JPH05264547A - 酵素免疫測定方法及び測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 酵素標識を用いた酵素免疫測定方法におい
て、検体に酵素標識及び磁気標識を行う第１工程と、酵
素標識及び磁気標識した検体を傾斜磁界中に入れて該検
体を局部濃縮する第２工程と、局部濃縮された検体と基
質を反応させ、吸光物質又は蛍光物質からなる反応生成
物を生成させる第３工程と、生成した反応生成物を吸光
分析または蛍光分析する第４工程とを有する酵素免疫測
定方法。 【効果】 局部濃縮された検体と基質を反応させるの
で、局部濃縮部分の反応生成物の濃度が高くなり、検体
の検出感度を高めることができ、高精度な測定が可能と
なる。また、検体の検出感度が高く微量の検体を検出で
きるので、検体の培養操作を不要或いは短縮することが
でき、測定に要する時間を短縮できる。さらに、必要な
サンプル量を少なくできる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中の検体（抗原又
は抗体）を測定する酵素免疫測定方法（ＥＩＡ）に係
り、ウイルスなど微量な検体を高精度で測定できるとと
もに採取サンプル量を低減するための技術に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】近年、ウイルス性肝炎、後天性免疫不全
症候群（ＡＩＤＳ）などのウイルス性疾患を早期に検査
するために、ウイルス等の検体を検出する測定方法が注
目されつつあり、検体を高精度で測定するための検査方
法が種々研究されている。免疫測定法としては従来よ
り、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等が知られている。

【０００３】これらの免疫測定法のうち、酵素免疫測定
法は、抗原又は抗体に酵素を標識し、容器内に注入した
酵素標識済みの検体に、標識した酵素と反応する基質を
反応させて吸光物質あるいは蛍光物質を生成させ、この
生成物質の吸光分析又は蛍光分析を行う方法である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
酵素免疫測定方法では、酵素を標識した微量の検体に基
質溶液を作用させて容器内で反応させ、容器内で攪拌さ
れて平均的濃度となった反応生成物を含む溶液を吸光分
析あるいは蛍光分析していたために、測定感度が低かっ
た。従って、この従来法によって検体を検出するために
は、標識されたウイルス等の検体量の濃度を大きくする
ことが必要であった。このために通常は、採取したサン
プルを培養し、検体の濃度を高めた後に測定を行ってお
り、サンプル採取から測定終了までに長時間を要してい
た。本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、酵素免
疫測定方法において、ウイルスなど微量な検体を高精度
で測定できるとともに採取サンプル量を低減するための
技術の提供を目的としている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するための手段として、酵素標識を用いた酵素免疫測
定方法において、検体に酵素標識及び磁気標識を行う第
１工程と、酵素標識及び磁気標識した検体を傾斜磁界中
に入れて該検体を局部濃縮する第２工程と、該第２工程
の後、局部濃縮された検体と基質を反応させ、吸光物質
又は蛍光物質からなる反応生成物を生成させる第３工程
と、該第３工程によって生成した反応生成物を吸光分析
または蛍光分析する第４工程とを有する酵素免疫測定方
法を提供する。

【０００６】また本発明は、上記酵素免疫測定方法を実
施するための測定装置として、先端に向けて漸次縮径す
る傾斜部が形成された磁極片を備え、該磁極片の下方に
位置する平面に対し、該磁極片直下の位置に近ずくに従
って強い磁力を与える傾斜磁界発生手段と、該磁極片の
下方に配設され、検体を収容するとともに該検体と基質
とを液相中で反応させるセルを備えた反応部と、該セル
に測定光を照射する光源部と、セルを通過した透過光あ
るいは反応生成物から生じた蛍光の強度を測定する光強
度測定部とを備えた吸光・蛍光測定手段とを備えたこと
を特徴とする酵素免疫測定装置を提供する。

【０００７】

【作用】本発明に係る酵素免疫測定方法は、酵素標識及
び磁気標識を行った検体を傾斜磁界中に入れて局部濃縮
し、局部濃縮された検体と基質を反応させるので、検体
が局部濃縮された部分では反応生成物の濃度が高い状態
となり、検体の検出感度が高くなる。

