EP1448994A2 - Isotopencodierte affinitätsmarker - Google Patents

Isotopencodierte affinitätsmarker

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Publication number
EP1448994A2
EP1448994A2 EP02779513A EP02779513A EP1448994A2 EP 1448994 A2 EP1448994 A2 EP 1448994A2 EP 02779513 A EP02779513 A EP 02779513A EP 02779513 A EP02779513 A EP 02779513A EP 1448994 A2 EP1448994 A2 EP 1448994A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
prg
group
compound
affinity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02779513A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oswald Lockhoff
Thomas Lehmann
Hans-Georg Lerchen
Dorian Immler
Hans-Ulrich Siegmund
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer Healthcare AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Healthcare AG filed Critical Bayer Healthcare AG
Publication of EP1448994A2 publication Critical patent/EP1448994A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
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    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals

Definitions

  • the invention relates to new, isotope-coded affinity markers for the mass spectrometric analysis of proteins as well as their production and use.
  • Proteomics technology opens up the possibility of identifying new biological targets and markers by analyzing biological systems at the protein level. It is known that only a certain part of all possible proteins of the proteins encoded in the genome is expressed, whereby, for example, tissue type, development status, activation of receptors or cellular interactions influence the expression patterns and rates. In order to determine differences in the expression of proteins in healthy or diseased tissue, various comparative methods for analyzing protein expression patterns can be used ((a) S.P. Gygi et al., Proc. ⁇ atl.
  • this method can be used for the quantitative analysis of complex protein mixtures ((a) SP Gygi et al., ⁇ ature Biotechnology, 1999, 17, 994; (b) RH Aebersold et al ., WO 00/11208).
  • the method is based on the fact that each of two or more protein mixtures to be compared, which have been obtained in different cell states, is reacted with an affinity marker of a different isotope coding.
  • the protein mixtures are then combined, if necessary fractionated or proteolytically treated and purified by affinity chromatography.
  • LC-MS liquid chromatography and mass spectrometry
  • Couples or groups of with themselves only in the Isotope coding distinguishing affinity markers labeled peptides are chemically identical and are eluted almost simultaneously in high pressure liquid chromatography (HPLC), but they differ in the mass spectrometer by the respective molecular weight differences due to different isotope patterns of the affinity markers.
  • Relative protein concentrations can be obtained directly by measuring the peak areas.
  • Suitable affinity markers are conjugates of affinity ligands which are covalently linked to protein-reactive groups via bridge members. Different isotopes are built into the bridge members. The method was based on affinity markers in which hydrogen atoms were replaced by deuterium atoms (1H / 2 D-
  • Peptides can be chemically very different, which in HPLC leads to elution behavior that is no longer simultaneous. Because related fragments are no longer eluted at the same time, effective processing of large peptide mixtures is severely limited. There are large differences in the use of affinity markers, which are either from the 1 H isotopes or the 2 D
  • Isotopes are built up and are noticeable in different elution behavior of the respective peptide samples.
  • PRG stands for a protein-reactive group and L stands for an A and PRG covalently linking linker
  • the affinity markers of the formula (I) according to the invention preferably have two or more carbon atoms of the isotope C, particularly preferably three, six, nine, twelve, 15, 18, 21 or 24 carbon atoms, in particular six, twelve, 18 or 24 C-atoms. Two or more carbon atoms can be linked to one another by carbon bonds, for example three carbon atoms. Even several can
  • Groups of C atoms linked in this way are present separately from one another in the affinity marker, for example two or more groups with three 13 C atoms each.
  • Affinity ligand A is used for the selective enrichment of samples using affinity chromatography.
  • the affinity columns are provided with the corresponding complementary partners to the affinity ligands, which form covalent or non-covalent bonds with the affinity ligands.
  • An example of a suitable affinity ligand is biotin or a biotin derivative which forms strong, non-covalent bonds with the complementary proteins avidin or streptavidin.
  • Affinity chromatography can be selectively isolated from sample mixtures.
  • carbohydrate residues for example, which cannot enter into covalent interactions with, for example, fixed lectins, can also be used as affinity ligands.
  • affinity ligands for example, the alternating effect of t haptens with antibodies or the interaction of transition metals with suitable ligands are used as complexing agents or other
  • Protein-reactive groups PRG are used for the targeted labeling of proteins on selected functional groups. PRGs have a specific reactivity for terminal functional groups of the proteins. Amino acids as elements of
  • Proteins that are frequently used for targeted labeling are, for example, mercaptoaminomonocarboxylic acids such as cysteine, diaminomonocarboxylic acids such as lysine or arginine or monoaminodicarboxylic acids such as aspartic acid or glutamic acid.
  • Protein-reactive groups can be, for example, thiol-reactive groups such as epoxides, ⁇ -haloacyl groups, nitriles, maleimides, sulfonated alkyl or arylthiols.
  • Carboxylate-reactive groups contain, for example, amines or alcohols in the presence of dehydrating agents.
  • protein-reactive groups can also be phosphate-reactive groups such as, for example, metal chelates and aldehyde-reactive and ketone-reactive groups such as, for example, amines
  • Sodium borohydride or sodium cyanoborohydride can be reduced. It can also be groups which react with the reaction products after targeted protein derivatization, such as, for example, a bromine cyanide cleavage or an elimination of phosphate groups etc.
  • Preferred compounds according to the invention are those of the formula (11)
  • PRG stands for a protein-reactive group, in particular for a
  • Epoxy a malemimido group, a halogen or an acrylic radical or another known protein-reactive group, such as, for. B. by W.H. Scouten in Methods in Enzymology, Volume 135, edited by Klaus Mosbach, Academic Press Inc. 1987, p. 30ff.
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 independently of one another and also for X 2 independently of other X 2 in the linker group for O, S, NH, NR, CO, CO-O, O-CO, CO-S, S -CO, SS, SO, SO 2 , CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, Si-O, O-Si, an arylene or diarylene group, where also X 1 , X 2 , X 3 or X 4 may be partially or completely absent,
  • B 1 and B 2 independently of one another represent optional fragments which are as
  • Bridges enable or facilitate the linking of A or PRG to the linker L and, if necessary, improve the solubility and for CO-O, O-CO, CO, NR, CO-NR,
  • NR-CO CS-NR
  • NR-CS NR-CS and which contain one or more, preferably between 1 and 10 CH groups, either alone or in combination with other groups, for example (CH 2 ) q -CONR, (CH 2 ) q -NR or (CH 2 ) q ,
  • n, p, q and x can independently represent numbers with the respective values from 0 to 100, the sum of n + xm + p + q preferably being less than 100 and particularly preferably between 10 and 30 and R represents alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxycarbonyl, aralkoxycarbonyl or aryl.
  • Formulas (I) or (II) can be used to analyze proteins and protein functions in complex mixtures.
  • the invention furthermore relates to the use of one or more differently isotope-labeled compounds according to the invention as a reagent for the mass spectrometric analysis of proteins, in particular for the identification of one or more proteins or protein functions in one or more protein-containing samples and for the determination of the relative expression levels of one or more proteins in one or more protein-containing samples.
