EP1569962A2

EP1569962A2 - Regulatorische elemente im 5'-bereich des vr1-gens

Info

Publication number: EP1569962A2
Application number: EP03778334A
Authority: EP
Inventors: Eberhard Weihe; Annette Bieller; Martin K. -H. SCHÄFER
Original assignee: Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 2002-12-09
Filing date: 2003-12-01
Publication date: 2005-09-07
Also published as: AU2003285346A1; WO2004053120A2; WO2004053120A3; AU2003285346A8; DE10257421A1; US20060154886A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, umfassend einen die Expression des VR1-Rezeptors modulierenden Sequenzabschnitt, einen die Nukleinsäure enthaltenden Vektor, eine Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert ist, ein Verfahren zur Modulation der Expression des VR1-Rezeptors sowie die Verwendung der Nukleinsäure oder des Vektors zur Prävention bzw. Behandlung von Schmerzen und zur Behandlung von mit dem VR1-Rezeptor assoziierten Sensibilitätsstörungen.

Description

Unser Zeichen/Our Ref. Datan/Date

GR01P003 O 1. Dezember 2003

Anmelder:

Grünenthal GmbH Zieglerstraße 6 52078 Aachen

Regulatorische Elemente im 5'-Bereich des VR1-Gens

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, umfassend einen die Expression des VR1 -Rezeptors modulierenden Sequenzabschnitt, einen die Nukleinsäure enthaltenden Vektor, eine Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert ist, ein Verfahren zur Modulation der Expression des VR1 -Rezeptors sowie die Verwendung der Nukleinsäure oder des Vektors zur Prävention bzw. Behandlung von Schmerzen und zur Behandlung von mit dem VR1 -Rezeptor assoziierten Sensibilitätsstörungen.

Schmerz ist nach der Definition der IASP (International Association for the Study of Pain) ein unangenehmes heftiges Sinnes- und Gefühlserlebnis, das mit tatsächlichen oder möglichen Gewebeschäden verbunden ist oder in solchen Kategorien beschrieben wird.

Demgegenüber bezieht sich die Nozizeption auf den Erhalt von Signalen im ZNS, die von spezialisierten sensorischen Rezeptoren (Nozizeptoren) hervorgerufen werden und Informationen über Gewebeschäden vermitteln. Ein bedeutender Fortschritt zum Verständnis der molekularen Grundlage der Nozizeption bei Säugetieren war die Isolierung und Charakterisierung des Vanilloid-Rezeptors vom Subtyp 1 (VR1 ; auch Capsaicin-Rezeptor genannt), der in sensorischen Neuro- nen mit kleinem Durchmesser, insbesondere primären sensorischen Neuronen des Schmerzleitungsweges exprimiert wird (Caterina et al. (1997) Nature 389: 816 bis 824). Die aus sensorischen Neuronen von Ratten isolierte cDNA codiert für ein Polypeptid aus 838 Aminosäuren mit einem vorhergesagtem Molekulargewicht von 95 kDa und einem Hydrophobizitätsprofil, aus dem 6 Transmembran- domänen vorhergesagt werden. VR1 wird in vitro durch verschiedene schädliche Stimuli aktiviert, die Pflanzenderivate, wie die Vanilloide Capsaicin und Resinifera- toxin sowie bestimmte endogene Agenzien, z.B. Protonen, das Fettsäurederivat Anandamid und inflammatorische Produkte des Lipoxygenase-Stoffwechselwegs der Arachidonsäure, einschließen. Darüber hinaus kann VR1 auch durch noxi- sehe Stimuli (Temperaturen > 42°C) aktiviert werden. Des weiteren wurde gezeigt, daß sensorische Neuronen aus VR1 ^''^"-Mäusen eine stark verringerte Antwort auf diese noxischen Reize zeigen. Auf noxische mechanische Reize antworten die VRI^^'-Mäuse normal, zeigen aber kein Vanilloid-induziertes Schmerzverhalten, ihre Detektion noxischer Hitze ist beeinträchtigt, und sie zeigen nur eine geringe thermische Hypersensivität nach einer Entzündung (Caterina et al. (2000) Science 288: 306 bis 313). Diese Beobachtungen lassen den Schluß zu, daß dem VR1 -Rezeptor eine wichtige Rolle im Schmerzgeschehen, bspw. für die thermische Hyperalgesie nach Gewebeschädigung, zukommt.

Neben der cDNA für VR1 wurde kürzlich auch die genomische Organisation des für den Vanilloid-Rezeptor codierenden Gens, insbesondere die Exon/Intron- Struktur, aufgeklärt (Quing Xue et al. (2001) Genomics 76: 14 bis 20). Unter den GenBank-Einträgen AC087118 (in der Version vom 20. Juli 2001) bzw. AF168787 sind die Nukleotidsequenzen der Promotorenregionen des VR1 -Rezeptorgens der Maus bzw. des Menschen abgelegt.

Bisherige Analgetika greifen bspw. entweder auf der Ebene der modulierenden Systeme, insbesondere der neuronalen Reizweiterleitung, an oder blockieren spezifisch die Generierung von Entzündungsmediatoren. Opioide wirken als spe- zifische Liganden der Opioid-Rezeptoren (μ, K, δ oder ORL1). Diese werden jedoch nur bei starken Schmerzen (wie bei Schmerzen im Zuge einer Krebserkran- kung) verwendet und weisen das gravierende Problem der Toleranzentwicklung auf, was eine immer höhere Dosierung erforderlich macht. Für schwache bis moderate Schmerzen werden sog. NSAID (engl. "non-stereoidal anti-inflammatoric drugs"), wie Salizylate, verwendet. Diese hemmen die Zyklooxigenasen COX1 und COX2, bspw. Aspirin®, Paracetamol® und Ibuprofen®. Ihre schmerzlindernde Wirkung ist jedoch zur Bekämpfung stärkerer Schmerzen meist nicht ausreichend.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein alternatives System zur Einflußnahme auf die Nozizeption, insbesondere zur Schmerzbekämpfung, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure bereitgestellt, enthaltend einen Sequenzabschnitt, der mindestens einen die Expression des VR1- Rezeptors modulierenden Bereich der Sequenz gemäß Fig. 3 und/oder gemäß Fig. 4 und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399, Positionen 221931 bis 223344, und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116, Positionen 31673 bis 36359, und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 44731 bis 43231 (unter dieser GenBank-Zugriffsnummer ist einer reverse Sequenz abgelegt) und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 36616 bis 33151 (unter dieser GenBank-Zugriffsnummer ist eine reverse Sequenz abgelegt) autweist, oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes homologes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz.

Der Ausdruck "die Expression des VR1 -Rezeptors modulierender Bereich" bedeu- tet, daß der entsprechende Bereich der vorstehend genannten Nukleotidsequen- zen regulierend, d.h. entweder verstärkend oder hemmend, bei der Expression des Vanilloid-Rezeptors, insbesondere bei der Transkription, einzugreifen vermag.

Bspw. wirken Bereiche mit Enhancer-Funktion der obigen Sequenzen, insbeson- dere die Bereiche der Sequenzen gemäß Fig.3 bzw. Fig.4, verstärkend, während solche, die Repressorbindungsstellen autweisen, vermindernd auf die Expressionsrate, insbesondere die Transkriptionsrate des auf die in der Fig. 3 gezeigten δ'-regulatorischen Region folgenden VR1-Gens (in diesem Fall beginnend mit E- xaon 1ab), bzw. die Transkriptionsrate des auf die in der Fig. 4 gezeigten 5'- regulatorischen Region folgenden VR1-Gens (in diesem Fall entweder beginnend mit Exon 1c oder Exon 1d), insbesondere des Gens der Ratte wirken. Bspw. ist eine Repressorwirkung der nachstehenden Faktoren delta EF1 und GFI1 bekannt (Funahasi et al. (1993) Development 119(2): 433-446; Zweidler et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 08/1996: 4024-4034. Ebenfalls wirken Bereiche mit Enhancer-Funktion der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399, Positionen 221931 bis 223344, bzw. der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116, Positionen 31673 bis 36359, verstärkend auf die Expressionrate (z.B. Transkriptionsrate) des jeweiligen auf den in diesen Sequenzen enthaltenen 5'-regulatorischen Bereich folgenden VR1-Gens (beginnend mit Exon 1ab oder Exon 1c bzw. Exon 1d), während Bereiche mit Repressorfunktion auf die Expressionsrate des VR1-Gens, insbesondere des VR1-Gens der Maus, vermindern wirken. Dementsprechend wirken Bereiche mit Enhancer-Funktion der Sequenz gemäß GenBank- Zugriffsnummer AF168787, Positionen 44731 bis 43231, bzw. der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 36616 bis 33151, verstär- kend auf die Expressionrate (z.B. Transkriptionsrate) des jeweiligen auf den in diesen Sequenzen enthaltenen 5'-regulatorischen Bereich folgenden VR1-Gens (beginnendr mit Exon 1ab oder Exon 1c bzw. Exon 1d), während Bereiche mit Repressorfunktion auf die Expressionsrate des VR1-Gens, insbesondere des humanen VR1 -Gens, vermindern wirken.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfaßt der die Expression des VR1 -Rezeptors modulierende Bereich mindes- tens eine in der Sequenz der Figur 3 und/oder Figur 4 vorhandene Transkriptions- faktorbindungsstelle, insbesondere eine Kernsequenz (Bindungsmotiv) einer derartigen Bindungsstelle. Bevorzugte Bindungsstellen umfassen die Bindungsmotive für die Transkriptionsfaktoren MZF1 (myeloid zinc finger protein 1; vgl. z.B. Position 39, 173, 1169 gemäß Fig. 3), NFkappaB (nuclear factor-kappaB; vgl. z.B. Position 39 gemäß Fig. 3), GATA 1/2/3 (GATA-binding factor; vgl. z.B. Position 62, 376, 1076 gemäß Fig. 3), IK 2 (Ikaros factor 2; vgl. z.B. Position 174, 517, 1087, 1235 gemäß Fig. 3), NFAT (nuclear factor of activated T-cells; vgl. z.B. Position 176, 1089 gemäß Fig. 3 bzw. Position 4013, 4139 gemäß Fig.4), AP4 (acti- vator protein 4; vgl. z.B. Position 336 gemäß Fig. 3), SRY (sex-determining region Y gene product; vgl. z.B. Position 392 gemäß Fig. 3), SOX5 (Sox-5; vgl. z.B. Position 393 gemäß Fig. 3), CP2 (vgl. z.B. Position 498 gemäß Fig. 3), cMyb (vgl. z.B. Position 824 gemäß Fig. 3), SREBP1 (sterol regulatory element-binding protein; vgl. z.B. Position 982 gemäß Fig. 3), deltaEFI (delta-crystallin/E2-box factor 1 ; vgl. z.B. Position 984, 998, 1118, 1294 gemäß Fig. 3), MyoD (myoblast determi- ning factor; vgl. z.B. Position 983, 997 gemäß Fig. 3), GKLF (gut-enriched Krüp- pel-like factor; vgl. z.B. Position 1099 gemäß Fig. 3), NRF2 (nuclear respiratory factor 2; vgl. z.B. Position 1104 gemäß Fig. 3), NF1 (nuclear factor 1; vgl. z.B. Position 1122 gemäß Fig. 3), CETS1P54 (c-Ets (p54); vgl. z.B. Position 1254 ge- maß Fig. 3) und NFY (nuclear factor Y; vgl. z.B. Position 1346 gemäß Fig. 3).

Zusätzlich oder alternativ in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bevorzugt vorhandene Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind z.B. diejenigen für TH1E47 (Thing1/E47 heterodimer; vgl. z.B. Position 560, 1533 gemäß Fig. 4), RORA1 (RAR-related orphan receptor alphal; vgl. z.B. Position 699 gemäß Fig. 4), SRY (vgl. z.B. Position 744 gemäß Fig. 4), GFI1 (growth factor independence 1; vgl. z.B. Position 749 gemäß Fig. 4), AP1 (activator protein 1; vgl. z.B. Position 870, 998 gemäß Fig. 4), deltaEFI (vgl. z.B. Position 1030, 4372 gemäß Fig. 4), GATA 1 (vgl. z.B. Position 1129 gemäß Fig. 4), TCF11 (TCF11/KCR-F1/Nrf1 homodi- mers; vgl. z.B. Position 1381 gemäß Fig. 4), MZF1(vgl. z.B. Position 3375, 4255 gemäß Fig. 4) IK2/1 (vgl. z.B. Position 3376, 4137, 4149, 4159, 4505 gemäß Fig. 4), Brn2 (POU factor Brn2; vgl. z.B. Position 3484 gemäß Fig. 4), cMyb (vgl. z.B. Position 3557 gemäß Fig. 4), S8 (vgl. z.B. Position 3731 gemäß Fig. 4), MyoD (vgl. z.B. Position 3890 gemäß Fig.4), NKX25 (homeodomain factor Nkx-2.5/Csx; vgl. z.B. Position 4065 gemäß Fig.4), NF1 (vgl. z.B. Position 4104 gemäß Fig.4), AP4 (vgl. z.B. Position 4179, 4182, 4308, 4334, 4418 gemäß Fig. 4), HNF3B (he- patocyte nuclear factor-3beta; vgl. z.B. Position 4204 gemäß Fig. 4) und HFH2 (HNF3 forkhead homologue 2; vgl. z.B. Position 4204 gemäß Fig. 4). Selbstverständlich kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine oder mehrere derartige Bindungsstellen eines oder mehrerer Transkriptionsfaktoren, alleine oder in irgendeiner Kombination, enthalten.

Erfindungsgemäß bevorzugt wird die oben definierte Nukleinsäure als dop- pelsträngiges DNA-Molekül. Als ein solches DNA-Molekül, insbesondere wenn es relativ kurzes Oligodesoxyribonukleotid (ODN) vorliegt, stellt die Nukleinsäure ein sog. "Decoy-ODN" oder "Cis-Element Decoy" dar, das eine Sequenz enthält, die der natürlichen Kernbindungssequenz bspw. einer der vorstehend genannten Transkriptionsfaktoren entspricht oder ähnelt und an die der jeweilige Transkriptionsfaktor, insbesondere die vorgenannten Transkriptjonsfaktoren, in der Zelle, insbesondere im Zellkern, bindet. Das Cis-Element Decoy wirkt daher als Molekül zur kompetitiven Hemmung der Aktivität des jeweiligen Transkriptionsfaktors.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, die erfindungsgemäße Nukleinsäure als Inhibitor der Aktivität von an die δ'-regulatorischen Region des VR1-Gens gemäß den Sequenzen in Fig. 3, Fig.4, GenBank-Zugriffsnummer AL670399, Positionen 221931 bis 223344, GenBank-Zugriffsnummer AL663116, Positionen 31673 bis 36359, GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 44731 bis 43231, oder GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 36616 bis 33151 bindenden Transkriptionsfaktoren als Arzneimittel einzusetzen. Derartige Proteine, zu denen auch die vorgenannten Transkriptionsfaktoren zählen, können in ihrer Wirkung als Transkriptionsaktivatoren durch erfindungsgemäße Nuk- leinsäuren mit Wirkung als Cis-Element Decoy inhibiert werden. Bevorzugt zur spezifischen Inhibierung der Aktivität, insbesondere vorstehend genannter Transkriptionsfaktoren, ist daher die Verwendung von erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNA-Oligonukleotiden (auch Cis-Decoy oder Decoy- ODN genannt), die eine oder mehrere Bindungsstellen für die oder den jeweiligen Transkriptionsfaktor(en) enthalten. Die exogene Zufuhr einer großen Zahl von Transkriptionsfaktorbindungsstellen, insbesondere in viel höherer Zahl als im Genom vorhanden, erzeugt eine Situation, in der ein Großteil eines bestimmten intrazellulär vorliegenden Transkriptionsfaktors spezifisch an das jeweilige Cis- Element Decoy und nicht an seine endogenen Ziel-Bindungsstellen im Genom bindet. Dieser Ansatz zur Inhibition der Bindung von Transkriptionsfaktoren an ihre endogene Bindungsstelle wird auch als "Squelching" bezeichnet. Das Squelching der Transkription unter Verwendung von Cis-Element Decoy wurde bspw. erfolgreich eingesetzt, um das Wachstum von Zellen zu inhibieren. Dabei wurden DNA-Fragmente verwendet, die spezifische Transkriptionsfaktorbin- dungssteilen des Transkriptionsfaktors E2F enthielten (Morishita et al. (1995) Prac. Natl. Acad. Sei. USA 92: 5855).

