CA2316269A1 - Epitopes peptidiques reconnus par des auto-anticorps antifilaggrine presents dans le serum des patients atteints de polyarthrite rhumatoide - Google Patents
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Abstract
L'invention est relative à des peptides comprenant des épitopes reconnus par des auto-anticorps antifilaggrine présents dans le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde. Lesdits épitopes comprennent un motif tripeptidique centré sur un résidu citrulline. L'invention est également relative à des antigènes artificiels comprenant ces épitopes, et à leur utilisation de cet antigène pour le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde.
Description
ÉPITOPES PEPTIDi~UES RECONNUS PAR DES A;.'TO-ANTICORPS
ANTIFILAGGRINE PRÉSENTS DANS LE SÉRUM CES PATIENTS
ATTEINTS DE POLYARTHRITE RHUMATOIDE.
La présente Invention est relative à de nouvelles préparations d'antigènes spécifiquement reconnus par des auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde.
La polyarthrite rhumatoïde (ci après abrégée en " PR ") est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques. I1 s'agit d'une maladie auto immune, et le sérum des patients atteints contient des auto-anticorps dont certains sont spécifiques, et peuvent constituer un marqueur de cette maladie, permettant son diagnostic même à des stades précoces. Des recherches ont donc été effectuées en vue d'identifier des antigènes reconnus par ces anticorps, afin d'en obtenir des préparations purifiées utilisables dans des techniques classiques de diagnostic immunologique.
Des auto-anticorps spécifiquement présents chez les malades atteints de PR et réagissant avec un antigène épithélial oesophagien de rat ont été décrits pour la première fois par B. J. J. YOUNG et al. dans Br.
Med. J. 2:97-99, (1979). Ces auto-anticorps ont été à
l'époque dénommés "anticorps antikératines".
Lors de précédents travaux, l'équipe des Inventeurs a obtenu, à partir d'épithéliums malpighiens humain et murin, des préparations d'antigènes apparentés à la filaggrine et à la profilaggrine, reconnus spécifiquement par les anticorps présents dans le sérum de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, et montré que les " anticorps antikératines " étaient en fait des auto-anticorps anti-filaggrine (ci-après dénommés " AAF "). La Demande EP 0 511 116 décrit ces préparations antigéniques, et leur utilisation pour le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde.
WO 99/35167 1'CT/FR98/02899
ANTIFILAGGRINE PRÉSENTS DANS LE SÉRUM CES PATIENTS
ATTEINTS DE POLYARTHRITE RHUMATOIDE.
La présente Invention est relative à de nouvelles préparations d'antigènes spécifiquement reconnus par des auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde.
La polyarthrite rhumatoïde (ci après abrégée en " PR ") est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques. I1 s'agit d'une maladie auto immune, et le sérum des patients atteints contient des auto-anticorps dont certains sont spécifiques, et peuvent constituer un marqueur de cette maladie, permettant son diagnostic même à des stades précoces. Des recherches ont donc été effectuées en vue d'identifier des antigènes reconnus par ces anticorps, afin d'en obtenir des préparations purifiées utilisables dans des techniques classiques de diagnostic immunologique.
Des auto-anticorps spécifiquement présents chez les malades atteints de PR et réagissant avec un antigène épithélial oesophagien de rat ont été décrits pour la première fois par B. J. J. YOUNG et al. dans Br.
Med. J. 2:97-99, (1979). Ces auto-anticorps ont été à
l'époque dénommés "anticorps antikératines".
Lors de précédents travaux, l'équipe des Inventeurs a obtenu, à partir d'épithéliums malpighiens humain et murin, des préparations d'antigènes apparentés à la filaggrine et à la profilaggrine, reconnus spécifiquement par les anticorps présents dans le sérum de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, et montré que les " anticorps antikératines " étaient en fait des auto-anticorps anti-filaggrine (ci-après dénommés " AAF "). La Demande EP 0 511 116 décrit ces préparations antigéniques, et leur utilisation pour le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde.
WO 99/35167 1'CT/FR98/02899
2 Les filaggrines sont une famille de protéines qui a été identifiée chez diverses espèces, entre autres chez l' homme, le rat, la souris, le cobaye, au niveau des épithéliums malpighiens kératinisants [pour revue sur les filaggrines, cf. DALE et al. [The Keratinocyte Handbook, Cambridge University Press, pp 323-350, (1994)]. Elles dérivent de la déphosphorylation et de la protéolyse d'un précurseur, la profilaggrine, qui est constituée essentiellement de domaines répétés de filaggrine séparés par des segments peptidiques interdomaines.
Le gène codant pour la profilaggrine se compose de sous-unités répétées dont chacune code pour une molécule de filaggrine, séparées par des portions codant pour les segments peptidiques interdomaines.
Toutes les unités de répétition codant pour chacune des filaggrines humaines ont la même longueur (972 paires de base chez l' homme) ; cependant, chez l' homme, on observe des variations importantes (10-15°s) de séquence d'une sous-unité à l'autre. Si la plupart sont conservatives, certaines de ces variations induisent des changements d'acides aminés et dans certains cas des changements de la charge électrique de la protéine. Ainsi les filaggrines humaines forment, indépendamment des modifications post-transcriptionnelles, une population hétérogène de molécules de taille similaire mais de séquences et de charges (pHi égal à 8,3 t 1,1) différentes [GAN et al., Biochem. 29, p. 9432-9440 (1990) j .
La profilaggrine est une protéine de poids moléculaire élevé (environ 400 000 chez l'homme) soluble en présence de fortes concentrations de sels ou d'urée.
Elle possède une forte teneur en acides aminés basiques (arginine et histidine), ainsi qu'en glycine, sérine et acide glutamique. Elle est pauvre en acides aminés non polaires et ne contient ni méthionine, ni cystéine, ni tryptophane. Elle est fortement phosphorylée sur des
Le gène codant pour la profilaggrine se compose de sous-unités répétées dont chacune code pour une molécule de filaggrine, séparées par des portions codant pour les segments peptidiques interdomaines.
Toutes les unités de répétition codant pour chacune des filaggrines humaines ont la même longueur (972 paires de base chez l' homme) ; cependant, chez l' homme, on observe des variations importantes (10-15°s) de séquence d'une sous-unité à l'autre. Si la plupart sont conservatives, certaines de ces variations induisent des changements d'acides aminés et dans certains cas des changements de la charge électrique de la protéine. Ainsi les filaggrines humaines forment, indépendamment des modifications post-transcriptionnelles, une population hétérogène de molécules de taille similaire mais de séquences et de charges (pHi égal à 8,3 t 1,1) différentes [GAN et al., Biochem. 29, p. 9432-9440 (1990) j .