  • the present application also describes an improved process for the preparation of the compounds of the formula (I) or (II), both in the form of the 12 C isotope pattern and those with 13 C labeling.
  • a major impairment in the use of the compounds mentioned in WO 00/11208 is their poor accessibility.
  • the affinity markers can only be accessed via several stages and in pure form in very low yield. At the end of the synthetic route, the affinity markers must be isolated by lossy HPLC purification steps. Overall, the compounds can only be prepared with unsatisfactory results by the processes described, which is why the isotope-labeled reagents in particular are poorly available and therefore expensive, which contradicts the widespread use of the method.
  • the present invention therefore also relates to a process for the preparation of an organic compound of the formula (I),
  • A stands for an affinity ligand residue
  • PRG for a protein-reactive group
  • L for an A and PRG covalently linking linker
  • Suitable protective groups are alkoxycarbonyl or aralkoxycarbonyl radicals customary in peptide chemistry, for example methoxycarbonyl (MOC), ethoxycarbonyl (EOC), trichloroethoxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl (BOC), benzyloxycarbonyl or fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC), which are reacted by reacting the corresponding chloroformate or alkylene acid
  • Aralkyl chloroformate can be obtained in the presence of inorganic or organic bases.
  • the chloroformic acid esters can be reacted with the ⁇ -diamino-oxaalkanes in an equimolar amount and at a reduced reaction temperature.
  • Temperature ranges are between -78 ° C and + 20 ° C, preferred ranges are - in ⁇
  • the reaction mixture thus obtained can be purified in a simple manner and without costly preparative HPLC purification method by distribution between aqueous and nonpolar organic solvent phase.
  • the polar, unreacted ⁇ , ⁇ -diamino-oxaalkanes remain in the aqueous phase, while the conjugates L-SG (monocarbamates) and the conjugates SG-L-SG (dicarbamates) formed in small quantities accumulate preferentially in the organic phase.
  • L-SG monocarbamates
  • SG-L-SG dicarbamates
  • the reaction of the crude mixture of the conjugates L-SG such as 1 (Scheme 1) with the affinity ligands A can again be carried out according to known methods.
  • Activated affinity ligands are, for example, biotin pentafluorophenyl ester or mixed anhydrides composed of biotin and alkyl chloroformate.
  • the reaction mixture can be worked up by simple distribution between aqueous and organic phases.
  • the conjugates A-L-SG such as 2 are obtained in high yields.
  • the selective cleavage of the temporary protective groups SG provides conjugates of affinity ligand and ligand A-L. These reactions can in turn be carried out using known methods.
  • the protein-reactive groups PRG can be introduced into the conjugates AL using known methods.
  • AL iodoacetic anhydride
  • conjugates AL-PRG are obtained which, as a protein-reactive group, have an iodoacetamide group (for example 4) which react selectively with sulfhydryl groups in cysteine side chains of peptides or proteins.
  • Sulfhydryl groups react conjugates AL-PRG, in which PRG stands for maleimide residues (for example 5 or 6).
  • Raney nickel 2.5 g was added to the solution of compound 7 (5.0 g; 22.9 mmol) in methanol (115 ml) and concentrated aqueous ammonia solution (68 ml) and for 5 hours at 100 ° C. and 100 hydrogenated bar. After cooling to room temperature, the catalyst was suctioned off. The filtrate was concentrated
  • affinity purification of derivatized peptides was carried out on freshly prepared affinity columns (Monomeric Avidin, Perbio Science GmbH, Bonn) with a column volume of 200 ⁇ l, which were prepared by the following washing steps: a) two column volumes 2xPBS; b) four column volumes of 30% (v / v) acetonitrile / 0.4% (v / v) trifluoroacetic acid; c) seven column volumes of 2xPBS; d) four column volumes of 2 mM biotin in 2xPBS; e) six column volumes of 100 mM glycine, pH 2.8 and f) six column volumes of 2xPBS.
  • the sample (30 ul) was diluted with 30 ul 2xPBS before application and then applied to the column.
  • the following washing steps were then carried out to remove the non-biotinylated peptides: a) six column volumes of 2xPBS; b) six column volumes of PBS; c) six column volumes of 50 mM ammonium hydrogen carbonate / 20% (v / v) methanol and d) one column volume of 0.3% (v / v)
  • the sample was eluted with the following steps: a) three column volumes of 0.3% (v / v) formic acid and b) three column volumes of 30% (v / v) acetonitrile / 0.4% (v / v) trifluoroacetic acid.
  • the eluate was evaporated to dryness and only dissolved again shortly before the analysis with mass spectrometry.
  • Phase column (C 18 phase) used.
  • the peptides were dissolved in eluent A (0.025% (v / v) trifluoroacetic acid) and injected. They were eluted with a gradient of eluent B (0.025% (v / v) trifluoroacetic acid, 84% (v / v) acetonitrile).
  • the eluting peptides were automatically recognized by the device's acquisition software and fragmented for identification. The identity of the peptides could thus be clearly determined.
  • 1 shows a chromatogram as is customary for peptide mixtures. It elutes a variety of peptides. In Fig. 2 to 5 are ion traces two? Peptide pairs shown.
  • the intensity of the signals is plotted in a mass range which corresponds to the triple positively charged peptide ions. It is clearly in Fig. 2 and 4 to see that the light and heavy variant of a peptide conjugate ICAT ® not co-elute when the derivatization with the unlabeled (Do) and the 8-fold deuterium-labeled (D 8) ICAT ® are performed , The runtime differences are 0.2 to 0.5 minutes depending on the size of the peptide and the number of cysteines in the sequence, with the deuterium-containing form eluting earlier.
  • Fig. 2 Ion traces of the light and heavy variants of the peptide TCVADESHAGCEK (triple-charged peptide ions) from bovine serum albumin
  • Fig. 4 Ion traces of the light and heavy variants of the peptide ALCSEKLDQWLCEK (triple-charged peptide ions) from bovine lactalbumin when using D 0 / D 8 -ICAT ® s.
  • 5 ion traces of the light and heavy variants of the peptide ALCSEKLDQWLCEK (triple-charged peptide ions) from bovine lactalbumin when using the 13 C ⁇ 3 C 6 affinity markers of Examples 4 and 12.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue, isotopencodierte Affinitätsmarker zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen sowie deren Herstellung und Verwendung.

Description

Isotopencodierte Affinitätsmarker
Die Erfindung betrifft neue, isotopencodierte Affinitätsmarker zur massenspektro- metrischen Analyse von Proteinen sowie deren Herstellung und Nerwendung.
Die Proteomics-Technologie eröffnet die Möglichkeit, durch Analyse von biologischen Systemen auf der Proteinebene neue biologische Targets und Marker zu identifizieren. Es ist bekannt, dass von den im Genom codierten Proteinen nur jeweils ein bestimmter Teil aller möglichen Proteine exprimiert wird, wobei beispielsweise 'Gewebetyp, Entwicklungsstand, Aktivierung von Rezeptoren oder zelluläre Interaktionen die Expressionsmuster und -raten beeinflussen. Um Unterschiede der Expression von Proteinen in gesundem oder krankem Gewebe festzustellen, können verschiedene vergleichende Methoden zur Analyse von Protein-Expressionsmustern herangezogen werden ((a) S. P. Gygi et al., Proc. Νatl.
