FR2798672A1 - Formes acides des peroxyredoxines et leur utilisation comme moyen de diagnostic - Google Patents
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Abstract
Formes acides purifiées des peroxyrédoxines et les fragments de celles-ci, caractérisés en ce qu'ils comprennent, dans une région proche de leurs site actif, la séquence SEQ ID Ndegre 2 suivante :Pro X1 Asp Phe Thr X2 Val X4 X3 Thr Gludans laquelle X1 représente n'importe quel acide aminé naturel, X2 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la phénylalanine et la proline, X3 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la proline et la thréonine et X4 représente un acide cystéine sulfinique ou un acide cystéique (acide cystéine sulfonique). Utilisation comme moyen de diagnostic et en thérapeutique.
Description
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La présente invention a pour objet les formes acides des peroxyrédoxines et leur utilisation comme moyen de diagnostic.
Le phénomène de mort cellulaire programmée (apoptose), joue un rôle important dans la vie des organismes multicellulaires.
Ce phénomène de mort cellulaire intervient au cours du développement embryonnaire normal, par exemple pour éliminer les neurones surnuméraires, ou dans l'élimination des cellules immunitaires autoréactives.
En revanche, une mort cellulaire anormale, non programmée, existe dans de nombreuses pathologies, notamment dans les pathologies neurodégénératives, inflammatoires et cardiaques. Cette mort cellulaire peut être accélérée, par exemple en cas d'ischémie ou d'athérosclérose, ou au contraire, les cellules peuvent échapper à cette mort cellulaire, par exemple dans le cas de maladies auto immunes ; cette absence de mort cellulaire explique également le caractère malin de certaines pathologies comme les cancers.
Ainsi ce phénomène oxydant est impliqué dans la mort cellulaire induite par des composés chimiques ou biologiques (Degli Espoti M. et al. (1998), FEBS Lett. 430,338-342 ; Quillet-Mary A. et al. (1997), J Biol. Chem., 272,21388- 21395), dans le syndrome d'ischémie-reperfusion (Parkins C. S. et al. (1998), Free Radic. Res., 28,271-281) ou dans la génération des plaques d'athérome en cas d'athérosclérose (Aviram M. et al. (1998), Mol. Cell. Biochem,. 188, 149-159).
Une des étapes importantes de la mort cellulaire ou apoptose est le phénomène de stress oxydant qui peut être défini comme l'action des espèces réactives oxygénées (superoxydes, peroxydes, hydroperoxydes et radicaux hydroxyles) ou des espèces réactives nitro-oxygénées (oxydes d'azote et peroxynitrites) sur les molécules biologiques telles que les lipides, les protéines et les acides nucléiques.
Outre l'apparition des espèces réactives mentionnées précédemment, le phénomène de stress oxydant dépend d'un autre facteur, à savoir la destruction de ces espèces chimiques réactives par des systèmes de protection cellulaire. Ces systèmes font intervenir soit des molécules réductrices comme la vitamine A et la vitamine E, soit des systèmes enzymatiques comme les superoxydes dismutases, les catalases et les peroxydases.
Parmi les peroxydases, se trouvent les peroxydases dépendantes du glutathion et les peroxydases dépendantes de la thiorédoxine.
Les peroxydases dépendantes de la thiorédoxine (TPx), également appelées peroxyrédoxines, ont été initialement découvertes dans les levures (Kim K. et al. (1988), J Biol. Chem., 263, 4704-4711) puis chez le rat (Kim I. et al. (1989), Proc.
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Natl. Acad. Sci. USA, 86,6018-6122) et se sont révélées hautement conservées à travers les espèces, y compris chez l'homme. Ce sont des antioxydants qui protègent les molécules biologiques contre l'oxydation et qui fonctionnent comme peroxydases, uniquement lorsqu'elles sont couplées à la thiorédoxine ou à un intermédiaire contenant un thiol (Pahl, P. et al. (1995), Genomics, 26,602-606).
Les peroxyrédoxines sont caractérisées par la présence, dans la région bordant leur site actif, de la séquence SEQ ID N 1 suivante :
Pro XI Asp Phe Thr X2 Val Cys X3 Thr Glu dans laquelle XI représente n'importe quel acide aminé naturel, X2 représente la phénylalanine ou la proline et X3 représente une proline ou une thréonine.
Pro XI Asp Phe Thr X2 Val Cys X3 Thr Glu dans laquelle XI représente n'importe quel acide aminé naturel, X2 représente la phénylalanine ou la proline et X3 représente une proline ou une thréonine.