La profilaggrine est une protéine de poids moléculaire élevé (environ 400 000 chez l'homme) soluble en présence de fortes concentrations de sels ou d'urée.
Elle possède une forte teneur en acides aminés basiques (arginine et histidine), ainsi qu'en glycine, sérine et acide glutamique. Elle est pauvre en acides aminés non polaires et ne contient ni méthionine, ni cystéine, ni tryptophane. Elle est fortement phosphorylée sur des
3 résidus sérine, ce qui lui confère un point isoélectrique proche de la neutralité.
La profilaggrine est clivée en unités filaggrine au cours d'un processus complexe de maturation, impliquant une déphosphorylation, suivie d'un clivage par des protéases au niveau des segments interdomaines. Ce clivage génère d'abord des fragments de taille intermédiaire, puis les molécules fonctionnelles de filaggrine.
Les filaggrines issues de la déphosphorylation et du clivage de la profilaggrine sont des protéines basiques dont le contenu en acides aminés est similaire à
celui des profilaggrines. Elles participent à
l'organisation des filaments de kératine, et subissent une maturation progressive au cours de laquelle les résidus arginine, basiques, sont convertis en résidus citrulline, neutres, sous l'action de la peptidylarginine déiminase [HARDING C.R. et SCOTT I.R., J. Mol. Biol. 170, p. 651-673 (1983)]. Ceci entraîne une réduction de leur affinité pour les kératines dont elles se détachent ;
elles sont alors totalement dégradées sous l'action de diverses protéases.
Les propriétés des filaggrines et des profilaggrines ont été particulièrement bien étudiées chez le rat, chez la souris et chez l'homme. La taille de la profilaggrine varie, selon les espèces, de 300 à
400 kD et celle des filaggrines de 27 à 64 kD.
Le polymorphisme observé chez l'homme entre les séquences des unités filaggrine à l'intérieur d'un même gène de profilaggrine n'apparaît pas chez le rat et la souris. Les filaggrines présentent en outre une grande variabilité inter et intra-spécifique au niveau de leur séquence. Cette variabilité n'affecte toutefois pas leurs propriétés fonctionnelles, ni leur composition globale en acides aminés, et leurs propriétés biochimiques. De même, les localisations tissulaires de la profilaggrine et des
La profilaggrine est clivée en unités filaggrine au cours d'un processus complexe de maturation, impliquant une déphosphorylation, suivie d'un clivage par des protéases au niveau des segments interdomaines. Ce clivage génère d'abord des fragments de taille intermédiaire, puis les molécules fonctionnelles de filaggrine.
Les filaggrines issues de la déphosphorylation et du clivage de la profilaggrine sont des protéines basiques dont le contenu en acides aminés est similaire à
celui des profilaggrines. Elles participent à
l'organisation des filaments de kératine, et subissent une maturation progressive au cours de laquelle les résidus arginine, basiques, sont convertis en résidus citrulline, neutres, sous l'action de la peptidylarginine déiminase [HARDING C.R. et SCOTT I.R., J. Mol. Biol. 170, p. 651-673 (1983)]. Ceci entraîne une réduction de leur affinité pour les kératines dont elles se détachent ;
elles sont alors totalement dégradées sous l'action de diverses protéases.
Les propriétés des filaggrines et des profilaggrines ont été particulièrement bien étudiées chez le rat, chez la souris et chez l'homme. La taille de la profilaggrine varie, selon les espèces, de 300 à
400 kD et celle des filaggrines de 27 à 64 kD.
Le polymorphisme observé chez l'homme entre les séquences des unités filaggrine à l'intérieur d'un même gène de profilaggrine n'apparaît pas chez le rat et la souris. Les filaggrines présentent en outre une grande variabilité inter et intra-spécifique au niveau de leur séquence. Cette variabilité n'affecte toutefois pas leurs propriétés fonctionnelles, ni leur composition globale en acides aminés, et leurs propriétés biochimiques. De même, les localisations tissulaires de la profilaggrine et des
4 fi.laggrines sont identiques chez les différents mammifères étudiés.
En poursuivant leurs travaux, les Inventeurs ont constaté que la profilaggrine présente dans les granules de kératohyaline de l'épiderme humain n'était contrairement aux filaggrines, pas reconnue par les AAF[SIMON et al. Clin. Exp. Immunol. 100, 90-98 (1995)).
Ils ont alors testé la réactivité des AAF avec de la filaggrine recombinante, et ont constaté que celle-ci non plus n'était pas reconnue. D'autre part, il avait été
précédemment observé que les formes des filaggrines épidermiques humaines principalement reconnues par les AAF étaient les formes acido-neutres décrites par SIMON
et al. [J. Clin. Invest., 92, 1387, (1993)] et dans la demande EP 0 511 116. Le tait que ces formes acido-neutres correspondent à un stade tardif de maturation de la filaggrine, permettait de supposer que tout ou partie des modifications post-traductionnelles intervenant jusqu'à ce stade étaient impliquées dans la formation des épitoges reconnus par les AAF.
Pour vérifier cette hypothèse, les Inventeurs ont cherché à reproduire in vitro, à partir de filaggrine recombinante, ces modifications post-traductionnelles, afin de déterminer lesquelles étaient susceptibles d'influer sur l'antigénicité de la filaggrine.
Ils ont ainsi constaté qu'en fait, la citrullination de la filaggrine suffisait à générer des épitoges reconnus par les AAF. En effet, ils ont observé, en procédant à la déimination in vitro de filaggrine recombinante que le remplacement d'au moins une partie des arginines par des citrullines permet l'obtention d'un antigène reconnu spécifiquement par les AAF présents dans le sérum des patients atteints de PR. Ils ont en outre localisé des régions qui étaient après citrullination, fortement immunoréactives vis-à-vis des auto-anticorps anti-filaggrine. I1 s'agit en particulier de la région S
correspondant à la portion C-terminale (acides aminés 144 à 324) et en particulier aux acides aminés 144 à 314, ainsi que de la région correspondant aux aciàes aminés 76 à 144, et de la région correspondant aux acides aminés 71 à 119 d'une unité de filaggrine humaine. Ces travaux ont abouti à l'obtention d'antigènes artificiels reconnus spécifiquement par les AAF présents dans le sérum des patients atteints de PR, et constitués par des polypeptides recombinants ou de synthèse, dérivés de la séquence de la filaggrine, ou de portions de celle-ci, par substitution d'au moins un résidu arginine par un résidu citrulline. Ces antigènes, ainsi que leur utilisation, font l'objet de la Demande FR FR 96 10651, déposée le 30 août 1996 au nom de BIOMÉRIEUX.
