EP1444352A2 - Gene, die für dna-replikations- und pathogenese proteine codieren - Google Patents

Gene, die für dna-replikations- und pathogenese proteine codieren

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EP1444352A2
EP1444352A2 EP02796536A EP02796536A EP1444352A2 EP 1444352 A2 EP1444352 A2 EP 1444352A2 EP 02796536 A EP02796536 A EP 02796536A EP 02796536 A EP02796536 A EP 02796536A EP 1444352 A2 EP1444352 A2 EP 1444352A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
rrp
nucleic acid
glutamicum
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02796536A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oskar Zelder
Markus Pompejus
Hartwig Schröder
Burkhard Kröger
Corinna Klopprogge
Gregor Haberhauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1444352A2 publication Critical patent/EP1444352A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • Certain products and by-products of naturally occurring metabolic processes in cells are used in many industries, including the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries. These molecules, collectively referred to as “fine chemicals", include organic acids, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, nucleotides and nucleosides, ipides and fatty acids, diols, carbohydrates, aromatic compounds, vitamins and cofactors and enzymes. Their production is best accomplished by growing large-scale bacteria that have been developed to produce and secrete large quantities of the desired molecule. A particularly suitable organism for this purpose is Corynehacterium glutamicum, a gram-positive, non-pathogenic bacterium. Through strain selection, a number of mutant strains have been developed that produce a range of desirable compounds. However, selecting strains that are improved in the production of a particular molecule is a time consuming and difficult process.
  • This invention provides novel nucleic acid molecules that can be used to identify or classify Corynebacterium glutamicum or related types of bacteria.
  • C. glutamicum is a gram-positive, aerobic bacterium that is commonly used in industry for the large-scale production of a number of fine chemicals and also for the degradation of hydrocarbons (e.g. when crude oil overflows) and for the oxidation of terpenoids.
  • the nucleic acid molecules can therefore be used to identify microorganisms that can be used for the production of fine chemicals, for example by fermentation processes.
  • G & noms or organisms related to genomes These new nucleic acid molecules encode proteins, which are referred to here as DNA replication, riboson and pathogenesis (RRP) proteins. These RRP proteins can, for example, be directly or indirectly involved in the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum.
  • the RRP proteins according to the invention can also be involved in the degradation of hydrocarbons or in the oxidation of terpenoids. These proteins can be used to identify Corynejacterium glutamicum or organisms related to C. glutamicum; the presence of an RRP protein specific for C. glutamicum and related species in a protein mixture can indicate the presence of one of these bacteria in the sample. Furthermore, these RRP proteins can have homologs in plants or animals which are involved in a disease state or a condition; so these proteins can serve as useful pharmaceutical targets for drug screening and the development of therapeutic compounds.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be used for the genetic manipulation of this organism in order to produce a or to modulate several fine chemicals.
  • This modulation can take place due to a direct effect of the manipulation of a gene according to the invention or due to an indirect effect of such a manipulation.
  • a protein that regulates a fine chemical pathway one can directly influence whether the production of the desired compound is up or down regulated, both of which modulate the yield or efficiency of the production of the fine chemical from the cell.
  • Indirect modulation of fine chemical production can also be done by modifying the activity of a protein according to the invention (ie by mutagenesis of the corresponding gene) so that the cell's ability to grow and divide or read. to remain viable and productive is increased overall.
  • the production of fine chemicals from C. glutamicum is usually achieved by large-scale fermentation culture of these microorganisms, conditions that are often suboptimal for growth and cell division.
  • a protein according to the invention for example a stress reaction protein, a cell wall protein or a protein which is involved in the metabolism of compounds which are necessary for the occurrence of cell division and growth, such as nucleotides and amino acids
  • a protein according to the invention for example a stress reaction protein, a cell wall protein or a protein which is involved in the metabolism of compounds which are necessary for the occurrence of cell division and growth, such as nucleotides and amino acids
  • glutamicum ie by changing the activity of one of the proteins according to the invention which is involved in such a pathway
  • glutamicum it is possible to simultaneously change the activity or regulation of another metabolic pathway in this microorganism which may be directly involved in the synthesis or degradation of a fine chemical.
  • Changes in the DNA replication proteins according to the invention can also bring about greater replication accuracy, and thereby increase the genetic stability and viability of the microorganisms and thereby reduce the risk that a further genetic modification which increases the production of the fine chemical is destroyed by faulty replication.
  • This invention provides new nucleic acid molecules which encode proteins, which are referred to here as RRP proteins and, for example, modulate the production or efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum or can serve as identification markers for C. glutamicum or related organisms .
  • Nucleic acid molecules that encode an RRP protein are referred to here as RRP nucleic acid molecules.
  • the RRP protein can modulate the production or efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum or serve as an identification marker for C. glutamicum or related organisms. Examples of such proteins are those encoded by the genes shown in Table 1.
  • isolated nucleic acid molecules for example cDNAs
  • isolated nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence which encodes an RRP protein or biologically active sections thereof, and also nucleic acid fragments which act as primers or hybridization probes for the detection or amplification of RRP -code the nucleic acid (e.g. DNA or mRNA).
  • the isolated nucleic acid molecule comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A or the coding region of one of these nucleotide sequences or a complement thereof.
  • the isolated nucleic acid molecule encodes one of the amino acid sequences listed in Appendix B.
  • the preferred RRP proteins according to the invention also preferably have at least one of the RRP activities described here.
  • nucleic acid sequences of the sequence listing together with the sequence changes at the respective position described in Table 1 are defined as Appendix A.
  • the isolated nucleic acid molecule is at least 15 nucleotides long and hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence from Appendix A.
  • the isolated nucleic acid molecule preferably corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule.
  • the isolated nucleic acid encodes more strongly preferably a naturally occurring C. glutamicum RRP protein or a biologically active portion thereof.
  • Another aspect of the invention relates to vectors, for example recombinant expression vectors, which contain the nucleic acid molecules according to the invention, and host cells, into which these vectors have been introduced.
  • this host cell is used to produce an RRP protein by growing the host cell in a suitable medium. The RRP protein can then be isolated from the medium or the host cell.
  • Another aspect of the invention relates to a genetically modified microorganism in which an RRP gene has been introduced or modified.
  • the genome of the microorganism has been changed by introducing at least one nucleic acid molecule according to the invention which codes the mutated RRP sequence as a transgene.
  • an endogenous RRP gene in the genome of the microorganism is altered by homologous recombination with an altered RRP gene, e.g. functionally disrupted.
  • the microorganism belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium, Corynebacterium glutamicum being particularly preferred.
  • the microorganism is also used to produce a desired compound, such as an amino acid, lysine being particularly preferred.
  • host cells that have more than one of the nucleic acid molecules described in Appendix A.
  • Such host cells can be produced in various ways known to those skilled in the art. For example, they can be transfected by vectors which carry several of the nucleic acid molecules according to the invention. However, it is also possible to introduce one nucleic acid molecule according to the invention into the host cell with one vector and therefore to use several vectors either simultaneously or in a staggered manner. Host cells can thus be constructed which carry numerous up to several hundred of the nucleic acid sequences according to the invention. Such an accumulation can often achieve superadditive effects on the host cell with regard to fine chemical productivity.
  • Another aspect of the invention relates to an isolated KRP protein or a section thereof, for example a biologically active section thereof.
  • the isolated RRP protein or its section can be used for production or ef- Modulate the efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum or serve as identification markers for C. glutamicum or related organisms.
  • the isolated RRP protein or a portion thereof is sufficiently homologous to an amino acid sequence of Appendix B so that the protein or its portion retains the ability, e.g., the production or efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. modulate glutamicum or serve as an identification marker for C. glutamicum or related organisms.
  • the invention also relates to an isolated RRP protein preparation.
  • the RRP protein comprises an amino acid sequence from Appendix B.
  • the invention relates to an isolated full-length protein which essentially forms a complete amino acid sequence from Appendix B (which is encoded by an open reading frame in Appendix A) is homologous.
  • the RRP polypeptide or a biologically active portion thereof can be operably linked to a non-RRP polypeptide to form a fusion protein.
  • this fusion protein has a different activity than the RRP protein alone.
  • this fusion protein can modulate the yield, production and / or efficiency of production of one or more fine chemicals in C. glutamicum or serve as an identification marker for C. glutamicum or related organisms.
  • the integration of this fusion protein in a host cell modulates the production of a desired compound from the cell.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing a fine chemical.
  • the method provides for the cultivation of a cell which contains a vector which brings about the expression of an RRP nucleic acid molecule according to the invention, so that a fine chemical is produced.
  • this method also comprises the step of obtaining a cell which contains such a vector, the cell being transfected with a vector which brings about the expression of an RRP nucleic acid.
  • this method also comprises the step in which the fine chemical is obtained from the culture.
  • the cell belongs to the genus Corynebacterium or Brevijbacterium.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the production of a molecule from a microorganism.
  • These methods involve contacting the cell with a substance that modulates RRP protein activity or RRP nucleic acid expression so that a cell-associated activity is changed compared to the same activity in the absence of the substance.
  • the cell is modulated with respect to one or more C. g utamici-jn RRP protein activities, so that the yield, production and / or efficiency of the production of a desired fine chemical by this microorganism is improved.
  • the substance that modulates RRP protein activity can be a substance that stimulates RRP protein activity or RRP nucleic acid expression. Examples of substances that stimulate RRP protein activity or RRP nucleic acid expression include small molecules, active RRP proteins and nucleic acids that encode RRP proteins and have been introduced into the cell. Examples of substances that inhibit RRP activity or expression include small molecules and RRP antisense nucleic acid molecules.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the yields, the production and / or the efficiency of producing a desired compound from a cell, comprising introducing into a cell a RRP wild-type or mutant gene which either remains on a separate plasmid or is integrated into the genome of the host cell.
  • the integration into the genome can be random or by homologous recombination, so that the native gene is replaced by the integrated copy, which causes the production of the desired compound from the cell to be modulated.
  • these yields are increased.
  • the chemical is a fine chemical, which in an especially preferred embodiment is an amino acid. In a particularly preferred embodiment, this amino acid is L-lysine.
  • the present invention provides RRP nucleic acid and protein molecules that are used to identify Corynebacterium glutamicum or related organisms, to map the C. glutamumcum genome (or the genome of a closely related organism), or to identify microorganisms that can be used for the production of fine chemicals, for example, through fermentations.
  • the proteins encoded by these nucleic acids can be used for direct or indirect modulation of the production or efficiency of the production of a or several fine chemicals in C. glutamicum, as identification markers for C. glutamicum or related organisms, for the oxidation of terpenoids or for the degradation of hydrocarbons or as targets for the development of therapeutic pharmaceutical compounds.
  • the aspects of the invention are further explained below.
  • fine chemical is known in the art and includes molecules that are produced by an organism and are used in various industries, such as, but not limited to, the pharmaceutical, agricultural, and cosmetic industries. These compounds include organic acids such as tartaric acid, itaconic acid and diaminopimelic acid, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides (as described, for example, in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and re - lated compounds, pp. 561-612, in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., ed. VCH: Weinheim and the quotes contained therein, lipids, saturated and unsaturated fatty acids (e.g.
  • arachidonic acid arachidonic acid
  • diols e.g. propanediol and butanediol
  • carbohydrates e.g. hyaluronic acid and trehalose
  • aromatic compounds e.g. aromatic amines, vanillin and indigo
  • vitamins and cofactors as described in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", Pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim and the citations contained therein; and Ong, AS, Niki, E. and Packer, L.
  • amino acids comprise the basic structural units of all proteins and are therefore essential for the normal cell functions in all organisms.
  • amino acid is known in the art.
  • the proteinogenic amino acids of which there are 20 types, serve as structural units for proteins in which they are linked to one another via peptide bonds, whereas the non-proteinogenic amino acids (of which hundreds are known) are usually not found in proteins (see Ul- mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)).
  • the amino acids can be in the optical D or L configuration, although L-amino acids are usually the only type found in naturally occurring proteins.
  • Lysine is not only an important amino acid for human nutrition, but also for monogastric animals such as poultry and pigs.
  • Glutamate is most commonly used as a flavor additive (monosodium glutamate, MSG) and widely used in the food industry, as well as aspartate, phenylalanine, glycine and cysteine.
  • Glycine, L-methionine and tryptophan are all used in the pharmaceutical industry.
  • Glutamine, valine, leucine, isoleucine, histidine, arginine, proline, serine and alanine are used in the pharmaceutical and cosmetic industries. Threonine, tryptophan and D- / L-methionine are widespread feed additives (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (Ed.) Biotechnology Vol 6, Chapter 14a, VCH: Weinheim).
  • amino acids can also be used as precursors for the synthesis of synthetic amino acids and proteins such as N-acetylcysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine, (S) -5-hydroxytryptophan and others in Ulann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 are suitable substances.
  • Cysteine and glycine are each produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transferring the side chain ⁇ -carbon atom to tetrahydrofolate in a reaction catalyzed by serine transhydroxymethylase.
  • Phenylalanine and tyrosine are synthesized from the precursors of the glycolysis and pentose phosphate pathways, erythrosis-4-phosphate and phosphoenolpyruvate, in a 9-step biosynthetic pathway that only differs in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in an 11-step process.
  • Tyrosine can also be produced from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, valine and leucine are each biosynthetic products from pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartate is made from oxaloacetate, an intermediate of the citrate cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each produced by converting aspartate.
  • Isoleucine is made from threonine.
  • histidine is formed from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • Amino acids the amount of which exceeds the protein biosynthesis requirement, cannot be stored and are instead broken down, so that intermediate products are provided for the main metabolic pathways of the cell (for an overview see Stryer, L., Biochemistry, 3rd edition, chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”; S 495-516 (1988)).
  • the cell is able to convert unwanted amino acids into useful metabolic intermediates, the production of amino acids is expensive in terms of energy, precursor molecules and the enzymes required for their synthesis.
  • amino acid biosynthesis is regulated by feedback inhibition, the presence of a particular amino acid slowing down or completely stopping its own production (for an overview of feedback mechanisms in amino acid biosynthetic pathways, see Stryer, L., Biochemistry , 3rd edition, chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)).
  • the emission of a The correct amino acid is therefore restricted by the amount of this amino acid in the cell.
  • Vitamins, cofactors and nutraceuticals comprise another group of molecules. Higher animals have lost the ability to synthesize them and must therefore absorb them, although they are easily synthesized by other organisms such as bacteria. These molecules are either biologically active molecules per se or precursors of biologically active substances that serve as electron carriers or intermediates in a number of metabolic pathways. In addition to their nutritional value, these compounds have a significant industrial value as dyes, antioxidants and catalysts or other processing aids. (For an overview of the structure, activity and the industrial applications of these compounds, see, for example, Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996).
  • vitamin is known in the art and encompasses nutrients which are required by an organism for normal function, but which cannot be synthesized by this organism itself.
  • the group of vitamins can include cofactors and nutraceutical compounds.
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds that are necessary for normal enzyme activity to occur. These compounds can be organic or inorganic; the cofactor molecules according to the invention are preferably organic.
  • nutraceutical encompasses food additives which are beneficial to plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and also certain lipids (e.g. polyunsaturated fatty acids).
  • Thiamine (vitamin Bi) is formed by chemical coupling of pyrimidine and thiazole units.
  • Riboflavin (vitamin B) is synthesized from guanosine 5 'triphosphate (GTP) and ribose 5'-phosphate. Riboflavin in turn is used to synthesize flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • vitamin Bg for example pyridoxine, pyridoxa in, pyridoxal 5 'phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride
  • Panthothenate pantothenic acid, R - (+) -N- (2, 4-dihydroxy-3, 3-dimethyl-l-oxobutyl) -ß-alanine
  • the final steps in pantothenate biosynthesis consist of the ATP-driven condensation of ß-alanine and pantoic acid.
  • pantothenate The enzymes responsible for the biosynthesis steps for the conversion into pantoic acid, into ⁇ -alanine and for the condensation into pantothenic acid are known.
  • the metabolically active form of pantothenate is coenzyme A, whose biosynthesis takes place over 5 enzymatic steps.
  • Pantothenate, pyridoxal-5'-phosphate, cysteine and ATP are the precursors of coenzyme A.
  • These enzymes not only catalyze the formation of pantothenate, but also the production of (R) -pantoic acid, (R) -pantolactone, (R) - Panthenol (provitamin B 5 ), Pantethein (and its derivatives) and coenzyme A.
  • the biosynthesis of biotin from the precursor molecule pimeloyl-CoA in microorganisms has been extensively investigated and several of the genes involved have been identified. It has been found that many of the corresponding proteins are involved in the Fe cluster synthesis and belong to the class of the nifS proteins.
  • the lipoic acid is derived from octanoic acid and serves as a coenzyme in energy metabolism, where it is a component of the pyruvate dehydrogenase complex and the ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase complex.
  • the folates are a group of substances that are all derived from folic acid, which in turn is derived from L-glutamic acid, p-aminobenzoic acid and 6-methylpterine.
  • Corrinoids such as the cobalamins and especially vitamin B ⁇ 2
  • the porphyrins belong to a group of chemicals that are characterized by a tetrapyrrole ring system.
  • the biosynthesis of vitamin B ⁇ is sufficiently complex that it has not been fully characterized, but a large part of the enzymes and substrates involved is now known.
  • Nicotinic acid (nicotinate) and nicotinamide are pyridine derivatives, which are also known as "Niacin” can be called.
  • Niacin is the precursor of the important coenzymes NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and their reduced forms.
  • nucleotide includes the basic structural units of the nucleic acid molecules, which comprise a nitrogenous base, a pentose sugar (for RNA the sugar is ribose, for DNA the sugar is D-deoxyribose) and phosphoric acid.
  • nucleoside encompasses molecules which serve as precursors of nucleotides, but which, in contrast to the nucleotides, have no phosphoric acid unit.
  • nucleic acid molecules By inhibiting the biosynthesis of these molecules or their mobilization to form nucleic acid molecules, it is possible to inhibit RNA and DNA synthesis; if this activity is specifically inhibited in cancer cells, the ability of tumor cells to divide and replicate can be inhibited.
  • nucleotides that do not form nucleic acid molecules but that serve as energy stores (i.e. AMP) or as coenzymes (i.e. FAD and NAD).
