EP1438330A2 - Leurres peptidiques pour la preparation de medicaments destines a la prevention ou au traitement des pathologies auto-immunes, ou des troubles lies a l'apparition d'anticorps diriges contre des proteines exogenes - Google Patents

Leurres peptidiques pour la preparation de medicaments destines a la prevention ou au traitement des pathologies auto-immunes, ou des troubles lies a l'apparition d'anticorps diriges contre des proteines exogenes

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EP1438330A2
EP1438330A2 EP20020802664 EP02802664A EP1438330A2 EP 1438330 A2 EP1438330 A2 EP 1438330A2 EP 20020802664 EP20020802664 EP 20020802664 EP 02802664 A EP02802664 A EP 02802664A EP 1438330 A2 EP1438330 A2 EP 1438330A2
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EP
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seq
lures
peptide
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mimotopic
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Claude Granier
Sylvie Villard
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock

Definitions

  • the subject of the invention is peptide lures of pathogenic antibodies for the preparation of medicaments intended for the prevention or treatment of autoimmune pathologies, or disorders linked to the appearance of antibodies directed against exogenous recombinant or non-recombinant proteins. used in the context of the treatment of these autoimmune pathologies or pathologies requiring the administration to patients of said exogenous proteins.
  • Hemophilia A is a (severe) pathology due to the absence or insufficiency of functional Vin factor (FN ⁇ i).
  • the coagulation capacity is restored in patients by the administration of concentrates of recombinant factor VIII or derived from plasmas.
  • the antibody response has the effect of inhibiting the procoagulant activity of the administered FNm and thus seriously complicating the treatment of these hemophiliacs.
  • Antibodies are known to have a specialized molecular structure, called a paratope, which allows them to perform an important biological function: recognition of the antigen.
  • the paratope of the antibody is able to recognize not only a limited part (called “epitope") of the antigen which was at the origin of its selection, but also smaller fragments of this antigen, in particular peptides corresponding to the epitope (called “epitopic peptides”), peptides having modifications of sequence or chemical structure compared to the epitope (called “epitope variants”) or molecules having no homology sequence with the antigen (called “mimotopes”).
  • the antibody response against FVm is polyclonal and heterogeneous in its specificity [Gilles et al, 1993, Blood, 2452-61] but it has been observed that the regions recognized by the inhibitory antibodies (epitopes) are restricted to a few main areas of the Vin factor molecule.
  • the A2 domain and the C2 domain were initially identified by immunoblotting methods using proteolytic fragments of FVII [Fulcher et al., 1985, PNAS USA 82, 7728-32] and subsequently confirmed when the nucleotide sequence of FVm has been determined (Vehar et al, 1984, Nature 312, 337-342; Gitschier et al., 1984, Nature 312, 326-336) and prepared recombinant fragments [Scandella et al., 1988, PNAS 86 (4), 1387; Scandella et al., 1989, Blood 74, 1618-26].
  • the epitope of a murine monoclonal inhibitor antibody could be restricted to a sequence of 25 amino acids from the A2 region (residues 484-508) thanks to the clever use of hybrids between the
  • the present invention follows from the demonstration by the Inventors, that peptides or pseudopeptides corresponding to variants of epitopes or to mimotopes, are capable of binding in the site of anti-FVIII antibodies, by preventing their binding to factor Vin, and thus reducing the anti-coagulant activity of this antibody.
  • the object of the present invention is to provide new means for combating antibodies present in the body in the context of autoimmune pathologies, or pathologies requiring the administration of proteins to patients, making it possible to considerably limit the cost of therapeutics. in this area, with an efficiency comparable to or even superior to current treatment methods.
  • the subject of the present invention is the use of peptide or pseudopeptide lures which bind to antibodies capable of developing against endogenous proteins in the context of autoimmune pathologies or against exogenous proteins administered to patients, in particular in the context of pathologies due to a deficiency in these proteins, the amino acid sequence of said peptide or pseudopeptide lures differing from that of the epitopes recognized by said antibodies, for the preparation of medicaments intended for the prevention or treatment of said autoimmune pathologies, or for the prevention or in the treatment of disorders linked to the appearance of antibodies directed against said exogenous proteins.
  • a more particular subject of the invention is the aforementioned use of peptide or pseudopeptide lures defined above, comprising between approximately 6 and approximately 20 natural or unnatural amino acids (and preferably between approximately 8 and approximately 16 of these amino acids), said lures being selected for their ability to:
  • the antibodies preferentially recognize the peptide or pseudopeptide decoys than the endogenous or exogenous proteins mentioned above.
  • the invention also relates to the abovementioned use, of lures as defined above, for the preparation of medicaments intended for prevention or treatment:
  • a more particular subject of the invention is the use of lures as defined above, for the preparation of medicaments intended for the prevention or treatment of disorders linked to the appearance of antibodies against the e ⁇ dogenic factor VIE, or against exogenous factor Vin or derivatives, recombinant or not, administered in the context of hemophilia A.
  • the invention also relates to the aforementioned use of peptide lures defined above, as obtained from vectors expressing libraries of peptides.
  • the invention more particularly relates to the aforementioned use of decoys having no homology, or even a weak homology of between approximately 10% and approximately 30%, with the epitopes of said proteins recognized by said antibodies, said decoys still being designated mimotopic lures.
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of mimotopic decoys of factor VIE.
  • a more particular subject of the invention is the aforementioned use of mimotopic decoys of factor VIE of formula (I) below:
  • ni and n2 independently of one another represents 0 or 1,
  • - X a represents a chain of 8 to 10 amino acids, natural or not.
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of mimotopic lures defined above of formula (I) in which:
  • - X] is chosen from Y, E, Q, S, R, A, K, N, or T,
  • - X 2 is chosen from R, T, H, G, S, L, V, P, F, D, K, A, Q or I.
  • a more particular subject of the invention is the aforementioned use of mimotopic lures defined above of formula (I) in which X a represents the following sequence: NPS I GDKN SEQ ID NO: l
  • the invention also more particularly relates to the aforementioned use of the mimotopic lure of the following formula:
  • the invention also relates to the aforementioned use of mimotopic decoys of formula (I) in which X a represents the sequence of following formula:
  • - n3 represents 0 or 1
  • - X 6 represents a hydrophobic amino acid.
  • a more particular subject of the invention is the aforementioned use of mimotopic lures defined above of formula (I), characterized in that:
  • - X 3 is chosen from I, Q, R, T, or K,
  • - X 4 is chosen from V, T, L, I, M, F, W, or Y,
  • - X 5 is chosen from F, or Y,
  • - X 6 is chosen from A, M, Y, P, T, or V,
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of mimotopic lures defined above of the following formulas:
  • nl2 and nl3 independently of one another represent 0 or 1,
  • - X to X 1 represent any amino acid
  • a more particular subject of the invention is the aforementioned use of mimotopic lures defined above of formula (I), characterized in that:
  • - X is chosen from H, S, T, M, Q, or G,
  • - X 8 is chosen from T, A, K, R, Q, or E,
  • - X is chosen from S, A, H, F, N, G, or T,
  • - X 10 is chosen from R, K, L, S, H, T, I, or A,
  • - X ⁇ is chosen from S, T, V, K, R, Y, M, or D,
  • - X 12 is chosen from S, R, or L,
  • - X 13 is chosen from I, H, or W.
  • the invention more particularly relates to the aforementioned use of mimotopic lures defined above of formula (I) chosen from those of the following formulas:
  • a more particular subject of the invention is also the above-mentioned use of the mimotopic lure of the following formula:
  • the subject of the invention is also the aforementioned use of mimotopic lures of the following formula:
  • nl4 and nl9 independently of one another represent 0 or 1,
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of mimotopic lures defined above of formula (I), characterized in that:
  • the invention more particularly relates to the aforementioned use of mimotopic lures defined above of formula (I) chosen from those of the following formulas:
  • the invention also relates to the aforementioned use of peptide lures corresponding to recognition epitopes by the antibodies present in said proteins, the peptide sequence of which is modified by deletion, substitution, or addition of at least one amino acid, said lures being designated epitopic variants.
  • the invention more particularly relates to the aforementioned use of epitopic variants of factor VIE.
  • a more particular subject of the invention is also the aforementioned use of epitopic variants of factor VIE of formula (E) below:
  • Xi to X 5 represent any amino acid. with the exception of the peptide of formula DDDLTDSEMDVVRFD (SEQ ID NO: 36).
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of epitopic variants defined above of formula (E), characterized in that: Xi represents D or A,
  • the invention more particularly relates to the aforementioned use of epitopic variants defined above of the following formulas:
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition characterized in that it comprises decoys as defined above, in association with pharmaceutically acceptable vehicles.
  • the pharmaceutical compositions of the invention are in forms capable of being administered parenterally, or orally.
  • the dosage of said pharmaceutical compositions is such that it is between approximately 1 and approximately 5 mg / kg / d of compounds of formula (I) or (E) defined above.
  • the invention also relates to the peptide sequences of formula (I) as defined.
  • a subject of the invention is also the peptide sequences of formula (E) as defined above.
  • the invention also relates to products comprising:
  • a subject of the invention is also the pseudopeptides derived from the peptide sequences of formula (I) and (E) defined above, in particular the pseudopeptides obtained by conversion of one or more, or even all of the peptides of said peptide sequences into an acid. amino D, which leads to a pseudopeptide largely more resistant to proteolysis than the initial peptide [Kramer et al., 1998, Protein Eng 11, 941-8].
  • the desired polypeptide is synthesized from an insoluble support such as a benzhydrylamine or chloromethylated resin (derived from a crosslinked polystyrene, and available from suppliers in chemical products).
  • an insoluble support such as a benzhydrylamine or chloromethylated resin (derived from a crosslinked polystyrene, and available from suppliers in chemical products).
  • the amino acid at the C-terminal of the polypeptide to be synthesized, the ⁇ nitrogen and the reactive sites of which are protected by protective groups, is attached to the resin using widely used coupling techniques.
  • the protective group for the amine function is deprotected (leaving the other protective groups, if they exist, intact) so that the next amino acid in the sequence (which also has suitable protective groups) is attached and so on.
  • Suitable protective groups fluorenyl methyloxy carbonyl for alpha amino, beta or gamma tertio butyl ester groups for aspartic and glutamic acids, tertio butyl oxy carbonyl for lysine and tryptophan, trityl for cysteine, asparagine, glutamine and histidine, tertio butyl for serine and threonine, 2,2,4,6,7-pentadihydrobenzo furan for arginine.
  • the lengthening of the peptide chain is carried out by successive additions of amino acids from the C-terminal to the N-terminal by esterification reaction.
  • the amino functions of the residues used are temporarily protected during coupling by a labile group (a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl or Fmoc group) which is eliminated in basic medium.
  • the reactive side chains are blocked by a stable group during the synthesis phase, and deprotected at the end of assembly.
  • a synthesis cycle takes place in 4 stages: firstly, the formation of a peptic bond between the NH 2 of an amino acid already deposited with the COOH of the following amino acid, which is previously activated by N-hydroxybenzotriazole and N, N diisopropylcarbodiimide.
