EP1453955A2 - Construits cellulaires cultives in vitro, preparation et utilisations - Google Patents

Construits cellulaires cultives in vitro, preparation et utilisations

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EP1453955A2
EP1453955A2 EP02804924A EP02804924A EP1453955A2 EP 1453955 A2 EP1453955 A2 EP 1453955A2 EP 02804924 A EP02804924 A EP 02804924A EP 02804924 A EP02804924 A EP 02804924A EP 1453955 A2 EP1453955 A2 EP 1453955A2
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EP
European Patent Office
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cells
construct
tissue
cell
culture
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02804924A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Annie Black
Jean-Louis Romette
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Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Natural Implant
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Filing date
Publication date
Application filed by Natural Implant filed Critical Natural Implant
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2533/10—Mineral substrates
    • C12N2533/18—Calcium salts, e.g. apatite, Mineral components from bones, teeth, shells

Definitions

  • the present invention relates to the technical fields of biology, biotechnology, toxicology, pharmacology and medicine. Its applications relate in particular to the fields of human and animal health. More particularly, the invention describes new methods of culturing and reconstituting human or animal tissues in vitro or ex vivo, typically from the cells which compose them. These methods make it possible to preserve the differentiation capacities of the cells used while orienting this differentiation in the desired direction.
  • the invention also relates to the cell constructs and the tissues thus reconstituted, as well as the numerous uses that can be made of them. It also relates to tools and kits for the implementation of these methods.
  • the invention is particularly useful in the field of grafts or implantology (tissue reconstruction or repair), as well as in the pharmaceutical industry, for the study of tissues and the analysis of the toxic or beneficial profile of molecules capable of '' enter pharmaceutical development and / or pharmaceutical compositions.
  • Tissue reconstruction combines methods of bioengineering with the principles that govern the life sciences so as to understand the structural and functional interconnections of normal and pathological tissues in mammals.
  • One of the objectives is to produce biological substitutes to test, restore, maintain or improve biological functions in vitro or in vivo, and to produce in vitro tissues or cellular constructs as similar as possible to the native tissues that one seeks to rebuild.
  • the use of cells from higher eukaryotic organisms, for experimental (genetic studies, toxicity studies, etc.), pharmacological or therapeutic (cell therapy, tissue repair, etc.) needs has undergone very significant development. To do this, different methods of obtaining cells or tissues have been developed, in particular for the preparation of primary cell cultures, based essentially on the taking and ex vivo treatment of a biopsy.
  • tissue cultures for example vessels
  • tissue cultures have been able to be produced in the absence of synthetic matrix or porous membrane, they are essentially limited to particular tissues and do not have characteristics suitable for direct therapeutic use.
  • the problem which the present invention proposes to solve consists in obtaining a functional cell construct capable of integrating biologically into the tissues of a recipient host subject, thanks to the resources of the cells of said construct and to the properties of said construct.
  • Particularly advantageous tissues within the meaning of the invention are tissues capable of behaving functionally when grafted to a recipient host, that is to say of incorporating or integrating in a durable manner with the inside this host and / or to be gradually reshaped by the cells of the host, with the aim of filling, repairing or restoring defective properties.
  • a first particular aspect of the invention relates to reconstituted or cellular constructed tissues comprising cells having a capacity for mineralization and / or ossification.
  • Another aspect of the invention relates to reconstructed cellular constructs or tissues capable of incorporating or integrating in a sustainable manner inside a host and comprising zones of mineralization and / or ossification.
  • tissues or cellular constructs of the invention can be produced from different cell types, alone or in combinations, in particular of ligament, tooth, bone, tendon cells, and comprise an extracellular matrix in which said cells are coated.
  • a specific aspect of the invention resides in tissue reconstituted from ligament cells, in particular from the periodontal ligament.
  • Another particular aspect of the invention is to provide reconstituted tissues having a significant thickness, typically greater than or equal to approximately 100 ⁇ m, in particular in which the cells and the matrix are functionally organized.
  • the present invention relates to cellular (or constructed) tissues reconstituted from animal cells, preferably from mammals, for example human cells, cultured in vitro without the intervention of a framework or synthetic matrix intended to give its hold to the fabric.
  • the cell constructs can thus advantageously be produced only using animal cells, preferably mammals, for example human cells, and components of endogenous extracellular matrix (Le., Produced by these cells).
  • a therapeutic composition comprising a reconstituted cellular tissue as defined above.
  • the invention provides in particular cellular dressings (or bioactive dressings) comprising a reconstituted tissue or cell mass as defined above, and intended for implantation in a subject.
  • the invention also relates to methods of tissue treatment or repair, comprising the preparation of a reconstituted tissue and its implantation in a subject, in an autologous, allogenic or xenogenic context, preferably in an autologous context.
  • the invention can be used for the treatment or repair of tissue defects in subjects, for the preparation of implants, for carrying out tests in vitro or ex vivo, etc.
  • the present invention relates to cell constructs prepared in vitro, their production and their uses.
  • animal cells cultivated in vitro under conditions ensuring the formation of a three-dimensional tissue structure, and (ii) an endogenous extracellular matrix in which said cells are trapped, and in that it comprises, among said cells , cells with a mineralization and / or ossification capacity.
  • the term “construct” or “cellular construct” designates a cluster or cellular tissue in the form of a spread construct. It can be a cluster or tissue comprising one or more layers of cells superimposed on each other, typically from 1 to 20 layers of cells, preferably from 2 to 15 layers approximately. Construct cells are embedded in a dense three-dimensional network of extracellular matrix synthesized by the construct's own cells, and which gives its structure and resistance to the construct of the invention.
  • construct designates, in general, an artificial tissue construct (that is to say in particular manufactured, cultivated or maintained in vitro) comprising one or more layers of cells cultured in vitro, coated in an extracellular matrix produced by said cells , construct cells being biologically active, Le., susceptible to division, proliferation, remodeling, release of biological factors, etc.
  • construct cells being biologically active, Le., susceptible to division, proliferation, remodeling, release of biological factors, etc.
  • the construct generally has a polarity, with a basal side and an apical side having different properties.
  • tissue or cellular constructs reconstituted according to the invention lies in the fact that they can comprise cells which have retained a capacity for mineralization and / or ossification.
  • the present application indeed shows that it is possible to artificially reconstitute tissues or constructed having the capacity of mineralization, thus creating mineralized zones.
  • This aspect of the invention is particularly unexpected and important, since it allows the construction of tissues having biological properties adapted to the reconstruction of defects and / or having integration properties in a host greatly improved.
  • the term cells having the capacity to produce mineralization / ossification cells producing, naturally or after particular stimulation, an enzymatic activity catalyzing the formation and / or the accumulation, in the extracellular matrix , calcium phosphate or calcium carbonate or a mixture of these different ions, typically in the form of particles, deposits, plates, etc.
  • These are typically cells producing, under the culture conditions, alkaline phosphatase and / or complementary proteins (BMP, BSP, OPN, OCN, etc.), thus allowing the production of inorganic phosphate.
  • BMP, BSP, OPN, OCN, etc. complementary proteins
  • This mineralization generally leads to the creation of a mineralized and / or ossified face of the cell construct, which generally corresponds to that exposed to the culture support. As will be described in the following text, this face is also the richest in collagen. Indeed, the mineralization takes place in the middle of collagen fibers present in the construct, thus allowing a solid anchoring of the latter in the mineralization deposits. In addition, the progenitor cells increase in number near the culture support and facilitate the mineralization initiated by the matrix and the collagen network.
  • This characteristic of the invention is particularly important and advantageous for the production of cellular constructs for repairing structures such as ligaments, tendons, teeth, bones, joints, etc., insofar as the production of mineralization promotes anchoring collagen fibers from the tissue in the mineralized layer and leads to a reconstituted tissue closer to the native tissue, in particular to a tissue including a cementum.
  • the mineralizing cells of the constructs of the invention are typically cells of the mesenchyme or precursors of these cells. Their mineralization capacity is preserved by the culture and / or processing conditions of the cells in the construct, and / or due to the particular tissue origin of these cells.
  • the reconstructed constructs or tissues according to the invention advantageously comprise animal cells, in particular mammalian cells, preferably human cells. They can be undifferentiated stem cells or cells derived from mature tissue, or a combination of such cells. If cells are taken from tissue mature, it can be any type of cell capable of producing the extracellular matrix and / or of conserving or acquiring a capacity for mineralization and / or ossification in particular under the influence of external factors. The cells involved in the reconstruction of the tissue can thus come from different cell populations, thus forming a heterogeneous population.
  • cells derived from mature tissues such as muscle, bone, tooth, cartilage, tendon or ligament, in particular the tooth and the ligament, in particular the periodontal ligament or the anterior cruciate ligament.
  • the cells when they come from the periodontium, they comprise, at least in the initial cultures, cells of the periodontal ligament, cells of the cementum and dentin, namely essentially fibroblasts (approximately 80%).
  • the cells derived from the periodontal ligament typically include fibroblasts, epithelial cells, cementoblasts, osteoblasts and / or progenitors of these different cell types.
  • odontoblasts When they come from the tooth, they include odontoblasts, ameloblasts, pulp cells, epithelial cells, cementoblasts and / or progenitors of these different cell types. It may also be a sample containing a majority of undifferentiated stem cells, the differentiation of which will be guided by appropriate culture means. It can also be chondrocytes or osteoblasts. These cells can originate from mesenchymal stem cells and / or cells isolated from an extract of bone marrow.
  • the tissue according to the invention may be composed of a single cell population or of a combination or mixture of several cell types (or populations), distributed uniformly or not within the tissue so as to mimic the cell composition and structure of native tissue. If different cell types are present, it is preferable that at least one of said cell types is capable of mineralization and / or ossification.
  • the cell type (s) having no mineralization capacity can (can) also be stimulated or transformed so as to induce mineralization and / or ossification.
  • the cells of the construct for example fibroblasts
  • the different cell populations can be associated at the start of the culture period, for example in a given ratio, or alternatively, for example by the association of several constructs.
  • a particular object of the invention resides in a cell construct as defined above, produced from (or comprising) ligament cells cultured in vitro, in particular of periodontal or anterior cruciate ligament.
  • the invention shows that artificial mineralized tissues can be made from this type of cells, which can be reshaped to produce thick constructs, and which have a functional biological organization.
  • the tissues or constructs according to the invention comprise cells which are drowned or coated or trapped in an endogenous extracellular matrix, that is to say produced by the cells in culture.
  • the extracellular matrix typically comprises (and essentially) a network of collagen fibers organized in particular into fibrils, sulfated proteoglycans, potentially involved in the regulation in vivo of the diameter of the fibrils, as well as simple or sulfated glycosaminoglycans (GAG).
  • hyaluronic acid HA
  • fibronectin a simple GAG
  • di-hyaluronic acid di-chondroitin-O-sulfate
  • di-chondroitin-4-sulfate di-chondroitin
  • di-chondroitin can be found in particular -6-sulfate, di-chondroitin-4,6-sulfate, di-chondroitin-4-sulfate-UA-2S and / or di-chondroitin-6-sulfate-UA-2S.
  • the extracellular matrix may further include decorin, such as biglycan or versicane, as well as tenascin, an extracellular matrix glycoprotein found particularly in mesenchyme or tissues under repair. It seems that the cells in culture gradually fill the space which separates them with a loose matrix rich in type III collagen and fibronectin and then reshape this matrix with type I collagen so as to make it denser.
  • decorin such as biglycan or versicane
  • tenascin an extracellular matrix glycoprotein found particularly in mesenchyme or tissues under repair.
  • the construct comprises cells having the capacity to synthesize an endogenous extracellular matrix, the composition of which is similar to that found in the original tissue, except voluntary modifications (eg, incorporation of synthetic materials, modification cell genetics, etc.).
  • the present invention relates to a construct as defined above comprising a basal layer and an apical layer relative to the culture support, said basal layer being rich in collagen and further comprising fibroblasts and cells progenitors responsible for mineralization and / or ossification and said apical layer being less rich in collagen than said basal layer, and typically comprising more proliferative cells.
  • the constructions according to the invention can be of variable dimensions, both in surface area and in thickness. In addition, they can have or take forms varied. The dimensions and the shape can be adapted by a person skilled in the art or by the user, depending on the desired applications.
  • a particular advantageous characteristic of the constructs or fabrics according to the invention lies in their substantial thickness, typically between 30 and 120 microns, preferably between 50 to 120 ⁇ m, even more preferably greater than or equal to approximately 100 ⁇ m.
  • the present application indeed shows that it is possible to produce in vitro cell constructs having a high thickness, in which the cells are capable of organizing, differentiating and proliferating, to create a functional polarity in the construct without cause particular cell necrosis.
  • This characteristic is advantageous because it provides a reconstituted tissue in which the cells organize and develop advantageous biological properties.
  • the cells behave differently.
  • the overall endogenous diffusion of substances within the tissue, and therefore in the environment of the cells is reduced, which increases the potential effect of the cells and leads to their reorganization and their remodeling.
  • This organization also favors the appearance of mineralization, the polarization of the tissue, the expression of a proliferative layer on the apical surface, the holding of the construct and / or its integration in a subject.
  • the thickness of the construct can be varied in different ways. Preferably, it is obtained artificially, for example by folding or rolling on itself a thinner construct, so as to increase its thickness by fusion and reshaping of the different cell layers.
  • the invention indeed shows that it is possible to compact a first tissue construct comprising around 3 layers of cells obtained by culture, and that this compacting (eg, folding, winding, etc.) leads to a tissue in which the cells s '' organize, differentiate, and develop advantageous biological properties.
  • the invention also shows that it is possible to cut a fabric or construct it in pieces which can then be folded or rolled up on themselves.
  • the thickness can also be increased artificially by a separation of the edges of the construct which causes the retraction of the latter and the compacting of the cells.
  • a particular object of the invention also resides in a cell construct, characterized in that it comprises (i) animal cells cultivated in vitro under conditions ensuring the formation of a three-dimensional tissue structure and (ii) an endogenous extracellular matrix in which said cells are coated (or imprisoned), and in that it has a thickness greater than or equal to approximately 100 ⁇ m.
  • the construct comprises or is produced from cells having a mineralization capacity, and / or comprises or is produced from ligament, tendon, tooth or bone cells.