Leur rôle dans la cellule est à l'heure actuelle très mal connu mais plusieurs hypothèses ont été émises. Ainsi la demande internationale WO 98/43666 qui décrit une nouvelle protéine appartenant à la famille des peroxyrédoxines, appelée AOP2, suggère que cette protéine pourrait jouer un rôle dans la protection contre l' athérosclérose.
Récemment certains auteurs ont montré (Zhang P. et al. (1997), J Biol. Chem., 272,30615-30618) que la thiorédoxine peroxydase de mammifère (TPx II) est un puissant inhibiteur de l'apoptose due à l'apparition d'espèces oxygénées réactives dans des cellules leucémiques Molt-4 traitées par des agents chimiques comme les céramides ou l'étoposide.
D'autres auteurs (Kang S.W. et al. (1998), J Biol. Chem., 273, 6297-6302) ont montré que les différentes isoformes cytosoliques des peroxyrédoxines de mammifères (Prx I, Prx II) diminuent la quantité de peroxyde d'hydrogène induit par les facteurs de croissance ou le facteur de nécrose tumorale a (TNF-a), suggérant que ces enzymes joueraient un rôle non seulement dans l'élimination du peroxyde d'hydrogène, mais participeraient également au signal des facteurs de croissance et du TNF-a.
Or les Inventeurs ont montré de manière surprenante que lorsqu'un stress oxydant est induit, in vitro, par un agent chimique dans des cellules en culture, il apparaît des formes acides des peroxyrédoxines, qui sont caractéristiques de la présence de ce stress.
Ces formes acides, caractérisées par un point isoélectrique plus acide que celui des formes normales des peroxyrédoxines correspondantes, résultent d'une modification directe des peroxyrédoxines et non pas d'une altération du gène codant pour lesdites peroxyrédoxines.
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De plus les Inventeurs ont montré que, dans le cas d'un stress intense mais de courte durée, la quantité totale de peroxyrédoxines ne varie pas alors que le rapport entre la forme acide et la forme native est augmenté par ledit stress.
Aussi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir aux formes acides purifiées des peroxyrédoxines, à l'utilisation de ces formes acides ou du rapport entre les formes natives et les formes acides des peroxyrédoxines comme moyen de diagnostic.
Ce moyen de diagnostic est simple à mettre en #uvre, rapide, et permet de mettre en évidence de manière fiable, la présence d'un désordre métabolique lié à un stress oxydant, même si ce stress est de courte durée.
La présente invention a en conséquence pour objet les formes acides purifiées des peroxyrédoxines et des fragments de celles-ci, caractérisés en ce qu'ils comprennent, dans une région proche de leur site actif, la séquence SEQ ID N 2 suivante :
Pro XI Asp Phe Thr X2 Val X4 X3 Thr Glu dans laquelle XI représente n'importe quel acide aminé naturel, X2 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la phénylalanine et la proline, X3 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la proline et la thréonine et X4 représente un acide cystéine sulfinique ou un acide cystéique (acide cystéine sulfonique), ainsi que leurs équivalents fonctionnels.
Pro XI Asp Phe Thr X2 Val X4 X3 Thr Glu dans laquelle XI représente n'importe quel acide aminé naturel, X2 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la phénylalanine et la proline, X3 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la proline et la thréonine et X4 représente un acide cystéine sulfinique ou un acide cystéique (acide cystéine sulfonique), ainsi que leurs équivalents fonctionnels.
Au sens de la présente invention, on entend par formes acides purifiées des peroxyrédoxines et des fragments de celles-ci, aussi bien les formes naturelles, que les fragments synthétiques obtenus par les techniques classiques de synthèse peptidique, et notamment par la technique de synthèse en phase solide décrite par Merrifield R. B. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85,2149-2154 ou par des techniques d'ADN recombinant (Corti, A., et al. (1997) Eur. J. Biochem. 248,692-699) ou par combinaison de ces deux types de techniques.
Au sens de la présente invention, on entend par équivalents fonctionnels, des séquences d'aminoacides comprenant des délétions, ou des additions, des modifications ou des substitutions conservatives ou une combinaison de celles-ci, au niveau de un ou plusieurs aminoacides, de manière à ce que la structure tertiaire et l'activité antioxydante ne soient pas altérées.
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Les modifications comprennent notamment celles résultant des processus posttraductionnels ou des modifications chimiques réalisées par des techniques classiques connues de l'homme du métier (acylation, fixation de lipides, de nucléotides, cyclisation ...).