  • the unreacted free NH 2 functions are acetylated to avoid the formation of truncated peptides.
  • the protective Fmoc group of the new amino acid is eliminated in basic medium by piperidine.
  • the amino functions thus obtained are identified by bromophenol blue. This cycle is repeated as many times as necessary.
  • the Peptides that remain covalently attached to the membrane are analyzed by an indirect colorimetric immunoassay.
  • the reactivity of the peptides is evaluated by immersion of the membrane in a solution of inhibitor antibody to be tested, generally used at a concentration of 0.1-1 ⁇ g / ml. After washing, the peptide-antibody interaction is revealed by incubation of an anti-Fc antibody labeled with alkaline phosphatase used at 1: 1000 (Sigma), which in the presence of its substrate (BCEP-MTT-MgCl 2 Sigma) gives a blue precipitate at the level of the peptides which have fixed the antibody to be tested. The membranes are then regenerated to remove the blue precipitate and the bound antibody for further testing.
  • Peptide ligands can be easily obtained by their ability to bind to an antibody using the phage-display technique (Smith, GP (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface, Science. 228, 1315-7), based on the presentation of random peptides on the surface of filamentous phages. These peptides can be exposed either on the surface of the phage pIE protein (maximum number 5 copies) or on the surface of the pVEI protein (maximum number 2700 copies). These peptides, of very varied size (from 6AA to 30AA) can be either linear or constrained by a sulfur bridge.
  • the biopanning technique is carried out according to the protocol described by Smith et al. above. Three selection and amplification rounds are carried out, in parallel for the pIE and pVEI banks. For each selection cycle, the various antico ⁇ s inhibitors, at a concentration of 1-5 ug / ml for the first 2 rounds, 0.1-0.5 mcg / ml for the 3 rd round, in carbonate buffer (NaHCO 3, 100 mM, pH 8.6), are adsorbed on a 10x1.5 cm Petri dish (Falcon 1029) overnight at 4 ° C with stirring.
  • carbonate buffer NaHCO 3, 100 mM, pH 8.6
  • TBS-T Tris Buffered Saline: NaCl 1.37 M / KC1 26.8 mM / Tris base 0.5 M-Tween 20 0.05% / pH 7
  • non-sites specific are saturated for 2 h at 37 ° C with a solution of TBS-T 0.1% -BSA 3% previously filtered.
  • 2.10 11 TU (transduction units) of each primary bank ie 100 times the diversity of each bank, or of phage eluate from the round previous selection are incubated overnight at 4 ° C under agitation.
  • the phages not retained are eliminated by 10 washes of 2 min with 0.5% TBS-T followed by 5 washes of 2 min with 0.05% TBS-T.
  • the phages selected are then eluted either by an acid elution (3 ml of 0.1 M HCl / glycine / BSA 1 mg ml previously filtered / pH 2.2, 30 min incubation at RT with shaking, then neutralization with 150 ⁇ l of Tris-HCl 2 M, pH 9) or by elution by competition with FVEI (ON incubation at 4 ° C).
  • the different eluates are then used to infect E.Coli K91 cells for amplification.
  • This amplification takes place in 2 stages: firstly 5 ml of a bacterial suspension in the exponential growth phase (absorbance 1.8 at 550 nm) is added to each eluate. After an incubation of 10 min at 37 ° C without shaking, 93 ml of Luria-Bertani medium (LB) with 0.2 ⁇ g / ml of tetracycline (Te) (pVEI banks) or 0.75 ⁇ g / ml of kanamycin (Ka) (pIE banks) ) are added and incubated for 30 min at 37 ° C at 225 revolutions per minute ( ⁇ ra).
  • LB Luria-Bertani medium
  • Te pVEI banks
  • Ka kanamycin
  • the concentration is then adjusted to 20 ⁇ g / ml for the Te and to 75 ⁇ g / ml for the Ka, then the suspension is incubated at 37 ° C. at 225 ⁇ m overnight. These different bacterial suspensions are then centrifuged at 4 ° C at 4000 ⁇ ra for 25 min, then at 8000 ⁇ m for 12 min, in order to precipitate the bacteria. The supernatant containing the phages is taken up in poly (ethylene glycol) 8000 / 2.5 M NaCl at a rate of 15 ml per 100 ml of supernatant; precipitation occurs overnight at 4 ° C.
  • the pellet After centrifugation at 4 ° C at 8000 ⁇ m for 40 min, the pellet is taken up in 3 ml of 50 mM TBS / NaCl, and incubated at 37 ° C for 30 min at 150 ⁇ m. The content is transferred to 3 eppendorfs, centrifuged at 15,000 ⁇ m for 10 min at 4 ° C to remove cell debris, then transferred to sterile 1.5 ml vials and stored at -80 ° C.
  • the quantity of amplified phages is evaluated by titration, while the enrichment in affine phages is evaluated by ELISA.
  • 3 cloning stages made it possible to obtain isolated bacterial colonies on solid medium (LB-agar-Tc medium at 20 ⁇ g / ml or Ka at 75 ⁇ g / ml). The ability of the different clones to bind specifically to inhibitory antico ⁇ s is then tested by ELISA.
  • Linked phages are detected using a anti-M13 antibody coupled to peroxidase (Amersham Boehringer) diluted 1: 3000, incubated for 1 h at 37 ° C. After 5 washes, the peroxidase (OPD) substrate is added. The reaction takes place for 30 min in the dark and then an absorbance measurement is made at 450 nm. After stopping the reaction by adding 4N H 2 SO 4 , a new measurement is carried out at 490 nm.
  • peroxidase OPD
  • the different epitopes identified in Spot or the mimotopes determined by the phage display technique are then synthesized in the form of soluble synthetic peptides thanks to an Abimed AMS422 synthesizer based on Fmoc chemistry in the soluble phase (Gausepohl, H., Boulin, C, Kraft, M. & Frank, RW (1992) Automated multiple peptide synthesis, Pept Res. 5, 315-20).
  • the peptides are deprotected and cleaved from the resin by treatment with trifluoroacetic acid in the presence of suitable scavengers.
  • the peptides are then lyophilized, and their purity is evaluated by HPLC. If necessary, the peptides are purified in order to obtain more than 90% homogeneity in HPLC.
  • the FVEI is immobilized on the ON plate at 4 ° C.
  • the inhibitor antibody is preincubated with its epitopic peptide (s) in the ON range at 4 ° C. in PBS-T0.1% -milk 2%. After 1 h of saturation with PBS-T0.1% -milk 2%, the Ac-peptide mixtures are incubated with the immobilized FVEI for 2 h at 37 ° C. Between each of these incubations, 3 washes with PBS-T0.1% are carried out except after saturation.
  • the detection of the FVIE-Ac complex is obtained by a mouse or human anti-IgG coupled to peroxidase diluted to 1: 3000 incubated for 1 h at 37 ° C.
  • the inhibitory nature of an antico ⁇ s is expressed in Bethesda unit, which corresponds to the reciprocal concentration of antibodies to neutralize 50% of the coagulating activity of FV I.
  • the neutralizing effect of peptides will result in a return at the initial coagulation time obtained in the absence of an inhibitor.
  • the monoclonal anti-FVEI antibodies are diluted in a 0.05 M imidazole buffer, pH 7.3.
  • An equal volume of this preparation (250 ⁇ l) with normal plasma buffered in imidazole (0.1 M, pH 7.4) are mixed and incubated for 2 h at 37 ° C.
  • normal plasma buffered in imidazole is mixed with a non-specific antibody which constitutes the control.
  • the inhibitory activity of an antico ⁇ s is read from a semi-logarithmic graph representing the correlation between the residual activity of the FVEI and the inhibitory activity.
  • the inhibiting antibody used at a concentration so as to obtain 50% of residual FVEI is preincubated ON at 4 ° C. in imidazole buffer with increasing concentrations of peptides. This mixture is then treated as above.
  • ESH8 a mouse monoclonal antibody, hereinafter called ESH8, which exhibits a very high activity of neutralization of the procoagulant activity of FVEI (6300 Besthesda Unit / mg [Scandella et al., 1995, Blood 86, 1811-9]) .
  • This antico ⁇ s is a good representative of human antico ⁇ s binding to the C2 domain of the VIE factor, * a human monoclonal antibody 2C11 (Jacquemin et al., 1998, mentioned above),
  • F7B4 several mouse monoclonal antibodies, hereinafter called F7B4, F29F11, F14A12, F18B1, F19C2 and F21C1 which represent a model of human antibodies that bind to the acid region t of factor VIE for the first 3, and the acid region a 3 for the latter.
  • Peptide lures of the “mimotope” type were obtained by the technique of recombinant phage banks. The approach for selecting peptides from random sequence banks has been described [Smith et al., 1993, Methods Enzymol. 217, 228-257].
  • Peptides carried by filamentous phages on the surface of their envelope protein (pvm or pEI) can be used: for example, a library coding for peptides of 15 amino acids, and another coding for peptides of 12 amino acids , structurally constrained by the constant presence of two cysteine residues.
  • the phage selection conditions used are those described (in particular by [Ferrieres et al., 2000, Eur. J. Biochem.
  • the elution of the phages specifically captured by the antibody is carried out either by acid treatment or by displacement with an excess of antigen.
  • the amino acid sequence of each selected peptide can be determined as described in particular by Ferrieres et al. For example, mimotope peptides of the antibody ESH8, as well as with the human antibody 2C11 could be obtained. Depending on the elution condition used, the consensus reasons obtained vary.
  • the first of the mimotopic type comprises a single sequence YCNPSIGDKNCR, sequence represented by 3 clones
  • the second group of epitopic type is distinguished by a consensus motif: XCX- hydrophobic- aromatic (Y / F) -GKTXLCX (where X represents any amino acid), which has A sequence homology with the C2 domain of factor VIE.
  • Residues such as glycine (G), lysine (K), threonine (T) and leucine (L) do not tolerate any substitution, as for the hydrophobic residue, the most reactive elements are valine (V), isoleucine (I) and leucine (L), but fully accept residues such as threonine (T), methionine (M), phenylalanine (F), tryptophan (W), and tyrosine (Y).
  • this position mainly tolerates phenylalanine (F), and tyrosine (Y) with a slight acceptance of tryptophan (W).
  • the blocking activity of lures can be verified in vitro by ELISA test.
  • the format used makes it possible to demonstrate the inhibition of the binding of the inhibitor antico ⁇ s to factor VIE by the lure introduced in increasing concentration.
  • the neutralizing capacity of the lure can be confirmed in a functional test such as the Bethesda Test (Kasper method, [Kasper et al., 1975, Thromb. Diath. Haemorrh. 34, 875-6]).
  • the 7 soluble mimotope peptides more particularly studied are the following:
  • peptide 107 has been shown to be a relatively effective peptide in inhibiting FVEI-antico ⁇ s 2C11 binding, the inventors became interested in more detail in its ability to neutralize the inhibitory activity of 2C11.