En poursuivant leur travaux, les Inventeurs sont parvenus à sélectionner à partir de la séquence d'une unité filaggrine, des peptides dans lesquels la substitution d'au moins un résidu arginine par un résidu citrulline donnait naissance à des épitopes reconnus spécifiquement par les AAF présents dans le sérum des patients atteints de PR.
Les séquences de ces peptides sont identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0: 5, SEQ ID N0: 6.
On entend par . '~ unité filaggrine ", un polypeptide dont la séquence est celle du produit de traduction de l'une quelconque des sous-unités codant pour un domaine filaggrine du gène de la profilaggrine humaine ou d'une autre espèce, ou bien est une séquence consensus, séquence théorique obtenue à partir des séquences des domaines filaggrine.
Les Inventeurs ont maintenant identifié des épitoges reconnus par les auto-anticorps anti-filaggrine . ces épitoges comprennent un motif tripeptidique centré sur un résidu citrulline, spécifiquement présent sur les peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0: 6, et absent de la séquence SEQ ID N0: 4.
I1 s'agit en particulier du motif tripeptidique Ser-Cit-His, dans lequel Cit représente un résidu citrulline.
La présente Invention a pour objet un peptide constituant un épitope reconnu par des autoanticorps anti-filaggrine présents dans le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, caractérisé en ce l0 que ledit épitope comprend un motif tripeptidique centré
sur un résidu citrulline, spécifiquement présent sur au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit peptide comprend au moins un motif pentapeptidique centré sur un résidu citrulline, présent sur au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0: 6.
Avantageusement, ledit peptide comprend le motif tripeptidique Ser-Cit-His, dans lequel Cit représente un résidu citrulline.
A titre .d'exemple, on citera des peptides dérivés, par citrullination, de peptides qui comprennent ie motif pentapeptidique, Xl-Ser-Arg-His-X2 dans lequel X1=Ser ou Gly, et X2=Ser ou Pro, et parmi ceux-ci, des peptides qui comprennent le motif hexapeptidique XO-X1-Ser-Arg-His-X2, ou le motif heptapeptidique XO-X1-Ser-Arg-His-X2-X3, dans lesquels X1 et X2 sont tels que définis ci-dessus, XO=Asp, et X3=Gly ou Arg.
Les peptides conformes à l'invention permettent la préparation d'antigènes artificiels reconnus spécifiquement par les auto-anticorps anti-filaggrine présents dans le sérum de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde. Ces antigènes artificiels font également partie de l'objet de la présente invention.
Des antigènes artificiels conformes à
l'invention comprennent au moins un épitope peptidique centré sur un résidu citrulline, tel que défini ci-dessus. Ils sont par exemple constitués par des peptides d'au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés, et avantageusement au moins 14 acides aminés. I1 peut s'agir de peptides constitués par au moins un fragment d'au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquence s SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou contenant au moins un tel fragment. Ces peptides peuvent comprendre plusieurs épitopes citrullinés spécifiquement reconnûs par les AAF, de séquences identiques ou différentes.
Le terme "peptide" tel qu'utilisé dans la présente Demande signifie notamment protéine ou fragment de protéine, oligopeptide, extrait, séparé ou substantiellement isolé ou synthétisé, notamment ceux obtenus par synthèse chimique ou par expression dans un organisme recombinant ; tout peptide dans la séquence duquel un ou plusieurs acides aminés de la série L sont remplacés par un acide aminé de la série D, et vice-versa ; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH, et avantageusement toutes les liaisons CO-NH de la chaîne peptidique est (sont) remplacées) par une (des) liaisons NH-CO ; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH et avantageusement toutes les liaisons CO-NH est ou sont remplacées) par une ou des liaisons) NH-C0, la chiralité de chaque résidu aminoacyle, qu'il soit impliqué ou non dans une ou plusieurs liaisons CO-NH sus-mentionnées, étant soit conservée, soit inversée par rapport aux résidus aminoacyles constituant un peptide de référence, ces composés étant encore désignés immunorétroïdes, un mimotope, etc.
Des antigènes conformes à l'invention peuvent par exemple étre obtenus par action de la PAD (peptidyl arginine déiminase) sur des protéines ou des peptides S
naturels, recombinants, ou de synthèse, comportant des résidus arginine, et en particulier comprenant au moins un résidu arginine constituant le centre d'un motif tripeptidique identique à ceux présents dans les S séquences SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 5, SEQ ID N0: 6 ; ils peuvent également être obtenus par synthèse peptidique, en incorporant directement un ou plusieurs résidus citrulline, et de préférence, un ou plusieurs épitoges comprenant un résidu citrulline, tels que définis ci-l0 dessus, dans le peptide synthétisé.
La présente Invention a également pour objet l'utilisation des antigènes conformes à l'invention, tels que définis ci-dessus, pour le diagnostic in vitro de la PR.
15 La présente invention englobe en particulier des compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence d'auto-anticorps spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, lesquelles compositions sont caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un 20 antigène conforme à l'invention, éventuellement marqué
et/cu conjugué avec une molécule porteuse.
La présente Invention a également pour objet un procédé de détection des auto-anticorps de classe G
spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, 25 lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend .
- la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un antigène conforme à l'Invention, tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les auto-anticorps 30 spécifiques de la PR éventuellement présents ;
- la détection, par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
Ce procédé de détection peut être mis en oeuvre grâce à un nécessaire comprenant au moins un 35 antigène selon l'Invention, ainsi que des tampons et réactifs appropriés pour la constitution d'un milieu réactionnel permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, et/ou des moyens de détection dudit complexe antigène/anticorps.
Ledit nécessaire peut également comprendre, le cas échéant, des échantillons de référence, tels qu'un ou plusieurs sérums) négatifs) et un ou plusieurs sérums) positif(s).
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et de mise en ceuvre d'antigènes conformes à l'invention.
EXEMPLE 1 . DEIMINATION IN VITRO DE FILAGGRINE
RECOMBINANTE PAR LA PEPTIDYL ARGININE DEIMINASE (P.A.D.).
De la filaggrine recombinante est produite selon le protocole suivant .
Un fragment d'ADN codant pour une unité
filaggrine est amplifié par PCR, à partir d'ADN génomique humain (cellules RAJI . ATCC CCL86) à l'aide des 2 amorces suivantes .
Amorce 5' .
En poursuivant leurs travaux, les Inventeurs ont constaté que la profilaggrine présente dans les granules de kératohyaline de l'épiderme humain n'était contrairement aux filaggrines, pas reconnue par les AAF[SIMON et al. Clin. Exp. Immunol. 100, 90-98 (1995)).
