CA2469611A1 - Construits cellulaires cultives in vitro, preparation et utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un construit cellulaire cultivé in vitro caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules animales cultivées in vitr o dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquell e lesdites cellules sont emprisonnées, et en ce qu'il comprend, parmi lesdites cellules, des cellules ayant une capacité de minéralisation et/ou d'ossification. L'invention est particulièrement utile dans le domaine des greffes ou de l'implantologie (reconstitution ou réparation tissulaire), ain si que dans l'industrie pharmaceutique, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules susceptibles d'entrer en développement pharmaceutique et/ou dans des compositions pharmaceutiques.</S DOAB>

Description

CONSTRUITS CELLULAIRES CULTIVES IN VITRO, PREPARATION ET UTILISATIONS
Introduction et état de l'art La présente invention se rapporte aux domaines techniques de la biologie, de la biotechnologie, de la toxicologie, de la pharmacologie et de la médecine. Ses applications concernent notamment les domaines de la santé
humaine et animale. Plus particulièrement, l'invention décrit de nouvelles méthodes de culture et de reconstitution de tissus humains ou animaux in vitro ou ex vivo, typiquement à partir de cellules qui les composent. Ces méthodes permettent de préserver les capacités de différentiation des cellules utilisées tout en orientant cette différentiation dans le sens souhaité. L'invention concerne en outre les construits cellulaires et les tissus ainsi reconstitués, de même que les nombreuses utilisations qu'il est possible d'en faire. Elle porte par ailleurs sur des outils et kits pour la mise en oeuvre de ces méthodes.
L'invention est particulièrement utile dans le domaine des greffes ou de l'implantologie (reconstitution ou réparation tissulaire), ainsi que dans l'industrie pharmaceutique, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules susceptibles d'entrer en développement pharmaceutique et/ou dans des compositions pharmaceutiques.
La reconstitution tissulaire combine des méthodes de la bio-ingénierie avec les principes qui régissent les sciences de la vie de manière à
comprendre les interconnexions structurales et fonctionnelles des tissus normaux et pathologiques chez les mammifères. L'un des objectifs recherchés est de produire des substituts biologiques pour tester, restaurer, maintenir ou améliorer des fonctions biologiques in vitro ou in vivo, et de produire in vitro des tissus ou construits cellulaires les plus semblables possibles aux tissus natifs que l'on cherche à reconstruire.

2 L'utilisation de cellules d'organismes eucaryotes supérieurs, pour des besoins expérimentaux (études génétiques, études de toxicité, etc.), pharmacologiques ou thérapeutiques (thérapie cellulaire, réparation tissulaire, etc.) a connu un développement très important. Pour ce faire, différentes méthodes d'obtention de cellules ou tissus ont été mises au point, notamment pour la préparation de cultures primaires de cellules, basées essentiellement sur le prélèvement et le traitement ex vivo d'une biopsie.
Des méthodes de reconstitution de tissus (par exemple de vaisseaux) ont été rapportées antérieurement, basées principalement sur l'utilisation d'une membrane poreuse ou d'une charpente synthétique exogène, destinée à
supporter et à permettre la culture des cellules du tissu à reconstituer. Par ailleurs, si des cultures tissulaires ont pu étre réalisées en l'absence de matrice synthétique ou de membrane poreuse, elles sont essentiellement limitées à des tissus particuliers et ne présentent pas des caractéristiques adaptées à un usage thérapeutique direct.
Description générale de l'invention Le problème que la présente invention se propose de résoudre consiste à
obtenir un construit cellulaire fonctionnel capable de s'intégrer de façon biologique dans les tissus d'un sujet hôte receveur, grâce aux ressources des cellules dudit construit et aux propriétés dudit construit. Des tissus particulièrement avantageux au sens de l'invention sont les tissus capables de se comporter de manière fonctionnelle lorsqu'on les greffe à un hôte receveur, c'est-à-dire de s'incorporer ou s'intégrer de façon durable à l'intérieur de cet hôte et/ou à être progressivement remodelé par les cellules de l'hôte, dans le but de combler, réparer ou restaurer des propriétés défectueuses.

3 Un premier aspect particulier de l'invention concerne des tissus reconstitués ou construits cellulaires comprenant des cellules ayant une capacité
de minéralisation et/ou d'ossification.
Un autre aspect de l'invention est relatif à des construits ou tissus cellulaires reconstitués capables de s'incorporer ou de s'intégrer de façon durable à l'intérieur d'un hôte et comprenant des zones de minéralisation et/ou d'ossification.
Les tissus ou construits cellulaires de l'invention peuvent être produits à
partir de différents types cellulaires, seuls ou en combinaisons, notamment de cellules de ligament, dent, os, tendon, et comprennent une matrice extracellulaire dans laquelle lesdites cellules sont enrobées.
Un aspect spécifique de l'invention réside dans un tissu reconstitué à
partir de cellules de ligament, notamment de ligament parodontal.
Un autre aspect particulier de l'invention est de fournir des tissus reconstitués présentant une épaisseur importante, typiquement supérieure ou égale à 100 Nm environ, en particulier dans lesquels les cellules et la matrice sont organisées fonctionnellement.
D'une manière générale, la présente invention concerne des tissus (ou construits) cellulaires reconstitués à partir de cellules animales, de préférence de mammifères, par exemple des cellules humaines, cultivées in vitro sans l'intervention d'une charpente ou matrice synthétique destinée à donner sa tenue au tissu. Les construits cellulaires peuvent ainsi avantageusement être réalisés uniquement à l'aide de cellules animales, de préférence mammifères, par exemple des cellules humaines, et de composants de matrice extracellulaire endogène (i.e., produits par ces cellules).
Un autre aspect de l'invention réside dans une composition thérapeutique comprenant un tissu cellulaire reconstitué tel que défini ci-avant.
L'invention fournit en particulier des pansements cellulaires (ou pansements bio actifs)

4 PCT/FR02/04360 comprenant un tissu ou amas cellulaire reconstitué tel que défini ci-avant, et destiné à une implantation chez un sujet.
L'invention concerne également des méthodes de traitement ou de réparation tissulaire, comprenant la préparation d'un tissu reconstitué et son implantation à un sujet, dans un contexte autologue, allogénique ou xénogénique, de préférence dans un contexte autologue.
L'invention est utilisable pour le traitement ou la réparation de défauts tissulaires chez des sujets, pour la préparation d'implants, pour la réalisation d'essais in vitro ou ex vivo, etc.
Description détaillée de l'invention La présente invention concerne des construits cellulaires préparés in vitro, leur production et leurs utilisations.
Un objet particulier de l'invention concerne plus spécifiquement un construit cellulaire caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ü) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont emprisonnées, et en ce qu'il comprend, parmi lesdites cellules, des cellules ayant une capacité
de minéralisation et/ou d'ossification.
Au sens de la présente invention, le terme « construit » ou « construit cellulaire » désigne un amas ou tissu cellulaire en forme de construit étalé.
II
peut s'agir d'un amas ou tissu comprenant une ou plusieurs couches de cellules superposées les unes aux autres, typiquement de 1 à 20 couches de cellules, préférentiellement de 2 à 15 couches environ. Les cellules du construit sont enrobées dans un réseau tridimensionnel dense de matrice extracellulaire S
synthétisée par les propres cellules du construit, et qui donne sa structure et sa tenue au construit de l'invention. Le terme construit désigne, de manière générale, un construit tissulaire artificiel (c'est-à-dire notamment fabriqué, cultivé
ou maintenu in vitro) comprenant une ou plusieurs couches de cellules cultivées S in vitro, enrobées dans une matrice extracellulaire produite par lesdites cellules, des cellules du construit étant biologiquement actives, i.e., susceptibles de division, prolifération, remodelage, libération de facteurs biologiques, etc.
Selon l'origine des cellules et les conditions de culture, le construit présente généralement une polarité, avec une face basale et une face apicale ayant des propriétés différentes.
Minéralisation Une caractéristique particulièrement avantageuse des tissus ou construits cellulaires reconstitués selon l'invention réside dans le fait qu'ils peuvent comprendre des cellules ayant conservé une capacité de minéralisation et/ou d'ossification. La présente demande montre en effet qu'il est possible de reconstituer artificiellement des tissus ou construits possédant la capacité
de minéralisation, créant ainsi des zones minéralisées. Cet aspect de l'invention est particulièrement inattendu et important, puisqu'il permet la construction de tissus ayant des propriétés biologiques adaptées à la reconstitution de défauts et/ou possédant des propriétés d'intégration dans un hôte fortement améliorées.
Au sens de l'invention, on entend par cellules ayant la capacité de produire une minéralisation/ossification, des cellules produisant, naturellement ou après stimulation particulière, une activité enzymatique catalysant la formation et/ou l'accumulation, dans la matrice extra-cellulaire, de phosphate de calcium ou de carbonate de calcium ou d'un mélange de ces différents ions, typiquement sous forme de particules, dépôts, plaques, etc. II s'agit typiquement de cellules produisant, dans les conditions de culture, la phosphatase alcaline et/ou les protéines complémentaires (BMP, BSP, OPN, OCN, etc.), permettant ainsi la production de phosphate inorganique.