Les modifications comprennent également celles résultant d'un couplage des peptides, par des liaisons covalentes, ioniques ou faibles à une molécule susceptible d'augmenter leur affinité pour un type de cellule particulier, notamment des couplages avec des peptides vecteurs.
Les substitutions conservatives bien connues de l'homme du métier, comprennent notamment la substitution d'un aminoacide par un autre aminoacide ayant même charge (aminoacides acides : Asp et Glu ; aminoacides basiques : Lys, Arg et ornithine ; aminoacides polaires neutres : Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, His et Trp), même taille, même caractère hydrophile (aminoacides hydrophobes : Ala, Val, Leu Ile, Pro, Phe et Met), même aromaticité (Phe et Tyr) et/ou même capacité à former des hélices.
Il est bien entendu que les équivalents fonctionnels comprennent également comme aminoacides, ceux qui sont des énantiomères et des diastéréoisomères des aminoacides naturels de conformation D, les aminoacides rares, notamment l'hydroxyproline, la méthyllysine et la diméthyllysine et les aminoacides synthétiques, notamment l'omithine, la norleucine, la cyclohexylalanine et les omégaaminoacides. Les équivalents fonctionnels recouvrent également les rétropeptides.
Dans un mode de réalisation particulier de réalisation de l'invention, ces peroxyrédoxines sont choisies dans le groupe constitué par les peroxyrédoxines de mammifères humains ou non.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les formes acides sont celles de TDX 1 d'origine humaine (SEQ ID N 3), TDX M d'origine humaine (SEQ ID N 4), TDX N d'origine humaine (SEQ ID N 5), AOP 2 d'origine humaine (SEQ ID N 6) et TDX 2 d'origine humaine (SEQ ID N 7), ainsi que leur fragments comprenant la SEQ ID N 2.
La présente invention a également pour objet des anticorps immunospécifiques dirigés contre les formes acides des peroxyrédoxines.
Dans un mode particulier de réalisation desdits anticorps, ils sont choisis dans le groupe constitué par des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux.
Dans un autre mode particulier de réalisation desdits anticorps, ils sont dirigés contre les formes acides des peroxyrédoxines choisies dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6 et SEQ ID N 7.
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Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal approprié (notamment un mammifère ou un gallinacé) avec la forme acide d'une peroxyrédoxine selon l'invention, éventuellement couplée à une protéine convenablement choisie telle que la sérum albumine bovine (SAB) ou la KLH (Kyu limpet hemocyanin), notamment selon les techniques décrites par Goumon Y. et. al.
(1998), J. Biol. Chem., 273,29847-29856 et par El-Majdoubi M., (1996), J. Neuro.
Cytol., 25,405-416.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus de manière connue en soi, notamment par fusion des cellules spléniques de souris immunisées avec un antigène consistant en la forme acide d'une peroxyrédoxine telle que définie ci-dessus, éventuellement couplée à une protéine convenable telle que SAB ou KLH avec des cellules myélomateuses appropriées.
La présente invention a également pour objet un réactif pour la détection et/ou le dosage des formes acides des peroxyrédoxines selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps spécifique des formes acides des peroxyrédoxines.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection des formes acides des peroxyrédoxines selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec un réactif conforme à l'invention et une étape dans laquelle on détecte une interaction spécifique entre ledit réactif et les formes acides des peroxyrédoxines telles que définies ci-dessus et présentes dans l'échantillon.
La présente invention a également pour objet un procédé pour détecter et/ou doser les formes acides des peroxyrédoxines selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on sépare les formes acides et les formes natives des peroxyrédoxines, suivant leur point isoélectrique, puis suivant leur poids moléculaire et une étape dans laquelle on détecte et/ou on dose lesdites formes acides.
Au sens de la présente invention un échantillon biologique est choisi dans le groupe comprenant notamment le c#ur, les artères, la peau, les muscles, le cerveau, les poumons, la rate, le sang, les cellules sanguines, la m#lle, le colon, l'intestin l'#sophage, l'estomac, et l'urine.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre de ce procédé, il comprend en plus le dosage des formes natives des peroxyrédoxines et la détermination du rapport entre la forme acide et entre la forme native de chaque peroxyrédoxine.
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Dans un autre mode particulier de mise en oeuvre de ce procédé, la détection et/ou le dosage des formes acides et des formes natives des peroxyrédoxines peuvent être réalisés par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par la technique colorimétrique décrite par T. Rabilloud et al. (Electrophoresis.(1998),
19, 1006-1014).
19, 1006-1014).