  • Fieure 2 depicts the dose-dependent neutralization of the inhibitory activity of 2C11 by the peptide 107.
  • a concentration at which 98% of the activity of FVm is inhibited (FIG. 1), total neutralization of its inhibitory effect is reached with a concentration of peptide 107 of the order of 100 ⁇ M, ITC 50 being equal to 19 ⁇ M.
  • a control peptide used in an identical concentration range has no neutralizing effect ( Figure 2).
  • Peptide 107 incubated with FVEI alone does not modify the procoagulant activity of FVEI ( Figure 2).
  • Peptides (103, 104, 105, 106, 108, and 109) can also effectively neutralize the inhibitory activity of 2C11. However, higher concentrations of peptide are necessary to achieve an efficiency similar to that of peptide 107 (data not shown).
  • the neutralization properties of peptide 107 were studied in vivo, using a mouse model deficient in FVIE.
  • Figure 3 shows that administration of 2C11 alone completely inhibited the procoagulant activity of the injected FVEI, while the mice which received the 2C11 antibody in the presence of peptide 107 maintain 52% of the procoagulant activity of FVEI.
  • the neutralizing activity of peptide 107 is very specific since a control peptide has no neutralizing effect.
  • a third step the inventors looked at whether the neutralizing properties of the peptide 107 with respect to 2C11 could also be applied to other sera from hemophiliac patients with inhibitors.
  • a preliminary study reveals that out of 12 sera from hemophiliac patients with inhibitors, 2 of them react with peptide 107 thus indicating that FVIE inhibitors similar to 2C11 are produced by other patients with hemophilia A.
  • FIG. 1 represents the effect of the antibody 2C11 on the activity of factor VIE evaluated by the Bethesda test.
  • Factor VIE was incubated in the presence of 3.5 nM of 2C11 antibody for 2 h at 37 ° C., the residual activity of factor VIE was then measured with a coagulometer, in one step.
  • the percentage of residual activity of the VIE factor is represented on the ordinate.
  • Bar A represents the activity of factor VIE alone (100%)
  • bar B represents activity of factor VIE in the presence of the antibody 2C11 at a concentration of 3.5 nM. In the presence of 3.5 nM of 2C11 the activity of factor VIE is almost completely inhibited.
  • FIG. 2 represents the evolution of the activity of factor VIE, evaluated by the Bethesda test, in the presence of 3.5 nM of antico ⁇ s 2C11 as a function of the concentration of peptide.
  • the 2C11 antibody was incubated overnight at 4 ° C in the presence of a control peptide or peptide 107 (SCHAWSNRRTCR) in variable concentration.
  • the VIE factor was then incubated for 2 h at 37 ° C. with these peptide-antico ⁇ s mixtures or with peptide 107 alone, then its residual activity was measured with a coagulometer, in one step.
  • the percentage of residual activity of the factor VIE is represented on the ordinate, the concentration of peptide is represented on the abscissa ( ⁇ M).
  • the black triangles represent the evolution of the residual activity of factor VIE in the presence of increasing concentrations of the peptide 107 alone, the black dots represent the evolution of the residual activity of factor Vm in the presence of the mixture between increasing concentrations of the peptide 107 and the antico ⁇ s 2C11, the white diamonds represent the evolution of the residual activity of factor VIE in the presence of the mixture between increasing concentrations of the control peptide and the antibody 2C11.
  • Peptide 107 neutralizes the effect of the 2C11 antibody.
  • FIG. 3 represents the effect of the injection of the antico ⁇ s 2C11 in the absence or in the presence of the peptide 107 or a control peptide on the blood coagulation of mice deficient in factor VIE and to which human factor Vm is administered.
  • Antico ⁇ s 2C11 (16.5 nM) or a mixture containing the antibody 2C11 (16.5 nM) and peptide 107 (650 ⁇ M) or a control peptide (700 ⁇ M) was injected into the tail vein d 'A knockout mouse, deficient in factor VIE, at a rate of 2.5 ⁇ g of 2C11 antibody, 1 mg of peptide 107 and 1 mg of control peptide. After 30 minutes, 0.5 IU of human factor VIE was injected and the plasma procoagulant activity was then measured by a chromogenic test 15 minutes later.
  • the percentage of residual activity of the VIE factor is represented on the ordinate.
  • Bar A represents the effect of the injection of factor VIE without prior injection of antibodies (100% "of residual activity).
  • Bar B represents the effect of the injection of the 2C11 antibody alone prior to the injection of factor Vm.
  • Bar C represents the effect of the injection of a mixture between the 2C11 antibody and the peptide 107 prior to the injection of factor VIE.
  • Bar D represents the effect of the injection of a mixture between the 2C11 antibody and a control peptide prior to the injection of factor VIE.
  • Peptide 107 specifically neutralizes the effect of the 2C11 antibody in vivo.

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Description

LEURRES PEPTIDIQUES POUR LA PREPARATION DE MEDICAMENTS DESTINES A LA PREVENTION OU AU TRAITEMENT DES PATHOLOGIES AUTO-IMMUNES, OU DES TROUBLES LIES A L'APPARITION D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE DES PROTEINES EXOGENES.
L'invention a pour objet des leurres peptidiques d'anticorps pathogènes pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des pathologies auto- immunes, ou des troubles liés à l'apparition d'anticorps dirigés contre des protéines exogènes recombinantes ou non utilisées dans le cadre du traitement de ces pathologies auto-immunes ou des pathologies nécessitant l'administration aux patients desdites protéines exogènes.
L'hémophilie A est une pathologie (sévère) due à l'absence ou l'insuffisance de facteur Vin (FNπi) fonctionnel. La capacité de coagulation est restaurée chez les patients par l'administration de concentrés de facteur VIII recombinant ou issu de plasmas.
Il est connu que chez un pourcentage important (environ 15-25%) d'hémophiles A traités par le facteur Nm, un processus d'auto-immunisation aboutit à l'apparition d'anticorps anti-FNπi inhibant la fonction procoagulante -du facteur NUI administré, rendant plus complexe encore le traitement des patients. Ces anticorps se lient à plusieurs régions (ou domaines structuraux) de la protéine FNiπ, en particulier les domaines C2, A2 et a3-A3-Cl.
La réponse anticorps a pour effet d'inhiber l'activité procoagulante du FNm administré et de compliquer ainsi sérieusement le traitement de ces hémophiles.
Aucune thérapeutique actuelle ne résout complètement ce problème ; la « tolérisation immunologique » par administration de doses massives de facteur VIII a un coût économique important pour le système de santé, ce qui rend nécessaire des recherches pour mettre au point des procédés possédant un rapport efficacité/coût plus favorable.
Il est connu que les anticorps possèdent une structure moléculaire spécialisée, appelée paratope, qui leur permet d'effectuer une fonction biologique importante: la reconnaissance de l'antigène. Le paratope de l'anticorps est capable de reconnaître non seulement une partie limitée (appelée « épitope ») de l'antigène qui a été à l'origine de sa sélection, mais aussi des fragments plus petits de cet antigène, en particulier des peptides correspondant à l'épitope (appelés « peptides epitopiques »), des peptides possédant des modifications de séquence ou de structure chimique par rapport à l'épitope (appelés « variants d'épitopes ») ou encore des molécules n'ayant pas d'homologie de séquence avec l'antigène (appelées « mimotopes »).
La réponse anticorps contre le FVm est polyclonale et hétérogène dans sa spécificité [Gilles et al, 1993, Blood, 2452-61] mais il a été observé que les régions reconnues par les anticorps inhibiteurs (epitopes) sont restreintes à quelques zones principales de la molécule de facteur Vin. Le domaine A2 et le domaine C2 ont été identifiés initialement par des méthodes d'immunoempreinte utilisant des fragments protéolytiques du FVIÏÏ [Fulcher et al., 1985, PNAS USA 82, 7728-32] et confirmés ultérieurement lorsque la séquence nucléotidique du FVm a été déterminée (Vehar et al, 1984, Nature 312, 337-342 ; Gitschier et al., 1984, Nature 312, 326-336) et des fragments recombinants préparés [Scandella et al., 1988, PNAS 86(4), 1387; Scandella et al., 1989, Blood 74, 1618-26]. Dans un cas particulier, l'épitope d'un anticorps inhibiteur monoclonal murin a pu être restreint à une séquence de 25 acides aminés de la région A2 (résidus 484-508) grâce à l'utilisation astucieuse d'hybrides entre les
I séquences du facteur VIE humain et porcin [Healey et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 14505-9]. Le clonage d'un anticorps humain à partir de lymphocytes B d'un patient hémophile a permis de montrer que cet anticorps reconnaissait le domaine C2 et inhibait la fonction du FVIII probablement en se liant avec une forte affinité sur le site de liaison du facteur de von Willebrandt [Jacquemin et al., 1998, Blood 92, 496-506]. Enfin, la région a3-A3-Cl semble aussi reconnue par des anticorps inhibiteurs.
Les approches thérapeutiques existant actuellement dans le cadre de la lutte contre les effets de ces anticorps, sont principalement les suivantes :
- stimulation par la desmopressine de la production de FVm chez les hémophiles modérés [Kesteven et al., 1984, Thromb. Haemost. 52, 50-2];
- activation de la cascade de la coagulation par des concentrés du complexe prothrombique [Lusher et al., 1983, Blood 62, 1135-8];
- administration de F Vu recombinant humain activé [Hedner et al., 1993, Transfus. Med Rev. 7, 78-83] ;
- utilisation de FVEI porcin [Hay et al., 1996, Vox Sang 70, 68-9],
- utilisation de concentrés de prothrombine activée (brevet US 4,160,02 (1979) : Method for producing a blood-coagulation-promoting préparation for human blood plasma; brevet US 4,357,321 (1982): Method and composition for treating clotting factor inhibitors ; brevet US 4,663,164 (1987): Aqueous compositions for treating blood clotting inhibitors),
- utilisation de fragments du facteur Vm (brevet US 4,649,132 (1987): Treatment of factor Vm inhibitors; brevet US 4,769,336 (1987): Treatment of factor Vm inhibitors; brevet US 5,149,637 (1992): Recombinant factor Vm fragments),
- utilisation d'immun-complexes (brevet US 5,543,145 (1996): Pharmaceutical composition and method for the suppression of factor VIII inhibitor production),
- utilisation de molécules hybrides facteur Vm humain/porcin (brevet US 5888974: Hybrid human/animal factor V S). Une approche conceptuelle des leurres moléculaires, non basée sur des peptides ou dérivés peptidiques, a été récemment décrite dans deux modèles différents de pathologies humaines à médiation humorale: le diabète et la myasthénie gravis. Dans les deux approches, de courtes séquences d'ARN ont été sélectionnées (à partir d'une large banque d'ARN de séquence aléatoire) pour leur capacité à se lier spécifiquement à un anticorps monoclonal représentatif des autoanticorps humains [Lee et al., 1997, Nat. Biotechnol. 15, 41-5 ; Lee et al., 1996, J. Exp. Med. 184, 315-24 ; Hay et al., 1996, susmentionné]. Dans les deux cas, les auteurs parviennent à démontrer que les leurres sélectionnés inhibent la liaison de quelques sérums de patients à leur cible (récepteur de l'insuline et récepteur de l'acétylcholine, respectivement). Cependant, ces observations n'ont pas été validées dans un modèle animal de ces pathologies. Une des faiblesses de cette approche est l'instabilité métabolique des ARN; bien que des ARN modifiés, plus résistants aux nucléases, aient été utilisés dans certaines de ces études, on peut penser que la demi-vie plasmatique de telles molécules soit suffisamment faible pour ôter toute chance au leurre d'agir.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs, que des peptides ou pseudopeptides correspondant à des variants d'épitopes ou à des mimotopes, sont capables de se fixer dans le site d'anticorps anti-FVIII, en empêchant leur liaison au facteur Vin, et en réduisant ainsi l'activité anti-coagulante de cet anticorps.