Ils ont alors testé la réactivité des AAF avec de la filaggrine recombinante, et ont constaté que celle-ci non plus n'était pas reconnue. D'autre part, il avait été
précédemment observé que les formes des filaggrines épidermiques humaines principalement reconnues par les AAF étaient les formes acido-neutres décrites par SIMON
et al. [J. Clin. Invest., 92, 1387, (1993)] et dans la demande EP 0 511 116. Le tait que ces formes acido-neutres correspondent à un stade tardif de maturation de la filaggrine, permettait de supposer que tout ou partie des modifications post-traductionnelles intervenant jusqu'à ce stade étaient impliquées dans la formation des épitoges reconnus par les AAF.
Pour vérifier cette hypothèse, les Inventeurs ont cherché à reproduire in vitro, à partir de filaggrine recombinante, ces modifications post-traductionnelles, afin de déterminer lesquelles étaient susceptibles d'influer sur l'antigénicité de la filaggrine.
Ils ont ainsi constaté qu'en fait, la citrullination de la filaggrine suffisait à générer des épitoges reconnus par les AAF. En effet, ils ont observé, en procédant à la déimination in vitro de filaggrine recombinante que le remplacement d'au moins une partie des arginines par des citrullines permet l'obtention d'un antigène reconnu spécifiquement par les AAF présents dans le sérum des patients atteints de PR. Ils ont en outre localisé des régions qui étaient après citrullination, fortement immunoréactives vis-à-vis des auto-anticorps anti-filaggrine. I1 s'agit en particulier de la région S
correspondant à la portion C-terminale (acides aminés 144 à 324) et en particulier aux acides aminés 144 à 314, ainsi que de la région correspondant aux aciàes aminés 76 à 144, et de la région correspondant aux acides aminés 71 à 119 d'une unité de filaggrine humaine. Ces travaux ont abouti à l'obtention d'antigènes artificiels reconnus spécifiquement par les AAF présents dans le sérum des patients atteints de PR, et constitués par des polypeptides recombinants ou de synthèse, dérivés de la séquence de la filaggrine, ou de portions de celle-ci, par substitution d'au moins un résidu arginine par un résidu citrulline. Ces antigènes, ainsi que leur utilisation, font l'objet de la Demande FR FR 96 10651, déposée le 30 août 1996 au nom de BIOMÉRIEUX.
En poursuivant leur travaux, les Inventeurs sont parvenus à sélectionner à partir de la séquence d'une unité filaggrine, des peptides dans lesquels la substitution d'au moins un résidu arginine par un résidu citrulline donnait naissance à des épitopes reconnus spécifiquement par les AAF présents dans le sérum des patients atteints de PR.
Les séquences de ces peptides sont identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0: 5, SEQ ID N0: 6.
On entend par . '~ unité filaggrine ", un polypeptide dont la séquence est celle du produit de traduction de l'une quelconque des sous-unités codant pour un domaine filaggrine du gène de la profilaggrine humaine ou d'une autre espèce, ou bien est une séquence consensus, séquence théorique obtenue à partir des séquences des domaines filaggrine.
Les Inventeurs ont maintenant identifié des épitoges reconnus par les auto-anticorps anti-filaggrine . ces épitoges comprennent un motif tripeptidique centré sur un résidu citrulline, spécifiquement présent sur les peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0: 6, et absent de la séquence SEQ ID N0: 4.
I1 s'agit en particulier du motif tripeptidique Ser-Cit-His, dans lequel Cit représente un résidu citrulline.
La présente Invention a pour objet un peptide constituant un épitope reconnu par des autoanticorps anti-filaggrine présents dans le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, caractérisé en ce l0 que ledit épitope comprend un motif tripeptidique centré
sur un résidu citrulline, spécifiquement présent sur au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit peptide comprend au moins un motif pentapeptidique centré sur un résidu citrulline, présent sur au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0: 6.
Avantageusement, ledit peptide comprend le motif tripeptidique Ser-Cit-His, dans lequel Cit représente un résidu citrulline.
A titre .d'exemple, on citera des peptides dérivés, par citrullination, de peptides qui comprennent ie motif pentapeptidique, Xl-Ser-Arg-His-X2 dans lequel X1=Ser ou Gly, et X2=Ser ou Pro, et parmi ceux-ci, des peptides qui comprennent le motif hexapeptidique XO-X1-Ser-Arg-His-X2, ou le motif heptapeptidique XO-X1-Ser-Arg-His-X2-X3, dans lesquels X1 et X2 sont tels que définis ci-dessus, XO=Asp, et X3=Gly ou Arg.
Les peptides conformes à l'invention permettent la préparation d'antigènes artificiels reconnus spécifiquement par les auto-anticorps anti-filaggrine présents dans le sérum de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde. Ces antigènes artificiels font également partie de l'objet de la présente invention.
Des antigènes artificiels conformes à
l'invention comprennent au moins un épitope peptidique centré sur un résidu citrulline, tel que défini ci-dessus. Ils sont par exemple constitués par des peptides d'au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés, et avantageusement au moins 14 acides aminés. I1 peut s'agir de peptides constitués par au moins un fragment d'au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquence s SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou contenant au moins un tel fragment. Ces peptides peuvent comprendre plusieurs épitopes citrullinés spécifiquement reconnûs par les AAF, de séquences identiques ou différentes.
Le terme "peptide" tel qu'utilisé dans la présente Demande signifie notamment protéine ou fragment de protéine, oligopeptide, extrait, séparé ou substantiellement isolé ou synthétisé, notamment ceux obtenus par synthèse chimique ou par expression dans un organisme recombinant ; tout peptide dans la séquence duquel un ou plusieurs acides aminés de la série L sont remplacés par un acide aminé de la série D, et vice-versa ; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH, et avantageusement toutes les liaisons CO-NH de la chaîne peptidique est (sont) remplacées) par une (des) liaisons NH-CO ; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH et avantageusement toutes les liaisons CO-NH est ou sont remplacées) par une ou des liaisons) NH-C0, la chiralité de chaque résidu aminoacyle, qu'il soit impliqué ou non dans une ou plusieurs liaisons CO-NH sus-mentionnées, étant soit conservée, soit inversée par rapport aux résidus aminoacyles constituant un peptide de référence, ces composés étant encore désignés immunorétroïdes, un mimotope, etc.