  • the purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides also have other possible uses: as intermediates in the biosynthesis of various fine chemicals (eg thiamine, S-adenosyl methionine, folate or riboflavin), as an energy source for the cell (e.g. ATP or GTP) ) and for chemicals themselves, which are usually used as flavor enhancers (for example IMP or GMP) or for many medical applications (see for example Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al VCH: Weinheim, pp. 561-612)
  • Enzymes that are involved in the purine, pyrimidine, nucleoside or nucleotide metabolism are also increasingly used as targets against chemicals for crop protection, including Fungicides, herbicides and insecticides are developed.
  • the purine nucleotides are synthesized from ribose 5-phosphate via a series of steps via the intermediate compound inosine 5 'phosphate (IMP), which leads to the production of guanosine 5' onophosphate (GMP) or adenosine 5 'monophosphate (AMP), from which the triphosphate forms used as nucleotides can be easily produced.
  • IMP inosine 5 'phosphate
  • GMP guanosine 5' onophosphate
  • AMP adenosine 5 'monophosphate
  • Pyrimidine biosynthesis takes place via the formation of uridine 5 'monophosphate (UMP) from ribose 5-phosphate. UMP in turn is converted to cytidine 5'-triphosphate (CTP).
  • the deoxy forms of all nucleotides are produced in a one-step reduction reaction from the diphosphate ribose form of the nucleotide to the diphosphate deoxyribose form of the nucleotide. After phosphorylation, these molecules can participate in DNA synthesis.
  • Trehalose consists of two glucose molecules that are linked by an ⁇ , ⁇ -l, 1 bond. It is commonly used in the food industry as a sweetener, as an additive for dried or frozen foods, and in beverages. applies. However, it is also used in the pharmaceutical, cosmetics and biotechnology industries (see, e.g., Nishi oto et al., (1998) U.S. Patent No. 5,759,610; Singer, MA and Lindquist, S. (1998 ) Trends Biotech. 16: 460-467; Paiva, CLA and Panek, AD (1996) Biotech Ann. Rev. 2: 293-314; and Shiosaka, M. (1997) J. Japan 172: 97-102). Trehalose is produced by enzymes from many microorganisms and is naturally released into the surrounding medium from which it can be obtained by methods known in the art.
  • the cell In order for a certain type of bacteria to survive in an environment, at least three activities are necessary. First, the cell must be able to divide efficiently so that the cell population is at least maintained or increased. Second, the cell must efficiently express those genes that encode proteins that are necessary for normal cell functions. Finally, the cell must be able to interact with its environment, either by adapting to the prevailing environmental conditions or by physically moving into preferred environments or by acting directly on the environment in a way that improves its survivability. The critical steps involved in each of these activities include replication of the bacterial genome, ribosomal activity in protein biosynthesis, and anti-cellular or cell lytic activities (as are involved in the pathogenesis of an organism).
  • the present invention is based at least in part on the discovery of new molecules, which are referred to here as RRP nucleic acid molecules.
  • RRP nucleic acid molecules are not only suitable for the identification of C. glutamicum or related types of bacteria, but also as markers for mapping the C. glutamicum genome and for the identification of bacteria which are suitable for the production of fine chemicals by, for example, fermentative methods.
  • the present invention is also based, at least in part, on the RRP protein molecules which are encoded by these RRP nucleic acid molecules. These RRP molecules can modulate the yield, production and / or efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum, serve as identification markers for C.
  • the RRP molecules according to the invention are direct or indirectly involved in the metabolic pathway of one or more fine chemicals in C. glutamicum.
  • the activity of the RRP molecules according to the invention to participate indirectly or directly in such metabolic pathways has an effect on the production of a desired fine chemical by this microorganism.
  • the activity of the RRP molecules according to the invention is modulated, so that the C. glutamicum metabolic pathways in which the RRP proteins according to the invention are involved are modulated in terms of efficiency or output, which directly or indirectly affects the Production or efficiency of production of a desired fine chemical modulated by C. glutamicum.
  • RRP protein or "RRP polypeptide” includes proteins that modulate the yield, production, and / or efficiency of production of one or more fine chemicals in C. glutamicum, degrade hydrocarbons, oxidize terpenoids, as a target protein for drug screening or design or can serve as identification markers for C. glutamicum or related organisms.
  • RRP proteins include those encoded by the RRP genes listed in Table 1 and Appendix A.
  • RRP gene or "RRP nucleic acid sequence” encompass nucleic acid sequences which encode an RRP protein which consists of a coding region and corresponding untranslated 5 'and 3' sequence regions. Examples of RRP genes are those listed in Table 1.
  • production or “productivity” are known in the art and include the concentration of the fermentation product (e.g. the desired fine chemical), which is formed within a specified period and a specified fermentation volume (e.g. kg product per hour per 1).
  • concentration of the fermentation product e.g. the desired fine chemical
  • fermentation efficiency encompasses the time it takes to achieve a certain amount of production (for example, how long it takes the cell to establish a certain rate of ejection of a fine chemical).
  • yield or “product / carbon yield” is known in the art and encompasses the efficiency of the conversion of the carbon source into the product (ie the fine chemical). For example, this is usually expressed as kg product per kg carbon source.
  • biosynthesis or “biosynthetic pathway” are known in the art and encompass the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a cell from intermediate compounds, for example in a multi-step or highly regulated process.
  • degradation or “degradation path” are known in the art and involve the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules), e.g. in a multi-step or highly regulated process.
  • metabolism is known in the art and encompasses all of the biochemical reactions that take place in an organism.
  • the metabolism of a particular compound for example the metabolism of an amino acid, such as glycine
  • the metabolism of an amino acid, such as glycine then encompasses all biosynthesis, modification and degradation pathways in the cell which concern this compound.
  • the RRP molecules according to the invention are capable of directly or indirectly modulating the production of a desired molecule, such as a fine chemical, in a microorganism, such as C. glutamicum.
  • a desired molecule such as a fine chemical
  • a microorganism such as C. glutamicum.
  • one or more RRP proteins of the invention can be manipulated so that their function is modulated. This modulation of the function can lead to modulation of the yield, production and / or efficiency of the production of one or more fine chemicals from C. glutamicum.
  • the ability of the cell to synthesize or degrade this compound can be directly modulated, thereby reducing the yield and / or modulate the efficiency of fine chemical production.
  • modulating the activity of a protein that regulates a fine chemical pathway one can directly influence whether the production of the desired compound is up or down, both of which modulate the yield or efficiency of the production of the fine chemical from the cell.
  • Indirect modulation of fine chemical production can also be done by modifying the activity of a protein of the invention (ie, mutagenizing the corresponding gene) so that the overall ability of the cell to grow and divide, or to remain viable and productive, is increased.
  • the production of fine chemicals from C. glutamicum is usually achieved by fermentation culture on a large scale of these microorganisms, conditions that are often suboptimal for growth and cell division.
  • a protein according to the invention for example a stress reaction protein, a cell wall protein or proteins which are involved in the metabolism of compounds which are necessary for the occurrence of cell growth and division, such as nucleotides and amino acids), so that better survival, It is possible to grow and multiply in these conditions is, it may be possible to increase the number and productivity of these modified C.
  • glutamicum cells in cultures on a large scale, which in turn should lead to increased yields and / or increased efficiency in the production of one or more desired fine chemicals.
  • the metabolic pathways of a cell are necessarily interdependent and co-regulated.
  • the isolated nucleic acid sequences according to the invention are located in the genome of a Corynebacterium glutamicum strain which is available from the American Type Culture Collection under the name ATCC 13032.
  • the nucleotide sequence of the isolated C. glutamicum RRP nucleic acid molecules and the predicted amino acid sequences of the C. glutamicum RRP proteins are shown in Appendix A and B, respectively. Computer analyzes were carried out which classified and / or identified many of these nucleotide sequences as sequences with homology to E. coli or Bacillus subtil ⁇ s genes.
  • the present invention also relates to proteins whose amino acid sequence is essentially homologous to an amino acid sequence in Appendix B.
  • a protein whose amino acid sequence is essentially homologous to a selected amino acid sequence is at least about 50% homologous to the selected amino acid sequence, for example the entire selected amino acid sequence.
  • a protein whose amino acid sequence is essentially homologous to a selected amino acid sequence can also be at least about 50-60%, preferably at least about 60-70%, more preferably at least about 70-80%, 80-90% or 90- 95%, and most preferably at least about 96%, 97%, 98%, 99% or even more homologous to the selected amino acid sequence.
  • An RRP protein according to the invention or a biologically active section or fragment thereof can modulate the yield, production and / or efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum, degrade hydrocarbons, oxidize terpenoids, serve as a target for drug development or as an identification marker serve for C. glutamicum or related organisms.
  • Various aspects of the invention are described in more detail in the subsections below:
  • nucleic acid molecules which encode RRP molecules or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which are sufficient for use as hybridization probes or primers for the identification or amplification of RRP-coding nucleic acids (for example RRP-DNA).
  • RRP-coding nucleic acids for example RRP-DNA
  • These nucleic acid molecules can be used to identify C. glutamicum or related organisms, to map the genome of C. glutamicum or related organisms or to identify microorganisms that are used to produce fine chemicals, e.g. by fermentation processes are suitable.
  • the term "nucleic acid molecule" as used herein is intended to encompass DNA molecules (e.g. cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (e.g.
  • nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably double-stranded DNA.
  • isolated nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid.
  • an "isolated" nucleic acid preferably has no sequences which naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid originates (for example sequences which are located at the 5 'or 3' end of the nucleic acid).
  • the isolated RRP nucleic acid molecule can contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of the nucleotide sequences that naturally comprise the nucleic acid molecule in the genomic Flank the DNA of the cell from which the nucleic acid originates (for example a C. glutamicum cell).
  • An "isolated" nucleic acid molecule such as a cDNA molecule, can also be substantially free of other cellular material or culture medium if it is produced by recombinant techniques, or of chemical precursors or other chemicals if it is chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention for example a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence from Appendix A or a section thereof, can be isolated using standard molecular biological techniques and the sequence information provided here become.
  • a C. glutamicum RRP cDNA can be isolated from a C. glutamicum bank by using a complete sequence from Appendix A or a portion thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J. , Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising a complete sequence from Appendix A or a section thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers which have been created on the basis of this sequence (for example a nucleic acid molecule comprising a complete sequence can be used Appendix A, or a portion thereof, can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers made from this same sequence from Appendix A).
  • mRNA can be isolated from normal endothelial cells (for example by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al.
  • cDNA can be obtained by means of reverse transcriptase (for example Moloney-MLV reverse transcriptase) at Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL) and using random polynucleotide primers or oligonucleotide primers based on one of the nuances shown in Appendix A - Kleotide sequences are produced.
  • Synthetic oligonucleotide primers for the amplification via polymerase chain reaction can be created on the basis of one of the nucleotide sequences shown in Appendix A.
  • a nucleic acid according to the invention can be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides which correspond to a KRP nucleotide sequence can also be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A.
  • the sequences of Appendix A correspond to the RRP cD ⁇ As according to the invention from Corynebacterium glutamicum. These cD ⁇ As include sequences, the RRP proteins (ie the "coding region” shown in each sequence in Appendix A), and the 5 'and 3' untranslated sequences, which are also given in Appendix A.
  • the nucleic acid molecule can alternatively include only the coding region of one of the sequences in Appendix A.
  • the nucleic acid molecule according to the invention can moreover comprise only a section of the coding region of one of the sequences in Appendix A, for example a fragment which can be used as a probe or primer or fragment which encodes a biologically active section of an RRP protein.
  • the nucleotide sequences determined from the cloning of the RRP genes from C. glutamicum enable the generation of probes and primers which are used to identify and / or clone RRP homologs in other cell types and organisms and RRP homologs from other Corynebak. teries or related species are designed.
  • the probe or primer usually comprises essentially purified oligonucleotide.
  • the oligonucleotide usually comprises a nucleotide sequence region which, under stringent conditions, comprises at least about 12, preferably about 25, more preferably about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides of a sense strand from one of the sequences given in Appendix A, an antisense strand of hybridizes one of the sequences given in Appendix A or naturally occurring mutants thereof.
  • Primers based on a nucleotide sequence from Appendix A can be used in PCR reactions for cloning RRP homologs. Probes based on the RRP nucleotide sequences can be used to detect transcripts or genomic sequences that encode the same or homologous proteins.
  • the probe also comprises a label group attached to it, for example a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme or an enzyme cofactor.
  • a label group attached to it for example a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme or an enzyme cofactor.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes a protein or a section thereof which comprises an amino acid sequence which is sufficiently homologous to an amino acid sequence of Appendix B that the protein or a section thereof retains the ability to increase the yield, production and / or To modulate the efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum, to degrade hydrocarbons, to oxidize terpenoids, to serve as a target for drug development or to serve as an identification marker for C. glutamicum or related organisms.
  • the term "sufficiently homologous" refers to proteins or portions thereof, their Amino acid sequences have a minimal number of identical or equivalent (for example an amino acid residue with a side chain similar to an amino acid residue in one of the sequences of Appendix B) amino acid residues to form an amino acid sequence from Appendix B, so that the protein or a portion thereof the yield, production and / or modulate the efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum, degrade hydrocarbons, oxidize terpenoids, serve as a target for drug development or as an identification marker for C. glutamicum or related organisms. Examples of these activities are also described here.
  • the "function of an RRP protein” thus contributes to the overall regulation of the metabolic pathway of one or more fine chemicals or to the degradation of a hydrocarbon or to the oxidation of a terpenoid.
  • Sections of proteins which are encoded by the RRP nucleic acid molecules according to the invention are preferably biologically active sections of one of the RRP proteins.
  • the term “biologically active section of an RRP protein”, as used here, is intended to include a section, for example a domain / a motif of an RRP protein, which / which the yield, production and / or efficiency of the Production of one or more fine chemicals modulated in C. glutamicum, degrades hydrocarbons, oxidizes terpenoids, serves as a target for drug development or as an identification ark for C. glutamicum or related organisms.
  • a test of the enzymatic activity can be carried out become.
  • Additional nucleic acid fragments that encode biologically active sections of an RRP protein can be determined by isolating a section from one of the sequences in Appendix B, expressing the encoded section of the RRP protein or peptide (for example by recombinant expression in vitro) and produce the activity of the encoded portion of the RRP protein or peptide.
  • the invention also encompasses nucleic acid molecules that differ from one (and portions thereof) of one of the nucleotide sequences shown in Appendix A because of the degenerate genetic code and thus encode the same RRP protein as that encoded by the nucleotide sequences shown in Appendix A.
  • an isolated one according to the invention Nucleic acid molecule is a nucleotide sequence that encodes a protein with an amino acid sequence shown in Appendix B.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes a full-length C. glutamicum protein which is essentially homologous to an amino acid sequence from Appendix B (encoded by an open reading frame shown in Appendix A).
  • nucleotide sequence of Appendix A which leads to a change in the amino acid sequence of the encoded RRP protein without affecting the functionality of the RRP protein.
  • nucleotide substitutions which lead to amino acid substitutions at "non-essential" amino acid residues can be prepared in a sequence from Appendix A.
  • a "non-essential" amino acid residue is a residue that can be changed in the wild-type sequence by one of the RRP proteins (Appendix B) without changing the activity of the RRP protein, whereas an "essential" amino acid residue for the RRP- Protein activity is required.
  • other amino acid residues for example non-conserved or only semi-preserved amino acid residues in the domain with RRP activity
  • a further aspect of the invention consequently relates to nucleic acid molecules which encode RRP proteins which contain modified amino acid residues which are not essential for RRP activity. These RRP proteins differ in amino acid sequence from a sequence in Appendix B, but still retain at least one of the RRP activities described here.
  • the isolated nucleic acid molecule in one embodiment, comprises a nucleotide sequence encoding a protein that comprises an amino acid sequence that has at least about 50% homology to an amino acid sequence from Appendix B and the yield, production, and / or efficiency of production of one or more fine chemicals in C. modulate glutamicum, degrade hydrocarbons, oxidize terpenoids, serve as a target for drug development or can serve as an identification marker for C. glutamicum or related organisms.
  • An isolated nucleic acid molecule that encodes an RRP protein that is homologous to a protein sequence from Appendix B can be prepared by introducing one or more nucleotide substitutions,
  • additions or deletions are generated in a nucleotide sequence from Appendix A, so that one or more amino acid substances ttions, additions or deletions are introduced into the encoded protein.
  • the mutations can be introduced into one of the sequences from Appendix A using standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • Conservative amino acid substitutions are preferably introduced on one or more of the predicted non-essential amino acid residues.
  • the amino acid residue is replaced by an amino acid residue with a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art.
  • amino acids with basic side chains eg lysine, arginine, histidine
  • acidic side chains eg aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar side chains eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • polar side chains e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains e.g. threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains e.g. tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • a predicted non-essential amino acid residue in an RRP protein is thus preferably replaced by another amino acid residue of the same side chain family.
  • the mutations can alternatively be introduced randomly over all or part of the RRP coding sequence, for example by saturation mutagenesis, and the resulting mutants can be examined for RRP activity described here in order to identify mutants, who maintain RRP activity.
  • the encoded protein can be expressed recombinantly, and the activity of the protein can be determined, for example, using the tests described here (see Example 8 of the example part).
  • vectors preferably expression vectors, containing a nucleic acid encoding an RRP protein (or a portion thereof).
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
  • plasmid which is a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, whereby additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (for example bacterial vectors with a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors). Other vectors (e.g.
  • non-episomal mammalian vectors are integrated into the genome of a host cell when introduced into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors can control the expression of genes with which they are operably linked. These vectors are referred to here as "expression vectors".
  • expression vectors usually the expression vectors that can be used in recombinant DNA techniques are in the form of plasmids.
  • plasmid and vector can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass other expression vector forms, such as viral vectors (e.g., replication-deficient retroviruses, adenoviruses and adeno-related viruses), which perform similar functions.
  • the recombinant expression vectors according to the invention comprise a nucleic acid according to the invention in a form which is suitable for the expression of the nucleic acid in a host cell, that is to say that the recombinant expression vectors comprise one or more regulatory sequences, selected on the basis of the host cells to be used for expression, with the are operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • “operably linked” means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) in such a way that expression of the nucleotide sequence is possible (for example in an in vitro transcription / Translation system or in a host cell if the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to include promoters, repressor binding sites, activator binding sites, enhancer areas and other expression control elements (for example terminators, other elements of the m-RNA secondary structure or polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzyology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatory sequences include those that control the constitutive expression of a nucleotide sequence in many host cell types and those that control the expression of the nucleotide sequence only in certain host cells. The person skilled in the art is aware that the design of an expression vector can depend on factors such as the choice of the host cell to be transformed, the desired level of protein expression etc.
