EP1448798A1 - Nanostruktur insbesondere zur analyse von einzelmolekülen - Google Patents

Nanostruktur insbesondere zur analyse von einzelmolekülen

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EP1448798A1
EP1448798A1 EP02792817A EP02792817A EP1448798A1 EP 1448798 A1 EP1448798 A1 EP 1448798A1 EP 02792817 A EP02792817 A EP 02792817A EP 02792817 A EP02792817 A EP 02792817A EP 1448798 A1 EP1448798 A1 EP 1448798A1
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EP
European Patent Office
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microchannel
carrier particle
fluid
flow
molecule
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02792817A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Ericson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gnothis Holding SA
Original Assignee
Gnothis Holding SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Gnothis Holding SA filed Critical Gnothis Holding SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • B01L2400/0454—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces radiation pressure, optical tweezers

Definitions

  • Nanostructure especially for the analysis of single molecules
  • the invention relates to a nanostructure and its use for the synthesis and analysis of molecules, in particular single molecules, for. B. for single molecule sequencing of nucleic acids.
  • the sequencing of the human genome consisting of approx. 3 x 10 9 bases or the genome of other organisms and the determination and comparison of individual sequence variants requires the provision of sequencing methods which are fast on the one hand and can be used routinely and at low cost on the other hand.
  • great efforts have been made to use common sequencing methods, for example the enzymatic chain termination method according to Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1 977) 5463), especially through automation (Adams et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (1 994), New York, Academic Press).
  • a maximum of 500,000 bases per day can currently be determined with a sequencer (Mega Bace from Applied Biosystems).
  • the conventional sequencing methods are less suitable for some applications.
  • Another approach is single molecule sequencing (Dörre et al., Bioimaging 5 (1 997), 139-1 52), in which the sequence of nucleic acids is achieved by the progressive enzymatic degradation of fluorescence-labeled single-stranded DNA molecules and detection of the sequentially released monomer molecules in a microstructure channel takes place in which the monomer molecules are guided electroosmotically by pumps.
  • the advantage of this method is that only a single molecule of the target nucleic acid is sufficient to carry out a sequence determination.
  • WO 99/36766 describes methods and devices for regulating laminar fluid flows in a flow cell. Discrete sensor areas are generated that can be used to detect analytes in a sample liquid.
  • PCT / EP01 / 07460 proposes methods and devices for single-molecule sequencing.
  • a system of microchannels in fluid communication is used, in which liquids are guided through the microchannels by means of a hydrodynamic flow.
  • the object underlying the present invention was to provide a device and a method for the synthesis and analysis of molecules, in particular for single-molecule sequencing of nucleic acids, which represent a further improvement over the prior art and in particular enable a simplified analysis.
  • a first microchannel for introducing a first fluid stream comprising a carrier particle with at least one molecule immobilized thereon
  • the device according to the invention is based on the principle that a carrier is provided with a plurality of microchannels in fluidic communication, at least two and preferably three or four or more microchannels being provided for introducing different fluid flows into the carrier. These microchannels open into another microchannel in which the immobilized molecule reacts with one or more reactants.
  • a carrier particle loaded with one or more immobilized molecules is introduced into the device through a first microchannel in a first fluid stream. Second fluid streams, each containing reactants for the immobilized molecule, were introduced into the device in one or more second microchannels.
  • One or more third microchannels are preferably provided, which are used to introduce one or more third fluid streams.
  • These third fluid streams can contain buffer solutions, for example.
  • B. serve to separate the first fluid stream from one or more second fluid streams.
  • the geometry of the device is designed in such a way that the fluid streams flowing into the fourth microchannel are essentially not mixed at least in a section of the fourth microchannel, in particular in the region of the mouth zone, the individual fluid streams preferably flowing in a laminar flow.
  • the loaded particle After introduction into the device, the loaded particle is by suitable means at a first predetermined position in the fourth microchannel, for. B. in the area of the mouth zone. At this position, the held particle can be brought into contact by suitable measures with one or more second fluid streams, which contain free reactants for the immobilized molecule, so that a reaction between the immobilized molecule and one or more free reactants can take place.
  • the presence of separate, preferably laminar, fluid flow zones in the fourth microchannel allows the contacting between the molecule and the reactants to be controlled in a targeted manner become.
  • the reaction can preferably be detected downstream in the fourth microchannel.
  • the held carrier particle is subjected to a transport within the fourth microchannel from the first predetermined position to a second predetermined position.
  • This transport takes place from the zone of the first fluid stream into the zone of a second fluid stream and preferably across the zone of a third fluid stream. It is further preferred that the transport takes place essentially transversely to the direction of flow.
  • the carrier particle held does not have to be transported, but the carrier particle can be brought into contact with the second fluid stream by changing the flow conditions in the fourth microchannel, e.g. can be achieved by changing the flow velocities in one or more microchannels, so that the captured carrier particle, which is initially in a zone corresponding to the first fluid flow, reaches a zone by changing the flow conditions in which it comes into contact with the second fluid flow.
  • the two aforementioned embodiments can also be combined with one another.
  • one or more third microchannels are preferably also provided which, for example, inert fluid flows, such as buffer solutions, into the device transport.
  • the third microchannel (s) can be arranged in such a way that one or more third fluid streams are created in the fourth microchannel, which are arranged between the first and second fluid streams.
  • the device according to the invention can be used for the analysis of molecules. When using carrier particles on which only a single molecule is immobilized, the device is suitable for carrying out single-molecule analyzes, for example for characterizing biomolecules. A particularly preferred area is the sequencing of nucleic acids.
  • the device can also be used for the synthesis of molecules, a starting product being immobilized on the particle carrier which is brought into contact with one or more reaction partners simultaneously or sequentially in the device according to the invention.
  • organic compounds e.g. B. complex organic compounds or biopolymers such as peptides, polypeptides, nucleic acids and nucleic acid analogs can be synthesized.
  • the device is particularly suitable for the synthesis of individual molecules.
  • the device for analytical applications e.g. B. is used for nucleic acid sequencing, it advantageously contains a means for detecting a reaction of the immobilized molecule with the reactant, for example a suitable detector. If the device is used for synthetic purposes, it advantageously contains means for isolating the molecule synthesized on the carrier particle, if necessary after cleavage from the carrier particle.
  • the device can contain means for introducing fluid flows into the microchannels, means for discharging fluid flows from the microchannels and reservoirs for first, second and possibly third fluid flows.
  • it preferably contains automatic manipulation devices, heating or cooling devices such as Peltier elements, means for sorting carrier particles and / or synthesis products, reagents and electronic control and evaluation devices.
  • Another object of the invention is a method for performing a reaction between an immobilized molecule and a free reactant, e.g. B. for single molecule analysis and in particular for single molecule sequencing, comprising: (a) providing a carrier particle with a molecule immobilized thereon,
  • Fluid stream comprising the carrier particle, (ii) at least one second microchannel for introducing at least one second fluid stream comprising a reactant for the molecule to be immobilized, (iii) optionally at least a third microchannel for
  • the method according to the invention is preferably a sequencing method in which a single nucleic acid molecule immobilized on a carrier is examined.
  • the method is suitable for other analytical and synthetic reactions with a small number of z. B. can be carried out up to 1,000 molecules or even only with single molecules. It is particularly preferred to carry out analytical reactions which can be detected within the device by optical methods.
  • the carrier particle used for the method has a size that enables movement in microchannels and retention in a desired position within a sequencer.
  • the particle size is preferably in the range from 0.5 to 10 ⁇ m and particularly preferably from 1 to 3 ⁇ m.
  • suitable materials for carrier particles are plastics such as polystyrene, polymethyl methacrylate, polypropylene, polycarbonate or copolymers thereof, glass, quartz, metals or semimetals such as silicon, metal oxides such as silicon dioxide or composite materials which contain several of the aforementioned components.
  • Optically transparent carrier particles for example of plastics or glass, particles of silicon or particles with a plastic core and a silicon or silicon dioxide shell are particularly preferably used.
  • Nucleic acid molecules are preferably immobilized on the carrier particle via their ⁇ 'ends.
  • the nucleic acid molecules can be bound to the support by covalent or non-covalent interactions.