Acad. Sei. U. S. A., 2000, 97, 9390; (b) D. R. Goodlett et al., Proteome Protein Anal, 2000, 3; (c) S. P. Gygi et al, Curr. Opin. Biotechnol., 2000, 11, 396).
Eine leistungsfähige Methode ist dabei die massenspektrometrische Detektion von Proteinen. Bei Nerwendung von unterschiedlich isotopencodierten Affimtätsmarkem
(ICAT® = Isotope Coded Affinity Tags) und Tandem-Massenspektrometrie kann dieses Verfahren zur quantitativen Analyse von komplexen Proteinmischungen herangezogen werden ((a) S. P. Gygi et al., Νature Biotechnology, 1999, 17, 994; (b) R. H. Aebersold et al., WO 00/11208). Das Verfahren beruht darauf, dass jede von zwei oder mehr zu vergleichenden Proteinmischungen, die in verschiedenen Zeilzuständen erhalten worden sind, mit einem Affinitätsmarker anderer Isotopencodierung umgesetzt wird. Die Proteinmischungen werden danach kombiniert, gegebenenfalls fraktioniert oder proteolytisch behandelt und aff itäts- chromatographisch gereinigt. Nach Elution der gebundenen Fragmente werden die Eluate durch Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massenspek- trometrie (LC-MS) analysiert. Paare bzw. Gruppen von mit sich nur in der Isotopencodierung unterscheidenden Affimtätsmarkem markierten Peptiden sind chemisch identisch und werden in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) nahezu zeitgleich eluiert, sie unterscheiden sich im Massenspektrometer jedoch um die jeweiligen Molekulargewichtsdifferenzen aufgrund unterschiedlicher Isotopenmuster der Affinitätsmarker. Relative Proteinkonzentrationen können direkt durch Messungen der Peakflächen erhalten werden. Geeignete Affinitätsmarker sind Konjugate aus Affinitätsliganden, die über Brückenglieder kovalent mit proteinreaktiven Gruppen verknüpft sind. Dabei werden in die Brückenglieder unterschiedliche Isotope eingebaut. Das Verfahren wurde anhand von Affinitätsmarkern, in denen Wasserstoff- Atome durch Deuterium- Atome ersetzt wurden (1H/2D-
Isotopencodierung), beschrieben.
Es hat sich jedoch gezeigt, dass das zur Codierung der beschriebenen Affinitätsmarker verwendete Isotopenpaar 1H/2D nicht in jedem Fall gleichwertig eingesetzt werden kann. Paare von mit 1H/2D-Isotopencodierung affinitätsmarkierten
Peptiden können chemisch recht unterschiedlich sein, was in der HPLC zu einem nicht mehr zeitgleichen Elutionsverhalten führt. Weil nun zusammengehörige Fragmente nicht mehr zeitgleich eluiert werden, ist eine effektive Prozessierung großer Peptidmischungen stark limitiert. Es gibt große Unterschiede bei der Verwendung von Affinitätsmarkern, die entweder aus den 1H-Isotopen oder der 2D-
Isotopen aufgebaut sind und die sich in unterschiedlichem Elutionsverhalten der j eweiligen Peptid-Proben bemerkbar machen.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die Unterschiede zwischen den 12C- und 13C-markierten Peptid-Proben nur marginal sind und die entsprechend markierten Substanzen ein nahezu identisches Elutionsverhalten in der HPLC aufweisen. Durch diese Markierungsmethode ist eine parallele Handhabung möglich, was zu einer starken Vereinfachung der Analysen führt. Durch Verwendung von 12C/13C-isotopencodierten Affinitätsmarkern können jetzt zugehörige Fragmente verschiedener Proben durch gemeinsame Aufarbeitung, Reinigung und massen- spektrometrische Detektion analysiert werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher organische Verbindungen, geeignet als Affinitätsmarker zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen* der Formel (I)
A-L-PRG (I)
in der
A für einen Affϊnitätsliganden-Rest,
PRG für eine proteinreaktive Gruppe und L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht,
die mindestens ein Kohlenstoff- Atom des Isotops 13C aufweisen.
Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Affinitätsmarker der Formel (I) zwei oder mehr Kohlenstoff- Atome des Isotops C auf, besonders bevorzugt drei, sechs, neun, zwölf, 15, 18, 21 oder 24 C-Atome, insbesondere sechs, zwölf, 18 oder 24 C-Atome. Dabei können zwei oder mehr C-Atome durch C- C-Bindungen miteinander verknüpft sein, beispielsweise drei C-Atome. Auch können mehrere
Gruppen derart verknüpfter C-Atome voneinander getrennt im Affinitätsmarker vorliegen, beispielsweise zwei oder mehr Gruppen mit je drei 13C-Atomen.
Der Affinitätsligand A dient zur selektiven Anreicherung von Proben mit Hilfe der Affinitätschromatographie. Die Affmitätssäulen sind mit den entsprechenden komplementären Partnern zu den Affmitätsliganden versehen, welche kovalente oder nicht kovalente Bindungen mit den Affinitätsliganden eingehen. Ein Beispiel für einen geeigneten Affmitätsliganden ist Biotin oder ein Biotin-Derivat, das mit den komplementären Proteinen Avidin oder Streptavidin starke, nicht kovalente Bindungen eingeht. Auf diese Weise können zu untersuchende Proben mit Hilfe der
Affinitätschromatographie selektiv aus Probenmischungen isoliert werden. Im gleichen Sinn können beispielsweise auch Kohlenhydrat-Reste, die nicht kovalente Wechselwirkungen mit beispielsweise fixierten Lektinen eingehen können, als Affmitätsliganden verwendet werden. Weiterhin kann im gleichen Sinn die Wechselt Wirkung von Haptenen mit Antikörpern oder die Interaktion von Übergangsmetallen mit entsprechenden Liganden als Komplexbildner genutzt werden oder andere
Systeme die miteinander in Wechselwirkung treten.