【０００８】

【実施例】図１は、本発明に係る酵素免疫測定方法を実
施するのに好適な酵素免疫測定装置の一実施例を示すも
のである。この測定装置は、先端に向けて漸次縮径する
傾斜部が形成された上部磁極片１と、その下方に配設さ
れた下部磁極片２と、これら各磁極片1,2の間に配設さ
れたフローセル３と、一端が上部磁極片１を貫通してそ
の先端に位置し、フローセル３に測定光を入射する入射
用光ファイバ４と、一端が下部磁極片２を貫通してその
先端に位置するように設けられた吸光分析用光ファイバ
５と、一端がフローセル３に近接するように設けられた
蛍光分析用光ファイバ６と、入射用光ファイバ４の他端
側に接続された第１の光源ユニット７と、同じく入射用
光ファイバ４の他端側に接続された第２の光源ユニット
８と、吸光分析用光ファイバ５の後端側に接続された吸
光分析ユニット９と、蛍光分析用光ファイバ６の後端側
に接続された蛍光分析ユニット１０を備えて構成されて
いる。

【０００９】上部磁極片１と下部磁極片２は、これらの
間に水平に配設されたフローセル３に対し、上部磁極片
１直下の位置に近ずくに従って強い磁力を与えるような
傾斜磁界を発生させるようになっている。図２は、傾斜
磁界発生装置の一例を示すものである。この傾斜磁界発
生装置１１は、電磁石１２と、その上部側に設けられ先
端部に上部磁極片２が取付けられた上部ヨーク１３と、
電磁石１２の下部に設けられ先端部の上面側に下部磁極
片３が取付けられた下部ヨーク１４を備えて構成されて
いる。

【００１０】上部磁極片１は、棒状を成し、その先端に
は円錐台状の傾斜磁界付与部１５が形成されている。こ
の上部磁極片１は、傾斜磁界付与部１５を下方に向けて
上部ヨーク１３に取付けられている。また、下部磁極片
２は、円柱状を成し、一方の面の中心が上部磁界付与部
１５の直下になるように下部ヨーク１４先端部の上面に
取付けられている。これらの磁極片１，２には、光ファ
イバを挿入するための貫通孔が設けられている。

【００１１】上記フローセル３は、透光性材料からなる
中空セル本体３ａの両端に試料液の導入路１６と排出路
１７を備えて構成されている。このフローセル３は、導
入路１６からセル本体３ａ内に試料を入れ、測定光を入
射して、その透過光強度あるいはセル内で発生した蛍光
強度を測定するとともに、セル本体３ａ内で検体の局部
濃縮及び検体の標識酵素と基質との反応を行わせるよう
になっている。

【００１２】このフローセル３には、検体の標識酵素と
基質との反応をその反応適温で行うために、フローセル
３を恒温に保つ機能を設けることが望ましい。この恒温
保持装置としては、フローセル３の周囲に恒温の流体を
流すものや、パイプを通して恒温の流体を循環供給する
恒温保持装置が用いられる。フローセル３内の試料液
は、シリンジやポンプを用いて一定量を供給、排出す
る。

【００１３】上記入射用光ファイバ４の後端側には、第
１の光源ユニット７と第２の光源ユニット８とが、光路
切替用ミラー１８を介して接続されている。第１の光源
ユニット７は、ハロゲンランプ１９と、干渉フィルタ２
０と、集光レンズ２１とを備えて構成されている。また
第２の光源ユニット８は、キセノン光源２２と、干渉フ
ィルタ２３と、集光レンズ２４とを備えて構成されてい
る。

【００１４】上記吸光分析用光ファイバ５の後端側に設
けられた吸光分析ユニット９は、受光素子２５と、干渉
フィルタ２６と、集光レンズ２７とを備えて構成されて
いる。また、上記蛍光分析用光ファイバ６の後端側に設
けられた蛍光分析ユニット１０は、光電子増倍管２８
と、干渉フィルタ２９と、集光レンズ３０とを備えて構
成されている。

【００１５】この酵素免疫測定装置は、フローセル３内
に酵素標識と磁気標識された検体を入れ、傾斜磁界発生
装置１１によってフローセル３に傾斜磁界を与えること
によって、フローセル内の検体を、上部磁極片１にある
傾斜磁界付与部１５中心の直下に局部濃縮する。そして
フローセル３内で検体の酵素と基質とを反応させて吸光
物質または蛍光物質からなる反応生成物を生成させた
後、第１の光源ユニット７と第２の光源ユニット８のい
ずれかの入射光を、入射用光ファイバ４を通してフロー
セル３に測定光を照射して、フローセル３を通過した透
過光を吸光分析用光ファイバ５を通して吸光分析ユニッ
ト９に送られ、又はフローセル３内で発生した蛍光を蛍
光分析用光ファイバ６を通して蛍光分析ユニット１０に
送られて、吸光分析または蛍光分析を行うようになって
いる。