  • the binding of the polynucleotides to the carrier can be mediated by high-affinity interactions between the partners of a specific binding pair, for example biotin / streptavidin or avidin, hapten / anti-hapten antibodies, sugar / lectin etc.
  • biotinylated nucleic acid molecules can be coupled to streptavidin-coated supports.
  • the nucleic acid molecules can also be bound to the support by adsorption.
  • nucleic acid molecules modified by incorporation of alkanethiol groups can be bound to metallic supports, for example gold supports.
  • covalent immobilization where the binding of the Polynucleotides can be mediated via reactive silane groups on a silica surface •.
  • Such carrier particles can be generated by the molecules to be analyzed, e.g. the nucleic acid molecules intended for sequencing, in a molar ratio of preferably 1: 5 to 1:20, e.g. 1:10, are brought into contact with the carrier particles under conditions in which the molecules are immobilized on the carrier.
  • the resulting carrier particles are then e.g. sorted on the basis of fluorescent marking groups contained on the molecules and separated from particles to which no molecule is bound. This sorting and separation can, for example, according to the in Holm et al.
  • nucleic acid molecules bound to a carrier can be in single-stranded or double-stranded form. In the case of double-stranded molecules, it must be ensured that labeled nucleotide building blocks can only be split off from a single strand.
  • a carrier for example DNA molecules or RNA molecules
  • essentially all, for example at least 90%, preferably at least 95% of all nucleotide building blocks of at least one base type carry a fluorescent labeling group.
  • essentially all nucleotide building blocks of at least two base types for example two, three or four base types, carry a fluorescent label, each base type advantageously carrying a different fluorescent label group.
  • Nucleic acids marked in this way can be obtained by enzymatic primer extension on a nucleic acid template using a suitable polymerase, for example a DNA polymerase such as a DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius or other thermostable organisms (Hopfner et al., PNAS USA 96 (1 999), 3600-3605) or a mutated Taq polymerase (Patel and Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-510) using fluorescence-labeled nucleotide building blocks.
  • the labeled nucleic acid strands can also be produced by amplification reactions, for example PCR.
  • asymmetrical amplification products in which only a single strand contains fluorescent labels.
  • Such asymmetrical amplification products can be sequenced in double-stranded form.
  • Nucleic acid fragments in which both strands are fluorescence-labeled are produced by symmetrical PCR. These two fluorescence-labeled strands can be separated and immobilized separately in single-stranded form on carrier particles, so that the sequence of one or both complementary strands can be determined separately.
  • one of the two strands at the 3 'end can be modified in this way, for example by installing a PNA clamp, so that it is no longer possible to split off monomer units. In this case, double-strand sequencing is possible.
  • sequence identifier i.e. a labeled nucleic acid of known sequence, e.g. by enzymatic reaction with ligase or / and terminal transferase, so that at the beginning of the sequencing a known fluorescence pattern is obtained first and only then the fluorescence pattern corresponding to the unknown sequence to be examined is obtained.
  • the nucleic acid template can be selected, for example, from DNA templates such as genomic DNA fragments, cDNA molecules, plasmids etc., but also from RNA templates such as mRNA molecules.
  • the fluorescent labeling groups can be used for labeling biopolyers, e.g. B.
  • the use of fluorescent labeling groups such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Cy3, Cy5 or derivatives thereof etc. can be selected.
  • Step (b) of the method comprises introducing a loaded carrier particle into a device according to the invention, e.g. a sequencer.
  • the introduction of the carrier particle through the first microchannel and the introduction of further fluid flows through the second and third microchannels can take place by hydrodynamic and / or electroosmotic flow.
  • a hydrodynamic flow is preferably used.
  • the control of the flow in the feed channels can be done together or separately by using suitable means, e.g. Pumps, valves and / or gravity-controlled supply take place.
  • the diameter of the first, second and third microchannels can be the same or different and is e.g. in the range from 5 to 500 ⁇ m, particularly preferably in the range from 10 to 100 ⁇ m and most preferably 25-75 ⁇ m.
  • the carrier particle can be held in the mouth area of the fourth microchannel according to method step (c).
  • a capture laser e.g. an IR laser
  • the carrier particle can be held in the mouth area of the fourth microchannel according to method step (c).
  • the carrier particle is preferably held in place by an automated process.
  • the carrier particles are passed through the first microchannel, passing through a detection element that activates the capture laser. Then, after capture and displacement in the fluid stream containing a reactant, the reaction is carried out on the immobilized carrier particle.
  • a washing away from remaining carrier particles are not necessary in the method according to the invention, since the captured carrier particle is shifted from the first fluid stream into a second fluid stream by active transport and / or by changing the flow conditions. It is therefore also possible to trap a further carrier particle as soon as the first carrier particle held has been removed from the first fluid stream. This leads to a considerable increase in the process speed.
  • the sequencing reaction of the method according to the invention comprises the progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the immobilized nucleic acid molecules.
  • An enzymatic cleavage is preferably carried out using an exonuclease, single-strand or double-strand exonucleases which degrade in the 5 ' ⁇ 3' direction or in the 3 ' ⁇ 5' direction - depending on the type of immobilization of the nucleic acid strands on the support - can be used.
  • T7 DNA polymerase, E. coli exonuclease I or E. coli exonuclease III are particularly preferably used as exonucleases.
  • reaction products e.g. B.
  • nucleotide building blocks released by the cleavage reaction are then e.g. by means of a hydrodynamic and / or electroosmotic flow through the fourth
  • Microchannel directed and preferably determined during the flow through the fourth microchannel.
  • a hydrodynamic one Preferably a hydrodynamic one
  • the hydrodynamic flow preferably has a parabolic flow profile, i.e. the flow rate is maximum in
  • the flow rate the maximum is preferably in the range from 1 to 50 mm / s, particularly preferably in the range from 5 to 10 mm / s.
  • the diameter of the fourth microchannel in the region of the section in which the fluid streams flow essentially without mixing is preferably in the range from 5 to 1000 ⁇ m, particularly preferably from 20 to 500 ⁇ m.
  • the fourth microchannel has a larger diameter than the first, second and third microchannels.
  • the flow velocity can be controlled in a targeted manner by local constrictions or / and extensions.
  • the flow rate can be increased by narrowing the channel and the flow rate can be reduced in a targeted manner by widening.
  • reaction products e.g. B. of fluorescence-labeled nucleotide building blocks
  • step (e) of the method according to the invention can be by means of any measurement method, e.g. with a spatially and / or time-resolved fluorescence spectroscopy, which is able to detect fluorescence signals down to single photon counting in a very small volume element such as is present in a microchannel.
  • the detection can be carried out by means of confocal single-molecule detection, such as by fluorescence correlation spectroscopy, with a very small, preferably confocal volume element, for example 0.1, 1 ⁇ 10 ⁇ 15 to 20 ⁇ 10 "12 I, through the microchannel flowing sample liquid is exposed to an excitation light of a laser which excites the receptors located in this measurement volume to emit fluorescent light, the emitted fluorescent light from the measurement volume being measured by means of a photodetector, and a correlation between the temporal change in the measured emission and the relative flow velocity of the involved molecules is created, so that with correspondingly strong dilution individual molecules in the measurement volume can be identified.
  • confocal single-molecule detection such as by fluorescence correlation spectroscopy
  • the detection can also be carried out by a time-resolved decay measurement, a so-called time gating, as described, for example, by Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: “Ultrafast Phenomenes", D.H. Auston, Ed., Springer 1984.
  • the fluorescence molecules are excited within a measurement volume and then - preferably at a time interval of> 100 ps - the detection interval is opened at the photodetector. In this way, background signals generated by Raman effects can be kept sufficiently low to enable essentially interference-free detection.
  • the detection is carried out using a laser device which has a diffraction element or a phase-modulating element in the beam path of the laser, which optionally in combination with one or more optical
  • Imaging elements is set up from the laser beam
  • the optical system To produce diffraction patterns in the form of a linear or two-dimensional array of focal areas in the microchannel, the optical
  • Arrangement is set up to confocal each focal area for the
  • the detection device is integrated in two mutually opposite sides of the microchannel walls, one wall having an array of laser elements emitting into the microchannel as the fluorescent excitation light source and the other an array of the laser elements in each case has opposite assigned photodetector elements as fluorescent light detectors.