Erfindungsgemäß ist bspw. die Sequenz einer Nukleinsäure geeignet, die an die Transkriptionsfaktoren C/EBP B, MZF, Nkx 2.5, NF-AT, GATA, MZF, Brn-2, IK2 oder AT4 bindet. C-EBTB bindet spezifisch an das Motiv mit der Kernsequenz GCAA, MZF bindet spezifisch an Motive mit der Kernsequenz GGG, Nkx 2.5 bindet spezifisch an Motive mit der Kernsequenz TAAT, NF-AT bindet spezifisch an Motive mit der Kernsequenz GAAA, GATA bindet spezifisch an Sequenzen mit dem Kemmotiv GATA, Brn-2 bindet spezifisch an Kernsequenzen mit dem Motiv AAAT, IK2 bindet spezifisch an das Motiv mit der Kernsequenz GGGA und AP4 bindet spezifisch an Motive mit der Kernsequenz GAGC. Weitere spezifische Beispiele für erfind ungsgemäß verwendbare Motive können den in den Tabellen 1 bis 6 (jeweils letzte (rechte) Spalte) im Anhang angegebenen Sequenzen entnommen werden, wobei die jeweilige Kernsequenz (Bindungsmotiv) in Großbuch- staben hervorgehoben ist. Daher kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure als Cis-Element Decoy als Oligomer ausgestaltet sein, das eine oder mehrere der vorstehenden Konsensus-Kernbindungssequenzen aufweist. Selbstverständlich kann das Cis-Element Decoy eine variable Größe aufweisen, die deutlich größer als die jeweilige Kernbindungssequenz ist und am δ'-Ende und/oder am 3'-Ende verlängert ist.

Da die Nukleinsäure als Cis-Element Decoy eine doppelsträngige Nukleinsäure ist, umfaßt ein derartiges erfindungsgemäßes DNA-Oligonukleotid jeweils nicht nur die Sense- oder Forward-Sequenz, sondern auch die komplementäre Anti- sense- oder Reverse-Sequenz. Die jeweiligen komplementären Sequenzen sind hier nicht wiedergegeben, ergeben sich jedoch für einen Fachmann leicht einseh- bar aus der spezifischen Basenpaarung (A-T, G-C) in DNA-Molekülen.

Das erfindungsgemäße Cis-Element Decoy kann aufgrund der spezifischen Basenpaarung in DNA nicht nur mehrere Bindungsstellen für einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren auf einem Strang aufweisen, sondern es kann/können je- weils eine oder mehrere Bindungsstellen im Sense- und Antisense-Strang vorliegen. Einem Fachmann ist daher ersichtlich, daß eine Vielzahl von Sequenzen als Inhibitoren bspw. für die vorstehend genannten Transkriptionsfaktoren verwendet werden können, solange sie die vorstehend dargelegten Bedingungen der Konsensus-Kernbindungssequenzen erfüllen und eine Affinität zum jeweiligen Transkriptionsfaktor aufweisen.

Die Affinität der Bindung einer erfindungsgemäßen doppelsträngigen Nukleinsäu- resequenz an einen Transkriptionsfaktor kann durch die Verwendung des E- lectrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Handbook, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour; Krzesc et al. (1999) FEBS Lett.453: 191) bestimmt werden. Dieser Test ist für die Qualitätskontrolle der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bei der Verwendung als Transkriptionsinhibitor des VR1-Gens bzw. für die Bestimmung der optimalen Länge einer Bindungsstelle besonders geeignet. Der EMSA ist e- benfalls zur Identifizierung anderer Sequenzen, an welche die vorstehend genannten Transkriptionsfaktoren oder andere Transkriptionsfaktoren, welche an die in der Figur 1 gezeigte Sequenz binden, geeignet. Das EMSA-Testsystem, wel- ches für die Isolierung neuer Bindungsstellen verwendet wird, wird bevorzugt mit gereinigten oder rekombinant exprimierten Versionen der jeweiligen Transkriptionsfaktoren durchgeführt, die in mehreren abwechselnden Runden von PCR- Vervielfältigung und Selektion beim EMSA eingesetzt werden (Thiesen und Bach (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3203).

Durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure als Cis-Element Decoy wird die Transkription des VR1-Gens derart moduliert, daß dieses Gen nicht oder vermindert exprimiert wird. Verminderte oder unterdrückte Expression bedeutet gemäß der vorliegenden Erfindung, daß die Transkriptionsrate verringert ist im Vergleich zu Zellen, die nicht mit einem erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNA- Oligonukleotid behandelt werden. Eine derartige Verminderung kann bspw. mittels Northern Blot (Sambrook et al., supra) oder RT-PCR (Sambrook et al., supra) bestimmt werden.

Es ist erfindungsgemäß ebenfalls möglich, die als Cis-Element Decoy ausgestaltete Nukleinsäure zur Erhöhung der Expressionsrate des VR1-Gens einzusetzen, indem im Cis-Element Decoy eine oder mehrere Bindungsstellen für ein die Transkriptionsrate des VR1-Gens Verminderendes Protein (Repressor) vorhanden sind. Als Beispiele für derartige Sequenzen können die bereits vorstehend genannten Faktoren delta EF1 und GFI1, von denen eine Repressorwirkung bekannt ist, angeführt werden.

Typischerweise wird die Transkriptionsrate des VR1-Gens bei mit erfindungsge- mäßen Decoys behandelten Zellen im Vergleich zu Zellen, die nicht mit einem erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNA-Oligonukleotid behandelt werden, mindestens 2-fach, insbesondere 5-fach, besonders bevorzugt mindestens 10- fach verringert oder erhöht.

Die als Cis-Element Decoy verwendete erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält in einer bevorzugten Ausführungsform ein oder mehrere, vorzugsweise 1 , 2, 3, 4 oder 5, insbesondere bevorzugt 1 oder 2 in der Sequenz der Figur 1 gezeigten Bindungsstellen, an welche ein Transkriptionsfaktor spezifisch bindet. Die jeweilige Nukleinsäure kann synthetisch, oder mit molekularbiologischem Verfahren in vitro oder intrazellulär hergestellt werden. Das jeweilige Verfahren ist einem Fachmann bekannt (vgl. bspw. Sambrook et al., supra).

Die Länge der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere des doppelsträngigen DNA-Oligonukleotids, ist vorzugsweise mindestens so lang wie eine verwendete Sequenz, die spezifisch an einen Transkriptionsfaktor bindet, der eine der in den vorstehend aufgeführten Sequenzen enthaltenen Kernbindungsse- quenzen aufweist. Üblicherweise umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure etwa 13 bis etwa 65 Bp, vorzugsweise etwa 18 bis etwa 23 Bp.

Oligonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- und Exonukleasen, insbesondere DNasen und RNasen, in der Zelle abgebaut. Daher kann eine erfin- dungsgemäße Decoy-Nukleinsäure modifiziert werden, um sie gegen enzymati- schen Abbau zu stabilisieren, so daß über einen längeren Zeitraum eine hohe Konzentration der doppelsträngigen Nukleinsäure in der Zelle gewährleistet ist und damit deren Wirkungsdauer verlängert wird. Typischerweise kann eine derartige Stabilisierung durch die Einführung einer oder mehrerer modifizierter Inter- nukleotidbindungen oder durch Einführung einer modifizierten Nukleobase erhalten werden.

Eine derartig modifizierte Nukleinsäure, insbesondere ein DNA-Oligonukleotid, enthält nicht notwendigerweise eine Modifikation an jeder Internukleotidbindung oder jeder Nukleobase. Vorzugsweise sind bspw. die Intemukleotidbindungen an den jeweiligen Enden beider Oligonukleotide eines Cis-Element Decoy modifiziert. Dabei können die letzten 6, 5, 4, 3, 2 oder die letzte oder eine andere oder mehrere lnternukleotidbindung(en) innerhalb der letzten 6 Intemukleotidbindungen modifiziert sein. Femer können verschiedene Modifikationen der Internukleotid- bindungen in die Nukleinsäure eingeführt werden und die daraus entstehenden doppelsträngigen DNA-Oligonukleotide auf die sequenzspezifische Bindung an die oder den gewünschten Transkriptionsfaktor(en) unter Verwendung des Stan- dard-EMSA-Testsystems getestet werden. Das EMSA-Testsystem erlaubt die Bestimmung der Bindungskonstante der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und so die Bestimmung, ob die Affinität durch die Modifikation verändert wurde. Das Cis- Element Decoy, die noch eine ausreichende Bindung zeigen, können ausgewählt werden, wobei eine ausreichende Bindung mindestens etwa 50% oder mindestens etwa 75%, besonders bevorzugt etwa 100% der Bindung der unmodifizierten Nukleinsäure bedeutet.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere Cis-Element Decoys, mit modifi- zierter oder modifizierten lntemukleotidbindung(en) oder modifizierten Nukleoba- sen, die immer noch eine ausreichende Bindung zeigen, können dahingehend überprüft werden, ob sie stabiler in der Zelle sind als die unmodifizierten Moleküle. Die mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure transfizierten Zellen werden dazu zu verschiedenen Zeitpunkten auf die Menge der dann noch vorhandenen Nukleinsäure untersucht. Dabei können die einem Fachmann bekannten Verfahren verwendet werden, z.B. Southern BIot-Techniken (Sambrook et al., supra) oder DNA-Chip-Array-Techniken (US-Patent 5,837,466). Eine erfolgreich modifizierte erfindungsgemäße Nukleinsäure, bspw. ein erfindungsgemäßes Cis- Element Decoy, hat eine Halbwertszeit in der Zelle, die höher ist als die des un- modifizierten Moleküls, vorzugsweise mindestens eine Halbwertszeit von etwa 48 Stunden, mehr bevorzugt von mindestens etwa 4 Tagen, besonders bevorzugt von mindestens etwa 7 Tagen.

Geeignete modifizierte Intemukleotidbindungen sind bspw. in Uhlmann und Pei- man ((1990) Chem. Rev. 90: 544 ) zusammengefaßt. Modifizierte Internukleotid- Phosphat-Reste und/oder nicht-Phosphor-Brücken in einer Nukleinsäure, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, enthalten z.B. Methylphosphonat, Phosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphoramidat, Phosphatester, während nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge bspw. Siloxan-Brücken, Carbonat- Brücken, Carboxymethylether-Brücken, Acetamidat-Brücken und/oder Thioether- Brücken enthalten. Als modifizierte Nukleobasen können bspw. 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin und Inosin genannt werden. Eine weitere Möglichkeit der Stabilisierung der erfiridungsgemäßen Nukleinsäure ist die Einführung struktureller Merkmale in die erfindungsgemäße Nukleinsäure, welche die Halbwertszeit der Nukleinsäure erhöhen. Derartige Strukturen, die z.B. Haarnadel- und Glocken-DNA enthalten, sind im US-Patent 5,683,985 offenbart. Gleichzeitig können modifizierte Intemukleotid-Phosphat-Reste und/oder nichtPhosphor-Brücken und/oder modifizierte Nukleobasen, zusammen mit den genannten Strukturen in die erfindungsgemäße Nukleinsäure eingeführt werden. Die sich daraus ergebenden Nukleinsäuren können im vorstehend beschriebenen Testsystem auf Bindung und Stabilität hin überprüft werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfaßt der vorstehend definierte regulatorische Sequenzabschnitt die in Fig. 3 gezeigte Sequenz, insbesondere die Nukleotide der in den Positionen 1 bis 1423 dieser Figur gezeigten Sequenz (d.h. bis zum Beginn des die cDNA codierenden Genabschnitts, der mit Exon 1a beginnt), oder ein die Expression des VR1- Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfaßt der vorstehend definierte regulatorische Sequenzabschnitt die in Fig. 4, gezeigte Sequenz, insbesondere die Nukleotide der in den Positionen 1 bis 4549 der in dieser Figur gezeigten Sequenz (d.h. bis zum Beginn des die cDNA codierenden Genabschnitts, der mit Exon 1d beginnt), oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfaßt der vorstehend definierte regulatorische Sequenzabschnitt die in Fig. 4, gezeigte Sequenz, insbesondere die Nukleotide der in den Positionen 1 bis 4190 der in dieser Figur gezeigten Sequenz (d.h. bis zum Beginn des die cDNA codierenden Genabschnitts, der mit Exon 1c beginnt), oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt der regulatorische Sequenzabschnitt der erfindungsgemäßen Nukleinsäure die Nukleotide der in den Positionen 4060 bis 4219 der in Fig.4 gezeigten Sequenz oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz. Der vorstehende Sequenzabschnitt, umfassend die Nukleotide der in den Positionen 4060 bis 4219 der in Fig. 4 gezeigten Sequenz, zeichnet sich durch eine hohe Konservierung zwischen verschiedenen Spezies, bspw. Ratte, Maus und Mensch aus (vgl. auch Fig. 2) und spielt daher eine herausragende Rolle bei der Regulation der Expression des VR1 -Rezeptors.

Ein weiterer Gegenstand der voriiegenden Erfindung betrifft eine für VR1 codierende Nukleinsäure, insbesondere eine (m)RNA oder (c)DNA, umfassend eine der in Fig. 1A, B und C gezeigten Sequenzen (wobei bei einer RNA für jedes in der Fig. 1A, B und C vorhandenes t (Thymidin) ein u (Uracil) steht), oder ein für VR1 codierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz. Bevorzugte Ausführungsformen dieser weiteren Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung enthalten die Nukleotide 1 bis 263 der Fig. 1A (Exon 1ab), 1 bis 191 der Fig. 1B (Exon 1c) oder 1 bis 138 der Fig. 1C (Exon 1d) oder ein für VR1 codierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz.

Erfindungsgemäße funktionshomologe Derivate, Allele oder Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäure als auch infunktionelle Derivate, Allele, Analoga bzw. Fragmente können durch Standardverfahren (Sambrook et al., supra) hergestellt werden. Hierbei werden bei den entsprechenden Sequenzen ein oder mehrere Nukleotide insertiert, deletiert oder substituiert. Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäure sind insbesondere solche Sequenzabschnitte, die eine Sequenz autweisen, welche eine oder mehrere der in der Fig. 3, der Fig. 4, der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399 (Positionen 221931 bis 223344), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116 (Positionen 31673 bis 36359), der Sequenz gemäß GenBank- Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 44731 bis 43231) oder der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 36616 bis 33151) gezeigten Transkriptionsfaktorbindungsstellen enthalten. Hierbei bevorzugte Transkripti- onsfaktorbindungsstellen sind in den Tabellen 1 bis 6 im Anhang angegeben.

Derivate erfindungsgemäßer Nukleinsäuren bzw. Fragmenten davon, sind bspw. vorstehend beschriebene Moleküle mit Internukleotidbindungs- bzw. Nukleoba- sen-Modifikationen.

Funktionshomologe Allel-Varianten im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Varianten, die mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70%, mehr bevorzugt mindestens 90% Homologie aufweisen. Allel-Varianten umfassen insbesondere solche funktioneilen oder infunktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der Sequenz gemäß Fig. 3, der Sequenz gemäß Fig. 4, der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399 (Positionen 221931 bis 223344), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116 (Positionen 31673 bis 36359), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 44731 bis 43231) oder der Sequenz gemäß GenBank- Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 36616 bis 33151) erhältlich sind, wobei jedoch die regulatorische Funktion bezüglich der Expression des VR1 -Rezeptors im wesentlichen erhalten bleibt.