  • a more particular object of the invention thus resides in a cell construct, characterized in that it comprises (i) cells taken from ligament, tendon, tooth and / or bone of mammal (s), cultivated in vitro in conditions ensuring the formation of a three-dimensional tissue structure, and (ii) an endogenous extracellular matrix in which said cells are coated (or imprisoned), and in that it has a thickness greater than or equal to approximately 100 ⁇ m.
  • Another more preferred object of the invention thus resides in a cell construct, characterized in that it comprises (i) cells taken from ligament, tendon, tooth and / or bone of mammal (s), cultured in vitro under conditions ensuring the formation of a three-dimensional tissue structure, and (ii) an endogenous extracellular matrix in which said cells are coated (or imprisoned), in that it has a thickness greater than or equal to approximately 100 ⁇ m and in that it comprises cells having a mineralization capacity and / or mineralized zones.
  • the construct has a basal layer (face) and an apical layer (face), the basal layer being rich in collagen and in mineralized zone.
  • the surface of the construct or tissue can be adapted by a person skilled in the art by varying the quantity of cells seeded, the duration of the culture, the dimensions of the culture device, etc.
  • building plots can be cut, having a shape suitable for the subsequent use of the construct, for example rectangular, square, circular, etc., and a surface also suitable for said use, for example between 1 and 20 cm 2 , preferably between 1 and 15 cm 2 , even more preferably between 2 and 10 cm 2 .
  • the cell constructs are prepared by a method typically comprising: a) the culture of cells of interest under conditions suitable for the synthesis of an extracellular matrix and the formation of a construct comprising one or more layers of cells embedded in the neosynthesized endogenous extracellular matrix, and b) recovering the construct.
  • This method can also comprise, before steps a) and b), the following steps a ') and b'): a ') the extraction of the cells of interest from one or more tissues, by any appropriate means, for example by enzymatic digestion, mechanical treatment, explant, etc., and b ') the amplification of said cells extracted during step a') in an appropriate medium, typically in the presence of ascorbic acid or a derivative of said acid.
  • the method can also further comprise a step c) of recovering the cell construct (for example by detachment) and a step d) of artificial increase in the thickness of said construct, in particular by folding (for example by successive folding), rolling of the construct on itself or retraction of the construct.
  • the cells can be extracted from the tissue chosen by any appropriate means, for example by enzymatic digestion (eg, collagenase) or by using an explant technique known to those skilled in the art. job. It can be a mechanical dissection (e.g., scalpel), an enzymatic washing, a cell concentration, a mechanical cutting (e.g., scissors), etc.
  • the cells thus extracted generally consist of a population of cells of various natures, for example of mature cells and of progenitor cells. These cells are typically representative of the composition of the tissue or construct to be reconstituted.
  • step b ' aims to increase the number of cells to facilitate the constitution of tissue. It can be performed for a variable period of time, for example from 1 to 10 days, or more, depending on the cell type, the quantity of cells available, etc.
  • the culture medium used is typically a basic culture medium as described below (possibly supplemented with ascorbic acid or a similar molecule), which can be changed 2 or 3 times per week depending on the state of proliferation cells.
  • the culture is treated to detach the adherent cells, for example by means of trypsin.
  • the duration of the passage in the oven which follows and allows the detachment of the fabric will be more or less long. For example, it will be 3 minutes for endothelial cells, 5 minutes for fibroblasts, 8 minutes for keratinocytes, etc. (see examples). During this phase, the cells produce only a small amount of extracellular matrix.
  • the amplified cells thus obtained are then used for the preparation of the construct. To this end, they are sown in a suitable device and cultivated under conditions suitable for the synthesis of an extracellular matrix and for the formation of a construct comprising one or more layers of cells embedded in the endogenous neosynthesized extracellular matrix.
  • the cells are seeded (for example in petri dishes), at a density of between approximately 10 3 and 10 6 cells / cm 2 , preferably between 3.10 3 and 5.10 5 cells / cm 2 , typically between 3000 and 12000 cells / cm 2 . In a typical experiment, approximately 5.10 5 cells are thus used per 75 cm 2 box , for example.
  • the cells are thus cultured for a sufficient time to allow
  • This culture can thus be maintained for 2 to 6 weeks, optionally with gentle stirring, advantageously by renewing the medium 1 to 3 times per week.
  • the cultures are advantageously carried out in a basic culture medium comprising ascorbic acid or a derivative thereof.
  • Ascorbate is added to promote the hydroxylation of praline and the secretion of procollagen, the soluble precursor of collagen, but also because it constitutes an important cofactor of active enzymes at the time of the post-translational phase and upstream regulates the synthesis of type I and III collagens.
  • Ascorbic acid can be replaced by one of its synthetic derivatives or by a nutrient acting on the synthesis of extracellular matrix. Therefore, the method of the invention does not require the use of exogenous matrix.
  • the basic culture media used are media adapted to the cell type (s) and to the tissue or construct to be reconstituted.
  • the culture medium and conditions must stimulate cell growth in constructs and the synthesis of extracellular matrix. It is preferable to choose a medium of known composition, that is to say in particular not comprising an animal organ or tissue extract, although the presence of such undefined compounds is possible if it promotes the obtaining of 'a construct according to the invention.
  • Synthetic or recombinant functional equivalents known to those skilled in the art can also be added to the culture medium of known composition. Those skilled in the art can easily determine the basic compounds necessary for the culture of animal cells.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • RPMI 1640 EDMEM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)
  • Ham media in particular Ham's F-12
  • NCTC 109 NCTC 109.
  • a preferred base medium according to the invention is a DMEM / Ham F12 mixture (50:50 by volume).
  • the medium may contain serum.
  • the basic medium is typically supplemented with in particular compounds such as amino acids and in particular praline and glycine which enter into the structure of collagen, growth factors, hormones and inorganic salts.
  • compounds such as amino acids and in particular praline and glycine which enter into the structure of collagen, growth factors, hormones and inorganic salts.
  • Specific culture media which can be used in the context of the present invention are described in application WO96 / 21003. Other media are described in the examples.
  • Cultures can be carried out in any suitable device, such as a plate, box, flask, pocket, etc. These are typically Petri dishes or the like.
  • the cultures are advantageously kept in an incubator which makes it possible to control temperature, humidity and gas mixtures.
  • Preferred culture conditions are, for example, a temperature between 35 and 40 ° C approximately, preferably 37 ° C approximately, an atmosphere containing from 5 to 10% CO 2 and a relative humidity comprised between approximately 75 and 95%.
  • the tissue thus produced contains cells associated with a dense three-dimensional network of extracellular matrix neosynthesized by said cells.
  • the cells multiply, overlap and manufacture an extracellular matrix whose composition is essentially identical to that of a natural extra-cellular matrix.
  • the cell construct is prepared from cells originating in particular from the tendon or ligament, from the skin or the dermis, it thus comprises, around the third week of culture, a high proportion of collagen concentrated in particular in half of the built whose face is directly in contact with the culture support. It is at this collagen network that mineralization will be initiated.
  • the cells are cultured under conditions ensuring the formation or the maintenance of the capacity of the cells to produce mineralization (or ossification).
  • This capacity can be linked to the cells used, and favored by the culture in the presence of a stimulus activating or increasing the mineralization and / or the ossification of the cells, in particular of the basal progenitor cells.
  • the mineralization of the tissue is surprisingly obtained by modifying the culture conditions. This mineralization concerns the neosynthesized matrix and in particular the constituent matrix of half of the construct in contact with the culture support.
  • Stimulation can be obtained by bringing the construct or the cells into contact with a particular material or with particles of this material, by adding differentiation factor (s), conditioned medium, synthetic substances or even by addition of natural substances such as coral or by mechanical stimulation.
  • differentiation factor s
  • conditioned medium synthetic substances
  • synthetic substances such as coral or by mechanical stimulation.
  • mineralizing materials there may be mentioned in particular a support or particles comprising hydroxyapatite, bioactive glass (or bio-glass), a mineralized collagen substitute, a bone substitute, a ceramic, in particular based on zirconium, or coral, or any material (for example a composite material) whose surface is coated, at least in part, with one of these components.
  • the mineralizing material can also be produced from an inert bio-activated material by the grafting on the surface of substances capable of inducing the mineralization of the construct.
  • substances or factors which can be used there may be mentioned for example adjuvants incorporated into the culture medium and reinforcing the stimulating effect of the mineralization created by the chosen support (cytokine, dexamethasone, beta-glycerophosphate, beta-aminopropionitrile )
  • the invention therefore comprises a method of preparing a mineralized or mineralizing cell construct, comprising a step of bringing the cells into contact with a stimulus such as a support or mineralizing material, particles of this material, differentiating factors, cytokines, a conditioned medium, a synthetic substance or a natural substance, stimulating the mineralization or the mineralization capacity of cells.
  • a stimulus such as a support or mineralizing material, particles of this material, differentiating factors, cytokines, a conditioned medium, a synthetic substance or a natural substance, stimulating the mineralization or the mineralization capacity of cells.
  • the stimulus is caused by a support or mineralizing material, advantageously comprising hydroxyapatite or bio-glass.
  • the hydration of bio-glass causes its absorption, and this type of support is therefore particularly suitable and advantageous when the tissue to be reconstituted is intended to be grafted, since ultimately only the graft remains in the recipient host.
  • a particular object of the invention therefore resides in a process for the preparation of a reconstructed cellular construct or tissue, comprising the in vitro culture of cells under conditions ensuring the synthesis of extracellular matrix and mineralization. It is advantageously a culture in the presence of a stimulus, such as a support, agent or mineralizing treatment, advantageously a culture on a mineralizing support or in the presence of mineralizing particles.
  • a stimulus such as a support, agent or mineralizing treatment
  • Obtaining a construct according to the invention having zones of mineralization does not require the addition of growth factor, such as for example TGF- ⁇ 1.
  • a particular subject of the invention also relates to a cellular construct or tissue, characterized in that it is capable of being obtained by a process comprising the in vitro culture, in the absence of a synthetic matrix or framework, of cells in conditions ensuring the formation of a construct comprising one or more layers of cells embedded in an endogenous extracellular matrix, and under conditions stimulating mineralization or ossification.
  • Mineralization is generally carried out or initiated at the same time as the stage of construction of the construct and synthesis of the extracellular matrix. However, mineralization generally continues after the recovery of the construct and / or its artificial thickening.
  • a particular object of the invention therefore consists in placing the culture cells in the presence of mineralizing agents, for example micro or nanoparticles of bio-glass or hydroxyapatite, from the start of the culture. These agents promote the migration of progenitor cells and stimulate their capacity for mineralization and / or ossification. Such mineralization and / or ossification particularly advantageously improves the integration of the reconstituted tissue or cell construct within the tissues of the receiving host.
  • mineralizing agents for example micro or nanoparticles of bio-glass or hydroxyapatite
  • the mineralization can be observed by coloring using, for example, paragon or via von Kossa staining.
  • periodontal cells seeded at the rate of approximately 5000 cells / cm 2 can thus be cultured for approximately three weeks, in the presence of hydroxyapatite microparticles (see FIG. 5).
  • the cells in culture recognize the stimulus and produce specific enzymes of the alkaline phosphatase type.
  • Phosphate substrates such as, for example, ⁇ -glycerophosphate will be hydrolyzed. They thus release phosphates capable of causing partial crystallization of the tissue by complexing with calcium ions to give calcium phosphate.
  • the fabrics or constructs can be manufactured in any suitable device, such as a plate, box, flange, pocket, etc. These are typically Petri dishes or the like.
  • the preparation is carried out in the absence of a synthetic three-dimensional matrix or framework.
  • a particular object of the invention resides in a process for the preparation of a reconstructed construct or tissue, comprising the in vitro culture of cells derived from periodontal or cruciate ligament, under conditions ensuring the synthesis of extracellular matrix.
  • the construct Once the construct has been produced, it can be recovered from the support by any known technique, typically by detachment.
  • One of the characteristics of the invention resides in fact in the ease of recovery of the cell construct reconstituted by simple detachment of said construct from its culture support.
  • the construct or fabric thus recovered can be treated (eg, compacted) in order to increase its thickness, typically by folding, winding, hoarding, etc.
  • the thickness of the cell construct corresponds to approximately 2 or 3 layers of cells stacked on top of each other, ie approximately 30 ⁇ m.
  • the cells are in fact generally maintained in culture until they have secreted a sufficient quantity of matrix to ensure minimal resistance to the cell construct. It is then possible to detach the cell construct from its culture support without it tearing, and to produce a cell construct having an increased thickness, for example from two to five times compared to a thin cultivated construct.
  • a particular object of the invention also relates to cell constructs or tissues, characterized in that they are capable of being obtained by a process comprising the in vitro culture, in the absence of a synthetic matrix or framework, of cells in conditions ensuring the formation of a construct comprising one or more layers of cells embedded in an endogenous extracellular matrix, and a step of detaching the construct from its culture support, folding or rolling the construct onto itself, making it possible to produce a reconstituted tissue having increased thickness.
  • Another particular object of the invention also relates to cellular constructs or tissues, characterized in that they are capable of being obtained by a process comprising the in vitro culture, in the absence of synthetic matrix or framework, of cells of periodontal or anterior ligament crossed under conditions ensuring the formation of a construct comprising one or more layers of cells embedded in an endogenous extracellular matrix, and, preferably, a step of detaching the construct from its culture support, folding or rolling of the built on itself, making it possible to produce a reconstituted tissue having an increased thickness.
  • constructs according to the invention can be maintained in culture for a variable period, typically in the presence of medium, to promote cell reorganization, the continuation of mineralization, etc. Constructed or tissues can then be used for clinical (graft, implant) or pharmaceutical applications.
  • constructs or tissues according to the invention can be stored in any suitable device, in the presence of culture medium, nutritive medium or isotonic saline solutions.
  • the tissues are preserved or maintained in boxes, tubes, flasks, ampoules, bags, etc., preferably in the presence of a large amount of medium.
  • the fabrics can be used extemporaneously or stored, preferably in the cold.
  • constructs or tissues described above can be used in the field of transplants or implantology as well as in the pharmaceutical industry, for the study of tissues and the analysis of the toxic or beneficial profile of molecules, in particular of drugs. candidates.
  • a tissue or construct according to the invention can thus be used in the field of transplants or implantology.