L'invention montre que des construits peuvent être réalisés à partir d'expiants, dans lesquels des cellules conservent la capacité de fabriquer des zones minérales, malgré les étapes de culture et/ou de traitement réalisées.
Cette minéralisation conduit généralement à la création d'une face S minéralisée et/ou ossifiée du construit cellulaire, qui correspond généralement à
celle exposée au support de culture. Comme il sera décrit dans la suite du texte, cette face est également la plus riche en collagène. En effet la minéralisation s'effectue au milieu de fibres de collagène présentes dans le construit, permettant ainsi un ancrage solide de ces dernières dans les dépôts de minéralisation. En outre, les cellules progénitrices augmentent en nombre à
proximité du support de culture et facilitent la minéralisation initiée par la matrice et le réseau collagénique.
Cette caractéristique de l'invention est particulièrement importante et avantageuse pour la réalisation de construits cellulaires de réparation de structures telles que ligaments, tendons, dents, os, articulation, etc., dans la mesure où la production d'une minéralisation favorise l'ancrage des fibres de collagène du tissu dans la couche minéralisée et conduit à un tissu reconstitué
plus proche du tissu natif, notamment d'un tissu incluant un cément.
Les cellules minéralisantes des construits de l'invention sont typiquement des cellules du mesenchyme ou des précurseurs de ces cellules. Leur capacité
de minéralisation est conservée par les conditions de culture et/ou de traitement des cellules dans le construit, et/ou en raison de l'origine tissulaire particulière de ces cellules.
Composition cellulaire Comme indiqué ci-avant, les construits ou tissus reconstitués selon l'invention comprennent avantageusement des cellules animales, en particulier des cellules de mammifère, de préférence des cellules humaines. II peut s'agir de cellules souches indifférenciées ou de cellules dérivées de tissus matures, ou d'une combinaison de telles cellules. Si les cellules sont prélevées dans un tissu mature, il peut s'agir de tout type de cellules capables de produire de la matrice extra-cellulaire et/ou de conserver ou d'acquérir une capacité de minéralisation et/ou d'ossification notamment sous l'influence de facteurs extérieurs. Les cellules impliquées dans la reconstruction du tissu peuvent ainsi provenir de S populations cellulaires différentes formant ainsi une population hétérogène.
II s'agit par exemple de cellules dérivées de tissus matures tels que le muscle, l'os, la dent, le cartilage, le tendon ou le ligament, en particulier la dent et le ligament, notamment le ligament parodontal ou le ligament antérieur croisé.
Préférentiellement, lorsque les cellules sont issues du parodonte, elles comprennent, au moins dans les cultures initiales, des cellules du ligament parodontal, des cellules du cément et de la dentine à savoir essentiellement des fibroblastes (environ 80%). Les cellules dérivées du ligament parodontal comprennent typiquement des fibroblastes, des cellules épithéliales, des cémentoblastes, des ostéoblastes et/ou des progéniteurs de ces différents types cellulaires. Lorsqu'elles sont issues de la dent, elles comprennent des odontoblastes, des améloblastes, des cellules pulpaires, des cellules épithéliales, des cémentoblastes et/ou des progéniteurs de ces différents types cellulaires. II peut encore s'agir d'un prélèvement contenant une majorité de cellules souches indifférenciées dont la différentiation sera orientée par des moyens de culture appropriés. II peut également s'agir de chondrocytes ou d'ostéoblastes. Ces cellules peuvent avoir pour origine des cellules souches mésenchymateuses et/ou des cellules isolées à partir d'un extrait de moelle osseuse.
La présence par exemple de cellules du type ostéoblaste ou chondroblaste ou de précurseurs de celles-ci du type pré-ostéoblaste ou pré-chondroblaste ou encore de cellules extraites de la moelle osseuse n'est néanmoins pas nécessaire pour obtenir un construit selon l'invention présentant notamment des zones de minéralisation et/ou d'ossification.
Le tissu selon l'invention peut étre composé d'une seule population cellulaire ou d'une combinaison ou mélange de plusieurs types (ou populations) cellulaires, répartis uniformément ou non au sein du tissu de façon à mimer la ô
composition cellulaire et la structure des tissus natifs. Si différents types cellulaires sont présents, il est préférable que l'un au moins desdits types cellulaires soit capable de minéralisation et/ou d'ossification. Le ou les types cellulaires ne présentant pas de capacité de minéralisation peu(ven)t en outre être stimulés) ou transformé (s) de manière à induire une minéralisation et/ou une ossification.
II est par ailleurs possible d'amener les cellules du construit (par exemple les fibroblastes) à exprimer des composés absents naturellement, par exemple en les exposant à une substance chimique, en exerçant un stimulus physique ou encore en utilisant des méthodes transgéniques.
Les différentes populations cellulaires peuvent être associées au début de la période de culture, par exemple dans un ratio donné, ou encore de façon successive, par exemple par l'association de plusieurs construits.
Un objet particulier de l'invention réside dans un construit cellulaire tel que défini ci-avant, réalisé à partir de (ou comprenant des) cellules de ligament cultivées in vitro, en particulier de ligament parodontal ou antérieur croisé.
L'invention montre que des tissus minéralisés artificiels peuvent étre fabriqués à
partir de ce type de cellules, qui peuvent étre remodelés pour produire des construits épais, et qui possèdent une organisation biologique fonctionnelle.
Matrice extracellulaire endogène Comme indiqué ci-avant, les tissus ou construits selon l'invention comprennent des cellules qui sont noyées ou enrobées ou emprisonnées dans une matrice extra-cellulaire endogène, c'est-à-dire produite par les cellules en culture. La matrice extracellulaire comprend typiquement (et essentiellement) un réseau de fibres de collagène organisées notamment en fibrilles, des protéoglycanes sulfatés, impliqués potentiellement dans la régulation in vivo du diamètre des fibrilles, ainsi que des glycosaminoglycanes (GAG) simples ou sulfatés. Parmi les GAG simples, on trouve typiquement de l'acide hyaluronique (HA) et/ou de la fibronectine et, parmi les GAG sulfatés, on peut trouver notamment de l'acide di-hyaluronique, du di-chondroïtine-0-sulfate, du di-chondroïtine-4-sulfate, du di-chondroïtine-6-sulfate, du di-chondroïtine-4,6-sulfate, du di-chondroïtine-4-sulfate-UA-2S et/ou du di-chondro'itine-6-sulfate-UA-2S. La matrice extracellulaire peut en outre comprendre de la décorine, telle que du biglycane ou du versicane, ainsi que de la ténascine, une glycoprotéine extra-cellulaire de la matrice que l'on trouve en particulier dans le mésenchyme ou les tissus en réparation. II semble que les cellules en culture remplissent progressivement l'espace qui les sépare avec une matrice lâche riche en collagène de type III et en fibronectine puis remodèlent cette matrice avec du collagène de type I de manière à la rendre plus dense.
II n'est pas nécessaire que la composition exacte de la matrice extracellulaire soit connue, pour une mise en oeuvre de l'invention.
Typiquement, le construit comprend des cellules ayant la capacité de synthétiser une matrice extra-cellulaire endogène, dont la composition est semblable à celle que l'on trouve dans le tissu d'origine, sauf modifications volontaires (e.g., incorporation de matériaux synthétiques, modification génétique des cellules, etc.).
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un construit tel que défini ci-avant comprenant une couche basale et une couche apicale par rapport au support de culture, ladite couche basale étant riche en collagène et comprenant en outre des fibroblastes et des cellules progénitrices à
l'origine de la minéralisation et/ou de l'ossification et ladite couche apicale étant moins riche en collagène que ladite couche basale, et comprenant typiquement plus de cellules prolifératives.
Dimensions du construit Les construits selon l'invention peuvent être de dimensions variables, tant en surface qu'en épaisseur. En outre, ils peuvent avoir ou prendre des formes variées. Les dimensions et la forme peuvent étre adaptées par l'homme du métier ou par l'utilisateur, en fonction des applications recherchées.
Une caractéristique particulière avantageuse des construits ou tissus selon l'invention réside dans leur épaisseur importante, comprise typiquement