  • the expression vectors according to the invention can be introduced into the host cells so that proteins or peptides, including of the fusion proteins or peptides encoded by the nucleic acids as described herein (e.g., RRP proteins, mutated forms of RRP proteins, fusion proteins, etc.).
  • the recombinant expression vectors according to the invention can be designed for the expression of RRP proteins in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • RRP genes in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells (with Baculovirus expression vectors), yeast and other fungal cells (see Romanos, MA et al.
  • the recombinant expression vector can be transcribed and translated in vitro, for example using regulatory sequences of the T7 promoter and T7 polymerase.
  • Proteins are usually expressed in prokaryotes using vectors which contain constitutive or inducible promoters which control the expression of fusion or non-fusion proteins.
  • Fusion vectors contribute a number of amino acids to a protein encoded therein, usually at the amino terminus of the recombinant protein. These fusion vectors usually have three functions: 1) to increase the expression of recombinant protein; 2) increasing the solubility of the recombinant protein; and 3) supporting the purification of the recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification.
  • a proteolytic cleavage site is often introduced at the junction of the fusion unit and the recombinant protein, so that the recombinant protein can be separated from the fusion unit after the fusion protein has been purified.
  • These enzymes and their corresponding recognition sequences include factor Xa, thrombin and enterokinase.
  • Common fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which Glutathione-S-Transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A to the recombinant target protein is fused.
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • the coding sequence of the RRP protein is cloned into a pGEX expression vector so that a vector is generated which encodes a fusion protein, comprising from the N-terminus to the C-terminus: GST - thrombin cleavage site - X protein.
  • the fusion protein can be purified by affinity chromatography using glutathione-agarose resin.
  • the recombinant RRP protein that is not fused to GST can be obtained by cleaving the fusion protein with thrombin.
  • Suitable inducible non-fusion E. coli expression vectors include pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET lld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990 ) 60-89).
  • Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter.
  • the target gene expression from the pETIld vector is based on the transcription from a T7-gnl0-lac fusion promoter, which is mediated by a coexpressed viral RNA polymerase (T7 gnl). This viral polymerase is supplied by the BL 21 (DE3) or HMS174 (DE3) host strains from a resident ⁇ prophage which harbors a T7 gnl gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • One strategy to maximize the expression of the recombinant protein is to express the protein in a host bacterium whose ability to proteolytically cleave the recombinant protein is impaired (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California ( 1990) 119-128).
  • Another strategy is to change the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be inserted into an expression vector, so that the individual codons for each amino acid are those which are preferably used in a bacterium selected for expression, such as C. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). This change in the nucleic acid sequences according to the invention can be carried out using standard DNA synthesis techniques.
  • the RRP protein expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943 ), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods of constructing vectors suitable for use in other fungi such as filamentous fungi NEN include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ & Punt, PJ (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, JF Peberdy et al., ed. , Pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • the RRP proteins according to the invention can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol .. 3: 2156-2165) and pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • the RRP proteins according to the invention can be expressed in cells of single-cell plants (such as algae) or in plant cells of higher plants (for example spermatophytes such as crops).
  • plant expression vectors include those which are described in detail in: Bekker, D., Keper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border ", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
  • a nucleic acid according to the invention is expressed in mammalian cells with a mammalian expression vector.
  • mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • the control functions of the expression vector are often provided by viral regulatory elements. Commonly used promoters come, for example, from polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus and si ian virus 40.
  • the recombinant mammalian expression vector can preferably bring about the expression of the nucleic acid in a specific cell type (for example, tissue-specific regulatory elements are used for the expression of the nucleic acid).
  • tissue-specific regulatory elements are known in the art.
  • suitable tissue-specific promoters include the albumin promoter (.. liver-specific; Pinkert et al (1987) Genes Dev 1: 268-277), lymphoid-specific promoters, and in particular promoters of T (Ca lame and Eaton (1988) Adv Im- munol 43235-275%) -Zellrezeptoren
  • neuron-specific promoters e.g. the neurofilament promoter; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477
  • pancreatic-specific promoters Edlund et al.
  • mammary specific promoters e.g., milk serum promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Patent Application Publication No. 264,166.
  • Development-regulated promoters are also included, for example the mouse hox promoters (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and the ⁇ -fetoprotein promoter (Ca pes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).
  • the invention also provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule according to the invention which is cloned into the expression vector in the antisense direction. That that the DNA molecule is operably linked to a regulatory sequence in such a way that expression (by transcription of the DNA molecule) of an RNA molecule which is antisense to the RRP mRNA becomes possible.
  • Regulatory sequences can be selected which are operably linked to a nucleic acid cloned in the antisense direction and which control the continuous expression of the antisense RNA molecule in a multiplicity of cell types, for example viral promoters and / or enhancers or regulatory sequences can be selected that control the constitutive, tissue-specific or cell-type-specific expression of antisense RNA.
  • the antisense expression vector can be in the form of a recombinant plasmid, phagemid or attenuated virus in which antisense nucleic acids are produced under the control of a highly effective regulatory region, the activity of which is determined by the cell type into which the vector is introduced.
  • a highly effective regulatory region the activity of which is determined by the cell type into which the vector is introduced.
  • Another aspect of the invention relates to the host cells into which a recombinant expression vector according to the invention has been introduced.
  • the terms "host cell” and “recombinant host cell” are used interchangeably here. It goes without saying that these terms refer not only to a specific target cell, but also to the descendants or potential descendants of this cell. Because determined in successive generations due to mutation or environmental influences Modifications can occur, these offspring are not necessarily identical to the parental cell, but are still included in the scope of the term as used here.
  • a host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • an RRP protein can be expressed in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells, yeast or mammalian cells (such as Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells).
  • suitable host cells are known to the person skilled in the art.
  • Microorganisms which are related to Corynebacterium glutamicum and which can be suitably used as host cells for the nucleic acid and protein molecules according to the invention are listed in Table 3.
  • vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • transformation and “transfection”, “conjugation” and “transduction” as used herein are intended to encompass a variety of methods known in the art for introducing foreign nucleic acid (e.g. DNA) into a host cell, including natural ones Competence, chemically mediated transmission, calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, lipofection or electroporation.
  • Suitable methods for transforming or transfecting host cells can be found in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and other laboratory manuals.
  • a gene encoding a selectable marker (eg resistance to antibiotics) is usually introduced into the host cells together with the gene of interest.
  • selectable markers include those that confer resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate.
  • a nucleic acid encoding a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as that encoding an RRP protein, or can be introduced on a separate vector. Cells that have been stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified, for example, by drug selection. (eg cells that have integrated the selectable marker survive, whereas the other cells die).
  • a vector which contains at least a section of an RRP gene into which a deletion, addition or substitution has been introduced in order to change the RRP gene, for example to functionally disrupt it.
  • This RRP gene is preferably a Corynebacterium glutamicun.-RRP gene, however a ho ologon from a related bacterium or even from a mammalian, yeast or insect source can be used.
  • the vector is designed such that the endogenous RRP gene is functionally disrupted in homologous recombination (i.e. no longer encodes a functional protein; also referred to as a "knockout" vector).
  • the vector can be designed in such a way that the endogenous RRP gene is mutated or otherwise altered when homologous recombination occurs, but still encodes the functional protein (for example, the upstream regulatory region can be altered in such a way that the expression of the endogenous RRP protein is changed.).
  • the altered portion of the RRP gene is flanked in the homologous recombination vector at its 5 'and 3' ends by additional nucleic acid of the RRP gene, which is a homologous recombination between the exogenous RRP gene carried by the vector and one endogenous RRP gene in a microorganism.
  • the additional flanking RRP nucleic acid is long enough for successful homologous recombination with the endogenous gene.
  • the vector contains less than one kilobase of flanking DNA (at both the 5 'and 3' ends) (see, e.g., Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503 for a description of homologous recombination vectors).
  • the vector is introduced into a microorganism (e.g., by electroporation), and cells in which the introduced RRP gene is homologously recombined with the endogenous RRP gene are selected using methods known in the art.
  • recombinant microorganisms can be produced which contain selected systems which allow regulated expression of the introduced gene. Inclusion of an RRP gene in a vector, thereby placing it under the control of the Lac operon, enables e.g. expression of the RRP gene only in the presence of IPTG.
  • These regulatory systems are known in the art.
  • a host cell according to the invention such as a prokaryotic or eukaryotic host cell in culture, can be used for the production (ie expression) of an RRP protein.
  • the invention also provides methods for the production of RRP proteins using the host cells of the invention.
  • the method comprises culturing the host cell according to the invention (into which a recombinant expression vector which encodes an RRP protein has been introduced, or into whose genome a gene has been introduced which is a wild-type or modified RRP protein encoded) in a suitable medium until the RRP protein has been produced.
  • the method comprises isolating the RRP proteins from the medium or the host cell.
  • the nucleic acid molecules, proteins, protein homologs, fusion proteins, primers, vectors and host cells described here can be used in one or more of the following methods: identification of C. glutamicum and related organisms, mapping of genomes of organisms related to C. glutamicum , Identification and localization of C. glutamicum sequences of interest, evolution studies, determination of RRP protein areas that are necessary for the function, modulation of the activity of an RRP protein; Modulating the activity of one or more metabolic pathways and modulating the cellular production of a desired compound, such as a fine chemical.
  • the RRP nucleic acid molecules according to the invention have a multitude of uses. They can initially be used to identify an organism as Corynebacterium glutamicum or a close relative of it.
  • the invention provides the nucleic acid sequences of a number of C. glutamicum genes. By probing the extracted genomic DNA of a culture of a uniform or mixed population of microorganisms under stringent conditions with a probe spanning a region of a C. glutamicum gene that is unique to this organism, one can determine whether this organism is present is.
  • Corynebacterium glutamicum itself is not pathogenic, but it is related to pathogenic species such as Corynebacterium diptheriae. The detection of such an organism is of significant clinical importance.
  • the cells in the sample can first be grown in a suitable liquid or on a suitable solid culture medium in order to increase the number of cells in the culture. These cells are lysed, and all of the DNA contained is extracted and, if necessary, cleaned to remove cell debris and protein material that could interfere with the subsequent analysis.
  • Polymerase chain reaction or a similar technique known in the art is performed (see a general overview of methodologies commonly used for nucleic acid sequence amplification in Mullis et al., U.S. Patent No. 4,683,195, Mullis et al., U.S. Patent No. 4965188 and Innis, MA, and Gelfand, DH (1989) PCR-Protocols, A guide to Methods and Applications, Academic Press, pp. 3-12, and (1988) Bio-technology 6: 1197, and International patent application no.
  • primers which are specific for an RRP nucleic acid molecule according to the invention are incubated with the nucleic acid sample so that this particular RRP nucleic acid sequence, if present in the sample, is amplified.
  • the particular nucleic acid sequence to be amplified is selected based on its exclusive presence in the genome of C. glutamicum and only a few closely related bacteria. The presence of the desired amplification product indicates the presence of C. glutamicum or an organism closely related to C. glutamicum.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can also serve as markers for specific regions of the genome. Using techniques known in the art, it is possible to prove the physical localization of the RRP nucleic acid molecules according to the invention on the C. glutamicum genome, which in turn can be used for easier localization of other nucleic acid molecules and genes on the map.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can also be sufficiently homologous to the sequences of related species so that these nucleic acid molecules can also enable the construction of a genomic map in such bacteria (e.g. Brevibacterium lactofermentum).
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention are not only suitable for mapping the genome, but also for functional studies of C. glutamicum proteins.
  • the C. gIutamicu_n genome can be split, for example, and the fragments incubated with the DNA-binding protein.
  • Those that bind the protein can additionally be probed with the nucleic acid molecules according to the invention, preferably with easily detectable labels; the binding of such a nucleic acid molecule to the genome fragment enables the fragment to be located on the genomic map of C. glutamicum, and if so several times with different ones Enzymes is carried out, it facilitates a rapid determination of the nucleic acid sequence to which the protein binds.
  • the RRP nucleic acid molecules according to the invention are also suitable for evolution and protein structure studies.
  • the metabolic processes in which the molecules according to the invention are involved are exploited by a large number of prokaryotic and eukaryotic cells;
  • the degree of evolutionary kinship of the organisms can be determined. Accordingly, such a comparison enables the determination of which sequence regions are conserved and which are not, which can be helpful in determining those regions of the protein which are essential for the enzyme function. This type of determination is valuable for protein technology studies and can give an indication of how much mutagenesis the protein can tolerate without losing its function.
  • the RRP proteins according to the invention can be used as markers for classifying an unknown bacterium as C. glutamicum or for identifying C. glutamicum or closely related bacteria in a sample.
  • cells in a sample may be amplified (eg, by culturing in a suitable medium) to increase the sample size and then lysed so that the proteins contained therein are released. If necessary, this sample can be cleaned to remove cell debris and nucleic acid molecules that could interfere with the subsequent analysis.
  • Antibodies that are specific for a selected RRP protein according to the invention can be incubated with the protein sample in a typical Western test format (see, for example, Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York), wherein the antibody binds to its target protein when this protein is present in the sample.
  • An RRP protein is selected for this type of test if it is unique or almost unique to C. glutamicum or C. glutamicum and very closely related bacteria.
  • the proteins in the sample are then separated by gel electrophoresis and transferred to a suitable matrix, such as nitrocellulose.
  • a suitable second antibody with a detectable label eg chemiluminescent or colorimetric
  • the presence or absence of the marker indicates the presence or absence of the target protein in the sample. If the protein is present, this indicates the presence of C. glutamicum.
  • a similar procedure allows an unknown bacterium to be classified as C. glutamicum; if a series of proteins specific to C. glutamicum are not detected in the protein samples prepared by the unknown bacterium, this bacterium is probably not C. glutamicum.
  • RRP proteins with functional differences from the wild-type RRP proteins. These proteins can be improved in terms of their efficiency or activity, can be present in the cell in larger numbers than usual or can be weakened in terms of their efficiency or activity.
  • Indirect modulation of fine chemical production can also be done by modifying the activity of a protein of the invention (ie, mutagenizing the corresponding gene) so that the overall ability of the cell to grow and divide, or to remain viable and productive, is increased.
  • the production of fine chemicals from C. glutamicum is usually achieved by large-scale fermentation culture of these microorganisms, conditions that are often suboptimal for growth and cell division.
  • a protein according to the invention for example a stress reaction protein, a cell wall protein or proteins which are involved in the metabolism of compounds which are necessary for the occurrence of cell growth and division, such as nucleotides and amino acids), so that better survival, Growing and multiplying in these conditions is possible, it may be possible to increase the number and productivity of these altered C.
  • the nucleic acid and protein molecules of the invention can be used to generate C. glutamicum or related bacterial strains expressing mutant RRP nucleic acid and protein molecules so that the yield, production and / or efficiency of production of a desired connection is improved.
  • the desired compound can be any product made by C. glutamicum, including the end products of biosynthetic pathways and intermediates of naturally occurring metabolic pathways, as well as molecules that are not naturally occurring in the C. glutamicum metabolism but which are produced by a C. glutamicum strain according to the invention ,
  • Example 1 Preparation of the entire genomic DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC13032
  • a culture of Corynejacteriuz ⁇ glutamicum (ATCC 13032) was grown overnight at 30 ° C. with vigorous shaking in BHI medium (Difco). The cells were harvested by centrifugation, the supernatant was discarded, and the cells were resuspended in 5 ml buffer I (5% of the original volume of the culture - all stated volumes are calculated for 100 ml culture volume).
  • composition of buffer I 140.34 g / 1 sucrose, 2.46 g / 1 MgSO 4 • 7 H 2 0, 10 ml / 1 KH 2 PO 4 solution (100 g / 1, with KOH to pH 6.7 adjusted), 50 ml / 1 M12 concentrate (10 g / 1 (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g / 1 NaCl, 2 g / 1 MgS0 4 • 7 H 2 0, 0.2 g / 1 CaCl 2 , 0.5 g / 1 yeast extract (Difco), 10 ml / 1 trace element mixture (200 mg / 1 FeS0 4 • H 2 0, 10 mg / 1 ZnS0 4 • 7 H 2 0, 3 mg / 1 MnCl 2 • 4 H 2 0, 30 mg / 1 H 3 B0 3 , 20 mg / 1 CoCl 2 • 6 H 2 0, 1 mg / 1 NiCl 2 • 6 H 2 0, 3 mg / 1 Na 2 Mo0 4 • 2 H 2 0, 500 mg /
  • the cell wall was broken down and the protoplasts obtained were harvested by centrifugation.
  • the pellet was washed once with 5 ml of buffer I and once with 5 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) The pellet was washed resuspended in 4 ml TE buffer and 0.5 ml SDS solution (10%) and 0.5 ml NaCl solution (5 M) were added.
  • proteinase K at a final concentration of 200 ⁇ g / ml, the suspension was incubated at 37 ° C. for about 18 hours.
  • the DNA was purified by extraction with phenol, pheno1-chloroform isoamyl alcohol and chlorofoirai isoamyl alcohol using standard methods. Then the DNA was precipitated by adding 1/50 volume of 3 M sodium acetate and 2 volumes of ethanol, followed by incubation for 30 min at -20 ° C and 30 min centrifugation at 12000 rpm in a high-speed centrifuge with an SS34 rotor (Sorvall) , The DNA was dissolved in 1 ml of TE buffer containing 20 ⁇ g / ml RNase A and dialyzed against 1000 ml of TE buffer at 4 ° C. for at least 3 hours. During this time the buffer was exchanged 3 times.
  • Plasmids of the pBS series (pBSSK +, pBSSK- and others; Stratagene, LaJolla, USA) or Cosmide, such as SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) or Lorist6 (Gibson, TJ Rosenthal, A., and Waterson, RH (1987) Gene 53: 283-286.
  • Genomic banks as described in Example 2, were used for DNA sequencing according to standard methods, in particular the chain termination method with ABI377 sequencing machines (see, for example, Fleischman, RD et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science 269: 496-512)
  • the sequencing primers with the following nucleotide sequences were used: 5 '-GGAAACAGTATGACCATG-3' or 5 '-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.