Dans un autre mode de mise en oeuvre particulier de ce procédé, la séparation des formes acides et des formes natives des peroxyrédoxines, suivant leur point isoélectrique peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par les techniques de focalisation isoélectrique telle que celle décrite par T.
Rabilloud et al. (Electrophoresis.(1997), 18, 307-316).
Dans un autre mode particulier de mise en oeuvre de ce procédé, la détection et/ou le dosage des formes acides et natives des peroxyrédoxines, après séparation, peuvent être réalisés avec un anticorps capable de se lier à la fois aux formes natives et aux formes acides des peroxyrédoxines, notamment avec un anticorps tel que ceux décrits dans la demande internationale WO 98/43666.
Dans un autre mode particulier de mise en oeuvre de ce procédé, la détection* et/ou le dosage des formes acides et natives des peroxyrédoxines sont réalisés avec des anticorps spécifiques de chaque forme.
Pour la mise en oeuvre des différents procédés de détection et/ou de dosage selon l'invention, les anticorps peuvent être fixés sur un support solide et les peroxyrédoxines détectées et/ou dosées par compétition ou par une méthode sandwich.. Dans ce cas, pour détecter la liaison antigène/anticorps, on utilise des marqueurs appropriés ou d'autres anticorps eux-mêmes conjugués à des marqueurs convenables, lesdits autres anticorps étant des anticorps classiquement utilisés, tels que par exemple, une IgG dirigée contre le deuxième anticorps et produite notamment chez la chèvre, le porc ou l'âne.
Parmi les marqueurs utilisés, on peut citer à titre d'exemple les marqueurs fluorescents, le système biotine/streptavidine, les marqueurs non isotopiques ou des enzymes, comme par exemple la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline.
La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage d'un trouble métabolique lié au stress oxydant, caractérisé en ce que l'on détermine, in vitro, dans un échantillon biologique, le rapport entre les formes acides et les formes natives des peroxyrédoxines.
La présente invention a également pour objet un coffret ou trousse de diagnostic pour mettre en oeuvre ledit procédé de dépistage, caractérisé en ce qu'il
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comprend au moins un anticorps spécifique des formes acides des peroxyrédoxines et au moins un anticorps choisi dans le groupe constitué par les anticorps capables de se lier à la fois aux formes natives et aux formes acides des peroxyrédoxines et les anticorps spécifiques des formes natives des peroxyrédoxines, des moyens de détection appropriés et au moins un témoin constitué par un échantillon de référence.
La présente invention a également pour objet une méthode pour sélectionner in vitro, des composés aptes à stimuler la formation des formes acides des peroxyrédoxines, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact des formes natives des peroxyrédoxines avec un agent provoquant un stress oxydant, en présence ou en absence d'un composé susceptible de stimuler ladite formation, - le dosage des formes acides formées, - éventuellement le dosage des formes natives des peroxyrédoxines et la mesure du rapport entre les formes acides et les formes natives des peroxyrédoxines.
La présente invention a également pour objet une méthode pour sélectionner in vitro, des composés aptes à inhiber la formation des formes acides des peroxyrédoxines, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact des formes natives des peroxyrédoxines avec un agent provoquant un stress oxydant, en présence ou en absence d'un composé susceptible d'inhiber ladite formation, - le dosage des formes acides formées, - éventuellement le dosage des formes natives des peroxyrédoxines et la mesure du rapport entre les formes acides et les formes natives des peroxyrédoxines.
Pour la mise en oeuvre de ces méthodes de sélection, les peroxyrédoxines, sous formes natives, peuvent être en solution ou fixées sur des supports ou exprimées dans des cellules convenablement choisies.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une molécule apte à stimuler la formation des formes acides des peroxyrédoxines pour la préparation d'un médicament favorisant la mort cellulaire.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre de cette utilisation, le médicament est un anticancéreux ou est utilisable dans le traitement des maladies auto immunes.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une molécule apte à inhiber la formation des formes acides des peroxyrédoxines pour la préparation d'un médicament inhibant la mort cellulaire.