La présente invention a pour but de fournir de nouveaux moyens pour lutter contre les anticorps présents dans l'organisme dans le cadre de pathologies auto-immunes, ou de pathologies nécessitant l'administration de protéines aux patients, permettant de limiter considérablement le coût des thérapeutiques actuelles dans ce domaine, et ce avec une efficacité comparable voire supérieure aux méthodes de traitement actuelles.
La présente invention a pour objet l'utilisation de leurres peptidiques ou pseudopeptidiques se liant à des anticorps susceptibles de se déyelopper contre des protéines endogènes dans le cadre de pathologies auto-immunes ou contre des protéines exogènes administrées aux patients, notamment dans le cadre de pathologies dues à une déficience en ces protéines, la séquence en acides aminés desdits leurres peptidiques ou pseudopeptidiques différant de celle des epitopes reconnus par lesdits anticorps, pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement desdites pathologies auto-immunes, ou à la prévention ou au traitement des troubles liés à l'apparition d'anticorps dirigés contre lesdites protéines exogènes.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de leurres peptidiques ou pseudopeptidiques définis ci-dessus, comprenant entre environ 6 et environ 20 acides aminés naturels ou non (et de préférence entre environ 8 et environ 16 de ces acides aminés), lesdits leurres étant sélectionnés pour leur capacité à :
- inhiber in vitro et in vivo la liaison d'anticorps à des protéines spécifiquement reconnues par ces derniers dans le cadre de pathologies auto-immunes, ou de pathologies nécessitant l'administration desdites protéines aux patients,
- restaurer in vitro et in vivo l'activité desdites protéines en présence desdits anticorps. Avantageusement, les anticorps reconnaissent préférentiellement les leurres peptidiques ou pseudopeptidiques que les protéines endogènes ou exogènes susmentionnées.
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée, de leurres tels que définis ci-dessus, pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement :
- de pathologies auto-immunes telles que :
. la myasthénie gravis,
. l'apparition d'autoanticorps dirigés contre l'insuline,
. l'apparition d'autoanticorps dirigés contre le facteur VIII ou D dans le cadre de variantes auto-immunes de l'hémophilie A ou B respectivement, notamment chez les femmes enceintes dans le cas de l'hémophilie A,
. l'apparition d'autoanticorps anti-sperme responsables de certains cas d'infertilité,
- ou des troubles liés à l'apparition d'anticorps dirigés contre les protéines exogènes, ou contre les protéines endogènes recombinantes synthétisées en vue d'une thérapie génique, lesdites protéines étant administrées dans le cadre du traitement de pathologies dues à une déficience en ces protéines, telles que l'hémophilie A ou B.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de leurres tels que définis ci- dessus, pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des troubles liés à l'apparition d'anticorps contre le facteur VIE eηdogène, ou contre le facteur Vin exogène ou dérivés, recombinants ou non, administrés dans le cadre de l'hémophilie A.
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de leurres peptidiques définis ci-dessus, tels qu'obtenus à partir de vecteurs exprimant des banques de peptides.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de leurres n'ayant aucune homologie, voire une faible homologie comprise entre environ 10% et environ 30%, avec les epitopes desdites protéines reconnus par lesdits anticorps, lesdits leurres étant encore désignés leurres mimotopiques.
L'invention vise plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques du facteur VIE. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques du facteur VIE de formule (I) suivante :
( Xl ) nl - C -Xa - C - ( X2 ) n2 ( I ) dans laquelle :
- ni et n2 indépendamment l'un de l'autre représente 0 ou 1 ,
- Xi et X2 indépendamment l'un de l'autre représente un acide aminé naturel ou non,
- Xa représente une chaîne de 8 à 10 acides aminés naturels ou non.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques définis ci-dessus de formule (I) dans laquelle :
- X] est choisi parmi Y, E, Q, S, R, A, K, N, ou T,
- X2 est choisi parmi R, T, H, G, S, L, V, P, F, D, K, A, Q ou I.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques définis ci-dessus de formule (I) dans laquelle Xa représente la séquence suivante : NPS I GDKN SEQ ID NO : l
A ce titre, l'invention a également plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée du leurre mimotopique de formule suivante :
YCNPS IGDKNCR SEQ ID NO : 2
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques de formule (I) dans laquelle Xa représente la séquence de formule suivante :
( X3 ) n3 - X4 -X5 — G - K - T - Xg - dans laquelle :
- n3 représente 0 ou 1,
- X représente un acide aminé quelconque,
- 4 représente un acide aminé hydrophobe,
- X5 représente un acide aminé aromatique,
- X6 représente un acide aminé hydrophobe.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques définis ci-dessus de formule (I), caractérisés en ce que :
- X3 est choisi parmi I, Q, R, T, ou K,
- X4 est choisi parmi V, T, L, I, M, F, W, ou Y,
- X5 est choisi parmi F, ou Y,
- X6 est choisi parmi A, M, Y, P, T, ou V,
A ce titre, l'invention vise plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques définis ci-dessus de formules suivantes :
EC IVYGKTALCT SEQ ID NO : 3 QCPTPGKTMLCT SEQ ED NO : 4
SCRLPGKTYLCH SEQ ID NO : 5
SCTVYGKTPLCG SEQ ID NO: 6
RCKTPGKTTLCS SEQ ID NO : 7
RCTVYGKTVLCL SEQ ID NO : 8
L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques de formule (I) dans laquelle Xa représente la séquence de formule suivante :
X -Xβ -W-X9-N-R-X10 -Xil" (X12) nl2- (Xl3)nl3 dans laquelle :
- nl2 et nl3 indépendamment l'un de l'autre représentent 0 ou 1,
- X à X1 représentent un acide aminé quelconque,
- le cas échéant W est remplacé par F.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques définis ci-dessus de formule (I), caractérisés en ce que :
- X est choisi parmi H, S, T, M, Q, ou G,
- X8 est choisi parmi T, A, K, R, Q, ou E,
- X est choisi parmi S, A, H, F, N, G, ou T,
- X10 est choisi parmi R, K, L, S, H, T, I, ou A,
- Xπ est choisi parmi S, T, V, K, R, Y, M, ou D,
- X12 est choisi parmi S, R, ou L,
- X13 est choisi parmi I, H, ou W.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques définis ci-dessus de formule (I) choisis parmi ceux de formules suivantes :
QCHT SΝRRSCL . SEQ ID ΝO : 9
SCHA SΝRRTCR SEQIDΝO:10
RCHA SNRKSCV SEQE)NO:ll
CSKWANRLVSIC SEQ ID NO: 12
CSK HNRSKRHC SEQE)NO:13
ACTTWSNRSKCP SEQIDNO:14
ECTRWSNRSRCF SEQ ID NO : 15
CMKWSNRSSR C SEQIDNO:16
KCGR SNRSSCT SEQIDNO:17
CGRWFNRSDLHC SEQ ID NO: 18
ACHE SNRSTCT SEQ ID NO: 19 KCSR TNRHLCD SEQ E) NO : 20
KCTRWTNRHLCS SEQ E) NO: 21
KCTRWTNRAHCP SEQ E) NO : 22
QCSK VNRSRCA SEQ D NO : 23
NCQKWTNRRTCL SEQ E) NO : 24
QCGR SNRSYCS SEQ E) NO : 25
TCHR GNRTSCQ SEQ E) NO : 26
QCHR ANRISCS SEQ ED NO : 27
RCTQWTNRAYCP SEQ E) NO : 28
ACTQ SNRHMCG SEQ E) NO : 29
TCHPFSNRSTCT SEQ ID NO : 30
L'invention a encore plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée du leurre mimotopique de formule suivante :
SCHA SNRRTCR SEQ ID NO: 10
L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée des leurres mimotopiques de formule suivante :
KCEPDDP PQCI J- SEQ ) NO : 31
ACKRNHR GACV SEQ ) NO : 32
ECGSHA GRRCK SEQ E) NO : 33 L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques définis ci-dessus de formule (I) dans laquelle Xa représente la séquence de formule suivante :
(Xl4) nl4~Xl5~ l6-H-Xι7- -G-Xi8- ( 19) ni 9 dans laquelle :
- nl4 et nl9 indépendamment l'un de l'autre représentent 0 ou 1,
- X14 à X) représentent un acide aminé quelconque.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques définis ci-dessus de formule (I), caractérisés en ce que :
- Xj représente K,
- X15 représente R, ou G,
- Xι représente N, ou S,
- X] représente R, ou A,
- X18 représente A, ou R,
- Xι9 représente R. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de leurres mimotopiques définis ci-dessus de formule (I) choisis parmi ceux de formules suivantes :
ACKRNHR GACV SEQ )NO : 34
ECGSHAWGRRCK SEQ IDNO: 35
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée, de leurres peptidiques correspondant à des epitopes de reconnaissance par les anticorps présents dans lesdites protéines, dont la séquence peptidique est modifiée par suppression, substitution, ou addition d'au moins un acide aminé, lesdits leurres étant désignés variants epitopiques.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de variants epitopiques du facteur VIE.
L'invention a plus particulièrement pour objet encore l'utilisation susmentionnée de variants epitopiques du facteur VIE de formule (E) suivante :
(C)„1-X1-X2-X3-L-T-D-S-E-M-D-V-V-R-X4-X5- (C)n2 (II) dans laquelle :
- ni et n2 indépendamment l'un de l'autre représentent 0 ou 1, Xi à X5 représentent un acide aminé quelconque. à l'exception du peptide de formule DDDLTDSEMDVVRFD ( SEQ ID NO : 36). L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de variants epitopiques définis ci-dessus de formule (E), caractérisés en ce que : Xi représente D ou A,
- X2 représente D ou A,
- X3 représente D ou A,
- » représente F, Y, ou W,
- X5 représente D ou A.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de variants epitopiques définis ci-dessus de formules suivantes :
DDDLTDSEMDVVRFD SEQ ID NO: 37
DDDLTDSEMDVVRYD SEQ ID NO: 38
DDDLTDSEMDVVR D SEQ E) NO: 39
CDDDLTDSEMDVVRFDC SEQ ID NO : 40
AAALTDSEMDVVRFA SEQ ID NO: 41
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend des leurres tels que définis ci-dessus, en association avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables. Avantageusement, les compositions pharmaceutiques de l'invention se présentent sous des formes susceptibles d'être administrées par voie parentérale, ou par voie orale.