Proteinreaktive Gruppen PRG dienen der gezielten Markierung der Proteine an ausgewählten funktionellen Gruppen. PRG haben eine spezifische Reaktivität für endständige funktionelle Gruppen der Proteine. Aminosäuren als Elemente von
Proteinen, die häufig für gezielte Markierungen verwendet werden, sind beispielsweise Mercaptoaminomonocarbonsäuren wie Cystein, Diaminomonocar- bonsäuren wie Lysin oder Arginin oder Monoaminodicarbonsäuren wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Proteinreaktive Gruppen können beispielsweise thiolreaktive Gruppen sein wie Epoxide, α-Haloacylgruppen, Nitrile, Maleinimide, sulfoniertes Alkyl oder Arylthiole. Carboxylatreaktive Gruppen enthalten beispielsweise Amine oder Alkohole in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln. Weiterhin können proteinreaktive Gruppen auch phosphatreaktive Gruppen wie beispielsweise Metallchelate sowie aldehydreaktive und ketonreaktive Gruppen wie beispielsweise Amine sein, die nach Bildung einer Schiff-Base gegebenenfalls mit
Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid reduziert werden. Ebenso können es Gruppen sein, die nach einer gezielten Proteinderivatisierung wie beispielsweise einer Bromcyanspaltung oder einer Elimination von Phosphatgruppen etc. mit den Umsetzungsprodukten reagieren.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind solche der Formel (11)
A-BI-X1-(CH2)π-[X -(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-B2-PRG (II)
in der A für einen Affmitätsliganden, insbesondere Biotin, steht,
PRG für eine proteinreaktive Gruppe steht, insbesondere für ein,
Epoxid, eine Malemimidogruppe, ein Halogen oder ein Acrylrest oder eine andere bekannte proteinreaktive Gruppe, wie sie z. B. von W.H. Scouten in Methods in Enzymology, Volume 135, edited by Klaus Mosbach, Academic Press Inc. 1987, S. 30ff beschrieben und zusammengefasst sind,
X1, X2, X3 und X4 unabhängig voneinander und auch für X2 unabhängig von anderen X2 in der Linkergruppe für O, S, NH, NR, CO, CO-O, O-CO, CO-S, S-CO, S-S, SO, SO2, CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, Si-O, O-Si, eine Arylen- oder Diarylengruppe steht, wobei auch X1, X2, X3 oder X4 teilweise oder vollständig nicht vorhanden sein können,
B1 und B2 unabhängig voneinander für optionale Fragmente stehen, die als
Brücken die Verknüpfung von A oder PRG an den Linker L ermöglichen oder erleichtern und dabei gegebenenfalls die Löslichkeit verbessern und für CO-O, O-CO, CO, NR, CO-NR,
NR-CO, CS-NR, NR-CS stehen und die eine oder mehrere, bevorzugt zwischen 1 und 10 CH -Gruppen enthalten, entweder allein oder in Kombination mit anderen Gruppen, beispielsweise (CH2)q-CONR, (CH2)q-NR oder (CH2)q,
m, n, p, q und x unabhängig voneinander für Zahlen stehen können mit den jeweiligen Werten von 0 bis 100, wobei die Summe von n + xm + p + q bevorzugt kleiner als 100 ist und besonders bevorzugt zwischen 10 und 30 liegt und R für Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxycarbonyl, Aralkoxycarbonyl oder Aryl steht.
Die entsprechenden C-haltigen Verbindungen der Formeln (I) oder (II) sind in der WO 00/11208 beschrieben. Dort ist auch beschrieben, wie die Verbindungen der
Formeln (I) oder (II) zur Analyse von Proteinen und Proteinfunktionen in komplexen Mischungen verwendet werden können.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer oder mehrerer unterschiedlich isotopenmarkierter erfmdungsgemäßer Verbindungen als Reagenz zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, insbesondere zur Identifikation von einem oder mehreren Proteinen oder Protein-Funktionen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben und zur Bestimmung der relativen Expressions-Niveaus von einem oder mehreren Proteinen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch ein verbessertes Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) oder (II), sowohl in der Form der 12C - Isotopenmuster als auch solcher mit 13C-Markierung.
Eine wesentliche Beeinträchtigung in der Verwendung der in WO 00/11208 genannten Verbindungen besteht in deren schlechter Zugänglichkeit. Die Affinitätsmarker sind nur über mehrere Stufen und in reiner Form nur in sehr geringer Ausbeute zugänglich. A Ende der Synthesewege müssen die Affinitätsmarker durch verlustreiche HPLC-Reinigungsschritte isoliert werden. Insgesamt lassen sich nach den beschriebenen Verfahren die Verbindungen nur mit unbefriedigenden Ergebnissen herstellen, weshalb ganz besonders die isotopenmarkierten Reagenzien schlecht verfügbar und somit teuer sind, was einer breiten Verwendung der Methode entgegenspricht.
Es hat sich herausgestellt, dass ein Flaschenhals in den beschriebenen Synthesesequenzen die Monofunktionalisierung von ,ω-Diamino-oxaalkanen ist. So ergibt die selektive Michael- Addition von Acrylamid-Derivaten an l,9-Tetradeutero-3,6- dioxa-l,9-nonandiamin das Monosubstitutionsprodukt nur in sehr schlechter Ausbeute (WO 00/11208, Seite 51; Verbindung 27). Auch die Monofunktio^ nalisierung von 4,7J0-Trioxa-l,13-tridecandiamin mit Biotin-pentafluorphenylester und dessen folgende Umsetzung mit Iodessigsäureanhydrid zum N-(13-Iodacet- amido-4,7-10-trioxatridecanyl)-biotinamid (Nature Biotechnology, 1999, 17, 994) liefert das Affmitätsmarker-Reagenz nur nach verlustreicher HPLC-Reinigung in schlechten Ausbeuten.
Es wurde gefunden, dass das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen (I) und
(II) sowohl in unmarkierter Form als auch m C-markierter Form verbessert werden kann, wenn die Differenzierung der beiden Aminogruppen in α,ω-Diamino- oxaalkanen, die als Linker L dienen können, zunächst durch die selektive Einführung einer temporären Schutzgruppe (SG) bewerkstelligt wird (Schema 1).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Herstellung einer organischen Verbindung der Formel (I),
A-L-PRG (I)
in der
A für einen Affinitätsliganden-Rest, PRG für eine proteinreaktive Gruppe und L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht,
durch Substitution eines α,ω-Diamins mit einem Affinitätsliganden-Rest und einer proteinreaktiven Gruppe in beliebiger Reihenfolge,
dadurch gekennzeichnet, dass i) das α,eo-Diamin zunächst einseitig mit einer Schutzgruppe SG geschützt wird,
und anschließend entweder j,
ii) das einseitig geschützte α,ω-Diamin mit einem Affinitätsliganden zu dem
Zwischenprodukt A-L-SG umgesetzt wird,
iii) die Schutzgruppe aus dem Zwischenprodukt A-L-SG entfernt wird und
iv) mit einer proteinreaktiven Verbindung zu einer Verbindung der Formel (I) umgesetzt wird.
oder
ii') das einseitig geschützte α,ω-Diamin mit einer proteinreaktiven Verbindung zu dem Zwischenprodukt SG-L-PRG umgesetzt wird,
in') die Schutzgruppe aus dem Zwischenprodukt SG-L-PRG entfernt wird und
iv') mit einem Affmitätsliganden zu einer Verbindung der Formel (I) umgesetzt wird.