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Dans un mode particulier de mise en oeuvre de cette utilisation, le médicament est utile dans le traitement des troubles neurodégénératifs.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles : - la figure 1 représente l'effet d'un stress oxydant induit par du tert-butyl-hydroperoxyde dans des fibroblastes embryonnaires humains non transformés (souche GM10 déposée auprès du NIGMS Coriell Cell Repositories,
Canden, New Jersey) - 1 A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine 1 d'origine humaine (TDX 1) ; correspond à la forme native de la peroxyrédoxine 1 d'origine humaine (TDX 1) ; 2A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine d'origine humaine, TDX N ; 2B correspond à la forme native de la peroxyrédoxine d'origine humaine, TDX N ; 3A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine 3 d'origine humaine, (TDX M) ; correspond à la forme native de la peroxyrédoxine 3 d'origine humaine (TDX M) ; 4A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine d'origine humaine, AOP 2 ; correspond à la forme native de la peroxyrédoxine, AOP 2 - (la) " extrait cellulaire contrôle " correspond à des cellules non traitées et (1b) " extrait cellulaire BHP " correspond à des cellules traitées par du tert-butylhydroperoxyde selon la méthode décrite dans l'exemple 1, - la figure 2 représente la quantité relative des formes acides et natives des peroxyrédoxines exprimée en pourcentage des protéines totales, et la détermination du rapport forme acide sur forme native pour différentes peroxyrédoxines dans des fibroblastes embryonnaires humains non transformés (souche GM10) témoins ou traités par du tert-butyl-hydroperoxyde (stress oxydant) selon la méthode décrite dans l'exemple 1, - la figure 3 représente l'effet d'un stress oxydant induit par du tert-butyl-hydroperoxyde dans des hématies - 1A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine 1 d'origine humaine (TDX 1) ; 1B correspond à la forme native de la peroxyrédoxine 1 d'origine humaine (TDX 1) ; (3a) " extrait cellulaire contrôle" correspond à des hématies non traitées et (3b) " extrait cellulaire BHP " correspond à des hématies traitées par du tert-butyl-hydroperoxyde selon la méthode décrite dans l'exemple 1, - la figure 4 illustre la détection par un anticorps de la forme acide de TDX 1 (lA) et de la forme native de TDX 1 ( 1 B) dans des lymphocytes T humains, cellules Jurkat (souche déposée à l'American Type Culture Collection sous le n ATCC : TIB 152), après séparation des deux formes par électrophorèse bidimensionnelle réalisée selon la méthode décrite dans l'exemple 1,
Canden, New Jersey) - 1 A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine 1 d'origine humaine (TDX 1) ; correspond à la forme native de la peroxyrédoxine 1 d'origine humaine (TDX 1) ; 2A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine d'origine humaine, TDX N ; 2B correspond à la forme native de la peroxyrédoxine d'origine humaine, TDX N ; 3A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine 3 d'origine humaine, (TDX M) ; correspond à la forme native de la peroxyrédoxine 3 d'origine humaine (TDX M) ; 4A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine d'origine humaine, AOP 2 ; correspond à la forme native de la peroxyrédoxine, AOP 2 - (la) " extrait cellulaire contrôle " correspond à des cellules non traitées et (1b) " extrait cellulaire BHP " correspond à des cellules traitées par du tert-butylhydroperoxyde selon la méthode décrite dans l'exemple 1, - la figure 2 représente la quantité relative des formes acides et natives des peroxyrédoxines exprimée en pourcentage des protéines totales, et la détermination du rapport forme acide sur forme native pour différentes peroxyrédoxines dans des fibroblastes embryonnaires humains non transformés (souche GM10) témoins ou traités par du tert-butyl-hydroperoxyde (stress oxydant) selon la méthode décrite dans l'exemple 1, - la figure 3 représente l'effet d'un stress oxydant induit par du tert-butyl-hydroperoxyde dans des hématies - 1A correspond à la forme acide de la peroxyrédoxine 1 d'origine humaine (TDX 1) ; 1B correspond à la forme native de la peroxyrédoxine 1 d'origine humaine (TDX 1) ; (3a) " extrait cellulaire contrôle" correspond à des hématies non traitées et (3b) " extrait cellulaire BHP " correspond à des hématies traitées par du tert-butyl-hydroperoxyde selon la méthode décrite dans l'exemple 1, - la figure 4 illustre la détection par un anticorps de la forme acide de TDX 1 (lA) et de la forme native de TDX 1 ( 1 B) dans des lymphocytes T humains, cellules Jurkat (souche déposée à l'American Type Culture Collection sous le n ATCC : TIB 152), après séparation des deux formes par électrophorèse bidimensionnelle réalisée selon la méthode décrite dans l'exemple 1,
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- la figure 5 représente la quantité relative des formes acides et natives des peroxyrédoxines exprimées en pourcentage des protéines totales et la détermination du rapport forme acide sur forme native pour différentes peroxyrédoxines dans des cellules Jurkat traitées par de l'antimycine A en présence ou non de phénylbutylnitrone comme antioxydant. La colonne " anti A " correspond aux cellules traitées par l'antimycine A seulement. La colonne " anti A + PNB " correspond aux cellules traitées par l'antimycine A et la phénylbutylnitrone selon l'exemple 4.