5 entre 30 et 120 microns, préférentiellement entre 50 à 120 Nm, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à environ 100 Nm. La présente demande montre en effet qu'il est possible de réaliser des construits cellulaires in vitro présentant une épaisseur élevée, dans lesquels les cellules sont capables de s'organiser, de se différencier et de proliférer, pour créer une polarité
10 fonctionnelle dans le construit sans entrainer de nécrose cellulaire particulière.
Cette caractéristique est avantageuse car elle fournit un tissu reconstitué
dans lequel les cellules s'organisent et développent des propriétés biologiques avantageuses. Ainsi, du fait de l'épaisseur accrue du tissu, les cellules ont un comportement différent. En particulier, la diffusion endogène globale de substances au sein du tissu, et donc dans l'environnement des cellules est diminuée, ce qui augmente l'effet potentiel des cellules et conduit à leur réorganisation et à leur remodelage. Cette organisation favorise en outre l'apparition d'une minéralisation, la polarisation du tissu, l'expression d'une couche proliférative sur la face apicale, la tenue du construit et/ou son intégration chez un sujet.
L'épaisseur du construit peut être modulée de différentes manières.
Préférentiellement, elle est obtenue artificiellement, par exemple par repliement ou roulage sur lui-même d'un construit plus mince, de manière à augmenter son épaisseur par fusion et remodelage des différentes couches cellulaires.
L'invention montre en effet qu'il est possible de compacter un premier construit tissulaire comportant environ 3 couches de cellules obtenues par culture, et que ce compactage (e.g., pliage, enroulement, etc.) conduit à un tissu dans lequel les cellules s'organisent, se différencient, et développent des propriétés biologiques avantageuses. L'invention montre également qu'il est possible de découper un tissu ou construit en parcelles qui peuvent ensuite étre repliées ou roulées sur elles-mêmes. L'épaisseur peut également être augmentée artificiellement par un décollement des bords du construit qui provoque la rétractation de ce dernier et le compactage des cellules.
A cet égard, un objet particulier de l'invention réside également dans un construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle et (ü) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 pm environ.
De manière plus particulière, le construit comporte ou est réalisé à partir de cellules présentant une capacité de minéralisation, et/ou comporte ou est réalisé à partir de cellules de ligament, tendon, dent ou os.
Un objet plus particulier de l'invention réside ainsi dans un construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à
partir de ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ü) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 Nm environ.
Un autre objet plus préféré de l'invention réside ainsi dans un construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à
partir de ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ü) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 Nm environ et en ce qu'il comporte des cellules présentant une capacité de minéralisation et/ou des zones minéralisées.

Typiquement, le construit comporte une couche (face) basale et une couche (face) apicale, la couche basale étant riche en collagène et en zone minéralisée.
Comme indiqué, la surface du construit ou tissu peut être adaptée par l'homme du métier en faisant varier la quantité de cellules ensemencées, la durée de la culture, les dimensions du dispositif de culture, etc. En outre, comme indiqué, des parcelles de construit peuvent être découpées, possédant une forme adaptée à l'utilisation ultérieure du construit, par exemple rectangulaire, carrée, circulaire, etc., et une surface également adaptée à ladite utilisation, par exemple comprise entre 1 et 20 cm2, de préférence entre 1 et 15 cm2, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 cm2.
Préparation Les tissus ou construits selon l'invention peuvent être produits de différentes façons. Selon un mode particulièrement préféré, qui constitue également un objet de la présente demande, les construits cellulaires sont préparés par une méthode comprenant typiquement:
a) la culture de cellules d'intérêt dans des conditions adaptées à la synthèse d'une matrice extra-cellulaire et à la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans la matrice extracellulaire endogène néosynthétisée, et b) ~ la récupération du construit.
Cette méthode peut en outre comprendre préalablement aux étapes a) et b), les étapes a') et b') suivantes a') l'extraction des cellules d'intérêt d'un ou de plusieurs tissus, par tout moyen approprié, par exemple par digestion enzymatique, traitement mécanique, expiant, etc., et b') l'amplification desdites cellules extraites durant l'étape a') dans un milieu approprié, typiquement en présence d'acide ascorbique ou d'un dérivé dudit acide.
La méthode peut par ailleurs comprendre en outre une étape c) de récupération du construit cellulaire (par exemple par décollement) et une étape d) d'augmentation artificielle de l'épaisseur dudit construit, notamment par repliement (par exemple par repliements successifs), roulement du construit sur lui-même ou rétractation du construit.
Dans l'étape a'), les cellules peuvent être extraites du tissu choisi par tout moyen approprié, par exemple par digestion enzymatique (e.g., collagénase) ou grâce à l'utilisation d'une technique d'expiant connue de l'homme du métier.
II
peut s'agir d'une dissection mécanique (e.g., scalpel), d'une lavage enzymatique, d'une concentration cellulaire, d'un découpage mécanique (e.g., ciseaux), etc. Les cellules ainsi extraites sont généralement constituées d'une population de cellules de natures variées, par exemple de cellules matures et de cellules progénitrices. Ces cellules sont typiquement représentatives de la composition du tissu ou construit à reconstituer.
Les cellules ainsi obtenues sont ensuite mises en suspension dans du milieu de culture, pour la réalisation de l'étape b') d'amplification (ou d'expansion ou de prolifération). Cette étape vise essentiellement à augmenter le nombre de cellules pour faciliter la constitution du tissu. Elle peut être réalisée pendant une période de temps variable, par exemple de 1 à 10 jours, ou plus, selon le type cellulaire, la quantité de cellules disponibles, etc. Le milieu de culture utilisé est typiquement un milieu de culture de base tel que décrit ci-après (éventuellement supplémenté d'acide ascorbique ou d'une molécule similaire), qui peut être changé 2 ou 3 fois par semaine selon l'état de prolifération des cellules. A
l'issue de cette étape, lorsque les cellules sont à confluence ou approximativement à

de confluence, la culture est traitée pour décoller les cellules adhérentes, par exemple au moyen de trypsine. Selon le type de cellule ou l'état de confluence, la durée du passage à l'étuve qui suit et permet le décollement du tissu, sera plus ou moins longue. Elle sera par exemple de 3 minutes pour des cellules endothéliales, de 5 minutes pour des fibroblastes, de 8 minutes pour des kératinocytes, etc. (voir exemples). Durant cette phase, les cellules ne produisent qu'une faible quantité de matrice extra-cellulaire.
Les cellules amplifiées ainsi obtenues sont ensuite utilisées pour la préparation du construit. A cet effet, elles sont ensemencées dans un dispositif adapté et cultivées dans des conditions adaptées à la synthèse d'une matrice extra-cellulaire et à la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans la matrice extracellulaire endogène néosynthétisée.
Typiquement, les cellules sont ensemencées (par exemple dans des boîtes de Pétri), à une densité comprise entre environ 103 et 106 cellules/cm2, de préférence entre 3.103 et 5.105 cellules/cmz, typiquement entre 3000 et 12000 cellules/cm2. Dans une expérience typique, on utilise ainsi environ 5.105 cellules par boîte de 75 cm2, par exemple.
Les cellules sont ainsi cultivées pendant une durée suffisante pour permettre - la production d'un construit ayant une surface désirée, composé
d'une ou plusieurs couches de cellules, typiquement 1 à 3 (soit environ 30 Nm d'épaisseur), enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, - l'adhésion du construit au support, - la prolifération des cellules en surface, et, - de préférence, de produire ou initier une minéralisation (ou ossification).
Cette culture peut ainsi étre maintenue pendant 2 à 6 semaines, éventuellement sous agitation douce, avantageusement en renouvelant le milieu 1 à 3 fois par semaine.