Des antigènes conformes à l'invention peuvent par exemple étre obtenus par action de la PAD (peptidyl arginine déiminase) sur des protéines ou des peptides S
naturels, recombinants, ou de synthèse, comportant des résidus arginine, et en particulier comprenant au moins un résidu arginine constituant le centre d'un motif tripeptidique identique à ceux présents dans les S séquences SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 5, SEQ ID N0: 6 ; ils peuvent également être obtenus par synthèse peptidique, en incorporant directement un ou plusieurs résidus citrulline, et de préférence, un ou plusieurs épitoges comprenant un résidu citrulline, tels que définis ci-l0 dessus, dans le peptide synthétisé.
La présente Invention a également pour objet l'utilisation des antigènes conformes à l'invention, tels que définis ci-dessus, pour le diagnostic in vitro de la PR.
15 La présente invention englobe en particulier des compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence d'auto-anticorps spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, lesquelles compositions sont caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un 20 antigène conforme à l'invention, éventuellement marqué
et/cu conjugué avec une molécule porteuse.
La présente Invention a également pour objet un procédé de détection des auto-anticorps de classe G
spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, 25 lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend .
- la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un antigène conforme à l'Invention, tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les auto-anticorps 30 spécifiques de la PR éventuellement présents ;
- la détection, par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
Ce procédé de détection peut être mis en oeuvre grâce à un nécessaire comprenant au moins un 35 antigène selon l'Invention, ainsi que des tampons et réactifs appropriés pour la constitution d'un milieu réactionnel permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, et/ou des moyens de détection dudit complexe antigène/anticorps.
Ledit nécessaire peut également comprendre, le cas échéant, des échantillons de référence, tels qu'un ou plusieurs sérums) négatifs) et un ou plusieurs sérums) positif(s).
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et de mise en ceuvre d'antigènes conformes à l'invention.
EXEMPLE 1 . DEIMINATION IN VITRO DE FILAGGRINE
RECOMBINANTE PAR LA PEPTIDYL ARGININE DEIMINASE (P.A.D.).
De la filaggrine recombinante est produite selon le protocole suivant .
Un fragment d'ADN codant pour une unité
filaggrine est amplifié par PCR, à partir d'ADN génomique humain (cellules RAJI . ATCC CCL86) à l'aide des 2 amorces suivantes .
Amorce 5' .
5' TTCCTATACCAGGTGAGCACTCAT 3' Amorce 3' .
5' AGACCCTGAACGTCCAGACCGTCCC 3' Le produit d'amplification est cloné dans le site SmaI du vecteur pUCl9. On procède à la sélection des clones recombinants, en vérifiant la présence d'un insert de 972 pb obtenu après digestion avec SacI et XbaI. Cet insert est ensuite sous-cloné dans pUCl9. L'insert résultant de ce sous-clonage est ensuite transféré dans le vecteur pGEX (commercialisé par la société PHARMACIA), entre les sites EcoRI et HindIII. Le vecteur d'expression ainsi obtenu exprime, dans E. coli, la filaggrine en fusion avec la glutathion-S-transférase (GST), sous contrôle du promoteur procaryote Tac. La synthèse de la protéine recombinante est induite par addition d'isopropyl-(3-D-galactoside (IPTG) à la culture.
La filaggrine recombinante ainsi obtenue sera dénommée ci-après . " fil-gst ".
On constate après électrophorëse, l'existence de 9 fragments qui résultent d'une protéolyse post 5 traductionnelle de la filaggrine entière.
Le mélange des 9 fragments est soumis à une déimination in vitro par la peptidyl arginine déiminase.
On utilise une préparation de peptidyl arginine déiminase de muscle de lapin (681 U/ml) l0 commercialisée par TAKARA BIOMED EUROPE, selon le protocole préconisé par le fabricant.
Les conditions opératoires sont les suivantes .
- Milieu réactionnel . Tris-HC1 0,1 M, CaCl2 10 mM, DTT 5 mM, pH 7,4 ;
- Rapport enzyme/substrat . 140 mU/~mole de filaggrine contenant 10% d'arginine soit 4 mU/~mole d'arginine ;
- Incubation . entre 0 et 60 mn à 50°C ;
Arrêt de la réaction . chauffage 3 mn en tampon de LAEMMLI
On effectue en parallèle les 8 réactions suivantes.
(1) BSA (sérum albumine bovine) incubée dans milieu réactionnel (lh, 50°C) sans P.A.D.
(2) BSA incubée dans milieu réactionnel (lh, 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
(3) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (lh, 50°C) sans P.A.D.
(4) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (5 minutes à 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
(5) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (15 minutes à 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
5' AGACCCTGAACGTCCAGACCGTCCC 3' Le produit d'amplification est cloné dans le site SmaI du vecteur pUCl9. On procède à la sélection des clones recombinants, en vérifiant la présence d'un insert de 972 pb obtenu après digestion avec SacI et XbaI. Cet insert est ensuite sous-cloné dans pUCl9. L'insert résultant de ce sous-clonage est ensuite transféré dans le vecteur pGEX (commercialisé par la société PHARMACIA), entre les sites EcoRI et HindIII. Le vecteur d'expression ainsi obtenu exprime, dans E. coli, la filaggrine en fusion avec la glutathion-S-transférase (GST), sous contrôle du promoteur procaryote Tac. La synthèse de la protéine recombinante est induite par addition d'isopropyl-(3-D-galactoside (IPTG) à la culture.
La filaggrine recombinante ainsi obtenue sera dénommée ci-après . " fil-gst ".
On constate après électrophorëse, l'existence de 9 fragments qui résultent d'une protéolyse post 5 traductionnelle de la filaggrine entière.
Le mélange des 9 fragments est soumis à une déimination in vitro par la peptidyl arginine déiminase.
On utilise une préparation de peptidyl arginine déiminase de muscle de lapin (681 U/ml) l0 commercialisée par TAKARA BIOMED EUROPE, selon le protocole préconisé par le fabricant.
Les conditions opératoires sont les suivantes .
- Milieu réactionnel . Tris-HC1 0,1 M, CaCl2 10 mM, DTT 5 mM, pH 7,4 ;
- Rapport enzyme/substrat . 140 mU/~mole de filaggrine contenant 10% d'arginine soit 4 mU/~mole d'arginine ;
- Incubation . entre 0 et 60 mn à 50°C ;
Arrêt de la réaction . chauffage 3 mn en tampon de LAEMMLI
On effectue en parallèle les 8 réactions suivantes.
(1) BSA (sérum albumine bovine) incubée dans milieu réactionnel (lh, 50°C) sans P.A.D.
(2) BSA incubée dans milieu réactionnel (lh, 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
(3) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (lh, 50°C) sans P.A.D.