  • An increase in the detection probability of nucleotide building blocks and thus an improvement in sensitivity can be achieved by a hydrodynamic flow profile in the fluid streams of the first, second and third microchannels and in the fluid sub-streams of the fourth microchannel of the sequencing device.
  • the hydrodynamic flow can be controlled by suitable control devices, e.g. B. can be set and controlled by controllable pumps and / or by special geometric design.
  • electrophoretic and electroosmotic methods for the transport of reagents can also be used in the sequencing device.
  • the method according to the invention also allows the parallel sequencing of several nucleic acid molecules bound to carrier particles in different, preferably parallel, microchannel systems.
  • the nucleic acid coupled to a carrier particle is essentially in the middle of a
  • Nucleotides are conducted downstream in the laminar flow to a detection volume element, which is essentially via the fluid
  • Partial flow and in particular over its middle, where the highest flow rate prevails, is positioned.
  • the flow rate is preferably so great that regardless of the thermal broadening of the
  • the nucleotide arrives in the detector field and is registered.
  • the detector field is kept as small as possible so that the reaction products, e.g. B. the nucleotide bases are completely detected, while only the smallest possible fraction of the background contamination (ratio of the detector cross section to
  • FIG. 1 is a schematic representation of a preferred embodiment of the device according to the invention.
  • a carrier particle (4) with a molecule immobilized thereon e.g. B. a nucleic acid molecule in a first fluid stream introduced into the device.
  • a second microchannel (6) is used to introduce a second fluid stream which contains a reactant, e.g. B. contains a reactant provided for the degradation of the nucleic acid molecule.
  • a third microchannel (8) is provided which is used to introduce a third fluid flow, e.g. B. serves a buffer solution.
  • the third fluid stream advantageously causes a separation of the first and the second fluid stream.
  • the first, second and third microchannels (2, 6, 8) open into a fourth microchannel (10). At least in the region of the junction with the fourth microchannel (10) there are separate fluid zones (2a, 6a, 8a) for the fluid streams originating from the microchannels (2, 6, 8).
  • the carrier particle (4) introduced through the first microchannel (2) is held in the fourth microchannel (10) at a first predetermined position (1 2) in the zone of the first fluid flow (2a).
  • the microparticle held in place at the first predetermined position (1 2) can then be transported, for example using the capture laser, to a second predetermined position (14), which is in the region of the second fluid flow (6a) emerging from the second microchannel (6 ) comes from.
  • the reaction e.g. B. the digestion of the immobilized on the carrier particle nucleic acid molecule with the degradation enzyme present in the second fluid stream, preferably an exonuclease.
  • the reaction products, e.g. B. the nucleotide building blocks which are separated sequentially by the enzymatic digestion are preferably from the fluid flow in the fourth microchannel (10) to a detection element (1 6) a confocal detection element, transported and detected there.
  • the flow rate in the system is set so that the broadening of the migration path of the split-off nucleotide building blocks caused by Brownian molecular movement is so low that they can be detected with sufficient statistical probability in the detection volume (16).
  • the diameter of the first, second and third microchannels (2, 6, 8) is preferably in the range of approximately 50 ⁇ m.
  • the fourth microchannel (10) preferably has a width of approximately 150 ⁇ m and a depth of approximately 50 ⁇ m.
  • the shapes and dimensions of the microchannels can be varied considerably provided that a mixture-free flow of several separate fluid streams is ensured at least in a section of the fourth microchannel.
  • the sequencing device according to the invention can the arrangement shown in Figure 1 several times, e.g. arranged in parallel or / and sequentially, so that a parallel or / and sequential determination of several molecules e.g. Nucleotide sequences per device is possible.
  • the sequencing device can also be used for other analyzes, e.g. for single molecule detection, but also for synthetic processes.
  • devices can also be used in which the third microchannel (8) is missing, or in which a plurality of second and / or third microchannels are present.
  • An example for such an embodiment with two third microchannels' is shown in FIG. 2
  • the embodiment of the device according to the invention shown in FIG. 2 allows the molecule immobilized on the carrier particle to be detected without the carrier particle having to be transported within the sequencing device after being captured.
  • the carrier particle is first introduced into the device through the first microchannel (20) in the setting shown in FIG. 2A and is held at a predetermined position (30) in the fourth microchannel (28) by a trapping laser.
  • the predetermined position (30) is initially in the region of the fluid flow (20a) originating from the first microchannel (20).
  • the device also contains a second microchannel (22) for introducing the reactant and two third microchannels (24, 26) for introducing buffer solution.
  • the flow conditions in the device are changed, e.g. by reducing or switching off the first fluid flow from the first microchannel and by switching on or increasing the fluid flows from the second microchannel (22) and a third microchannel (26).
  • the fluid flow zones associated with the respective microchannels change in the fourth microchannel (28).
  • the microparticle held at position (30) thus reaches the region of the second fluid stream (22a) that comes from the second microchannel (22) and contains the degrading enzyme.
  • FIG. 1 and FIG. 2 can also be combined with one another. This means that both a transport of the captured microparticle from a first predetermined position to a second predetermined position and a change in the fluid flow conditions in the region of the Mouth zone in the fourth microchannel from a "capture" setting to • an "analysis” setting.
  • FIGS. 3a, 3b and 3c finally show 3 specific embodiments of the device according to the invention which have already been used in practice.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Nanostruktur und ein Verfahren zur Analyse oder Synthese von wenigen Molekülen oder Einzelmolekülen, insbesondere zur Einzelmolekül-Sequenzierung von Nukleinsäuren.

Description

Nanostruktur, insbesondere zur Analyse von Einzelmolekülen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine Nanostruktur und deren Verwendung zur Synthese und Analyse von Molekülen, insbesondere von Einzelmolekülen, z. B. zur Einzelmolekül-Sequenzierung von Nukleinsäuren.
Die Sequenzierung des aus ca. 3 x 109 Basen bestehenden humanen Genoms oder des Genoms anderer Organismen sowie die Bestimmung und der Vergleich individueller Sequenzvarianten erfordert die Bereitstellung von Sequenziermethoden, die einerseits schnell sind und andererseits routinemäßig und mit geringen Kosten eingesetzt werden können. Es wurden in den letzten Jahren große Anstrengungen unternommen, um gängige Sequenziermethoden, z.B. die enzymatische Kettenabbruchmethode nach Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1 977) 5463), zu beschleunigen, insbesondere durch Automatisierung (Adams et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (1 994), New York, Academic Press). So können derzeit maximal 500 000 Basen pro Tag mit einem Sequenziergerät (Mega Bace von Applied Biosystems) bestimmt werden. Dennoch sind die konventionellen Sequenzierverfahren für einige Anwendungen weniger geeignet.
Während der letzten Jahre sind neue Ansätze zur Überwindung der
Beschränkungen konventioneller Sequenzierverfahren entwickelt worden, u.a. die Sequenzierung durch Rastertunnelmikroskopie (Lindsay und Phillip,
Gen. Anal. Tech. Appl. 8 (1 991 ), 8-1 3), durch hochparallelisierte Kapillarelektrophorese (Huang et al., Anal. Chem. 64 (1 992), 2149-21 54; Kambara und Takahashi, Nature 361 ( 1 993), 565-566), durch Oligonukleotidhybridisierung (Drmanac et al., Genomics 4 (1 989), 1 14- 1 28; Khrapko et al., FEBS Let. 256 (1 989), 1 1 8-1 22; Maskos und Southern, Nucleic Acids Res. 20 ( 1 992), 1 675-1 678 und 1 679-1 684) sowie durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisierungs- Massenspektroskopie (Hillenkamp et al., Anal. Chem. 63 (1 991 ), 1 1 93A- 1 203A) .
Ein weiterer Ansatz ist die Einzelmolekülsequenzierung (Dörre et al., Bioimaging 5 (1 997), 139-1 52), bei der die Sequenz von Nukleinsäuren durch fortschreitenden enzymatischen Abbau von fluoreszenzmarkierten einzelsträngigen DNA-Molekülen und Nachweis der sequenziell freigesetzten Monomermoleküle in einem Mikrostrukturkanal erfolgt, in dem die Monomermoleküle durch Pumpen elektroosmotisch geleitet werden. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass jeweils nur ein einziges Molekül der Zielnukleinsäure für die Durchführung einer Sequenzbestimmung ausreicht.