Pour assurer la formation d'une matrice extracellulaire, les cultures sont avantageusement réalisées dans un milieu de culture de base comprenant de l'acide ascorbique ou un dérivé de celui-ci. L'ascorbate est ajouté pour promouvoir l'hydroxylation de la proline et la sécrétion du procollagène, 5 précurseur soluble du collagène, mais également parce qu'il constitue un cofacteur important d'enzymes actifs au moment de la phase post-traductionnelle et qu'il régule en amont la synthèse des collagènes de type I
et III. L'acide ascorbique peut étre remplacé par l'un de ses dérivés synthétiques ou par un nutriment agissant sur la synthèse de matrice extra-cellulaire. De ce 10 fait, le procédé de l'invention ne requiert pas l'utilisation de matrice exogène.
Les milieux de culture de base utilisés sont des milieux adaptés aulx) types) cellulaires) et au tissu ou construit à reconstituer. Le milieu et les conditions de culture doivent stimuler la croissance cellulaire en construit et la 15 synthèse de matrice extra-cellulaire. II est préférable de choisir un milieu de composition connue, c'est-à-dire notamment ne comprenant pas d'organe ou d'extrait tissulaire animal, bien que la présence de tels composés non définis soit possible si elle favorise l'obtention d'un construit selon l'invention. Des équivalents fonctionnels synthétiques ou recombinants connus de l'homme du métier peuvent aussi étre ajoutés au milieu de culture de composition connue.
L'homme du métier peut déterminer facilement les composés de base nécessaires à la culture des cellules animales. Parmi les milieux commerciaux disponibles sur le marché et utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment des milieux qui fournissent des sels inorganiques, une source énergétique, des acides aminés et de la vitamine B tels que le DMEM
(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), le MEM (Minimal Essential Medium), le RPMI 1640, l'EDMEM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), les milieux Ham (notamment Ham's F-12) ou NCTC 109. Un milieu de base préféré selon l'invention est un mélange DMEM/Ham F12 (50 :50 en volume). Le milieu peut contenir du sérum. Le milieu de base est typiquement complété avec notamment des composés tels que des acides aminés et en particulier de la proline et de la glycine qui rentrent dans la structure du collagène, des facteurs de croissance, des hormones et des sels inorganiques. Des milieux de culture spécifiques utilisables dans le cadre de la présente invention sont décrits dans la demande W096/21003. D'autres milieux sont décrits dans les exemples.
Les cultures peuvent être réalisées dans tout dispositif approprié, tel que plaque, boite, flasque, poche, etc. II s'agit typiquement de boites de Pétri ou similaires. Les cultures sont avantageusement maintenues dans un incubateur qui permet de contrôler température, humidité et mélanges gazeux. Des conditions de culture préférées sont par exemple une température comprise entre 35 et 40°C environ, de préférence 37°C environ, une atmosphère contenant de 5 à 10% C02 et une humidité relative comprise entre environ 75 et 95%.
Le tissu ainsi fabriqué contient des cellules associées à un réseau tridimensionnel dense de matrice extra-cellulaire néosynthétisée par lesdites cellules. Durant cette étape, et en réponse à la stimulation des cellules par l'acide ascorbique ou par un dérivé de cet acide, les cellules se multiplient, se superposent et fabriquent une matrice extra-cellulaire dont la composition est essentiellement identique à celle d'une matrice extra-cellulaire naturelle.
Lorsque le construit cellulaire est préparé à partir de cellules issues notamment de tendon ou de ligament, de la peau ou du derme, il comprend ainsi, aux environs de la troisième semaine de culture, une forte proportion de collagène concentrée en particulier dans la moitié du construit dont la face est directement en contact avec le support de culture. C'est au niveau de ce réseau de collagène que la minéralisation va être initiée.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, les cellules sont cultivées dans des conditions assurant la formation ou le maintien de la capacité des cellules à produire une minéralisation (ou une ossification).
Cette capacité peut être liée aux cellules utilisées, et favorisée par la culture en présence d'un stimulus activant ou augmentant la minéralisation et/ou l'ossification des cellules, notamment des cellules progénitrices basales.

Dans un mode particulier, la minéralisation du tissu est obtenue de façon surprenante en modifiant les conditions de culture. Cette minéralisation concerne la matrice néosynthétisée et en particulier la matrice constitutive de la moitié du construit en contact avec le support de culture. La stimulation peut être obtenue par mise en contact du construit ou des cellules avec un matériau particulier ou avec des particules de ce matériau, par l'ajout de facteurs) de différentiation, de milieu conditionné, de substances synthétiques ou encore par l'ajout de substances naturelles telles que du corail ou par stimulation mécanique. Parmi les matériaux minéralisant utilisables, on peut citer notamment un support ou des particules comprenant de l'hydroxyapatite, du verre bioactif (ou bio-verre), un substitut collagénique minéralisé, un substitut osseux, une céramique, notamment à base de zirconium, ou du corail, ou tout matériau (par exemple un matériau composite) dont la surface est revêtue, au moins en partie, de l'un de ces composants. Ainsi, le matériau minéralisant peut étre également produit à
partir d'un matériau inerte bio-activé par le greffage en surface de substances susceptibles d'induire la minéralisation du construit. Parmi les substances ou facteurs utilisables, on peut citer par exemple des adjuvants incorporés dans le milieu de culture et renforçant l'effet stimulant de la minéralisation crée par le support choisi (cytokine, de la déxaméthasone, du béta-glycérophosphate, du béta-aminopropionitrile) Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention comprend donc une méthode de préparation d'un construit cellulaire minéralisé ou minéralisant, comprenant une étape de mise en contact des cellules avec un stimulus tel qu'un support ou matériau minéralisant, des particules de ce matériau, des facteurs de différenciation, des cytokines, un milieu conditionné, une substance synthétique ou une substance naturelle, stimulant la minéralisation ou la capacité de minéralisation des cellules. De préférence le stimulus est provoqué
par un support ou matériau minéralisant, comprenant avantageusement de l'hydroxyapatite ou du bio-verre. A terme, l'hydratation du bio-verre provoque sa résorption, et ce type de support est donc particulièrement adapté et avantageux lorsque le tissu à reconstituer est destiné à être greffé, puisqu'à terme seul le greffon subsiste au sein de l'hôte receveur.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans un procédé de préparation d'un construit ou tissu cellulaire reconstitué, comprenant la culture in vitro de cellules dans des conditions assurant la synthèse de matrice extracellulaire et la minéralisation. II s'agit avantageusement d'une culture en présence d'un stimulus, tel qu'un support, agent ou traitement minéralisant, avantageusement d'une culture sur un support minéralisant ou en présence de particules minéralisantes. L'obtention d'un construit selon l'invention présentant des zones de minéralisation ne nécessite pas l'ajout de facteur de croissance, tel que par exemple le TGF-(31.
Un objet particulier de l'invention porte également sur un construit ou tissu cellulaire, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé
comprenant la culture in vifro, en l'absence de matrice ou charpente synthétique, de cellules dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et dans des conditions stimulant la minéralisation ou l'ossification.
La minéralisation est généralement réalisée ou initiée en même temps que l'étape de formation du construit et de synthèse de la matrice extracellulaire.
Toutefois, la minéralisation se poursuit généralement après la récupération du construit et/ou son épaississement artificiel.
Un objet particulier de l'invention consiste donc à mettre les cellules culture en présence d'agents minéralisant, par exemple de micro ou de nano-particules de bio-verre ou d'hydroxyapatite, dès le début de la culture. Ces agents favorisent la migration des cellules progénitrices et stimulent leur capacité de minéralisation et/ou d'ossification.