【００１６】次に、上述した酵素免疫測定装置を用いた
酵素免疫測定方法の一例を説明する。この酵素免疫測定
法における検体は、患者血液や体液等に含まれるウイル
スなどの抗原、または抗体を用いることができるが、こ
こではウイルスなどの抗原を検体とした場合を例示す
る。図３は、酵素標識と磁気標識を行った検体３１を示
すものである。この検体３１は、検出すべき検体抗原３
２と、第１抗体３３と、マイクロビーズ３４と、酵素３
５と、磁性微粒子３６と、第２抗体３７とからなってい
る。この検体３１を作製するには、まず、ウイルス等の
検体抗原３２を、それに対する第１抗体３３を標識した
マイクロビーズ３４（固相）に抗原抗体反応によって結
合させ、さらに検体抗原３２に酵素３５を標識すると共
に、磁性微粒子３６を標識した第２抗体３７を結合させ
ることによって作製する。抗原３２に各抗体33,37およ
び酵素３５を結合させる順序は限定されず、また、これ
ら抗体33,37と酵素３５とを２種以上を同時に結合させ
ることも可能である。上記マイクロビーズ３４は、ポリ
スチレン、ナイロン、シリコン等からなる1〜数10μｍ
程度のものが用いられる。また磁性微粒子３６として
は、粒径0.1μｍ以下のマグネタイト微粒子等が用いら
れる。

【００１７】ここで用いられる酵素３５は、基質と反応
して吸光物質または蛍光物質を生成する酵素が用いられ
る。その酵素と基質の組み合わせを例示すると、 酵素がペルオキシダーゼ、基質がグアヤコールと過酸
化水素 酵素がβ−ガラクトシダーゼ、基質がニトロフェニル
−β−D−ガラクトシド 酵素がアルカリ性ホスファターゼ、基質がｐ−ニトロ
フェニルフォスフェート等である。

【００１８】以上のようにして酵素標識及び磁気標識し
た検体３１を、図１に示した測定装置のフローセル３に
入れ、フローセル３に傾斜磁界を付与し、この検体３１
を上部磁極片１の傾斜磁界付与部１５中心部に局部濃縮
させる。このときフローセル３の容量が小さい場合や、
検体３１の液量が多い場合には、検体３１の局部濃縮を
行いつつ、検体３１を含む試料液をシリンジなどで少量
づつ送り込むことによって、検体３１をフローセル３内
で局部濃縮することができる。また、この局部濃縮時
に、印加する磁場が強過ぎると、検体が点状に集中して
しまい、基質と反応する際の接触効率が悪くなるので、
磁場の強さ及び磁場の分布を調整して、入射用光ファイ
バ４から照射される測定光の光束の範囲内に検体３１が
平均的に集合されるような傾斜磁界を印加することが望
ましい。

【００１９】フローセル３内に検体３１を入れて局部濃
縮した後、フローセル３内に基質溶液を入れ、検体３１
の酵素３５と基質とをフローセル３内の液相中で反応さ
せ、吸光物質又は蛍光物質からなる反応生成物を生成さ
せる。この場合、反応生成物は、検体３１が局部濃縮さ
れた測定光の光束中において高い濃度となる。なお、酵
素３５と基質とを反応させる場合には、フローセル３を
恒温（反応適温）に保っておく。

【００２０】この反応を終了したならば、フローセル３
内の反応生成物を吸光分析または蛍光分析して検体３１
の検出を行う。この反応生成物が吸光物質である場合に
は、光路切替ミラー１８の切替により、ハロゲンランプ
１９を備えた第１の光源ユニット７からの測定光を、入
射用光ファイバ４を通して上部磁極片１先端からフロー
セル３に照射し、フローセル３を通過した光を下部磁極
片２先端から吸光分析用光ファイバ５を通して吸光分析
ユニット９に導いて、フローセル３内の吸光度を測定
し、吸光物質の濃度を定量する。光ファイバは、磁界中
においても光伝送特性が変化しないために、繰り返し磁
場を印加する測定系においても、透過光量の変動等の測
定誤差となる現象を生じることがなく、光源、受光素子
の位置も任意に設定することができる。

【００２１】また、反応生成物が蛍光物質である場合に
は、光路切替ミラー１８の切替により、強力なキセノン
光源２２を備えた第２の光源ユニット８からの測定光
を、入射用光ファイバ４を通して上部磁極片１の先端か
らフローセル３に照射し、フローセル３内で発生した蛍
光を、フローセル３の側方に先端を配置した蛍光分析用
光ファイバ６を通し、蛍光分析ユニット１０に導いて、
その蛍光強度を測定し、蛍光物質の濃度を定量する。こ
の蛍光分析の場合には、フローセル３内を透過する測定
光に対し、９０度程度の角度で蛍光分析用光ファイバ６
の先端を設置するのが好ましい。発生する蛍光は光量が
微少であるので、干渉フィルタ２９やモノクロメータで
測定波長を選択した後、光電子増倍管２８で計測を行
う。また、入射光路にチョッパーを挿入し、受光部でチ
ョッパーの駆動周波数に同期して測定を行い、ＳＮ比を
高めても良い。