Homologe oder sequenzverwandte Nukleotidsequenzen können aus Säugerspezies, einschließlich Mensch, nach gängigen Verfahren durch Homologie- Screening, durch Hybridisierung mit einer Probe der erfindungsgemäßen Nuklein- säuresequenz oder Teilen davon isoliert werden. Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe der Sequenz gemäß Fig. 3, der Sequenz gemäß Fig. 4, der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399 (Positionen 221931 bis 223344), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116 (Positionen 31673 bis 36359), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 44731 bis 43231) oder der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 36616 bis 33151), bspw. ihrer Homologen aus anderen Säugetieren, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA, zu verstehen. Derartige funktionelle Äquivalente lassen sich ausgehend von der Nukleotidsequenz gemäß Fig. 3, der Nukleotidsequenz gemäß Fig. 4, der Nukleotidsequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399 (Positionen 221931 bis 223344), der Nukleotidsequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116 (Positionen 31673 bis 36359), der Nukleotidsequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 44731 bis 43231) oder der Nukleotidsequenz gemäß GenBank- Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 36616 bis 33151), oder Teilen dieser Sequenzen, bspw. mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder per PCR-Technik aus anderen Vertebraten, insbesondere Mammalia, isolieren. Daher sind erfindungsgemäß alle mit den vorstehend genannten Sequenzen hybridisierende Sequenzen mit offenbart. Diese Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhafterweise kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche verwendet. Es können jedoch auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständige Sequenz zur Hybridisierung verwendet werden.

Je nach der verwendeten Nukleinsäuresequenz (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) bzw. je nachdem, welche Nukleinsäureart (DNA oder RNA) für die Hybridisierung verwendet wird, variieren diese Standardbedingungen. So liegen bspw. die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge. Unter Standardbedingungen sind bspw., je nach Nukleinsäure, Temperaturen zwischen 42°C und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid, wie bspw. 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid, zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis etwa 45°C. Für DNA: RNA Hybride liegen die Hybridisierungstemperaturen vorteilhafterweise bei 0,1 x SSC und Tem- peraturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis etwa 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G+C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind einem Fach- mann aus einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, bspw. Sambrook et al., supra, bekannt und lassen sich nach bekannten Formeln, bspw. abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G+C-Gehalt, berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann ein Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (Hrsg.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames und Higgins (Hrsg.), 1985, Nuclic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Weiterhin sind erfindungsgemäß unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die vorzugsweise am 3'-Ende verändert wurden. Als derartige Markierungen oder "Tags" sind in der Literatur bspw. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (Studir et al. (1990) Meth. Enzymol, 185: 60 bis 89, und Ausubel et al., supra).

Darüber hinaus kommen alle einem Fachmann geläufigen Methoden für die Herstellung, Modifikation und/oder Detektion erfindungsgemäßer Nukleinsäurese- quenzen, die in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden können, in Betracht (PCR (vgl. Innis et al,. PCR Protocols: A Guide to Methode and Applications) oder chemische Synthese). Durch entsprechende PCR-Primer können bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eingeführt werden, bspw. Restriktionsstellen. Hierdurch können erfindungsgemäße Sequenzen für den Transfer in Klonierungsvektoren entsprechend entworfen werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor oder ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt, das eine vorstehend definierte Nukleinsäure (Sequenz), typischerweise eine DNA-Sequenz enthält. Dabei kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure (Sequenz) mit mindestens einem weiteren genetischen Regulationselement, bspw. Transkriptionssignalen, funktional verknüpft werden. Mit solchermaßen hergestellten Vektoren können anschließend Wirtsor- ganismen bzw. Wirtszellen, z.B. Zellkulturen aus Säugetierzellen, transformiert werden. Ein erfindungsgemäßer Vektor, enthaltend die vorstehend definierte Nukleotidsequenz, kann bspw. die für den VR1 -Rezeptor codierende cDNA- Sequenz, vorzugsweise der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nachgeschaltet, enthalten. Selbstverständlich kann der für den VR1 -Rezeptor codierende Ab- schnitt auch für ein funktionshomologes Derivat, Allel oder Fragment des VR1- Rezeptors codieren, bzw. eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz enthalten.

Bevorzugte DNA-Sequenzen, die für ein funktionshomologes Protein des VR1- Rezeptors codieren, weisen mindestens 60% Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 80% und noch mehr bevorzugt mindestens 95% mit der cDNA- Sequenz auf, die sich aus den entsprechenden Angaben im GenBank-Eintrag AF 327067 (genomische Sequenz des VR1-Gens der Ratte) ergibt. Auch die sich aus diesen DNA-Sequenzen ergebenden funktionshomologen Teilsequenzen können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Vektors exprimiert werden. Darüber hinaus gehören zum Rahmen der vorliegenden Erfindung auch alle nativen Spleißvarianten der VR1-cDNA-Sequenz. Erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsformen der VR1-cDNA beginnen z.B. mit Exon 1ab, Exon 1a oder Exon 1d (vgl. auch Fig. 6).

Der erfindungsgemäße Vektor bzw. das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt kann auch für eine Allelvariante oder Isoform des VR1 -Rezeptors codieren. Unter Allelvarianten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Varianten ver- standen, die 60 - 100% Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70 - 100%, ganz besonders bevorzugt 90 - 100% aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen oder infunktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der für den VR1 -Rezeptor codie- renden cDNA-Sequenz (z.B. beginnend mit Exon 1ab, Exon 1c oder Exon 1d) erhältlich sind, wobei die wesentliche biologische Eigenschaft als Liganden- gesteuerter Kationenkanal erhalten bleibt.

Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßer Vektor bzw. ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz bzw. deren Derivate, Varianten, Homologe oder Fragmente, auch ein Protein mit der Funktion des VR1 -Rezeptors aber auch einer infunktionellen Variante, bspw. einer doppelt negativen Mutante (DN-Mutante) in therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Form verwendet werden. Zur Generierung derartiger rekombinanter VR1 -Proteine können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, welche die für das VR1-Konstrukt codierenden Sequenzen um bestimmte Nukleo- tidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide codieren, die bspw. einer einfacheren Aufreinigung dienen.

Des weiteren kann ein erfindungsgemäßer Vektor funktionell mit den vorstehend genannten Elementen verknüpfte weitere Regulationselemente, bspw. Translationsstart- bzw. Translationsstopsignale, umfassen. Diese Verknüpfung führt je nach gewünschter Anwendung zu einer nativen Expressionsrate oder auch zu einer Erhöhung bzw. Erniedrigung der nativen Genexpression.

Der erfindungsgemäße Vektor, bspw. ein Expressionsvektor zur Expression funk- tioneller oder unfunktioneller VR1 -Rezeptoren, kann weitere Regulationssequenzen umfassen, die bspw. in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-PR- oder eben I-PL-Promotor enthalten sind. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind bspw. in den Gram-positiven Promotoren wie amy und SP02, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Säugetierpromotoren wie CaM- Kinase II, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, ß-Globin, GFAP, GAP43, Ty- rosin-Hydroxylase, Kainat-Rezeptor-Untereinheit 1 , Glutamat-Rezeptor- Untereinheit B enthalten. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen mit der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäu- resequenz, bspw. die vorstehend genannten Regulationssequenzen, für einen erfindungsgemäßen (Expressions-)Vektor verwendet werden.

Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft kombiniert werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression bspw. von VR1-Rezeptor-Konstrukten ermöglichen. Dies kann bspw. je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatori- sehen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, in dem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine verstärkte Translation möglich, in dem bspw. die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Als Regulationssequenzen werden alle dem Fachmann geläufigen Elemente bezeichnet, die auf der Transkriptions- und/oder Translationsebene die Expression beeinflussen können. Insbesondere sind dabei neben Promotorsequenzen sog. "Enhancer"-Sequenzen hervorzuheben, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken können. Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die sog. "Locus Control Regions", "Silencer" oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für gewebsspezifische Expression verwendet werden. Auch sog. "Terminatorsequenzen" werden vorteilhafterweise in einem erfindungsgemäßen (Expressions-)Vektor vorhanden sein und erfindungsgemäß unter den Terminus "Regulationssequenz" subsummiert. Unter den Begriff "Vektor" fallen sowohl rekombinante Nukleinsäurekonstrukte bzw. Genkonstrukte, wie zuvor beschrieben, als auch komplette Vektorkonstrukte, die neben erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen und etwaigen weiteren Regulationssequenzen typischerweise auch weitere Elemente enthalten. Diese Vektor- konstrukte oder Vektoren können bspw. zur Expression des VR1 -Rezeptors in einem geeigneten Wirtsorganismus verwendet werden. Vorteilhafterweise wird mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, enthaltend einen vorstehend genannten Sequenzabschnitt, in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert. Geeignete Vektoren sind einem Fachmann wohl bekannt und können bspw. aus "Clo- ning Vectors" (Hrsg. Pouwls et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen einem Fachmann bekannte Vektoren wie bspw. Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Sindbisvirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu ver- stehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in das Genom von Säugetieren wird typischerweise lineare DNA verwendet.

Die Expression mit den erfindungsgemäßen, an regulatorische Nukleinsäurese- quenzen gekoppelten VR1 -Rezeptor-DNA-Sequenzen kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, welche die Genexpression weiter positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf Transkriptionsebene erfolgen, indem weitere Transkriptionssignale, wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem bspw. die Stabilität der mRNA verbessert oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird. Bei Erhöhung der Kopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen bei homologen Genen, bspw. in ein Nukleinsäure- fragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise eine den je- weiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche weiteren regulatorischen Sequenzen verwendet, welche die Genexpression verstärken. Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit den für inter- agierende oder für potentiell interagierende Proteine codierenden Sequenzen in einen einzelnen Vektor kloniert werden und anschließend in vitro in einer Wirtszel- le oder in vivo in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Alternativ kann auch jede der potentiell interagierenden Nukleinsäuresequenzen und die für ein VR1- Genkonstrukt codierende Sequenz in je einen einzelnen Vektor eingebracht und diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden, bspw. Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun eingebracht werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann mindestens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene und/oder Gene, die für ein fluoreszierendes Protein codieren, insbesondere GFP) in einen erfindungsgemäßen (Expres- sions-)Vektor, insbesondere ein komplettes Vektorkonstrukt, eingebaut werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Wirtszellen, ausgenommen humane Keimzellen und humane embryonale Stammzellen, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind. Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro- oder eukaryontischer Natur in Betracht, bspw. von Bakterien, Pilzen, Hefen, pflanzlichen oder tierischen Zellen. Bevorzugte Wirtszellen sind Bakterienzellen, wie Escherichia coli, Strep- tomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryontische Mikroorganismen, wie Aspergilius oder Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al. (1997) Nature 282: 39).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Transformation mittels erfindungsgemäßer Nukleinsäuren und/oder Vektoren Zellen aus multizellulären Organismen gewählt. Dies geschieht bspw. bei der Expression von VR1- Konstrukten vor dem Hintergrund einer ggf. erwünschten Glykosylierung (N- und/oder O-gekoppelt) des codierten VR1-Konstrukts. Diese Funktion kann in höheren Eukaryontenzellen - im Vergleich zu Prokaryontenzellen - in geeigneter Weise ausgeführt werden. Im Prinzip ist jede höhere eukaryontische Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, bspw. Affen, Ratten, Hamstern, Mäusen oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien bekannt. In einer keineswegs abschlie- ßenden Aufzählung werden die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryonen- nierenzellinie) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1997), BHK (Babyhamsternie- renzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Accad. Sei. USA 77: 4216, (1980)), HeLa (humane Karzinomzellen) und weitere - insbesondere für den Laboreinsatz etablierte - Zellinien, bspw. HEK293-, SF9- oder COS-Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane Zellen, insbesondere neuronale Stammzellen und Zellen des "Schmerz-Weges", vorzugsweise primäre sensorische Neuronen. Humane Zellen, insbesondere autologe Zellen eines Patienten, eignen sich nach (vor allem ex vivo) Transformation mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder erfindungsgemäßen Vektoren, ganz besonders als Arz- neimittel für bspw. gentherapeutische Zwecke, also nach Durchführung einer Zellentnahme, ggf. ex vivo Expansion, Transformation, Selektion und abschließender Retransplantation in den Patienten.

Die Kombination aus einer Wirtszelle und einem zu den Wirtszellen passenden erfindungsgemäßen Vektor, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie bspw. Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promotorsystem, die Phagen λ, Mu oder andere temperente Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen, bilden eine erfindungsgemäße Wirtszelle, die als Expressionszellsystem in Verbindung mit der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäu- resequenz dienen kann. Bevorzugte erfindungsgemäße Expressionssysteme auf der Basis erfindungsgemäßer Wirtszellen sind bspw. die Kombination aus Säugetierzellen, bspw. CHO-Zellen oder neuronale Zellen, und Vektoren, wie bspw. pcDNA 3neo-Vektor oder bspw. HEK293-Zellen und CMV-Vektoren, die für Säugetierzellen besonders geeignet sind. Somit eignen sich die erfindungsgemäßen Gegenstände als Arzneimittel einerseits zur Inhibition der Nozizeption, bspw. aufgrund der Verminderung der Transkription des VR1 -Rezeptors mittels erfindungsgemäßer Cis-Element-Decoy- Moleküle oder durch verstärkte Expression einer infunktionellen Variante des VR1 -Rezeptors mit Hilfe eines Vektors, umfassend die gesamte in Fig. 3 oder Fig. 4 gezeigte regulatorische Nukleinsauresequenz oder die gesamte regulatorische Nukleinsauresequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399 (Positionen 221931 bis 223344), gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116 (Positionen 31673 bis 36359), gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 44731 bis 43231) oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 36616 bis 33151), oder geeignete Abschnitte, Allele oder Derivate dieser Sequenzen. Andererseits können die erfindungsgemäßen Gegenstände dazu verwendet werden, eine mit dem VR1 -Rezeptor zusammenhängende Sensibilitätsstörung, die zur verminderten Sensibilität des jeweiligen Organismus, insbesonde- re zu einer Hyp- oder Analgesie, führt, mittels erfindungsgemäßer Gegenstände behandelt werden, indem bspw. eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Kombination mit der für den VR1 -Rezeptor codierenden cDNA in die Zellen des jeweiligen Organismus eingebracht wird, um so, bspw. bei abnorm verminderter oder fehlender Expression des endogenen VR1 -Rezeptors, für die Expression eines funktionsfähigen VR1 -Rezeptorkonstrukts zu sorgen.

Folglich umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorstehend genannten Gegenstände zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Schmerzen, insbesondere akuten oder chronischen Schmerzen, sowie auch die Verwendung zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Sensibilitätsstörungen, die mit dem VR1 -Rezeptor zusammenhängen, insbesondere zur Behandlung von Hyperalgesie, Hypalgesie oder Analgesie, Neuralgie, Myalgie.

Erfindungsgemäße Arzneimittel bzw. unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände hergestellte Arzneimittel enthalten neben den vorstehend definierten Gegenständen ggf. einen oder mehrere geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstof- fe. Erfindungsgemäße Arzneimittel können als flüssige Arzneiform in Form von Injektionslösung, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben dem mindestens einen erfindungsgemäßen Gegenstand je nach galenischer Form ggf. Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängen davon ab, ob das Arzneimittel oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, bukkal, rektal oder topisch, den Schleimhäuten, den Au- gen usw., appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflas- ter, ggf. unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen. Die einem Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Grad der Erkrankung. Üblicherweise werden 2 bis 500 mg/kg Körpergewicht wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe bspw. eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Protease- oder DNAse-lnhibitoren usw.

Geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, bspw. bei Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure als Cis-Element Decoy, sind als Beispiele Lipide, kationische Lipide, Polymere, Liposomen, Nukleinsäure-Aptamere, Peptide und Proteine, die an DNA gebunden sind (oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle zu nen- nen, um bspw. die Einbringung von Nukleinsäuren in die Zelle zu erhöhen, um das Arzneimittelgemisch auf nur eine Untergruppe von Zellen zu richten, um den Abbau der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in der Zelle zu verhindern, um die Lagerung des Arzneimittelgemischs vor der Verwendung zu erleichtem usw. Beispiele für Peptide und Proteine oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle sind z.B. Antikörper, Antikörperfragmente, Liganden, Adhäsionsmoleküle, die alle modifiziert oder unmodifiziert sein können. Hilfsstoffe, die bspw. die Cis-Element De- coys in der Zelle stabilisieren, sind z.B. Nukleinsäure-kondensierende Substanzen wie kationische Polymere, Poly-L-Lysin oder Polyethylenimin.