  • In vivo mutagenesis of Corynebacterium glutamicum can be carried out by passing a plasmid (or other vector) DNA through E. coli or other microorganisms (e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae), which maintain the integrity of their genetic information cannot maintain.
  • E. coli or other microorganisms e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae
  • Common mutator strains have mutations in the genes for the DNA repair system (eg, mutHLS, mutD, mutT, etc., for comparison see Rupp, WD (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, S 2277-2294, ASM: Washington). These strains are known to the person skilled in the art. The use of these strains is illustrated, for example, in Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34.
  • Example 5 DNA transfer between Escherichia coli and CoryneJba ⁇ terium glutamicum
  • Corynebacterium and Brevi acterium species contain endogenous plasmids (such as pHM1519 or pBLl) that replicate autonomously (for an overview see, for example, Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146).
  • Shuttle vectors for Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum can easily be constructed using standard vectors for E. coli (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring
  • Origin of replication and a suitable marker from Corynebacterium glutamicum is added.
  • origins of replication are preferably taken from endogenous plasmids isolated from Corynebacterium and Brevibactertium species.
  • transformation markers for these species are genes for kanamycin resistance (such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon) or for chloramphenicol (Winnacker, EL (1987) "Fro Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim)
  • kanamycin resistance such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon
  • chloramphenicol Winnacker, EL (1987) "Fro Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim)
  • gene overexpression see, for example, Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, JF et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 and Eikmanns, BJ et al. (1992) Gene 102 : 93-98).
  • C. glutamicum can be carried out by protoplast transformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159: 306-311), electroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters , 53: 399-303) and, in cases where special vectors are used, can also be achieved by conjugation (as described, for example, in Schaefer, A., et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666).
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the mutant gene is to carry out a Northern blot (see, for example, Ausubel et al., (1988) Current Protocols) in Molecular Biology, Wiley: New York), wherein a primer which is designed in such a way that it binds to the gene of interest, with a detectable
  • the label usually radioactive or chemiluminescent is labeled so that - when the total RNA of a culture of the organism is extracted, separated on a gel, transferred to a stable matrix and incubated with this probe - the binding and the quantity of binding of the Probe indicates the presence and also the amount of RNA for this gene.
  • Total cell RNA can be isolated from Corynebacterium glutamicum by various methods known in the art, such as in Bormann, ER et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • Standard techniques such as Western blot, can be used to determine the presence or the relative amount of protein that is translated from this mRNA (see, for example, Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York).
  • total cell proteins are extracted, separated by gel electrophoresis, transferred to a matrix, such as nitrocellulose, and incubated with a probe, such as an antibody, which specifically binds to the desired protein.
  • This probe is usually provided with a chemiluminescent or colorimetric label that is easy to detect. The presence and the observed amount of labeling indicate the presence and the amount of the mutant protein sought in the cell.
  • Example 7 Growth of genetically modified Corynebacterium glutamicum media and growing conditions
  • Corynebacteria are grown in synthetic or natural growth media.
  • a number of different growth media for Corynebakterian are known and readily available (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992) "The Genus
  • Corynebacterium in: The Procaryotes, Vol. II, Balows, A., et al., Ed. Springer-Verlag). These media consist of one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides. Very good carbon sources are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose. Sugar can also be obtained via complex Compounds such as molasses or other by-products of sugar refining to the media.
  • Sources of different carbon sources are alcohols and organic see acids such as methanol, ethanol, acetic acid or lactic acid.
  • Sources of nitrogen are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts, such as NH 4 C1 or (NH 4 ) S0 4 , NH 4 OH, nitrates,
  • Urea amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soy flour, soy protein, yeast extract, meat extract and others.
  • Inorganic salt compounds that may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the media usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • Growth factors and salts often come from complex media components such as yeast extract, molasses, corn steep liquor and the like.
  • the exact composition of the media connections strongly depends on the respective experiment and is decided individually for each specific case. Information on media optimization is available from the textbook "Applied Microbiology. Physiology, A Practical Approach” (ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized either by heat (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can either be sterilized together or, if necessary, separately. All media components can be present at the beginning of the cultivation or can be added continuously or in batches.
  • the growing conditions are defined separately for each experiment.
  • the temperature should be between 15 ° C and 45 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0, and can be maintained by adding buffers to the media.
  • An exemplary buffer for this purpose is a potassium phosphate buffer.
  • Synthetic buffers such as MOPS, HEPES; ACES etc. can be used alternatively or simultaneously.
  • the cultivation pH value can be keep constant by adding NaOH or NH 4 OH. If complex media components, such as yeast extract, are used, the need for additional buffers is reduced since many complex compounds have a high buffer capacity.
  • the pH value can also be regulated with gaseous ammonia.
  • the incubation period is usually in the range of several hours to several days. This time is selected so that the maximum amount of product accumulates in the broth.
  • the disclosed growth experiments can be carried out in a variety of containers, such as microtiter plates, glass tubes, glass flasks or glass or metal fermenters of different sizes.
  • the microorganisms should be grown in microtiter plates, glass tubes or shake flasks either with or without baffles.
  • 100 ml shake flasks are used which are filled with 10% (by volume) of the required growth medium.
  • the flasks should be shaken on a rotary shaker (amplitude 25 mm) at a speed in the range of 100-300 rpm. Evaporation losses can be reduced by maintaining a humid atmosphere; alternatively, a mathematical correction should be made for the evaporation losses.
  • the medium is inoculated to an ODgoo of 0.5-1.5 using cells that are placed on agar plates, such as CM plates (10 g / 1 glucose, 2.5 g / 1 NaCl, 2 g / 1 urea, 10 g / 1 polypeptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 meat extract, 22 g / 1 agar pH 6.8 with 2 M NaOH), which had been incubated at 30 ° C., were grown.
  • the inoculation of the media is carried out either by introducing a saline solution of C. glutamicum cells from CM plates or by adding a liquid preculture of this bacterium.
  • DNA band shift assays also referred to as gel retardation assays
  • reporter gene assays as described in Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 and the references cited therein. Reporter gene test systems are well known and established for use in pro- and eukaryotic cells using enzymes such as beta-galactosidase, green fluorescent protein and several others.
  • membrane transport proteins The activity of membrane transport proteins can be determined according to techniques as described in Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 85-137; 199-234; and 270-322.
  • Example 9 Analysis of the influence of mutated protein on the production of the desired product
  • the effect of the genetic modification in C. glutamicum on the production of a desired compound can be determined by growing the modified microorganisms under suitable conditions (such as those described above) and the medium and / or the cellular components with respect to the increased production of the desired product (ie an amino acid) is investigated.
  • suitable conditions such as those described above
  • Such analysis techniques are well known to the person skilled in the art and include spectroscopy, thin-layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods and analytical chromatography, such as high-performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p. 89- 90 and pp.
  • the analytical methods include measurements of the amount of nutrients in the medium (e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions), measurements of the biomass composition and growth, analysis of the production of common metabolites of biosynthetic pathways and measurements of gases that are generated during fermentation , Standard methods for these measurements are in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, ed. IRL Press, pp. 103-129; 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773) and the literature references specified therein.
  • nutrients in the medium e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions
  • Example 10 Purification of the desired product from C. glutamicum culture
  • the desired product can be obtained from C. glutamicum cells or from the supernatant of the culture described above by various methods known in the art. If the desired product is not secreted by the cells, the cells can be harvested from the culture by slow centrifugation, the cells can be lysed by standard techniques such as mechanical force or ultrasound treatment. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is obtained for further purification of the desired compound. If the product is secreted by the C. glutamicum cells, the cells are removed from the culture by slow centrifugation and the supernatant fraction is kept for further purification.
  • the supernatant fraction from both purification procedures is subjected to chromatography with a suitable resin, the desired molecule either being retained on the chromatography resin, but not many impurities in the sample, 5 or the impurities remaining on the resin, but the sample is not.
  • chromatography steps can be repeated if necessary using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of the suitable chromatography resins and their most effective application 10 for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • the identity and purity of the isolated compounds can be determined by prior art techniques. These include high performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin layer chromatography, NIRS,
  • routine 40 determines many equivalents of the specific embodiments of the invention. These equivalents are intended to be encompassed by the claims below.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuremoleküle, deren Verwendung zur Konstruktion von gentechnisch verbesserten Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Aminosäuren mit Hilfe dieser gentechnisch verbesserten Mikroorganismen.

Description

Gene die für DNA-Replikations- und Pathogenese Proteine codieren
Hintergrund der Erfindung
Bestimmte Produkte und Nebenprodukte von natürlich vorkommenden Stoffwechselprozessen in Zellen werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Moleküle, die ge- meinsam als "Feinchemikalien" bezeichnet werden, umfassen organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, ipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Co- faktoren sowie Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am besten mittels Anzucht von Bakterien im Großmaßstab, die entwickelt wurden, um große Mengen des jeweils gewünschten Moleküls zu produzieren und sezernieren. Ein für diesen Zweck besonders geeigneter Organismus ist Corynehacterium glutamicum, ein gram-positives, nicht-patho- genes Bakterium. Über Stammselektion ist eine Reihe von Mutanten- stammen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter Verbindungen produzieren. Die Auswahl von Stämmen, die hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls verbessert sind, ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt neuartige Nukleinsäuremoleküle bereit, die sich zur Identifizierung oder Klassifizierung von Corynebacterium glutamicum oder verwandten Bakterienarten verwenden lassen. C. glutamicum ist ein gram-positives, aerobes Bakterium, das in der Industrie für die Produktion im Großmaßstab einer Reihe von Feinchemikalien und auch zum Abbau von Kohlenwasserstoffen (bspw. beim Überlaufen von Rohöl) und zur Oxidation von Terpenoiden gemeinhin verwendet wird. Die Nukleinsäuremoleküle können daher zum Identifizieren von Mikroorganismen eingesetzt werden, die sich zur Produktion von Feinchemikalien, bspw. durch Fermentationsverfahren, verwenden lassen. C. glutamicum selbst ist zwar nicht-pa- thogen, jedoch ist es mit anderen Corynebacterium-Arten, wie Corynebacterium diphtheriae (dem Erreger der Diphtherie) verwandt, die bedeutende Pathogene beim Menschen sind. Die Fähigkeit, das Vorhandensein von Corynebacterium-Arten zu identifizieren, kann daher auch eine signifikante klinische Bedeutung haben, z.B. bei diagnostischen Anwendungen. Diese Nukleinsäuremoleküle können zudem als Bezugspunkte zur Kartierung des C. glutamicum-G&noms oder von Genomen verwandter Organismen dienen. Diese neuen Nukleinsäuremoleküle codieren Proteine, die hier als DNA-ßeplikations-, Ribosonen- und Pathogenese- (RRP) Proteine bezeichnet werden. Diese RRP-Proteine können bspw. direkt oder indirekt an der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum beteiligt sein. Die erfindungsgemäßen RRP-Proteine können auch am Abbau von Kohlenwasserstoffen oder an der Oxida- tion von Terpenoiden beteiligt sein. Diese Proteine lassen sich zur Identifikation von Corynejacterium glutamicum oder von zu C. glutamicum verwandten Organismen verwenden; das Vorliegen eines für C. glutamicum und verwandte Arten spezifischen RRP-Proteins in einem Proteingemisch kann auf das vorliegen eines dieser Bakterien in der Probe hindeuten. Ferner können diese RRP-Protein Homologa in Pflanzen oder Tieren aufweisen, die an einem Erkrankungszustand oder einem Leiden beteiligt sind; so können diese Proteine als nützliche pharmazeutische Ziele für das Arzneimit- tel-Screening und die Entwicklung therapeutischer Verbindungen dienen.
Aufgrund der Verfügbarkeit von in Corynebacterium glutamicum ver- wendbaren Klonierungsvektoren, wie bspw. offenbart in Sinskey et al . , US-Patent Nr . 4 649 119 , und von Techniken zur genetischen Manipulation von C. glutamicum und den verwandten Brevibacterium- Arten (z.B. Iactofer_ι.entu_π) (Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162:591-597 (1985); Katsumata et al., J. Bacteriol. 159:306-311 (1984); und Santamaria et al. J. Gen. Microbiol. 130:2237-2246 (1984)), lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur genetischen Manipulation dieses Organismus verwenden, um die Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien zu modulieren. Diese Modulation kann aufgrund einer direkten Auswirkung der Ma- nipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder aufgrund einer indirekten Auswirkung einer solchen Manipulation erfolgen. Bspw. kann man durch Modifikation der Aktivität eines Proteins, das an der Biosynthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt ist, (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) die Fähigkeit der Zelle zur Synthese oder zum Abbau dieser Verbindung direkt modulieren, wodurch die Ausbeute und/oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie moduliert wird. Ebenso kann man durch Modulation der Aktivität eines Proteins, das einen Feinchemikalien- Stoffwechselweg reguliert, direkt beeinflussen, ob die Produktion der gewünschten Verbindung hoch- oder herunterreguliert wird, was beides die Ausbeute oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie von der Zelle moduliert.
Die indirekte Modulation der Feinchemikalienproduktion kann auch durch Modifikation der Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) erfolgen, so daß die Fähigkeit der Zelle, zu wachsen und sich zu teilen oder le- bensfähig und produktiv zu bleiben, insgesamt erhöht ist. Die Produktion von Feinchemikalien aus C. glutamicum wird gewöhnlich durch Fermentationskultur im Großmaßstab dieser Mikroorganismen erzielt, Bedingungen, die für das Wachstum und die Zellteilung häufig suboptimal sind. Durch Verändern eines erfindungsgemäßen Proteins (z.B. eines Streßreaktionsproteins, eines Zellwandproteins oder eines Proteins, das am Stoffwechsel von Verbindungen beteiligt ist, die für das Auftreten von Zellteilung und -Wachstum nötig sind, wie Nukleotide und Aminosäuren) , so daß ein bes- seres Überleben, Wachsen und Vermehren in diesen Bedingungen möglich ist, kann es möglich sein, die Anzahl und die Produktivität dieser veränderten C. glutamicu-π-Zellen in Kulturen im Großmaßstab zu steigern, was wiederum zu gesteigerten Ausbeuten und/oder zu gesteigerter Effizienz der Produktion einer oder mehrerer ge- wünschter Feinchemikalien führen sollte. Ferner sind die Stoff- echselwege einer Zelle notwendigerweise voneinander abhängig und co-reguliert. Durch Ändern der Aktivität irgendeines Stoffwechselwegs in C. glutamicum (d.h. durch Ändern der Aktivität eines der erfindungsgemäßen Proteine, das an einem solchen Weg betei- ligt ist) ist es möglich, gleichzeitig die Aktivität oder Regulation eines anderen Stoffwechselwegs in diesem Mikroorganismus zu ändern, der direkt an der Synthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt sein kann.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen wie eine Veränderung eines erfindungsgemäßen RRP-Proteins die Ausbeute, Produktion oder Produktivität einer Feinchemikalie in einem C. glutamicum Stamm, der ein solch verändertes RRP-Protein trägt, beeinflußt. Beispielsweise ist es möglich, durch Beschleunigung der DNA-Replikations- geschwindigkeit (z.B. durch Optimierung der Aktivität einer oder mehrerer DNA Polymerasen oder durch Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der eine erfindungsgemäße Topoisomerase oder Helicase die DNA entdrillt) die Zellteilung zu beschleunigen, was wiederum die Anzahl der lebenden Feinche ikalien-produzierenden Zel- len in einer Kultur erhöht. In ähnlicher Weise kann durch Erhöhung der Translationsgeschwindigkeit (z.B. durch Optimierung der Aktivität ribosomaler Proteine) die Anzahl von Proteinen in einer Zelle erhöht werden, die an der Synthese einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien beteiligt sind. Beide Maßnahmen soll- ten dazu führen, daß bei einer Kultivierung von Mikroorganismen mit entsprechend veränderten RRP-Proteinen die Produktion der gewünschten Feinchemikalie erhöht wird.
Veränderungen in den erfindungsgemäßen DNA-Replikationsproteinen können auch größere Replikationsgenauigkeit bewirken, und dadurch die genetische Stabilität und Lebensfähigkeit der Mikroorganismen erhöhen und dadurch das Risiko verringern, daß eine weitere, die Produktion der Feinchemikalie erhöhende genetische Veränderung durch fehlerhafte Replikation wieder zunichte gemacht wird.
Diese Erfindung stellt neue Nukleinsäuremoleküle bereit, die Proteine codieren, die hier als RRP-Proteine bezeichnet werden und bspw die Produktion oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren oder als Iden- tifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen können. Nukleinsäuremoleküle, die ein RRP-Protein codieren, werden hier als RRP-Nukleinsäuremoleküle bezeichnet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das RRP-Protein die Produktion oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen. Beispiele für solche Proteine sind diejenigen, die von den in Tabelle 1 angegebenen Genen codiert werden.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft folglich isolierte Nukleinsäu- remoleküle (bspw. cDNAs) , umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein RRP-Protein oder biologisch aktive Abschnitte davon codiert, sowie Nukleinsäurefragmente, die sich als Primer oder Hybridisie- rungssonden zum Nachweis oder zur Amplifikation von RRP-codieren- der Nukleinsäure (bspw. DNA oder mRNA) eignen. Bei besonders be- vorzugten Ausführungsformen umfaßt das isolierte Nukleinsäuremo- lekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen oder den codierenden Bereich einer dieser Nukleotidsequenzen oder ein Komplement davon. In anderen bevorzugten Ausführungsformen codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang B auf- geführten Aminosäuresequenzen. Die bevorzugten erfindungsgemäßen RRP-Proteine besitzen ebenfalls vorzugsweise mindestens eine der hier beschriebenen RRP-Aktivitäten.