De préférence la posologie desdites compositions pharmaceutiques est telle qu'elle est comprise entre environ 1 et environ 5 mg/kg/j de composés de formule (I) ou (E) définis ci- dessus.
L'invention concerne également les séquences peptidiques de formule (I) telles que définies.
L'invention a également pour objet les séquences peptidiques de formule (E) telles que définies ci-dessus.
L'invention concerne également les produits comprenant :
* au moins une séquence peptidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, et/ou au moins une séquence peptidique de formule (E) telle que définie ci-dessus,
* et au moins un composé choisi parmi le facteur VET extrait, ou recombinant, ou autres produits dérivés d'origine humaine ou animale, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, en thérapie de substitution du facteur VIE, dans le cadre du traitement ou de la prophylaxie des accidents hémorragiques chez les patients atteints d'hémophilie A.
L'invention a également pour objet les pseudopeptides dérivés des séquences peptidiques de formule (I) et (E) définies ci-dessus, notamment les pseudopeptides obtenus par conversion d'un ou plusieurs, voire la totalité des peptides desdites séquences peptidiques en un acide aminé D, ce qui conduit à un pseudopeptide largement plus résistant à la protéolyse que le peptide initial [Kramer et al., 1998, Protein Eng 11, 941-8].
S 'agissant de la synthèse des composés de formule (I) ou (E) susmentionnés, celle-ci est avantageusement effectuée de la manière suivante.
Dans la procédure d'une synthèse en phase solide d'un polypeptide, le polypeptide souhaité est synthétisé à partir d'un support insoluble telle qu'une résine benzhydryle amine ou chloromethylée (dérivée d'un polystyrène réticulé, et disponible chez des fournisseurs en produits chimiques).
L'acide aminé en C-terminal du polypeptide à synthétiser, dont l'azote α ainsi que les sites réactifs sont protégés par des groupements protecteurs, est fixé à la résine en utilisant des techniques de couplage fort usitées. Le groupement protecteur de la fonction amine est déprotégé (laissant les autres groupements protecteurs, s'ils existent, intacts) de sorte que l'acide aminé suivant dans la séquence (disposant lui aussi de groupements protecteurs adéquats) est fixé et ainsi de suite. Quand le polypeptide est entièrement synthétisé, il est séparé de son support résineux, et tous les groupements protecteurs sont éliminés, puis le polypeptide est récupéré. Exemple de groupements protecteurs appropriés : fluorenyl méthyloxy carbonyl pour les groupements alpha amino, béta ou gamma tertio butyl ester pour les acides aspartique et glutamique, tertio butyl oxy carbonyl pour la lysine et le tryptophane, trityl pour la cystéine, l'asparagine, la glutamine et l'histidine, tertio butyl pour la serine et la thréonine, 2,2,4,6,7-pentadihydrobenzo furane pour l'arginine.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention de composés de formule (I) et (E) susmentionnés, et de la démonstration de leur capacité à inhiber les anticorps anti-facteur VIE.
I) MATERIEL ET METHODES '
1) Techniques pour les leurres peptidiques de type variant d'épitope
Principe de la technique Spot :
Cette synthèse parallèle de peptides sur membrane Spot (Frank, R. (1992) Spot Synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support, tetrahedron. 48, 9217-9232) permet d'obtenir rapidement un grand nombre de peptides différents assemblés simultanément sur un support cellulosique plan. Les peptides sont préparés à une échelle de l'ordre de 50 nmol par spot, sous forme immobilisée. Sur une feuille de cellulose (12-8 cm) sont crées des sites circulaires (spot) d'environ 5 mm de diamètre, chimiquement réactifs qui serviront de point d'ancrage pour fixer l'acide aminé C- terminal du peptide. L'allongement de la chaîne peptidique s'effectue par additions successives des acides aminés du C-terminal vers le N-terminal par réaction d'estérification. Les fonctions aminées des résidus utilisés sont protégées temporairement lors du couplage par un groupement labile (un groupement 9-fluorénylméthyloxyçarbonyle ou Fmoc) qui est éliminé en milieu basique. Les chaînes latérales réactives sont bloquées par un groupement stable durant la phase de synthèse, et déprotégées en fin d'assemblage. Un cycle de synthèse se déroule en 4 étapes : premièrement formation d'une liaison peptique entre le NH2 d'un acide aminé déjà déposé avec le COOH de l'acide aminé suivant, qui est au préalable activé par du N-hydroxybenzotriazole et de la N,N diisopropylcarbodiimide. Deuxièmement, les fonctions NH2 libres n'ayant pas réagi sont acétylées pour éviter la formation de peptides tronqués. Troisièmement, le groupement Fmoc protecteur du nouvel acide aminé est éliminé en milieu basique par la pipéridine. Quatrièmement, les fonctions aminées ainsi obtenues sont repérées par du bleu de bromophénol. Ce cycle est répété autant de fois que nécessaire. En fin de synthèse, après avoir procédé à la déprotection des chaînes latérales des acides aminés, les peptides qui restent fixés de manière covalente sur la membrane sont analysés par un immunoessai colorimétrique indirect.
a) Préparation des membranes La séquence complète du FVIE, à l'exception du domaine B, a été synthétisée sur membrane de cellulose sous forme de pentadécapeptides chevauchant décalés de 2 résidus selon la méthode Spot. Le protocole général a été décrit précédemment par Molina et al. (Molina, F., Laune, D., Gougat, C, Pau, B. & Granier, C. (1996) Improved performances of spot multiple peptide synthesis, Pept Res. 9, 151-5). Les membranes sont commercialisées par Abimed (Lagenfeld, Allemagne). Les acides aminés Fmoc et le N-hydroxybenzotriazole ont été commandés chez Novabiochem. Le robot qui effectue les différentes étapes de couplage est un robot ASP222 robot (Abimed). Tous les peptides sont acétylés en leur N-terminal. Une fois les peptides assemblés, les groupes protecteurs des chaînes latérales, sont déprotégés par un traitement à l'acide trifluororacétique.
b) Test immunologique colorimétrique indirect
Après saturation de la membrane dans une solution bloquante, la réactivité des peptides est évaluée par immersion de la membrane dans une solution d'anticorps inhibiteur à tester, utilisée généralement à une concentration de 0.1-1 μg/ml. Après lavages, l'interaction peptide- anticorps est révélée par incubation d'un anticorps anti-Fc marqué à la phosphatase alcaline utilisée au 1:1000 (Sigma), qui en présence de son substrat (BCEP-MTT-MgCl2 Sigma) donne un précipité bleu au niveau des peptides ayant fixé l'anticorps à tester. Les membranes sont ensuite régénérées pour éliminer le précipité bleu et l'anticorps lié en vue d'autres tests.
c) Obtention d'épitopes analogues
Une fois l'épitope identifié, une série de peptides analogues est préparée en synthèse Spot en substituant chaque position de la séquence réactive par les 19 acides aminés (à l'exception de la cystéine). L'introduction d'une contrainte par l'ajout d'un pont soufré permet également d'obtenir des epitopes analogues.
2) Techniques pour les leurres peptidiques de type « mimotopique »
. Principe de la technique du phase displav
Des ligands peptidiques peuvent être facilement obtenus grâce à leur capacité de liaison à un anticorps en utilisant la technique du phage-display (Smith, G. P. (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface, Science. 228, 1315-7), basée sur la présentation de peptides aléatoires à la surface de phages filamenteux. Ces peptides peuvent être exposés soit à la surface de la protéine pIE des phages (nombre maximal 5 copies) soit à la surface de la protéine pVEI (nombre maximal 2700 copies). Ces peptides, de taille très variée (de 6AA jusqu'à 30AA) peuvent être soit linéaires soit contraints par un pont soufré.
a) Différentes banques de phages peptides utilisées
Pour effectuer le screening des peptides aléatoires, différentes banques ont été utilisées :
* 4 banques peptidiques, où le peptide aléatoire est exprimé à la surface de la pVEI du ' phage (une 15mer linéaire, une 12 er contrainte, une 17mer semi-contrainte et une 30mer linéaire). Celles-ci, décrites par L.L.C. Bonnycastle (University Burnaby, BC, Canada) (Bonnycastle, L. L., Mehroke, J. S., Rashed, M., Gong, X. & Scott, J. K. (1996) Probing the basis of antibody reactivity with a panel of constrained peptide libraries displayed by filamentous phage, J Mol Biol. 258, 747-62), sont constituées environ de 1013 TU/ml et construites à partir du vecteur f88.4, dérivé du phage fd-tet.
* 2 banques peptidiques, où le peptide aléatoire est exprimé à la surface de la pIE du phage (une 9mer linéaire et une 12mer contrainte). Celles-ci sont décrites par le Dr Mazzucchheli L (Mazzucchelli, L., Burritt, j. B., Jesaitis, A. L, Nusrat, A., Liang, T. W., Gewirtz, A. T., Schnell, F. j. & Parkos, C. A. (1999) Cell-specific peptide binding by human neutrophils, Blood. 93, 1738-48), et leur diversité est de l'ordre de 109 TU/ml.