  • the fabric or construct is preferably in this case of substantial thickness, typically of approximately 100 ⁇ m. It can thus advantageously be a compacted construct, eg folded or rolled on itself so as to increase its thickness by fusion and reshaping of the different cellular layers as described above, or simply detached from the support to form a cell cluster.
  • the constructs of the invention can be used as such, in the form of dressings or cellular "patches", or to coat or cover all or part of an implant intended to be introduced into a subject.
  • the tissue or cell construct according to the invention can be directly used in the context of a transplant.
  • the invention indeed proposes the production of a cell dressing, essentially comprising a cell mass as defined above.
  • An object of the invention therefore resides in particular in a pharmaceutical composition comprising a construct or tissue as described above. It is advantageously a thick or compacted fabric as described above.
  • the dressing can be applied directly to a cavity or to injured tissue during simple surgical operations.
  • the dressing of the invention can be used in the context of the treatment of periodontal pockets.
  • ligament cells it is possible to reconstitute or repair a ligament such as the anterior cruciate ligament for example.
  • a graft can also be directly envisaged at the level of the site reached by the receiving host.
  • the invention therefore also provides a method of tissue treatment or repair, comprising the preparation of a tissue reconstituted by in vitro culture as described above, and the injection of this tissue, optionally after packaging in any acceptable solution or vehicle on the pharmaceutical plan.
  • the tissue can possibly be associated with an exogenous matrix, such as collagen.
  • the fabric or construct of the invention is used for the preparation of an implant, in particular for covering or coating all or part of an implant.
  • an implant can be a dental implant (cf.: example 4 relating to the "ligaplant"), ligament, a bone or cartilaginous prosthesis, etc.
  • the construct produced is typically arranged or wrapped around the structure of the implant.
  • a dental implant can for example comprise a coronary part on which the crown of the tooth to be replaced will be fixed and a radicular part corresponding to the root of said tooth and around which it is possible to roll a cell construct according to the invention.
  • the present invention therefore relates to a method of preparing an implant using a construct as described above, comprising winding said construct on the surface of the implant and culturing said implant associated with said constructed under conditions making it possible to maintain or stimulate the proliferation and / or differentiation of cells while promoting the fusion and remodeling of the different cellular layers of said construct on the surface of the implant.
  • This construct can in particular be reconstructed from periodontal cells cultivated for approximately three weeks under the conditions indicated above (see also Figure 4).
  • the mineralized face of the cell construct which corresponds to that exposed to the culture support is then exposed directly to the implant, in an amplification medium and in the presence of ascorbic acid.
  • This face of the cell construct then allows the entire construct to adhere to the implant in a stable, solid and particularly advantageous manner, in particular thanks to the progenitor cells which will increase in number around said implant and will facilitate the mineralization initiated by the matrix and the collagen network.
  • the structure thus reconstituted is then very close to the natural cement of the tooth.
  • the amplification medium facilitates the fusion and the reshaping of the different cellular layers of the construct, insofar as no nutritional limit is imposed.
  • the mineralized tissue according to the invention thus generally improves the integration of the implant in the recipient alveolar site.
  • a construct according to the invention can therefore be used to prepare a dental or ligament implant for example.
  • tissue or cell construct for the study of tissues and the analysis of the toxic or beneficial profile of molecules.
  • the reconstituted tissues of the invention (or a part thereof) are brought into contact with one or more test compounds, and the effect of said test compound is determined, for example so to characterize the cellular reactions with regard to this or these test compounds.
  • the test compound can be very varied in nature. Thus, it can be an isolated compound or a mixture of substances.
  • the compound can be chemical or biological in nature. It may especially be a peptide, polypeptide, nucleic acid, lipid, carbohydrate, a chemical molecule, plant extracts, combinatorial banks, etc.
  • the test compound can also be a treatment applied to tissues (radiation, UV, etc.).
  • test compound can be applied at different concentrations, chosen by the user.
  • the present invention therefore relates to the use of a reconstituted tissue as defined above, for the evaluation (in vitro or ex vivo) of the biological and / or toxic properties of a test compound, in particular of molecules intended for therapeutic use.
  • kits for the implementation of the preparation and study processes and also for the use of the reconstituted tissues as described above advantageously include a container and / or culture reagents, and / or a tissue construct as defined above.
  • Figure 1 Cells extracted from a periodontal ligament seeded at 5000 cells / cm 2 on D2 (A) after three weeks of culture (B). The cells multiply, overlap and synthesize the extra-cellular matrix.
  • Figure 2 Macroscopic appearance of a construct after three weeks of static culture in a 100 mm diameter petri dish.
  • Figure 3 Mineralized tissue. The Paragon coloration makes it possible to visualize the mineralization deposits.
  • Figure 4 Dental implant and association of a tissue according to the invention with the dental implant.
  • FIG. 5 Tissue mineralized by the addition of hydroxyapatite for the treatment of periodontal pockets. Periodontal cells are cultured in the presence of micro-particles of hydroxyapatite for three weeks. The neosynthesized collagen matrix contains deposits of mineralization (von Kossa coloration).
  • FIG. 6 Histological section (magnification X100) of a construct constructed from cells of the periodontal ligament (cells of the cemento-amelar junction) cultivated on the surface of a support for hydroxyapatite, according to the method of the invention, and implanted under the skin of an athymic mouse (Swiss nu nu) for 12 weeks. The inclusion is carried out in paraffin after demineralization of the sample and the coloring is carried out with Masson trichrome.
  • the tissue structure obtained is comparable to that of a fibrillar cell cement like that which exists on a normal tooth.
  • Figure 7 This figure represents a tissue of a simple sheet, marked by immunohistochemistry to detect type V collagen.
  • the light gray color represents the counterstaining and the dark gray color the marking of type V collagen.
  • Figure 8 This figure represents a fabric identical to that of Figure 7 after being folded or rolled.
  • the profile of the marking thus shows the remodeling (without preserving the polarity of each folding of the fabric).
  • the light gray color represents the counter coloration and the dark gray color the marking of type V collagen.
  • the media and / or products used e.g., vitamin C, ascorbic acid 2-phosphate, collagenase, dexamethasone, etc.
  • vitamins C e.g., vitamin C, ascorbic acid 2-phosphate, collagenase, dexamethasone, etc.
  • These substances are generally sterilized before use.
  • the collagenase A (clostridiopeptidase A) used is a bacterial protease produced by clostridium histolyticum. This protease has specificity for the X-Gly links of the Pro-X-Gly-Pro sequences (X representing a neutral amino acid) found in the collagen triple helices.
  • Collagenase is not inhibited by serum but by EDTA and is activated by calcium. Its optimal pH is between 6 and 8. In lyophilized form, it is stable between +2 and + 8 ° C and in solution between -15 ° and -25 ° C. Collagenase can be reconstituted in buffered solutions, such as PBS, HBSS or DMEM / F12, which contain calcium.
  • Dexamethasone is a glucocorticoid with a PM of 392.5, which increases the level of alkaline phosphatase. It is prepared from a commercial source (Sigma D-2915). The ⁇ -glycerophosphate, whose MW is 216, is hydrolyzed by alkaline phosphatase into phosphate ions, necessary for good mineralization. It is prepared from commercial sources (Sigma G-9891).
  • Antibiotic-free media are prepared 1 or 2 days before use, so that sterility can be checked. They are homogenized and controlled. Antibiotics are added extemporaneously at the time of use of the medium. Bacteriological control is carried out according to conventional methods. Storage is typically between + 2 ° C and + 8 ° C.
  • the dental tissues obtained are kept in a transport medium until they are processed, if possible within 24 hours of receipt.
  • the tissues are then washed 3 times in PBS, in the presence of antibiotics, so as to remove the excess blood.
  • the roots of the teeth are then placed in 60 mm diameter petri dishes, for example with approximately 5 ml of collagenase A (see the paragraph relating to the media).
  • the teeth are scraped with a scalpel from half the root to its lower end, until small fragments of cement and dentin are obtained.
  • the fragments are incubated overnight at 37 ° C (approximately between 16 and 20 hours) in a CO 2 incubator.
  • the cells and the tissue fragments are put in a tube, centrifuged and resuspended in culture medium.
  • the suspension of cells and debris is then reseeded into the extraction petri dish with 4 ml of medium. of culture.
  • the culture medium is changed 2 or 3 times a week depending on the state of proliferation of the cells.
  • the culture is maintained between 10 days and 3 weeks approximately before being ready to be trypsinized.
  • the petri dish should preferably have approximately 50% confluence.
  • the cultured cells are pre-confluent or confluent, they are treated according to the following steps:
  • the culture dish is rinsed with PBS culture, then trypsin-EDTA is added so as to cover the entire culture (approximately 5 ml per 75 cm 2 ).
  • the flanges are placed in the oven at 37 ° C.
  • the time will be more or less long, preferably less than approximately 5 minutes for endothelial cells or fibroblasts, and less than approximately
  • the supernatant is removed and an amount of culture medium is added so as to have a suspension containing 100,000, 1 million or 10 million cells per ml as required.
  • the final suspension can be made at different concentrations as required.
  • the fabric produced contains cells associated with a dense three-dimensional network of extracellular matrix neosynthesized by these same cells.
  • This extracellular matrix is produced following stimulation of cells by ascorbic acid, a synthetic derivative of this product or a nutrient acting on the synthesis of extracellular matrix, without resorting to the addition of exogenous matrix.
  • This fabric is produced in culture devices, porous or not, of various sizes according to the desired dimensions.
  • the fibroblasts are seeded at a density between 3000 and 12000 cells / cm2.
  • the culture medium is changed regularly, for example 3 times a week for 2 to 6 weeks, with or without agitation of the cultures, so as to maintain environmental (physico-chemical) and nutritional conditions favorable to the development of the culture.
  • the cells involved in tissue reconstruction can come from the same cell population or from different cell populations, thus forming a heterogeneous population. They can be periodontal ligament fibroblasts, cementoblasts, odontoblasts, ameloblasts, pulp cells, ligament and tendon fibroblasts, chondrocytes, osteoblasts, mesenchymal stem cells, marrow extracts bone, of any other cell type having the capacity to mineralize in particular under the influence of external factors or a mixture of said cells.
  • the tissue can be composed of several cell types which do not have the capacity to mineralize, but which can be stimulated so as to cause this mineralization. They may for example be skin fibroblasts and / or muscle cells.
  • the tissue can be composed of several cell types at the same time, distributed evenly or not.
  • the mineralization of the tissues can be obtained by modifying the culture conditions so as to cause the mineralization of the neosynthesized matrix.
  • This stimulation can be obtained by contact with a material or particles of this same material and / or by the addition of differentiation factors, cytokines, conditioned medium, dexamethasone, beta-glycerophosphate, beta-aminopropionitrile, by l 'addition of synthetic substances such as calcium phosphate, calcium carbonate, hydroxyapatite, bioactive glass (bioactive glass), ceramics, natural substances of the coral type but also by mechanical stimulation.
  • Obtaining a construct according to the invention having zones of mineralization does not require the addition of growth factor, such as for example TGF- ⁇ 1.
  • EXAMPLE 3 Implantation of a construct in vivo
  • This example describes the in vivo introduction of an implant of the invention comprising a tissue construct.
  • the construct was prepared as described in Examples 1 and 2 from human periodontal ligament (PDL) cells, then wound around a bio-glass implant (45 S 5).
  • the construct was stored in DMEM medium supplemented with antibiotic (gentamycin).
  • antibiotic gentamycin
  • Male athymic mice (Swiss NU / NU 4 weeks) were anesthetized.
  • a subcutaneous implantation, at the dorsal level, was performed. For this, 4 bags are prepared on each mouse, under sterile conditions. The implants are placed in these pockets, which are then sutured. A bandage was placed over the sutured area.
  • mice were sacrificed, and the constructs were recovered with the adjacent tissue of murine origin. The whole was included in resin after fixing. Cups were produced and colored in Paragon. The sections are analyzed, and the constructs obtained are compared with those produced from skin fibroblasts, treated in a similar manner, and with constructs which have not undergone implantation. Histological sections show that the constructs derived from PDL according to the invention and implanted in mice have dense fibrillar structures, similar to those found in a native periodontal ligament. The results obtained also show that the set of fibers is anchored to the surface of the implant by a thick layer of mineralization, of cellular origin. These tissue structures are absent from other preparations.
  • the "Ligaplant” is a product intended to replace a lost tooth in a patient, it associates a ligament reconstituted from the cells of this patient, with an implant produced from a biomaterial.
  • the periodontal ligament is a ligament, which is anchored on the root, mainly by cellular and acellular fibrillar cements. This ligament is also attached to the bone of the alveoli by a fibrillar structure embedded in the bone (Sharpey fibers).
  • the ligament is reconstructed on the surface of an implant, meeting the conditions so that an anchor close to the cementum is synthesized in vitro, before the reimplantation of the product. Restoration of the anchor on the side of the cell will be done once the product is reimplanted. The presence of this newly formed tissue structure guides the healing process, avoiding osseointegration of the implant.
  • Use of the patient's cells to reconstruct the ligament part of the Ligaplant makes it an autologous product.
  • a heterogeneous population is extracted from the surface of the lost tooth by scraping the middle part of the root.
  • This population includes the main cell types of PDL: fibroblasts, cementoblasts, endothelial cells, and progenitors of these different cell types. The presence of these cells is confirmed both by observation under light microscopy, but also by the results of molecular biology analyzes performed on this population directly obtained from the biopsy extracted from the root surface.
  • RT-PCR detection of messenger RNAs coding for alkaline phosphatase, osteocalcin (OCN), osteopontin (OPN), bone sialoprotein (BSP) and type I collagen confirms both this heterogeneity of the population by the diversity of the cellular markers expressed, but also the possibilities, which exist, of reconstruction of the PDL from these cells.
  • OCN osteocalcin
  • OPN osteopontin
  • BSP bone sialoprotein
  • the biopsy collected on the surface of the root of the lost tooth is treated with collagenase, so as to accelerate the extraction of the cells.
  • collagenase neither diminishes the proliferative capacities of the cells nor their capacities to express specific functions (mineralization and production of extra cellular matrix).
  • the cell population is first amplified so as to increase the number of cells harvested. Cell proliferation is maintained at a high level in the exponential phase of the growth curve by repeated passages, performed before the culture reaches confluence.
