Zeichnung veranschaulicht sind. In dieser zeigen
Fig. 1
eine Vorrichtung nach dem Stand der Technik zur Beseitigung von Giftstoffen aus Blut,
Fig. 2
eine bekannte Vorrichtung zur Messung optischer Eigenschaften in dem Blutkreislauf der Vorrichtung nach Fig. 1,
Fig. 3
eine schematische Detailansicht einer ersten Ausführungsform der Erfindung, normal zur Flussrichtung gesehen,
Fig. 4
in einer schematischen Detailansicht in Flussrichtung gesehen eine Variante der Erfindung,
Fig. 5
in einer Darstellung wie Fig. 3 eine weitere Ausführungsform der Erfindung,
Fig. 6
die Ausführung nach Fig. 5 in Flussrichtung gesehen und
Fig. 7
in einem Diagramm gemessene Ausgangssignale des Detektors einer Vorrichtung nach der Erfindung.
Um die Empfindlichkeit bekannter Vorrichtungen und Systeme zur Detektion markierter Mikropartikel zu erhöhen, sieht die Erfindung vor, neben einer ersten Markierung - in den gezeigten Ausführungsformen eine Fluoreszenzmarkierung - eine weitere Markierung, nämlich eine magnetische Markierung, zu verwenden. Hier in Frage kommende Mikropartikel besitzen z. B. eine mikrosphärische Zellulosematrix mit einem Eisen(II, III)-oxid-Kern. Zur Fluoreszenzmarkierung kann der Farbstoff Kresylviolett (9-Diamino-benzophenoxazonium-Perchlorat) mit 1,4-Glycidyloxyproyltrimethoxylsilan auf der Partikeloberfläche festgelegt werden, wobei ein bevorzugter Durchmesser der solcherart markierten Partikel zwischen 5 und 15 µm liegt. Natürlich könnte die zu detektierende Markierung auch anderer Art, z. B. eine radioaktive, sein, doch hat sich die Fluoreszenzmarkierung in der Praxis als besonders geeignet, da günstig, unbedenklich und mit vertretbarem Aufwand detektierbar, herausgestellt.
Wie aus Fig. 3 hervorgeht, sieht die Erfindung weiters vor, die zu detektierenden Mikropartikel mit Hilfe eines Magnetfeldes einzufangen und anzusammeln, um sie an der Sammelstelle an Hand ihrer Fluoreszenzmarkierung zu detektieren. Bei der gezeigten Ausführungsform ist im Nahbereich eines Schlauchabschnittes der venösen Leitung 4 ein Permanentmagnet 19 angeordnet. In Flussrichtung stromab des Magneten 19 befindet sich die Spitze des Fluoreszenzdetektors 18, der in Fig. 2 gezeigt ist und von welchem die Linse 14 und der durch diese gebündelte Strahlengang 20 ersichtlich sind.
Wenn das Magnetfeld des Magneten 19 stark genug ist - der Magnet 19 bzw. die Magnete diese und der weiteren Ausführungsformen können natürlich auch als Elektromagnete ausgebildet sein - bleiben sämtliche magnetisch markierte Partikel im Bereich des Magneten 19 an der inneren Schlauchwandung haften. Diese Ablagerung 21 markierter Partikel wird von der Strömung zum Teil stromab des Magneten 19 mitgezogen. Bei der praktischen Realisierung achtet man darauf, dass sich ein signifikanter Bereich der Ablagerung 21 im Fokus des Strahlengangs 20 befindet.
Der Fluoreszenzdetektor 18 misst die Intensität der Fluoreszenzstrahlung, welche von den mit der Anregungswellenlänge bestrahlten Mikropartikeln ausgeht. Da sich die markierten Partikel an der Sammelstelle bzw. Magnetfalle ansammeln und nicht - wie nach dem Stand der Technik - im Vorbeiströmen gemessen werden müssen, kann praktisch die gesamte Menge der in den Blutkreislauf 3 eingetretenen markierten Partikel bestimmt werden. Messungen haben gezeigt, dass die Intensität des Fluoreszenzlichtes im wesentlichen proportional zur gesamten Menge der in den Primärkreislauf 3 übergegangenen Partikel ist.
Bei der Variante nach Fig. 4 sind zwei Magnete 19a, 19b radial ausgerichtet und um einen Winkel von z. B. 60 ° bis 120 °, vorzugsweise 90 ° gegeneinander versetzt bezüglich der (venösen) Leitung 4 angeordnet. Dabei läuft der Strahlengang 20 des Detektors 18 zweckmäßigerweise durch die Winkelsymmetrale der Magnete 19a, 19b. Da sich die markierten Partikel zwischen den beiden Magneten 19a, 19b ablagern, liegen die Ablagerungen in einem freien optischen Pfad für den Detektor 18 und die Partikel können direkt an der Sammelstelle mit dem Anregungslicht bestrahlt werden. Zweckmäßigerweise kann der Strahlengang 20 des Fluoreszenzdetektors 18 geringfügig stromab der Achsen der Magnete 19a, 19b durch die Wandung der Leitung 4 verlaufen, um das "Verschmieren" der Ablagerung 19 (siehe Fig. 2) auf Grund der Strömung zu berichtigen.
Eine dritte Variante bezüglich der Relativlage von Strahlengang des Detektors 19, Magnet 19 und Leitung 4 ist den Fig. 5 und 6 zu entnehmen. Hier liegt die Nord-Süd-Magnetachse eines Permanentmagneten 19 in einem Winkel von 60 ° bis 120 °, vorzugsweise normal bezüglich des Strahlengangs 20 des Detektors 18 und auch bezüglich der Achse der Leitung 4. Magnetisch markierte Mikropartikel sammeln sich an der dem Magneten 19 zugekehrten Innenseite der Leitung 4 an und werden von dem Detektorstrahl seitlich beleuchtet. Die seitliche Position des Detektorstrahls wird im Betrieb so justiert, dass sich ein maximales Ausgangssignal ergibt.