Bei einer lokalen Anwendung erfindungsgemäßer Gegenstände, bspw. von Cis- Element Decoys, erfolgt die Verabreichung durch Injektion, Katheter, Suppositori- um ("Zäpfchen"), Aerosole (Nasen- bzw. Mundspray, Inhalation), Trokars, Projektile, pluronische Gele, Polymere, die anhaltend Medikamente freisetzen, oder irgendeine andere Vorrichtung, die einen lokalen Zugang ermöglicht. Auch die ex vivo Anwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittelgemischs, das zur Behandlung der vorstehend genannten Indikationen verwendet wird, erlaubt einen lokalen Zugang.

Erfindungsgemäße Gegenstände können ggf. in einer Zusammensetzung als Arzneimittel- (Wirkstoff)gemisch mit bspw. mindestens einem weiteren Schmerzmittel kombiniert werden. Auf diese Weise können erfindungsgemäße Gegens- tände bspw. in Verbindung mit Opiaten und/oder synthetischen Opioiden (bspw. Morphin, Levomethadon, Codein, Tramadol, Bupremorphin) und/oder NSAID (bspw. Diclofenac, Ibuprofen, Paracetamol) kombiniert werden, bspw. in einer der vorgenannt offenbarten Verabreichungsformen oder auch im Zuge einer kombinierten Therapie in jeweils separierten Verabreichungsformen mit ggf. unter- schiedlicher Konfektionierung in einem an die Bedürfnisse des jeweiligen Patienten angepassten medizinisch sinnvoll gestalteten Therapieplan. Bevorzugt ist die Verwendung derartiger Zusammensetzungen als Arzneimittelgemische mit bspw. etablierten Analgetika zur Behandlung (bzw. zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung) von vorliegend offenbarten medizinischen Indikationen.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Modulation der Expression des VR1 -Rezeptors oder ggf. anderer Rezeptorgene oder Gene, umfassend das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des Vektors in eine das VR1-Gen enthaltende Zelle.

Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Behand- lung der vorstehend genannten Indikationen, umfassend das Verabreichen mindestens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes bzw. eines vorstehend beschriebenen Arzneimittels an einen Patienten, der einen derartigen Wirkstoff benötigt. Die bevorzugten Verabreichungswege, Mengen der Wirkstoffe bzw. des Arzneimittels usw., die im eriϊndungsgemäßen Behandlungsverfahren verwendet werden können, wurden bereits vorstehend dargelegt. „Patienten" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind neben Menschen auch Tiere, insbesondere Nager, z.B. Maus, Ratte, Meerschweinchen und Kaninchen, und Haus- bzw. Nutztiere, bspw. Huhn, Gans, Ente, Ziege, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Hund und Katze.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. beim Behandlungsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände eignet sich insbesondere die von der in Fig. 3 bzw. Fig. 4 gezeigten Sequenz abgeleitete Nukleinsäure bzw. der entsprechende Vektor bzw. die korrespondierende Wirtszelle zum Einsatz bei der Ratte. Dabei eignen sich die von der in Fig. 3 gezeigten Sequenz abgeleiteten Gegenstände besonders zur Regulation der Expression VR-1 Gens und damit zusammenhängenden Störungen in Niere, Gehirn und/oder Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzellen oder Zelllinien), während sich die von der in der Fig. 4 gezeigten Sequenz abgleiteten Gegenstände besonders zur Beeinflussung der VR1 -Genexpression in Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzellen oder Zelllinien) eignen.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. beim Behandlungsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände eignet sich insbesondere die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399, Positionen 221931 bis 223344, bzw. von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116, Positionen 31673 bis 36359, abgeleitete Nukleinsäure bzw. der entsprechende Vektor bzw. die korrespondierende Wirtszelle zum Einsatz bei der Maus. Dabei eignen sich die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399, Positionen 221931 bis 223344, abgeleiteten Gegenstände besonders zur Regulation der Expression VR-1 Gens und damit zusammenhängenden Störungen in Niere, Gehirn und/oder Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzel- len oder Zelllinien), während sich die von der Sequenz gemäß GenBank- Zugriffsnummer AL663116, Positionen 31673 bis 36359, abgleiteten Gegenstände besonders zur Beeinflussung der VR1 -Genexpression in Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzellen oder Zelllinien) eignen.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. beim Behandlungsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände eignet sich insbesondere die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 44731 bis 43231, bzw. der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 36616 bis 33151, abgeleitete Nukleinsäure bzw. der entsprechende Vektor bzw. die korrespondierende Wirtszelle zum Einsatz beim Menschen. Dabei eignen sich die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 44731 bis 43231, abgeleiteten Gegenstände besonders zur Regulation der Expression VR-1 Gens und damit zusammenhängenden Störungen in Niere, Gehirn und/oder Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzellen oder Zelllinien), während sich die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 36616 bis 33151, abgleiteten Gegenstände besonders zur Beeinflussung der VR1 -Genexpression in Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzellen oder Zelllinien) eignen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Nachweisverfahren für einen Transkriptionsfaktor, vorzugsweise mit hohem Durchsatz. Hierzu werden die an den erfindungsgemäßen 5'-regulatorischen Bereich bindenden regulatorischen Proteine, bspw. Transkriptionsfaktoren, durch die wechselseitigen Wechselwirkungen nachgewiesen. Dies kann bspw. durch die Methoden Western-Blot, Gel- Shift-Tests oder Tests mit Reportergenen erfolgen. Vorzugsweise kann ein solches Verfahren auch auf der Basis eines ELISA durchgeführt werden, auch im Sinne eines Hochdurchsatzverfahrens. Der herkömmliche ELISA wird dabei, wie folgt abgewandelt. Der einzufangende bspw. Transkriptionsfaktor wird nicht durch einen Antikörper eingefangen, sondern vielmehr durch eine doppelsträngige Oli- gonukleotidprobe, welche dem erfindungsgemäßen 5'-regulatorischen Bereich des VR1-Gens oder einem Abschnitt desselben von mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10 Nukleotiden Länge, entspricht. Vorzugsweise werden die doppelsträngigen Proben auf einem Untergrund, bspw. einer Mikrotiterplatte, gebunden. Eingefangene die Nukleotidprobe bindende Proteine (soweit diese als Regulatorproteine für den δ'-Bereich von VR1 bekannt sind) können bspw. durch entsprechende gegen die eingefangenen Proteine gerichtete Antikörper, bspw. ra- dioaktiv- oder Fluoreszenz-markiert oder durch Meerettich-Peroxidase konjugiert (nachgeschaltete Farbstoffreaktion), detektiert werden. Auf diese Weise können Überexpression und Unterexpression der Transkriptionsfaktoren in einer Probe, bspw. in Zellextrakten, nachgewiesen werden und entsprechende diagnostische Erkenntnisse, ggf. präventiv, gewonnen werden.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 zeigt Sequenzen von δ'-RACE-Fragmenten, die, ausgehend von mRNA aus Spinalganglien der Ratte, mit genspezifischen Primem erhalten wur- den, welche im Exon 2 der VR1-cDNA hybridisieren. Dargestellt sind 3 Arten von RACE-Fragmenten, die im 3'-Bereich 49 Nukleotide des Exons 2 enthalten (AF029310, grau unterlegt), aber sich in ihren δ'-Sequenzen unterscheiden. Die Sequenz des Primers rVR72 ist unterstrichen. Die Sequenz des RACE-Fragmentes 1ab (A) enthält im δ'-Bereich zwei Exons (1a und 1b). Das Exon 1a ist doppelt unterstrichen. Das dargestellte Exon 1 des RACE-Fragmentes 1c (B) wurde in unterschiedlichen Längen isoliert. Die Startpunkte der verschieden RACE-Fragmente 1c sind im Fettdruck sowie doppelt unterstrichen dargestellt. Das RACE-Fragment in der Fig. 1C enthält das 138 bp große Exon 1d. Die Sequenzen der Exons 1a, 1b, 1c und 1d sind in der genomischen Sequenz der Ratte mit der Zugriffsnummer AC126839 enthalten [Position 63696 - 63790 (Exon 1a), 71745 - 71912 (Exon 1b), Position 87717 - 87907 (Exon 1c) und Position 88077 - 88214 (Exon 1d)].

Fig. 2 zeigt eine Gegenüberstellung von Sequenzen des hoch konservierten DNA-Bereichs im δ'-Bereich des Exons 1c des VR1-Gens. Dargestellt sind die Sequenzabschnitte von Ratte [AC126839, Position 87687 - 87746], Maus [AL663116, Position 3δ87δ - 36034] und Mensch [AF 168787, Position 32680 - 32416]. Identische Nukleotide sind grau unterlegt.

Fig. 3 zeigt die genomische Sequenz im δ'-Bereich aufwärts des Exons 1a des VR1-Gens der Ratte. Die Sequenz wurde unter Verwendung des Genome- Walker Kits (Fa. Clontech) isoliert und ist in der genomischen Sequenz der Ratte mit der Datenbanknummer AC126839 [Position 62273 - 53722] enthalten. Die ersten Nukleotide des RACE-Fragmentes 1ab sind kursiv dar- gestellt. DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, die sowohl bei der Ratte als auch bei der Maus an der gleichen Sequenzposition lokalisiert sind, sind unterstrichen dargestellt.

Fig.4 zeigt die genomische VR1 -Sequenz der Ratte 5'-wärts des Exons 1d. Die dargestellte Sequenz ist in der Genomsequenz der Ratte mit der Zugriffsnummer AC 126839 (Position 83628 - 88214) enthalten. Die Exons 1c und 1d sind grau unterlegt. Die GenomeWalker-Fragmente sind an der Postion 1 bis 4361 lokalisiert. DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, die sowohl bei der Ratte als auch bei der Maus an der gleichen Sequenzposi- tion lokalisiert sind, sind unterstrichen dargestellt. Der zwischen Mensch,

Maus und Ratte hochkonservierte Sequenzabschnitt (Positionen 4060 bis 4219) ist kursiv und im Fettdruck dargestellt (vgl. auch Fig. 2).

Fig. δ zeigt photographische Aufnahmen von 1 ,δ %-Agarosegelen von RT-PCR- Proben, die der Amplifikation von Exon-1c/2- und Exon-1d/2-Fragmenten der VR1 -mRNA in verschiedenen Geweben der Ratte dienten. Aufgetrennt wurden 10 μl der PCR-Reaktionen, die mit den Primerpaaren 1C-14δF/1c- 417R (A) und VR1d-18F/1c-417R (B) oder mit GAPDH-Primern (C) und cDNA aus Gehirn (Spur 1), Herz (Spur 2), Leber (Spur 3), Darm (Spur 4), Milz (Spur δ), Niere (Spur 6), Spinalganglien (Spur 7) und Muskel (Spur 8) durchgeführt wurden. Die Reaktionen mit den GAPDH-Primern dienten als Positivkontrolle. Es wurde 1 μl der jeweiligen cDNA-Lösung in die PCR-

Reaktionen eingesetzt. Zur weiteren Kontrolle wurde aus allen verwendeten Gewebe-Isolationen RNA entnommen und in einer PCR mit den verschiedenen Primerpaaren getestet (Spur 9). Eine weitere Kontrolle wurde ohne cDNA- bzw. RNA-Lösung durchgeführt (Spur 10). Die erwartete Grö- ße der Produkte umfasst 292 bp (A), 364 bp (B) und 227 bp (C). In Fig. 6A ist in der Spur 1 ein weiteres Fragment mit einer Länge von etwa 600 bp zu erkennen. Das größere Fragment in Spur 7 der Fig. δB ist möglicherweise ein PCR-Artefakt.

Fig. 6 ist eine schematische Darstellung der δ'-Enden der verschiedenen humanen VR1-cDNAs. Im oberen Teil der Abbildung ist der genomische DNA- Abschnitt dargestellt auf dem die Exons 1a, 1b, 1c, 1d und 2 lokalisiert sind. Außerdem sind die δ'-Bereiche mit Exon 1 und 2 der verschiedenen cDNA-Formen skizziert. Die Zugriffsnummern der Sequenzen sind seitlich aufgeführt.

Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher, ohne sie einzuschränken.

Beispiel 1

Identifizierung der δ'-Enden der VR1 -mRNA der Ratte

Die δ'-Enden der VR1-mRNA der Ratte wurden mit Hilfe der δ'-RACE-(δ'-rapid amplification of the cDNA ends) Methode (RACE-PCR Kit, Fa. Clontech) aus Spi- nalganglien-mRNA isoliert. Als genspezifische Primer wurden die Oligonukleotide AGWδδ und rVR72 (5'-CCTCTGAGTCTAAGCTAGCCCGTTGTT-3', 5'-

TAGCCCGTTGTTCCATCCTTTCCAG-6') verwendet. Beide Primer hybridisieren im Exon 2 der VR1 cDNA-Sequenz der Ratte mit der GenBank-Zugriffsnummer AF029310 (Position 86 - 111 bzw. 72 - 96). Die Sequenz AF029310 ist auch mit der Bezeichnung VR1L1 unter der Zugriffsnummer AB040873 in GenBank abgelegt. Es wurden 3 verschiedene Typen von RACE-PCR-Fragmenten isoliert, die sich in ihrer δ'-Sequenz unterscheiden. Alle Fragmente enthalten im 3'-Bereich 49 Nukleotide des Exons 2 (s. Fig.1). Die δ'-Sequenzen der Fragmente wurden mit Hilfe der Computerprogamme FASTA und BLAST in der genomischen Sequenz der Ratte mit der GenBank-Zugriffsnummer AG126839 identifiziert, wobei die Sequenz in der Fig. 1 A auf zwei Abschnitte verteilt ist und somit aus zwei Exons besteht (96 bp und 168 bp). Aufgrund der Position in der Sequenz AC126839 werden die 5'-Sequenzen im Folgenden mit Exon 1a und 1 (Position 53696 - 53790 und 71745 - 71912; Fig. 1A), Exon 1c (Position 87717 - 87907; Fig. 1B) und E- xon 1d (Position 88077 - 88214; Fig. 1C) bezeichnet. Die Sequenz in Fig. 1B enthält die ersten 47 Nukleotide des Exons 1 der cDNA AF029310. Vom Exon 1c- Typ wurden Fragmente mit unterschiedlichen Startstellen isoliert. Die verschieden großen 1c-Exonsequenzen umfassen 191, 115, 103, 79, 76, 46, 38 bp.

Beispiel 2

Das humane VR1-Gen enthält 4 verschiedene Exon 1 -Varianten

In der Arbeit von Quing Xue et al. (2001, Genomics 76: 14 bis 20) wurde die Genstruktur des humanen VR1-Gens dargestellt und die Lokalisation der Exons 1a, 1b und 1c auf der genomischen DNA gezeigt.

Aufgrund der bioinformatischen Analysen von humanen VR1 -Sequenzen, die in

GenBank abgelegt sind, wurde beim Menschen ein weiteres Exon 1 identifizieren (Fig. 6). Der mit Exon 1d bezeichnete Abschnitt ist auf der genomischen DNA stromabwärts des Exons 1c lokalisiert. Der Sequenzvergleich der VR1-cDNAs hat gezeigt, dass die Transkripte sich nur in der Sequenz des Exons 1 unterscheiden.