  • the culture conditions cause a selection of cells: the endothelial cells disappear, in fact they can neither adhere to the support, nor proliferate, while the fibroblasts actively multiply .
  • the presence of cementoblasts is detectable by the level of expression of the mineralization markers which are specific to them.
  • the difference in morphology of the cementoblasts, which made it possible to identify them under the microscope, has disappeared, tending to prove that their shape has evolved into a spindle shape similar to that of fibroblasts.
  • This is a common phenomenon, observed during the culture of cells present in mineralized tissue structures, of the chondrocyte, osteocyte type.
  • this dedifferentiation of cementoblasts seems limited to their morphology. Indeed, the production of mineralization zones, induced in vitro by the addition of ⁇ -glycerophosphate to the culture medium, proves the functionality of these cells.
  • the cells are not peeled but left in the petri dish in the presence of a proliferation medium supplemented with vitamin C to stimulate cellular matrix synthesis extra.
  • a continuous carpet is formed, after 3 weeks of culture, consisting of several layers of cells enclosed in a dense extracellular matrix.
  • the culture is prolonged beyond the confluence so as to induce a significant production of extra cellular matrix.
  • the culture is structured and takes the form of a thick sheet made up of cells inside a dense extracellular matrix.
  • This sheet is detached from the bottom of the box by mechanical means (rolling). It can then be handled, given its good properties mechanical. A 15 cm 2 piece of this sheet is cut using a scalpel. It is wrapped in several layers around the implant (cylinder 5 mm in diameter and 11 mm long) and constitutes the cellular part of the "Ligaplant".
  • the future “Ligaplant” is ready for an ultimate phase of differentiation which should allow the cells to produce a mineral anchor.
  • This phase is obtained by cultivating this construct in an environment favorable to mineralization for 2 weeks.
  • the anchoring of the sheet on the implant is obtained by synthesis of a mineralization of the ECM by the cells, in the presence of a culture medium containing 10 mM of ⁇ -glycerophosphate.
  • the nature of the cell-implant interface guides this mineralization.
  • Calcium phosphate ceramics can thus be used to obtain a direct link with a mineralizing tissue.
  • the cells react on contact with this biomaterial, producing a mineral bonding layer from which a cementum is reconstructed when the product is placed in vivo.
  • the inventors proceeded to the subcutaneous implantation in the skull of nude mice (Swiss nu nu) of sheet constructions -implant.
  • the evolution of these constructions was evaluated in kinetic form, with points taken at 4, 8 and 12 weeks after implantation, by varying different parameters such as the origin of the biopsy (apex, central area of the root, collar), the nature of the material constituting the implant (dentin, hydroxyapatite, titanium coated with calcium phosphate).
  • the intensity of the mineralization of the MEC was measured by appropriate treatments of the histological sections.
  • the results obtained show a gradual evolution over time of the thickness of the mineralized layers present at the interface of hydroxyapatite. As this process develops, collagen fibers embedded in this mineral substrate appear markedly. It is possible to observe in places the presence of cells included in the mineral part. These structural elements are present on the entire cell-biomaterial interface.
  • the conclusions of this histological analysis show that a characteristic tissue of the fibrillar cell cement, with a significant amount of Sharpey fibers, is reconstructed by the PDL cells and constitutes an anchoring of the sheet on the implant.
  • the constituent material As the implant is subjected to heavy loads, the constituent material has been selected to obtain optimal bio-compatibility while retaining a mechanical resistance comparable to that of implants of the “osteo-integrated” type.
  • the material which was chosen to constitute the implant is produced by bio activation of titanium.
  • the naturally produced anchor apatite layer is very thin ( ⁇ 1 ⁇ m), which eliminates the risk of fragile rupture in the layer (71) and preserves the micro-roughness of the implant surface (and therefore the bond mechanical between the metallic and mineral phases).
  • the titanium-apatite bond is a bond of resistant covalent type which constitutes a continuous transition between the 2 phases.

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Abstract

La présente invention concerne un construit cellulaire cultivé in vitro caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont emprisonnées, et en ce qu'il comprend, parmi lesdites cellules, des cellules ayant une capacité de minéralisation et/ou d'ossification. L'invention est particulièrement utile dans le domaine des greffes ou de l'implantologie (reconstitution ou réparation tissulaire), ainsi que dans l'industrie pharmaceutique, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules susceptibles d'entrer en développement pharmaceutique et/ou dans des compositions pharmaceutiques.

Description

CONSTRUITS CELLULAIRES CULTIVES IN VITRO, PREPARATION ET UTILISATIONS
Introduction et état de l'art
La présente invention se rapporte aux domaines techniques de la biologie, de la biotechnologie, de la toxicologie, de la pharmacologie et de la médecine. Ses applications concernent notamment les domaines de la santé humaine et animale. Plus particulièrement, l'invention décrit de nouvelles méthodes de culture et de reconstitution de tissus humains ou animaux in vitro ou ex vivo, typiquement à partir de cellules qui les composent. Ces méthodes permettent de préserver les capacités de différentiation des cellules utilisées tout en orientant cette différentiation dans le sens souhaité. L'invention concerne en outre les construits cellulaires et les tissus ainsi reconstitués, de même que les nombreuses utilisations qu'il est possible d'en faire. Elle porte par ailleurs sur des outils et kits pour la mise en œuvre de ces méthodes.
L'invention est particulièrement utile dans le domaine des greffes ou de l'implantologie (reconstitution ou réparation tissulaire), ainsi que dans l'industrie pharmaceutique, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules susceptibles d'entrer en développement pharmaceutique et/ou dans des compositions pharmaceutiques.
La reconstitution tissulaire combine des méthodes de la bio-ingénierie avec les principes qui régissent les sciences de la vie de manière à comprendre les interconnexions structurales et fonctionnelles des tissus normaux et pathologiques chez les mammifères. L'un des objectifs recherchés est de produire des substituts biologiques pour tester, restaurer, maintenir ou améliorer des fonctions biologiques in vitro ou in vivo, et de produire in vitro des tissus ou construits cellulaires les plus semblables possibles aux tissus natifs que l'on cherche à reconstruire. L'utilisation de cellules d'organismes eucaryotes supérieurs, pour des besoins expérimentaux (études génétiques, études de toxicité, etc.), pharmacologiques ou thérapeutiques (thérapie cellulaire, réparation tissulaire, etc.) a connu un développement très important. Pour ce faire, différentes méthodes d'obtention de cellules ou tissus ont été mises au point, notamment pour la préparation de cultures primaires de cellules, basées essentiellement sur le prélèvement et le traitement ex vivo d'une biopsie.
Des méthodes de reconstitution de tissus (par exemple de vaisseaux) ont été rapportées antérieurement, basées principalement sur l'utilisation d'une membrane poreuse ou d'une charpente synthétique exogène, destinée à supporter et à permettre la culture des cellules du tissu à reconstituer. Par ailleurs, si des cultures tissulaires ont pu être réalisées en l'absence de matrice synthétique ou de membrane poreuse, elles sont essentiellement limitées à des tissus particuliers et ne présentent pas des caractéristiques adaptées à un usage thérapeutique direct.
Description générale de l'invention
Le problème que la présente invention se propose de résoudre consiste à obtenir un construit cellulaire fonctionnel capable de s'intégrer de façon biologique dans les tissus d'un sujet hôte receveur, grâce aux ressources des cellules dudit construit et aux propriétés dudit construit. Des tissus particulièrement avantageux au sens de l'invention sont les tissus capables de se comporter de manière fonctionnelle lorsqu'on les greffe à un hôte receveur, c'est-à-dire de s'incorporer ou s'intégrer de façon durable à l'intérieur de cet hôte et/ou à être progressivement remodelé par les cellules de l'hôte, dans le but de combler, réparer ou restaurer des propriétés défectueuses. Un premier aspect particulier de l'invention concerne des tissus reconstitués ou construits cellulaires comprenant des cellules ayant une capacité de minéralisation et/ou d'ossification.
Un autre aspect de l'invention est relatif à des construits ou tissus cellulaires reconstitués capables de s'incorporer ou de s'intégrer de façon durable à l'intérieur d'un hôte et comprenant des zones de minéralisation et/ou d'ossification.
Les tissus ou construits cellulaires de l'invention peuvent être produits à partir de différents types cellulaires, seuls ou en combinaisons, notamment de cellules de ligament, dent, os, tendon, et comprennent une matrice extracellulaire dans laquelle lesdites cellules sont enrobées.
Un aspect spécifique de l'invention réside dans un tissu reconstitué à partir de cellules de ligament, notamment de ligament parodontal.
Un autre aspect particulier de l'invention est de fournir des tissus reconstitués présentant une épaisseur importante, typiquement supérieure ou égale à 100 μm environ, en particulier dans lesquels les cellules et la matrice sont organisées fonctionnellement.
D'une manière générale, la présente invention concerne des tissus (ou construits) cellulaires reconstitués à partir de cellules animales, de préférence de mammifères, par exemple des cellules humaines, cultivées in vitro sans l'intervention d'une charpente ou matrice synthétique destinée à donner sa tenue au tissu. Les construits cellulaires peuvent ainsi avantageusement être réalisés uniquement à l'aide de cellules animales, de préférence mammifères, par exemple des cellules humaines, et de composants de matrice extracellulaire endogène (Le., produits par ces cellules).
Un autre aspect de l'invention réside dans une composition thérapeutique comprenant un tissu cellulaire reconstitué tel que défini ci-avant. L'invention fournit en particulier des pansements cellulaires (ou pansements bio actifs) comprenant un tissu ou amas cellulaire reconstitué tel que défini ci-avant, et destiné à une implantation chez un sujet.
L'invention concerne également des méthodes de traitement ou de réparation tissulaire, comprenant la préparation d'un tissu reconstitué et son implantation à un sujet, dans un contexte autologue, allogénique ou xénogénique, de préférence dans un contexte autologue.
L'invention est utilisable pour le traitement ou la réparation de défauts tissulaires chez des sujets, pour la préparation d'implants, pour la réalisation d'essais in vitro ou ex vivo, etc.
Description détaillée de l'invention
La présente invention concerne des construits cellulaires préparés in vitro, leur production et leurs utilisations.
Un objet particulier de l'invention concerne plus spécifiquement un construit cellulaire caractérisé en ce qu'il comprend :
(i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont emprisonnées, et en ce qu'il comprend, parmi lesdites cellules, des cellules ayant une capacité de minéralisation et/ou d'ossification.
Au sens de la présente invention, le terme « construit » ou « construit cellulaire » désigne un amas ou tissu cellulaire en forme de construit étalé. Il peut s'agir d'un amas ou tissu comprenant une ou plusieurs couches de cellules superposées les unes aux autres, typiquement de 1 à 20 couches de cellules, préférentiellement de 2 à 15 couches environ. Les cellules du construit sont enrobées dans un réseau tridimensionnel dense de matrice extracellulaire synthétisée par les propres cellules du construit, et qui donne sa structure et sa tenue au construit de l'invention. Le terme construit désigne, de manière générale, un construit tissulaire artificiel (c'est-à-dire notamment fabriqué, cultivé ou maintenu in vitro) comprenant une ou plusieurs couches de cellules cultivées in vitro, enrobées dans une matrice extracellulaire produite par lesdites cellules, des cellules du construit étant biologiquement actives, Le., susceptibles de division, prolifération, remodelage, libération de facteurs biologiques, etc. Selon l'origine des cellules et les conditions de culture, le construit présente généralement une polarité, avec une face basale et une face apicale ayant des propriétés différentes.
Minéralisation
Une caractéristique particulièrement avantageuse des tissus ou construits cellulaires reconstitués selon l'invention réside dans le fait qu'ils peuvent comprendre des cellules ayant conservé une capacité de minéralisation et/ou d'ossification. La présente demande montre en effet qu'il est possible de reconstituer artificiellement des tissus ou construits possédant la capacité de minéralisation, créant ainsi des zones minéralisées. Cet aspect de l'invention est particulièrement inattendu et important, puisqu'il permet la construction de tissus ayant des propriétés biologiques adaptées à la reconstitution de défauts et/ou possédant des propriétés d'intégration dans un hôte fortement améliorées.
Au sens de l'invention, on entend par cellules ayant la capacité de produire une minéralisation/ossification, des cellules produisant, naturellement ou après stimulation particulière, une activité enzymatique catalysant la formation et/ou l'accumulation, dans la matrice extra-cellulaire, de phosphate de calcium ou de carbonate de calcium ou d'un mélange de ces différents ions, typiquement sous forme de particules, dépôts, plaques, etc. Il s'agit typiquement de cellules produisant, dans les conditions de culture, la phosphatase alcaline et/ou les protéines complémentaires (BMP, BSP, OPN, OCN, etc.), permettant ainsi la production de phosphate inorganique. L'invention montre que des construits peuvent être réalisés à partir d'expiants, dans lesquels des cellules conservent la capacité de fabriquer des zones minérales, malgré les étapes de culture et/ou de traitement réalisées.
Cette minéralisation conduit généralement à la création d'une face minéralisée et/ou ossifiée du construit cellulaire, qui correspond généralement à celle exposée au support de culture. Comme il sera décrit dans la suite du texte, cette face est également la plus riche en collagène. En effet la minéralisation s'effectue au milieu de fibres de collagène présentes dans le construit, permettant ainsi un ancrage solide de ces dernières dans les dépôts de minéralisation. En outre, les cellules progénitrices augmentent en nombre à proximité du support de culture et facilitent la minéralisation initiée par la matrice et le réseau collagénique.
Cette caractéristique de l'invention est particulièrement importante et avantageuse pour la réalisation de construits cellulaires de réparation de structures telles que ligaments, tendons, dents, os, articulation, etc., dans la mesure où la production d'une minéralisation favorise l'ancrage des fibres de collagène du tissu dans la couche minéralisée et conduit à un tissu reconstitué plus proche du tissu natif, notamment d'un tissu incluant un cément.
Les cellules minéralisantes des construits de l'invention sont typiquement des cellules du mesenchyme ou des précurseurs de ces cellules. Leur capacité de minéralisation est conservée par les conditions de culture et/ou de traitement des cellules dans le construit, et/ou en raison de l'origine tissulaire particulière de ces cellules.