Une telle minéralisation et/ou ossification améliore de façon particulièrement avantageusement l'intégration du tissu ou construit cellulaire reconstitué au sein des tissus de l'hôte récepteur.
La minéralisation peut être observée par coloration à l'aide par exemple de paragon ou via une coloration von Kossa. A titre d'exemple spécifique, des cellules de parodonte ensemencées à raison d'environ 5000 cellules/cm2, peuvent ainsi être cultivées pendant trois semaines environ, en présence de microparticules d'hydroxyapatite (voir figure 5). Les cellules en culture reconnaissent le stimulus et produisent des enzymes spécifiques de type phosphatase alcaline. Des substrats phosphatés comme par exemple le ~3-glycérophosphate vont être hydrolysés. Ils libèrent ainsi des phosphates capables de provoquer la cristallisation partielle du tissu en se complexant aux ions calcium pour donner du phosphate de calcium.
Comme indiqué, les tissus ou construits peuvent être fabriqués dans tout dispositif approprié, tel que plaque, boite, flasque, poche, etc. II s'agit typiquement de boites de Pétri ou similaires. Préférentiellement, la préparation est réalisée en l'absence de matrice ou charpente tridimensionnelle synthétique.
Un objet particulier de l'invention réside dans un procédé de préparation d'un construit ou tissu reconstitué, comprenant la culture in vitro de cellules issues de ligament parodontal ou croisé, dans des conditions assurant la synthèse de matrice extracellulaire.
Une fois le construit produit, il peut être récupéré du support par toute technique connue, typiquement par décollement. Une des caractéristiques de l'invention réside en effet dans la facilité de récupération du construit cellulaire reconstitué par simple décollement dudit construit de son support de culture.
Par ailleurs, dans une étape supplémentaire d), le construit ou tissu ainsi récupéré peut être traité (e.g., compacté) en vue d'augmenter son épaisseur, typiquement par repliement, enroulement, amassement, etc. Généralement, avant qu'elle n'ait été augmentée artificiellement, l'épaisseur du construit cellulaire correspond à environ 2 ou 3 couches de cellules empilées les unes sur les autres, soit environ 30 Nm. Les cellules sont en effet généralement 5 maintenues en culture jusqu'à ce qu'elles aient sécrété une quantité
suffisante de matrice pour assurer une tenue minimale au construit cellulaire. II est alors possible de décoller le construit cellulaire de son support de culture sans qu'il ne se déchire, et de produire un construit cellulaire ayant une épaisseur augmentée, par exemple de deux à cinq fois par rapport à un construit mince cultivé.
Un objet particulier de l'invention concerne également des construits ou tissus cellulaires, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou de charpente synthétique, de cellules dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et une étape de décollement du construit de son support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-méme, permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.
Un autre objet particulier de l'invention concerne également des construits ou tissus cellulaires, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'étre obtenus par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou charpente synthétique, de cellules de ligament parodontal ou antérieur croisé
dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice , extracellulaire endogène, et, de préférence, une étape de décollement du construit de son support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-même, permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.
Les construits selon l'invention peuvent être maintenus en culture pendant une période variable, typiquement en présence de milieu, pour favoriser la réorganisation cellulaire, la poursuite de la minéralisation, etc. Les construits ou tissus peuvent ensuite être utilisés dans le cadre d'applications cliniques (greffe, implant) ou pharmaceutiques.
Conservation/Maintien Les construits ou tissus selon l'invention peuvent être conservés dans tout dispositif adapté, en présence de milieu de culture, de milieu nutritif ou de solutions salines isotoniques. Typiquement, les tissus sont conservés ou maintenus dans des boites, tubes, flasques, ampoules, poches, etc., préférentiellement en présence d'une quantité importante de milieu. Les tissus peuvent être utilisés extemporanément ou conservés, de préférence au froid.
Utilisations Les construits ou tissus décrits ci-dessus peuvent être utilisés dans le domaine des greffes ou de l'implantologie ainsi que dans l'industrie pharmaceutique, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules, notamment de médicaments candidats.
Un tissu ou construit selon l'invention peut ainsi être utilisé dans le domaine des greffes ou de l'implantologie. Le tissu ou construit est dans ce cas préférentiellement d'épaisseur importante, typiquement de 100 um environ. II
peut ainsi s'agir avantageusement d'un construit compacté, e.g., replié ou roulé
sur lui-même de manière à augmenter son épaisseur par fusion et remodelage des différentes couches cellulaires comme décrit ci-avant, ou simplement détaché du support pour former un amas cellulaire.
Pour un usage en réparation tissulaire, les construits de l'invention peuvent être utilisés tels quels, sous forme de pansements ou de « patch »
cellulaires, ou pour enrober ou recouvrir tout ou partie d'un implant destiné
à être introduit chez un sujet.

Le tissu ou construit cellulaire selon l'invention peut être directement utilisé dans le cadre d'une greffe. L'invention propose en effet la réalisation d'un pansement cellulaire, comprenant essentiellement un amas cellulaire tel que défini ci-avant. Un objet de l'invention réside donc notamment dans une composition pharmaceutique comprenant un construit ou tissu tel que décrit cl-avant. II s'agit avantageusement d'un tissu épais ou compacté tel que décrit cl-avant. Le pansement peut être appliqué directement sur une cavité ou sur un tissu lésé, lors d'opérations chirurgicales simples. Par exemple, si le tissu est reconstitué à partir de cellules du parodonte, le pansement de l'invention peut être utilisé dans le cadre du traitement des poches parodontales. S'il s'agit de cellules de ligament, il est possible de reconstituer ou réparer un ligament tel que le ligament croisé antérieur par exemple. Si le tissu est reconstitué à partir de chondrocytes ayant conservé leur capacité de minéralisation et/ou d'ossification, une greffe peut également être directement envisagée au niveau du site atteint de l'hôte récepteur.
L'invention propose donc également une méthode de traitement ou réparation tissulaire, comprenant la préparation d'un tissu reconstitué par culture in vitro comme décrit ci-avant, et l'injection de ce tissu, éventuellement après conditionnement dans toute solution ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Dans ce contexte, le tissu peut éventuellement être associé à
une matrice exogène, telle que du collagène.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, le tissu ou construit de l'invention est utilisé pour la préparation d'un implant, notamment pour recouvrir ou enrober tout ou partie d'un implant. II peut s'agir d'un implant dentaire (cf. :
exemple 4 relatif au « ligaplant »), ligamentaire, d'une prothèse osseuse ou cartilagineuse, etc. Dans ce cas, le construit produit est typiquement disposé ou enroulé
autour de la structure de l'implant.
Un implant dentaire peut par exemple comprendre une partie coronaire sur laquelle sera fixée la couronne de la dent à remplacer et une partie radiculaire correspondant à la racine de ladite dent et autour de laquelle il est possible de rouler un construit cellulaire selon l'invention. La présente invention concerne donc une méthode de préparation d'un implant à l'aide d'un construit tel que décrit ci-avant, comprenant l'enroulement dudit construit à la surface de l'implant et la mise en culture dudit implant associé audit construit dans des conditions permettant de maintenir ou stimuler la prolifération et/ou la différentiation des cellules tout en favorisant la fusion et le remodelage des différentes couches cellulaires dudit construit à la surface de l'implant.
Ce construit peut en particulier être reconstruit à partir de cellules du parodonte cultivées pendant environ trois semaines dans les conditions indiquées ci-dessus (voir également Figure 4). La face minéralisée du construit cellulaire qui correspond à celle exposée au support de culture est exposée ensuite directement à l'implant, dans un milieu d'amplification et en présence d'acide ascorbique. Cette face du construit cellulaire permet alors à
l'ensemble du construit d'adhérer à l'implant de façon stable, solide et particulièrement avantageuse, notamment grâce aux cellules progénitrices qui vont augmenter en nombre autour dudit implant et vont faciliter la minéralisation initiée par la matrice et le réseau collagénique. La structure ainsi reconstituée est alors très proche du cément naturel de la dent. Le milieu d'amplification facilite quant à lui la fusion et le remodelage des différentes couches cellulaires du construit, dans la mesure où aucune limite nutritionnelle n'est imposée. Le tissu minéralisé
selon l'invention améliore ainsi globalement l'intégration de l'implant dans le site alvéolaire receveur.
Un construit selon l'invention peut donc être utilisé pour préparer un implant dentaire ou ligamentaire par exemple.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation dans l'industrie pharmaceutique d'un tissu ou construit cellulaire selon l'invention, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les tissus reconstitués de l'invention (ou une partie de ceux-ci) sont mis en contact avec un ou plusieurs composés tests, et l'effet dudit composé test est déterminé, par exemple de façon à caractériser les réactions cellulaires à l'égard de ce ou ces composés tests.

Le composé test peut être de nature très variée. Ainsi, il peut s'agir d'un composé isolé ou d'un mélange de substances. Le composé peut être de nature chimique ou biologique. II peut s'agir notamment d'un peptide, polypeptide, acide nucléique, lipide, glucide, d'une molécule chimique, d'extraits végétaux, de banques combinatoires, etc. Le composé test peut également être un traitement appliqué aux tissus (radiations, UV, etc.).
Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, le composé test peut être appliqué à différentes concentrations, choisies par l'utilisateur.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un tissu reconstitué
tel que défini ci-avant, pour l'évaluation (in vitro ou ex vivo) des propriétés biologiques et/ou toxiques d'un composé test, notamment de molécules destinées à un usage thérapeutique.
Elle a également pour objet l'utilisation d'un tissu reconstitué tel que défini ci-avant, pour le criblage de molécules destinées à un usage thérapeutique.
La présente demande a également pour objet des kits pour la mise en oeuvre des procédés de préparation et d'études et également pour l'utilisation des tissus reconstitués tels que décrits ci avant. De tels kits comprennent avantageusement un conteneur et/ou des réactifs de culture, et/ou un construit tissulaire tel que défini ci-avant.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits plus en détails à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures Figure 1 : Cellules extraites d'un ligament parodontal ensemencées à 5000 cellules/cm2 à J2 (A) après trois semaines de culture (B). Les cellules se multiplient, se superposent et synthétisent de la matrice extra-cellulaire.