b) Criblage de la banque de phages (biopanning)
La technique de biopanning est réalisée suivant le protocole décrit par Smith et al. susmentionné. Trois tours de sélection et d'amplification sont réalisés, en parallèle pour les banques pIE et pVEI. Pour chaque cycle de sélection, les différents anticoφs inhibiteurs, à la concentration de 1-5 μg/ml pour les 2 premiers tours, 0.1-0.5 μg/ml pour le 3ème tour, dans du tampon carbonate (NaHCO3, 100 mM, pH 8.6), sont adsorbés sur une boîte de Pétri 10x1.5 cm (Falcon 1029) pendant une nuit à 4°C sous agitation. Après 5 lavages de 2 min au TBS-T 0.05% (Tris Buffered Saline : NaCl 1.37 M / KC1 26.8 mM / Tris base 0.5 M-Tween 20 0.05% / pH 7) pour éliminer l'excès d'anticoφs, les sites non spécifiques sont saturés pendant 2 h à 37°C avec une solution de TBS-T 0.1%-BSA 3% préalablement filtrée. Après élimination de cette dernière solution par 5 lavages de 2 min au TBS-T 0.05%, 2.1011 TU (unités de transduction) de chaque banque primaire, soit 100 fois la diversité de chaque banque, ou d'éluat de phages issus du tour de sélection précédent sont incubés une nuit à 4°C sous agitation. Les phages non retenus sont éliminés par 10 lavages de 2 min avec du TBS-T 0.5% suivis de 5 lavages de 2 min avec du TBS-T 0.05%. Les phages retenus sont ensuite élues soit par une élution acide (3 ml d'HCl 0.1 M / glycine / BSA 1 mg ml préalablement filtrée / pH 2.2, incubation de 30 min à TA sous agitation, puis neutralisation avec 150 μl de Tris-HCl 2 M, pH 9) soit par une élution par compétition avec du FVEI (incubation ON à 4°C). Les différents éluats sont ensuite utilisés pour infecter des cellules E.Coli K91 pour amplification. Cette amplification se déroule en 2 étapes : tout d'abord 5 ml d'une suspension bactérienne en phase exponentielle de croissance (absorbance 1.8 à 550 nm) est ajouté à chaque éluat. Après une incubation de 10 min à 37°C sans agitation, 93 ml de milieu Luria- Bertani (LB) avec 0.2 μg/ml de tétracycline (Te) (banques pVEI) ou 0.75 μg/ml de kanamycine (Ka) (banques pIE) sont ajoutés et incubés 30 min à 37°C à 225 tours par minute (φra). La concentration est ensuite ajustée à 20 μg/ml pour la Te et à 75 μg/ml pour la Ka, puis la suspension est incubée à 37°C à 225 φm pendant la nuit. Ces différentes suspensions bactériennes sont ensuite centrifugées à 4°C à 4000 φra pendant 25 min, puis à 8000 φm pendant 12 min, afin de précipiter les bactéries. Le surnageant contenant les phages est repris dans du poly(éthylèneglycol) 8000 / NaCl 2.5 M à raison de 15 ml pour 100 ml de surnageant; la précipitation s'effectue durant la nuit à 4°C. Après centrifugation à 4°C à 8000 φm pendant 40 min, le culot est repris dans 3 ml de TBS 50 mM / NaCl, et incubé à 37°C pendant 30 min à 150 φm. Le contenu est transféré dans 3 eppendorfs, centrifugé à 15000 φm pendant 10 min à 4°C pour éliminer les débris cellulaires, puis transféré dans des ampoules stériles de 1.5 ml et stocké à -80°C.
A chaque étape de sélection, la quantité de phages amplifiés est évaluée par titration, tandis que l' enrichissement en phages affins est évalué par ELISA. Après 3 tours de sélection, 3 étapes de clonage ont permis d'obtenir sur milieu solide (milieu LB-agar-Tc à 20 μg/ml ou Ka à 75 μg/ml) des colonies bactériennes isolées. L'aptitude des différents clones à se lier spécifiquement aux anticoφs inhibiteurs est ensuite testée par ELISA.
c) Elisa Direct: Test de reconnaissance des anticoφs inhibiteurs par les phages Les différents anticoφs inhibiteurs utilisés pour le criblage des banques sont immobilisés à 1 μg/ml en tampon NaHCO3 sur plaque de microtitration (Nunc) durant une nuit à 4°C. Les puits sont saturés avec du PBS-T0.1%-lait 2% pendant lh30 à 37°C. Les phages issus des différents pannings, dilués au 1/25 en tampon PBS-T0.1%-lait 2% sont ensuite incubés pendant lh30 à 37°C. Entre chacune de ces incubations, 3 lavages au PBS- T0.1% sont effectués sauf après la saturation. Les phages liés sont détectés à l'aide d'un anticorps anti-M13 couplé à la peroxydase (Amersham Boehringer) dilué au 1:3000, incubé pendant 1 h à 37°C. Après 5 lavages, le substrat de la peroxydase (OPD) est ajouté. La réaction se déroule pendant 30 min à l'obscurité puis une mesure de l'absorbance est effectuée à 450 nm. Après arrêt de la réaction par ajout d'H2SO4 4N, une nouvelle mesure est effectuée à 490 nm.
La spécificité des phages est mise en évidence par l'absence de réactivité avec des anticoφs irrelevants.
d) Détermination de la séquence des oligonucléotides Le séquençage de l'ADN issu des phages est effectué sur séquenceur automatique (EUROGENTEC). Les amorces utilisées : 5' GTT TTG TCG TCT TTC CAG ACG 3' pour la pEI, et 5' TCG GCA AGC TCT TTT AGG 3' pour la pVEI, sont localisées en aval de l'insert peptidique.
3) Capacité des peptides variants epitopiques ou mimotopiques sous forme soluble à inhiber leur anticoφs inhibiteurs in vitro and ex vivo
a) Synthèse de peptides solubles
Les différents epitopes identifiés en Spot ou les mimotopes déterminés par la technique du phage display sont ensuite synthétisés sous forme de peptides synthétiques solubles grâce à un synthétiseur Abimed AMS422 basé sur de la chimie Fmoc en phase soluble (Gausepohl, H., Boulin, C, Kraft, M. & Frank, R. W. (1992) Automated multiple peptide synthesis, Pept Res. 5, 315-20). Les peptides sont déprotégés et clivés de la résine par un traitement avec de l'acide trifluoroacétique en présence de scavengers appropriés. Les peptides sont alors lyophilisés, et leur pureté est évaluée en HPLC. Si nécessaire, les peptides sont purifiés en vue d'obtenir plus de 90% d'homogénéité en HPLC.
b) Capacité neutralisante des leurres in vitro
Le FVEI est immobilisé sur la plaque ON à 4°C. En parallèle, l'anticorps inhibiteur est préincubé avec son/ses peptides epitopiques en gamme ON à 4°C dans du PBS-T0.1% -lait 2%. Après 1 h de saturation avec du PBS-T0.1% -lait 2%, les mélanges Ac-peptide sont incubés avec le FVEI immobilisé pendant 2 h à 37°C. Entre chacune de ces incubations, 3 lavages au PBS-T0.1% sont effectués sauf après la saturation. La détection du complexe FVIE-Ac est obtenue par un anti-IgG de souris ou humain couplé à la peroxydase dilué au 1:3000 incubé pendant 1 h à 37°C. Après 5 lavages de PBS-T0.1%, le substrat de la peroxydase (OPD) est ajouté. La réaction se déroule pendant 3U"min à l'obscurité puis une mesure de l'absorbance est effectuée à 450 nm. Après arrêt de la réaction par ajout de H2SO4 4N, une nouvelle mesure est effectuée à 490nm.
c) Capacité neutralisante des leurres dans un test fonctionnel (Test Bethesda) Ce test fonctionnel (Kasper, C. K. & Pool, J. G. (1975) Letter: Measurement of mild factor VIE inhibitors in Bethesda units, Thromb Diath Haemorrh. 34, 875-6) consiste à mesurer le temps nécessaire à un mélange composé des différents facteurs de la coagulation (FIXa, FVEI, phospholipides, calcium...) pour coaguler complètement. L'effet inhibiteur d'un anticoφs se caractérisera dans un tel test par un allongement du temps du coagulation, la capacité inhibitrice de l'anticorps sera d'autant plus élevée que l'allongement du temps de coagulation sera importante. Le caractère inhibiteur d'un anticoφs est exprimé en unité Bethesda, ce qui correspond à la concentration réciproque d'anticorps pour neutraliser 50% de l'activité coagulante du FV I. Par contre, l'effet neutralisant des peptides se traduira par un retour au temps de coagulation initial obtenu en absence d'inhibiteur.
Le test fonctionnel suivi découle du test décrit par Kasper susmentionné. Les anticoφs monoclonaux anti-FVEI sont dilués dans un tampon imidazole 0.05 M, pH 7.3. Un volume égal de cette préparation (250μl) avec du plasma normal tamponné dans de l'imidazole (0.1 M, pH 7.4) sont mélangés et incubés pendant 2 h à 37°C. De manière similaire, du plasma normal tamponné dans de l'imidazole est mélangé à un anticoφs non-spécifique lequel constitue le contrôle. L'activité inhibitrice d'un anticoφs est lue à partir d'un graphe semi- logarithmique représentant la corrélation entre l'activité résiduelle du FVEI et l'activité inhibitrice.
Pour mettre en évidence la capacité des peptides à neutraliser les anticoφs inhibiteurs, l'anticorps inhibiteur utilisé à une concentration de sorte à obtenir 50% de FVEI résiduel, est préincubé ON à 4°C dans du tampon imidazole avec des concentrations croissantes en peptides. Ce mélange est ensuite traité comme ci-dessus.
E) DESCRIPTIF DETAILLE 1) Choix des anticoφs :
Il a été utilisé :
• un anticoφs monoclonal de souris, ci-après dénommé ESH8, qui présente une très grande activité de neutralisation de l'activité procoagulante du FVEI (6300 Besthesda Unit/mg [Scandella et al., 1995, Blood 86, 1811-9]). Cet anticoφs est un bon représentant des anticoφs humains se liant au domaine C2 du facteur VIE, * un anticoφs monoclonal humain 2C11 (Jacquemin et al., 1998, susmentionné),
• plusieurs anticoφs monoclonaux de souris, ci-après dénommés F7B4, F29F11, F14A12, F18B1, F19C2 et F21C1 qui représentent un modèle des anticoφs humains se liant à la région acide at du facteur VIE pour les 3 premiers, et la région acide a3 pour les derniers.
2) Procédés pour obtenir des leurres : Il a été obtenu des leurres peptidiques de type "variants d'épitopes", en utilisant la technique Spot pour introduire des variations de la séquence en acides aminés de l'épitope. Les peptides variants d'épitope conservent la réactivité avec l'anticorps ou peuvent montrer
I une réactivité plus forte que l'épitope. Par exemple, une telle approche concernant l'épitope D356WRF360 de l'anticorps anti-FVIE F7B4 a montré que la F360 pouvait être substituée sans perte de réactivité par les 2 autres acides aminés aromatiques W et Y. Dans un autre exemple, la présentation de l'épitope sous forme cyclique a été évaluée avec le peptide CDDDLTDSEMDWRFDC et l'importance des charges négatives a été étudiée avec le peptide AAALTDSEMDVVRFA. Tous ces leurres de type « variants d'épitopes » ont été obtenus par synthèse peptidique conventionnelle et leur activité de liaison à l'anticorps antifacteur VIE mesurée.