Geeignete Schutzgruppen sind in der Peptidchemie übliche Alkoxycarbonyl- oder Aralkoxycarbonyl-reste, beispielsweise Methoxycarbonyl (MOC), Ethoxycarbonyl (EOC), Trichlorethoxycarbonyl, tert-Butyloxycarbonyl (BOC), Benzyloxycarbonyl oder Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC), die durch Umsetzung der entsprechenden Chlorameisensäure-alkylester oder Chlorameisensäure-aralkylester in Gegenwart von anorganischen oder organischen Basen erhalten werden können. Die Chlorameisensäureester können in äquimolarer Menge und bei erniedrigter Reaktionstemperatur mit den ,ω-Diamino-oxaalkanen umgesetzt werden. Geeignete
Temperaturbereiche sind zwischen -78°C und +20°C, bevorzugte Bereiche sind - in ¬
zwischen -30°C und 0°C. Die auf diese Weise erhaltene Reaktionsmischung kann in einfacher Weise und ohne aufwendige präparative HPLC-Reinigungsverfahren durch Verteilung, zwischen wässriger und unpolarer organischer Lösungsmittelphase, gereinigt werden. Die polaren, nicht umgesetzten α,ω-Diamino-oxaalkane verbleiben in der wässrigen Phase, wälirend die Konjugate L-SG (Monocarbamate) und die in geringer Menge entstandenen Konjugate SG-L-SG (Dicarbamate) sich bevorzugt in der organischen Phase anreichern. Bei sehr langkettigen Oligoethylenoxiden kann es von Vorteil sein, die Mischung der Mono- und Dicarbamate durch Aussalzen in die organische Phase zu treiben.
Die Umsetzung der Rohmischung der Konjugate L-SG wie beispielsweise 1 (Schema 1) mit den Affinitätsliganden A kann wiederum nach bekannten Methoden erfolgen. Aktivierte Affinitätsliganden sind beispielsweise Biotin-pentafluorphenylester oder gemischte Anhydride aus Biotin und Chlorameisensäurealkylester. Auch auf dieser Stufe kann die Aufarbeitung der Reaktionsmischung durch einfache Verteilung zwischen wässrigen und organischen Phasen erfolgen. Auf diese Weise werden die Konjugate A-L-SG wie beispielsweise 2 in hohen Ausbeuten erhalten. Die selektive Abspaltung der temporären Schutzgruppen SG liefert Konjugate aus Affinitätsligand und Ligand A-L. Diese Reaktionen können wiederum nach bekannten Methoden erfolgen.
Insgesamt lassen sich also durch Verwendung von Schutzgruppen die Konjugate A-L wesentlich einfacher und mit besseren Ausbeuten erhalten als nach den bisher beschriebenen Methoden.
Die Einführung der proteinreaktiven Gruppen PRG in die Konjugate A-L gelingt nach bekannten Verfahren. Durch Umsetzung von A-L mit Iodessigsäureanhydrid werden Konjugate A-L-PRG erhalten, die als proteinreaktive Gruppe eine Iodacet- amid-Gruppe aufweisen (beispielsweise 4), welche selektiv mit Sulfhydrylgruppen in Cystein-Seitenketten von Peptiden oder Proteinen reagieren. Ebenfalls mit Sulfhydryl-Gruppen reagieren Konjugate A-L-PRG, in denen PRG für Maleinimid- Reste steht (beispielsweise 5 oder 6). i
Es wurde ferner gefunden, dass das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung der Konjugate A-L-PRG vorteilhaft auch verwendet werden kann, wenn in den Linkereinheiten L einzelne 12C-Atome durch 13C-Atome ausgetauscht sind
(Schema 2). Die jeweiligen chemischen Schritte sind direkt auf die 13C-Bausteine übertragbar. Hierbei ist von besonderem Vorteil, dass die teilweise sehr teuren C- markierten Zwischenstufen mit guten Ausbeuten und wiederum ohne aufwendige HPLC-Reinigungen hergestellt werden können.
Die beschriebenen Verbindungen der Formel (I) mit ihren 13C-Isotopenmarkierungen sind zusammen mit ihren nicht markierten Analoga in hervorragender Weise geeignet, komplexe Proteinmischungen zu analysieren. Die 12C/13C-Affinitäts- marker-Paare unterscheiden sich dabei vorteilhaft von den entsprechenden HZ D-
Affinitätsmarker-Paaren, die bereits detailliert beschrieben sind (WO 00/11208 und Nature Biotechno logy, 1999, 17, 994). Von besonderem Vorteil dabei ist, dass Peptidproben, die entweder mit 12C- Affinitätsmarkern oder mit 13C-Affinitäts- markern markiert worden sind, praktisch zeitgleich bei der HPLC auf Reverse Phase (RP)-Materialen eluiert werden. Demgemäß lassen sich auch in der gekoppelten
Massenspektrometrie zusammengehörige Proben zeitgleich vermessen. Vergleichsproben, die andererseits mit ^-Affinitätsmarkern oder mit 2D-Affinitätsmarkern markiert worden sind, unterscheiden sich in ihrem Laufverhalten in der HPLC signifikant. Mit deuterierten Affinitätsmarkern verknüpfte Peptide werden in der RP- HPLC deutlich eher eluiert als die entsprechenden 1H-Affinitätsmarker-Peptid-
Konjugate. Diese Zeitunterschiede im ^^-Elutionsverhalten, die im zweistelligen Sekundenbereich liegen können, ermöglichen keine zeitgleiche Analyse zusammengehöriger Proben gleicher Peptidfrequenz im Massenspektrometer. Die Vorteile der Verwendung von 12C/13C-Affinitätsmarker-Paaren gegenüber ent- sprechenden H7 D-Affinitätsmarker-Paaren werden anhand der durchgeführten
Versuche deutlich. Beispiele
Die folgenden Synthesevorschriften beziehen sich auf die Schemata 1 und 2. In den. Beispielen sind die 13C- Atome durch * markiert.
Beispiel 1
Zu der Lösung von 4,7,10-Trioxa-l,13-tridecandiamin (20,0 g; 90,8 mmol) in 2-
Propanol (2000 ml) wurde bei — 10°C eine Lösung von Chlo ameisensäure-(9- fluorenylmethyl)-ester (23,5 g; 90,8 mmol) in Tetrahydrofuran (500 ml) langsam zugetropft. Nach 2 h wurde der Ansatz bei vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (1000 ml) aufgenommen und zweimal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (je 250 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und eingeengt. Der Rückstand ist weitgehend einheitlich und frei von dem Ausgangsprodukt 4,7,10-Trioxa-l,13-tridecandiamin. Ausbeute Rohprodukt 36,5 g (91 %), Sirup. Rf 0,27 (Dichlormethan/Methanol = 5:1); MS (ESI): mlz 443,4 (M+H)+. Beispiel 2
Zu der Lösung von Biotin (1,32 g; 5,4 mmol) in N,N-Dimethylformamid (60 ml) wurde bei 0°C Chlorameisensäureethylester (590 mg; 5,4 mmol) und N- Ethyldiisopropylamin (1,40 g; 10,8 mmol) getropft. Nach 2 h bei 20°C wurde die Mischung zu der Lösung der Verbindung 1 (1,20 g; 2,7 mmol) getropft und 1 h gerührt. Die Mischung wurde eingeengt, in Dichlormethan aufgenommen, mit IN Salzsäure und gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde über Kieselgel chromatographisch gereinigt (Eluens Dichlormethan/Methanol, Gradient 50:1 -> 10:1). Ausbeute 1,4 g (77 %), Sirup. Rf 0,51 (Dichlormethan/Methanol = 5:1); MS (ESI): m/z 669,4 (M+H)+.