(4) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (5 minutes à 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
(5) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (15 minutes à 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
(6) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (30 minutes à 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
7 PCT/FR98/02899 (7) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (lh à 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
(8) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (lh à 50°C) avec 60 mU de P.A.D. et en présence de 10 mM
de N-éthylmaléimide (inhibiteur de la P.A.D.).
On dépose 1 ~1 de chaque échantillon sur un gel d'électrophorèse (gel PHAST°-SDS 12,5ô, PHARMACIA), et on réalise l'électrophorèse avec l'appareil PHAST-SYSTEM°
(PHARMACIA), dans les conditions préconisées par le l0 fabricant. Après transfert sur nitrocellulose, on révèle soit avec un pool de 5 sérums de patients atteints de PR , dilué au 1/2000 soit avec l'anticorps monoclonal anti-filaggrine AHF2 [SIMON et al. J. Invest. Dermatol.
105, 432, (1995)] à la concentration de 0,2 ~g/ml.
Le complexe antigène/anticorps est révélé à
l'aide d'un anticorps secondaire couplé à la peroxydase, par la technique ECL.
Les résultats montrent qu'en l'absence de réaction de citrullination, la fil-gst n'est pas reconnue par les sérums de patients atteints de PR, alors que dès 5 minutes de citrullination, elle est détectée par ces sérums. Or. constate une augmentation de la réactivité
avec le pool de sérums quand on fait agir la P.A.D.
pendant 60 minutes à 50°C.
En outre, ces résultats permettent de supposer qu'il existe un ou plusieurs épitopes de forte affinité
dans la moitié COOH-terminale de la filaggrine (positions 144 à 324), cet ou ces épitope(s) étant répétés) entre les positions 76 et 149.
E~I,E 2 . CITRULLINATION DES PEPTIDES S-47-S ET S-35-R
PAR LA P.A.D, ET ESSAI DE LA RÉACTIVITÉ DES PEPTIDES
CITRULLINÉS.
Le peptide de 49 acides aminés S-47-S de séquence (code 1 lettre) .
correspondant aux acides aminés 71 à 119 de la séquence d'une unité àe filaggrine humaine, et comportant 6 résidus arginine, et le peptide de 37 acides aminés S-35-R de séquence (code 1 lettre) .
NH~-SQDP,DSQAQSEDSERRSASASRNHRGSAQEQSRDGSR-COOH
correspondant aux acides aminés 155 à 191 de la séquence d'une unité de filaggrine humaine, et comportant 7 résidus arginine, ont été préparés par l0 synthèse peptidique. Les peptides S-47-S et S-35-R sont représentés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID N0: 3 et SEQ ID N0: 4.
Ces 2 peptides, ainsi que la fil-gst, ont été
citrullinés par action de la P.A.D., pendant 30 minutes à
50°C, dans le même milieu réactionnel que celui indiqué à
l'exemple 1. Les conditions spécifiques pour chaque peptide, et pour la fil-gst sont les suivantes .
- peptide S-97-S . 4 mU/~mole arginine - peptide S-35-R . 2,7 mU/~.mole arginine - fil-gst . comme indiqué à l'exemple 2.
On compare, par " dot-blot ", la réactivité de chaque peptide et celle de la fil-gst, avant et après action de l'enzyme, vis-à-vis de l'anticorps monocîonal AHF4, et du sérum d'un patient atteint de PR.
Les conditions opératoires sont les suivantes .
- 0,5 ~g par dépôt de chaque antigène (peptides, fil-gst, variants acido-neutres de la filaggrine (VAF)) - Traitement de la nitrocellulose 45 minutes à
80°C, avant immunodétection.
- sérum PR utilisé à la dilution de 1/2000 ;
anticorps monoclonal AHF4 utilisé à une concentration de 0,2 ~g/ml Les résultats montrent que .
- AHF4 reconnaît le peptide S-47-~ et la fil-gst citrullinés ou non, mais ne reconnaît pas S-35-R, citrulliné ou non.
- S-47-S est reconnu, après ci~rullination, par le sérum du patient atteint de PR, alors que S-35-R, citrulliné ou non, n'est pas reconnu. Le même sérum reconnaît par ailleurs les VAF et la fil-gst citrullinée, mais ne reconnaît pas la fil-gst non-citrullinée.
E7~LE 3 . SYNTHESE DES PEPTIDES E-12-H ET E-12-D
CITRULLINES ET NON CITRULLINES ET ESSAI DE LA REACTIVITE
DES PEPTIDES.
Les peptides E-12-H et E-12-D ont été
déterminés par référence aux séquences nucléotidiques du gène de la profilaggrine humaine décrites pa= GAN S.Q et al. [Biochemistry, 29 . 9432-9440, (1990)].
Le peptide de 14 acides aminés E-12-H de séquence (code 1 lettre) .
comprend 1 résidu arginine, et le peptide de 14 acides aminés E-12-D de séquence (code 1 lettre) .
NHZ-ESSRDGSRHPRSHD-COOH
comprend 3 résidus arginine.
Les peptides E-12-H et E-12-D sont représentés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID N0: 5 et SEQ ID N0: 6.
Ces peptides ont été préparés par synthèse peptidique en phase solide.
Les peptides E-12-H et E-12-D citrullinés ont été synthétisés directement par incorporation d'une citrulline en remplacement d'une arginine.
Pour le peptide E-12-D, seul le résidu arginine correspondant au Home acide aminé de la séquence a été remplacé par une citrulline lors de la synthèse peptidique.
La réactivité de chaque peptide citrulliné et non citrulliné a été testée respectivement vis-à-vis d'ur.
sérum normal, de deux sérums de patients PR, d'anticorps anti-filaggrine (AFAs) purifiés à partir d'un pool de 45 sérums de patients PR et d'anticorps anti-filaggrine purifiés à partir de 12 sérums de patients PR.
PROTOCOLE EXPERIMENTAL .