Beispiel 3

Isolierung genomischer VR1 -Sequenzen der Ratte

Genomische DNA wurde mit Hilfe des GenomeWalker Kits der Fa. Clontech isoliert. Dieses Reaktionssystem enthält vier verschiedene Fraktionen von genomi- sehen DNA-Fragmenten. Jede Fraktion wurde mit einem anderen Restriktionsenzym (EcoR V, Dra I, Pvu II, Ssp I) verdaut und die entstandenen DNA-Fragmente mit einem DNA-Adaptor gekoppelt. Der DNA-Adaptor enthält die Sequenzen der Primer AP1 und AP2. Für die Isolierung der Sequenzen wurde die genomische DNA mittels Nested-PCR amplifiziert. Hierfür wurden die Primer AP1 und AP2 und zwei genspezifische Primer verwendet. Ein 1460 bp großes Fragment im 5'- aufwärtigen Bereich des Exons 1a wurde mit Hilfe der Primer VR1ab-35R (5- CGAGAGTGACGGGTCGCGAAGTCAT-3') und VR1ab-1R (δ'-

GACAGCACAΆCTCAGGCGGCTTGAA-3') angereichert und enthält die ersten 27 Nukleotide des RACE-Fragmentes 1ab (Fig. 3). Ausgehend von der veröffentlich- ten Ratten-cDNA (GenBank-Zugriffsnummer AF029310) wurden aus dem Bereich δ'-aufwärts des Exons 1c zwei überlappende Fragmente mittels zweier Nested- PCR amplifiziert. Die Sequenz umfasst insgesamt 4361 bp und enthält die ersten 172 Nukleotide des RACE-Fragmentes 1c (Fig. 4). Die erste PCR wurde mit den Primern AGW23 (δ'-CAGCTAGGTGCAGGCACACCCCAAA-3') und AGW4 (δ'- CCCA- AΆTGGAGCAAGTGCCTTGGAG-3') durchgeführt. Die Primer AGWZ021 (δ'-

TGTGAGCGCATGTGCCTATGCTTGCATT-3') und AGWZ001 (δ'-

CTTGCATTTGCCAGACCCAGAGCAGGAT-3') wurden bei der zweiten PCR verwendet. Die PCR-Fragmente wurden in den Vektor pGEM-T ligiert und sequenziert. Die Sequenzen der genomischen Fragmente sind in Fig. 3 und 4 dargestellt. Des Weiteren wurden die Sequenzen mit dem Computerprogramm BLAST in der genomischen Sequenz der Ratte mit der Datenbanknummer AC126839 identifiziert [Position 62273 - 63696 (Sequenz im δ'-Bereich aufwärts des Exons 1a) und Position 83628 - 87716 (Sequenz im δ'-Bereich aufwärts des Exons 1c); die Angaben beziehen sich auf Sequenzen, die keine Nukleotide der RACE-Fragmente enthalten].

Beispiel 4

Identifizierung von ortholoqen Sequenzen der Exons 1a. 1b. 1c und 1d und der genomischen DNA δ'-aufwärts der Exons 1a und 1d

Die in GenBank abgelegten VR1 -Sequenzen wurden mit Hilfe der Computerpro- gamme BLAST und FASTA hinsichtlich orthologer Sequenzen bei der Maus und beim Menschen durchsucht.

1. Exon 1a und 1b

Bei der Maus wurden die Exons in der Sequenz mit der Datenbanknummer AL663116 [Position 1308 - 1401 (Exon 1a, 92%) und Position 19666 - 19823 (Exon 1b, 94%)] identifiziert. Das Exon 1a ist auch in der Sequenz mit der Daten- banknummer AL670399 [Position 223346 - 223438 (92%)] enthalten. Diese Sequenz endet stromaufwärts vor dem Exon 1b, enthält aber einen größeren Bereich δ'-aufwärts des Exons 1a.

Die cDNAs oder ESTs der Maus, welche die VR1 -Exons 1a, 1b und weitere Se- quenzabschnitte des VR1 Gens enthalten, sind nicht in den einchlagigen Datenbanken abgelegt. Allerdings wurden die Exons in der cDNA des Gens Carbo- hydrate Kinase-Like (CARKL) mit der Datenbanknummer NM_029031 [Position 26 - 119 (Exon 1a; 92%) und Position 911 - 1078 (Exon 1b; 94%)] identifiziert.

Beim Menschen wurde lediglich die Sequenz des Exons 1b der Ratte identifiziert. Die humane genomische Sequenz AF168787 zeigt im Abschnitt von Position 50823 bis zur Position 50656 eine signifikante Übereinstimmung (86%) mit dem Exon 1b der Ratte. Zur humanen CARKL-cDNA zeigte das Exon 1b der Ratte, aber nicht das Exon 1a, eine Homologie [NM_013276, Position 960 - 1127, 86%]. Es wurden auch ESTs des Menschen identifiziert, die aber außer dem Exon 1b die Sequenz des CARKL Gens enthalten. Die humanen Exons 1a und 1b (XM_040678/AL136801, Position 1-242) sind ebenfalls in der CARKL-cDNA- Sequenz enthalten [NM_013276, Position 2689 - 2791 (Exon 1a) und Position 3δ3δ - 3673 (Exon 1b)]. In anderen Sequenzabschnitten wurde keine Übereinstimmung zwischen den cDNAs der Gene CARKL und VR1 identifiziert. Die Sequenzen der humanen Exons 1a und 1b zeigten keinerlei Homologien mit den Exons 1a und 1b der Ratte oder mit anderen Sequenzen der Ratte oder der Maus. In der genomischen Sequenz des Menschen mit der Datenbanknummer AF168787 sind die humanen Exons 1a [Position 44730 - 44628] und 1b [Position 43884 - 43746] enthalten.

2. Exon 1c

Das Exon 1c ist in der genomischen Sequenz der Maus mit der GenBank- Zugriffsnummer AL663116 [Position 36006 - 36191, 96%] enthalten. In GenBank sind drei 628bp bzw. 629bp große EST/cDNA-Sequenzen abgelegt, deren 5'- Bereich eine Übereinstimmung mit dem Exon 1c der Ratte zeigt [BB6δ6502, XM_147δ17, XM_112546; Position 1-74, 98%]. Mit der VR1-cDNA der Ratte zeigen diese ESTs eine deutliche Übereinstimmung [identische Nukleotide 564/601 (92%)]. Das humane Exon 1c zeigt keine deutliche Homologie zum Exon 1c der Ratte.

Exon 1d

Die Sequenz des Exons 1d der Ratte zeigte in den ersten 114 Nukleotiden eine signifikante Übereinstimmung zur genomischen Sequenz der Maus [AL663116, Postion 36360-36474; 86%]. Es sind weder cDNAs noch ESTs der Maus mit der

Sequenz des Exons 1d in GenBank abgelegt. Eine Homologie zu Sequenzen des Menschen wurde nicht identifiziert. Das humane Exon 1d zeigt keine Übereinstimmung zum Exon 1d der Ratte.

4. Sequenzen δ'-wärts des Exons 1a und des Exons 1c bzw. 1d

Das 1423 bp große genomische Fragment der Ratte aus dem δ'-Bereich des E- xons 1a ist in zwei Abschnitten, die lediglich durch 23 Nukleotide voneinander getrennt sind, homolog zur genomischen Sequenz der Maus [GenBank- Zugriffsnummer AL670399; Position 221931 - 222726 (80%) und 222764 - 223320 (86%)]. Der Bereich δ'-wärts des Exons 1d der Ratte zeigt eine deutliche Übereinstimmung zur Maus-Sequenz unter der GenBank-Zugriffsnummer AL663116 [Position 32368 - 33403 (81%), 35013 - 35101 (90%), 35211 - 35264 (94%) und Position 35290 - 36359 (87%)].

Entsprechende Abschnitte 5'-wärts der Exons 1a und 1c bzw. 1d des Menschen zeigten keine signifikante Übereinstimmung mit der Ratten-Sequenz. Die einzige Ausnahme ist ein 165 bp großer Bereich in der humanen Sequenz unter der GenBank-Zugriffsnummer AF168787 [Position 32580 - 32416, (84%)]. Dieser Sequenzabschnitt ist zwischen Mensch, Maus und Ratte hoch konserviert (Fig. 2).

Beispiel 5

Identifizierung von DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren im δ'-Bereich der Exons 1a und 1d des VR1-Gens

Die Regulation eines Gens auf Transkriptionsebene erfolgt über regulatorische Bereiche (z.B. Promotoren, Enhancer, Silencer), die modular aus kurzen regulatorischen Sequenzelementen aufgebaut sind. Diese dienen als Bindungsstellen für funktionelle Klassen von Proteinen, die Transkriptionsfaktoren genannt werden.

Zur Identifizierung von DNA-Motiven für Transkriptionsfaktoren wurden die genomischen Sequenzen im Bereich 5'-wärts der VR1 Exons 1a und 1d der Ratte [AC126839; Position 62273 - 63696 und 83628 - 88216], der Maus [AL670399; Position 221931 - 223344; AL663116, Position 31673 - 36369] und des Menschen [AF168787, 44731 - 43231 und 36616 - 33151] mit Hilfe des Compu- terprogrammes Matlnspector (sense-Strang, Gore Simil.: 1.000/ Matrix Simil.: 0.900, Tab. 1 bis 6 im Anhang) hinsichtlich möglicher DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren analysiert. In den Abbildungen der Genomsequenzen der Ratte im Bereich der Exons 1a und 1c/1d (Fig. 3 und 4) sind DNA-Motive für Transkriptionsfaktoren dargestellt, die auf dem sense-DNA-Strang und auch an der gleichen Postion in der Sequenz der Maus lokalisiert sind. Es handelt sich hierbei in der Sequenz δ'-wärts des Exons 1a (Fig. 3) um die Bindungsmotive für die Transkriptionsfaktoren MZF1 (myeloid zinc finger protein 1; Position 39, 173, 1169), NFkappaB (nuclear factor-kappaB; Position 39), GATA 1/2/3 (GATA- binding factor; Position 62, 376, 1076), IK 2 bzw. Klf 7 (Ikaros factor 2 bzw. Krüppel-like factor 7; Position 174, 517, 1087, 1235), NFAT (nuclear factor of activated T-cells; Position 176, 1089), AP4 (activator protein 4; Position 336), SRY (sex- determining region Y gene product; Position 392), SOX5 (Sox-5; Position 393), CP2 (Position 498), cMyb (Position 824), SREBP1 (sterol regulatory element- binding protein; Position 982), deltaEFI (delta-crystallin/E2-box factor 1; Position 984, 998, 1118, 1294), MyoD (myoblast determining factor, Position 983, 997), GKLF (gut-enriched Krüppel-like factoπ Position 1099), NRF2 (nuclear respiratory factor 2; Position 1104), NF1 (nuclear factor 1; Position 1122), CETS1P64 (c-Ets (pδ4); Position 1254) und NFY (nuclear factor Y; Position 1346). In der Sequenz δ'-wärts des Exons 1d (Fig. 4) wurden Bindungsstellen für folgende Transkriptionsfaktoren identifiziert: TH1E47 (Thing1/E47 heterodimer; Position 660, 1533), RORA1 (RAR-related orphan receptor alphal; Position 699), SRY (Position 744), GFI1 (growth factor independence 1; Position 749), AP1 (activator protein 1; Position 870, 998), deltaEFI (Position 1030, 4372), GATA 1 (Position 1129), TCF11 (TCF11/KCR-F1/Nrf1 homodimers; Position 1381), MZF1 Position 3375, 4256), IK2/1 bzw. Klf 7 (Position 3376, 4137, 4149, 4159, 4606), Brn2 (POU factor Brn2; Position 3484), cMyb (Position 3667), S8 (Position 3731), MyoD (Position 3890), NFAT (Position 4013, 4139), NKX2δ (homeodomain factor Nkx-2.5/Csx; Position 4065), NF1 (Position 4104), AP4 (Position 4179, 4182, 4308, 4334, 4418), HNF3B (hepatocyte nuclear factor-3beta; Position 4204) und HFH2 (HNF3 fork- head homologue 2; Position 4204). Da zwischen den Sequenzen des Menschen und der Ratte bzw. der Maus nur in einem 165 bp großen Abschnitt im Bereich des Exons 1c eine signifikante Übereinstimmung vorhanden ist, wurden die Se- quenzpositionen von DNA-Bindungsstellen in der humanen VR1 -Sequenz in den Abbildungen 3 und 4 nicht berücksichtigt. Allerdings wurden fast alle DNA-Motive, die sich bei der Ratte und der Maus an der gleichen Sequenzposition befinden, in den entsprechenden Abbschnitten δ'-wärts der humanen Exons 1a bzw. 1c 1d identifiziert. Ausnahmen stellen die Bindungsstellen der Faktoren cMyb, GATA 1/3/2, GKLF, NFY, NRF2, SOXδ, SREBP1 und SRY dar, die nicht in dem 1,5 kb großen Bereich (sense-Strang) δ'-wärts des humanen Exons 1a identifiziert wurden.

Neben der aktivierenden Funktion der aufgezählten Transkriptionsfaktoren ist ins- besondere die Repressorwirkung der Faktoren delta EF1 und GFI1 bekannt (Fu- nahasi et al. (1993) Development 119 (2): 433-446; Zweidieret al. (1996) Molecular and Cellular Biology, Aug.: 4024-4034).

Beispiel 6

Expression von Transkript-Varianten des VR1-Gens

Es wurden RT-PCR-Experimente mit o/wartf-Primern durchgeführt, die spezifisch im Exon 1c (1C-145F; δ'-CAGCTCCAAGGCACTTGCTC-3') und Exon 1d (VR1d-18F; δ'-GAGAGGTGGTGGTCAGTTGGCTTATGT-3') hybridisieren. Als reverse-Primer wurde der für Exon 2 spezifische Primer 1c-417R (δ'-GCCAGCCCGCCTTCCTCATA-3') verwendet. Zur Kontrolle wurden RT-PCRs mit GAPDH-Primern (5'-

CGACCCCTTCATTGACCTCAACTACATG-3' und 6'-

CCCCGGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3') durchgeführt. Gesamt-RNA wurde aus Gehirn, Herz, Leber, Darm, Milz, Niere, Spinalganglien und Muskel der Ratte isoliert, mit DNase I behandelt und in cDNA umgeschrieben. Es wurden 2,5 μg Ge- samt-RNA für die reverse Transkription verwendet. Der Reaktionsansatz wurde auf ein Endvolumen von 60 μl aufgefüllt. Es wurde 1 μl der jeweiligen cDNA- Lösung für einen 60 μl PCR-Reaktionsansatz eingesetzt. Die Größe der PCR- Produkte wurde wie folgt erwartet: 292 bp (1C-14δF/1c-417R), 364 bp (VR1d- 18F/1C-417R), 227 bp (GAPDH-Primer).

Die RT-PCR Experimente zeigen, dass die VR1 -Variante, die das Exon 1c entält, in den Spinalganglien und im Muskel synthetisiert wird (Fig. 6A). Im Gegensatz dazu wurde die mRNA mit dem Exon 1d nur in Spinalganglien nachgewiesen (Fig. δB). Ausgehend vom Exon 1c wurde mit Gehim-cDNA ein PCR-Frgagment erzeugt, dass ca. die dopelte Länge der erwarteten Größe aufwies und wahrscheinlich von einer weiteren Variante der VR1-mRNA abstammt.

Diese Ergebnisse weisen auf eine gewebe- und somit zellspezifische Expression von VR1 -Transkripten hin, die sich hinsichtlich des Exon 1 unterscheiden. Demzufolge wird das VR1-Gen in den verschiedenen Gewebe-Typen bzw. Zellen spezifisch von unterschiedlichen Promotoren aus aktiviert.

Zusammenfassung

Die vorliegende Erfindung zeigt, dass sowohl beim Menschen als auch bei der Ratte vier Exon 1 -Varianten existieren. Aufgrund der Lokalisation auf der genomischen DNA werden die Exons mit 1a, 1b, 1c und 1d bezeichnet. Bei der Ratte wurden drei verschiedene Transkripttypen identifiziert. Die erste Variante enthält die Exons 1a und 1 b, die zweite das Exon 1c und die dritte das Exon 1d. Die Analyse der humanen VR1-cDNAs zeigt, dass diese Transkriptformen auch beim Menschen existieren. Aufgrund der signifikanten Übereinstimmung der Sequenzen zwischen Ratte und Maus ist die Existenz dieser VR1 -Genstruktur auch bei der Maus wahrscheinlich.

Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Transkriptvarianten des VR1-Gens in verschiedenen Gewebearten unterschiedlich exprimiert werden. Demzufolge wird das VR1-Gen in den verschiedenen Gewebe- bzw Zelltypen von unterschiedlichen Promotoren aus aktiviert.

Durch die bioinformatischen Analysen der entsprechenden Sequenzen bei der Ratte, der Maus und beim Menschen wurden in den δ'-Bereichen der Exons 1a, 1c und 1d Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren identifiziert, die als Aktivatoren bzw. Repressoren fungieren.