Die in Fig. 7 dargestellten Messergebnisse illustrieren deutlich die mit der Erfindung erzielbare Verbesserung der Empfindlichkeit und Anhebung des Signal-Rausch-Verhältnisses. Die Linie 22 zeigt das Ausgangssignal des Photodetektors 17 bei Abwesenheit fluoreszenzmarkierter Partikel, somit das Grundrauschen. Auf der Ordinate ist die Höhe des Ausgangssignals aufgetragen, auf der Abszisse das Partikelvolumen, genauer gesagt das Partikelvolumen, welches bereits an der Messstelle vorbeigeströmt ist.
Die Linie 23 betrifft eine Messung mit fluoreszenzmarkierten und auch ferromagnetisch markierten Partikeln in einer Anordnung wie z. B. nach Fig. 3 mit entferntem Magnet 19. Es ergibt sich ein zwar feststellbares, jedoch nur wenig über dem Grundrauschen liegendes Ausgangssignal, das unabhängig von dem insgesamt an der Messstelle vorbeigeströmten Partikelvolumen ist. Eine gleiche Linie ergibt sich, wenn die Partikel nur fluoreszenzmarkiert sind, gleich ob ein Magnet 19 vorhanden ist oder nicht.
Die Kurve 24 schließlich zeigt ein Messergebnis bei Anwendung der Erfindung, wobei deutlich die Steigerung des Signal/Rausch-Verhältnisses zu erkennen ist, die auf eine durchschnittliche Verdoppelung des Ausgangssignals zurückzuführen ist. An dem Messpunkt ist in Ordinatenrichtung je die Standardabweichung der Ausgangssignale für fünf Messungen eingezeichnet. Die markierten Partikel werden vom Magneten eingefangen und festgehalten. Die Anzahl der festgehaltenen Partikel steigt mit der Gesamtmenge der durch die Magnetfalle getretenen Partikel an und bewirkt eine Steigerung der Fluoreszenzintensität.

Claims (12)

  1. Verfahren zur Detektion von markierten Mikropartikeln in einem eine Leitung durchströmenden Medium,
    dadurch gekennzeichnet, dass
    Mikropartikel eingesetzt werden, welche einerseits magnetisch aktivierbare Markierungsanteile aufweisen und die andererseits zumindest eine weitere detektierbare Markierung besitzen, und die Mikropartikel mit Hilfe eines Magnetfeldes in dem strömenden Medium eingefangen und angesammelt und an der Sammelstelle als Ablagerung (21) an der Innenwandung der Leitung auf Basis ihrer weiteren Markierung kontinuierlich detektiert werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Markierung eine optische Fluoreszenzmarkierung ist und die Mikropartikel an der Sammelstelle optisch detektiert werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das strömende Medium ein extrakorporaler Blutfluss einer Blutreinigungsanlage ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium in einer Leitung (4) mit optisch durchlässiger Wandung strömt und das Magnetfeld mit Hilfe zumindest eines außerhalb der Leitung (4) gelegenen Magneten (19; 19a, 19b) erzeugt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Bereich des zumindest einen Magneten (19; 19, 19b) die Ablagerung (21) von eingefangenen und markierten Mikropartikeln an der Innenwand der Leitung (4) mit Hilfe des Strahlenganges (20) eines Fluoreszenzdetektors (18) detektiert wird.
  6. Vorrichtung zur Detektion von magnetisch und fluoreszenzmarkierten Mikropartikeln in einem strömenden Medium
    gekennzeichnet durch
    eine Leitung (4) mit einer optisch durchlässigen Wandung zur Führung des Mediumstromes,
    zumindest einen Magneten (19; 19a, 19b), der zur Erzeugung eines Magnetfeldes im Inneren der Leitung (4) an deren Außenseite angeordnet ist, wobei das Magnetfeld bei Vorhandensein der markierten Mikropartikel zu einer Ablagerung (21) der Partikel an der Innenwandung der Leitung führt, und
    einen Fluoreszenzdetektor (18), dessen Strahlengang (20) durch die Wandung der Leitung (4) in deren Innenraum zu dem Bereich einer möglichen Ablagerung (21) von Mikropartikeln verläuft.
  7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der zumindest eine Magnet (19;19a,19b) ein Permanentmagnet ist.
  8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Magnet (19) nahe der Leitung (4), unmittelbar stromauf des Eintrittes des Strahlenganges (20) in die Leitung angeordnet ist.
  9. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Magnet (19) nahe der Leitung (4) gelegen ist, wobei die Nord-Süd-Achse des Magneten (19) unter einem Winkel zu dem Strahlengang (20) des Fluoreszenzdetektors (18), jedoch im wesentlichen in einer gemeinsamen Normalebene zur Leitung (4) liegt.
  10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Winkel zwischen Nord-Süd-Richtung des Magneten (19) und Strahlengang (20) des Detektors (18) zwischen 60 ° und 120 ° liegt.
  11. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zwei Magnete (19a, 19b) in einer Normalebene zur Leitung (4) angeordnet sind, wobei die Nord-Süd-Achsen der Magneten (19a, 19b) unter 60 ° bis 120 °, vorzugsweise 90 °, gegeneinander geneigt sind und der Strahlengang (20) des Detektors (18) in Richtung der Leitung gesehen im wesentlichen durch die Winkelsymmetrale der Nord-Süd-Achsen verläuft.
  12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlengang (20) des Fluoreszenzdetektors (18) geringfügig stromab der Achsen der Magneten (19a, 19b) durch die Wandung der Leitung (4) verläuft.
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