Les puits de plaques de microtitration NUNC
MAXISORP ont été revêtus respectivement à l'aide des peptides E-î2-D et E-12-H non-citrullinés et citrullinés, dilués à une concentration de 5 ~.g/ml dans un tampon PBS
(pH: 7,4) et incubés pendant une nuit à 4°C (volume final . 100 ~g/puits). Les puits ont été saturés pendant 30 minutes à 37°C en PBS-Tween 20, 0,05% gélatine 2,5%, 200 ~.1/puits. Le sérum de contrôle négatif (sérum normal) a été dilué au 1/120. Les anticorps anti-filaggrine ont été dilués en PBS-Tween 20, 0,05%-gélatine 0,5% (PBS TG) de sorte que les concentrations finales en auto-anticorps anti-filaggrine soient celles indiquées dans le tableau I
annexé. Le sérum de contrôle négatif, les sérums PR et les anticorps anti-filaggrine ont été ajoutés (volume final . 100 ~1/puits) et soumis à incubation pendant 1 heure à 37°C et une nuit à 4°C. Des anticorps de chèvre anti-chaînes lourdes gamma des immunoglobulines humaines, marqués à la peroxydase (commercialisés par la société
SOUTHERN BIOTECHNOLOGIES) ont été ajoutés dans chaque puits (dilution en PBSTG . 1/2000, volume final 100 ~1/puits) et soumis à incubation pendant 1 heure à
37°C. La révélation a été effectuée par addition d'ortho-3o phénylènediamine (2mg/ml, pendant 10 minutes).
Les résultats présentés dans le tableau I
annexé sont donnés en rapport de DO à 492 nm . signal peptide citrulliné/signal peptide non-citrulliné.
Ces résultats montent que, dans la majorité
des cas, le rapport en DO peptide citrulliné/peptide non citrulliné est supérieur à 1, et illustrent donc la bonne 1~
sensibilité des peptides citrullinés par rapport aux peptides non-citrullinés pour leur réactivité vis-à-vis des autoanticorps anti-filaggrine.
LISTE DE SQUENCES
<110> BIOMERIEUX
SERRE, Guy GIRBAL-NEUHAUSER, lisabeth VINCENT, Christian SIMON, Michel SEBBAG, Mireille DALBON, Pascal JOLIVET-REYNAUD, Colette ARNAUD, Michel JOLIVET, Michel <120> EPITOPES PEPTIDIQUES RECONNUS PAR DES AUTO-ANTICORPS
ANTIFILAGGRINE PRSENTS DANS LE SRUM DES PATIENTS
ATTEINTS DE POLYARTHRT_TE RHUMATOIDE
<130> MJPcb1067/la <140>
<141>
<150> FR9716673 <151> 1997-12-30 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 29 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 1 ttcctatacc aggtgagcac tcat <210> 2 <211> 25 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 2 agaccctgaa cgtccagacc gtccc <210> 3 <211> 99 <212>
<213> Homo sapiens <400> 3 stghsgsqhs htttqgrsda srgssgsrst sretrdqeqs gdgsrhsgs49 <210> 9 <211> 37 <212>
<213> Homo sapiens <400> 9 sqdrdsqaqs edserrsasa srnhrgsaqe qsrdgsr <210> 5 <2I1> 14 <212>
<213> Homo sapiens <400> 5 eqsadssrhs gsgh 1q <210> 6 <211> 19 <212>
<213> Homo sapiens <400> 6 essrdgsrhp rshd 14
de N-éthylmaléimide (inhibiteur de la P.A.D.).
On dépose 1 ~1 de chaque échantillon sur un gel d'électrophorèse (gel PHAST°-SDS 12,5ô, PHARMACIA), et on réalise l'électrophorèse avec l'appareil PHAST-SYSTEM°
(PHARMACIA), dans les conditions préconisées par le l0 fabricant. Après transfert sur nitrocellulose, on révèle soit avec un pool de 5 sérums de patients atteints de PR , dilué au 1/2000 soit avec l'anticorps monoclonal anti-filaggrine AHF2 [SIMON et al. J. Invest. Dermatol.
105, 432, (1995)] à la concentration de 0,2 ~g/ml.
Le complexe antigène/anticorps est révélé à
l'aide d'un anticorps secondaire couplé à la peroxydase, par la technique ECL.
Les résultats montrent qu'en l'absence de réaction de citrullination, la fil-gst n'est pas reconnue par les sérums de patients atteints de PR, alors que dès 5 minutes de citrullination, elle est détectée par ces sérums. Or. constate une augmentation de la réactivité
avec le pool de sérums quand on fait agir la P.A.D.
pendant 60 minutes à 50°C.
En outre, ces résultats permettent de supposer qu'il existe un ou plusieurs épitopes de forte affinité
dans la moitié COOH-terminale de la filaggrine (positions 144 à 324), cet ou ces épitope(s) étant répétés) entre les positions 76 et 149.
E~I,E 2 . CITRULLINATION DES PEPTIDES S-47-S ET S-35-R
PAR LA P.A.D, ET ESSAI DE LA RÉACTIVITÉ DES PEPTIDES
CITRULLINÉS.
Le peptide de 49 acides aminés S-47-S de séquence (code 1 lettre) .
correspondant aux acides aminés 71 à 119 de la séquence d'une unité àe filaggrine humaine, et comportant 6 résidus arginine, et le peptide de 37 acides aminés S-35-R de séquence (code 1 lettre) .
NH~-SQDP,DSQAQSEDSERRSASASRNHRGSAQEQSRDGSR-COOH
correspondant aux acides aminés 155 à 191 de la séquence d'une unité de filaggrine humaine, et comportant 7 résidus arginine, ont été préparés par l0 synthèse peptidique. Les peptides S-47-S et S-35-R sont représentés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID N0: 3 et SEQ ID N0: 4.
Ces 2 peptides, ainsi que la fil-gst, ont été
citrullinés par action de la P.A.D., pendant 30 minutes à
50°C, dans le même milieu réactionnel que celui indiqué à
l'exemple 1. Les conditions spécifiques pour chaque peptide, et pour la fil-gst sont les suivantes .
- peptide S-97-S . 4 mU/~mole arginine - peptide S-35-R . 2,7 mU/~.mole arginine - fil-gst . comme indiqué à l'exemple 2.
On compare, par " dot-blot ", la réactivité de chaque peptide et celle de la fil-gst, avant et après action de l'enzyme, vis-à-vis de l'anticorps monocîonal AHF4, et du sérum d'un patient atteint de PR.
Les conditions opératoires sont les suivantes .
- 0,5 ~g par dépôt de chaque antigène (peptides, fil-gst, variants acido-neutres de la filaggrine (VAF)) - Traitement de la nitrocellulose 45 minutes à
80°C, avant immunodétection.
- sérum PR utilisé à la dilution de 1/2000 ;
anticorps monoclonal AHF4 utilisé à une concentration de 0,2 ~g/ml Les résultats montrent que .
- AHF4 reconnaît le peptide S-47-~ et la fil-gst citrullinés ou non, mais ne reconnaît pas S-35-R, citrulliné ou non.
- S-47-S est reconnu, après ci~rullination, par le sérum du patient atteint de PR, alors que S-35-R, citrulliné ou non, n'est pas reconnu. Le même sérum reconnaît par ailleurs les VAF et la fil-gst citrullinée, mais ne reconnaît pas la fil-gst non-citrullinée.