Il a été obtenu des leurres peptidiques de type « mimotopes » par la technique des banques de phages recombinants. L'approche de sélection de peptides à partir de banques aléatoires de séquences a été décrite [Smith et al., 1993, Methods Enzymol. 217, 228-257]. Des peptides portés par des phages filamenteux à la surface de leur protéine d'enveloppe (pvm ou pEI) peuvent être utilisés: par exemple, une banque codant pour des peptides de 15 acides aminés, et une autre codant pour des peptides de 12 acides aminés, contraints structuralement par la présence constante de deux résidus de cystéine. Les conditions de sélection des phages utilisées sont celles décrites (notamment par [Ferrieres et al., 2000, Eur. J. Biochem. 267, 1819-1829]). L'elution des phages spécifiquement capturés par l'anticorps est effectuée soit par traitement acide soit par déplacement avec un excès d'antigène. La séquence en acides aminés de chaque peptide sélectionné peut être déterminée comme décrit notamment par Ferrieres et al. Par exemple, des peptides mimotopes de l'anticorps ESH8, ainsi qu'avec l'anticorps humain 2C11 ont pu être obtenus. Suivant la condition d'élution utilisée, les motifs consensus obtenus varient. Par élution acide, deux groupes de séquences, toutes étant issues de la banque contrainte de 12 acides aminés, sont obtenus : le premier de type mimotopique comprend une seule séquence YCNPSIGDKNCR, séquence représentée par 3 clones, le second groupe de type épitopique se distingue par un motif consensus: X-C-X- hydrophobe- aromatique (Y/F)-G-K-T-X-L-C-X (où X représente n'importe quel acide aminé), qui présente Une homologie de séquence avec le domaine C2 du facteur VIE. Ce motif consensus est retrouvé dans 6 différentes séquences : ECIVΥGKTALCT (représentée 1 fois), QCQTFGKTMLCT (4 fois), SCRLFGKTYLCH (1 fois), SCTVYGKTPLCG (11 fois), RCKTFGKTTLCS (1 fois) et RCTVYGKTVLCL (1 fois). Tandis qu'avec l'elution avec l'antigène, une seule séquence est obtenue et elle provient de la banque linéaire de 15 acides aminés KPGEVPRHRVTDFDR, représentée 4 fois.
Pour vérifier que ces séquences prises en dehors du contexte du phage soient toujours réactives avec l' anticoφs ESH8, celles-ci ont été synthétisées sur membrane par la technique Spot. Il s'avère que toutes ont gardé leur réactivité. Ensuite, pour déterminer les résidus clés de la liaison ESH8/peptide, chaque acide aminé du peptide a été substitué par les 19 autres acides aminés (à l'exception de la cystéine) pour déterminer 1) quels étaient les résidus critiques à la liaison ESH8/peptide 2) les éventuelles substitutions tolérables ce qui permet de dégager une caractéristique commune (exemple caractère hydrophobe ou aromatique, présence d'une longue chaîne latérale). Les résidus comme la glycine (G), la lysine (K), la thréonine (T) et la leucine (L) ne tolèrent aucune substitution, par contre quant au résidu hydrophobe, les éléments les plus réactifs sont valine (V), isoleucine (I) et leucine (L), mais acceptent tout à fait des résidus tels que la thréonine (T), la méthionine (M), la phénylalanine (F), le tryptophane (W), et la tyrosine (Y). Quant au résidu aromatique, cette position tolère principalement la phénylalanine (F), et la tyrosine (Y) avec une légère acceptation du tryptophane (W).
Une fois ces séquences identifiées, un leurre est obtenu par synthèse peptidique conventionnelle.
3) Procédés pour déterminer l'activité bloquante des leurres : L'activité bloquante des leurres peut être vérifiée in vitro en test ELISA. Le format utilisé permet de mettre en évidence l'inhibition de la liaison de l'anticoφs inhibiteur au facteur VIE par le leurre introduit en concentration croissante. La capacité neutralisante du leurre peut être confirmée dans un test fonctionnel comme le Test Bethesda (méthode de Kasper, [Kasper et al., 1975, Thromb. Diath. Haemorrh. 34, 875-6]).
Les 7 peptides mimotopes solubles plus particulièrement étudiés sont les suivants :
103 KCGR SNRSSCT
104 ECGSHA GRRCK
105 CSK HNRSKRHC
106 CMKWSNRSSRWC
107 SCHA SNRRTCR
108 QCHTWSNRRSCL 109 CHA SNRKSCV Les Inventeurs ont étudié la capacité de ces peptides solubles à inhiber la liaison de l' anticoφs 2C11 au facteur VIE dans un test ELISA in vitro de la manière suivante: immobilisation du FVEI, pré-incubation de 2C11 avec les peptides solubles en gamme (200μM, 20μM, 2μM, 200nM, 20nM, 2nM) toute la nuit à 4°C, puis incubation de ce prémélange sur le FVm, révélation ensuite de l'anticorps 2C11. Les résultats obtenus sont indiqués ci-après.
% d'inhibition 103 104 105 106 107 108 109
200 62,73 63,71 75,58 36,56 90,48 60,69 75,05
20 28,26 30,68 45,04 21,99 80,04 25,99 37,48
2 3,47 13,44 10,27 0,00 37,33 15,79 12,46
0,02 0 0 0 0 0 0 0
0,002 0 0 0 0 0 0 0
Tous les peptides testés inhibent la liaison Ac 2C11/FVIE, le peptide 107 se révélant être le plus efficace.
4) Capacité du peptide 107 (SCHAWSNRRTCR) à neutraliser l'anticorps 2C11 dans des analyses fonctionnelles et in vivo.
Comme le peptide 107 s'est avéré un peptide relativement efficace à inhiber la liaison FVEI- anticoφs 2C11, les Inventeurs se sont intéressés plus en détails à sa capacité à neutraliser l'activité inhibitrice de 2C11.
Dans un premier temps, les Inventeurs ont évalué dans un essai fonctionnel de coagulation (test Bethesda) la capacité du peptide 107 à restaurer l'activité procoagulante de FVm en présence de 2C11. La Fieure 2 dépeint la neutralisation dose-dépendante de l'activité inhibitrice de 2C11 par le peptide 107. A une concentration en 2C11 de 3,5 nM, concentration à laquelle 98% de l'activité du FVm est inhibée (Figure 1), la neutralisation totale de son effet inhibiteur est atteinte avec une concentration en peptide 107 de l'ordre de 100 μM, ITC50 étant égale à 19 μM. Un peptide contrôle utilisé dans une gamme de concentration identique ne présente aucun effet neutralisant (Figure 2). Le peptide 107 incubé avec du FVEI seul ne modifie nullement l'activité procoagulante du FVEI (Figure 2). Les peptides (103, 104, 105, 106, 108, et 109) peuvent également neutraliser efficacement l'activité inhibitrice de 2C11. Cependant, des concentrations plus élevées en peptide sont nécessaires pour atteindre une efficacité semblable à celle du peptide 107 (données non montrées). Dans un deuxième temps, les propriétés de neutralisation du peptide 107 ont été étudiées in vivo, en utilisant un modèle de souris déficientes en FVIE. Une étude préliminaire a permis de définir qu'une administration intraveineuse de 0,5 UI de FVm recombinant humain à de telles souris permettait d'obtenir un taux plasmatique en FVm de l'ordre de 0,3 IU/ml FVm, taux stable pour au moins une heure. Ceci déterminé, de l'anticorps 2C11 (à 16,7 nM) incubé seul, en présence du peptide 107, ou d'un peptide contrôle (650 μM et 700 μM, respectivement) a été injecté dans la veine de la queue de trois groupes de souris respectivement. Trente minutes plus tard, le taux plasmatique en FVm de ces souris a été reconstitué par l'injection des 0,5 UI de FVIE humain et après quinze minutes l'activité procoagulante plasmatique a été mesurée. La Figure 3 prouve que administration de 2C11 seul a complètement inhibé l'activité procoagulante du FVEI injecté, alors que les souris qui ont reçu l'anticorps 2C11 en présence du peptide 107 maintiennent 52% de l'activité procoagulante du FVEI. L'activité neutralisante du peptide 107 est bien spécifique puisqu'un peptide contrôle ne présente aucun effet neutralisant.
Dès lors, ces données indiquent que la capacité neutralisante du peptide 107 sur l'inhibition de l 'anticoφs 2C11 vis à vis du FVm, suggérée par des expériences in vitro, est également vérifiée dans des conditions in vivo, qui ressemblent à l'hémophilie A.
Dans un troisième temps, les Inventeurs ont regardé si les propriétés neutralisantes du peptide 107 vis à vis de 2C11 pouvaient également s'appliquer à d'autres sérums de patients hémophiles avec inhibiteurs. Une étude préliminaire révèle que sur 12 sérums de patients hémophiles avec inhibiteurs, 2 d'entre eux réagissent avec le peptide 107 indiquant ainsi que des inhibiteurs du FVIE semblables à 2C11 sont produits par d'autres patients présentant l'hémophilie A.
Figure 1
La figure 1 représente l'effet de l'anticorps 2C11 sur l'activité du facteur VIE évaluée par le test Bethesda. Du facteur VIE a été incubé en présence de 3,5 nM d'anticorps 2C11 durant 2h à 37°C, l'activité résiduelle du facteur VIE a alors été mesurée avec un coagulomètre, en une étape.
Le pourcentage d'activité résiduelle du facteur VIE est représenté en ordonnée. La barre A représente l'activité du facteur VIE seul (100%), la barre B représente l'activité facteur VIE en présence de l'anticorps 2C11 à la concentration de 3,5 nM. En présence de 3,5 nM de 2C11 l'activité du facteur VIE est inhibée quasi complètement.
Figure 2
La figure 2 représente l'évolution de l'activité du facteur VIE, évaluée par le test Bethesda, en présence de 3,5 nM d' anticoφs 2C11 en fonction de la concentration en peptide. L'anticorps 2C11 a été incubé une nuit à 4°C en présence d'un peptide contrôle ou du peptide 107 (SCHAWSNRRTCR) en concentration variable. Le facteur VIE a alors été incubé 2h à 37°C avec ces mélanges peptide-anticoφs ou avec du peptide 107 seul puis son activité résiduelle a été mesurée avec un coagulomètre, en une étape.
Le pourcentage d'activité résiduelle du facteur VIE est représenté en ordonnée, la concentration en peptide est représentée en abscisse (μM). Les triangles noirs représentent l'évolution de l'activité résiduelle du facteur VIE en présence de concentrations croissantes du peptide 107 seul, les points noirs représentent l'évolution de l'activité résiduelle du facteur Vm en présence du mélange entre des concentrations croissantes du peptide 107 et l' anticoφs 2C11, les losanges blancs représentent l'évolution de l'activité résiduelle du facteur VIE en présence du mélange entre des concentrations croissantes du peptide contrôle et l'anticorps 2C11.
Le peptide 107 permet de neutraliser l'effet de l'anticorps 2C11.
Figure 3
La figure 3 représente l'effet de l'injection de l'anticoφs 2C11 en absence ou en présence du peptide 107 ou d'un peptide contrôle sur la coagulation sanguine de souris déficientes en facteur VIE et auxquelles on administre du facteur Vm humain.
L'anticoφs 2C11 (16,5 nM) ou un mélange contenant l'anticorps 2C11 (16,5 nM) et le peptide 107 (650 μM) ou un peptide contrôle (700 μM) a été injecté dans la veine de la queue d'une souris « knock out », déficiente en facteur VIE, à raison de 2,5 μg d'anticorps 2C11, 1 mg de peptide 107 et 1 mg de peptide contrôle. Après 30 minutes, 0,5 UI de facteur VIE humain a été injecté et l'activité procoagulante plasmatique a alors été mesurée par un test chromogénique 15 minutes plus tard.