Ein Nachteil der bei Dörre et al. beschriebenen Methode besteht jedoch darin, dass die sequenziell freigesetzten Monomermoleküle mit den Wänden der MikroStrukturen wechselwirken können, was zu erheblichen Problemen bei der Auswertung führen kann.
In WO 99/36766 werden Verfahren und Vorrichtungen zur Regelung von laminaren Fluidströmen in einer Flusszelle beschrieben. Es werden diskrete Sensorbereiche erzeugt, die zum Nachweis von Analyten in einer Probeflüssigkeit verwendet werden können.
In PCT/EP01 /07460 werden Verfahren und Vorrichtungen zur Einzelmolekül-Sequenzierung vorgeschlagen. Hierzu wird ein System von in fluidischer Kommunikation stehenden Mikrokanälen verwendet, bei dem Flüssigkeiten mittels einen hydrodynamischen Flusses durch die Mikrokanäle geleitet werden. Die vorliegende Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, eine Verrichtung und ein Verfahren zur Synthese und Analyse von Molekülen, insbesondere zur Einzelmolekül-Sequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, die eine weitere Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik darstellen und insbesondere eine vereinfachte Analyse ermöglichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung einer Vorrichtung, umfassend:
(a) ein System von in fluidischer Kommunikation stehenden, zumindest teilweise optisch transparenten Mikrokanälen, umfassend
(i) einen ersten Mikrokanal zum Einbringen eines ersten Fluidstroms, umfassend ein Trägerpartikel mit mindestens einem darauf immobilisierten Molekül,
(ii) mindestens einen zweiten Mikrokanal zum Einbringen von mindestens einem zweiten Fluidstrom, umfassend einen
Reaktanten für das immobilisierte Molekül,
(iii) gegebenenfalls mindestens einen dritten Mikrokanal zum Einbringen von mindestens einem dritten Fluidstrom,
(iv) mindestens einen vierten Mikrokanal, wobei die Mikrokanäle (i), (ii) und (iii) in den vierten Mikrokanal einmünden und wobei zumindest in einem Abschnit des vierten Mikrokanals zumindest die ersten und zweiten Fluidströme im
Wesentlichen ohne Vermischung strömen,
(b) Mittel zum Festhalten des Trägerpartikels an einer vorbestimmten Position im Bereich des Abschnitts des vierten Mikrokanals, in dem die Fluidströme im Wesentlichen ohne Vermischung strömen,
(c) Mittel zum Inkontaktbringen des festgehaltenen Trägerpartikels mit dem zweiten, den Reaktanten enthaltenden Fluidstrom und
(d) gegebenenfalls Mittel zum Nachweis einer Reaktion des immobili- sierten Moleküls mit dem Reaktanten. Die erfindungsgemäße Vorrichtung beruht auf dem Prinzip, dass ein Träger - mit mehreren in fluidischer Kommunikation stehenden Mikrokanälen bereitgestellt wird, wobei mindestens zwei und vorzugweise drei oder vier oder mehr Mikrokanäle zum Einbringen von unterschiedlichen Fluidströmen in den Träger vorgesehen sind. Diese Mikrokanäle münden in einen weiteren Mikrokanal, in dem die Reaktion des immobilisierten Moleküls mit einem oder mehreren Reaktanten erfolgt. Ein mit einem oder mehreren immobilisierten Molekülen beladenes Trägerpartikel wird dabei durch einen ersten Mikrokanal in einem ersten Fluidstrom in die Vorrichtung eingebracht. In einem oder mehreren zweiten Mikrokanälen wurden zweite Fluidströme, die jeweils Reaktanten für das immobilisierte Molekül enthalten, in die Vorrichtung eingebracht. Vorzugweise sind ein oder mehrere dritte Mikrokanäle vorgesehen, die zum Einbringen eines oder mehrerer dritter Fluidströme dienen, wobei diese dritten Fluidströme beispielsweise Pufferlö- sungen enthalten können und z. B. zur Trennung des ersten Fluidstroms von einem oder mehreren zweiten Fluidströmen dienen. Die Geometrie der Vorrichtung ist dabei derart ausgestaltet, dass die in den vierten Mikrokanal mündenden Fluidströme zumindest in einem Abschnitt des vierten Mikrokanals, insbesondere im Bereich der Mündungszone im Wesentlichen nicht durchmischt werden, wobei die einzelnen Fluidströme vorzugsweise in einem laminaren Fluß strömen.
Nach dem Einbringen in die Vorrichtung wird das beladene Partikel durch geeignete Mittel an einer ersten vorbestimmten Position im vierten Mikrokanal, z. B. im Bereich der Mündungszone festgehalten. An dieser Position kann das festgehaltene Partikel durch geeignete Maßnahmen mit einem oder mehreren zweiten Fluidströmen, die freie Reaktanten für das immobilisierte Molekül enthalten, in Kontakt gebracht werden, so dass eine Reaktion zwischen dem immobilisierten Molekül und einem oder mehreren freien Reaktanten ablaufen kann. Durch das Vorhandensein separater, vorzugsweise laminarer Fluidstromzonen im vierten Mikrokanal kann das lnkontaktbringen zwischen Molekül und Reaktanten gezielt gesteuert werden. Ein Nachweis der Reaktion kann vorzugsweise stromabwärts im vierten Mikrokanal erfolgen.
In einer ersten Ausführungsform wird das festgehaltene Trägerpartikel innerhalb des vierten Mikrokanals einem Transport von der ersten vorbestimmten Position zu einer zweiten vorbestimmten Position unterzogen. Dieser Transport erfolgt aus der Zone des ersten Fluidstroms in die Zone eines zweiten Fluidstroms und vorzugsweise über die Zone eines dritten Fluidstroms hinweg. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Transport im Wesentlichen quer zur Strömungsrichtung stattfindet.
In einer weiteren Ausführungsform muss kein Transport des festgehaltenen Trägerpartikels erfolgen, sondern das Inkontakbringen des Trägerpartikels mit dem zweiten Fluidstrom kann durch Änderung der Strömungsverhält- nisse im vierten Mikrokanal, z.B. durch Änderung der Flussgeschwindigkeiten in einem oder mehreren Mikrokanälen erreicht werden, so dass das eingefangene Trägerpartikel, das sich zunächst in einer dem ersten Fluidstrom entsprechenden Zone befindet, durch Änderung der Strömungsverhältnisse in eine Zone gelangt, in der es mit dem zweiten Fluidstrom in Kontakt kommt. Selbstverständlich können beide zuvor genannten Ausführungsformen auch miteinander kombiniert werden.
Neben dem ersten und dem einen oder mehreren zweiten Mikrokanälen, welche das Trägerpartikel mit dem immoblisierten Molekül und den oder die Reaktanten in die Vorrichtung transportieren, sind vorzugsweise weiterhin ein oder mehrere dritte Mikrokanäle vorgesehen, die beispielweise inerte Fluidströme, wie etwa Pufferlösungen, in die Vorrichtung transportieren. Dabei können der oder die dritten Mikrokanäle derart angeordnet werden, dass im vierten Mikrokanal ein oder mehrere dritte Fluidströme entstehen, die zwischen den ersten und zweiten Fluidströmen angeordnet sind. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur Analyse von Molekülen eingesetzt werden. Bei Verwendung von Trägerpartikeln, auf denen nur ein einziges Molekül immobilisiert ist, eignet sich die Vorrichtnung zur Durchführung von Einzelmolekülanalysen, beispielsweise zur Charakterisierung von Biomolekülen. Ein besonders bevorzugtes Gebiet ist die Sequenzierung von Nukleinsäuren. Darüberhinaus kann die Vorrichtung auch zur Synthese von Molekülen einsetzt werden, wobei auf dem Träger Partikel ein Ausgangsprodukt immobilisiert wird, das in der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem oder mehreren Reaktionspartnern gleichzeitig oder sequenziell in Kontakt gebracht wird. Auf diese Weise können beispielsweise organische Verbindungen, z. B. komplexe organische Verbindungen oder Biopolymere, wie etwa Peptide, Polypeptide, Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga synthetisiert werden. Dabei ist die Vorrichtung insbesondere auch zur Synthese von Einzelmolekülen geeignet.