Figure 2 : Aspect macroscopique d'un construit après trois semaines de culture statique dans une boite de pétri de 100 mm de diamètre.
Figure 3: Tissu minéralisé. La coloration Paragon permet de visualiser les 5 dépôts de minéralisation.
Figure 4 : Implant dentaire et association d'un tissu selon l'invention à
l'implant dentaire.
10 Figure 5 : Tissu minéralisé par l'ajout d'hydroxyapatite pour le traitement des poches parodontales. Des cellules du parodonte sont cultivées en présence de micro-particules d'hydroxyapatite pendant trois semaines. La matrice collagénique néosynthétisée contient des dépôts de minéralisation (coloration von Kossa).
Figure 6 : Coupe histologique (Grossissement X100) d'un construit élaboré à
partir de cellules du ligament parodontal (cellules de la jonction cémento-amélaire) cultivées à la surface d'un support d'hydroxyapatite, selon le procédé
de l'invention, et implantées sous la peau d'une souris athymique (Swiss nu nu) pendant 12 semaines. L'Inclusion est réalisée dans de la paraffine après déminéralisation de l'échantillon et la coloration est réalisée avec le trichrome de Masson.
On distingue les noyaux des cellules qui apparaissent plus foncés dans la partie appelée « cellules ». Les fibres de collagène (fibres de Sharpey) et les protéines de la matrice minéralisée au contact du support d'hydroxyapatite correspondent à la masse poreuse appelée « HA ».
La structure tissulaire obtenue est comparable à celle d'un cément cellulaire fibrillaire comme il en existe sur une dent normale.
Figure 7: Cette figure représente un tissu d'un feuillet simple, marqué par immunohistochimie pour détecter le collagène de type V. La couleur gris clair représente la contre-coloration et la couleur gris foncé le marquage du collagène de type V.
Figure 8 : Cette figure représente un tissu identique à celui de la figure 7 après avoir été plié ou roulé. Le profil du marquage montre ainsi le remodelage (sans conservation de la polarité de chaque repliement du tissu). La couleur gris clair représente la contre-coloration et la couleur gris foncé le marquage du collagène de type V.
Exemples MATERIELS ET METHODES
Les milieux et/ou produits utilisés (e.g., vitamine C, acide ascorbique 2-phosphate, collagénase, dexaméthasone, etc.) sont généralement d'origine commerciale, ou sont disponibles dans le commerce. Ces substances sont généralement stérilisées avant emploi.
Ainsi, la collagénase A (clostridiopeptidase A) utilisée est une protéase bactérienne produite par clostridium histolyticum. Cette protéase a une spécificité pour les liens X-Gly des séquences Pro-X-Gly-Pro (X représentant un acide aminé neutre) retrouvé dans les triples hélices collagéniques. La collagénase n'est pas inhibée par le sérum mais par l'EDTA et est activée par le calcium. Son pH optimal est situé
entre 6 et 8. Sous forme lyophillisée, elle est stable entre +2 et +8°C
et en solution entre -15° et -25°C. La collagénase peut être reconstituée dans des solutions tamponnées, telles que le PBS, le HBSS ou le DMEM/F12, qui contiennent du calcium.
La Déxaméthasone est un glucocorticoide de PM de 392,5, qui permet d'augmenter le niveau de phosphatase alkaline. Elle est préparée à partir de source commerciale (Sigma D-2915).

Le ~i-glycérophosphate, dont le PM est de 216, est hydrolysé par la phosphatase alcaline en ions phosphates, nécessaires à une bonne minéralisation. II est préparé
à partir de source commerciale (Sigma G-9891 ).
Pour la préparation et le contrôle des milieux, des aliquots des produits sont décongelés dans un bain-marie et décontaminés, avant d'étre entrés sous la hotte à flux laminaire. Ils sont ajoutés stérilement dans le DMEM/F12 liquide.
Les milieux sans antibiotique sont préparés 1 ou 2 jours avant utilisation, afin de pouvoir en contrôler la stérilité. II sont homogénéisés et contrôlés. Les antibiotiques sont ajoutés extemporanément au moment de l'utilisation du milieu.
Le contrôle bactériologique est réalisé selon les méthodes classiques. Le stockage s'effectue typiquement entre +2°C et +8°C.
Milieu de s,~mthèse Produits Concentrations DMEM 1 :1 Ham F12 1 :1 SV supplment 10%
en Fer Hyclone Acide ascorbique1 mM

phosphate Pnicilline 100 UI/ml Gentamicine 20 Ng/ml Amphotricine 1 Ng/ml B

Milieu de différentiation Produits Concentrations DMEM 1 :1 Ham F12 1 :1 SV supplment 10%
en Fer Hyclone Acide ascorbique1 mM

phosphate (3-glycrophosphate10 mM

Dexamethasone 10 nM

Pnicilline 100 UI/ml Gentamicine 20 Ng/ml Amphotricine 1 Ng/ml B

EXEMPLE 1 : Extraction et culture d'un feuillet cellulaire à partir de cellules prélevées sur une racine de dents Dans cet exemple, l'extraction a été réalisée en suivant les étapes suivantes Les tissus dentaires obtenus sont maintenus dans un milieu de transport jusqu'à
ce qu'ils soient traités, si possible dans les 24 heures suivant la réception.
Les tissus sont ensuite lavés 3 fois dans du PBS, en présence d'antibiotiques, de manière à éliminer l'excès de sang. Les racines des dents sont alors placées dans des boîtes de pétri de 60 mm de diamètre par exemple avec environ 5 ml de collagénase A (voir le paragraphe relatif aux milieux). Les dents sont grattées avec un scalpel à partir de la moitié de la racine jusqu'à son extrémité
inférieure, jusqu'à l'obtention de petits fragments de cément et de dentine. Les fragments sont incubés une nuit à 37°C (environ entre 16 et 20 heures) dans un incubateur à C02. Les cellules et les fragments de tissus sont mis dans un tube, centrifugés et resuspendus dans du milieu de culture. La suspension de cellules et de débris est alors réensemencée dans la boîte de pétri d'extraction avec 4 ml de milieu de culture. Le milieu de culture est changé 2 ou 3 fois par semaine selon l'état de prolifération des cellules. La culture est maintenue entre 10 jours et 3 semaines environ avant d'être prête à être trypsinée. La boîte de pétri doit préférentiellement présenter approximativement 50 % de confluence.
Lorsque les cellules cultivées sont pré-confluentes ou confluentes, elles sont traitées selon les étapes suivantes La boîte de culture est rincée avec du PBS culture, puis de la trypsine-EDTA
est ajoutée de façon à recouvrir toute la culture (approximativement 5 ml par 75cm2).
Les flasques sont mises à l'étuve à 37°C. Selon le type de cellule ou l'état de confluence, le temps sera plus ou moins long, de préférence inférieur à
environ 5 minutes pour des cellules endothéliales ou des fibroblastes, et inférieur à
environ ou 10 minutes, pour des kératinocytes. Le décollement des cellules est suivi 15 et/ou contrôlé par observations, par exemple au microscope. La suspension cellulaire est agitée et transférée dans un tube, dont un aliquot d'environ 50N1 est prélevé pour numération des cellules. Après centrifugation (environ 10 minutes à
1200 tours/min), le surnageant est éliminé et une quantité de milieu de culture est ajoutée de façon à avoir une suspension contenant 100 000, 1 million ou 10 millions de cellules par ml selon les besoins. La suspension finale peut être faite à différentes concentrations selon les besoins.
EXEMPLE 2 : Production du construit Le tissu fabriqué contient des cellules associées à un réseau tridimensionnel dense de matrice extracellulaire néosynthétisée par ces mêmes cellules. Cette matrice extracellulaire est produite suite à la stimulation des cellules par l'acide ascorbique, un dérivé synthétique de ce produit ou un nutriment agissant sur la synthèse de matrice extracellulaire, sans avoir recours à l'ajout de matrice exogène.

Ce tissu est réalisé dans des dispositifs de culture, poreux ou non, de tailles variées selon les dimensions désirées. Les fibroblastes sont ensemencés à une densité comprise entre 3000 et 12000 cellules/cm2. Le milieu de culture est changé régulièrement, par exemple 3 fois par semaine pendant 2 à 6 semaines, 5 avec ou sans agitation des cultures, de façon à maintenir des conditions environnementales (physico-chimiques) et nutritionnelles favorables au développement de la culture.
Les cellules impliquées dans la reconstruction du tissu peuvent provenir d'une 10 même population cellulaire ou de populations cellulaires différentes formant ainsi une population hétérogène. II peut s'agir de fibroblastes du ligament parodontal, de cémentoblastes, d'odontoblastes, d'améloblastes, de cellules pulpaires, de fibroblastes des ligaments et tendons, de chondrocytes, d'ostéoblastes, de cellules souches mésenchymateuses, d'extraits de moelle osseuse, de tout autre 15 type cellulaire ayant la capacité de minéraliser notamment sous l'influence de facteurs extérieurs ou d'un mélange desdites cellules. La présence par exemple de cellules du type ostéoblaste ou chondroblaste ou de cellules précurseurs de ces dernières telles que des pré-ostéoblastes ou des pré-chondroblastes ou encore de cellules extraites de la moelle osseuse n'est néanmoins pas 20 nécessaire pour obtenir un construit selon l'invention présentant notamment des zones de minéralisation.
Le tissu peut être composé de plusieurs types cellulaires ne présentant pas de capacité de minéralisation, mais qui peuvent étre stimulés de manière à
25 provoquer cette minéralisation. II peut s'agir par exemple de fibroblastes de la peau et/ou de cellules musculaires.
Le tissu peut être composé de plusieurs types cellulaires à la fois, répartis uniformément ou non.
La minéralisation des tissus peut être obtenue en modifiant les conditions de culture de façon à provoquer la minéralisation de la matrice néosynthétisée.