Beispiel 3
Die Lösung der Verbindung 2 (1,0 g; 1,50 mmol) in Methanol (80 ml) wurde mit Piperidin (2,7 g; 31,9 mmol) versetzt. Nach 16 h bei 20°C wurde die Mischung eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und 5 mal mit Dichlormethan gewaschen. Die wässrige Phase wurde lyophüisiert. Ausbeute 0,53 g (79 %), amorpher Feststoff. Rf 0,13 (Acetonitril Wasser/Essigsäure = 10:3:0,1); MS (ESI): m/z 447,3 (M+H)+.
Beispiel 4
Die Lösung der Verbindung 3 (100 mg; 0,22 mmol) in Dimethylformamid (5 ml) wurde mit Iodessigsäureanhydrid (87,2 mg; 0,25 mmol) versetzt. Nach 1 h wurde die Mischung eingeengt. Der Rückstand wurde in Methanol (5 ml) aufgenommen und zur Entfernung restlicher Iodessigsäure mit einem schwach basischem Anionen- austauscher gerührt. Das Harz wurde abgesaugt, das Filtrat wurde eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Eluens Dichlormethan/Methanol = 30:1). Ausbeute 64 mg (46 %), Sirup. Rf 0,40 (Dichlor- methan Methanol = 5:1); MS (ESI): m/z 615,3 (M+H)+.
Beispiel 5
Maleinimidopropionsäure (13 mg; 0,078 mmol) wurde in DMF (5 ml) gelöst und mit der Verbindung 3 (35 mg; 0,078 mmol) sowie 1-Hydroxy-lH-benzotriazol (16 mg; 0J18 mmol), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid . Hydrochlorid (18 mg; 0,094 mmol) und Hünig-Base (30 mg) versetzt. Es wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsgemisch Acetonitril/Wasser = 10/1). Die entj sprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefällt. Ausbeute 8 mg (17%), amorpher Feststoff. Rf = 0,12 (Acetonitril/Wasser 10:1); MS (ESI): m/z 598 (M+H)+.
Beispiel 6
Die Verbindung 3 (22,3 mg; 0,05 mmol) wurde in DMF (10 ml) vorgelegt und mit Maleinsäureanhydrid (4,9 mg; 0,05 mmol) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurden 1-Hydroxy-lH-benzotriazol (0,075 mmol), N-
(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid (0,06 mmol) und Hünig-Base (50 mg) zugesetzt. Die Mischung wurde weitere 2 Tage bei RT gerührt. Es wurde eingeengt und durch Flash-Chromatographie gereinigt (Eluens Acetonitril/Wasser = 10:1).
Beispiel 7
N .N
Diethylenglycol (3 ,18 g; 30 mmol) wurde zu einer Lösung aus wässrigem Kaliumhydroxid (40%o; 120 mg) und 1,4-Dioxan (3,75 ml) getropft. Die Lösung wurde unter
1 "
Eiskühlung tropfenweise mit Acrylsäurenitril-1,2,3- C (3,36 g; 60 mmol) versetzt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wurde 16 h nachgerührt. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (30 ml) verdünnt und zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Eluens: Dichlormethan-Methanol = 50:1). Ausbeute 6,21 g (95 %), Sirup. Rf = 0,71 (Dichlormethan-Methanol = 10:1); MS (ESI): m/z 241,1 (M+Na)+, 219,1 (M+H)+.
Beispiel 8
H,N , „* ι
Die Lösung der Verbindung 7 (5,0 g; 22,9 mmol) in Methanol (115 ml) und konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (68 ml) wurde mit Raney-Nickel (2,5 g) versetzt und 5h bei 100°C und 100 bar mit Wasserstoff hydriert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Katalysator abgesaugt. Das Filtrat wurde eingeengt Der
Rückstand wurde dreimal in Ethanol aufgenommen und eingeengt. Ausbeute 3,84 g (74 %), Sirup. Rf = 0,27 (Dichlormethan-Methanol-Ammoniak = 4 : 3 : 1); MS (ESI): m/z 227,3 (M+H)+; 13C-NMR (100,6 MHz, CDC13): δ = 69,48, 69,10 (13CH2- O), 39,13, 38,77 (13CH2-NH2), 32,74, 32,38, 32,36, 32,01 (13CH2-13CH2-13CH2).
Beispiel 9
Zu der Lösung der Verbindung 8 (1,0 g; 4,42 mmol) in 2-Propanol (50 ml) wurde bei -10 °C eine Lösung von Chlorameisensäure-(9-fluorenylmethyl)-ester (1J4 g; 4,42 mmol) in Tetrahydrofuran (20 ml) gegeben. Es wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und 16 h gerührt. Die Mischung wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) aufgenommen, zweimal mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand' ist weitgehend einheitlich und wurde ohne weitere Aufreinigung in der Folgestufe eingesetzt. Ausbeute 1,76 g (89 %), Sirup. Rf 0,27 (Dichlormethan/Methanol = 5:1); MS (ESI): m/z 449,4 (M+H)+.
Beispiel 10
Zu der Lösung von Biotin (2J6 g; 8,8 mmol) in N,N-Dimethylformamid (100 ml) wurde bei 0°C Chlorameisensäureethylester (959 mg; 8,8 mmol) und N-Ethyl- diisopropylamin (2,29 g; 17,7 mmol) getropft. Nach 2 h bei 20°C wurde die Mischung zu der Lösung des Rohprodukts 9 (1,76 g; 3,9 mmol) getropft und 1 h gerührt. Die Mischung wurde eingeengt, in Dichlormethan aufgenommen, mit IN Salzsäure und gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, getrocknet und eingeengt.
Der Rückstand wurde über Kieselgel chromatographisch gereinigt (Eluens Dichlormethan/Methanol, Gradient 50:1 -> 10:1). Ausbeute 1,6 g (61 %), Sirup. Rf 0,51 (Dichlormethan/Methanol = 5:1); MS (ESI): m/z 675,3 (M+H)+. 13C-NMR (100,6 MHz, CDC13): δ = 69,95, 69,67, 69,49, 69,11 (13CH2-O), 39,08, 38,71, 37,74, 37,38 (13CH2-NH2), 29,69, 29,32, 29,21, 28,95, 28,83, 28,46 (13CH2-13CH2-13CH2). Beispiel 11
Die Verbindung 10 (1,18 g; 1,74 mmol) wurde in Methanol (20 ml) gelöst und mit Piperidin (1 ml) versetzt. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurde eingeengt, Der Rückstand wurde in Wasser (20 ml) aufgenommen und 5 mal mit Dichlormethan gewaschen. Die wässrige Phase wurde lyophilisiert. Ausbeute 905 mg (88 %), amorpher Feststoff. MS (ESI): m/z 453,4 (M+H)+.