Exemple 1 : du stress oxydant sur les peroxyrédoxines.
1. Matériel et méthodes
1.1. Séparation en électrophorèse bidimensionnelle
Les protéines cellulaires sont extraites par un mélange contenant 8 M d'urée, 2 M de thiourée, 4 % (p/v) de CHAPS (Cholamidopropyl diméthylammonio propane sulfonate), 40 mM de dithiothreitol et 20 mM de spermine sous forme de base. Après centrifugation à 200 000 g pendant 30 minutes pour éliminer les acides nucléiques, l'extrait est déposé sur une bandelette de gel de polyacrylamide (200x3x0,5 mM) incluant un gradient de pH immobilisé (de pH 4 à pH 8) et contenant 8 M d'urée, 2 M de thiourée, 4 % (p/v) de CHAPS, 10 mM de dithiothreitol et 0,4 % (p/v) d'ampholytes porteurs couvrant l'intervalle de pH 3-10.
1.1. Séparation en électrophorèse bidimensionnelle
Les protéines cellulaires sont extraites par un mélange contenant 8 M d'urée, 2 M de thiourée, 4 % (p/v) de CHAPS (Cholamidopropyl diméthylammonio propane sulfonate), 40 mM de dithiothreitol et 20 mM de spermine sous forme de base. Après centrifugation à 200 000 g pendant 30 minutes pour éliminer les acides nucléiques, l'extrait est déposé sur une bandelette de gel de polyacrylamide (200x3x0,5 mM) incluant un gradient de pH immobilisé (de pH 4 à pH 8) et contenant 8 M d'urée, 2 M de thiourée, 4 % (p/v) de CHAPS, 10 mM de dithiothreitol et 0,4 % (p/v) d'ampholytes porteurs couvrant l'intervalle de pH 3-10.
Les protéines sont séparées sous l'effet d'un champ électrique (70 000 V. h) et migrent jusqu'à leur point isoélectrique. Après cette séparation, la bandelette de polyacrylamide est imprégnée pendant 30 minutes par un tampon Tris 125 mM, HCl 100 mM contenant 6 M d'urée et 2 % (p/v) de dodécyl sulfate de sodium. La bandelette ainsi imprégnée est placée au sommet d'un gel de polyacrylamide (concentration 10 % p/v) et les protéines sont soumises à une électrophorèse de zone en présence de dodécyl sulfate de sodium. Les protéines sont ensuite révélées sur le gel de polyacrylamide par coloration argentique selon la technique décrite par T. Rabilloud et al. (1998) (référence citée).
1.2. Mesure du stress oxydant
Des cellules humaines en culture (souche GM10) sont cultivées dans un milieu DMEM (Dubelcco's modified Eagles médium
Deux heures avant la récolte des cellules, du tert-butyl hydroperoxyde est ajouté dans le milieu à une concentration finale de 0,15 mM. Après cette période de deux heures, les cellules sont récoltées, lavées avec une solution
Des cellules humaines en culture (souche GM10) sont cultivées dans un milieu DMEM (Dubelcco's modified Eagles médium
Deux heures avant la récolte des cellules, du tert-butyl hydroperoxyde est ajouté dans le milieu à une concentration finale de 0,15 mM. Après cette période de deux heures, les cellules sont récoltées, lavées avec une solution
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saline, puis lysées en présence de cholamidopropyl dimethyl ammonio propane sulfonate à 40 g/1, d'urée 420 g/1, de thiourée 150 g/1 et de dithiothréitol 1,5 g/1.
Le lysat cellulaire est ensuite analysé par électrophorèse bidimensionnelle selon la méthode décrite précédemment.
La nature des protéines ayant les points isoélectriques et masses moléculaires correspondant à ceux des peroxyrédoxines (formes natives et acides) est confirmée par carte peptidique massique après digestion à la trypsine des protéines séparées sur le gel bidimensionnel.
2. Résultats
Ils sont illustrés à la figure 1 et à la figure 2.
Ils sont illustrés à la figure 1 et à la figure 2.
Lorsque les cellules ont été soumises à un stress oxydant, on observe une diminution des taches correspondant aux formes natives des différentes peroxyrédoxines (1B figure lb et figure 2).
Bien que la quantité totale de peroxyrédoxines reste globalement identique en l'absence ou en présence d'un stress oxydant, le rapport entre les deux formes est augmenté de manière significative dans les cellules ayant été soumises à n stress oxydant.