Wenn die Vorrichtung für analytische Anwendungen, z. B. zur Nuklein- säuresequenzierung eingesetzt wird, enthält sie zweckmäßigerweise ein Mittel zum Nachweis einer Reaktion des immobilisierten Moleküls mit dem Reaktanten, beispielsweise einen geeigneten Detektor. Wird die Vor- richtung für synthetische Zwecke eingesetzt, so enthält sie günstigerweise Mittel zur Isolierung des auf dem Trägerpartikels synthetisierten Moleküls, ggf. nach Abspaltung vom Trägerpartikel.
Weiterhin kann die Vorrichtung Mittel zum Einleiten von Fluidströmen in die Mikrokanäle, Mittel zum Ableiten von Fluidströmen aus den Mikrokanälen und Reservoirs für erste, zweite und ggf. dritte Fluidströme enthalten. Außerdem enthält sie vorzugsweise automatische Manipulationsvorrichtungen, Heiz- oder Kühleinrichtungen wie Peltier-Elemente, Mittel zur Sortierung von Trägerpartikeln oder/und Syntheseprodukten, Reagenzien sowie elektronische Steuer- und Auswertungsgeräte. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zwischen einem immobilisierten Molekül und einem freien Reaktanten, z. B. zur Einzelmolekülanalyse und insbesondere zur Einzelmolekül-Sequenzierung, umfassend: (a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Molekül,
(b) Einbringen des Trägerpartikels in ein System von in fluidischer Kommunikation stehenden, zumindest teilweise optisch transparenten Mikrokanälen, wobei die Vorrichtung umfasst: (i) einen ersten Mikrokanal zum Einbringen eines ersten
Fluidstroms, umfassend das Trägerpartikel, (ii) mindestens einen zweiten Mikrokanal zum Einbringen von mindestens einem zweiten Fluidstrom, umfassend einen Reaktanten für das zu immobilisierte Molekül, (iii) gegebenenfalls mindestens einen dritten Mikrokanal zum
Einbringen eines dritten Fluidstroms,
(iv) mindestens einen vierten Mikrokanal, wobei die Mikrokanäle
(i), (ii) und (iii) in den vierten Mikrokanal einmünden und wobei zumindest in einem Abschnitt des vierten Mikrokanals zumindest die ersten und zweiten Fluidströme im
Wesentlichen ohne Vermischung strömen,
(c) Festhalten des Trägerpartikels an einer vorbestimmten Position im Bereich des Abschnitts des vierten Mikrokanals, in dem die Fluidströme im Wesentlichen ohne Vermischung strömen, (d) Inkontaktbringen des festgehaltenen Trägerpartikels mit mindestens einem zweiten, den Reaktanten enthaltenden Fluidstrom und (e) gegebenenfalls Nachweisen der Reaktion zwischen dem immobilisierten Molekül und dem Reaktanten.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorzugsweise eine Sequenziermethode, bei der ein einzelnes auf einem Träger immobilisiertes Nukleinsäuremolekül untersucht wird. Das Verfahren eignet sich jedoch für andere analytische und synthetische Reaktionen, die mit einer geringen Anzahl von z. B. bis zu 1 000 Molekülen oder sogar nur mit Einzelmolekülen duchgeführt werden können. Besonders bevorzugt ist die Durchführung von analytischen Reaktionen, die innerhalb der Vorrichtung durch optische Methoden nachweisbar sind.
Das für das Verfahren verwendete Trägerpartikel hat eine Größe, die eine Bewegung in Mikrokanälen und das Festhalten an einer gewünschten Position innerhalb einer Sequenziervorrichtung ermöglicht. Die Partikelgröße liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 10 μm und besonders bevorzugt von 1 bis 3 μm. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind Kunststoffe wie Polystyrol, Polymethylmethacrylat, Polypropylen, Polycar- bonat oder Copolymere davon, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle wie Silicium, Metalloxide wie Siliciumdioxid oder Verbundmaterialien, die mehrere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststoffen oder Glas, Partikel aus Silicium oder Partikel mit einem Kunststoffkern und einer Silicium- oder Siliciumdioxidhülle eingesetzt.
Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise über ihre δ'-Enden auf dem Trägerpartikel immobilisiert. Die Bindung der Nukleinsäuremoleküle an den Träger kann durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen. Beispielsweise kann die Bindung der Polynukleotide an den Träger durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z.B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti- Hapten-Antikörper, Zucker/Lectin etc., vermittelt werden. So können biotinylierte Nukleinsäuremoleküle an Streptavidin-beschichtete Träger gekoppelt werden. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle auch adsorptiv an den Träger gebunden werden. So kann eine Bindung von durch Einbau von Alkanthiolgruppen modifizierten Nukleinsäuremolekülen an metallische Träger, z.B. Goldträger, erfolgen. Noch eine weitere Alternative ist die kovalente Immobilisierung, wobei die Bindung der Polynukleotide über reaktive Silangruppen auf einer Silika-Oberfläche • vermittelt werden kann.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden Trägerpartikel verwendet, an die nur ein einziges Molekül, z.B. ein Nukleinsäuremolekül, gebunden ist. Derartige Trägerpartikel können dadurch erzeugt werden, dass die zu analysierenden Moleküle, z.B. die zur Sequenzierung vorgesehenen Nukleinsäuremoleküle, in einem molaren Verhältnis von vorzugsweise 1 :5 bis 1 :20, z.B. 1 : 10, mit den Trägerpartikeln unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, bei denen eine Immobilisierung der Moleküle an den Träger stattfindet. Die resultierenden Trägerpartikel werden dann, z.B. anhand von auf den Molekülen enthaltenen Fluoreszenzmarkierungsgruppen sortiert und von Partikeln, an die kein Molekül gebunden ist, abgetrennt. Diese Sortierung und Abtrennung kann beispielsweise nach den in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue μTAS 96, 85- 87) , Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1 994), 5740-5747) oder Rigler (J. Biotech. 41 (1 995), 1 77-1 86) beschriebenen Methoden erfolgen, die eine Detektion mit einem konfokalen Mikroskop beinhalten.
Die an einen Träger gebundenen Nukleinsäuremoleküle, z.B. DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, können in einzelsträngiger Form oder doppelsträngiger Form vorliegen. Bei doppelsträngigen Molekülen muss sichergestellt sein, dass markierte Nukleotidbausteine nur von einem einzigen Strang abgespalten werden können. Bei den zu sequenzierenden Nukleinsäure- strängen tragen im Wesentlichen alle, z.B. mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 % aller Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe. Vorzugsweise tragen im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens zwei Basentypen, beispielsweise zwei, drei oder vier Basentypen, eine Fluoreszenzmarkierung, wobei jeder Basentyp günstigerweise eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungsgruppe trägt. Derart markierte Nukleinsäuren können durch enzymatische Primerextension an einer Nukleinsäurematrize unter Verwendung einer geeigneten Polymerase, z.B. einer DNA-Polymerase wie etwa einer DNA- Polymerase von Thermococcus gorgonarius oder anderen thermostabilen Organismen (Hopfner et al., PNAS USA 96 ( 1 999), 3600-3605) oder einer mutierten Taq-Polymerase (Patel und Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095- 510) unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nukleotidbausteine erzeugt werden. Die markierten Nukleinsäurestränge können auch durch Amplifika- tionsreaktionen, z.B. PCR, hergestellt werden. So entstehen bei einer asymmetrischen PCR Amplifikationsprodukte, bei denen nur ein einziger Strang Fluoreszenz-markierungen enthält. Derartige asymmetrische Amplifikationsprodukte können in doppelstrangiger Form sequenziert werden. Durch symmetrische PCR werden Nukleinsäurefragmente hergestellt, bei denen beide Stränge fluoreszenzmarkiert sind. Diese beiden fluoreszenzmarkierten Stränge können separiert und getrennt in einzelsträn- giger Form auf Trägerpartikeln immobilisiert werden, sodass die Sequenz eines oder beider Komplementärstränge separat bestimmt werden kann. Alternativ kann einer der beiden Stränge am 3'-Ende derart modifiziert werden, z.B. durch Einbau einer PNA-Klammer, sodass eine Abspaltung von Monomerbausteinen nicht mehr möglich ist. In diesem Fall ist eine Doppelstrangsequenzierung möglich.