Cette stimulation peut être obtenue par contact avec un matériau ou des particules de ce même matériau et/ou par l'ajout de facteurs de différentiation, de cytokines, de milieu conditionné, de dexamethasone, de beta-glycérophosphate, beta-aminopropionitrile, par l'ajout de substances synthétiques de type phosphate de calcium, carbonate de calcium, hydroxyapatite, verre bioactif (bioactive glass), de céramiques, de substances naturelles de type corail mais aussi par stimulation mécanique. L'obtention d'un construit selon l'invention présentant des zones de minéralisation ne nécessite pas l'ajout de facteur de croissance, tel que par exemple le TGF-~i1.
A l'issue de la culture des cellules prélevées dans l'Exemple 1, un feuillet est obtenu qui est récupéré par décollement. Le construit est représenté sur les figures 1-5.
EXEMPLE 3 : Implantation d'un construit in vivo Cet exemple décrit l'introduction in vivo d'un implant de l'invention comprenant un construit tissulaire.
Le construit a été préparé comme décrit dans les exemples 1 et 2 à partir de cellules de ligament parodontal (PDL) humain, puis enroulé autour d'un implant en bio-verre (45 S 5). Le construit a été stocké dans du milieu DMEM
additionné
d'antibiotique (gentamycine). Des souris mâles athymiques (Swiss NU/NU de 4 semaines) ont été anesthésiées. Une implantation sous-cutanée, au niveau dorsal, a été réalisée. Pour cela, 4 poches sont préparées sur chaque souris, en conditions stériles. Les implants sont placés dans ces poches, qui sont ensuite suturées. Un pansement a été placé sur la zone suturée.
Un mois après l'implantation, les souris ont été sacrifiées, et les construits ont été récupérés avec le tissu adjacent d'origine murine. L'ensemble a été inclus dans de la résine après fixation. Des coupes ont été produites et colorées au Paragon. Les coupes sont analysées, et les construits obtenus sont comparés à
ceux produits à partir de fibroblastes de peau, traités de façon similaire, et à des construits n'ayant pas subi d'implantation. Les coupes histologiques montrent que les construits issus de PDL selon l'invention et implantés chez les souris présentent des structures fibrillaires denses, proches de celles que l'on trouve dans un ligament parodontal natif. Les résultats obtenus montrent de plus que l'ensemble de fibres est ancré à la surface de l'implant par une couche de minéralisation épaisse, d'origine cellulaire. Ces structures tissulaires sont absentes des autres préparations.
Ces résultats illustrent les avantages des tissus et méthodes de l'invention, permettant la production de construits ayant des propriétés biologiques avantageuses et compatibles avec un usage in vivo. L'insertion in vivo des construits de l'invention permet de stimuler le recrutement de facteurs exogènes à la biopsie d'origine du construit, et entraine une maturation du construit contenant des cellules biologiquement actives.
EXEMPLE 4 : Fabrication du « Ligaplant » à partir de cellules autologues Le « Ligaplant » est un produit destiné à remplacer une dent perdue chez un patient, il associe un ligament reconstitué à partir des cellules de ce patient, à un implant produit à partir d'un biomatériau. Le ligament parodontal est un ligament, qui est ancré sur la racine, principalement, par des céments cellulaire et acellulaire fibrillaires. Ce ligament est aussi rattaché à l'os de l'alvéole par une structure fibrillaire enchâssée dans l'os (fibres de Sharpey). Le ligament est reconstruit à la surface d'un implant, en réunissant les conditions pour qu'un ancrage proche du cément soit synthétisé in vitro, avant la réimplantation du produit. La restauration de l'ancrage du côté de l'alvéole se fera une fois le produit réimplanté. La présence de cette structure tissulaire néoformée oriente le processus de cicatrisation, en évitant l'ostéointégration de l'implant.
L'utilisation des cellules du patient pour reconstruire la partie ligamentaire du Ligaplant en fait un produit autologue.
Une population hétérogène est extraite de la surface de la dent perdue par grattage de la partie médiane de la racine. Cette population comprend les principaux types cellulaires du PDL : fibroblastes, cémentoblastes, cellules endothéliales, et progéniteurs de ces différents types cellulaires. La présence de ces cellules est confirmée à la fois par l'observation en microscopie optique, mais aussi par les résultats des analyses de biologie moléculaire pratiqués sur cette population directement issue de la biopsie extraite de la surface radiculaire.
La détection par RT-PCR des ARN messagers codant pour la phosphatase alcaline, l'ostéocalcine (OCN), l'ostéopontine (OPN), la bone sialo-protéine (BSP) et du collagène de type I, confirme à la fois cette hétérogénéité de la population par la diversité des marqueurs cellulaires exprimés, mais aussi les possibilités, qui existent, de reconstruction du PDL à partir de ces cellules.
Au cours de la phase de prolifération menée pendant le procédé de fabrication du produit, une synthèse importante de collagène de type I prouvant la présence de fibroblastes actifs dans la culture est constatée. Dans le même temps, la phosphatase alcaline et des marqueurs spécifiques de cellules capables de produire une minéralisation de la structure tissulaire (OPN, OCN, BSP) s'expriment.
Ces activités spécifiques sont conservées tout au long du procédé et sont exploitées pour constituer la partie tissulaire du Ligaplant.
La biopsie collectée à la surface de la racine de la dent perdue est traitée par la collagénase, de façon à accélérer l'extraction des cellules. Une étude réalisée par les inventeurs a montré que l'utilisation de la collagénase ne diminue ni les capacités prolifératives des cellules ni leurs capacités à
exprimer des fonctions spécifiques (minéralisation et production de matrice extra cellulaire). A l'issue de la phase d'extraction, on se trouve en présence d'une population hétérogène de cellules à la morphologie bien marquée (cellules rondes :cémentoblastes, cellules allongées : fibroblastes).

La population cellulaire est d'abord amplifiée de façon à augmenter le nombre des cellules récoltées. La prolifération des cellules est maintenue à
un niveau élevé dans la phase exponentielle de la courbe de croissance par des passages répétés, réalisés avant que la culture ne parvienne à confluence. Au cours de cette phase, les conditions de culture (composition du milieu, technique de culture) provoquent une sélection des cellules : les cellules endothéliales disparaissent, en effet elles ne peuvent ni adhérer au support, ni proliférer, alors que les fibroblastes se multiplient activement. La présence des cémentoblastes est détectable par le niveau d'expression des marqueurs de minéralisation qui leur sont spécifiques. La différence de morphologie des cémentoblastes, qui permettait de les identifier sous le microscope, a disparu, tendant à prouver que leur forme a évolué vers une forme en fuseau similaire à celle des fibroblastes. II
s'agit là d'un phénomène courant, constaté lors de la culture de cellules présentes dans des structures tissulaires minéralisées, de type chondrocytes, ostéocytes. Cependant cette dédifférenciation des cémentoblastes semble limitée à leur morphologie. En effet, la production de zones de minéralisation, induite in vitro par adjonction de f3-glycérophosphate au milieu de culture, prouve la fonctionnalité de ces cellules.
A la fin du 3eme passage, les cellules ne sont pas décollées mais laissées dans la boîte de pétri en présence d'un milieu de prolifération, additionné de vitamine C pour stimuler la synthèse de matrice extra cellulaire. Un tapis continu se forme, après 3 semaines de culture, constitué de plusieurs couches de cellules englobées dans une matrice extra cellulaire dense. Dés qu'un nombre, de l'ordre de 5.105 cellules par cm2 de surface de boite de Petri, est obtenu, la culture est prolongée au-delà de la confluence de façon à induire une production importante de matrice extra cellulaire. A la fin de cette étape, la culture s'est structurée et prend la forme d'un feuillet épais constitué de cellules à
l'intérieur d'une matrice extra cellulaire dense.
Ce feuillet est décollé du fond de la boîte par des moyens mécaniques (roulage). II peut être alors manipulé, compte tenu de ses bonnes propriétés mécaniques. Un morceau de 15 cm2 de ce feuillet, est découpé à l'aide d'un scalpel. II est enroulé en plusieurs couches autour de l'implant (cylindre de 5 mm de diamètre et de 11 mm de long) et constitue la partie cellulaire du « Ligaplant ».