Als Anhang A werden im folgenden die Nukleinsäuresequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Als Anhang B werden im folgenden die Polypeptidsequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Se- quenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Bei einer weiteren Aus ührungsform ist das isolierte Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nu- kleotidsequenz aus Anhang A umfaßt. Das isolierte Nukleinsäuremolekül entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül . Die isolierte Nukleinsäure codiert stärker be- vorzugt ein natürlich vorkommendes C. glutamicum-RRP-Protein oder einen biologisch aktiven Abschnitt davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, bspw. rekombinante Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, und Wirtszellen, in die diese Vektoren eingebracht worden sind. Bei einer Ausführungsform wird diese Wirtszelle zur Herstellung eines RRP-Proteins verwendet, indem die Wirtszelle in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Das RRP-Protein kann dann aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen genetisch veränderten Mikroorganismus, bei dem ein RRP-Gen eingebracht oder ver- ändert worden ist. Das Genom des Mikroorganismus ist bei einer Ausführungsform durch Einbringen mindestens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls verändert worden, das die mutierte RRP- Sequenz als Transgen codiert. Bei einer anderen Ausführungsform ist ein endogenes RRP-Gen im Genom des Mikroorganismus durch ho- ologe Rekombination mit einem veränderten RRP-Gen verändert, z.B. funktioneil disruptiert, worden. Der Mikroorganismus gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, wobei Corynebacterium glutamicum besonders bevorzugt ist. Der Mikroorganismus wird in einer bevorzugten Aus- führungsform auch zur Herstellung einer gewünschten Verbindung, wie einer Aminosäure verwendet, wobei Lysin besonders bevorzugt ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Wirtszellen, die mehr als eine der in Anhang A beschriebenen Nukleinsäuremoleküle besitzen. Solche Wirtszellen lassen sich auf verschiedene dem Fachmann bekannte Wege herstellen. Beispielsweise können sie durch Vektoren, die mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle tragen, transfiziert werden. Es ist aber auch möglich mit einem Vektor jeweils ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül in die Wirtszelle einzubringen und deshalb mehrere Vektoren entweder gleichzeitig oder zeitlich abgestuft einzusetzen. Es können somit Wirtszellen konstruiert werden, die zahlreiche, bis zu mehreren Hundert der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen tragen. Durch eine solche Akkumulation lassen sich häufig überadditive Effekte auf die Wirtszelle hinsichtlich der Feinchemikalien-Produktivität erzielen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes KRP- Protein oder einen Abschnitt, bspw. einen biologisch aktiven Abschnitt, davon. Das isolierte RRP-Protein oder sein Abschnitt kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Produktion oder Ef- fizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte RRP-Protein oder ein Abschnitt davon hinreichend homolog zu einer Aminosäu esequenz von Anhang B, so daß das Protein oder sein Abschnitt die Fähigkeit behält, bspw. die Produktion oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum zu modulieren oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder ver- wandte Organismen zu dienen.
Die Erfindung betrifft zudem ein isoliertes RRP-Proteinpräparat . Das RRP-Protein umfaßt bei bevorzugten Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz aus Anhang B. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Vollängen- protein, das zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B (welche von einem offenen Leseraster in Anhang A codiert wird) im wesentlichen homolog ist .
Das RRP-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon kann mit einem Nicht-RRP-Polypeptid funktionsfähig verbunden werden, damit ein Fusionsprotein entsteht. Dieses Fusionsprotein hat bei bevorzugten Ausführungsformen eine andere Aktivität als das RRP-Protein allein. Bei anderen bevorzugten Aus ührungsformen kann dieses Fusionsprotein die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen. Die Integration dieses Fusionsproteins in eine Wirtszelle moduliert bei besonders bevor- zugten Ausführungsformen die Produktion einer gewünschten Verbindung von der Zelle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie. Das Verfahren sieht die Anzucht einer Zelle vor, die einen Vektor enthält, der die Expression eines erfindungsgemäßen RRP-Nukleinsäuremoleküls bewirkt, so daß eine Feinchemikalie produziert wird. Dieses Verfahren umfaßt bei einer bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt der Gewinnung einer Zelle, die einen solchen Vektor enthält, wobei die Zelle mit einem Vektor transfiziert ist, der die Expression einer RRP- Nukleinsäure bewirkt. Dieses Verfahren umfaßt bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt, bei dem die Feinchemikalie aus der Kultur gewonnen wird. Die Zelle gehört bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebac- terium oder Brevijbacterium. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Produktion eines Moleküls von einem Mikroorganismus . Diese Verfahren umfassen das Zusammenbringen der Zelle mit einer Substanz, die die RRP-Proteinaktivität oder die RRP-Nukleinsäure- Expression moduliert, so daß eine zeilassoziierte Aktivität verglichen mit der gleichen Aktivität bei Fehlen der Substanz verändert wird. Die Zelle wird bei einer bevorzugten Ausführungsform hinsichtlich einer oder mehrerer C. g utamici-jn-RRP-Proteinaktivi- täten moduliert, so daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effi- zienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Mikroorganismus verbessert wird. Die Substanz, die die RRP- Proteinaktivität moduliert, kann eine Substanz sein, die die RRP- Proteinaktivität oder die RRP-Nukleinsäure-Expression stimuliert. Beispiele für Substanzen, die die RRP-Proteinaktivität oder RRP- Nukleinsäureexpression stimulieren, umfassen kleine Moleküle, aktive RRP-Proteine und Nukleinsäuren, die RRP-Proteine codieren und in die Zelle eingebracht worden sind. Beispiele für Substanzen, die die RRP-Aktivität oder -Expression hemmen, umfassen kleine Moleküle und RRP-Antisense-Nukleinsäuremoleküle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Ausbeuten, der Produktion und/oder der Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung aus einer Zelle, umfassend das Einbringen eines RRP-Wildtyp- oder -Mutantengens in eine Zelle, das entweder auf einem gesonderten Plasmid bleibt oder in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Die Integration in das Genom kann zufallsgemäß oder durch homologe Rekombination erfolgen, so daß das native Gen durch die integrierte Kopie ersetzt wird, was die Produktion der gewünschten Verbindung von der zu modulierenden Zelle hervorruft. Diese Ausbeuten sind bei einer bevorzugten Ausführungsform erhöht. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Chemikalie eine Feinchemikalie, die in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Aminosäure ist. Diese Aminosäure ist in einer besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform L-Lysin.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt RRP-Nukleinsäure- und -Protein- moleküle bereit, die zur Identifikation von Corynebacterium glutamicum oder verwandter Organismen, zur Kartierung des C. gluta- mάcum-Genoms (oder des Genoms eines nah verwandten Organismus) oder zur Identifikation von Mikroorganismen verwendet werden können, die zur Produktion von Feinchemikalien, z.B. durch Fermenta- tions erfahren, verwendet werden können. Die von diesen Nukleinsäuren codierten Proteine können zur direkten oder indirekten Modulation der Produktion oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum, als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen, zur Oxidation von Terpenoiden oder zum Abbau von Kohlenwasserstoffen oder als Ziele zur Entwicklung therapeutischer pharmazeutischer Verbindun- gen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Aspekte sind nachstehend weiter erläutert.
I . Feinchemikalien
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Moleküle, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw. , jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts- und Kosmetikindustrie. Diese Verbindungen umfas- sen organische Säuren, wie Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopi- melinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and re- lated compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten) , Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure) , Diole (bspw. Propandiol und Butandiol) , Kohlehydrate (bspw. Hya- luronsäure und Trehalose) , aromatische Verbindungen (bspw. aromatische A ine, Vanillin und Indigo) , Vitamine und Cofaktoren (wie beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen beschriebenen Chemika- lien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert .
A. Metabolismus und Verwendungen von Aminosäuren
Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen in allen Organismen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die nicht-proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ul- mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in der optischen D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch euka- ryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L., Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phe- nylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin) , so bezeichnet, weil sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosynthese gewöhnlich mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Biosynthesewege in die übrigen 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glut- amin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu synthetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren interessante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschafts- und pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mononatrium- glutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie ver- wendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet. Threo- nin, Tryptophan und D-/L-Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechno- logy Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim) . Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S) -5-Hydroxytryptophan und anderen in Ul ann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakteriellen Aminosäure-Biosynt- hese und ihrer Regulation s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Bio- chem. 47:533-606) . Glutamat wird durch reduktive Aminierung von α-Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure-Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nach- einander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren, beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt der Glykolyse) und ergibt nach Oxida- tions-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seitenketten-ß-Kohlen- stoffatoms auf Tetrahydrofolat in einer durch Serin-Transhydroxy- methylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glykolyse- und Pentosephosphatweges, Eryt- hrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat, in einem 9-Schritt-Bio- syntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Präphenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11-Schritt-Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalaninhydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-l-pyrophosphat, einem aktivierten Zucker.
Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden statt dessen abgebaut, so daß Zwischenprodukte für die Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäureproduktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure-Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen Überblick über Rückkopplungs-Mechanismen bei Aminosäure-Biosynthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer be- stimmten Aminosäure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
B. Metabolismus und Verwendungen von Vitaminen, Cofakto n und Nutrazeutika
Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenüberträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Verarbei- tungs-Hilfsstoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Ver- bindungen umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nah- rungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren).
Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S) . Thiamin (Vitamin Bi) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol-Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B ) wird aus Guanosin-5 ' -triphosphat (GTP) und Ribose-5'-phosphat synthetisiert . Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavinmononu- kleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin Bg" bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxa in, Pyridoxal-5 ' -phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxinhydrochlorid) , sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6-methylpyri- din. Panthothenat (Pantothensäure, R-(+) -N-(2, 4-Dihydroxy-3, 3-di- methyl-l-oxobutyl) -ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-ge- triebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure . Die für die Biosyntheseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Ala- nin und zur Kondensation in Pantothensäure erantwortlichen Enzyme sind bekannt . Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5'-phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion von (R) -Pantoinsäure, (R)-Pantolacton, (R) -Panthenol (Provitamin B5) , Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene identifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster- Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehö- ren. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des α-Ketoglutaratdehydro- genasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthese der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den Stoffwechselzwischenprodukten Guanosin-5 ' -triphosphat (GTP) , L-Glutaminsäure und p-Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin Bι2) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin Bι ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollstän- dig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der beteiligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niacin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinami- dadenindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.
Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien, wie Riboflavin, Vitamin Bς, , Pantothenat und Biotin, auch durch großangelegte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind. Nur Vitamin Bχ2 wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert . In-vitro-Ver- fahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.
C. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene für den Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Begriff "Purin" oder "Py- rimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteile der Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff "Nukleo- tid" beinhaltet die grundlegenden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose- Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D- Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Moleküle oder ihrer Mobilisierung zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet bei Krebszellen gehemmt, läßt sich die Tei- lungs- und Replikationsfähigkeit von Tumorzellen hemmen. Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energiespeicher (d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen.
Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese medizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin-Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R.I. und Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res. Reviews 10:505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressiva oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J.L. (1995) "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5:752-757; (1995) Biochem. Soc . Trans- act. 23:877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatzmöglichkeiten: als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemikalien (z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Ribofla- vin) , als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, die gewöhnlich als Geschmacksverstärker (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen verwendet werden (siehe bspw. Kuninaka, A. , (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612) . Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolis us beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden, entwickelt werden.
Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Übersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleo- sides"; Kap. 8 in: Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York) . Der Purin-Metabolismus , das Objekt intensiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabolismus in hö- heren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden aus Ribose-5-phosphat über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung Inosin-5 '-phosphat (IMP) synthetisiert, was zur Produktion von Guanosin-5 ' - ono- phosphat (GMP) oder Adenosin-5 ' -monophosphat (AMP) führt, aus de- nen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Verbindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Pyrimidin- biosynthese erfolgt über die Bildung von Uridin-5 ' -monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat . UMP wiederum wird in Cytidin-5'-triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher Nukleotide werden in einer Einsehritt-Reduktionsreaktion aus der Di- phosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyribose- fo:rm des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphorylierung kön- nen diese Moleküle an der DNA-Synthese teilnehmen.
D. Trehalose-Metabolismus und Verwendungen
Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über eine α,α-l, 1-Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken ver- wendet. Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishi oto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610; Singer, M.A. und Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16:460-467; Paiva, C.L.A. und Panek, A.D. (1996) Biotech Ann. Rev. 2:293-314; und Shiosaka, M. (1997) J. Japan 172:97-102). Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
II . Aktivität der erfinungsgemäßen Gene
Damit eine bestimmte Bakterienart in einer Umgebung überleben kann, sind wenigstens drei Aktivitäten nötig. Erstens muß die Zelle in der Lage sein, sich effizient zu teilen, damit die Zellpopulation wenigstens aufrechterhalten oder erhöht wird. Zweitens muß die Zelle effizient solche Gene exprimieren, die Proteine codieren, welche für normale Zellfunktionen nötig sind. Schließlich muß die Zelle in der Lage sein, mit ihrer Umgebung zu interagie- ren, entweder durch Adaption an die vorherrschenden Umgebungsbedingungen oder durch physische Fortbewegung in bevorzugte Umgebungen oder durch direkte Einwirkung auf die Umgebung in einer Weise, daß ihre Überlebensfähigkeit verbessert wird. Die kritischen Schritte, die bei jeder dieser Aktivitäten involviert sind beinhalten Replikation des bakteriellen Genoms, ribosomale Aktivität bei der Proteinbiosynthese und antizelluläre oder zelllyti- sche Aktivitäten (wie sie in der Pathogenese eines Organismus involviert sind) .
III . Elemente und Verfahren der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung von neuen Molekülen, die hier als RRP-Nukleinsäure-Mole- küle bezeichnet werden. Diese RRP-Nukleinsäuremoleküle eignen sich nicht nur zur Identifikation von C. glutamicum oder verwandten Bakterienarten, sondern auch als Marker zur Kartierung des C. glutamicum-Genoms und zur Identifizierung von Bakterien, die sich zur Produktion von Feinchemikalien durch z.B. fermentative Verfahren eignen. Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teil- weise auch auf den RRP-Proteinmolekülen, die von diesen RRP-Nu- kleinsäuremolekülen codiert werden. Diese RRP-Moleküle können die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen die- nen, Kohlenwasserstoffe abbauen und als Ziele für die Entwicklung therapeutischer pharmazeutischer Verbindungen dienen. In einer Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen RRP-Moleküle direkt oder indirekt am Stoffwechselweg einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum beteiligt. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Aktivität der erfindungsgemäßen RRP-Moleküle, an solchen Stoffwechselwegen indirekt oder direkt teilzunehmen, eine Auswirkung auf die Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Mikroorganismus. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität der erfindungsgemäßen RRP-Moleküle moduliert, so daß die C. glutamicum-Stoffwechselwege, an denen die erfindungsgemäßen RRP-Proteine beteiligt sind, hinsieht- lieh der Effizienz oder des Ausstoßes moduliert werden, was direkt oder indirekt die Produktion oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch C. glutamicum moduliert.
Der Begriff "RRP-Protein" oder "RRP-Polypeptid" umfaßt Proteine, die die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen, Terpenoide oxidieren, als Zielprotein für Arzneimittelscreening oder -design oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen können. Beispiele für RRP-Proteine umfassen solche, die von den in Tabelle 1 und Anhang A aufgeführten RRP-Genen codiert werden. Die Ausdrücke "RRP-Gen" oder "RRP-Nukleinsäuresequenz" umfassen Nu- kleinsäuresequenzen, die ein RRP-Protein codieren, das aus einem codierenden Bereich und entsprechenden untranslatierten 5'- und 3 ' -Sequenzbereichen besteht. Beispiele für RRP-Gene sind die in Tabelle 1 aufgelisteten. Die Begriffe "Produktion" oder "Produktivität" sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (bspw. der gewünschten Feinchemikalie) , das innerhalb einer festgelegten Zeitspanne und eines festgelegten Fermentationsvolumens gebildet wird (bspw. kg Produkt pro Std. pro 1) . Der Begriff "Effizienz der Produktion" umfaßt die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (bspw. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Ausstoßrate einer Feinchemikalie benötigt) . Der Be- griff "Ausbeute" oder "Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie) . Dies wird bspw. gewöhnlich ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Vergrößern der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe "Biosynthese" oder "Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Die Begriffe "Abbau" oder "Abbauweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle) , bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Der Begriff "Metabolismus" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Metabolismus einer bestimmten Verbindung (z.B. der Metabolismus einer Aminosäure, wie Glycin) umfaßt dann sämtliche Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.
Die erfindungsgemäßen RRP-Moleküle sind in einer anderen Ausführungsform befähigt, die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus, wie C. gluta- micum, direkt oder indirekt zu modulieren. Unter Verwendung von Gen-Rekombinationstechniken kann/können ein oder mehrere erfindungsgemäße RRP-Proteine so manipuliert werden, daß seine Funktion moduliert ist. Diese Modulation der Funktion kann zur Modulation der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien von C. glutamicum führen.
Beispielsweise kann man durch Modifikation der Aktivität eines Proteins, das an der Biosynthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt ist, (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) die Fähigkeit der Zelle, diese Verbindung zu synthetisieren oder abzubauen, direkt modulieren und dadurch die Ausbeute und/ oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalien modulieren. Ebenso kann man durch Modulation der Aktivität eines Proteins, das einen Feinchemikalien-Stoffwechselweg reguliert, direkt be- einflussen, ob die Produktion der gewünschten Verbindung hoch- oder herunterreguliert wird, was beides die Ausbeute oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie von der Zelle moduliert.
Die indirekte Modulation der Feinchemikalienproduktion kann auch durch Modifikation der Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) erfolgen, so daß die Fähigkeit der Zelle, zu wachsen und sich zu teilen oder lebensfähig und produktiv zu bleiben, insgesamt erhöht ist. Die Produktion von Feinchemikalien aus C. glutamicum wird gewöhnlich durch Fermentationskultur im Grofimaßstab dieser Mikroorganismen erzielt, Bedingungen, die für das Wachstum und die Zellteilung häufig suboptimal sind. Durch Verändern eines erfindungsgemäßen Proteins (z.B. eines Streßreaktionsproteins, eines Zellwandproteins oder von Proteinen, die am Stoffwechsel von Verbindungen beteiligt sind, die für das Auftreten von Zellwachstum und -tei- lung nötig sind, wie Nukleotide und Aminosäuren) , so daß ein besseres Überleben, Wachsen und Vermehren in diesen Bedingungen mög- lieh ist, kann es möglich sein, die Anzahl und die Produktivität dieser veränderten C. glutamicum-Zellen in Kulturen im Großmaßstab zu steigern, was wiederum zu gesteigerten Ausbeuten und/oder zu gesteigerter Effizienz der Produktion einer oder mehrerer ge- wünschter Feinchemikalien führen sollte. Ferner sind die Stoff- wechselwege einer Zelle notwendigerweise voneinander abhängig und co-reguliert . Durch Ändern der Aktivität irgendeines Stoffwechselwegs in C. glutamicum (d.h. durch Ändern der Aktivität eines der erfindungsgemäßen Proteine, das an einem solchen Weg betei- ligt ist) ist es möglich, gleichzeitig die Aktivität oder Regulation eines anderen Stoffwechselwegs in diesem Mikroorganismus zu ändern, der direkt an der Synthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt sein kann.