Gegebenenfalls kann an den zu untersuchenden Nukleinsäurestrang noch ein "Sequenzidentifikator", d.h. eine markierte Nukleinsäure bekannter Sequenz, angefügt werden, z.B. durch enzymatische Reaktion mit Ligase oder/und Terminaler Transferase, sodass zu Beginn der Sequenzierung zunächst ein bekanntes Fluoreszenzmuster und anschließend erst das der unbekannten, zu untersuchenden Sequenz entsprechende Fluoreszenzmuster erhalten wird.
Die Nukleinsäurematrize, deren Sequenz bestimmt werden soll, kann beispielsweise aus DNA-Matrizen wie genomischen DNA-Fragmenten, cDNA-Molekülen, Plasmiden etc., aber auch aus RNA-Matrizen wie mRNA- Molekülen ausgewählt werden. Die Fluoreszenzmarkierungsgruppen können aus bekannten zur Markierung v o n B i o p o ly me re n , z . B . N u kl e i n s ä u re n , v e rwe n d ete n Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3, Cy5 oder Derivaten davon etc. ausgewählt werden.
Schritt (b) des Verfahrens umfasst das Einbringen eines beladenen Trägerpartikels in eine erfindungsgemäße Vorrichtung, z.B. eine Sequenziervorrichtung.
Das Einbringen des Trägerpartikels durch den ersten Mikrokanal sowie das Einbringen weiterer Fluidströme durch die zweiten und dritten Mikrokanäle kann durch hydrodynamischen oder/und elektroosmotischen Fluss erfolgen. Vorzugsweise wird ein hydrodynamischer Fluss verwendet. Die Steuerung des Flusses in den Zufuhrkanälen kann gemeinsam oder jeweils getrennt durch Verwendung geeigneter Mittel, z.B. Pumpen, Ventile oder/und gravitationsgeregelte Zufuhr erfolgen. Der Durchmesser der ersten, zweiten und dritten Mikrokanäle kann jeweils gleich oder unterschiedlich sein und liegt z.B. im Bereich von 5 bis 500 μm, besonders bevorzugt im Bereich von 1 0 bis 100 m und am meisten bevorzugt 25-75 μm.
Mit Hilfe eines Einfanglasers, z.B. eines IR-Lasers, kann das Trägerpartikel im Mündungsbereich des vierten Mikrokanals gemäß Verfahrensschritt (c) festgehalten werden. Derartige Methoden sind beispielsweise bei Ashkin et al. (Nature 330 (1987), 24-31 ) und Chu (Science 253 (1991 ), 861 -866) beschrieben.
Vorzugsweise erfolgt das Festhalten des Trägerpartikels durch einen automatisierten Prozess. Hierzu werden die Trägerpartikel durch den ersten Mikrokanal geleitet, wobei sie ein Detektionselement passieren, das den Einfanglaser aktiviert. Dann wird nach dem Einfangen und einer Verlagerung in den einen Reaktanten enthaltenden Fluidstrom die Reaktion am immobilisierten Trägerpartikel durchgeführt. Ein Wegwaschen von restlichen Trägerpartikeln ist beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich, da das eingefangene Trägerpartikel durch aktiven Transport oder/und durch Veränderung der Strömungsverhältnisse aus dem ersten Fluidstrom in einen zweiten Fluidstrom verlagert wird. Daher ist auch das Einfangen eines weiteren Trägerpartikels möglich, sobald das erste festgehaltene Trägerpartikel aus dem ersten Fluidstrom entfernt worden ist. Dies führt zu einer erheblichen Steigerung der Verfahrensgeschwindigkeit.
Die Sequenzierungsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das fortschreitende Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen. Vorzugsweise erfolgt eine enzymatische Abspaltung unter Verwendung einer Exonuklease, wobei Einzelstrang- bzw. Doppelstrang-Exonukleasen, die in 5'→3'-Richtung oder in 3'→5'-Richtung abbauen - je nach Art der Immobilisierung der Nukleinsäurestränge auf dem Träger - eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt werden als Exonukleasen T7 DNA-Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease III verwendet.
Die Reaktionsprodukte, z. B. die durch die Abspaltungsreaktion freigesetzten Nukleotidbausteine, werden dann z.B. mittels eines hydrodynamischen oder/und elektroosmotischen Flusses durch den vierten
Mikrokanal geleitet und vorzugsweise während des Flusses durch den vierten Mikrokanal bestimmt. Vorzugsweise wird ein hydrodynamischer
Fluss verwendet, der eine Erhöhung der Flussgeschwindigkeit ermöglicht, die wiederum zu einer Erhöhung der Detektionswahrscheinlichkeit eines
Reaktionsprodukts führt. Weiterhin kann man durch den hydrodynamischen
Fluss, der z.B. durch Saugwirkung oder Anlegen von Druck erzeugt wird, das Auftreten von Wandeffekten gegenüber elektroosmotischen Pumpen verringern. Der hydrodynamische Fluss weist vorzugsweise ein parabolisches Flussprofil auf, d.h. die Fließgeschwindigkeit ist maximal im
Zentrum des Fluidstroms und nimmt in einer parabolischen Funktion zu den
Rändern bis zu einer Minimalgeschwindigkeit ab. Die Flussgeschwindigkeit liegt im Maximum vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50 mm/s, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 mm/s. Der Durchmesser des vierten Mikrokanals im Bereich des Abschnitts, in dem die Fluidströme im Wesentlichen ohne Vermischung strömen, liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 1 000 μm, besonders bevorzugt von 20 bis 500 μm.
In manchen Fällen kann es bevorzugt sein, dass der vierte Mikrokanal einen größeren Durchmesser als die ersten, zweiten und dritten Mikrokanäle aufweist. Dies jedoch nicht unbedingt erforderlich. So kann beispiels-weise durch lokale Verengungen oder/und Erweiterungen die Strömungsgeschwindigkeit gezielt gesteuert werden. Beispielsweise kann durch Verengung des Kanals die Strömungsgeschwindigkeit erhöht und durch Verbreiterung die Strömungsgeschwindigkeit gezielt verringert werden.
Die Identifizierung von Reaktionsprodukten, z. B. von fluoreszenzmarkierten Nukleotidbausteinen, gemäß Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mittels einer beliebigen Messmethode, z.B. mit einer orts- oder/und zeitaufgelösten Fluoreszenz-Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement wie es in einem Mikrokanal vorliegt, Fluoreszenzsignale bis hinunter zu Einzelphotonenzählung zu erfassen.
Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetek- tion, wie etwa durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, erfolgen, wobei ein sehr kleines, vorzugsweise konfokales Volumenelement, bei- spielsweise 0, 1 x 1 0~15 bis 20 x 10"12 I der durch den Mikrokanal strömenden Probeflüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Rezeptoren zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Fotodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindigkeit der beteiligten Moleküle erstellt wird, sodass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen. Die konfokale Einzelmolekülbestimmung ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc.Photo-Opt.lnstrum.Eng. 1 921 (1 993), 239 ff.) und Mets und Rigler (J.Fluoresc. 4 (1 994) 259-264) beschrieben.
Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomenes", D.H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend - vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von > 100 ps - das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Detektion unter Verwendung einer Laser-Vorrichtung, die ein Beugungselement oder ein phasenmodulierendes Element im Strahlengang des Lasers aufweist, welches gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren optischen
Abbildungselementen dazu eingerichtet ist, aus dem Laserstrahl ein
Beugungsmuster in Form eines linearen oder zweidimensionalen Arrays von Fokalbereichen in dem Mikrokanal zu erzeugen, wobei die optische
Anordnung dazu eingerichtet ist, jeden Fokalbereich konfokal für die
Fluoreszenzdetektion durch die Fotodetektoranordnung abzubilden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Detektionsvorrichtung in zwei aneinander gegenüberliegende Seiten begrenzende Wände des Mikrokanals integriert, wobei eine Wand einen Array von in den Mikrokanal emittierenden Laserelementen als Fluoreszenz-Anregungslichtquelle aufweist und die andere einen Array von den Laserelementen jeweils gegenüberliegend zugeordneten Fotodetektorelementen als Fluoreszenzlichtdetektoren aufweist. Diese beiden Ausführungsformen sind ausführlich in der Patentanmeldung DE 100 23 423.2 offenbart.