Composition cellulaire
Comme indiqué ci-avant, les construits ou tissus reconstitués selon l'invention comprennent avantageusement des cellules animales, en particulier des cellules de mammifère, de préférence des cellules humaines. Il peut s'agir de cellules souches indifférenciées ou de cellules dérivées de tissus matures, ou d'une combinaison de telles cellules. Si les cellules sont prélevées dans un tissu mature, il peut s'agir de tout type de cellules capables de produire de la matrice extra-cellulaire et/ou de conserver ou d'acquérir une capacité de minéralisation et/ou d'ossification notamment sous l'influence de facteurs extérieurs. Les cellules impliquées dans la reconstruction du tissu peuvent ainsi provenir de populations cellulaires différentes formant ainsi une population hétérogène.
Il s'agit par exemple de cellules dérivées de tissus matures tels que le muscle, l'os, la dent, le cartilage, le tendon ou le ligament, en particulier la dent et le ligament, notamment le ligament parodontal ou le ligament antérieur croisé. Préférentiellement, lorsque les cellules sont issues du parodonte, elles comprennent, au moins dans les cultures initiales, des cellules du ligament parodontal, des cellules du cément et de la dentine à savoir essentiellement des fibroblastes (environ 80%). Les cellules dérivées du ligament parodontal comprennent typiquement des fibroblastes, des cellules épithéliales, des cémentoblastes, des ostéoblastes et/ou des progéniteurs de ces différents types cellulaires. Lorsqu'elles sont issues de la dent, elles comprennent des odontoblastes, des améloblastes, des cellules pulpaires, des cellules épithéliales, des cémentoblastes et/ou des progéniteurs de ces différents types cellulaires. Il peut encore s'agir d'un prélèvement contenant une majorité de cellules souches indifférenciées dont la différentiation sera orientée par des moyens de culture appropriés. Il peut également s'agir de chondrocytes ou d'ostéoblastes. Ces cellules peuvent avoir pour origine des cellules souches mésenchymateuses et/ou des cellules isolées à partir d'un extrait de moelle osseuse. La présence par exemple de cellules du type ostéoblaste ou chondroblaste ou de précurseurs de celles-ci du type pré-ostéoblaste ou pré-chondroblaste ou encore de cellules extraites de la moelle osseuse n'est néanmoins pas nécessaire pour obtenir un construit selon l'invention présentant notamment des zones de minéralisation et/ou d'ossification.
Le tissu selon l'invention peut être composé d'une seule population cellulaire ou d'une combinaison ou mélange de plusieurs types (ou populations) cellulaires, répartis uniformément ou non au sein du tissu de façon à mimer la composition cellulaire et la structure des tissus natifs. Si différents types cellulaires sont présents, il est préférable que l'un au moins desdits types cellulaires soit capable de minéralisation et/ou d'ossification. Le ou les types cellulaires ne présentant pas de capacité de minéralisation peu(ven)t en outre être stimulé(s) ou transformé (s) de manière à induire une minéralisation et/ou une ossification.
Il est par ailleurs possible d'amener les cellules du construit (par exemple les fibroblastes) à exprimer des composés absents naturellement, par exemple en les exposant à une substance chimique, en exerçant un stimulus physique ou encore en utilisant des méthodes transgéniques.
Les différentes populations cellulaires peuvent être associées au début de la période de culture, par exemple dans un ratio donné, ou encore de façon successive, par exemple par l'association de plusieurs construits.
Un objet particulier de l'invention réside dans un construit cellulaire tel que défini ci-avant, réalisé à partir de (ou comprenant des) cellules de ligament cultivées in vitro, en particulier de ligament parodontal ou antérieur croisé. L'invention montre que des tissus minéralisés artificiels peuvent être fabriqués à partir de ce type de cellules, qui peuvent être remodelés pour produire des construits épais, et qui possèdent une organisation biologique fonctionnelle.
Matrice extracellulaire endogène
Comme indiqué ci-avant, les tissus ou construits selon l'invention comprennent des cellules qui sont noyées ou enrobées ou emprisonnées dans une matrice extra-cellulaire endogène, c'est-à-dire produite par les cellules en culture. La matrice extracellulaire comprend typiquement (et essentiellement) un réseau de fibres de collagène organisées notamment en fibrilles, des protéoglycanes sulfatés, impliqués potentiellement dans la régulation in vivo du diamètre des fibrilles, ainsi que des glycosaminoglycanes (GAG) simples ou sulfatés. Parmi les GAG simples, on trouve typiquement de l'acide hyaluronique (HA) et/ou de la fibronectine et, parmi les GAG sulfatés, on peut trouver notamment de l'acide di-hyaluronique, du di-chondroïtine-O-sulfate, du di- chondroïtine-4-sulfate, du di-chondroïtine-6-sulfate, du di-chondroïtine-4,6- sulfate, du di-chondroïtine-4-sulfate-UA-2S et/ou du di-chondroïtine-6-sulfate- UA-2S. La matrice extracellulaire peut en outre comprendre de la décorine, telle que du biglycane ou du versicane, ainsi que de la ténascine, une glycoprotéine extra-cellulaire de la matrice que l'on trouve en particulier dans le mesenchyme ou les tissus en réparation. Il semble que les cellules en culture remplissent progressivement l'espace qui les sépare avec une matrice lâche riche en collagène de type III et en fibronectine puis remodèlent cette matrice avec du collagène de type I de manière à la rendre plus dense.
Il n'est pas nécessaire que la composition exacte de la matrice extracellulaire soit connue, pour une mise en œuvre de l'invention. Typiquement, le construit comprend des cellules ayant la capacité de synthétiser une matrice extra-cellulaire endogène, dont la composition est semblable à celle que l'on trouve dans le tissu d'origine, sauf modifications volontaires (e.g., incorporation de matériaux synthétiques, modification génétique des cellules, etc.).
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un construit tel que défini ci-avant comprenant une couche basale et une couche apicale par rapport au support de culture, ladite couche basale étant riche en collagène et comprenant en outre des fibroblastes et des cellules progénitrices à l'origine de la minéralisation et/ou de l'ossification et ladite couche apicale étant moins riche en collagène que ladite couche basale, et comprenant typiquement plus de cellules prolifératives.
Dimensions du construit
Les construits selon l'invention peuvent être de dimensions variables, tant en surface qu'en épaisseur. En outre, ils peuvent avoir ou prendre des formes variées. Les dimensions et la forme peuvent être adaptées par l'homme du métier ou par l'utilisateur, en fonction des applications recherchées.
Une caractéristique particulière avantageuse des construits ou tissus selon l'invention réside dans leur épaisseur importante, comprise typiquement entre 30 et 120 microns, préférentiellement entre 50 à 120 μm, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à environ 100 μm. La présente demande montre en effet qu'il est possible de réaliser des construits cellulaires in vitro présentant une épaisseur élevée, dans lesquels les cellules sont capables de s'organiser, de se différencier et de proliférer, pour créer une polarité fonctionnelle dans le construit sans entraîner de nécrose cellulaire particulière.
Cette caractéristique est avantageuse car elle fournit un tissu reconstitué dans lequel les cellules s'organisent et développent des propriétés biologiques avantageuses. Ainsi, du fait de l'épaisseur accrue du tissu, les cellules ont un comportement différent. En particulier, la diffusion endogène globale de substances au sein du tissu, et donc dans l'environnement des cellules est diminuée, ce qui augmente l'effet potentiel des cellules et conduit à leur réorganisation et à leur remodelage. Cette organisation favorise en outre l'apparition d'une minéralisation, la polarisation du tissu, l'expression d'une couche proliférative sur la face apicale, la tenue du construit et/ou son intégration chez un sujet.
L'épaisseur du construit peut être modulée de différentes manières. Préférentiellement, elle est obtenue artificiellement, par exemple par repliement ou roulage sur lui-même d'un construit plus mince, de manière à augmenter son épaisseur par fusion et remodelage des différentes couches cellulaires. L'invention montre en effet qu'il est possible de compacter un premier construit tissulaire comportant environ 3 couches de cellules obtenues par culture, et que ce compactage (e.g., pliage, enroulement, etc.) conduit à un tissu dans lequel les cellules s'organisent, se différencient, et développent des propriétés biologiques avantageuses. L'invention montre également qu'il est possible de découper un tissu ou construit en parcelles qui peuvent ensuite être repliées ou roulées sur elles-mêmes. L'épaisseur peut également être augmentée artificiellement par un décollement des bords du construit qui provoque la rétractation de ce dernier et le compactage des cellules.
A cet égard, un objet particulier de l'invention réside également dans un construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 μm environ.
De manière plus particulière, le construit comporte ou est réalisé à partir de cellules présentant une capacité de minéralisation, et/ou comporte ou est réalisé à partir de cellules de ligament, tendon, dent ou os.
Un objet plus particulier de l'invention réside ainsi dans un construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à partir de ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 μm environ.
Un autre objet plus préféré de l'invention réside ainsi dans un construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à partir de ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 μm environ et en ce qu'il comporte des cellules présentant une capacité de minéralisation et/ou des zones minéralisées. Typiquement, le construit comporte une couche (face) basale et une couche (face) apicale, la couche basale étant riche en collagène et en zone minéralisée.
Comme indiqué, la surface du construit ou tissu peut être adaptée par l'homme du métier en faisant varier la quantité de cellules ensemencées, la durée de la culture, les dimensions du dispositif de culture, etc. En outre, comme indiqué, des parcelles de construit peuvent être découpées, possédant une forme adaptée à l'utilisation ultérieure du construit, par exemple rectangulaire, carrée, circulaire, etc., et une surface également adaptée à ladite utilisation, par exemple comprise entre 1 et 20 cm2, de préférence entre 1 et 15 cm2, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 cm2.
Préparation
Les tissus ou construits selon l'invention peuvent être produits de différentes façons. Selon un mode particulièrement préféré, qui constitue également un objet de la présente demande, les construits cellulaires sont préparés par une méthode comprenant typiquement: a) la culture de cellules d'intérêt dans des conditions adaptées à la synthèse d'une matrice extra-cellulaire et à la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans la matrice extracellulaire endogène néosynthétisée, et b) la récupération du construit.
Cette méthode peut en outre comprendre préalablement aux étapes a) et b), les étapes a') et b') suivantes : a') l'extraction des cellules d'intérêt d'un ou de plusieurs tissus, par tout moyen approprié, par exemple par digestion enzymatique, traitement mécanique, explant, etc., et b') l'amplification desdites cellules extraites durant l'étape a') dans un milieu approprié, typiquement en présence d'acide ascorbique ou d'un dérivé dudit acide.
La méthode peut par ailleurs comprendre en outre une étape c) de récupération du construit cellulaire (par exemple par décollement) et une étape d) d'augmentation artificielle de l'épaisseur dudit construit, notamment par repliement (par exemple par repliements successifs), roulement du construit sur lui-même ou rétractation du construit.
Dans l'étape a'), les cellules peuvent être extraites du tissu choisi par tout moyen approprié, par exemple par digestion enzymatique (e.g., collagénase) ou grâce à l'utilisation d'une technique d'expiant connue de l'homme du métier. Il peut s'agir d'une dissection mécanique (e.g., scalpel), d'une lavage enzymatique, d'une concentration cellulaire, d'un découpage mécanique (e.g., ciseaux), etc. Les cellules ainsi extraites sont généralement constituées d'une population de cellules de natures variées, par exemple de cellules matures et de cellules progénitrices. Ces cellules sont typiquement représentatives de la composition du tissu ou construit à reconstituer.
Les cellules ainsi obtenues sont ensuite mises en suspension dans du milieu de culture, pour la réalisation de l'étape b') d'amplification (ou d'expansion ou de prolifération). Cette étape vise essentiellement à augmenter le nombre de cellules pour faciliter la constitution du tissu. Elle peut être réalisée pendant une période de temps variable, par exemple de 1 à 10 jours, ou plus, selon le type cellulaire, la quantité de cellules disponibles, etc. Le milieu de culture utilisé est typiquement un milieu de culture de base tel que décrit ci-après (éventuellement supplémenté d'acide ascorbique ou d'une molécule similaire), qui peut être changé 2 ou 3 fois par semaine selon l'état de prolifération des cellules. A l'issue de cette étape, lorsque les cellules sont à confluence ou approximativement à 50 % de confluence, la culture est traitée pour décoller les cellules adhérentes, par exemple au moyen de trypsine. Selon le type de cellule ou l'état de confluence, la durée du passage à l'étuve qui suit et permet le décollement du tissu, sera plus ou moins longue. Elle sera par exemple de 3 minutes pour des cellules endothéliales, de 5 minutes pour des fibroblastes, de 8 minutes pour des kératinocytes, etc. (voir exemples). Durant cette phase, les cellules ne produisent qu'une faible quantité de matrice extra-cellulaire.
Les cellules amplifiées ainsi obtenues sont ensuite utilisées pour la préparation du construit. A cet effet, elles sont ensemencées dans un dispositif adapté et cultivées dans des conditions adaptées à la synthèse d'une matrice extra-cellulaire et à la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans la matrice extracellulaire endogène néosynthétisée.
Typiquement, les cellules sont ensemencées (par exemple dans des boîtes de Pétri), à une densité comprise entre environ 103 et 106 cellules/cm2, de préférence entre 3.103 et 5.105 cellules/cm2, typiquement entre 3000 et 12000 cellules/cm2. Dans une expérience typique, on utilise ainsi environ 5.105 cellules par boîte de 75 cm2, par exemple.
Les cellules sont ainsi cultivées pendant une durée suffisante pour permettre
- la production d'un construit ayant une surface désirée, composé d'une ou plusieurs couches de cellules, typiquement 1 à 3 (soit environ 30 μm d'épaisseur), enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, - l'adhésion du construit au support,
- la prolifération des cellules en surface, et,
- de préférence, de produire ou initier une minéralisation (ou ossification).