Die isolierten erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen befinden sich im Genom eines Corynebacterium glutamicum-Stammes, der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 13032 erhältlich ist. Die Nukleotidsequenz der isolierten C. glu- tamicum-RRP-Nukleinsäuremoleküle und die vorhergesagten Aminosäu- resequenzen der C. glutamicum-RRP-Proteine sind im Anhang A bzw. B gezeigt. Es wurden Compu eranalysen durchgeführt, die viele dieser Nukleotidsequenzen als Sequenzen mit Homologie zu E. coli- oder Bacillus subtilϊs-Genen klassifizierten und/oder identifizierten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Proteine, deren Aminosäuresequenz zu einer Aminosäuresequenz in Anhang B im wesentlichen homolog ist. Wie hier verwendet, ist ein Protein, dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen homolog zu einer ausgewählten Amino- säuresequenz ist, zumindest zu etwa 50% homolog zu der ausgewählten Aminosäuresequenz, bspw. zur gesamten ausgewählten Aminosäuresequenz. Ein Protein, dessen Aminosäuresequenz zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz im wesentlichen homolog ist, kann auch mindestens zu etwa 50-60%, vorzugsweise mindestens zu etwa 60-70%, stärker bevorzugt mindestens zu etwa 70-80%, 80-90% oder 90-95% und am stärksten bevorzugt mindestens zu etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder noch homologer zur ausgewählten Aminosäuresequenz sein.
Ein erfindungsgemäßes RRP-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt oder Fragment davon kann die Ausbeute, Produktion und/ oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen, Terpe- noide oxidieren, als Ziel für Arzneimittelentwicklung dienen oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen. In den nachstehenden Unterabschnitten sind verschiedene Aspekte der Erfindung ausführlicher beschrieben:
A. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die RRP-Moleküle oder biologisch aktive Abschnitte davon codieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als Hybridi- sierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizie- rung von RRP-codierenden Nukleinsäuren (z.B. RRP-DNA) hinreichen. Diese Nukleinsäuremoleküle können zur Identifikation von C. glutamicum oder verwandten Organismen, zur Kartierung des Genoms von C. glutamicum oder verwandten Organismen oder zur Identifikation von Mikroorganismen, die zur Produktion von Feinchemikalien, z.B. durch Fermentationsverfahren, geeignet sind, verwendet werden. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", wie hier verwendet, soll DNA- Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) sowie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleotidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfaßt zudem die am 3'- und am 5 '-Ende des codierenden Genbereichs gelegene untransla- tierte Sequenz: mindestens etwa 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5 ' -Endes des codierenden Bereichs und mindestens etwa 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3 '-Endes des codierenden Bereichs des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzel- strängig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise doppel- strängige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, die die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (bspw. Sequenzen, die sich am 5'- bzw. 3 '-Ende der Nukleinsäure befinden). In verschiedenen Ausführungsformen kann bspw. das isolierte RRP-Nukleinsäuremole- kül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (bspw. eine C. glutamicum-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, bspw. eine Nukleinsäu- remolekül mit einer Nukleotidsequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Bspw. kann eine C. glutamicum-RRP-cDNA aus einer C. glu- tamicum-Bank isoliert werden, indem eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie bspw. beschrieben in Sam- brook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Ab- schnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isoliert werden, indem Oligonukleotidprimer verwendet werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz aus Anhang A erstellt worden sind) . Bspw. läßt sich mRNA aus normalen Endothelzellen isolieren (bspw. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299), und die cDNA kann mittels reverser Transkriptase (bspw. Moloney-MLV-Reverse-Transkriptase, erhältlich bei Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Trans- kriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) und mittels zufallsgemäßen Polynukleotidprimern oder Oligonu- kleotidprimern auf der Basis einer der im Anhang A gezeigten Nu- kleotidsequenzen hergestellt werden. Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifizierung via Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann mittels cDNA oder alternativ genomischer DNA als Matrize und geei- gneten Oligonukleotidprimern gemäß PCR-Standard-Amplifikations- techniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer KRP-Nukleotidsequenz entsprechen, können ferner durch Standard- Syntheseverfahren, bspw. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemä- ßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A aufge- führten Nukleotidsequenzen. Die Sequenzen von Anhang A entsprechen den erfindungsgemäßen RRP-cDΝAs aus Corynebacterium glutamicum. Diese cDΝAs umfassen Sequenzen, die RRP-Proteine (d.h. den "codierenden Bereich", der in jeder Sequenz in Anhang A angegeben ist), sowie die 5'- und 3 '-untranslatierten Sequenzen, die eben- falls in Anhang A angegeben sind. Das Nukleinsäuremolekül kann alternativ nur den codierenden Bereich einer der Sequenzen in Anhang A umfassen.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann überdies nur einen Abschnitt des codierenden Bereichs von einer der Sequenzen in Anhang A umfassen, bspw. ein Fragment, das als Sonde oder Primer oder Fragment verwendet werden kann, welches einen biologisch aktiven Abschnitt eines RRP-Proteins codiert. Die aus der Klonie- rung der RRP-Gene aus C. glutamicum ermittelten Nukleotidsequen- zen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von RRP-Homologa in anderen Zelltypen und Organismen und RRP-Homologa von anderen Corynebak- terien oder verwandten Arten ausgelegt sind. Die Sonde bzw. der Primer umfaßt gewöhnlich im wesentlichen gereinigtes Oligonukleo- tid. Das Oligonukleotid umfaßt gewöhnlich einen Nukleotidsequenz- bereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise etwa 25, stärker bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges von einer der in Anhang A angegebenen Sequenzen, eines Antisense-Stranges von ei- ner der in Anhang A angegebenen Sequenzen oder natürlich vorkommenden Mutanten davon hybridisiert. Primer auf der Basis einer Nukleotidsequenz aus Anhang A können in PCR-Reaktionen zur Klonierung von RRP-Homologa verwendet werden. Sonden auf der Basis der RRP-Nukleotidsequenzen können zum Nachweisen von Transkripten oder genomischen Sequenzen, die das gleiche oder homologe Proteine codieren, verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Sonde zudem eine daran gebundene Markierungs- gruppe, bspw. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Cofaktor. Diese Sonden können als Teil eines diagnostischen Test-Kits zur Identifizierung von Zellen verwendet werden, die ein RRP-Protein mißexprimieren, bspw. durch Messen einer Menge einer RRP-codierenden Nukleinsäure in einer Zellenprobe, bspw. durch Nachweisen der RRP-mRNA-Spiegel oder durch Bestimmen, ob ein genomisches RRP-Gen mutiert oder dele- tiert ist.
Bei einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon, der eine Aminosäuresequenz umfaßt, die hinreichend homolog zu einer Amino- säuresequenz von Anhang B ist, daß das Protein oder ein Abschnitt davon die Fähigkeit behält, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum zu modulieren, Kohlenwasserstoffe abzubauen, Terpe- noide zu oxidieren, als Ziel für Arzneimittelentwicklung zu die- nen oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen zu dienen. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "hinreichend homolog" Proteine oder Abschnitte davon, deren Aminosäuresequenzen eine minimale Anzahl identischer oder äquivalenter (bspw. einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen von Anhang B) Aminosäurereste zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B aufwei- sen, so daß das Protein oder ein Abschnitt davon die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen, Terpenoide oxidieren, als Ziel für Arzneimittelentwicklung dienen oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen kann. Beispiele dieser Aktivitäten sind ebenfalls hier beschrieben. Somit trägt die "Funktion eines RRP-Proteins" zur Gesamt-Regulation des Stoffwechselweges einer oder mehrerer Feinchemikalien oder zum Abbau eines Kohlenwasserstoffs oder zur Oxidation eines Terpenoids bei .
Abschnitte von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen RRP-Nu- kleinsäuremolekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte von einem der RRP-Proteine. Der Begriff "biologisch aktiver Abschnitt eines RRP-Proteins", wie er hier verwen- det wird, soll einen Abschnitt, bspw. eine Domäne/ein Motiv eines RRP-Proteins, umfassen, die/das die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum moduliert, Kohlenwasserstoffe abbaut, Terpenoide oxidiert, als Ziel für Arzneimittelentwicklung oder als Identi- fikations arker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dient. Zur Bestimmung, ob ein RRP-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen oder Terpenoide oxi- dieren kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend beschrieben in Beispiel 8 des Beispielteils, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzliche Nukleinsäurefragmente, die biologisch aktive Ab- schnitte eines RRP-Proteins codieren, lassen sich durch Isolieren eines Abschnitts von einer der Sequenzen in Anhang B, Exprimieren des codierten Abschnitt des RRP-Proteins oder -Peptides (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Bestimmen der Aktivität des codierten Abschnittes des RRP-Proteins oder -Peptides herstellen.
Die Erfindung umfaßt zudem Nukleinsäuremoleküle, die sich von einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen (und Abschnitten davon) aufgrund des degenerierten genetischen Codes unterscheiden und somit das gleiche RRP-Protein codieren wie dasjenige, das von den in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen codiert wird. In einer anderen Ausführungsform hat ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die ein Protein mit einer in Anhang B gezeigten Aminosäuresequenz codiert . In einer weiteren Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein C. glutamicum-Vollängenprotein, das zu einer Amino- säuresequenz aus Anhang B (codiert von einem in Anhang A gezeigten offenen Leseraster) im wesentlichen homolog ist.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der RRP-Sequenz, die in der Population existieren können, ist der Fachmann sich ebenfalls bewußt darüber, daß Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz von Anhang A eingebracht werden können, was zur Änderung der Aminosäuresequenz des codierten RRP-Proteins führt, ohne daß die Funktionsfähigkeit des RRP-Proteins beeinträchtigt wird. Bspw. lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an "nicht- essentiellen" Aminosäureresten zu AminosäureSubstitutionen führen, in einer Sequenz von Anhang A herstellen. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der sich in der Wildtypsequenz von einem der RRP-Proteine (Anhang B) verändern läßt, ohne daß die Aktivität des RRP-Proteins verändert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die RRP-Proteinaktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste jedoch (bspw. nicht-konser- vierte oder lediglich semikonservierte Aminosäurereste in der Domäne mit RRP-Aktivität) können für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen sich somit wahrscheinlich verändern, ohne daß die RRP-Aktivität verändert wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft folglich Nukleinsäuremoleküle, die RRP-Proteine codieren, die veränderte Aminosäurereste enthalten, die für die RRP-Aktivität nicht-essentiell sind. Diese RRP-Proteine unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer Sequenz in Anhang B, behalten aber dennoch mindestens eine der hier beschriebenen RRP-Aktivitäten. Das isolierte Nukleinsäuremolekül umfaßt bei einer Ausführungsform eine Nukleotidsequenz, die ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die mindestens etwa 50% Homologie zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B aufweist und die Ausbeute, Produktion und/ oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen, Terpenoide oxidieren, als Ziel für Arzneimittelentwicklung dienen oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen kann.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein RRP-Protein codiert, das zu einer Proteinsequenz aus Anhang B homolog ist, kann durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen,
-additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz aus Anhang A erzeugt werden, so daß eine oder mehrere Aminosäuresubsti- tutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein eingebracht werden. Die Mutationen können in eine der Sequenzen aus Anhang A durch Standard-Techniken, wie stellengerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vor- zugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäurereste eingeführt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Aspa- raginsäure, Glutaminsäure) , ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cy- stein) , nicht-polaren Seitenketten, (bspw. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan) , betaverzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) . Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäu- rerest in einem RRP-Protein wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. In einer weiteren Ausführungsform können die Mutationen alternativ zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der RRP- codierenden Sequenz eingebracht werden, bspw. durch Sättigungsmu- tagenese, und die resultierenden Mutanten können auf eine hier beschriebene RRP-Aktivität untersucht werden, um Mutanten zu identifizieren, die eine RRP-Aktivität beibehalten. Nach der Mutagenese von einer der Sequenzen aus Anhang A kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Pro- teins kann bspw. mit den hier beschriebenen Tests (siehe Beispiel 8 des Beispielteils) bestimmt werden.
B. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein RRP-Protein (oder einen Abschnitt davon) codieren. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (bspw. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikations- ursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle beim Einbringen in die Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funkti- onsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben die Expressionsvektoren, die bei DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden können, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch andere Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (bspw. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren) , die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die sich zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, d.h. daß die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, umfassen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden sind. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden" , daß die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die regulatorische (n) Sequenz (en) gebunden ist, daß die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist (bspw. in einem in-vitro-Tran- skriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist) . Der Begriff "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Repressorbindungsstellen, Akti- vatorbindungsstellen, Enhancerbereiche und andere Expressionskon- trollelemente (bspw. Terminatoren, andere Elemente der m-RNA-Se- kundärstruktur oder Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese regulatorischen Sequenzen sind bspw beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzyology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Regulatorische Sequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern. Der Fachmann ist sich dessen bewußt, daß die Gestaltung eines Expressionsvektors von Faktoren abhängen kann, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Ausmaß der Proteinexpression usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die Wirtszellen eingebracht werden, so daß dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich der Fusionsproteine oder -peptide, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden, hergestellt werden (bspw. RRP-Proteine, mutierte Formen von RRP- Proteinen, Fusionsproteine, usw.). Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von RRP-Proteinen in prokaryotischen oder eukaryo- tischen Zellen ausgestaltet sein. Bspw. können RRP-Gene in bakteriellen Zellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen (mit Baculovi- rus-Expressionsvektoren) , Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A. et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review" , Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsg., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi. in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., Hrsg, S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge) , Algenzellen und Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep. : 583-586) oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiter erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, bspw. mit regulatorischen Sequenzen des T7-Promotors und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren steuern eine Reihe von Aminosäuren zu einem darin codierten Protein, gewöhnlich am Aminoterminus des rekombinanten Proteins, bei. Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von reko - binantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und 3) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreini- gung. Bei Fusions-Expressionsvektoren wird oft eine proteolyti- sche Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so daß die Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist. Diese Enzyme und ihre entspre- chenden Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase .
Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , bei denen Glutathion-S-Transferase (GST) , Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Ziel- protein fusioniert wird. Bei einer Ausführungsform ist die codierende Sequenz des RRP-Proteins in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, so daß ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein codiert, umfassend vom N-Terminus zum C-Terminus: GST - Thrombin- Spaltstelle - X-Protein. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie mittels Glutathion-Agarose-Harz gereinigt werden. Das rekombinante RRP-Protein, das nicht mit GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nicht-Fusions-E. -coli-Expres- sionsvektoren umfassen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) und pET lld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89) . Die Zielgenexpression aus dem pTrc- Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET lld-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gnl0-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten vira- len RNA-Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL 21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen geliefert, der ein T7 gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt .
Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium, dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins gestört ist (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119-128) . Eine weitere Strategie ist die Veränderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserierenden Nukleinsäure, so daß die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression ausge- wählten Bakterium, wie C. glutamicum, verwendet werden (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Diese Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kann durch Standard- DNA-Synthesetechniken erfolgen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der RRP-Protein-Expres- sionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSecl (Bal- dari et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Hersko- witz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eig- nen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cam- bridge University Press: Cambridge.
Alternativ können die erfindungsgemäßen RRP-Proteine in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren ex- primiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen RRP-Proteine in Zellen einzelliger Pflanzen (wie Algen) oder in Pflanzenzellen höherer Pflanzen (bspw. Spermatophyten, wie Feldfrüchte) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Bek- ker, D. , Keper, E. , Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation" , Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Säugetierzellen mit einem Säugetier-Expressionsvektor exprimiert. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft von viralen regulatorischen Elementen bereitgestellt. Gemeinhin verwendete Promotoren stammen bspw. aus Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalievirus und Si ian Virus 40. Weitere geeignete Ex- pressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. , Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp bewirken (bspw. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nuklein- säure verwendet) . Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht-einschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), lymphoid-spezifische Promotoren (Ca.lame und Eaton (1988) Adv. Im- munol. 43:235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren
(Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) und Immunglobuli- nen (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen und Baltimore
(1983) Cell 33:741-748), neuronenspezifische Promotoren (bspw. der Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al.,
(1985) Science 230:912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren (bspw. Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4 873 316 und europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264 166) . Entwicklungs- regulierte Promotoren sind ebenfalls umfaßt, bspw. die Maus-hox- Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249:374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Ca pes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546) .
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in Anti- sense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. D.h. daß das DNA-Molekül derart mit einer regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden ist, daß die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls , das zur RRP-mRNA antisense ist, möglich wird. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig an eine in Antisense-Richtung klo- nierte Nukleinsäure gebunden sind und die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, bspw. können virale Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisen- se-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt wird, in den der Vek- tor eingebracht wird. Für eine Diskussion der Regulation der Genexpression mittels Antisense-Genen siehe Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, daß diese Begriffe nicht nur eine be- stimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Zelle betreffen. Da in aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch im Umfang des Begriffs, wie er hier verwendet wird, noch umfaßt.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Bspw. kann ein RRP-Protein in Bakterienzellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie Ovarzel- len des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig. Mikroorganismen, die mit Corynebacterium glutamicum verwandt sind und sich geeignet als Wirtszellen für die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwenden lassen, sind in Tabelle 3 aufgeführt .
Durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionsverfahren läßt sich Vektor-DNA in prokaryotische oder eukaryotische Zellen einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", "Konjugation" und "Transduktion", wie sie hier verwendet werden, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (bspw. DNA) in eine Wirtszelle umfassen, einschließlich natürlicher Kompetenz, chemisch vermittelter Übertragung, Calciumphosphat- oder Calciumchlorid- Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofek- tion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen lassen sich nachlesen in Sam- brook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbücher .
Es ist bekannt, daß für die stabile Transfektion von Säugetierzellen je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Zur Identifizierung und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, die die Resistenz gegen Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotre- xat, verleihen. Eine Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der ein RRP-Protein codiert, oder kann auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können bspw. durch Medikamentenselektion identifiziert wer- den (z.B. überleben Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben) .
Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines RRP- Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um das RRP-Gen zu verändern, bspw. funktioneil zu disrumpieren. Dieses RRP-Gen ist vorzugsweise ein Corynebacterium glutamicun.-RRP-Gen, jedoch kann ein Ho ologon von einem verwandten Bakterium oder sogar aus einer Säugetier-, Hefeoder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor derart ausgestaltet, daß das endogene RRP-Gen bei homologer Rekombination funktioneil disrumpiert ist (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert; auch als "Knockout"-Vektor bezeichnet) . Der Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene RRP-Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen RRP-Proteins verändert wird.). Der veränderte Abschnitt des RRP-Gens ist im homologen Rekombinationsvektor an seinem 5'- und 3 '-Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des RRP-Gens flankiert, die eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen RRP-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen RRP-Gen in einem Mikroorganismus ermöglicht. Die zusätzliche flankierende RRP-Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend lang. Gewöhnlich enthält der Vektor weniger als eine Kilobase flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3 '-Ende) (siehe z.B. Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren) . Der Vektor wird in einen Mikroorganismus (z.B. durch Elektroporation) eingebracht, und Zellen, in denen das eingebrachte RRP-Gen mit dem endogenen RRP- Gen homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachge- biet bekannter Verfahren selektiert.
Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorganismen produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. Der Einschluß eines RRP-Gens in einen Vektor, wodurch es unter die Kontrolle des Lac-Operons gebracht wird, ermöglicht z.B. die Expression des RRP-Gens nur in Gegenwart von IPTG. Diese regulatorischen Systeme sind im Fachgebiet bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann zur Produktion (d.h. Expression) eines RRP-Proteins verwendet werden. Die Erfindung stellt zudem Verfahren zur Produktion von RRP-Proteinen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Anzucht der erfindungs- gemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein RRP-Protein codiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das ein Wildtyp- oder verändertes RRP-Protein codiert) in einem geeigneten Medium, bis das RRP-Protein produziert worden ist. Das Verfahren umfaßt in einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der RRP-Proteine aus dem Medium oder der Wirtszelle.
C . Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinho- mologa, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren nachstehenden Verfahren verwendet werden: Identifikation von C. glutamicum und verwandten Organismen, Kartierung von Genomen von Organismen, die mit C. glutamicum verwandt sind, Identifikation und Lokalisation von C. glutamicum-Se- quenzen von Interesse, EvolutionsStudien, Bestimmung von RRP-Pro- teinbereichen, die für die Funktion notwendig sind, Modulation der Aktivität eines RRP-Proteins; Modulation der Aktivität eines oder mehrerer Stoffwechselwege und Modulation der zellulären Produktion einer gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie. Die erfindungsgemäßen RRP-Nukleinsäuremoleküle haben eine Vielzahl von Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines Organismus als Corynebacterium glutamicum oder naher Verwandter davon verwendet werden. Sie können zudem zur Identifikation des Vorliegens von C. glutamicum oder eines Verwandten davon in einer Mischpopulation von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäuresequenzen einer Reihe von C. glutamicum-Genen bereit. Durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer einheitlichen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit ei- ner Sonde, die einen Bereich eines C. glutamicum-Gens überspannt, das für diesen Organismus einzigartig ist, kann man bestimmen, ob dieser Organismus zugegen ist. Corynebacterium glutamicum selbst ist zwar nicht pathogen, jedoch ist es mit pathogenen Arten, wie Corynebacterium diptheriae, verwandt. Der Nachweis eines solchen Organismus ist von signifikanter klinischer Bedeutung.
Zum Nachweis des Vorliegens von C. glutamicum in einer Probe können im Fachgebiet bekannte Techniken eingesetzt werden. Insbesondere können die Zellen in der Probe zunächst in einer geeigneten Flüssigkeit oder auf einem geeigneten festen Kulturmedium gezüchtet werden, um die Anzahl der Zellen in der Kultur zu vergrößern. Diese Zellen werden lysiert, und die gesamte enthaltene DNA wird extrahiert und gegebenenfalls gereinigt, um Zelltrümmer und Proteinmaterial zu entfernen, die die anschließende Analyse stören könnten. Polymerasekettenreaktion oder eine ähnliche, im Fachgebiet bekannte Technik wird durchgeführt (s. einen allgemeinen Überblick über Methodologien, die gewöhnlich zur Nukleinsäurese- quenz-Amplifikation verwendet werden in Mullis et al., U.S. -Patent Nr. 4683195, Mullis et al . , U.S.-Patent Nr. 4965188 und In- nis, M.A., und Gelfand, D.H. (1989) PCR-Protocols, A guide to Methods and Applications, Academic Press, S. 3-12, und (1988) Bio- technology 6:1197, und Internationale Patentanmeldung Nr.
W089/01050) , wobei Primer, die für ein erfindungsgemäßes RRP-Nu- kleinsäuremolekül spezifisch sind, mit der Nukleinsäureprobe inkubiert werden, so daß diese bestimmte RRP-Nukleinsäuresequenz, falls in der Probe vorhanden, amplifiziert wird. Die bestimmte, zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz wird auf der Basis ihres ausschließlichen Vorkommens im Genom von C. glutamicum und nur einiger nah verwandter Bakterien ausgewählt. Das Vorliegen des gewünschten Amplifikationsproduktes zeigt das Vorliegen von C. glutamicum oder eines mit C. glutamicum nah verwandten Organismus an.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können ferner als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken ist es mög- lieh, die physikalische Lokalisierung der erfindungsgemäßen RRP- Nukleinsäuremoleküle auf dem C. glutamicum-Genom nachzuweisen, was wiederum zur leichteren Lokalisierung anderer Nukleinsäuremoleküle und Gene auf der Karte verwendet werden kann. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem hinreichend homo- log zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so daß diese Nukleinsäuremoleküle ebenfalls die Konstruktion einer genomischen Karte in solchen Bakterien ( z.B. Brevibacterium lactofermentum) ermöglichen können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle eignen sich nicht nur zum Kartieren des Genoms, sondern auch für funk- tionelle Studien von C. glutamicum-Proteinen. Zur Identifikation des Genombereichs, an den ein bestimmtes C. gluta_τ.icu_r_-DNA-bin- dendes Protein bindet, kann das C. gIutamicu_n-Genom bspw. gespal- ten und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, vorzugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermög- licht die Lokalisation des Fragmentes auf der genomischen Karte von C. glutamicum, und wenn dies mehrmals mit unterschiedlichen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert es eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein bindet.
Die erfindungsgemäßen RRP-Nukleinsäuremoleküle eignen sich eben- falls für Evolutions- und Proteinstruktur-Untersuchungen. Die Stoffwechselprozesse, an denen die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden von einer Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ausgenutzt; durch Vergleich der Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen, die ähn- liehe Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der Evolu- tions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung, welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung solcher Bereiche des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der Bestimmung ist für Proteintechnologie-Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, wieviel Mutagenese das Protein tolerieren kann ohne die Funktion zu verlieren.
Die erfindungsgemäßen RRP-Proteine lassen sich als Marker zur Klassifizierung eines unbekannten Bakteriums als C. glutamicum oder zur Identifikation von C. glutamicum oder nahe verwandten Bakterien in einer Probe verwenden. Unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken können bspw. Zellen in einer Probe ge- gebenenfalls amplifiziert werden (z.B. durch Züchten in einem geeigneten Medium) , um die Probengröße zu erhöhen, und können dann lysiert werden, so daß die darin enthaltenen Proteine freigesetzt werden. Diese Probe kann gegebenenfalls gereinigt werden, um Zelltrümmer und Nukleinsäuremoleküle zu entfernen, die die an- schließende Analyse stören könnten. Antikörper, die für ein ausgewähltes erfindungsgemäßes RRP-Protein spezifisch sind, können mit der Proteinprobe in einem typischen Western-Test-Format inkubiert werden (s. z.B. Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) , wobei der Antikörper an sein Zielprotein bindet, wenn dieses Protein in der Probe vorliegt. Ein RRP-Protein wird für diesen Testtyp ausgewählt, wenn es für C. glutamicum oder C. glutamicum und sehr nahe verwandte Bakterien einzigartig oder fast einzigartig ist. Die Proteine in der Probe werden dann durch Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine geeignete Matrix, wie Nitrocellulose übertragen. Ein geeigneter Zweitantikörper mit einer nachweisbaren Markierung (z.B. chemilumineszierend oder colorimetrisch) wird mit der Matrix inkubiert, gefolgt von stringente Waschen. Das Vorliegen oder Fehlen der Markierung zeigt das Vorliegen oder Fehlen des Zielpro- teins in der Probe an. Ist das Protein zugegen, zeigt dies das Vorliegen von C. glutamicum an. Ein ähnliches Verfahren ermöglicht die klassifizierung eines unbekannten Bakteriums als C. glutamicum; wenn eine Reihe für C. glutamicum spezifischer Proteine nicht in den Proteinproben nachgewiesen wird, die von dem unbekannten Bakterium präpariert wurden, ist dieses Bakterium wahrscheinlich nicht C. glutamicum.
Die genetische Manipulation der erfindungsgemäßen RRP-Nukleinsäu- remoleküle kann die Produktion von RRP-Proteinen mit funktionel- len Unterschieden zu den Wildtyp-RRP-Proteinen bewirken. Diese Proteine können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität ver- bessert werden, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle zugegen sein oder können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität geschwächt sein.
Diese Änderungen der Aktivität können direkt die Ausbeute, Pro- duktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren. Beispielsweise kann man durch Modifikation der Aktivität eines Proteins, das an der Biosynthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt ist, (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) die Fähigkeit der Zelle, diese Verbindung zu synthetisieren oder abzubauen, direkt modulieren und dadurch die Ausbeute und/oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie modulieren. Ebenso kann man durch Modulation der Aktivität eines Proteins, das einen Feinchemikalien- Stoffwechselweg reguliert, direkt beeinflussen, ob die Produktion der gewünschten Verbindung hoch- oder herunterreguliert wird, was beides die Ausbeute oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie von der Zelle moduliert .
Die indirekte Modulation der Feinchemikalienproduktion kann auch durch Modifikation der Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) erfolgen, so daß die Fähigkeit der Zelle, zu wachsen und sich zu teilen oder lebensfähig und produktiv zu bleiben, insgesamt erhöht ist. Die Produktion von Feinchemikalien aus C. glutamicum wird gewöhnlich durch Fermentationskultur im Großmaßstab dieser Mikroorganismen erzielt, Bedingungen, die für das Wachstum und die Zellteilung häufig suboptimal sind. Durch Verändern eines erfindungsgemäßen Proteins (z.B. eines Streßreaktionsproteins, eines Zellwandproteins oder von Proteinen, die am Stoffwechsel von Verbindungen beteiligt sind, die für das Auftreten von Zellwachstum und -tei- lung nötig sind, wie Nukleotide und Aminosäuren) , so daß ein besseres Überleben, Wachsen und Vermehren in diesen Bedingungen möglich ist, kann es möglich sein, die Anzahl und die Produktivität dieser veränderten C. glutamicum-Zellen in Kultur im Großmaßstab zu steigern, was wiederum zu gesteigerten Ausbeuten und/oder zu gesteigerter Effizienz der Produktion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien führen sollte. Ferner sind die Stoff- wechselwege einer Zelle notwendigerweise voneinander abhängig und co-reguliert . Durch Ändern der Aktivität irgendeines Stoffwechselwegs in C. glutamicum (d.h. durch Ändern der Aktivität eines der erfindungsgemäßen Proteine, das an einem solchen Weg betei- ligt ist) ist es möglich, gleichzeitig die Aktivität oder Regulation eines anderen Stoffwechselwegs in diesem Mikroorganismus zu ändern, der direkt an der Synthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt sein kann.
Diese vorstehend genannten Mutagenesestrategien für RRP-Proteine, die erhöhte Ausbeuten einer Feinchemikalie aus C. glutamicum bewirken sollen, sollen nicht einschränkend sein; Variationen dieser Mutagenesestrategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Unter Verwendung dieser Strategien und einschließlich der hier offenbarten Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwendet werden, um C. glutamicum- oder verwandte Bakterienstämme, die mutierte RRP-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, zu erzeugen, so daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer ge- wünschten Verbindung verbessert wird. Die gewünschte Verbindung kann jedes von C. glutamicum hergestellte Produkt sein, einschließlich der Endprodukte von Biosynthesewegen und Zwischenprodukte natürlich vorkommender metabolischer Wege sowie Moleküle, die im Metabolismus von C. glutamicum nicht natürlich vorkommen, die jedoch von einem erfindungsgemäßen C. glutamicum-Stamm produziert werden.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als einschränkend aufgefaßt werden sollen. Die Inhalte sämtlicher, in dieser Patentanmeldung zitierter Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichter Patentanmeldungen sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1: Präparation der gesamten genomischen DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Eine Kultur von Corynejacteriuzπ glutamicum (ATCC 13032) wurde über Nacht bei 30°C unter starkem Schütteln in BHI-Medium (Difco) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 5ml Puffer I (5% des Ursprungsvolumens der Kultur - sämtliche angegebenen Vo- lumina sind für 100 ml Kulturvolumen berechnet) resuspendiert. Zusammensetzung von Puffer I: 140,34 g/1 Saccharose, 2,46 g/1 MgS04 • 7 H20, 10 ml/1 KH2P04-Lösung (lOOg/1, mit KOH auf pH-Wert 6,7 eingestellt), 50 ml/1 M12-Konzentrat (10 g/1 (NH4)2S04, 1 g/1 NaCl, 2 g/1 MgS04 • 7 H20, 0,2 g/1 CaCl2, 0,5 g/1 Hefe-Extrakt (Difco) , 10 ml/1 Spurenelemente-Mischung (200 mg/1 FeS04 • H20, 10 mg/1 ZnS04 • 7 H20, 3 mg/1 MnCl2 • 4 H20, 30 mg/1 H3B03, 20 mg/1 CoCl2 • 6 H20, 1 mg/1 NiCl2 • 6 H20, 3 mg/1 Na2Mo04 • 2 H20, 500 mg/1 Komplexbildner (EDTA oder Citronensäure) , 100 ml/1 Vitamingemisch (0,2 ml/1 Biotin, 0,2 mg/1 Folsäure, 20 mg/1 p-Aminobenzoesäure, 20 mg/1 Riboflavin, 40 mg/1 Ca-Panthothenat, 140 mg/1 Nikotinsäure, 40 mg/1 Pyridoxolhydrochlorid, 200 mg/1 Myo-Inositol) . Ly- sozym wurde in einer Endkonzentration von 2 , 5 mg/ml zur Suspension gegeben. Nach etwa 4 Std. Inkubation bei 37°C wurde die Zellwand abgebaut, und die erhaltenen Protoplasten wurden durch Zen- trifugation geerntet. Das Pellet wurde einmal mit 5 ml Puffer I und einmal mit 5 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8) gewaschen. Das Pellet wurde in 4 ml TE-Puffer resuspendiert, und 0,5 ml SDS-Lösung (10%) und 0,5 ml NaCl-Lösung (5 M) wurden zugegeben. Nach Zugabe von Proteinase K in einer Endkonzentration von 200 μg/ml wurde die Suspension etwa 18 Std. bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol, Pheno1-Chloro- form-Isoamylalkohol und Chlorofoirai-Isoamylalkohol mittels Standard-Verfahren gereinigt . Dann wurde die DNA durch Zugabe von 1/50 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol, anschließender Inkubation für 30 min bei -20°C und 30 min Zentrifugation bei 12000 U/min in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit einem SS34-Rotor (Sorvall) gefällt. Die DNA wurde in 1 ml TE-Puffer gelöst, der 20 μg/ml RNase A enthielt, und für mindestens 3 Std. bei 4°C gegen 1000 ml TE-Puffer dialysiert. Während dieser Zeit wurde der Puffer 3mal ausgetauscht . Zu Aliquots von 0 , 4 ml der dialysierten DNA-Lösung wurden 0,4 ml 2 M LiCl und 0, 8 ml Ethanol zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei -20°C wurde die DNA durch Zentrifugation gesammelt (13000 U/min, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Deutschland) . Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer gelöst. Durch dieses Verfahren hergestellte DNA konnte für alle Zwecke verwendet werden, einschließlich Southern-Blotting oder zur Kon- struktion genomischer Banken.
Beispiel 2: Konstruktion genomischer Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) -Banken in Escherichia coli
Ausgehend von DNA, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, wurden gemäß bekannter und gut eingeführter Verfahren (siehe bspw. Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" . Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al . (1994) "Current Protocols in Molecular Bio- logy", John Wiley & Sons) Cosmid- und Plasmid-Banken hergestellt. Es ließ sich jedes Plasmid oder Cosmid einsetzen. Besondere Verwendung fanden die Plasmide pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl Acad. Sei. USA, 75:3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134:1141-1156); Plasmide der pBS-Reihe (pBSSK+, pBSSK- und andere; Stratagene, LaJolla, USA) oder Cosmide, wie SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) oder Lorist6 (Gibson, T.J. Rosenthal, A. , und Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286.
Beispiel 3 : DNA-Sequenzierung und Computer-Funktionsanalyse
Genomische Banken, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zur DNA- Sequenzierung gemäß Standard-Verfahren, insbesondere dem Kettenabbruchverfahren mit ABI377-Sequenziermaschinen (s. z.B. Flei- schman, R.D. et al . (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd. , Science 269:496-512) verwendet. Die Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen wurden verwendet: 5 ' -GGAAACAGTATGACCATG-3 ' oder 5 ' -GTAAAACGACGGCCAGT-3 ' .
Beispiel 4 : In-vivo-Mutagenese
In vivo-Mutagenese von Corynebacterium glutamicum kann durchgeführt werden, indem eine Plasmid- (oder andere Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae) geschleust wird, die die Integrität ihrer genetischen Information nicht aufrechterhalten können. Übliche Mutatorstämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-ReparaturSystem auf (z.B., mutHLS, mutD, mutT, usw., zum Ver- gleich siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Esche- richia coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington) . Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist bspw. in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34 veranschaulicht .