【００２２】この酵素免疫測定法は、酵素標識及び磁気
標識を行った検体３１を傾斜磁界中に入れて局部濃縮
し、局部濃縮された検体３１と基質を反応させるので、
検体が局部濃縮された部分では、反応生成物の濃度が高
くなり、従来の酵素免疫測定法に比べて検体の検出感度
を高めることができ、高精度な測定が可能となる。ま
た、検体の検出感度が高く微量の検体を検出できるの
で、検体の培養操作を不要或いは短縮することができ、
測定に要する時間を短縮できる。さらに、必要なサンプ
ル量を少なくすることができる。

【００２３】なお、先の実施例は、本発明の１つの例示
にすぎず、実施例による酵素免疫測定装置及び酵素免疫
測定方法は様々な改変が可能であることは言うまでもな
い。例えば、図１に示した酵素免疫測定装置において、
入射用光ファイバ４と吸光分析用光ファイバ５を上部磁
極片１と下部磁極片２を貫通するように配設したが、こ
れらのファイバを磁極片から離して配設してもよい。ま
た、フローセル３への入射端にレンズを配して測定光を
コリメートし、受光端においてもレンズ等で透過光を集
光し、分析用光ファイバに入射してもよい。

【００２４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明では、酵素
標識及び磁気標識を行った検体を傾斜磁界中に入れて局
部濃縮し、局部濃縮された検体と基質を反応させるの
で、検体が局部濃縮された部分では反応生成物の濃度が
高くなり、従来の酵素免疫測定法に比べて検体の検出感
度を高めることができ、高精度な測定が可能となる。ま
た、検体の検出感度が高く微量の検体を検出できるの
で、検体の培養操作を不要或いは短縮することができ、
測定に要する時間を短縮できる。さらに、必要なサンプ
ル量を少なくできるなどの優れた効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明に係る酵素免疫測定装置の一実施例を
示す概略構成図である。

【図２】 図１の装置の傾斜磁界発生装置を示す斜視図
である。

【図３】 本発明に係る酵素免疫測定方法において用い
られる検体を例示する概略図である。

【符号の説明】

１…上部磁極片、２…下部磁極片、３…フローセル、４
…入射用光ファイバ、５…吸光分析用光ファイバ、６…
蛍光分析用光ファイバ、７,８…光源ユニット、９…吸
光分析ユニット、１０…蛍光分析ユニット、１１…傾斜
磁界発生装置、１５…傾斜磁界付与部、３１…検体、３
２…検体抗原、３３,３７…抗体、３４…マイクロビー
ズ、３５…酵素、３６…磁性微粒子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/536 Ｅ 8310−2Ｊ (72)発明者 真田 和夫 千葉県佐倉市六崎1440番地 藤倉電線株式 会社佐倉工場内 (72)発明者 藤原 幸一 東京都千代田区内幸町一丁目１番６号 日 本電信電話株式会社内 (72)発明者 有島 功一 東京都千代田区内幸町一丁目１番６号 日 本電信電話株式会社内 (72)発明者 星野 光利 東京都千代田区内幸町一丁目１番６号 日 本電信電話株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素標識を用いた酵素免疫測定方法にお
   いて、検体に酵素標識及び磁気標識を行う第１工程と、
   酵素標識及び磁気標識した検体を傾斜磁界中に入れて該
   検体を局部濃縮する第２工程と、該第２工程の後、局部
   濃縮された検体と基質を反応させ、吸光物質又は蛍光物
   質からなる反応生成物を生成させる第３工程と、該第３
   工程によって生成した反応生成物を吸光分析または蛍光
   分析する第４工程とを有する酵素免疫測定方法。
2. 【請求項２】 先端に向けて漸次縮径する傾斜部が形成
   された磁極片を備え、該磁極片の下方に位置する平面に
   対し、該磁極片直下の位置に近ずくに従って強い磁力を
   与える傾斜磁界発生手段と、 該磁極片の下方に配設され、検体を収容するとともに該
   検体と基質とを液相中で反応させるセルを備えた反応部
   と、 該セルに測定光を照射する光源部と、セルを通過した透
   過光あるいは反応生成物から生じた蛍光の強度を測定す
   る光強度測定部とを備えた吸光・蛍光測定手段とを備え
   たことを特徴とする酵素免疫測定装置。