Im Muskelgewebe wurde die VR1 -Variante, die das Exon 1c enthält, nachgewie- sen, während das VR1 -Transkript mit dem Exon 1d im Muskel nicht detektiert wurde. Das unterschiedliche Expressionsprofil der VR1 -Varianten und die Identifizierung von DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren lässt die Schlussfolgerung zu, dass in den δ'-Bereichen stromaufwärts der Exons 1a, 1c und 1d unterschiedliche Kombinationen von Transkriptionsfaktoren binden und dadurch ei- ne gewebe- und bzw. zellspezifische Expression der verschiedenen VR1- Varianten bewirken.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die verschiedenen δ'-Bereiche der Exons 1a, 1c und 1d und die darin enthaltenen Bindungsstellen fürTranskriptions- faktoren eine wichtige Rolle bei der gewebe- bzw. zellspezifischen Regulation der Expression des VR1 -Gens spielen. Darüber hinaus ermöglicht diese Form der Genstruktur in Kombination mit den DNA-Motiven für verschiedene Transkriptionsfaktoren eine Induzierbarkeit des VR1-Gens im ausdifferenzierten Organismus. Anhang: Tabellen 1 bis 6

(Wo absteigende Sequenzbereiche angegeben sind, handelt es sich bei den unter den entsprechenden GenBank-Zugriffsnummern ablegten Sequenzen um reverse Sequenzen.)

Tab. 1: Transkriptionsfaktorbindungsstellen im δ'-Bereich aufwärts des VR1- Exons 1a der Ratte.

Die Sequenz der Ratte (GenomeWalker Klon GW-3; AC126839, Position 52273 - 6369δ) wurde mit Hilfe des Computerprogramms Matlnspector (sense-Strang, Core Simil.: 1.000, Matrix Simil.: 0.900) hinsichtlich möglicher DNA- Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren analysiert. Die Transkriptionsfaktoren, die an der gleichen Position wie bei der Maus-Sequenz identifiziert wurden, sind in der Tabelle grau unterlegt.

Matrxx 1 Position str) Core Matrix Sequence

Name I of Matrix Simil. Simil.

(+) 1.000 0.910 gccaACAAtcca

(+) 1.000 0.983 ccaaCAATcc t+> 1.000 1,000 agtGGGGa

(+> 1.000 -0.SÖ4 GGGGagaccc

(+) 1.000 0.918 tcaaGGGAtaac

<*)^" , i.oop 0.S45 aggGATAaca

(+) 1.000 0.949 aggGATAaca

(+) 1.000 0.944 aggGATAaca

(+) 1.000 0.905 ggGATAaca

(+) 1.000 0.936 tggaaTATTtattaa

{^•*} 1,000 0.925 aatgGGGAaaca

⁽*) 1.000 Q.919 aatGGGGa

<*> 1 1.0OO„ 0.9-13 atgggGAAAcag

(+) 1.000 0.939 cccacagaATTAaagt

(+) 1.000 0.927 acagAATTaaagtta

(+) 1.000 0.914 aataggttCTGGatgt

(+) 1.000 0.964 acgccataATTAaaaa

(+) 1.000 0.951 caTAATta

•C+) 1,000 ,m1 acCÄGCtgta

(+) 1.000 0.946 attGATAaga

(+) 1.000 0.977 attGATAaga

(+) 1.000 0.933 attGATAaga

(+) 1.000 0.928 ttGATAaga

(+) 1.000 0.959 tgataaGATAa

(+) 1.000 0.945 tgataAGATaa

(+) 1.000 0.986 tgatAAGAtaa

(+) 1.000 0.963 ataaGATAaaaga

(+) 1.000 0.955 taaGATAaaa

(+) 1.000 0.956 taaGATAaaa

(+) 1.000 0.916 aaGATAaaa

(+5 1.000 0.980 aaaGATAaaa

<+} 1.000 0.970 aaaGATAaaa

{*) 1.000 0.972 aaaGATAaaa

(+) 1.000 0.916 aaGATAaaa

(+) 1.000 0.952 aaaaACAAtgat

(+> 1.000 0.986 aaaaCAATga (+) 1.000 0.930 caatgatGCAAtca aatgatgcAATCaatgttatttat gcataGATAgtcat taGATAgtc

GTCAttcctcaac gcaagacCCAG ttctGGGAgaat aaCÄGCtcct tcaCCAAtact acctGGGAatgtg acctGGGAatgt gctcatgtctGTTGgggt cattaGATAccgct taGATAccg gcTGACtttgt agcggggccaGTTGtcac tgTCACctgac tgtcACCTgac gtCACCtgac aaccACCTgac acCACCtgac ttttcaagAATCatcggcagctaa cacttGATAgggtt ttGATAggg ttgtGGGAaaggt ttgtGGGAaagg tgtggGAAAggt gaaaggtggaAGGG ggcGGAAgag cttTGGCaccttggcaag tggcACCTtgg cctTGGCaaggacagggg tgaGGGGa gtaGGGGa ccctGGGAcgcc ccCGGAactt ctccACCTatc ctcgaCCAAtaggagc gatTGGCagggacgcccc ggcaGGGAcgcc

Tab. 2: Transkriptionsfaktorbindungsstellen im δ'-Bereich aufwärts des VR1- Exons 1a der Maus.

Die Sequenz der Maus (AL670399, Position 221931 - 223344) wurde mit Hilfe des Computerprogramms Matlnspector (sense-Strang, Core Simil.: 1.000, Matrix Simil.: 0.900) hinsichtlich möglicher DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren analysiert. Die Transkriptionsfaktoren, die an der gleichen Position wie bei der Sequenz der Ratte identifiziert wurden, sind in der Tabelle grau unterlegt.

Matrix 1 Position str) | Core | Matrix Sequence

Name 1 of Matrix I Simil. | Simil.

V$NKX25 02 1 11 (+) 1 1.000 | 0.939 ccTAATtg

V$NF1 Q6 1 14 (+) 1 1.000 | 0.968 aatTGGCcataatccatg

SfξφföFl 01 ^" ' ^{"' * '} 1 34 {+. 1 iToo y 1,000 agtGGGGa Jf$KFKÄPPABSÖ 01. f 37 w f 1.000 I 0.904 GGGGagaccc

V-S-SäljU. 02 ! 55 m ι 1,000 | 0.92- . caaggGATAgtaca

V$TH1E47 01 1 132 (+) 1 1.000 | 0.916 gtatgattCTGGaata

V$NKX25 02 1 165 (+) 1 1.000 | 0.903 ctTAATgg

V$ΪK2 01 1 168 M 1 1 ÖÖ0 I 0,92$ aatgGGGAaaca

^•'ξMSEl 01 i fl.68 <*) 1 1.000 | 0,979 aatGGGGa

%r$mm Q ii 169 m * 1.000 ! 0.923 atgggGAAAcag

V$TCF11 01 1 309 (+) 1 1.000 | 0.980 GTCAtaataaaaa

!9$AE>4 Q5 ^? l ~t '334 {*} 1 ^* i.ooo { 0.9"4 acCAGCtgta

V$BARBIE 01 1 343 (+) 1 1.000 | 0.926 attaAAAGtttgagg

•9$GaTAl 05 f "" J " X 366 ,+) 1 ^"Cooo j 0.867 taaGATAaca i?$GATA2 02 1 ^J 366 <+} 1 1,000 j 0.96f taaGATAaca

P5SATA3 02 ! 366 {+} | 1.000 t 0.S57 taaGATAaca

V$LM02C0M 02 ] 367 (+) 1 1.000 | 0.938 aaGATAaca

V$SRY 02 .... _l 1 369 (+) 1 1.000 | 0.944 gataACAAaaag

Ws&x 02 - ~ 384 <+} I α.ooo [ 0.947 ^! agaaACAAtgag j?$sόxs i . 385, <+} 1 1.000 i O.S85 gaaaCAATga

V$HFH2 01 1 450 (+) 1 1.000 | 0.936 gatTGTTatttt

V$CJ^>2 Öϊ ^{' '} ^' I ^~" ^"Hέ C+) I χ: y 0,93/5 gcaagatCCAG

V$IK2 01, j 5üj5 (+) | 1.000 j. _ 0,525 ctctGGGAgaat

V$AP4 Q5 1 632 (+) 1 1.000 | 0.947 acCAGCtgtc ψ$ mB oi ^• I x 777 {+} 1 1.000 I 0.945 gctaatgtctGTTGgggt

V$PADS C 1 796 (+) 1 1.000 | 0.932 gGTGGTgtc

V$TCF11 01 1 802 (+) 1 1.000 | 0.968 GTCAtaccagaaa

V$DELTAEFI 01 1 843 (+) 1 1.000 | 0.994 tctcACCTgac

V$MYOD Q6 1 844 (+) 1 1.000 | 0.970 ctCACCtgac

V$AP1FJ Q2 1 848 (+) 1 1.000 | 0.906 ccTGACagctt

V$SOX5 01 1 889 (+) 1 1.000 | 0.978 gcaaCAATct

V$AP4 Q5 1 964 (+) 1 1.000 | 0.947 gcCAGCtgtc V$SREBP1 01 1 970 t*> i 1,000 | 0.902 tgTCACctgac

VSDEKTÄEFI 01 i 970 (+} ! i.ooo i 0.979 tgtcACCTgac

VSWYOD β 1 971 <+⁾ 1 1.000 | 0,972 gtCACCtgac

VlDEI-TAEFl 01 I 984 C+⁾ i 1.000 | 0,976 aaccACCTgac

V$MΪ.OÜ Q6 985 (*} 1 1,000 | 0,989 acCACCtgac

V$AP1FJ Q2 1 989 {+) 1 1.000 | 0.907 ccTGACttgaa

WGATA1 03 ^" ! J050 (^♦> 1 1.000 | 0.9-.S aggagGATAacgct

V$GATA2 02 1 1052 (+) 1 1.000 | 0.913 gagGATAacg

V$LM02COM 02 ! 1053 <+) ! 1.000 | 0.947 agGATAacg $ϊ Z 01 1 1072 {+} ) i.ooo ι 0,922 gtgaGGGAaggg

'ii.$G£ öl 1 1078 (+) 1 1.000 j 0.903 gaagggtggaAGGG iV$t.RF2 01 1 1090 {*} ! 1.000 i 0,914 ggcGGAAgag SDEKTAEFl 01 I 1103 {+} ] 1.000 1 0.947 aggcACCTtgg SNFl OS t 1108 ?+> ! 1.000 i 0.934 ^■ cctTGGCagggacagggg

|v$MZFl 01 1 1155 i 1.000 i 0.95? i gtaGGGGa

V$IK2 01 1 1155 (+) 1.000 | 0.910 gtagGGGAagca

^•V$IK2 01 1 1220 (+) ! 1.000 ) 0.939 ccctGGGAcccc

V$CETS1P54 01 l 1241 {+. t 1.000 [ 0.907 ccCGGAacct tcTGACcaata tgaCCAAtaga aataGATCcc ctccACCTatc acCGGAggcc tgtGGGGa tggggagcgCGTGgtg cGTGGTgtt cgtggTGTTtgcttt tggTGTTtgcttt ctcgaCCAAtagaagt tgAAGTg

Tab. 3: Transkriptionsfaktorbindungsstellen im 5'-Bereich aufwärts des VR1- Exons 1a des Menschen.

Die Sequenz des Menschen (AF168787, Position 44731 - 43231) wurde mit Hilfe des Computerprogramms Matlnspector (sense-Strang, Core Simil.: 1.000, Matrix Simil.: 0.900) hinsichtlich möglicher DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren analysiert. Die Transkriptionsfaktoren, die in der Sequenz der Ratte und der Maus an gleichen Positionen lokalisiert wurden, und in der humanen Sequenz zwar nicht unbedingt an der gleichen Stelle aber im entsprechenden Sequenzabschnitt identifiziert wurden, sind grau unterlegt. Die Faktoren cMyb, GATA 1/2/3, GKLF, NFY, NRF2, SOXδ, SREBP1 und SRY wurden nicht im seπse-DNA-Strang δ'-aufwärts des humanen Exons 1a identifiziert.

Matrix Positio (str) | Core Matrix Sequence Name of Matrix | Simil. Simil . acccACCTgac ccCACCtgac ctgGGGGa aggcACCTgcc ggCACCtgcc acCAGCtggc gctggcctcagTGACcaga agTGACcagaa tggggcaCGTGacccg ggggCACGtgaccc ggggCACGtgaccc gggcaCGTGacc gggCACGtgacc ggCACGtgac gCACGTga cgTGACccggg ttCAGCagct agCAGCtcca cagtGGGAgtgc ggaaTGACgtgc ggaatgACGTgctgaag

TGACgtgc agggctTTCC agggctTTCC gatGCAGctgtcggg tgCAGCtgtc ggCAGCtctg

GTCAtgctccgga agacACCTcaa ccTGACaccat

GTCAtcctttccc cagatcccAAATgagt atTGACccacc acccACCTggg ccCACCtggg acctGGGAgcta atgtGGGAgaga gtCAGCaggc gttcACCTgta ttCACCtgta V$NKX25 01 1 733 (+) 1 1.000 1 0.932 CCAAGTg ^s/siKi oi i 735 {+> i l.^*000 1 0.909 aagtGGGAaaaga

V$IK201 t 735 (+ϊ ( 1.000 I 0.958 aagtGGGAaaag f$NFÄT Q6 i 736 (+) I 1.000 1 0.935 agtggGAAAaga

V$ETFAT αδ i 818 <+) I 1.000 1 0.9S0 ttctgGAAAagt

V$CETS1P5401 1 856 w i i.ooo I 0.944 acCGGAggcc $IK201 _ J 910 {+) | 1.000 t. 0,914 gccaGGGAttga

V$AP1FJ Q2 1 917 (+) | 1.000 1 0.903 atTGACccaag ysc?2 oi »1 ~ 1012 (^•*} 1 1.000 1 0.915 gctgcacCCAG

,V5MSE^*101 1 1096 <+5 1 i.ooo o.Sδs aagGGGGa

1?§ΪK201 , I 1216 1+) ) 3 -0Ö0 . -10,937 tcatGGGAaggg $!K2 01, l 1221 1 * 1.000 1 0.90A ggaaGGGAtgca

V$AHRARNT 01 1 1310 (+) | 1.000 1 0.902 ttcgcttggCGTGggc

1 •*vA* {*} \ 1,000 f 0,919 gctTGGCgtgggctttgc

¥$AP405 J; * 1352 (+j 1 "1.000 1 0,-923 ctCAGCagaa y$MFl Q6 „ t ? I 1373 1 1,000 π ^•0,913 agtTGGCatccctgtagg iflKS 01 < 1 1385 m i 1.000 1 0.930 tgtaGGGAtccc $IK201 .--* « M²- jn f, 1,000 J 0.931 ggtaGGGAtggc

Tab. 4: Transkriptionsfaktorbindungsstellen im 5'-Bereich aufwärts des VR1- Exons 1d der Ratte.

Die Sequenz der Ratte (Fig .4. Position 1 - 4549; AC126839, Position 83528 - 88215) wurde mit Hilfe des Computerprogramms Matlnspector (sense-Strang, Core Simil.: 1.000, Matrix Simil.: 0.900) hinsichtlich möglicher DNA- Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren analysiert. Die Transkriptionsfaktoren, die an der gleichen Position wie bei der Maus-Sequenz identifiziert wurden, sind in der Tabelle grau unterlegt.

Matrix 1 Position (str) | Core | Matrix Sequence

Name | of Matrix | Simil . | Simil .