Exemple 2 : du stress oxydant sur la peroxyrédoxine de globules rouges.
1. Matériel et méthodes
Des globules rouges humains sont suspendus dans 10 fois leur volume de milieu RPMI 1640 (Rockwell Park Mémorial Institute) et le tert-butyl hydroperoxyde est ajouté dans le milieu à une concentration finale de 0,3 mM.
Des globules rouges humains sont suspendus dans 10 fois leur volume de milieu RPMI 1640 (Rockwell Park Mémorial Institute) et le tert-butyl hydroperoxyde est ajouté dans le milieu à une concentration finale de 0,3 mM.
Après deux heures d'incubation, les globules rouges sont séparés du milieu réactionnel par centrifugation et rincés dans du tampon PBS salin (phosphate buffered saline).
Finalement les protéines sont extraites et séparées comme décrit à l'exemple 1.2.
2. Résultats
Ils sont illustrés à la figure 3.
Ils sont illustrés à la figure 3.
Lorsque les hématies ont été soumises à un stress oxydant, on observe une diminution de la tache correspondant à la forme native de la peroxyrédoxine 1 (1B figures 3A et 3B) et une augmentation de la tache correspondant à la forme acide de la peroxyrédoxine 1 (lA figures 3A et 3B).
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Exemple 3 : Détermination du rapport entre les formes acides et natives des peroxyrédoxines au moyen d'un anticorps.
1. Matériel et méthodes
Des protéines de cellules Jurkat en culture sont extraites et séparées comme décrit dans l'exemple 1.
Des protéines de cellules Jurkat en culture sont extraites et séparées comme décrit dans l'exemple 1.
Après séparation, les protéines sont transférées sur membrane de poly(difluorure de vinylidène). Cette membrane est ensuite mise en contact avec un anticorps polyclonal réalisé chez le lapin et dirigé contre la peroxyrédoxine 1, puis après rinçage, avec un conjugué de peroxydase et de protéine A de Staphylococcus aureus.
La peroxyrédoxine 1 est détectée au moyen de l'activité enzymatique de la peroxydase.
2. Résultats
Ils sont illustrés à la figure 4.
Ils sont illustrés à la figure 4.
L'utilisation d'un anticorps apte à se lier à la fois à la forme active et à la forme acide de la peroxyrédoxine 1 permet de quantifier la quantité de chacune des formes et de déterminer le rapport entre les deux formes.
Exemple 4 : Détermination du rapport entre les formes acides et natives des peroxyrédoxines après un stress oxydant par l'antimycine A et mesure de l'effet d'un antioxydant, la phénylbutylnitrone.
1. Matériel et méthodes
Des cellules Jurkat en culture sont cultivées pendant 24 heures dans un milieu RPMI 1640 contenant 26 M d'antimycine A, 300 M de phénylbutylnitrone.
Des cellules Jurkat en culture sont cultivées pendant 24 heures dans un milieu RPMI 1640 contenant 26 M d'antimycine A, 300 M de phénylbutylnitrone.
Finalement les protéines sont extraites et séparées comme décrit à l'exemple 1.2.
2. Résultats
Ils sont illustrés à la figure 5.
Ils sont illustrés à la figure 5.
En présence d'un agent antioxydant, le rapport entre les formes acides et les formes natives des peroxyrédoxines est diminué.
L'ensemble de ces résultats montrent que la détermination du rapport entre les formes acides et natives des peroxyrédoxines permet de détecter de manière simple et fiable la présence d'un stress oxydant et donc d'être utilisé comme marqueur de la présence d'un désordre métabolique lié à un stress oxydant.
Claims (21)
1. Formes acides purifiées des peroxyrédoxines et les fragments de celles-ci, caractérisés en ce qu'ils comprennent, dans une région proche de leurs site actif, la séquence SEQ ID N 2 suivante :
Pro XI Asp Phe Thr X2 Val X4 X3 Thr Glu dans laquelle
XI représente n'importe quel acide aminé naturel,
X2 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la phénylalanine et la proline, X3 représente un acide aminé choisi dans le groupe constitué par la proline et la thréonine et X4 représente un acide cystéine sulfinique ou un acide cystéique (acide cystéine sulfonique), ainsi que leurs équivalents fonctionnels.
2. Formes acides purifiées selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont issues de mammifères humain ou non.