E7~LE 3 . SYNTHESE DES PEPTIDES E-12-H ET E-12-D
CITRULLINES ET NON CITRULLINES ET ESSAI DE LA REACTIVITE
DES PEPTIDES.
Les peptides E-12-H et E-12-D ont été
déterminés par référence aux séquences nucléotidiques du gène de la profilaggrine humaine décrites pa= GAN S.Q et al. [Biochemistry, 29 . 9432-9440, (1990)].
Le peptide de 14 acides aminés E-12-H de séquence (code 1 lettre) .
comprend 1 résidu arginine, et le peptide de 14 acides aminés E-12-D de séquence (code 1 lettre) .
NHZ-ESSRDGSRHPRSHD-COOH
comprend 3 résidus arginine.
Les peptides E-12-H et E-12-D sont représentés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID N0: 5 et SEQ ID N0: 6.
Ces peptides ont été préparés par synthèse peptidique en phase solide.
Les peptides E-12-H et E-12-D citrullinés ont été synthétisés directement par incorporation d'une citrulline en remplacement d'une arginine.
Pour le peptide E-12-D, seul le résidu arginine correspondant au Home acide aminé de la séquence a été remplacé par une citrulline lors de la synthèse peptidique.
La réactivité de chaque peptide citrulliné et non citrulliné a été testée respectivement vis-à-vis d'ur.
sérum normal, de deux sérums de patients PR, d'anticorps anti-filaggrine (AFAs) purifiés à partir d'un pool de 45 sérums de patients PR et d'anticorps anti-filaggrine purifiés à partir de 12 sérums de patients PR.
PROTOCOLE EXPERIMENTAL .
Les puits de plaques de microtitration NUNC
MAXISORP ont été revêtus respectivement à l'aide des peptides E-î2-D et E-12-H non-citrullinés et citrullinés, dilués à une concentration de 5 ~.g/ml dans un tampon PBS
(pH: 7,4) et incubés pendant une nuit à 4°C (volume final . 100 ~g/puits). Les puits ont été saturés pendant 30 minutes à 37°C en PBS-Tween 20, 0,05% gélatine 2,5%, 200 ~.1/puits. Le sérum de contrôle négatif (sérum normal) a été dilué au 1/120. Les anticorps anti-filaggrine ont été dilués en PBS-Tween 20, 0,05%-gélatine 0,5% (PBS TG) de sorte que les concentrations finales en auto-anticorps anti-filaggrine soient celles indiquées dans le tableau I
annexé. Le sérum de contrôle négatif, les sérums PR et les anticorps anti-filaggrine ont été ajoutés (volume final . 100 ~1/puits) et soumis à incubation pendant 1 heure à 37°C et une nuit à 4°C. Des anticorps de chèvre anti-chaînes lourdes gamma des immunoglobulines humaines, marqués à la peroxydase (commercialisés par la société
SOUTHERN BIOTECHNOLOGIES) ont été ajoutés dans chaque puits (dilution en PBSTG . 1/2000, volume final 100 ~1/puits) et soumis à incubation pendant 1 heure à
37°C. La révélation a été effectuée par addition d'ortho-3o phénylènediamine (2mg/ml, pendant 10 minutes).
Les résultats présentés dans le tableau I
annexé sont donnés en rapport de DO à 492 nm . signal peptide citrulliné/signal peptide non-citrulliné.
Ces résultats montent que, dans la majorité
des cas, le rapport en DO peptide citrulliné/peptide non citrulliné est supérieur à 1, et illustrent donc la bonne 1~
sensibilité des peptides citrullinés par rapport aux peptides non-citrullinés pour leur réactivité vis-à-vis des autoanticorps anti-filaggrine.
LISTE DE SQUENCES
<110> BIOMERIEUX
SERRE, Guy GIRBAL-NEUHAUSER, lisabeth VINCENT, Christian SIMON, Michel SEBBAG, Mireille DALBON, Pascal JOLIVET-REYNAUD, Colette ARNAUD, Michel JOLIVET, Michel <120> EPITOPES PEPTIDIQUES RECONNUS PAR DES AUTO-ANTICORPS
ANTIFILAGGRINE PRSENTS DANS LE SRUM DES PATIENTS
ATTEINTS DE POLYARTHRT_TE RHUMATOIDE
<130> MJPcb1067/la <140>
<141>
<150> FR9716673 <151> 1997-12-30 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 29 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 1 ttcctatacc aggtgagcac tcat <210> 2 <211> 25 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 2 agaccctgaa cgtccagacc gtccc <210> 3 <211> 99 <212>
<213> Homo sapiens <400> 3 stghsgsqhs htttqgrsda srgssgsrst sretrdqeqs gdgsrhsgs49 <210> 9 <211> 37 <212>
<213> Homo sapiens <400> 9 sqdrdsqaqs edserrsasa srnhrgsaqe qsrdgsr <210> 5 <2I1> 14 <212>
<213> Homo sapiens <400> 5 eqsadssrhs gsgh 1q <210> 6 <211> 19 <212>
<213> Homo sapiens <400> 6 essrdgsrhp rshd 14
Claims (7)
1) Peptide comprenant un épitope reconnu par des autoanticorps anti-filaggrine présents dans le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, caractérisé en ce que ledit épitope comprend un motif tripeptidique centré sur un résidu citrulline, spécifiquement présent sur au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.
2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend le motif tripeptidigue Ser-Cit-His, dans lequel Cit représente un résidu citrulline.
3) Antigène artificiel reconnu spécifiquement par les auto-anticorps anti-filaggrine présents dans le sérum de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par au moins un peptide selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
4) Utilisation d'un antigène selon une quelconque des revendications 1 à 3, pour le diagnostic in vitro de la polyarthrite rhumatoïde.
5) Composition antigénique pour le diagnostic de la présence d'auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un antigène selon une quelconque des revendications 1 à 3, éventuellement marqué et/ou conjugué avec une molécule porteuse.
6) Procédé de détection des auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde dans un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend .
- la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un antigène selon une quelconque des revendications 1 à 3, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde éventuellement présents;
- la détection, par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
- la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un antigène selon une quelconque des revendications 1 à 3, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde éventuellement présents;
- la détection, par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
7) Nécessaire pour la détection des auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un antigène selon quelconque des revendications 1 à 3, ainsi que des tampons et réactifs appropriés pour la constitution d'un milieu réactionnel permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, et/ou des moyens de détection dudit complexe antigène/anticorps.
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