V$MYOD 01 1331 +) 1.000 0.920 atgCAGGtgatg

V$LM02COM 01 1331 +) 1.000 0.946 atgCAGGtgatg

V$HNF3B 01 1342 +) 1.000 0.905 gtcttTGTTtccttt

V$MZF1 01 1369 +) 1.000 0.974 | gatGGGGa

V$IK2 01 1369 ( +) 1.000 0.903 gatgGGGAcaga

V$TCFII oi i X38X +) J 1,000 | _0.954 GTCAtacccagtg

V$TATA 01 1469 +) 1.000 0.942 ctaTAAAgagtcagg

V$GATAl 04 1512 +) 1.000 0.914 gcctGATAtcctg

V$LM02COM 02 1514 +) 1.000 0.932 CtGATAtcc homologer

^$ΪH1E47 01 ^{* *"} X -+) A.DDÖ 0.939 ctctgggtCTGGcaaa Bereich T

V$AP4 Q5 1654 +) 1.000 0.938 ctCAGCtcat

V$CAAT 01 | 1674 +) 1.000 0.919 tgagtCCAAtga

V$NFY 01 1674 +) 1.000 0.929 tgagtCCAAtgagata

V$NFY Q6 1676 +) 1.000 0.914 agtCCAAtgag

V$GATA1 02 1681 +) 1.000 0.929 aatgaGATAgtatg

V$GATA2 03 1683 +) 1.000 0.930 tgaGATAgta

V$LM02COM 02 1684 +) 1.000 0.925 gaGATAgta

V$GATA1 03 1701 +) 1.000 0.904 gcgtaGATAccaac

V$LM02COM 02 1704 +) 1.000 0.934 taGATAcca

V$DELTAEFI 01 1765 +) 1.000 0.943 cgccACCTgcc

V$MYOD Q6 1766 +) 1.000 0.990 gcCÄCCtgcc

V$IK2 01 1847 +) 1.000 0.905 gacaGGGAgggc

V$NKX25 01 1928 +) 1.000 0.930 gtAAGTg

V$AP1FJ Q2 2033 +) 1.000 0.915 gaTGACagaag

V$NFAT Q6 2050 +) 1.000 0.965 cccagGAAAaga

VSNFAT Q6 2058 +) 1.000 0.952 aagagGAAAtgc

V$IK1 01 2098 +) 1.000 0.906 gctgGGGAatctt

V$IK2 01 2098 +) 1.000 0.917 gctgGGGAatct

V$MZFl 01 2098 +) 1.000 0.968 gctGGGGa

V$AP4 Q5 2110 +) 1.000 0.907 ttCAGCagtg

VSMZFl 01 2134 +. 1.000 0.968 gctGGGGa

V$IK2 01 2134 +) 1.000 0.918 gctgGGGAagga

V$IK1 01 2134 +) 1.000 0.900 gctgGGGAaggac

VSIK2 01 2168 + 1.000 0.916 agtaGGGAtgag

V$GATA1 06 2196 +) 1.000 0.992 ccaGATAaga

V$GATA2 02 2196 +) 1.000 0,983 ccaGATAaga

V$GATA3 02 2196 +. 1.000 0.957 ccaGATAaga

V$IiM02C0M 02 2197 +) 1.000 0.956 caGATAaga

V$EVIl 02 2198 +) 1.000 0.934 agatAAGAgaa

V$GKLF 01 2199 +. 1.000 0.922 gataagagaaAGGG

V$GKLF 01 2223 +) 1.000 0.923 aaacagaaggAGGG

V$IK2 01 2230 +) 1.000 0.900 aggaGGGAtggg

V$IK2 01 2235 + . 1.000 0.919 ggatGGGAggga

V$GATA1 04 2294 +) 1.000 0.944 aagaGATAatatc

V$GATA2 03 2295 (+) 1.000 0.992 agaGATAata

V$GATA3 02 2295 1+) 1.000 0.997 agaGATAata

V$I*M02C0M 02 2296 ⁽+) 1.000 0.924 gaGATAata

V$MZF1 01 2340 t+) 1.000 0.962 ataGGGGa

V$NKX25 02 2363 ⁽+) 1.000 0.971 ctTAATtc

V$GATA3 03 2373 ⁽+) 1.000 0.950 acAGATcaga

V$GATA1 02 2457 ⁽+) 1.000 0.941 agagaGATAcaggg

V$LM02CQM 02 2460 (+1 1.000 0.956 gaGATAcag

V$IK2 01 2464 (+) | 1.000 0.914 tacaGGGAagat

V$GÄTÄ3 03 2470 (+} 1 1.000 0.900 gaAGATgata

V$GATA1 03 2471 (+) | 1.000 0.968 aagatGATAagaag

V..GATA2 02 2473 (+) 1.000 0.967 gatGATAaga

V$GATA3 02 2473 (+) | 1.000 0.930 gatGATAaga

V$GKLF 01 2473 !+) 1.000 0.901 gatgataagaAGGG

V$LM02C0M 02 2474 (+) | 1.000 0.928 atGATAaga

V$CMYB 01 2503 (+) 1 1.000 | 0.922 agaagcagctGTTGggga

V$E47 01 2504 (+) 1.000 0.920 gaaGCAGctgttggg

V$AP4 Q5 2506 (+) I 1.000 0.976 agCAGCtgtt

V$IK2 01 2513 (-*-> | 1.000 0.908 gttgGGGAcaaa

V$M2F1 01 2513 (+) 1.000 0.971 gttGGGGa

V$IK2 01 2560 (+) | 1.000 | 0.914 gttgGGGAtttg

V$MZF1 01 2560 ;->-> 1 i.ooo 0.971 gttGGGGa

V$NF1 Q6 2567 (+) 1.000 0.944 attTGGCtcagtgacaga

V$AP1FJ Q2 1 2576 (+) ' 1.000 ι 0.949 agTGACagagc

V$AP4 Q5 2622 (+> ) 1.000 I 0.905 ccCAGCtccg

V$ISRE 01 2680 ⁽+) | 1.000 0.918 gaGTTTcagtttgcg

V$VBP 01 1 2735 (+) | 1.000 l 0.945 gTTACatgaa

V$VMYB 01 1 2744 ⁽+) l i.ooo 1 0.936 atgAACGgaa

Tab. 5: Transkriptionsfaktorbindungsstellen im 5'-Bereich aufwärts des VR1- Exons 1d der Maus.

Die Sequenz der Maus (AL663116, Position 31673 - 36359) wurde mit Hilfe des Computerprogramms Matlnspector (sense-Strang, Core Simil.: 1.000, Matrix Simil.: 0.900) hinsichtlich möglicher DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren analysiert. Die Transkriptionsfaktoren, die an der gleichen Position wie bei der Sequenz der Ratte identifiziert wurden, sind in der Tabelle grau unterlegt.

Matrix Positio (str) | Core Matrix Sequence

Name of Matrix Simil. Simil.

V$IK2 01 33 ( +) 1.000 0.928 acttGGGAggca

V$GFI1 01 145 +) 1.000 0.935 aaaaaaaaAATCaaatttaatact

V$SRY 02 188 ( +) 1.000 0.915 tctaACAAaacc

V$LM02COM 02 217 ( +) 1.000 0.907 ttGATAttc

V$AENT 01 220 +) 1.000 0.953 atattcaCGTGctaaa

V$ÜSF 01 221 ( +) 1.000 0.982 tattCACGtgctaa

V$MAX 01 221 +) 1.000 0.941 tattCACGtgctaa

V$NMYC 01 222 +) 1.000 0.960 attcaCGTGcta

V$MYCMAX 02 222 +) 1.000 0.917 attCACGtgcta

V$OSF Q6 223 +) 1.000 0.922 ttCACGtgct

V$OSF C 224 +) 1.000 0.997 tCACGTgc

V$NFAT Q6 242 +) 1.000 0.965 gttagGAAAata

V$GFI1 01 338 +) 1.000 0.948 aacatacaAATCtgagccacggtg

V$NF1 Q6 376 +) 1.000 0.910 catTGGCattgcgtgtca

VSAHRARNT 01 378 +) 1.000 0.949 ttggcattgCGTGtca

V$TCF11 01 390 +) 1.000 0.967 GTCAtggacatgc

V$CEBPB 01 452 +) 1.000 0.994 aagttgtGCAAtgt

V$AP1FJ Q2 463 +) 1.000 0.907 tgTGACatctg

V$DELTAEF1 01 491 +) 1.000 0.974 aagcACCTtaa

V$GATA1 02 512 +) 1.000 0.922 cacttGATAttgaa

V$LM02COM 02 515 +) 1.000 0.937 ttGATAttg

V$S8 01 517 +) 1.000 0.946 gatattgaATTAagtt

V$HNF3B 01 676 +) 1.000 0.923 tttttTGTTtgtttg

V$HFH8 01 678 +) 1.000 0.921 tttTGTTtgtttg

V$HFH2 01 678 +) 1.000 0.953 tttTGTTtgttt

V$HFH3 01 678 +) 1.000 0.968 tttTGTTtgtttg

V$HNF3B 01 680 +) 1.000 0.930 ttgttTGTTtgtttt

V$HFH2 01 682 +) 1.000 0.963 gttTGTTtgttt

V$HFH3 01 682 +) 1.000 0.977 gttTGTTtgtttt

V$HFH8 01 682 +) 1.000 0.908 gttTGTTtgtttt

V$HFH3 01 686 +) 1.000 0.904 gttTGTTtttgtt

VITH1E47 01 692 (+) _l.O00 0.919 ttttgtttCTGGctgt homologer

V$LM02COM 01 735 +) 1.000 0.969 agcCAGGtgtgg Bereich 4-

V$TCF11 01 759 +) 1.000 0.973 GTCAtcccagcac

V$AP1FJ Q2 773 [+) 1.000 0.934 tcTGACacaga

V$CEBPB 01 792 (+) 1.000 0.911 ggttgatGCAAgtc

"?$RORAl 01 ' ' ^{• "}.. -^" " "' 831 ^'• !+) | 1,000 0.94t tgttccaGGTCag y$SRY 02 ^' ' 880,_s f» 1-000 13.933 acaaACAAaaat

W$GFII oi . , ; ~ 881 (+) ,1.000 ,1 .909 caaacaaaAATCctagagaaactc

V$TCF11 01 954 (+) 1.000 0.993 GTCAttgtggccc

V$NFAT Q6 980 (+) 1.000 0.974 catagGAAAcag

¥$ÄP1FJ Q2 , „ 1000 , [+) i.ooo ; 0.9W. ggTGACcatag

V$STAF 02 1070 (+) 1.000 0.935 ctttCCCAtcatccagagcct

V$IK1 01 1088 +) 1.000 0.911 cctaGGGAacact

V$IK2 01 1088 (+) 1.000 0.949 cctaGGGAacac

VlAPIFJ . ^~- 1129 ^"t« [ 1.000 \ ^"0.903 ctTGACttcca

ΫSPELTAEFl 01, 1151 [+) [ 1.000 L Ö.942 gaacACCTtgt

V$DELTAEFI 01 1248 (+) 1.000 0.949 tgccACCTgtg V$MYOD Q6 1 1249 (+) | 1.000 0.924 | gcCACCtgtg fr$< &ϊtö.Λ0iχmst^! IMm SS iM πftiϊSö.y! -sSOS S | aaatGATAttcag

V$LM02COM 02 1 1269 (+) | 1.000 0.907 atGATAttc

V$DELTAEF1 01 1 1303 (+) | 1.000 0.952 ccacACCTgct

VSMYOD Q6 1 1304 (+) | 1.000 | 0.950 I caCACCtgct

V$NF1 Q6 | 1378 (+) | 1.000 0.907 | attTGGCatctcagaagc

V$SRY 02 1 1403 (+) ] 1.000 0.916 aaaaACAAgaag

V$RFX1 02 1 1447 (+) | 1.000 0.906 | aggacaccagtGCAAcca

V$TCF11 01 1 1482 (+) | 1.000 0.902 GTCAcgttgcctg i$1^ßl--OϊϊliJiBfi!!l fMSBBftlliBlÄ^'a , iipps GTCAtatccagtg

V$DELTAEFI 01 1 1658 (+) | 1.000 0.978 | tcacACCTgat

V$MYOD Q6 1 1659 (+) | 1.000 0.944 caCACCtgat homologer ^n m XKmi iffi_filoö -jäiifϊl cactqgqtCTGGcaaa Bereich T

V$DELTAEFI 01 1 1752 (+) | 1.000 0.958 ccacACCTcat

V$NKX25 01 1 1773 (+) | 1.000 0.938 tgAAGTg

V$NFY 01 1 1784 (+) | 1.000 0.910 tgagcCCAAtgggata

V$IK2 01 | 1790 {+) | 1.000 0.940 caatGGGAtagt

V$GATA1 02 1 1791 (+) | 1.000 0.915 aatggGATAgtatg

V$NKX25 01 1 1807 (+) | 1.000 0.938 tgAAGTg

V$CMYB 01 1 1862 (+) | 1.000 0.902 cactgctgctGTTGacat

V$IK2 01 1 1883 (+} | 1.000 0.949 aactGGGAccac

V$DELTAEF1 01 ] 1897 (+) | 1.000 0.939 agccACCTacc

V$NRF2 01 | 1908 (+) | 1.000 0.916 acaGGAAgtg

V$IK2 01 1 1973 (+) | 1.000 0.920 gacaGGGAaggg

V$LM02COM 02 1 2015 (+) | 1.000 0.911 gtGATAcct

V$NKX25 01 1 2056 (+) | 1.000 0.930 gtAAGTg

V$E47 01 1 2075 (+) | 1.000 0.944 ggtGCAGgtggcttc

V$MYOD 01 1 2076 (+) | 1.000 0.908 gtgCAGGtggct

V$LM02COM 01 1 2076 (+) | 1.000 0.956 gtgCAGGtggct

V$NFAT Q6 1 2136 (+) | 1.000 0.979 tagagGAAAagc

V$GATA1 02 1 2159 (+) ! 1.000 0.937 gtgatGATAgaaga

V$NFAT Q6 1 2181 (+) | 1.000 0.962 agtagGAAAaga

V$AP4 Q5 | 2238 (+) | 1.000 0.907 ttCAGCagtg

V$MZF1 01 1 2263 (+) | 1.000 0.956 ctgGGGGa

V$IK2 01 1 2263 (+) | 1.000 0.912 ctggGGGAagga

V$AP1 Q2 | 2279 (+) | 1.000 0.902 gaTGACtggtg

V$IK2 01 | 2297 (+) 1 1.000 0.920 agtaGGGAtgga

V$AP4 Q5 | 2325 (+) | 1.000 0.956 ccCAGCtgag

V$IK2 01 | 2336 {+) | 1.000 0.901 gagaGGGActgg

V$I 2 01 1 2360 (+) | 1.000 0.900 aggaGGGAtggg

V$IK2 01 | 2369 (+) | 1.000 0.934 gggtGGGAggcc

V$CREB 02 1 2414 (+) | 1.000 0.937 aggaTGACgaca

V$AP1FJ Q2 1 2416 (+) | 1.000 0.923 gaTGACgacaa

V$GATA3 03 | 2426 (+) | 1.000 0.923 agAGATcgta

V$MZF1 01 1 2475 (+) | 1.000 0.948 tcaGGGGa

V$TCF11 01 l 2489 (+} | 1.000 0.982 GTCAtggatgctt

V$NKX25 02 | 2499 (+) | 1.000 0.971 ctTAATtc

V$AP4 Q5 1 2531 (+) | 1.000 0.947 acCAGCtgag

V$GATA1 02 1 2593 (+) | 1.000 0.921 agagaGATAcaagg

V$GATA2 03 1 2595 (+) | 1.000 0.931 agaGATAcaa

V$LM02COM 02 ) 2596 (+) | 1.000 | 0.913 gaGATAcaa

V$IK2 01 | 2637 (+) | 1.000 0.933 gtttGGGAggtg

V$LYF1 01 1 2638 {+) | 1.000 0.989 tttGGGAgg

V$GATA1 02 1 2665 (+) | 1.000 0.932 ttggtGATAgcaga

V$LM02COM 02 | 2668 (+) | 1.000 0.921 gtGATÄgca

V$NKX25 01 | 2722 (+) | 1.000 0.938 tgAAGTg

V$GATA1 02 | 2729 (+) | 1.000 | 0.932 tttagGATAatgaa

V$LM02COM 02 1 2732 (+) | 1.000 | 0.932 agGATAatg

V$SRY 02 1 2776 (+) | 1.000 | 0.902 aaaaACAAgaac

V$TCF11 01 1 2874 (+) | 1.000 | 0.973 GTCAtgtgatctg

V$TCF11 01 | 2890 (+) | 1.000 | 0.973 GTCAtgtgatctg

V$DELTAEFI 01 1 2913 (+) | 1.000 | 0.934 taacACCTccg

V$IK2 01 | 3042 (+) | 1.000 | 0.927 ggctGGGAgtta

V$AP1FJ Q2 | 3063 (+) | 1.000 0.939 gaTGACtccac

V$CP2 01 1 3125 (+) | 1.000 | 0.951 gCtccatCCAG

V$FREAC7 01 1 3161 (+) | 1.000 | 0.912 I aagaaaTAAAaaggaa

V$NFAT Q6 1 3169 (+) | 1.000 0.954 aaaagGAAAgaa

V$GATA1 03 | 3223 (+) | 1.000 | 0.968 ttgtaGATAaaggg

V$GATA2 02 1 3225 (+) | 1.000 | 0.941 1 gtaGATAaag

V$GATA3 02 1 3225 (+) | 1.000 | 0.905 gtaGATAaag

V$LMO2C0M 02 | 3226 (+) | 1.000 | 0.959 1 taGATAaag

V$IK2 01 | 3260 (+) | 1.000 | 0.924 1 gtctGGGAgagt V$MZF1 01 | 3297 (+) 1 1.000 | 0.989 tgtGGGGa sMsri oi i 3344 {+) ) 1.000 I 0.986 agaGGGGa homologer Bereich 4- ⁱV$I 2 01 i 3344 {+) ) 1.000 i 0.901 agagGGGAacca