Beispiel 5 : DNA-Transfer zwischen Escherichia coli und CoryneJbaσ- terium glutamicum
Mehrere Corynebacterium- und Brevi-acterium-Arten enthalten endo- gene Plasmide (wie bspw. pHM1519 oder pBLl) die autonom replizieren (für einen Überblick siehe bspw. Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5:137-146). Shuttle-Vektoren für Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum lassen sich leicht mittels Standard-Vektoren für E. coli konstruieren (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons), denen ein Replikationsursprung für und ein geeigneter Marker aus Corynebacterium glutamicum beigegeben wird. Solche Replikationsursprünge werden vorzugsweise von endogenen Plasmiden entnommen, die aus Corynebacterium- und Brevibactertium-Arten isoliert worden sind. Besondere Verwendung als Transformationsmarker für diese Arten sind Gene für Kanamycin-Resistenz (wie solche, die vom Tn5- oder Tn-903-Transposon stammen) oder für Chloramphenicol (Winnacker, E.L. (1987) "Fro Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim) . Es gibt zahlreiche Beispiele in der Litera- tur für die Herstellung einer großen Vielzahl von Shuttle-Vektoren, die in E. coli und C. glutamicum replizieren und für verschiedene Zwecke verwendet werden können, einschließlich Gen- Überexpression (siehe bspw. Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162:591-597, Martin, J.F. et al., (1987) Biotechnology, 5:137-146 und Eikmanns, B.J. et al. (1992) Gene 102:93-98) .
Mittels Standard-Verfahren ist es möglich, ein Gen von Interesse in einen der vorstehend beschriebenen Shuttle-Vektoren zu klonie- ren und solche Hybrid-Vektoren in Corynebacterium glutamicum- Stämme einzubringen. Die Transformation von C. glutamicum läßt sich durch Protoplastentransformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159:306-311), Elektroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53:399-303) und in Fällen, bei denen spezielle Vektoren verwendet werden, auch durch Konjugation erzielen (wie z.B. beschrieben in Schäfer, A. , et (1990) J. Bacteriol. 172:1663-1666). Es ist ebenfalls möglich, die Shuttle-Vektoren für C. glutamicum auf E. coli zu übertragen, indem Plas id-DNA aus C. glutamicum (mittels im Fachgebiet bekann- ter Standard-Verfahren) präpariert und in E. coli transformiert wird. Dieser Transformationsschritt kann mit Standard-Verfahren erfolgen, jedoch wird vorteilhafterweise ein Mcr-defizienter E. coli-Sta m verwendet, wie NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166:1-19) .
Beispiel 6 : Bestimmung der Expression des mutanten Proteins
Die Beobachtungen der Aktivität eines mutierten Proteins in einer transformierten Wirtszelle beruhen auf der Tatsache, daß das mu- tante Protein auf ähnliche Weise und in ähnlicher Menge exprimiert wird wie das Wildtyp-Protein. Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Transkriptionsmenge des mutanten Gens (ein Anzeichen für die mRNA-Menge, die für die Translation des Genprodukts verfügbar ist) ist die Durchführung eines Northern-Blots (s. bspw. Ausubel et al . , (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) , wobei ein Primer, der so ausgestaltet ist, daß er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweis- baren (gewöhnlich radioaktiven oder chemilumineszierenden) Markierung versehen wird, so daß - wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix übertragen und mit dieser Sonde inkubiert wird - die Bindung und die Quantität der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der RNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information ist ein Hinweis auf das Ausmaß der Transkription des mutanten Gens . Gesamt-Zell-RNA läßt sich durch verschiedene Verfahren aus Corynebacterium glutamicum isolieren, die im Fachge- biet bekannt sind, wie in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Mi- crobiol. 6:317-326 beschrieben.
Zur Bestimmung des Vorliegens oder der relativen Menge an Protein, das von dieser mRNA translatiert wird, können Standard- Techniken, wie Western-Blot, eingesetzt werden (s. bspw. Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York) . Bei diesem Verfahren werden Gesamt-Zellproteine extrahiert, durch Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrocellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Anti- körper, die an das gewünschte Protein spezifisch bindet, inkubiert, . Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszierenden oder colorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen läßt. Das Vorliegen und die beobachtete Menge an Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gesuchten Mutanten- proteins in der Zelle an.
Beispiel 7 : Wachstum von genetisch verändertem Corynebacterium glutamicum - Medien und Anzuchtbedingungen
Genetisch veränderte Corynebakterien werden in synthetischen oder natürlichen Wachstumsmedien gezüchtet. Eine Anzahl unterschiedlicher Wachstumsmedien für Corynebakterian sind bekannt und leicht erhältlich (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:205-210; von der Osten et al . (1998) Biotechnology Letters 11:11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus
Corynebacterium", in: The Procaryotes, Bd. II, Balows, A. , et al., Hrsg. Springer-Verlag). Diese Medien bestehen aus einer oder mehreren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen, Vitaminen und Spurenelementen. Bevorzugte Kohlenstoff- quellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind bspw. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Alkohole und organi- sehe Säuren, wie Methanol, Ethanol, Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische StickstoffVerbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie NH4C1 oder (NH4) S04, NH4OH, Nitrate,
Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geei- gnete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure. Die Medien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bspw. Biotin, Ribofla- vin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Me- dienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Micro- biol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls ge- trennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Anzuchtbedingungen werden für jedes Experiment gesondert de- finiert. Die Temperatur sollte zwischen 15°C und 45°C liegen und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen, und kann durch Zugabe von Puffern zu den Medien aufrechterhalten werden. Ein beispielhafter Puffer für diesen Zweck ist ein Kaliumphosphatpuffer. Synthetische Puffer, wie MOPS, HEPES; ACES usw., können alternativ oder gleichzeitig verwendet werden. Der Anzucht-pH-Wert läßt sich während der An- zucht auch durch Zugabe von NaOH oder NH4OH konstant halten. Werden komplexe Medienkomponenten, wie Hefe-Extrakt, verwendet, sinkt der Bedarf an zusätzlichen Puffern, da viele komplexe Verbindungen eine hohe Pufferkapazität aufweisen. Beim Einsatz eines Fermenters für die Anzucht von Mikroorganismen kann der pH-Wert auch mit gasförmigem Ammoniak reguliert- werden.
Die Inkubationsdauer liegt gewöhnlich in einem Bereich von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen. Diese Zeit wird so ausgewählt, daß sich die maximale Menge Produkt in der Brühe ansammelt . Die offenbarten Wachstumsexperimente können in einer Vielzahl von Behältern, wie Mikrotiterplatten, Glasröhrchen, Glaskolben oder Glas- oder Metallfermentern unterschiedlicher Größen durchgeführt werden. Zum Screening einer großen Anzahl von Klonen sollten die Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, Glasröhrchen oder Schüttelkolben entweder mit oder ohne Schikanen, gezüchtet werden. Vorzugsweise werden 100-ml-Schüttelkolben verwendet, die mit 10% (bezogen auf das Volumen) des erforderlichen Wachstumsmediums gefüllt sind. Die Kolben sollten auf einem Kreiselschüttler (Ampli- tude 25 mm) mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 100-300 U/ min geschüttelt werden. Verdampfungsverluste können durch Aufrechterhalten einer feuchten Atmosphäre verringert werden; alternativ sollte für die Verdampfungsverluste eine mathematische Korrektur durchgeführt werden.
Werden genetisch modifizierte Klone untersucht, sollte auch ein unmodifizierter Kontrollklon oder ein Kontrollklon getestet werden, der das Basisplasmid ohne Insertion enthält. Das Medium wird auf eine ODgoo von 0,5 - 1,5 angeimpft, wobei Zellen verwendet werden, die auf Agarplatten, wie CM-Platten (10 g/1 Glucose, 2,5 g/1 NaCl, 2 g/1 Harnstoff, 10 g/1 Polypepton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 Fleischextrakt, 22 g/1 Agar pH-Wert 6,8 mit 2 M NaOH), die bei 30°C inkubiert worden sind, gezüchtet wurden. Das Animpfen der Medien erfolgt entweder durch Einbringen einer Kochsalzlösung von C. glutamicum-Zellen von CM-Platten oder durch Zugabe einer flüssigen Vorkultur dieses Bakteriums.
Beispiel 8 : In-vitro-Analyse der Funktion mutanter Proteine
Die Bestimmung der Aktivitäten und kinetischen Parameter von Enzymen ist im Fachgebiet gut bekannt. Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms müssen an die spezifische Aktivität des Wildtypenzyms angepaßt werden, was innerhalb der Fähigkeiten des Fachmann liegt. Überblicke über En- zyme im allgemeinen sowie spezifische Einzelheiten, die die
Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können bspw. in den nachstehenden Literaturstellen gefunden werden: Di- xon, M. , und Webb, E.C: (1979) Enzy es, Longmans, London; Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York; Walsh (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology.
Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D: Hrsg. (1983) The Enzymes, 3. Aufl., Academic Press, New York; Bisswanger, H. (1994) Enzymkinetik, 2. Aufl. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graßl, M. Hrsg. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3. Aufl. Bd. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Bd. A9, "Enzymes", VCH, Weinheim, S. 352-363.
Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann durch viele gut eingeführte Verfahren gemessen werden, wie DNA-Banden-Shift- Assays (die auch als Gelretardations-Assays bezeichnet werden) . Die Wirkung dieser Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann mit Reportergen-Assays (wie in Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14:3895-3904 und den darin zitierten Literaturstellen be- schrieben) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme sind wohlbekannt und für Anwendungen in pro- und eukaryotischen Zellen etabliert, wobei Enzyme, wie beta-Galactosidase, Grün-Fluoreszenz- Protein und mehrere andere verwendet werden.
Die Bestimmung der Aktivität von Membran-Transportproteinen kann gemäß Techniken, wie sie in Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Func- tion, Springer: Heidelberg, S. 85-137; 199-234; und 270-322 beschrieben sind, erfolgen.
Beispiel 9 : Analyse des Einflusses von mutiertem Protein auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Wirkung der genetischen Modifikation in C. glutamicum auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Aminosäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten bezüglich der erhöhten Produktion des gewünschten Produktes (d.h. einer Aminosäure) untersucht wird/werden. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzyma- tische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (s. bspw. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. , et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification" , S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. und Cabral, J.M.S. (1992)
Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in Ulimann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separa- tion and purification techniques in biotechnology, Noyes Publica- tions) .
Zusätzlich zur Messung des Fermentationsendproduktes ist es ebenfalls möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analy- sieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamt-Effizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (bspw. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Io- nen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion gemeinsamer Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Mi- crobial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsg. IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und den darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Beispiel 10: Reinigung des gewünschten Produktes aus C. glutami- cum-Kultur
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus C. glutamicum-Zellen oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kultur kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung, lysiert werden. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Über- Standsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den C. glutamicum-Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten. Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, 5 oder die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung 10 für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
15 Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, und das vorhergehende Reinigungsverfahren soll nicht einschränkend sein. Diese Reinigungstechniken sind bspw. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986) .
20
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS,
25 Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27,
30 VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566,
575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd.
35 17.
Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann - indem er lediglich Routinever- 40 fahren verwendet - viele Äquivalente der erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen. Diese Äquivalente sollen von den nachstehenden Patentansprüchen umfaßt sein.
Die Angaben in Tabelle 1 sind folgendermassen zu verstehen: In Spalte 1"DNA-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "5" in der Spalte "DNA-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 5.
In Spalte 2"AS-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "6" in der Spalte "AS-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 6.
In Spalte 3"Identifikation" wird eine eindeutige interne Bezeich- nung für jede Sequenz aufgeführt.
In Spalte 4 "AS-POS" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die Aminosäureposition der Polypeptidsequenz "AS-ID" in der gleichen Zeile. Eine "26" in der Spalte "AS-POS" bedeutet demzufolge die Aminosäureposition 26 der entsprechend angegebenen Polypeptidsequenz. Die Zählung der Position beginnt N-Terminal bei +1.
In Spalte 5 "AS-Wildtyp" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Wildtyp-Stamm.
In Spalte 6 "AS-Mutante" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Mutanten-Stamm.
In Spalte 7 "Funktion" wird die physiologische Funktion der entsprechenden Polypeptidsequenz aufgeführt .
Ein-Buchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Aspartat
E Glutamat
F Pheny1alanin
G Glycin
H His
I Isoleucin
K Lysin
L Leucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Threonin V Valin
W Tryptophan
Y Tyrosin
Tabelle 1
Gene die für DNA-Replikations- und Pathogenese-Proteine codieren
DNA AS Identifikation: AS AS AS Funktion: ID: ID: Pos: Wildtyp utante
1 2 RXA00050 66 A V ATP-DEPENDENT RNA HELICASE DEAD
596 G S ATP-DEPENDENT RNA HELICASE DEAD
3 4 RXA00061 754 S N DNA POLYMERASE l (EC 2.7.7.7)
5 6 RXA00157 90 V I INVASIN 1
159 G R INVASIN 1
449 G D INVASIN 1
454 S F INVASIN 1
590 s F INVASIN 1
7 8 RXA00208 45 G E VULNIBACTIN UTILIZATION PROTEIN VIUB
61 D N VULNIBACTIN UTILIZATION PROTEIN VIUB
76 P L VULNIBACTIN UTILIZATION PROTEIN VIUB
9 10 RXA00313 69 E K 23S RRNA ETHYLTRANSFERASE (EC 2.1.1.-)
11 12 RXA00341 254 G D EXORIBONUCLEASE II (EC 3.1.13.1)
414 D G EXORIBONUCLEASE II (EC 3.1.13.1)
13 14 RXA00407 187 D H DNA POLYMERASE III, ALPHA CHAIN (EC 2.7.7.7)
15 16 RXA00694 34 A T SSU ribosomal protein S8P
18 RXA00696 66 T 1 LSU ribosomal protein L18P
20 RXA00807 62 G E DNA POLYMERASE III, DELTA' SUBUNIT (EC 2.7.7.7)
241 R C DNA POLYMERASE III, DELTA' SUBUNIT (EC 2.7.7.7)
22 RXA01238 156 S N DNA POLYMERASE III, ALPHA CHAIN (EC 2.7.7.7)
24 RXA01280 43 K R SSU ribosomal protein S12P
26 RXA01305 400 L F ADHESIN AIDA-I
545 S F ADHESIN AIDA-I
28 RXA01343 11 A V LSU ribosomal protein L1 P
30 RXA01480 297 G D DNA PRIMASE (EC 2.7.7.-)
32 RXA01563 117 P S RIBONUCLEASE D (EC 3.1.26.3)
375 R Q RIBONUCLEASE D (EC 3.1.26.3)
34 RXA01581 274 S F 23S RRNA METHYLTRANSFERASE (EC 2.1.1.-)
36 RXA01661 64 G D RRNA METHYLTRANSFERASE (EC 2.1.1.-)
38 RXA01683 130 R C DNA GYRASESUBUNITA (EC 5.99.1.3)
584 S F DNA GYRASE SUBUNITA (EC 5.99.1.3)
40 RXA01718 284 P S CBS domain containing protein
42 RXA01736 236 P S PUTATIVE ATP-DEPENDENT DNA HELICASE
44 RXA01770 243 D N DNA HELICASE II (EC 3.6.1.-)
46 RXA01772 502 S F Superfamiiy II DNA and RNA helicase
48 RXA01949 97 S N LSU ribosomal protein L23P
50 RXA01966 46 A V OLIGORIBONUCLEASE (EC 3.1.-.-)
52 RXA02070 150 A T MRP PROTEIN HOMOLOG
54 RXA02082 726 A V CHROMOSOME SEGREGATION PROTEIN SMC2
781 L F CHROMOSOME SEGREGATION PROTEIN SMC2
905 A T CHROMOSOME SEGREGATION PROTEIN SMC2
56 RXA02145 321 P L MENAQUINOL-CYTOCHROME C REDUCTASE CYTOCHROME B SUBUNIT
58 RXA02293 349 A V ATP-DEPENDENT HELICASE HRPB
60 RXA02357 896 G E PROBABLE ATP-DEPENDENT HELICASE LHR (EC 3.6.1.-) 1414 T I PROBABLE ATP-DEPENDENT HELICASE LHR (EC 3.6.1.-)
62 RXA02363 728 V M ATP-dependent helicase
64 RXA02533 142 R C TRANSCRIPTIONAL REGULATORY PROTEIN
66 RXA02657 840 H Y PROBABLE DNA POLYMERASE III, ALPHA CHAIN (EC 2.7.7.7)
1161 D N PROBABLE DNA POLYMERASE III, ALPHA CHAIN (EC 2.7.7.7)
68 RXA03166 1183 P L ATP-DEPENDENT HELICASE HRPA
70 RXA03266 103 T I DNA POLYMERASE III, BETA CHAIN (EC 2.7.7.7)
364 P L DNA POLYMERASE III, BETA CHAIN (EC 2.7.7.7)
72 RXA03332 52 G E phage Hau3 resistance protein
74 RXA03341 153 E K DNA-BINDING PROTEIN
76 RXA03590 398 P s virulence-associated protein E
78 RXA03607 176 R K Hypothetical phage protein
80 RXA03743 157 S F DNA TOPOISOMERASE I (EC 5.99.1.2)
82 RXA03903 811 E K DNA TOPOISOMERASE I (EC 5.99.1.2)
84 RXA04194 922 R c ATP-DEPENDENT DNA HELICASE
86 RXA07017 574 P s DNA POLYMERASE III SUBUNITS GAMMA AND TAU (EC 2.7.7.7)
88 RXA07018 1245 L F DNA-DIRECTED RNA POLYMERASE BETA' CHAIN (EC 2.7.7.6)
90 RXA07019 55 G s LSU ribosomal protein L2P
91 92 RXA07020 314 R S PHENYLALANYL-TRNA SYNTHETASE ALPHA CHAIN (EC 6.1.1.20)
93 94 RXA07027 256 G D PHAGE INFECTION PROTEIN
95 96 RXA07028 27 E K TYPE II RESTRICTION-MODIFICATION SYSTEM RESTRICTION SUBUNIT
310 A V TYPE II RESTRICTION-MODIFICATION SYSTEM RESTRICTION SUBUNIT

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül codierend für ein Polypeptid mit der jeweils in Tabellel/Spalte2 in Bezug genommenen Aminosäuresequenz wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Ta- bellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition eine andere proteinogene Aminosäure codiert als die jeweilige in Tabelle 1/Spalte 5 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure.
2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Tabelle 1/Spalte 4 angegebenenen Aminosäureposition die in Tabelle 1/Spalte 6 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure codiert.
3. Ein Vektor, der wenigstens eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 enthält .
4. Eine Wirtszelle, die mit wenigstens einem Vektor nach An- spruch 3 transfiziert ist.
5. Eine Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls zur Modulation der Produktion einer Feinchemikalie aus besagter Zelle führt .
6. Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie welches die Kultivierung einer Zelle beinhaltet, die mit wenigstens einen Vektor nach Anspruch 3 transfiziert worden ist, so dass die Feinchemikalie produziert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Feinchemikalie eine Aminosäure ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure Lysin ist .
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