Beispiel 12
Die Lösung der Verbindung 11 (100 mg; 0,22 mmol) in Dimethylformamid (5 ml) wurde mit Iodessigsäureanhydrid (86 mg; 0,24 mmol) versetzt. Nach 2 h wurde die Mischung eingeengt und über präparative HPLC gereinigt.. Ausbeute 101 mg (73 %), Sirup. Rf 0,37 (Dichlormethan/Methanol = 5:1); MS (ESI): m/z 621,2 (M+H)+, 643,2 (M+Na)+; 13C-NMR (100,6 MHz, CDC13): δ = 69,94, 69,83, 69,56, 69,45 (13CH2-O), 38,62, 38,26, 37,72, 37,36 (13CH2-NH2), 29,22, 28,85, 28,71, 28,48, 28,34, 28,33,
27,96 (13CH2-13CH2-13CH2). Beispiel 13
Die Verbindung 11 (22,6 mg; 0,05 mmol) wurde in DMF (10 ml) vorgelegt und mit
Maleinsäureanhydrid (4,9 mg; 0,05 mmol) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurden 1-Hydroxy-lH-benzotriazol (0,075 mmol), N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid (0,06 mmol) und Hünig-Base (50 mg) zugesetzt. Die Mischung wurde weitere 2 Tage bei RT gerührt. Es wurde eingeengt und durch Flash-Chromatographie gereinigt (Eluens Acetonitril Wasser = 10:1).
Biologische Untersuchungen
Kupplung der Affinitätsmarker an SDS-7
Als Probe wurde eine Mischung von sieben Proteinen verwendet, die auch
Verwendung als Größenstandard in der Gelelektrophorese findet (SDS-7-Mar er, Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen).
24 μg der Proteinmischung wurden in 5 μl Puffer 1 (50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 5 mM EDTA; 0,5% (w/v) SDS) gelöst und mit 45 μl Puffer 2 (50 mM Tris-HCl, pH 8,3;
5 mM EDTA) verdünnt. Durch Erhitzen auf 100°C für 3 Minuten wurden die Proteine denaturiert. Zur Reduktion der vorhandenen Cy steine wurden 0,8 μl Reduktionslösung (10% (w/v) Tributylphosphin in Isopropanol) zugegeben und der Ansatz 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Zur Umsetzung der freien Cysteine mit Affinitäts- markern wurden dann 10 μl Derivatisierungslösung (30 μg/μl der erfin- dungsgemäßen Affinitätsmarker bzw. ihrer C- Analoga in DMSO) zugesetzt und für 90 Minuten bei 37°C inkubiert.
Als Testprobe wurden zwei identische Proben SDS-7 wie oben beschrieben vorbereitet und mit dem unmarkierten Affinitätsmarker des Beispiels 4 und dem demarkierten Affinitätsmarker des Beispiels 12 derivatisiert. Die kommerziell erhältlichen Do/D8-ICAT®s (Applied Biosystems, Foster City) wurden als Vergleich ebenfalls eingesetzt.
Nach der Derivatisierung wurden jeweils 20 μl der beiden vorher getrennt behandelten, zu vergleichenden Proben gemischt und die Mischung mit 1 μl Trypsinlösung (1 mg/ml Trypsin (Promega GmbH, Mannheim) in Puffer 2) versetzt. Die Spaltung der Proteine erfolgte über Nacht (ca. 17 Stunden) bei 37°C. Affinitätsreinigung derivatisierter Peptide
Die Affinitätsreinigung derivatisierter Peptide erfolgte an frisch hergestellten Affinitätssäulen (Monomeric Avidin, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn) mit einem Säulenvolumen von 200 μl, die durch folgende Waschschritte vorbereitet wurden: a) zwei Säulenvolumina 2xPBS; b) vier Säulenvolumina 30% (v/v) Acetonitril / 0,4% (v/v) Trifluoressigsäure; c) sieben Säulenvolumina 2xPBS; d) vier Säulenvolumina 2 mM Biotin in 2xPBS; e) sechs Säulenvolumina 100 mM Glycin, pH 2,8 und f) sechs Säulenvolumina 2xPBS.
Die Probe (30 μl) wurde vor dem Auftragen mit 30 μl 2xPBS verdünnt und dann auf die Säule aufgetragen. Danach wurden zum Entfernen der nicht-biotinylierten Peptide folgende Waschschritte durchgeführt: a) sechs Säulenvolumina 2xPBS; b) sechs Säulenvolumina PBS; c) sechs Säulenvolumina 50 mM Ammonium- hydrogencarbonat / 20% (v/v) Methanol und d) ein Säulenvolumen 0,3% (v/v)
Ameisensäure. Die Probe wurde mit folgenden Schritten eluiert: a) drei Säulenvolumina 0,3% (v/v) Ameisensäure und b) drei Säulenvolumina 30% (v/v) Acetonitril / 0,4% (v/v) Trifluoressigsäure. Das Eluat wurde bis zur Trockenheit eingedampft und erst kurz vor der Analyse mit Massenspektrometrie wieder gelöst.
Massenspektrometrische Analyse
Zur Analyse der Peptide wurde ein Ionenfallen-Massenspektrometer (ThermoFinnigan, San Jose) eingesetzt, das direkt mit einer Hochdruckflüssigkeits- Chromatographie verbunden ist (LC-MS). Als Trennsäule wurde eine Reversed-
Phase-Säule (C18-Phase) benutzt. Die Peptide wurden in Eluent A (0,025%) (v/v) Trifluoressigsäure) gelöst und injiziert. Sie wurden mit einem Gradienten von Eluent B (0,025% (v/v) Trifluoressigsäure, 84% (v/v) Acetonitril) eluiert. Die eluierenden Peptide wurden durch die Akquisitions-Software des Gerätes automatisch erkannt und für eine Identifizierung fragmentiert. Damit konnte die Identität der Peptide eindeutig bestimmt werden. Fig. 1 zeigt ein Chromatogramm, wie es für Peptidmischungen üblich ist. Es eluiert eine Vielzahl von Peptiden. In Fig. 2 bis 5 sind jeweils Ionenspuren zweie? Peptidpaare dargestellt. Aufgetragen ist die Intensität der Signale in einem Massenbereich, der den dreifach positiv geladenen Peptidionen entspricht. Deutlich ist in Fig. 2 und 4 zu sehen, dass die leichte und schwere Variante eines Peptid- ICAT®-Konjugats nicht koeluieren, wenn die Derivatisierung mit dem unmarkierten (Do) und dem 8fach Deuterium-markierten (D8) ICAT® durchgeführt werden. Die Laufzeitunterschiede betragen 0,2 bis 0,5 Minuten je nach Größe des Peptids und der Anzahl von Cysteinen in der Sequenz, wobei die Deuterium-haltige Form jeweils früher eluiert. Fig. 3 und 5 zeigen die gleichen Peptidpaare, derivatisiert mit dem unmarkierten (13Co) Affinitätsmarker des Beispiels 4 und dem 6fach 13C-markierten (13C6) Affinitätsmarker des Beispiels 12. Hier zeigt sich eine perfekte Koelution der beiden Peptide. Die Sequenzen der Peptide wurden in allen Fällen durch die Fragmentierungsmuster bestätigt.
Fig. 1: Chromatogramm einer mit Affinitätsmarker derivatisierten Probe.
Fig. 2: Ionenspuren der leichten und schweren Varianten des Peptides TCVADESHAGCEK (dreifach geladene Peptidionen) aus Rinderserumalbumin bei
Verwendung von D0/D8-ICAT®s.