Eine Erhöhung der Detektionswahrscheinlichkeit von Nukleotidbausteinen und somit eine Verbesserung der Sensitivität kann durch ein hydrodynamisches Flussprofil in den Fluidströmen der ersten, zweiten und dritten Mikrokanäle sowie in den Fluid-Teilströmen des vierten Mikrokanals der Sequenziervorrichtung erreicht werden. Der hydrodynamische Fluss kann durch geeignete Steuereinrichtungen, z. B. durch steuerbare Pumpen oder/und durch spezielle geometrische Ausgestaltung eingestellt und geregelt werden. Zusätzlich zum hydrodynamischen Fluss können in der Sequenziervorrichtung auch elektrophoretische und elektroosmotische Methoden zum Transport von Reagenzien eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt auch die parallele Sequenzierung von mehreren Trägerpartikel-gebundenen Nukleinsäuremolekülen in jeweils verschiedenen, vorzugsweise parallel angeordneten Mikrokanalsystemen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die an ein Trägerpartikel gekoppelte Nukleinsäure im Wesentlichen in der Mitte eines
Fluid-Teilstroms festgehalten, die abgespaltenen fluoreszenzmarkierten
Nukleotide werden im laminaren Fluss stromabwärts zu einem Detektions- volumenelement geleitet, welches im Wesentlichen über den Fluid-
Teilstrom und insbesondere über dessen Mitte, wo die höchste Flussge- schwindigkeit herrscht, positioniert ist. Die Flussgeschwindigkeit ist dabei vorzugsweise so groß, dass ungeachtet der thermischen Verbreiterung der
Flusstrajektorien durch Brown'sche Diffusion das Nukleotid im Detektorfeld ankommt und registriert wird. Das Detektorfeld wird dabei so klein wie möglich gehalten, dass die Reaktionsprodukte, z. B. die Nukleotidbasen vollständig detektiert werden, während nur ein geringstmöglicher Bruchteil der Hintergrundkontamination (Verhältnis des Detektorquerschnitts zum
Kanal- bzw. Fluid-Teilstromquerschnitt) im Detektor auftritt. Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden. Es zeigen:
Figur 1 die schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. In einen ersten Mikrokanal (2) wird ein Trägerpartikel (4) mit einem darauf immobilisierten Molekül, z. B. einem Nukleinsäuremolekül in einem ersten Fluidstrom in die Vorrichtung eingebracht. Ein zweiter Mikrokanal (6) dient zum Einbringen eines zweiten Fluidstroms, der einen Reaktanten, z. B. einen zum Abbau des Nuklein- säuremoleküls vorgesehenen Reaktanten enthält. Weiterhin ist ein dritter Mikrokanal (8) vorgesehen, der zum Einbringen eines dritten Fluidstroms, z. B. einer Pufferlösung dient. Der dritte Fluidstrom bewirkt günstigerweise eine Trennung des ersten und des zweiten Fluidstroms. Die ersten, zweiten und dritten Mikrokanäle (2, 6, 8) münden in einen vierten Mikrokanal (10) . Zumindest im Bereich der Einmündung in den vierten Mikrokanal (10) existieren jeweils separate Fluidzonen (2a, 6a, 8a) für die aus den Mikrokanälen (2, 6, 8) stammenden Fluidströme.
Das durch den ersten Mikrokanal (2) eingebrachte Trägerpartikel (4) wird im vierten Mikrokanal ( 10) an einer ersten vorbestimmten Position (1 2) in der Zone des ersten Fluidstroms (2a) festgehalten. Das an der ersten vorstimmten Position (1 2) festgehaltene Mikropartikel kann dann, z.B. unter Verwendung des Einfanglasers, zu einer zweiten vorbestimmten Position ( 14) transportiert werden, die im Bereich des zweiten Fluidstroms (6a) liegt, der aus dem zweiten Mikrokanal (6) stammt. An dieser zweiten vorbestimmten Position ( 14) kann die Reaktion, z. B. der Verdau des auf dem Trägerpartikel immobilisierten Nukleinsäuremoleküls mit dem im zweiten Fluidstrom vorhandenen Abbauenzym, vorzugsweise einer Exonuklease, erfolgen. Die Reaktionsprodukte, z. B. die durch den enzymatischen Verdau sequenziell abgespaltenen Nukleotidbausteine werden vom Fluidstrom im vierten Mikrokanal ( 10) zu einem Detektionselement ( 1 6), vorzugsweise einem konfokalen Detektionselement, transportiert und dort nachgewiesen.
Die Fließgeschwindigkeit im System, insbesondere im vierten Mikrokanal, wird so eingestellt, dass die durch die Brown'sche Molekularbewegung verursachte Verbreiterung des Wanderungsweges der abgespaltenen Nukleotidbausteine derart gering ist, dass sie mit ausreichender statistischer Wahrscheinlichkeit im Detektionsvolumen (1 6) nachgewiesen werden können.
Der Durchmesser der ersten, zweiten und dritten Mikrokanäle (2, 6, 8) ist vorzugsweise im Bereich von ca. 50 μm. Der vierte Mikrokanal (10) hat vorzugsweise eine Breite von ca. 1 50 μm und eine Tiefe von ca. 50 μm. Die Formen und Abmessungen der Mikrokanäle können jedoch erheblich variiert werden, sofern ein vermischungsfreier Fluss mehrerer separater Fluidströme zumindest in einem Abschnitt des vierten Mikrokanals gewährleistet ist.
Die erfindungsgemäße Sequenziervorrichtung kann die in Figur 1 gezeigte Anordnung mehrfach, z.B. parallel oder/und sequenziell angeordnet, enthalten, so dass eine parallele oder/und sequenzielle Bestimmung mehrerer Moleküle z.B. Nukleotidsequenzen pro Vorrichtung möglich ist.
Vorteile der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung bestehen insbesondere darin, dass eine einfache Steuerung und Separierung mehrerer unterschiedlicher Fluidströme möglich ist. Die Vorrichtung kann neben der angegebenen Anwendung bei der Nukleinsäuresequenzierung auch für andere Analysen, z.B. für den Einzelmolekülnachweis, aber auch für synthetische Prozesse eingesetzt werden.
In Abweichung von der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform können auch Vorrichtungen eingesetzt werden, in denen der dritte Mikrokanal (8) fehlt, oder in denen mehrere zweite oder/und dritte Mikrokanäle vorhanden sind. Ein Beispiel für eine solche Ausführungsform mit zwei dritten Mikrokanälen ' ist in Figur 2 gezeigt. Die in Figur 2 gezeigte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung erlaubt einen Nachweis des auf dem Trägerpartikel immobilisierten Moleküls, ohne dass das Trägerpartikel nach dem Einfangen innerhalb der Sequenziervorrichtung transportiert werden muss.
Das Trägerpartikel wird hierzu zunächst in der in Figur 2A gezeigten Einstellung durch den ersten Mikrokanal (20) in die Vorrichtung eingebracht und an einer vorbestimmten Position (30) im vierten Mikrokanal (28) durch einen Einfanglaser festgehalten. Dabei liegt die vorbestimmte Position (30) zunächst im Bereich des aus dem ersten Mikrokanal (20) stammenden Fluidstroms (20a). Weiterhin enthält die Vorrichtung einen zweiten Mikrokanal (22) zum Einbringen des Reaktanten sowie zwei dritte Mikrokanäle (24, 26) zum Einbringen von Pufferlösung.
Nach dem Einfangen des Mikropartikels an der Position (30) werden die Strömungsverhältnisse in der Vorrichtung geändert, z.B. durch Verringerung oder Abschalten des ersten Fluidstroms aus dem ersten Mikrokanal und durch Anschalten bzw. Verstärkung der Fluidströme aus dem zweiten Mikrokanal (22) und einem dritten Mikrokanal (26). Auf diese Weise verändern sich die den jeweiligen Mikrokanälen zugehörigen Fluidstromzonen im vierten Mikrokanal (28). Bei der in Figur 2B gezeigten Einstellung gelangt auf diese Weise das an der Position (30) festgehaltene Mikropartikel in den Bereich des aus dem zweiten Mikrokanal (22) stammenden zweiten Fluidstroms (22a), der das Abbauenzym enthält.