Le pourcentage d'activité résiduelle du facteur VIE est représenté en ordonnée. La barre A représente l'effet de l'injection de facteur VIE sans injection préalable d'anticorps (100%» d'activité résiduelle). La barre B représente l'effet de l'injection de l'anticorps 2C11 seul préalablement à l'injection de facteur Vm. La barre C représente l'effet de l'injection d'un mélange entre l'anticorps 2C11 et le peptide 107 préalablement à l'injection de facteur VIE. La barre D représente l'effet de l'injection d'un mélange entre l'anticorps 2C11 et un peptide contrôle préalablement à l'injection de facteur VIE.
Le peptide 107 neutralise spécifiquement l'effet de l'anticorps 2C11 in vivo.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de leurres peptidiques ou pseudopeptidiques se liant à des anticoφs susceptibles de se développer contre des protéines endogènes dans le cadre de pathologies auto-immunes ou contre des protéines exogènes administrées aux patients, notamment dans le cadre de pathologies dues à une déficience en ces protéines, la séquence en acides aminés desdits leurres peptidiques ou pseudopeptidiques différant de celle des epitopes reconnus par lesdits anticoφs, pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement desdites pathologies auto-immunes, ou à la prévention ou au traitement des troubles liés à l'apparition d'anticorps dirigés contre lesdites protéines exogènes.
2. Utilisation de leurres peptidiques ou pseudopeptidiques selon la revendication 1, comprenant entre environ 6 et environ 20 acides aminés naturels ou non (et de préférence entre environ 8 et environ 16 de ces acides aminés), lesdits leurres étant sélectionnés pour leur capacité à :
- inhiber in vitro et in vivo la liaison d'anticorps à des protéines spécifiquement reconnues par ces derniers dans le cadre de pathologies auto-immunes, ou de pathologies nécessitant l'administration desdites protéines aux patients,
- restaurer in vitro et in vivo l'activité desdites protéines en présence desdits anticoφs.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, de leurres pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement :
- de pathologies auto-immunes telles que :
. la myasthénie gravis,
. l'apparition d'autoanticorps dirigés contre l'insuline,
. l'apparition d'autoanticorps dirigés contre le facteur VEI ou IX dans le cadre de variantes auto-immunes de l'hémophilie A ou B respectivement, notamment chez les femmes enceintes dans le cas de l'hémophilie A,
. l'apparition d'autoanticorps anti-sperme responsables de certains cas d'infertilité,
- ou des troubles liés à l'apparition d' anticoφs dirigés contre les protéines exogènes, ou contre les protéines endogènes recombinantes synthétisées en vue d'une thérapie génique, lesdites protéines étant administrées dans le cadre du traitement de pathologies dues à une déficience en ces protéines, telles que l'hémophilie A ou B.
4. Utilisation de leurres selon l'une des revendications 1 à 3, pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des troubles liés à l'apparition d'anticorps contre le facteur VIE endogène, ou contre le facteur VIE exogène ou dérivés, recombinants ou non, administrés dans le cadre de l'hémophilie A.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, de leurres peptidiques tels qu'obtenus à partir de vecteurs exprimant des banques de peptides.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, de leurres n'ayant aucune homologie, voire une faible homologie comprise entre environ 10% et environ 30%, avec les epitopes desdites protéines reconnus par lesdits anticoφs, lesdits leurres étant encore désignés leurres mimotopiques.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, de leurres mimotopiques du facteur vm.
8. Utilisation selon la revendication 7, de leurres mimotopiques de formule (I) suivante : dans laquelle :
- ni et n2 indépendamment l'un de l'autre représente 0 ou 1,
- Xi et X2 indépendamment l'un de l'autre représente un acide aminé naturel ou non,
- Xa représente une chaîne de 8 à 10 acides aminés naturels ou non.
9. Utilisation, selon la revendication 8, de leurres mimotopiques de formule (I) dans laquelle :
- X\ est choisi parmi Y, E, Q, S, R, A, K, N, ou T,
- X2 est choisi parmi R, T, H, G, S, L, V, P, F, D, K, A, Q ou I.
10. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, de leurres mimotopiques de formule (I) dans laquelle Xa représente la séquence suivante :
NPS I GDKN SEQ E NO : l
11. Utilisation selon la revendication 10, du leurre mimotopique de formule suivante
YCNPSIGDKNCR SEQ ID NO : 2
12. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, de leurres mimotopiques de formule (I) dans laquelle Xa représente la séquence de formule suivante :
(X3) n3-X4~X5-G-K-T-Xg-L dans laquelle :
- n3 représente 0 ou 1 ,
- X3 représente un acide aminé quelconque,
- X4 représente un acide aminé hydrophobe, '
- X5 représente un acide aminé aromatique,
- XÔ représente un acide aminé hydrophobe.
13. Utilisation selon la revendication 12, de leurres mimotopiques caractérisés en ce que
- X3 est choisi parmi I, Q, R, T, ou K,
- » est choisi parmi V, T, L, I, M, F, W, ou Y,
- X5 est choisi parmi F, ou Y,
- X6 est choisi parmi A, M, Y, P, T, ou V,
14. Utilisation selon la revendication 12 ou 13, de leurres mimotopiques de formules suivantes :
ECIVYGKTALCT SEQ ID NO : 3
QCPTFGKTMLCT SEQ E)NO: 4
SCR FGKTYLCH SEQ E)NO: 5
SCTVYGKTPLCG SEQ IDNO: 6
RCKTFGKTTLCS SEQ ID NO : 7
RCTVYGKTVLC SEQ ) NO : 8
15. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, de leurres mimotopiques de formule (I) dans laquelle Xa représente la séquence de formule suivante :
X7 -Xβ - W-Xg -N-R-Xio -Xll - (Xl2) nl2- (Xl3)nl3 dans laquelle :
- nl2 et ni 3 indépendamment l'un de l'autre représentent 0 ou 1,
- X7 à X]3 représentent un acide aminé quelconque, - le cas échéant W est remplacé par F.
16. Utilisation selon la revendication 15, de leurres mimotopiques caractérisés en ce que
- X7 est choisi parmi H, S, T, M, Q, ou G,
- X8 est choisi parmi T, A, K, R, Q, ou E, X9 est choisi parmi S, A, H, F, V, G, ou T,
- Xio est choisi parmi R, K, L, S, H, T, I, ou A,
- Xi j est choisi parmi S, T, V, K, R, Y, M, ou D, X12 est choisi parmi S, R, ou L,
- X13 est choisi parmi I, H, ou W.
17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16, de leurres mimotopiques choisis parmi ceux des formules suivantes :
QCHT SNRRSCL, SEQ ID NO : 9
SCHA SNRRTCR SEQ ID NO: 10
RCHA SNRKSCV SEQ ID NO: 11
CSK ANRLVSIC SEQ ID NO: 12
CSK HNRSKRHC SEQ ) NO: 13
ACTT SNRSKCP SEQ ) NO: 14
ECTR SNRSRCF SEQ ) NO : 15
CMKWSNRSSR C SEQ ID NO: 16
KCGR SNRSSCT SEQ E) NO: 17
CGRWFNRSDLHC SEQ ID NO: 18
ACHE SNRSTCT SEQ ) NO: 19
KCSRWTNRHLCD SEQ E NO : 20
KCTR TNRHLCS SEQ ID NO: 21
KCTR TNRAHCP SEQ IDNO : 22
QCSK VNRSRCA SEQ ID NO : 23
NCQK TNRRTCL SEQ E) NO : 24
QCGR SNRSYCS SEQ IDNO: 25
TCHR GNRTSCQ SEQ ID NO : 26
QCHR ANRISCS SEQ ID NO : 27 RCTQ TNRAYCP SEQ D NO : 28
ACTQ SNRHMCG SEQ ) NO : 29
TCHPFSNRSTCT SEQ ED NO : 30
18. Utilisation selon la revendication 17, du leurre mimotopique de formule suivante :
SCHA SNRRTCR SEQ E) NO: 10
19. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, des leurres mimotopiques de formule suivante :
KCEPDDPWPQCI SEQ ID NO : 31
ACKRNHR GACV SEQ IDNO : 32
ECGSHA GRRCK SEQ E) NO : 33
20. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, de leurres mimotopiques de formule (I) dans laquelle Xa représente la séquence de formule suivante :
(X14) nl4-Xl5~Xl6-H-Xi7- -G-Xi8- (X19) nl9 dans laquelle :
- nl4 et nl9 indépendamment l'un de l'autre représentent 0 ou 1 ,
- X14 à X19 représentent un acide aminé quelconque.
21. Utilisation selon la revendication 20, de leurres mimotopiques caractérisés en ce que :
- X]4 représente K,
- X15 représente R, ou G,
- Xi6 représente N, ou S,
- X]7 représente R, ou A,
- X18 représente A, ou R,
- Xt9 représente R.
22. Utilisation selon les revendications 19 à 20, de leurres mimotopiques de formules suivantes :
ACKRNHRWGACV SEQ ID NO : 34
ECGSHAWGRRCK SEQ ID NO: 35
23. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, de leurres peptidiques correspondant à des epitopes de reconnaissance par les anticoφs présents dans lesdites protéines, dont la séquence peptidique est modifiée par suppression, substitution, ou addition d'au moins un acide aminé, lesdits leurres étant désignés variants epitopiques.
24. Utilisation selon la revendication 23, de variants epitopiques du facteur VIE.
25. Utilisation selon la revendication 24, de variants epitopiques de formule (E) suivante:
(C)nl-X1-X2-X3-L-T-D-S-E-M-D-V-V-R-X4-X5- (C)n2 dans laquelle :
- ni et n2 indépendamment l'un de l'autre représentent 0 ou 1,
- Xi à X représentent un acide aminé quelconque. à l'exception du peptide de formule DDDLTDSEMDVVRFD (SEQ ID NO : 36).
26. Utilisation selon la revendication 25, de variants epitopiques caractérisés en ce que
- X] représente D ou A,
- X2 représente D ou A,
- X3 représente D ou A,
- * représente F, Y, ou W,
- X5 représente D ou A.
27. Utilisation selon la revendication 26, de variants epitopiques de formules suivantes
DDDLTDSEMDVVRFD SEQ E) NO: 37
DDDLTDSEMDVVRYD SEQ ID NO : 38
DDDLTDSEMDVVRWD SEQ E) NO: 39
CDDDLTDSEMDVVRFDC SEQ E) NO : 40
AAALTDSEMDVVRFA SEQ E) NO: 41
28. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend des leurres tels que définis dans l'une des revendication 1 à 27 en association avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables.
29. Séquences peptidiques de formule (I) telles que définies dans l'une des revendications 8 à 22.
30. Séquences peptidiques de formule (E) telles que définies dans l'une des revendications 25 à 28.
31. Produits comprenant :
* au moins une séquence peptidique de formule (I) selon la revendication 29, et/ou au moins une séquence peptidique de formule (E) selon la revendication 30,
* et au moins un composé choisi parmi le facteur VIE extrait, ou recombinant, ou autres produits dérivés d'origine humaine ou animale, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, en thérapie de substitution du facteur VIE, dans le cadre du traitement ou de la prophylaxie des accidents hémorragiques chez les patients atteints d'hémophilie A.
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