Cette culture peut ainsi être maintenue pendant 2 à 6 semaines, éventuellement sous agitation douce, avantageusement en renouvelant le milieu 1 à 3 fois par semaine. Pour assurer la formation d'une matrice extracellulaire, les cultures sont avantageusement réalisées dans un milieu de culture de base comprenant de l'acide ascorbique ou un dérivé de celui-ci. L'ascorbate est ajouté pour promouvoir l'hydroxylation de la praline et la sécrétion du procollagène, précurseur soluble du collagène, mais également parce qu'il constitue un cofacteur important d'enzymes actifs au moment de la phase post- traductionnelle et qu'il régule en amont la synthèse des collagènes de type I et III. L'acide ascorbique peut être remplacé par l'un de ses dérivés synthétiques ou par un nutriment agissant sur la synthèse de matrice extra-cellulaire. De ce fait, le procédé de l'invention ne requiert pas l'utilisation de matrice exogène.
Les milieux de culture de base utilisés sont des milieux adaptés au(x) type(s) cellulaire(s) et au tissu ou construit à reconstituer. Le milieu et les conditions de culture doivent stimuler la croissance cellulaire en construit et la synthèse de matrice extra-cellulaire. Il est préférable de choisir un milieu de composition connue, c'est-à-dire notamment ne comprenant pas d'organe ou d'extrait tissulaire animal, bien que la présence de tels composés non définis soit possible si elle favorise l'obtention d'un construit selon l'invention. Des équivalents fonctionnels synthétiques ou recombinants connus de l'homme du métier peuvent aussi être ajoutés au milieu de culture de composition connue. L'homme du métier peut déterminer facilement les composés de base nécessaires à la culture des cellules animales. Parmi les milieux commerciaux disponibles sur le marché et utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment des milieux qui fournissent des sels inorganiques, une source énergétique, des acides aminés et de la vitamine B tels que le DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium), le MEM (Minimal Essential Médium), le RPMI 1640, l'EDMEM (Iscove's Modified Dulbecco's Médium), les milieux Ham (notamment Ham's F-12) ou NCTC 109. Un milieu de base préféré selon l'invention est un mélange DMEM/Ham F12 (50 :50 en volume). Le milieu peut contenir du sérum. Le milieu de base est typiquement complété avec notamment des composés tels que des acides aminés et en particulier de la praline et de la glycine qui rentrent dans la structure du collagène, des facteurs de croissance, des hormones et des sels inorganiques. Des milieux de culture spécifiques utilisables dans le cadre de la présente invention sont décrits dans la demande WO96/21003. D'autres milieux sont décrits dans les exemples.
Les cultures peuvent être réalisées dans tout dispositif approprié, tel que plaque, boite, flasque, poche, etc. Il s'agit typiquement de boites de Pétri ou similaires. Les cultures sont avantageusement maintenues dans un incubateur qui permet de contrôler température, humidité et mélanges gazeux. Des conditions de culture préférées sont par exemple une température comprise entre 35 et 40°C environ, de préférence 37°C environ, une atmosphère contenant de 5 à 10% CO2 et une humidité relative comprise entre environ 75 et 95%.
Le tissu ainsi fabriqué contient des cellules associées à un réseau tridimensionnel dense de matrice extra-cellulaire néosynthétisée par lesdites cellules. Durant cette étape, et en réponse à la stimulation des cellules par l'acide ascorbique ou par un dérivé de cet acide, les cellules se multiplient, se superposent et fabriquent une matrice extra-cellulaire dont la composition est essentiellement identique à celle d'une matrice extra-cellulaire naturelle. Lorsque le construit cellulaire est préparé à partir de cellules issues notamment de tendon ou de ligament, de la peau ou du derme, il comprend ainsi, aux environs de la troisième semaine de culture, une forte proportion de collagène concentrée en particulier dans la moitié du construit dont la face est directement en contact avec le support de culture. C'est au niveau de ce réseau de collagène que la minéralisation va être initiée.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, les cellules sont cultivées dans des conditions assurant la formation ou le maintien de la capacité des cellules à produire une minéralisation (ou une ossification). Cette capacité peut être liée aux cellules utilisées, et favorisée par la culture en présence d'un stimulus activant ou augmentant la minéralisation et/ou l'ossification des cellules, notamment des cellules progénitrices basales. Dans un mode particulier, la minéralisation du tissu est obtenue de façon surprenante en modifiant les conditions de culture. Cette minéralisation concerne la matrice néosynthétisée et en particulier la matrice constitutive de la moitié du construit en contact avec le support de culture. La stimulation peut être obtenue par mise en contact du construit ou des cellules avec un matériau particulier ou avec des particules de ce matériau, par l'ajout de facteur(s) de différentiation, de milieu conditionné, de substances synthétiques ou encore par l'ajout de substances naturelles telles que du corail ou par stimulation mécanique. Parmi les matériaux minéralisant utilisables, on peut citer notamment un support ou des particules comprenant de l'hydroxyapatite, du verre bioactif (ou bio-verre), un substitut collagénique minéralisé, un substitut osseux, une céramique, notamment à base de zirconium, ou du corail, ou tout matériau (par exemple un matériau composite) dont la surface est revêtue, au moins en partie, de l'un de ces composants. Ainsi, le matériau minéralisant peut être également produit à partir d'un matériau inerte bio-activé par le greffage en surface de substances susceptibles d'induire la minéralisation du construit. Parmi les substances ou facteurs utilisables, on peut citer par exemple des adjuvants incorporés dans le milieu de culture et renforçant l'effet stimulant de la minéralisation crée par le support choisi (cytokine, de la déxaméthasone, du béta-glycérophosphate, du béta-aminopropionitrile)
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention comprend donc une méthode de préparation d'un construit cellulaire minéralisé ou minéralisant, comprenant une étape de mise en contact des cellules avec un stimulus tel qu'un support ou matériau minéralisant, des particules de ce matériau, des facteurs de différenciation, des cytokines, un milieu conditionné, une substance synthétique ou une substance naturelle, stimulant la minéralisation ou la capacité de minéralisation des cellules. De préférence le stimulus est provoqué par un support ou matériau minéralisant, comprenant avantageusement de l'hydroxyapatite ou du bio-verre. A terme, l'hydratation du bio-verre provoque sa résorption, et ce type de support est donc particulièrement adapté et avantageux lorsque le tissu à reconstituer est destiné à être greffé, puisqu'à terme seul le greffon subsiste au sein de l'hôte receveur.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans un procédé de préparation d'un construit ou tissu cellulaire reconstitué, comprenant la culture in vitro de cellules dans des conditions assurant la synthèse de matrice extracellulaire et la minéralisation. Il s'agit avantageusement d'une culture en présence d'un stimulus, tel qu'un support, agent ou traitement minéralisant, avantageusement d'une culture sur un support minéralisant ou en présence de particules mineralisantes. L'obtention d'un construit selon l'invention présentant des zones de minéralisation ne nécessite pas l'ajout de facteur de croissance, tel que par exemple le TGF-β1.
Un objet particulier de l'invention porte également sur un construit ou tissu cellulaire, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou charpente synthétique, de cellules dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et dans des conditions stimulant la minéralisation ou l'ossification.
La minéralisation est généralement réalisée ou initiée en même temps que l'étape de formation du construit et de synthèse de la matrice extracellulaire. Toutefois, la minéralisation se poursuit généralement après la récupération du construit et/ou son épaississement artificiel.
Un objet particulier de l'invention consiste donc à mettre les cellules culture en présence d'agents minéralisant, par exemple de micro ou de nano- particules de bio-verre ou d'hydroxyapatite, dès le début de la culture. Ces agents favorisent la migration des cellules progénitrices et stimulent leur capacité de minéralisation et/ou d'ossification. Une telle minéralisation et/ou ossification améliore de façon particulièrement avantageusement l'intégration du tissu ou construit cellulaire reconstitué au sein des tissus de l'hôte récepteur.
La minéralisation peut être observée par coloration à l'aide par exemple de paragon ou via une coloration von Kossa. A titre d'exemple spécifique, des cellules de parodonte ensemencées à raison d'environ 5000 cellules/cm2, peuvent ainsi être cultivées pendant trois semaines environ, en présence de microparticules d'hydroxyapatite (voir figure 5). Les cellules en culture reconnaissent le stimulus et produisent des enzymes spécifiques de type phosphatase alcaline. Des substrats phosphatés comme par exemple le β- glycérophosphate vont être hydrolyses. Ils libèrent ainsi des phosphates capables de provoquer la cristallisation partielle du tissu en se complexant aux ions calcium pour donner du phosphate de calcium.
Comme indiqué, les tissus ou construits peuvent être fabriqués dans tout dispositif approprié, tel que plaque, boite, flasque, poche, etc. Il s'agit typiquement de boites de Pétri ou similaires. Préférentiellement, la préparation est réalisée en l'absence de matrice ou charpente tridimensionnelle synthétique.
Un objet particulier de l'invention réside dans un procédé de préparation d'un construit ou tissu reconstitué, comprenant la culture in vitro de cellules issues de ligament parodontal ou croisé, dans des conditions assurant la synthèse de matrice extracellulaire.
Une fois le construit produit, il peut être récupéré du support par toute technique connue, typiquement par décollement. Une des caractéristiques de l'invention réside en effet dans la facilité de récupération du construit cellulaire reconstitué par simple décollement dudit construit de son support de culture.
Par ailleurs, dans une étape supplémentaire d), le construit ou tissu ainsi récupéré peut être traité (e.g., compacté) en vue d'augmenter son épaisseur, typiquement par repliement, enroulement, amassement, etc. Généralement, avant qu'elle n'ait été augmentée artificiellement, l'épaisseur du construit cellulaire correspond à environ 2 ou 3 couches de cellules empilées les unes sur les autres, soit environ 30 μm. Les cellules sont en effet généralement maintenues en culture jusqu'à ce qu'elles aient sécrété une quantité suffisante de matrice pour assurer une tenue minimale au construit cellulaire. Il est alors possible de décoller le construit cellulaire de son support de culture sans qu'il ne se déchire, et de produire un construit cellulaire ayant une épaisseur augmentée, par exemple de deux à cinq fois par rapport à un construit mince cultivé.
Un objet particulier de l'invention concerne également des construits ou tissus cellulaires, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou de charpente synthétique, de cellules dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et une étape de décollement du construit de son support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-même, permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.
Un autre objet particulier de l'invention concerne également des construits ou tissus cellulaires, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou charpente synthétique, de cellules de ligament parodontal ou antérieur croisé dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et, de préférence, une étape de décollement du construit de son support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-même, permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.
Les construits selon l'invention peuvent être maintenus en culture pendant une période variable, typiquement en présence de milieu, pour favoriser la réorganisation cellulaire, la poursuite de la minéralisation, etc. Les construits ou tissus peuvent ensuite être utilisés dans le cadre d'applications cliniques (greffe, implant) ou pharmaceutiques.
Conservation/Maintien
Les construits ou tissus selon l'invention peuvent être conservés dans tout dispositif adapté, en présence de milieu de culture, de milieu nutritif ou de solutions salines isotoniques. Typiquement, les tissus sont conservés ou maintenus dans des boites, tubes, flasques, ampoules, poches, etc., préférentiellement en présence d'une quantité importante de milieu. Les tissus peuvent être utilisés extemporanément ou conservés, de préférence au froid.
Utilisations
Les construits ou tissus décrits ci-dessus peuvent être utilisés dans le domaine des greffes ou de l'implantologie ainsi que dans l'industrie pharmaceutique, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules, notamment de médicaments candidats.
Un tissu ou construit selon l'invention peut ainsi être utilisé dans le domaine des greffes ou de l'implantologie. Le tissu ou construit est dans ce cas préférentiellement d'épaisseur importante, typiquement de 100 μm environ. Il peut ainsi s'agir avantageusement d'un construit compacté, e.g., replié ou roulé sur lui-même de manière à augmenter son épaisseur par fusion et remodelage des différentes couches cellulaires comme décrit ci-avant, ou simplement détaché du support pour former un amas cellulaire.
Pour un usage en réparation tissulaire, les construits de l'invention peuvent être utilisés tels quels, sous forme de pansements ou de « patch » cellulaires, ou pour enrober ou recouvrir tout ou partie d'un implant destiné à être introduit chez un sujet. Le tissu ou construit cellulaire selon l'invention peut être directement utilisé dans le cadre d'une greffe. L'invention propose en effet la réalisation d'un pansement cellulaire, comprenant essentiellement un amas cellulaire tel que défini ci-avant. Un objet de l'invention réside donc notamment dans une composition pharmaceutique comprenant un construit ou tissu tel que décrit ci- avant. Il s'agit avantageusement d'un tissu épais ou compacté tel que décrit ci- avant. Le pansement peut être appliqué directement sur une cavité ou sur un tissu lésé, lors d'opérations chirurgicales simples. Par exemple, si le tissu est reconstitué à partir de cellules du parodonte, le pansement de l'invention peut être utilisé dans le cadre du traitement des poches parodontales. S'il s'agit de cellules de ligament, il est possible de reconstituer ou réparer un ligament tel que le ligament croisé antérieur par exemple. Si le tissu est reconstitué à partir de chondrocytes ayant conservé leur capacité de minéralisation et/ou d'ossification, une greffe peut également être directement envisagée au niveau du site atteint de l'hôte récepteur.
L'invention propose donc également une méthode de traitement ou réparation tissulaire, comprenant la préparation d'un tissu reconstitué par culture in vitro comme décrit ci-avant, et l'injection de ce tissu, éventuellement après conditionnement dans toute solution ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Dans ce contexte, le tissu peut éventuellement être associé à une matrice exogène, telle que du collagène.
Dans un autre mode de mise en œuvre, le tissu ou construit de l'invention est utilisé pour la préparation d'un implant, notamment pour recouvrir ou enrober tout ou partie d'un implant. Il peut s'agir d'un implant dentaire (cf. : exemple 4 relatif au « ligaplant »), ligamentaire, d'une prothèse osseuse ou cartilagineuse, etc. Dans ce cas, le construit produit est typiquement disposé ou enroulé autour de la structure de l'implant. Un implant dentaire peut par exemple comprendre une partie coronaire sur laquelle sera fixée la couronne de la dent à remplacer et une partie radiculaire correspondant à la racine de ladite dent et autour de laquelle il est possible de rouler un construit cellulaire selon l'invention. La présente invention concerne donc une méthode de préparation d'un implant à l'aide d'un construit tel que décrit ci-avant, comprenant l'enroulement dudit construit à la surface de l'implant et la mise en culture dudit implant associé audit construit dans des conditions permettant de maintenir ou stimuler la prolifération et/ou la différentiation des cellules tout en favorisant la fusion et le remodelage des différentes couches cellulaires dudit construit à la surface de l'implant.