Selbstverständlich können die in Figur 1 und Figur 2 gezeigten Ausführungsformen auch miteinander kombiniert werden. Dies bedeutet, dass sowohl ein Transport des eingefangenen Mikropartikels von einer ersten vorbestimmten Position zu einer zweiten vorbestimmten Position als auch eine Veränderung der Fluidstromverhältnisse im Bereich der Mündungszone in den vierten Mikrokanal von einer "Einfang"-Einstellung zu • einer "Analyse"-Einstellung erfolgen kann.
Die Figuren 3a, 3b und 3c zeigen schließlich 3 konkrete - bereits in der Praxis einsetzte - Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Claims

Patentansprüche
Vorrichtung, umfassend:
(a) ein System von in fluidischer Kommunikation stehenden, zumindest teilweise optisch transparenten Mikrokanälen, umfassend
(i) einen ersten Mikrokanal zum Einbringen eines ersten Fluidstroms, umfassend ein Trägerpartikel mit mindestens einem darauf immobilisierten Molekül, (ii) mindestens einen zweiten Mikrokanal zum Einbringen von mindestens einem zweiten Fluidstrom, umfassend einen Reaktanten für das immobilisierte Molekül, (iii) gegebenenfalls mindestens einen dritten Mikrokanal zum Einbringen von mindestens einem dritten
Fluidstrom, (iv) mindestens einen vierten Mikrokanal, wobei die
Mikrokanäle (i), (ii) und (iii) in den vierten Mikrokanal einmünden und wobei zumindest in einem Abschnitt des vierten Mikrokanals zumindest die ersten und zweiten Fluidströme im Wesentlichen ohne
Vermischung strömen,
(b) Mittel zum Festhalten des Trägerpartikels an einer vorbestimmten Position im Bereich des Abschnitts des vierten
Mikrokanals, in dem die Fluidströme im Wesentlichen ohne Vermischung strömen,
(c) Mittel zum Inkontaktbringen des festgehaltenen Trägerpartikels mit dem zweiten, den Reaktanten enthaltenden Fluidstrom und
(d) gegebenenfalls Mittel zum Nachweis einer Reaktion des immobilisierten Moleküls mit dem Reaktanten.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die ersten, zweiten und dritten Fluidströme zumindest in einem Abschnitt des vierten Mikrokanals einen im Wesentlichen laminaren Fluss aufweisen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend Mittel zum Transport des festgehaltenen Trägerpartikels von einer ersten vorbestimmten Position im vierten Mikrokanal zu einer zweiten vorbestimmten Position in den Bereich eines zweiten Fluidstroms.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend Mittel zur Veränderung der Strömungsverhältnisse im vierten Mikrokanal, so dass das festgehaltene Trägerpartikel in den Bereich eines zweiten Fluidstroms gelangt.
5. Vorrichtung nach einer der Ansprüche 1 bis 4 weiterhin umfassend:
- Mittel zum Einleiten von Fluidströmen in die Mikrokanäle,
- Mittel zum Ableiten von Fluidströmen aus den Mikrokanälen, - Reservoirs für erste, zweite und gegebenenfalls dritten Fluidströme.
6. Verwendung einer Vorrichtung nach einer der Ansprüche 1 bis 5 zur Analyse von Molekülen.
7. Verwendung nach Anspruch 6 zur Einzelmolekülanalyse.
8. Verwendung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7 zur Sequenzierung von Nukleinsäuren.
9. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Synthese von Molekülen.
0. Verwendung nach Anspruch 9 zur Synthese von Einzelmolekülen.
1 . Verwendung nach Anspruch 10 zur Synthese von organischen Verbindungen oder Biopolymeren.
2. Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zwischen einem immobilisierten Molekül und einem freien Reaktanten, umfassend: (a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit mindestens einem darauf immobilisierten Molekül, (b) Einbringen des Trägerpartikels in ein System von in fluidischer
Kommunikation stehenden, zumindest teilweise optisch transparenten Mikrokanälen, wobei die Vorrichtung umfasst: (i) einen ersten Mikrokanal zum Einbringen eines ersten Fluidstroms, umfassend das Trägerpartikel, (ii) mindestens einen zweiten Mikrokanal zum Einbringen von mindestens einem zweiten Fluidstrom, umfassend einen Reaktanten für das immobilisierte Molekül, (iii) gegebenenfalls mindestens einen dritten Mikrokanal zum Einbringen von mindestens einem dritten Fluidstrom,
(iv) mindestens einen vierten Mikrokanal, wobei die
Mikrokanäle (i), (ii) und (iii) in den vierten Mikrokanal einmünden und wobei zumindest in einem Abschnitt des vierten Mikrokanals zumindest die ersten und zweiten Fluidströme im Wesentlichen ohne
Vermischung strömen, (c) Festhalten des Trägerpartikels an einer vorbestimmten Position im Bereich des Abschnitts des vierten Mikrokanals, in dem die Fluidströme im Wesentlichen ohne Vermischung strömen, (d) Inkontaktbringen des festgehaltenen Trägerpartikels mit - mindestens einem zweiten, den Reaktanten enthaltenden Fluidstrom und
(e) gegebenenfalls Nachweisen der Reaktion zwischen dem immobilisierten Molekül und dem Reaktanten.
1 3. Verfahren nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Trägerpartikel aus Kunststoff, Glas, Quarz, Metallen, Halbmetallen, Metalloxiden oder aus einem Verbundmaterial verwendet.
14. Verfahren nach Anspruch 1 2 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Trägerpartikel aus Kunststoff, Glas oder Silicium oder einen Verbundmaterial daraus verwendet.
1 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerpartikel einen Durchmesser von 0,5 bis 1 0 μm aufweist.
1 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Trägerpartikel mit einem einzigen darauf immobilisierten Molekül verwendet
1 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass man durch den mindestens einem dritten Mikrokanal einen
Flüssigkeitsstrom zur Trennung von erstem und zweitem Flüssigkeitsstrom leitet.
1 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 7 zur Analyse von Molekülen.
1 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 8 zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend: das Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsäuremoleküls eine Fluoreszenzmarkierung tragen, fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül, das Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch den vierten Mikrokanal und das Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
20. Verfahren nach Anspruch 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül auf dem Trägerpartikel über seinen 5'- Terminus mittels bioaffiner Wechselwirkungen immobilisiert wird.
21 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 9 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens zwei Basentypen eine Fluoreszenzmarkierung tragen.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 9 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Abspalten einzelner Nukleotidbausteine durch eine Exonuklease erfolgt.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 7 zur Synthese von Molekülen.
24. Verfahren nach Anspruch 23 zur Synthese von organischen ' Molekülen oder Biopolymeren
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Festhalten des Trägerpartikels mit einem Einfanglaser erfolgt.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Reaktion durch eine konfokale Fluoreszenzmessung in einem Detektionsvolumenelement erfolgt.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch konfokale Einzelmoleküldetektion wie etwa Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie erfolgt.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung bzw. Time Gating in einem Detektionsvolumenelement erfolgt.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass eine parallele oder/und sequenzielle Reaktion an Molekülen in einem oder mehreren Mikrokanälen durchgeführt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerpartikel im Wesentlichen in der Mitte eines Fluid- Teilstroms festgehalten und der Nachweis durch Leiten von Reaktionsprodukten in einem laminaren Fluss zu einem • Detektionsvolumenelement erfolgt, das sich über den Fluid-Teilstrom erstreckt, in dem das Trägerpartikel festgehalten wird.
31 . Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsvolumenelement so klein wie möglich gehalten wird, um alle Reaktionsprodukte gerade noch nachzuweisen.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 31 , umfassend das Transportieren des festgehaltenen Trägerpartikels im vierten Mikrokanal von einer ersten vorbestimmten Position zu einer zweiten vorbestimmten Position, die im Bereich des zweiten Fluidstroms liegt.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 32, umfassend das Verändern der Strömungsverhältnisse im vierten Mikrokanal, so dass das festgehaltene Trägerpartikel in den Bereich des zweiten Fluidstroms gelangt.
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