3. Formes acides purifiées selon les revendications 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles ont choisies dans le groupe constitué par la TDX 1 d'origine humaine (SEQ ID N ID N 3), TDX M d'origine humaine (SEQ ID N 4), TDX N d'origine humaine (SEQ ID N 5), AOP 2 d'origine humaine (SEQ ID N 6) et TDX 2 d'origine humaine (SEQ ID N 7), ainsi que leur fragments comprenant la SEQ ID N 2.
4. Anticorps immunospécifiques caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre les formes acides des peroxyrédoxines selon la revendication 1.
5. Anticorps immunospécifiques, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre les formes acides des peroxyrédoxines choisies dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6 et SEQ ID N 7.
6. Anticorps selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont choisis dans le groupe constitué par des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux.
7. Réactif pour détecter et/ou doser des formes acides des peroxyrédoxines, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps selon l'une quelconque des revendications 4 à 6.
8. Procédé pour détecter et/ou doser les formes acides des
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peroxyrédoxines, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec un réactif selon la revendication 7.et une étape dans laquelle on détecte uneinteraction spécifique entre ledit réactif et les formes acides des peroxyrédoxines présentes dans l'échantillon.
9. Procédé pour détecter et/ou doser les formes acides des peroxyrédoxines, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on sépare les formes acides et les formes natives des peroxyrédoxines, suivant leur point isoélectrique, puis suivant leur poids moléculaire et une étape dans laquelle on détecte et/ou on dose lesdites formes acides présentes dans l'échantillon.
10. Procédé pour détecter et/ou doser les formes acides des peroxyrédoxines, selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séparation des formes acides et des formes natives des peroxyrédoxines, suivant leur point isoélectrique est réalisée par focalisation isoélectrique.
11. Procédé pour détecter et/ou doser les formes acides des peroxyrédoxines, selon les revendications 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comprend en plus la détection des formes natives des peroxyrédoxines et la détermination du rapport entre les formes acides et les formes natives des peroxyrédoxines.
12. Procédé pour détecter et/ou doser les formes acides des peroxyrédoxines, selon la revendication 11, caractérisé en ce que la détection et/ou le dosage des formes acides et natives des peroxyrédoxines sont réalisés avec des anticorps capables de se lier à la fois à la forme native et à la forme acide, après séparation des deux formes.
13. Procédé pour détecter et/ou doser les formes acides des peroxyrédoxines, selon la revendication 11, caractérisé en ce que la détection et/ou le dosage des formes acides et natives des peroxyrédoxines sont réalisés avec des anticorps spécifiques de chaque forme.
14. Procédé de dépistage d'un trouble métabolique lié au stress oxydant, caractérisé en ce que l'on détermine, in vitro dans un échantillon biologique, le rapport entre les formes acides et les forme natives des peroxyrédoxines.
15. Coffret ou trousse de diagnostic pour mettre en oeuvre le procédé de dépistage selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps spécifique des formes acides des peroxyrédoxines et au moins un anticorps capable de se lier à la fois aux formes natives et aux formes acides des peroxyrédoxines ou au moins un anticorps spécifique des formes natives des
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peroxyrédoxines, des moyens de détection appropriés et au moins un témoin constitué par un échantillon de référence.
16. Méthode pour sélectionner in vitro, des composés aptes à stimuler la formation des formes acides des peroxyrédoxines, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact des formes natives des peroxyrédoxines avec un agent provoquant un stress oxydant, en présence ou en absence d'un composé susceptible de stimuler ladite formation, - le dosage des formes acides formées, - éventuellement le dosage des formes natives des peroxyrédoxines et la mesure du rapport entre les formes acides et les formes natives des peroxyrédoxines.
17. Méthode pour sélectionner in vitro, des composés aptes à inhiber la formation des formes acides des peroxyrédoxines, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact des formes natives des peroxyrédoxines avec un agent provoquant un stress oxydant, en présence ou en absence d'un composé susceptible d'inhiber ladite formation, - le dosage des formes acides formées, - éventuellement le dosage des formes natives des peroxyrédoxines et la mesure du rapport entre les formes acides et les formes natives des peroxyrédoxines.
18. Utilisation d'une molécule apte à stimuler la formation des formes acides des peroxyrédoxines pour la préparation d'un médicament favorisant la mort cellulaire.
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que le médicament est un anticancéreux ou est utilisable dans le traitement des maladies auto immunes.
20. Utilisation d'une molécule apte à inhiber la formation des formes acides des peroxyrédoxines pour la préparation d'un médicament inhibant la mort cellulaire.
21. Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que le médicament est utile dans le traitement des troubles neurodégénératifs.
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