Ce construit peut en particulier être reconstruit à partir de cellules du parodonte cultivées pendant environ trois semaines dans les conditions indiquées ci-dessus (voir également Figure 4). La face minéralisée du construit cellulaire qui correspond à celle exposée au support de culture est exposée ensuite directement à l'implant, dans un milieu d'amplification et en présence d'acide ascorbique. Cette face du construit cellulaire permet alors à l'ensemble du construit d'adhérer à l'implant de façon stable, solide et particulièrement avantageuse, notamment grâce aux cellules progénitrices qui vont augmenter en nombre autour dudit implant et vont faciliter la minéralisation initiée par la matrice et le réseau collagénique. La structure ainsi reconstituée est alors très proche du cément naturel de la dent. Le milieu d'amplification facilite quant à lui la fusion et le remodelage des différentes couches cellulaires du construit, dans la mesure où aucune limite nutritionnelle n'est imposée. Le tissu minéralisé selon l'invention améliore ainsi globalement l'intégration de l'implant dans le site alvéolaire receveur.
Un construit selon l'invention peut donc être utilisé pour préparer un implant dentaire ou ligamentaire par exemple.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation dans l'industrie pharmaceutique d'un tissu ou construit cellulaire selon l'invention, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules. Dans un mode particulier de mise en œuvre, les tissus reconstitués de l'invention (ou une partie de ceux-ci) sont mis en contact avec un ou plusieurs composés tests, et l'effet dudit composé test est déterminé, par exemple de façon à caractériser les réactions cellulaires à l'égard de ce ou ces composés tests. Le composé test peut être de nature très variée. Ainsi, il peut s'agir d'un composé isolé ou d'un mélange de substances. Le composé peut être de nature chimique ou biologique. Il peut s'agir notamment d'un peptide, polypeptide, acide nucléique, lipide, glucide, d'une molécule chimique, d'extraits végétaux, de banques combinatoires, etc. Le composé test peut également être un traitement appliqué aux tissus (radiations, UV, etc.).
Pour la mise en œuvre du procédé de l'invention, le composé test peut être appliqué à différentes concentrations, choisies par l'utilisateur.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un tissu reconstitué tel que défini ci-avant, pour l'évaluation (in vitro ou ex vivo) des propriétés biologiques et/ou toxiques d'un composé test, notamment de molécules destinées à un usage thérapeutique.
Elle a également pour objet l'utilisation d'un tissu reconstitué tel que défini ci-avant, pour le criblage de molécules destinées à un usage thérapeutique.
La présente demande a également pour objet des kits pour la mise en œuvre des procédés de préparation et d'études et également pour l'utilisation des tissus reconstitués tels que décrits ci avant. De tels kits comprennent avantageusement un conteneur et/ou des réactifs de culture, et/ou un construit tissulaire tel que défini ci-avant.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits plus en détails à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Cellules extraites d'un ligament parodontal ensemencées à 5000 cellules/cm2 à J2 (A) après trois semaines de culture (B). Les cellules se multiplient, se superposent et synthétisent de la matrice extra-cellulaire. Figure 2 : Aspect macroscopique d'un construit après trois semaines de culture statique dans une boîte de pétri de 100 mm de diamètre.
Figure 3 : Tissu minéralisé. La coloration Paragon permet de visualiser les dépôts de minéralisation.
Figure 4 : Implant dentaire et association d'un tissu selon l'invention à l'implant dentaire.
Figure 5 : Tissu minéralisé par l'ajout d' hydroxyapatite pour le traitement des poches parodontales. Des cellules du parodonte sont cultivées en présence de micro-particules d' hydroxyapatite pendant trois semaines. La matrice collagénique néosynthétisée contient des dépôts de minéralisation (coloration von Kossa).
Figure 6 : Coupe histologique (Grossissement X100) d'un construit élaboré à partir de cellules du ligament parodontal (cellules de la jonction cémento- amélaire) cultivées à la surface d'un support d' hydroxyapatite, selon le procédé de l'invention, et implantées sous la peau d'une souris athymique (Swiss nu nu) pendant 12 semaines. L'Inclusion est réalisée dans de la paraffine après déminéralisation de l'échantillon et la coloration est réalisée avec le trichrome de Masson.
On distingue les noyaux des cellules qui apparaissent plus foncés dans la partie appelée « cellules ». Les fibres de collagène (fibres de Sharpey) et les protéines de la matrice minéralisée au contact du support d'hydroxyapatite correspondent à la masse poreuse appelée « HA ».
La structure tissulaire obtenue est comparable à celle d'un cément cellulaire fibrillaire comme il en existe sur une dent normale.
Figure 7 : Cette figure représente un tissu d'un feuillet simple, marqué par immunohistochimie pour détecter le collagène de type V. La couleur gris clair représente la contre-coloration et la couleur gris foncé le marquage du collagène de type V.
Figure 8 : Cette figure représente un tissu identique à celui de la figure 7 après avoir été plié ou roulé. Le profil du marquage montre ainsi le remodelage (sans conservation de la polarité de chaque repliement du tissu). La couleur gris clair représente la contre-coloration et la couleur gris foncé le marquage du collagène de type V.
Exemples
MATERIELS ET METHODES
Les milieux et/ou produits utilisés (e.g., vitamine C, acide ascorbique 2- phosphate, collagénase, déxaméthasone, etc.) sont généralement d'origine commerciale, ou sont disponibles dans le commerce. Ces substances sont généralement stérilisées avant emploi.
Ainsi, la collagénase A (clostridiopeptidase A) utilisée est une protease bactérienne produite par clostridium histolyticum. Cette protease a une spécificité pour les liens X-Gly des séquences Pro-X-Gly-Pro (X représentant un acide aminé neutre) retrouvé dans les triples hélices collagéniques. La collagénase n'est pas inhibée par le sérum mais par l'EDTA et est activée par le calcium. Son pH optimal est situé entre 6 et 8. Sous forme lyophillisee, elle est stable entre +2 et +8°C et en solution entre -15° et -25°C. La collagénase peut être reconstituée dans des solutions tamponnées, telles que le PBS, le HBSS ou le DMEM/F12, qui contiennent du calcium.
La Déxaméthasone est un glucocorticoide de PM de 392,5, qui permet d'augmenter le niveau de phosphatase alkaline. Elle est préparée à partir de source commerciale (Sigma D-2915). Le β-glycérophosphate, dont le PM est de 216, est hydrolyse par la phosphatase alcaline en ions phosphates, nécessaires à une bonne minéralisation. Il est préparé à partir de source commerciale (Sigma G-9891 ).
Pour la préparation et le contrôle des milieux, des aliquots des produits sont décongelés dans un bain-marie et décontaminés, avant d'être entrés sous la hotte à flux laminaire. Ils sont ajoutés stérilement dans le DMEM/F12 liquide.
Les milieux sans antibiotique sont préparés 1 ou 2 jours avant utilisation, afin de pouvoir en contrôler la stérilité. Il sont homogénéisés et contrôlés. Les antibiotiques sont ajoutés extemporanément au moment de l'utilisation du milieu. Le contrôle bactériologique est réalisé selon les méthodes classiques. Le stockage s'effectue typiquement entre +2°C et +8°C.
Milieu de synthèse
Milieu de différentiation
EXEMPLE 1 : Extraction et culture d'un feuillet cellulaire à partir de cellules prélevées sur une racine de dents
Dans cet exemple, l'extraction a été réalisée en suivant les étapes suivantes :
Les tissus dentaires obtenus sont maintenus dans un milieu de transport jusqu'à ce qu'ils soient traités, si possible dans les 24 heures suivant la réception. Les tissus sont ensuite lavés 3 fois dans du PBS, en présence d'antibiotiques, de manière à éliminer l'excès de sang. Les racines des dents sont alors placées dans des boîtes de pétri de 60 mm de diamètre par exemple avec environ 5 ml de collagénase A (voir le paragraphe relatif aux milieux). Les dents sont grattées avec un scalpel à partir de la moitié de la racine jusqu'à son extrémité inférieure, jusqu'à l'obtention de petits fragments de cément et de dentine. Les fragments sont incubés une nuit à 37°C (environ entre 16 et 20 heures) dans un incubateur à CO2. Les cellules et les fragments de tissus sont mis dans un tube, centrifugés et resuspendus dans du milieu de culture. La suspension de cellules et de débris est alors réensemencée dans la boîte de pétri d'extraction avec 4 ml de milieu de culture. Le milieu de culture est changé 2 ou 3 fois par semaine selon l'état de prolifération des cellules. La culture est maintenue entre 10 jours et 3 semaines environ avant d'être prête à être trypsinée. La boîte de pétri doit préférentiellement présenter approximativement 50 % de confluence.
Lorsque les cellules cultivées sont pré-confluentes ou confluentes, elles sont traitées selon les étapes suivantes :
La boîte de culture est rincée avec du PBS culture, puis de la trypsine-EDTA est ajoutée de façon à recouvrir toute la culture (approximativement 5 ml par 75cm2).
Les flasques sont mises à l'étuve à 37°C. Selon le type de cellule ou l'état de confluence, le temps sera plus ou moins long, de préférence inférieur à environ 5 minutes pour des cellules endothéliales ou des fibroblastes, et inférieur à environ
15 ou 10 minutes, pour des kératinocytes. Le décollement des cellules est suivi et/ou contrôlé par observations, par exemple au microscope. La suspension cellulaire est agitée et transférée dans un tube, dont un aliquot d'environ 50μl est prélevé pour numération des cellules. Après centrifugation (environ 10 minutes à
1200 tours/min), le surnageant est éliminé et une quantité de milieu de culture est ajoutée de façon à avoir une suspension contenant 100 000, 1 million ou 10 millions de cellules par ml selon les besoins. La suspension finale peut être faite à différentes concentrations selon les besoins.
EXEMPLE 2 : Production du construit
Le tissu fabriqué contient des cellules associées à un réseau tridimensionnel dense de matrice extracellulaire néosynthétisée par ces mêmes cellules. Cette matrice extracellulaire est produite suite à la stimulation des cellules par l'acide ascorbique, un dérivé synthétique de ce produit ou un nutriment agissant sur la synthèse de matrice extracellulaire, sans avoir recours à l'ajout de matrice exogène. Ce tissu est réalisé dans des dispositifs de culture, poreux ou non, de tailles variées selon les dimensions désirées. Les fibroblastes sont ensemencés à une densité comprise entre 3000 et 12000 cellules/cm2. Le milieu de culture est changé régulièrement, par exemple 3 fois par semaine pendant 2 à 6 semaines, avec ou sans agitation des cultures, de façon à maintenir des conditions environnementales (physico-chimiques) et nutritionnelles favorables au développement de la culture.
Les cellules impliquées dans la reconstruction du tissu peuvent provenir d'une même population cellulaire ou de populations cellulaires différentes formant ainsi une population hétérogène. Il peut s'agir de fibroblastes du ligament parodontal, de cémentoblastes, d'odontoblastes, d'améloblastes, de cellules pulpaires, de fibroblastes des ligaments et tendons, de chondrocytes, d'ostéoblastes, de cellules souches mésenchymateuses, d'extraits de moelle osseuse, de tout autre type cellulaire ayant la capacité de minéraliser notamment sous l'influence de facteurs extérieurs ou d'un mélange desdites cellules. La présence par exemple de cellules du type ostéoblaste ou chondroblaste ou de cellules précurseurs de ces dernières telles que des pré-ostéoblastes ou des pré-chondroblastes ou encore de cellules extraites de la moelle osseuse n'est néanmoins pas nécessaire pour obtenir un construit selon l'invention présentant notamment des zones de minéralisation.
Le tissu peut être composé de plusieurs types cellulaires ne présentant pas de capacité de minéralisation, mais qui peuvent être stimulés de manière à provoquer cette minéralisation. Il peut s'agir par exemple de fibroblastes de la peau et/ou de cellules musculaires.
Le tissu peut être composé de plusieurs types cellulaires à la fois, répartis uniformément ou non.
La minéralisation des tissus peut être obtenue en modifiant les conditions de culture de façon à provoquer la minéralisation de la matrice néosynthétisée. Cette stimulation peut être obtenue par contact avec un matériau ou des particules de ce même matériau et/ou par l'ajout de facteurs de différentiation, de cytokines, de milieu conditionné, de déxaméthasone, de beta- glycérophosphate, beta-aminopropionitrile, par l'ajout de substances synthétiques de type phosphate de calcium, carbonate de calcium, hydroxyapatite, verre bioactif (bioactive glass), de céramiques, de substances naturelles de type corail mais aussi par stimulation mécanique. L'obtention d'un construit selon l'invention présentant des zones de minéralisation ne nécessite pas l'ajout de facteur de croissance, tel que par exemple le TGF-β1.
A l'issue de la culture des cellules prélevées dans l'Exemple 1 , un feuillet est obtenu qui est récupéré par décollement. Le construit est représenté sur les figures 1-5.
EXEMPLE 3 : Implantation d'un construit in vivo
Cet exemple décrit l'introduction in vivo d'un implant de l'invention comprenant un construit tissulaire.
Le construit a été préparé comme décrit dans les exemples 1 et 2 à partir de cellules de ligament parodontal (PDL) humain, puis enroulé autour d'un implant en bio-verre (45 S 5). Le construit a été stocké dans du milieu DMEM additionné d'antibiotique (gentamycine). Des souris mâles athymiques (Swiss NU/NU de 4 semaines) ont été anesthésiees. Une implantation sous-cutanée, au niveau dorsal, a été réalisée. Pour cela, 4 poches sont préparées sur chaque souris, en conditions stériles. Les implants sont placés dans ces poches, qui sont ensuite suturées. Un pansement a été placé sur la zone suturée.