Fig. 3: Ionenspuren der leichten und schweren Varianten des Peptides TCVADESHAGCEK (dreifach geladene Peptidionen) aus Rinderserumalbumin bei Verwendung der 13Co/13C6-Affinitätsmarker der Beispiele 4 und 12.
Fig. 4: Ionenspuren der leichten und schweren Varianten des Peptides ALCSEKLDQWLCEK (dreifach geladene Peptidionen) aus Rinder-Lactalbumin bei Verwendung von D0/D8-ICAT®s. Fig. 5: Ionenspuren der leichten und schweren Varianten des Peptides ALCSEKLDQWLCEK (dreifach geladene Peptidionen) aus Rinder-Lactalbumin bei Verwendung der 13C< 3C6- Affinitätsmarker der Beispiele 4 und 12.

Claims

Patentansprüche
1. Organische Verbindung der Formel (I),
A-L-PRG (I)
in der
A für einen Affmitätsliganden-Rest, PRG für eine proteinreaktive Gruppe und
L für einen A und PRG kovalent Verknüpfenden Linker steht,
dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Kohlenstoff-Atom des Isotops 13C aufweist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinreaktive Gruppe PRG eine selektive Reaktivität für eine Aminosäure-, Phosphat-, Aldehyd- oder Keto-Gruppe des Proteins oder für ein Produkt einer Umsetzung des Proteins aufweist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2;~ dadurch gekennzeichnet, dass die proteinreaktive Gruppe -PRG ein Epoxid, eine Malennmidogruppe, ein Halogen oder ein Acrylrest ist.
4. Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Affmitätsliganden-Rest A der Rest von Biotin, eines Biotin-Derivats, eines Kohlenhydrats, eines Haptens oder eines Komplexbildners, insbesondere von Biotin oder eines Biotin-Derivats, ist.
5. Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie der Formel (II) genügt, A-B1-X1-(CH2)n-[X -(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-B2-PRG (II)
in der
A für einen Affmitätsliganden, insbesondere Biotin, steht,
PRG für eine proteinreaktive Gruppe steht, insbesondere für ein
Epoxid, eine Maleinimidogruppe, ein Halogen oder ein Acrylrest,
X1, X2, X3, X4 unabhängig voneinander und auch für X2 unabhängig von anderen X2 in der Linkergruppe für O, S, NH, NR, CO, CO-O,
O-CO, CO-S, S-CO, S-S, SO, SO2, CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, Si-O, O-Si, eine Arylen- oder Diarylengruppe steht, wobei auch X1, X2, X3 oder X4 teilweise oder vollständig nicht vorhanden sein können,
B1, B2 unabhängig voneinander für optionale Fragmente stehen, die als Brücken die Verknüpfung von A oder PRG an den Linker
L ermöglichen oder erleichtern und dabei gegebenenfalls die Löslichkeit verbessern und für CO-O, OrCO, CO, NR, CO- NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS stehen und die eine oder mehrere, bevorzugt zwischen 1 und 10 CH2-Gruppen enthalten, entweder allein oder in Kombination mit anderen
Gruppen, beispielsweise (CH2)q-CONR, (CH2)q-NR oder (CH2)q,
m, n, p, q, x unabhängig voneinander für Zahlen stehen können mit den jeweiligen Werten von 0 bis 100, wobei die Summe von n + xm + p + q bevorzugt kleiner als 100 ist und besonders bevorzugt zwischen 10 und 30 liegt und
R für Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxycarbonyl, Aralkoxy- carbonyl oder Aryl steht.
6. Verfahren zur Herstellung einer organischen Verbindung der Formel (I),
A-L-PRG (I)
in der
A für einen Affinitätsliganden-Rest,
PRG für eine proteinreaktrve Gruppe und L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht,
durch Substitution eines α,ω-Diamins mit einem Affmitätsliganden-Rest und einer proteinreaktiven Gruppe in beliebiger Reihenfolge,
dadurch gekennzeichnet, dass
i) das α,co-Diamin zunächst einseitig mit einer Schutzgruppe SG geschützt wird,
und anschließend entweder
ii) das einseitig geschützte α,ω-Diamin mit einem Affmitätsliganden zu dem Zwischenprodukt A-L-SG umgesetzt wird,
iii) die Schutzgruppe aus dem Zwischenprodukt A-L-SG entfernt wird und iv) mit einer proteinreaktiven Verbindung zu einer Verbindung der Formel (I) umgesetzt wird.
oder
ii') das einseitig geschützte α,ω-Diamin mit einer proteinreaktiven Verbindung zu dem Zwischenprodukt SG-L-PRG umgesetzt wird,
iii') die Schutzgruppe aus dem Zwischenprodukt SG-L-PRG entfernt wird und
iv') mit einem Affinitätsliganden zu einer Verbindung der Formel (I) umgesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als ,ω-Diamin ein α,ω-Diamino-oxaalkan eingesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das α,ω- Diamin mit einem Alkoxycarbonyl- oder Aralkoxycarbonyl-Rest als Schutzgruppe SG geschützt wird, vorzugsweise mit Methoxycarbonyl (MOC), Ethoxycarbonyl (EOC), Trichlorethoxycarbonyl, te/t-Butyloxycarbonyl (BOC), Benzyloxycarbonyl oder Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC).
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein α,co-Diamm mit mindestens einem Kohlenstoff-Atom des Isotops C eingesetzt wird.
10. Verwendung einer oder mehrerer unterschiedlich isotopenmarkierter Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder erhalten durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 als Reagenz zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen.
11. Verwendung gemäß dem vorstehenden Anspruch zur Identifikation von einem oder mehreren Proteinen oder Protein-Funktionen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.
12. Verwendung gemäß Anspruch 10 zur Bestimmung der relativen Expressions- Niveaus von einem oder mehreren Proteinen in einer oder mehreren Protein- haltigen Proben.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1304845C (zh) * 2004-04-14 2007-03-14 中国科学院上海有机化学研究所 一种新型含碘树脂衍生物用在基于质谱的蛋白组学研究中的方法
WO2006017208A1 (en) * 2004-07-12 2006-02-16 Applera Corporation Mass tags for quantitative analyses
US20070048752A1 (en) 2004-07-12 2007-03-01 Applera Corporation Mass tags for quantitative analyses
GB0916881D0 (en) * 2009-09-25 2009-11-11 Electrophoretics Ltd Mass labels
US10008677B2 (en) 2011-01-13 2018-06-26 Universal Display Corporation Materials for organic light emitting diode
CN112125921B (zh) * 2020-09-28 2022-01-21 江苏省原子医学研究所 一种光敏剂前药化合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4665037A (en) * 1986-04-28 1987-05-12 Analytichem International, Inc. Method of sequencing peptides
ATE536422T1 (de) * 1998-08-25 2011-12-15 Univ Washington Schnelle quantitative analyse von proteinen oder proteinfunktionen in komplexen gemischen
US6818454B2 (en) * 2001-02-16 2004-11-16 Battelle Memorial Institute Phosphoprotein binding agents and methods of their use
WO2002086168A1 (en) * 2001-04-19 2002-10-31 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomolecule characterization using mass spectrometry and affinity tags
US7045296B2 (en) * 2001-05-08 2006-05-16 Applera Corporation Process for analyzing protein samples

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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