Le futur « Ligaplant » est prét pour une phase ultime de différenciation qui doit permettre aux cellules de produire un ancrage minéral. Cette phase est obtenue en cultivant ce construit dans un milieu favorable à la minéralisation pendant semaines.
10 L'ancrage du feuillet sur l'implant est obtenue par synthèse d'une minéralisation de la MEC par les cellules, en présence d'un milieu de culture contenant 10 mM
de f3-glycérophosphate. La nature de l'interface cellules-implant guide cette minéralisation. Les céramiques de phosphate de calcium peuvent ainsi être utilisées pour obtenir un lien direct avec un tissu minéralisant. Les cellules 15 réagissent au contact de ce biomatériau en produisant une couche minérale d'accroche à partir de laquelle un cément est reconstruit lorsque le produit est placé in vivo.
Afin de comprendre comment une telle organisation cellulaire pouvait se 20 différencier in vivo, et comment cet ancrage primaire pouvait évoluer vers un cément, les inventeurs ont procédé à l'implantation sous cutanée au niveau du crane de souris nude (Swiss nu nu) de constructions feuillet -implant.
L'évolution de ces constructions a été évaluée sous forme de cinétique, avec des points pris à 4, 8 et 12 semaines après implantation, en faisant varier différents paramètres 25 telle que l'origine de la biopsie (apex, zone centrale de la racine, collet), la nature du matériau constituant l'implant (dentine, hydroxyapatite, titanes revêtus de phosphate de calcium).
Les résultats les plus significatifs ont été obtenus avec un feuillet constitué
30 de cellules extraites d'une biopsie correspondant au PDL de la partie médiane de la racine de la dent, appliquées sur un implant d'hydroxyapatite. Par l'utilisation d'immunomarquage (anticorps spécifiques de composants du tissu humain) les inventeurs ont pu vérifié que les constructions n'étaient pas dénaturées par la présence du tissu murin environnant et qu'elles préservaient leur identité
structurale spécifique d'origine. Les marquages effectués permettent d'identifier l'origine des tissus reconstruits après réimplantation. Les inventeurs ont pu constater qu'il existait une limite bien identifiée entre l'implant et les cellules humaines qui lui sont associées et le tissu murin environnant.
L'intensité de la minéralisation de la MEC a été mesurée par des traitements appropriés des coupes histologiques. Les résultats obtenus montrent une évolution progressive en fonction du temps de l'épaisseur des couches minéralisées présentent à l'interface de l'hydroxyapatite. Au fur et à mesure que ce processus se développe apparaissent de façon marquée des fibres de collagène enchâssées dans ce substrat minéral. II est possible de constater par endroits la présence de cellules incluses dans la partie minérale. Ces éléments structuraux sont présents sur toute l'interface cellules-biomatériau. Les conclusions de cette analyse histologique montrent qu'un tissu caractéristique du cément cellulaire fibrillaire, avec une quantité importante de fibres de Sharpey, est reconstruit par les cellules du PDL et constitue un ancrage du feuillet sur l'implant.
L'implant étant soumis à des charges importantes, le matériau constitutif a été sélectionné pour obtenir la bio-compatibilité optimale tout en gardant une résistance mécanique comparable à celle des implants de type « ostéo intégrés ». Le matériau qui a été choisi pour constituer l'implant est produit par bio activation du titane.
La couche d'apatite d'ancrage naturellement produite est très fine (~1 pm), ce qui élimine le risque de rupture fragile dans la couche (71 ) et préserve la micro-rugosité de surface de l'implant (et donc la liaison mécanique entre les phases métalliques et minérales). En outre et du fait du procédé chimique et physiologique d'activation du titane, la liaison titane-apatite est une liaison de type covalente résistante qui constitue une transition continue entre les 2 phases.

Claims (28)

REVENDICATIONS

1. Construit cellulaire cultivé in vitro caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle et (II) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont emprisonnées, et en ce qu'il comprend, parmi lesdites cellules, des cellules ayant une capacité de minéralisation et/ou d'ossification.

2. Construit selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il possède une épaisseur comprise entre 30 et 120 microns, de préférence entre 50 et 120 microns.

3. Construit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules animales sont des cellules de mammifère, préférentiellement des cellules humaines.

4. Construit selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules animales sont des cellules souches indifférenciées et/ou des cellules dérivées de tissus matures.

5. Construit selon la revendication 4, caractérisé en ce que les cellules dérivées de tissus matures sont des cellules issues du muscle, de l'os de la dent, du cartilage, du tendon et/ou du ligament, en particulier du ligament parodontal ou antérieur croisé.

6. Construit selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules dérivées du ligament parodontal comprennent des fibroblastes, des cellules épithéliales, des cémentoblastes, des ostéoblastes et/ou des progéniteurs de ces différents types cellulaires.

7. Construit selon la revendication 4, caractérisé en ce que les cellules souches indifférenciées sont des cellules mésenchymateuses ou des cellules isolées à partir d'un extrait de moelle osseuse.

8. Construit selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une seule population cellulaire ou une combinaison de plusieurs populations cellulaires.

9. Construit selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend dans son épaisseur une couche basale et une couche apicale par rapport au support de culture, ladite couche basale étant riche en collagène et comprenant en outre des fibroblastes et des cellules progénitrices à l'origine de la minéralisation et/ou de l'ossification, et ladite couche apicale étant moins riche en collagène que ladite couche basale.

10. Construit ou tissu cellulaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou de charpente synthétique, de cellules dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et une étape de décollement du construit de son support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-même, permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.

11. Construit ou tissu cellulaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou charpente synthétique, de cellules de ligament parodontal ou antérieur croisé dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et, de préférence, une étape de décollement du construit de son support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-même, permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.

12. Construit ou tissu cellulaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou charpente synthétique, de cellules dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire endogène, et dans des conditions stimulant la minéralisation ou l'ossification.

13. Construit cellulaire cultivé in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 µm environ.

14. Construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à partir de ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 µm environ.

15. Construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à partir de ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle, et (ii) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 µm environ et en ce qu'il comporte des cellules présentant une capacité de minéralisation et/ou des zones minéralisées.

16. Procédé de préparation d'un construit cellulaire selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) la culture de cellules d'intérêt dans des conditions adaptées à la synthèse d'une matrice extra-cellulaire et à la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans la matrice extracellulaire endogène néosynthétisée, et b) la récupération du construit.

17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, préalablement aux étapes a) et b), les étapes a') et b') suivantes:
a') l'extraction des cellules d'intérêt d'un ou de plusieurs tissus, et b') l'amplification desdites cellules extraites dans un milieu approprié, typiquement en présence d'acide ascorbique ou d'un dérivé dudit acide.

18. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape c) de récupération du construit cellulaire et une étape d) d'augmentation artificielle de l'épaisseur dudit construit, notamment par repliement, roulement du construit sur lui-même ou rétractation du construit.

19. Procédé selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que les cellules sont cultivées en présence d'un stimulus choisi parmi un support ou matériau minéralisant, des particules de ce matériau, des facteurs de différenciation, un milieu conditionné, une substance synthétique et/ou une substance naturelle.

20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le support ou matériau minéralisant comprend de l'hydroxyapatite, du bio-verre, un substitut osseux, une céramique, du corail ou un matériau composite dont la surface est revêtue de l'un de ces composés.

21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le support ou matériau minéralisant est produit à partir d'un matériau inerte bio-activé par le greffage en surface de substances susceptibles d'induire la minéralisation du construit.

22. Utilisation d'un construit selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'un implant.

23. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'implant est un implant dentaire ou ligamentaire.

24. Méthode de préparation d'un implant à l'aide d'un construit selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enroulement dudit construit à la surface de l'implant et la mise en culture dudit implant associé audit construit dans des conditions permettant de maintenir ou stimuler la prolifération et/ou la différentiation des cellules tout en favorisant la fusion et le remodelage des différentes couches cellulaires dudit construit à la surface de l'implant.

25. Utilisation d'un construit selon l'une quelconque des revendications 1 à

pour l'évaluation in vitro de molécules destinées à un usage thérapeutique.

26. Kit pour la préparation d'un construit selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 ou pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 16 à 21, comprenant un conteneur et des réactifs de culture.

27. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un construit cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, et un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.

28. Implant, caractérisé en ce qu'il comporte une partie recouverte d'un construit cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.