Un mois après l'implantation, les souris ont été sacrifiées, et les construits ont été récupérés avec le tissu adjacent d'origine murine. L'ensemble a été inclus dans de la résine après fixation. Des coupes ont été produites et colorées au Paragon. Les coupes sont analysées, et les construits obtenus sont comparés à ceux produits à partir de fibroblastes de peau, traités de façon similaire, et à des construits n'ayant pas subi d'implantation. Les coupes histologiques montrent que les construits issus de PDL selon l'invention et implantés chez les souris présentent des structures fibrillaires denses, proches de celles que l'on trouve dans un ligament parodontal natif. Les résultats obtenus montrent de plus que l'ensemble de fibres est ancré à la surface de l'implant par une couche de minéralisation épaisse, d'origine cellulaire. Ces structures tissulaires sont absentes des autres préparations.
Ces résultats illustrent les avantages des tissus et méthodes de l'invention, permettant la production de construits ayant des propriétés biologiques avantageuses et compatibles avec un usage in vivo. L'insertion in vivo des construits de l'invention permet de stimuler le recrutement de facteurs exogènes à la biopsie d'origine du construit, et entraîne une maturation du construit contenant des cellules biologiquement actives.
EXEMPLE 4 : Fabrication du « Ligaplant » à partir de cellules autologues
Le « Ligaplant » est un produit destiné à remplacer une dent perdue chez un patient, il associe un ligament reconstitué à partir des cellules de ce patient, à un implant produit à partir d'un biomatériau. Le ligament parodontal est un ligament, qui est ancré sur la racine, principalement, par des céments cellulaire et acellulaire fibrillaires. Ce ligament est aussi rattaché à l'os de l'alvéole par une structure fibrillaire enchâssée dans l'os (fibres de Sharpey). Le ligament est reconstruit à la surface d'un implant, en réunissant les conditions pour qu'un ancrage proche du cément soit synthétisé in vitro, avant la réimplantation du produit. La restauration de l'ancrage du côté de l'alvéole se fera une fois le produit réimplanté. La présence de cette structure tissulaire néoformée oriente le processus de cicatrisation, en évitant l'ostéointégration de l'implant. L'utilisation des cellules du patient pour reconstruire la partie ligamentaire du Ligaplant en fait un produit autologue.
Une population hétérogène est extraite de la surface de la dent perdue par grattage de la partie médiane de la racine. Cette population comprend les principaux types cellulaires du PDL : fibroblastes, cémentoblastes, cellules endothéliales, et progéniteurs de ces différents types cellulaires. La présence de ces cellules est confirmée à la fois par l'observation en microscopie optique, mais aussi par les résultats des analyses de biologie moléculaire pratiqués sur cette population directement issue de la biopsie extraite de la surface radiculaire. La détection par RT-PCR des ARN messagers codant pour la phosphatase alcaline, l'ostéocalcine (OCN), l'ostéopontine (OPN), la bone sialo-protéine (BSP) et du collagène de type I, confirme à la fois cette hétérogénéité de la population par la diversité des marqueurs cellulaires exprimés, mais aussi les possibilités, qui existent, de reconstruction du PDL à partir de ces cellules. Au cours de la phase de prolifération menée pendant le procédé de fabrication du produit, une synthèse importante de collagène de type I prouvant la présence de fibroblastes actifs dans la culture est constatée. Dans le même temps, la phosphatase alcaline et des marqueurs spécifiques de cellules capables de produire une minéralisation de la structure tissulaire (OPN, OCN, BSP) s'expriment.
Ces activités spécifiques sont conservées tout au long du procédé et sont exploitées pour constituer la partie tissulaire du Ligaplant.
La biopsie collectée à la surface de la racine de la dent perdue est traitée par la collagénase, de façon à accélérer l'extraction des cellules. Une étude réalisée par les inventeurs a montré que l'utilisation de la collagénase ne diminue ni les capacités prolifératives des cellules ni leurs capacités à exprimer des fonctions spécifiques (minéralisation et production de matrice extra cellulaire). A l'issue de la phase d'extraction, on se trouve en présence d'une population hétérogène de cellules à la morphologie bien marquée (cellules rondes .cémentoblastes, cellules allongées : fibroblastes). La population cellulaire est d'abord amplifiée de façon à augmenter le nombre des cellules récoltées. La prolifération des cellules est maintenue à un niveau élevé dans la phase exponentielle de la courbe de croissance par des passages répétés, réalisés avant que la culture ne parvienne à confluence. Au cours de cette phase, les conditions de culture (composition du milieu, technique de culture) provoquent une sélection des cellules : les cellules endothéliales disparaissent, en effet elles ne peuvent ni adhérer au support, ni proliférer, alors que les fibroblastes se multiplient activement. La présence des cémentoblastes est détectable par le niveau d'expression des marqueurs de minéralisation qui leur sont spécifiques. La différence de morphologie des cémentoblastes, qui permettait de les identifier sous le microscope, a disparu, tendant à prouver que leur forme a évolué vers une forme en fuseau similaire à celle des fibroblastes. Il s'agit là d'un phénomène courant, constaté lors de la culture de cellules présentes dans des structures tissulaires minéralisées, de type chondrocytes, osteocytes. Cependant cette dédifférenciation des cémentoblastes semble limitée à leur morphologie. En effet, la production de zones de minéralisation, induite in vitro par adjonction de β-glycérophosphate au milieu de culture, prouve la fonctionnalité de ces cellules.
A la fin du 3eme passage, les cellules ne sont pas décollées mais laissées dans la boîte de pétri en présence d'un milieu de prolifération, additionné de vitamine C pour stimuler la synthèse de matrice extra cellulaire. Un tapis continu se forme, après 3 semaines de culture, constitué de plusieurs couches de cellules englobées dans une matrice extra cellulaire dense. Dés qu'un nombre, de l'ordre de 5.105 cellules par cm2 de surface de boite de Pétri, est obtenu, la culture est prolongée au-delà de la confluence de façon à induire une production importante de matrice extra cellulaire. A la fin de cette étape, la culture s'est structurée et prend la forme d'un feuillet épais constitué de cellules à l'intérieur d'une matrice extra cellulaire dense.
Ce feuillet est décollé du fond de la boîte par des moyens mécaniques (roulage). Il peut être alors manipulé, compte tenu de ses bonnes propriétés mécaniques. Un morceau de 15 cm2 de ce feuillet, est découpé à l'aide d'un scalpel. Il est enroulé en plusieurs couches autour de l'implant (cylindre de 5 mm de diamètre et de 11 mm de long) et constitue la partie cellulaire du « Ligaplant ».
Le futur « Ligaplant » est prêt pour une phase ultime de différenciation qui doit permettre aux cellules de produire un ancrage minéral. Cette phase est obtenue en cultivant ce construit dans un milieu favorable à la minéralisation pendant 2 semaines. L'ancrage du feuillet sur l'implant est obtenue par synthèse d'une minéralisation de la MEC par les cellules, en présence d'un milieu de culture contenant 10 mM de β-glycérophosphate. La nature de l'interface cellules-implant guide cette minéralisation. Les céramiques de phosphate de calcium peuvent ainsi être utilisées pour obtenir un lien direct avec un tissu minéralisant. Les cellules réagissent au contact de ce biomatériau en produisant une couche minérale d'accroché à partir de laquelle un cément est reconstruit lorsque le produit est placé in vivo.
Afin de comprendre comment une telle organisation cellulaire pouvait se différencier in vivo, et comment cet ancrage primaire pouvait évoluer vers un cément, les inventeurs ont procédé à l'implantation sous cutanée au niveau du crâne de souris nude (Swiss nu nu) de constructions feuillet -implant. L'évolution de ces constructions a été évaluée sous forme de cinétique, avec des points pris à 4, 8 et 12 semaines après implantation, en faisant varier différents paramètres telle que l'origine de la biopsie (apex, zone centrale de la racine, collet), la nature du matériau constituant l'implant (dentine, hydroxyapatite, titanes revêtus de phosphate de calcium).
Les résultats les plus significatifs ont été obtenus avec un feuillet constitué de cellules extraites d'une biopsie correspondant au PDL de la partie médiane de la racine de la dent, appliquées sur un implant d'hydroxyapatite. Par l'utilisation d'immunomarquage (anticorps spécifiques de composants du tissu humain) les inventeurs ont pu vérifié que les constructions n'étaient pas dénaturées par la présence du tissu murin environnant et qu'elles préservaient leur identité structurale spécifique d'origine. Les marquages effectués permettent d'identifier l'origine des tissus reconstruits après réimplantation. Les inventeurs ont pu constater qu'il existait une limite bien identifiée entre l'implant et les cellules humaines qui lui sont associées et le tissu murin environnant.
L'intensité de la minéralisation de la MEC a été mesurée par des traitements appropriés des coupes histologiques. Les résultats obtenus montrent une évolution progressive en fonction du temps de l'épaisseur des couches minéralisées présentent à l'interface de l'hydroxyapatite. Au fur et à mesure que ce processus se développe apparaissent de façon marquée des fibres de collagène enchâssées dans ce substrat minéral. Il est possible de constater par endroits la présence de cellules incluses dans la partie minérale. Ces éléments structuraux sont présents sur toute l'interface cellules-biomateriau. Les conclusions de cette analyse histologique montrent qu'un tissu caractéristique du cément cellulaire fibrillaire, avec une quantité importante de fibres de Sharpey, est reconstruit par les cellules du PDL et constitue un ancrage du feuillet sur l'implant.
L'implant étant soumis à des charges importantes, le matériau constitutif a été sélectionné pour obtenir la bio-compatibilité optimale tout en gardant une résistance mécanique comparable à celle des implants de type « ostéo- intégrés ». Le matériau qui a été choisi pour constituer l'implant est produit par bio activation du titane.
La couche d'apatite d'ancrage naturellement produite est très fine (~1 μm), ce qui élimine le risque de rupture fragile dans la couche (71) et préserve la micro-rugosité de surface de l'implant (et donc la liaison mécanique entre les phases métalliques et minérales). En outre et du fait du procédé chimique et physiologique d'activation du titane, la liaison titane-apatite est une liaison de type covalente résistante qui constitue une transition continue entre les 2 phases.

Claims

REVENDICATIONS
1. Construit cellulaire cultivé in vitro caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont emprisonnées, et en ce qu'il comprend, parmi lesdites cellules, des cellules ayant une capacité de minéralisation et/ou d'ossification.
2. Construit selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il possède une épaisseur comprise entre 30 et 120 microns, de préférence entre 50 et 120 microns.
3. Construit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules animales sont des cellules de mammifère, préférentiellement des cellules humaines.
4. Construit selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules animales sont des cellules souches indifférenciées et/ou des cellules dérivées de tissus matures.
5. Construit selon la revendication 4, caractérisé en ce que les cellules dérivées de tissus matures sont des cellules issues du muscle, de l'os de la dent, du cartilage, du tendon et/ou du ligament, en particulier du ligament parodontal ou antérieur croisé.
6. Construit selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules dérivées du ligament parodontal comprennent des fibroblastes, des cellules épithéliales, des cémentoblastes, des ostéoblastes et/ou des progéniteurs de ces différents types cellulaires.
7. Construit selon la revendication 4, caractérisé en ce que les cellules souches indifférenciées sont des cellules mésenchymateuses ou des cellules isolées à partir d'un extrait de moelle osseuse.
8. Construit selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une seule population cellulaire ou une combinaison de plusieurs populations cellulaires.
9. Construit selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend dans son épaisseur une couche basale et une couche apicale par rapport au support de culture, ladite couche basale étant riche en collagène et comprenant en outre des fibroblastes et des cellules progénitrices à l'origine de la minéralisation et/ou de l'ossification, et ladite couche apicale étant moins riche en collagène que ladite couche basale.
10. Construit ou tissu cellulaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou de charpente synthétique, de cellules dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et une étape de décollement du construit de son support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-même, permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.
11. Construit ou tissu cellulaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou charpente synthétique, de cellules de ligament parodontal ou antérieur croisé dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et, de préférence, une étape de décollement du construit de son support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-même, permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.
12. Construit ou tissu cellulaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou charpente synthétique, de cellules dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et dans des conditions stimulant la minéralisation ou l'ossification.
13. Construit cellulaire cultivé in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 μm environ.
14. Construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à partir de ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 μm environ.
15. Construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à partir de ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 μm environ et en ce qu'il comporte des cellules présentant une capacité de minéralisation et/ou des zones minéralisées.
16. Procédé de préparation d'un construit cellulaire selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la culture de cellules d'intérêt dans des conditions adaptées à la synthèse d'une matrice extra-cellulaire et à la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans la matrice extracellulaire endogène néosynthétisée, et b) la récupération du construit.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, préalablement aux étapes a) et b), les étapes a') et b') suivantes :
a') l'extraction des cellules d'intérêt d'un ou de plusieurs tissus, et b') l'amplification desdites cellules extraites dans un milieu approprié, typiquement en présence d'acide ascorbique ou d'un dérivé dudit acide.
18. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape c) de récupération du construit cellulaire et une étape d) d'augmentation artificielle de l'épaisseur dudit construit, notamment par repliement, roulement du construit sur lui-même ou rétractation du construit.
19. Procédé selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que les cellules sont cultivées en présence d'un stimulus choisi parmi un support ou matériau minéralisant, des particules de ce matériau, des facteurs de différenciation, un milieu conditionné, une substance synthétique et/ou une substance naturelle.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le support ou matériau minéralisant comprend de l'hydroxyapatite, du bio-verre, un substitut osseux, une céramique, du corail ou un matériau composite dont la surface est revêtue de l'un de ces composés.
21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le support ou matériau minéralisant est produit à partir d'un matériau inerte bio-activé par le greffage en surface de substances susceptibles d'induire la minéralisation du construit.
22. Utilisation d'un construit selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'un implant.
23. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'implant est un implant dentaire ou ligamentaire.
24. Méthode de préparation d'un implant à l'aide d'un construit selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enroulement dudit construit à la surface de l'implant et la mise en culture dudit implant associé audit construit dans des conditions permettant de maintenir ou stimuler la prolifération et/ou la différentiation des cellules tout en favorisant la fusion et le remodelage des différentes couches cellulaires dudit construit à la surface de l'implant.
25. Utilisation d'un construit selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour l'évaluation in vitro de molécules destinées à un usage thérapeutique.
26. Kit pour la préparation d'un construit selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 ou pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 16 à 21 , comprenant un conteneur et des réactifs de culture.
27. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un construit cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, et un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
28. Implant, caractérisé en ce qu'il comporte une partie recouverte d'un construit cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.
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