V$IK2 01 | 3390 (+) 1 1.000 | 0.935 ggtaGGGAacca

V$GATA3 03 | 3408 (+) 1 1.000 | 0.942 atAGATtata

V$IK2 01 | 3416 (+) 1 1.000 | 0.929 tataGGGAagag homologer

V$TH1E47 01 | 3423 (+) 1 1.000 | 0.905 aagaqcctCTGGcaga Bereicht

V$GATA1 02 | 3467 (+) 1 1.000 | 0.947 ttcagGATAgaggg

V$GATA1 03 | 3467 (+) 1 1.000 | 0.917 ttcagGATAgaggg

V$GATA1 04 | 3468 (+) 1 1.000 | 0.909 tcagGATAgaggg

V$LM02COM 02 | 3470 (+) 1 1.000 | 0.926 agGATAgag

V$IK2 01 | 3509 (+) 1 1.000 | 0.930 ggtaGGGAttga

V$IK2 01 | 3525 (+) 1 1.000 | 0.935 tgctGGGAgaac

V$R0RA1 01 | 3535 (+) 1 1.000 | 0.934 acctagaGGTCag

V$0CT1 06 | 3551 (+) 1 1.000 | 0.939 cactttgacATGTt homologe Bereiche*!*

,V$BKH2 01 ^* , ,1, fϊ^' \ ,. 355 1.000 ^' TH S gacatgttAAATaggc

V$SRY 02 | 3627 (+) 1 1.000 | 0.903 taatACAAttca

NtfςsπtB 01 \fsV .,.».. 3653 t- f ^"i_*ooo y ^" 0,972 cctagtggcaGTTGcttg

V$BARBIE 01 | 3720 (+) 1 1.000 | 0.915 cctgAAAGctggtgg

V$CREL 01 | 3732 (+) 1 1.000 | 0.968 tggactTTCC

V$NFKAPPAB65 01 | 3732 (+) 1 1.000 | 0.967 tggactTTCC

V$IK1 01 | 3750 (+) 1 1.000 | 0.903 atctGGGAaggag

V$IK2 01 | 3750 (+) 1 1.000 | 0.959 atctGGGAagga

*§S801 X | " ^* 3:843 in 1.0^*00 | 0.93 ggtgagaaATTAgcac if$mθD oχ *,,.. | t ? in i ι^χn ι - 0.Ö45 agaCAGGtggct

V$LM02COM 01 | 4017 (+) 1 1.000 | 0.949 agaCAGGtggct

V$TCF11 01 | 4040 (+) 1 1.000 | 0.964 GTCAtttcccttt

V$NFÄT fiδ .?^'.' j ^" 4ΪΪ4 t+> 1 1-0- 1 .963 gtttgGAAAatc

V$GFI1 01 | 4144 (+) 1 1.000 | 0.944 gtttggaaAATCaaggctccaaga

_,V$NK--25 01 'f_. f ώs£ in i J..OÜ0 1 ^"0.917 ctAAGTg

V$DELTAEFI 01 | 4210 (+) 1 1.000 | 0.940 gtgcACCTcgg

W%mι Q6 ^"| ,4244 i i 1.000 f 01915 catTGGCtgtggtttctg

V$PADS C | 4251 (+) 1 1.000 | 0.950 tGTGGTttc y$ικι oi " i " ^' \ ^{^""}4276 m ) i.ooo j 0.909: tgatGGGAaaagc

Ψ$ΣK2*01 ' | ^" 4276 W I i.ooo 1 0,947 tgatGGGAaaag

VSHFAT ^*Q6 ' . 1 4277 w i 1.000 | 0.944 gatggGAAAagc

V$IK2 01 "1 . ] 4288 <*. i 1.000 | 0-9S4; ctttGGGAtcct

V$IK-. 01 ^*<^:' |* -4298 m ) 1,000 ! 0.961 ctctGGGAatcg

?$IK1 01 V ^'{ ^* k " 4298 in ι 1.000 I 0,920 ctctGGGAatcgg

V$RFX1 02 | 4307 (+) 1 1.000 | 0.962 tcggagccgtgGCAAcag

V$RFX1 01 | 4308 (+) 1 1.000 | 0.905 cggagccgtgGCAAcag

-t§A Q ' i ri ^' «432Ö ιy . I.OOO^"' 1 0^".9lβ agCAGCtgct

^•V^AP Q5 „. )^> in i 1.000 ) O.^l aaCAGCagct

*V$HMF3B 01 4342 {+. I 1,000 ! 0.93-3 gcaaaTGTTtccttg y$BFH2 01 I 4344 tn t 1.000 1 0.922 aaaTGTTtcctt y§MZ l 01 * j 4395 (+) 1 i.ooo i 0.948 ccaGGGGa ^§AP4 05 1 ' 4445 {+) 1 1,000 | 0,914 caCAGCagcc

•V$ÄP Q5 j, 4471 i i 1.000 1 0.90t aaCAGCtcca

V§DELTAEF1 01, ^l ' j-* 4507 i+) I 1,000 j 0_t 50 ctgcACCTagc m&M Q5 *^■ I ^• 4555 i < 1.000 J 0,935 tcCAGCtgtg !V$IK2 01 ^l , , 1 *. 4639 {+ .ooo 1 ϊ 0.912 ttctGGGAggct

V$RFX1 02 | 4643 (+) 1 1.000 | 0.915 gggaggctgaaGCAAcag homologe

V$CEBPB 01 | 4647 (+) 1 1.000 | 0.903 ggctgaaGCAAcag Bereiche t

Tab. 6: Transkriptionsfaktorbindungsstellen im 5'-Bereich aufwärts des VR1- Exons 1d des Menschen.

Die Sequenz des Menschen (AF168787, Position 36616 - 33151) wurde mit Hilfe des Computerprogramms Matlnspector (sense-Strang, Core Simil.: 1.000, Matrix Simil.: 0.900) hinsichtlich möglicher DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren analysiert.

S?$ΪK2~0Ϊ ^* % _r ^ i 13 in^'f T.ooo 1 o.fli ttgtGGGAggtt y|ικέ oi ι ^s J zi \ i i.ooo { 0j,914 accaGGGAaagg

W$m& Q6 i . 28 *> I I„OOÖ i 0.903 ccaggGAAAgga y$κmι oi [ so m ι i-ooq j 0,990 GTCAttcaggtga

V$LM02COM 01 1 53 (+) | 1.000 | 0.919 attCAGGtgaga y§XK2 01 ^{*' " " *} 4 ^r 4 {+1 I ».δoo I 0.9 6 aggaGGGAtgga y$R0R&i o f 137 {*) I i.OOO I 0.93O ggctggaGGTCac y$ϊ 2 ol ( 196 <+} 1 1.000 I 0.916 ggcaGGGActgc m&zwi oi I 219 <*} f 1,000 t 0.982 ggaGGGGa

!<r$IK2 01 234 {*} | 1.000 I. 0.912 tggaGGGAacag -?MZFi , oi i 266 {+) | 1,000 ) 0,980 cggGGGGa

^•¥$DELTAEF1 01 t 287 i r 1.000 | 0.971 cttcACCTgca

VSMYOD Q6 | 288 {+}, | 1.000 I 0,908 ttCACCtgca

VS1K2 01 1 308 in I 1.000 I 0.909 ggcaGGGAtgga $XK2 Qϊ I 321 <+) f 1,000 t 0,923 ctcaGGGAagag

V$ÄP . Q$ ι 1 354 {+} I i.ooo i 0.902 agCAGCcgct y$APl 02 ! 361 {*} | 1.000 ! 0.948 gcTGACttgga

^SIK2 01 -*. _ | 386 {*} I 1,000 1 0*₁,924 ccttGGGAgggg

V$EVI1 02 1 432 (+) | 1.000 | 0.949 ggagAAGAtaa

^GATÄl 04 1 i 434 in I i.000 } .θ³.« agaaGATAaggct

WGATÄ302 [ 435 {+} 1 1.000 I 0.924 gaaGATAagg §GATA202 . ^" , 1. 35 jn I 1,000 i 0,969 gaaGATAagg

V$LM02COM 02 1 436 (+) | 1.000 | 0.990 aaGATAagg

V$E47 02 1 464 (+) | 1.000 | 0.905 accccCAGGtgtgggg

V$LM02COM 01 1 466 (+) | 1.000 I 0.985 cccCAGGtgtgg y^*?MZFl 01 ^"1 - 473 in~~\ i.oool _jOsfs¹ tgtGGGGa

V$IK2 Öl * . ^** "473 £+} 1 i.ooo i O_j.908 tgtgGGGAacgg

V$VMYB 02 1 477 (+) | 1.000 | 0.928 gggAACGgc

W$IS2 oi " ^l't " t ^5W" *+ i ΪT ooo r 0,105 gccaGGGAgtcc

•VfϊK2 O , »^*. 1 _ sä« i i 1,000 i 0.92| ggccGGGActtc

V$NFKB Q6 1 542 (+) | 1.000 | 0.917 ccGGGActtcccct

V$CREL 01 1 543 (+) | 1.000 | 0.949 cgggacTTCC

V$NFKB C 1 543 {+) | 1.000 | 0.948 cGGGACttcccc

V$NFKAPPAB 01 1 544 (+) | 1.000 | 0.985 GGGActtccc

-Ϋ§GATA102 1 " ι ιn^~ r f.000 1 ^""ö~.S33 ccggtGATActgtt

V$LM02COM 02 1 594 (+) | 1.000 | 0.943 gtGATActg

V$XFD3 01 1 617 (+) | 1.000 | 0.905 tctgttAACAaaga y$SRY 02 1 ^* f 620 t+.T 1,000 I 0,925 gttaACAAagag $N T Q6 I 664 (*) | 1.000 [ cactgGAAAtgg

V$HNF3B 01 I $ i j 1.000 1 0,923 cgtttTGTTtttttt $HI?H2 01 I 698 <+) 1 1.000 j 0.938 tttTGTTttttt

V$HFH3 01 1 698 (+) | 1.000 | 0.924 tttTGTTtttttt

V$ÄP405 i Hz in I ι,öö"δ ) ^"0.926 ctCAGCtcac

V5HKX25 01 1 789 i \ 1.000 j 1,000 tcAAGTg

V$IK2 01 m {+> ^ 1.000 ! 0.950 agctGGGActac

V$AHRARNT 01 1 827 (+) | 1.000 | 0.905 gactacaggCGTGcac v$mi Qδ 1 "" 894 {+) | i.ooo ι 0,916 tgtTGGCtaggctggtct y$ FΪl 01 1 1010 (+) | 1,000 | 0.932 gaggcagaAATCactttggaggct

V$CEBPB 01 1 1030 (+) | 1.000 | 0.906 ggctaagGCAAtgg

(V$NFAT 06 1 1102 {+) I 1.000 I 0.933 agaagGAAAtga y$RORÄl 01 1 1131 i 1 1,000 j 0.911 gttgagaGGTCac

V$NFE2 01 1 1147 (+) | 1.000 | 0.902 tgCTGAgtctt

JV$NFAΪ 06 ^* [ 1202 (+} | 1.000 [ 0.940 gaatgGAAAgca tv$ ÄΕAl 04 t 1222 {+> I 1,000 1 0.934 accaGATAtttgc

V$LM02COM 02 1 1224 {+) | 1.000 | 0.917 caGATAttt

cacacttcaATGCc ctTGACtcagg tgtTGGCgtcccgcaggc gtCCCGcaggca ggCAGCtgct gtctGGGAgaga tgTGACtctct tgAAGTg acgcctggAATCccagcactttgg ctttGGGAggcc gagGCAGgtggatga aggCAGGtggat tggaTGACgagg gaTGACgaggt atgacgaGGTCag ccTGACtctac atacaacaATTAgctg tacaACAAttag acaaCAATta atgGCAGgtgcctgc tggCAGGtgcct attcGGGAggct acctGGGAggtg aaaagGAAAtga aaTGACactga cactGATAgttat ctGATAgtt ggctGGGAcctg gcTGACccaga tttGGGGa gttaGGGActag gaaAACGgaa gtttTGACgtcg tttTGACgtcgctg ttTGACgtcgct

TGACgtcg

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Claims

Patentansprüche

1. Nukleinsäure, enthaltend einen Sequenzabschnitt, der mindestens einen die Expression des VR1 -Rezeptors modulierenden Bereich der Sequenz gemäß Fig. 3 und/oder gemäß Fig. 4 und/oder gemäß GenBank- Zugriffsnummer AL670399, Positionen 221931 bis 223344, und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116, Positionen 31673 bis

36359, und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 44731 bis 43231, und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 36616 bis 33151, aufweist, oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes homologes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei der die Expression des VR1- Rezeptors modulierende Bereich eine Transkriptionsfaktorbindungsstel- le umfasst.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei der Sequenzabschnitt ein oder mehrere Bindungsmotive für die Transkriptionsfaktoren, ausgewählt aus MZF1, NFkappaB, GATA 1/2/3, IK 2, NFAT, AP4, SRY, SOX5, CP2, cMyb, SREBP1 , deltaEFI , MyoD, GKLF, NRF2, NF1 , CETS1 P54, NFY

TH1E47, RORA1, GFI1, AP1, GATA 1, TCF11, 4255), IK2/1, Brn2, S8, HNF3B und HFH2, umfasst.

4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die ein doppelsträngi- ges DNA-Molekül ist.

5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die modifizierte Inter- nukleotidbindungen und/oder modifizierte Nukleobasen enthält.

6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die etwa 13 bis etwa 65 Nukleotide oder Basenpaare umfasst.

7. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Sequenzabschnitt die in Fig. 3 gezeigte Sequenz oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, o- der eine hiermit unter Standardbedingungen unter stringenten Bedingungen hybridisierende Sequenz umfasst.

8. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Sequenzabschnitt die in Fig. 4 gezeigte Sequenz oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, o- der eine hiermit unter Standardbedingungen unter stringenten Bedingungen hybridisierende Sequenz umfasst.

9. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Sequenz- abschnitt die Nukleotide der Positionen 1 bis 1423 der in Fig. 3 gezeigten Sequenz oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz umfasst.

10. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Sequenzabschnitt die Nukleotide der Positionen 1 bis 4549 der in Fig. 4 gezeigten Sequenz oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz umfasst.

11. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Sequenzabschnitt die Nukleotide der Positionen 4060 bis 4219 der in Fig. 4 gezeigten Sequenz oder ein die Expression des VR1 -Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz umfasst.

12. Vektor, enthaltend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11.

13. Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 12 transformiert ist, wobei die Wirtszelle keine humane Keimzelle und keine humane embryonale Stammzelle ist.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, die eine Säugetierzelle, insbesondere ei- ne humane Zelle, ist.

15. Verfahren zur Modulation der Expression des VR1 -Rezeptors, umfassend das Einbringen der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder des Vektors nach Anspruch 12 in eine das VR1-Gen enthalten- de Zelle.

16. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder Vektor nach Anspruch 12 oder der Wirtszelle nach Anspruch 13 oder 14 als Arzneimittel.

17. Verwendung der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder des Vektors nach Anspruch 12 zur Prävention und/oder Behandlung von Schmerzen.

18. Verwendung der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder des Vektors nach Anspruch 12 zur Behandlung von mit der Aktivität des VR1 -Rezeptors assoziierten Sensibilitätsstörungen.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Sensibilitätsstörung eine Analgesie, Hypalgesie oder Hyperalgesie ist.