FR2848566A1 - Peptides epitopiques de l'enzyme thyroperoxydase, les compositions les contenant et leurs applications - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des peptides purifiés de 5 à 20 acides aminés reconnus par les auto-anticorps dirigés contre la thyroperoxydase humaine, lesdits peptides constituant des épitopes discontinus issus de la région immunodominante discontinue de la thyroperoxydase humaine constituée de quatre régions distinctes de la TPO appartenant aux domaines homologues de la MPO et du CCP. L'invention se rapporte aussi à des anticorps dirigés contre ces peptides et les applications de ces peptides et anticorps notamment pour la détection d'auto-anticorps contre la thyroperoxydase humaine.

Description

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PEPTIDES EPITOPIQUES DE l'ENZYME THYROPEROXYDASE, LES COMPOSITIONS LES CONTENANT ET LEURS APPLICATIONS.

La présente invention appartient au domaine de l'immunologie, notamment au domaine des pathologies autoimmunes et en particulier aux maladies auto-immunes de la thyroïde liées à l'apparition d'auto-anticorps dirigés contre l'enzyme thyroperoxydase. Le dosage des autoanticorps anti-TPO est essentiel pour le diagnostic de ces pathologies autoimmunes thyroïdiennes et le titrage par méthode immunologique de ces auto-anticorps anti-TPO constitue un progrès important. En effet, de nombreux travaux ont montré que les auto-anticorps anti-TPO étaient capables d'induire la destruction de la glande thyroïde en activant une cytoxicité dépendante des anticorps.

La thyroperoxydase humaine (TPO), d'abord décrite comme l'antigène (Ag) microsomal thyroïdien (1), est une enzyme liée à la membrane s'exprimant au pôle apical des thyrocytes (2). La TPO génère la forme fonctionnelle de la thyroglobuline par iodation et couplage des résidus de tyrosine (3). Au cours des maladies auto-immunes de la thyroïde (MAIT), la TPO représente une cible majeure pour le système immunitaire (4,5), conduisant à des titres élevés d'auto-anticorps (aAc) anti-TPO spécifiques présents dans les sérums de patients souffrant des maladies de Hashimoto et de Basedow. En plus de leur rôle comme marqueurs diagnostics rapides et précoces des MAIT, les aAc anti-TPO agissent aussi comme molécules effectrices soit en modulant la présentation de l'Ag aux cellules T, soit comme médiateurs de la destruction de la thyroïde comme conséquence de l'activation du complément ou de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (6-12).

Les études d'alignement et les homologies structurales ont montré que la TPO est formée par trois domaines distincts : un domaine homologue de la myélopéroxydase (MPO), un domaine homologue de la protéine de contrôle du complément

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(CCP), et un domaine homologue du facteur EGF, à partir des extrémités N-terminales vers les extrémités C-terminales (13). Bien que la structure de chaque domaine ait été élucidée en partie par une modélisation en trois dimensions (13-16), et que des cristaux à basse résolution aient été obtenus (17,18), la structure tridimensionnelle complète de la TPO reste inconnue. La flexibilité observée pour les régions charnières rend probablement difficile le positionnement exact de chaque domaine en relation avec les autres (15).

Ces observations montrent une structure hautement complexe de la TPO, qui explique que les aAc anti-TPO présents dans les sérums de patients atteints de MAIT, reconnaissent préférentiellement des épitopes discontinus de la TPO (22) .

Différentes approches ont été utilisées pour déterminer les régions épitopiques reconnues par les aAc anti-TPO présents dans les sérums de patients et identifier les acides aminés critiques impliqués dans ces interactions : (i) compétition entre des Acm de souris ou des antisérums polyclonaux de lapin et les aAc anti-TPO humains (13,23-25) pour la liaison à la TPO, (ii) analyse d'aAc humains antiTPO se fixant à l'Ag recombinant et/ou tronqué (15,16,26- 30), (iii) génération de fragments de TPO par hydrolyse enzymatique suivi de l'analyse de leur fixation aux aAc anti-TPO (31,32), et (iv) expression par des cellules eucaryotes de protéines chimères MPO-TPO obtenues par mutagenèse dirigée et analyse de leur liaison aux aAc antiTPO (33-35) .

Ces approches ont démontré une réponse restreinte des aAc spécifiques anti-TPO, qui reconnaissent principalement une région immunodominante discontinue (RID). Par compétition entre les aAc anti-TPO présents dans les sérums de patients et un pool d'Acm anti-TPO, la RID a été divisée en deux domaines imbriqués nommés A et B (25).

Récemment, Guo et ses collaborateurs (23), en utilisant le même pool d'anticorps murins et des fragments (Fabs)

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d'anticorps monoclonaux humains anti-TPO comme compétiteurs, ont défini les domaines A et B de la RID avec une nomenclature inversée. Cette seconde nomenclature, définie en utilisant les Fabs humains, sera utilisée ciaprès. La RID a été partiellement caractérisée seulement, sans relation directe claire entre les régions identifiées.

Les auteurs font l'hypothèse que la plupart des techniques couramment utilisées pour cartographier les épitopes linéaires des anticorps monoclonaux sont inadéquates pour définir de manière précise un épitope discontinu sur des molécules comme la TPO, qui ont une architecture hautement organisée.

Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention sont basés sur la combinaison de deux approches technologiques déjà utilisées pour définir les épitopes hautement structurés (36-39). Premièrement, des peptides ont été sélectionnés pour leur capacité à mimer des épitopes naturels par criblage de banques de peptides présentés à la surface de phages. Deuxièmement, les alignements de séquences des mimotopes sélectionnés, avec la séquence primaire de l'Ag, et par repositionnement de ces peptides sur la structure tridimensionnelle de l'Ag, ont permis l'identification d'épitopes conformationnels potentiels.

Cette stratégie a été utilisée pour définir l'épitope reconnu par l'aAc anti-TPO IgGl recombinant T13, aAc reconnaissant la RID de la TPO. Cet aAc anti-TPO T13 recombinant a été obtenu à partir d'une banque d'anticorps présentés à la surface de phages, construite à partir de cellules B infiltrants la thyroïde de patients atteints de la maladie de Basedow (40, 41) . Quatre régions distinctes de la TPO appartenant aux domaines homologues de la MPO et du CCP définissent la RID discontinue, reconnue par l'aAc T13 humain recombinant mais également par les aAc anti-TPO

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présents dans les sérums des patients souffrant des maladies de Basedow et d'Hashimoto.

La RID reconnue par les aAc anti-TPO, qui est un des auto-antigènes majeurs (aAg) dans les MAIT, n'a pas encore été complètement définie. En utilisant la technique de phages présentant à leur surface des peptides, la Demanderesse a identifié trois motifs critiques, LxPExD, QSYP, et Ex (E/D)PPV, les 12 mimotopes sélectionnés, qui interagissent directement avec l'aAc humain recombinant anti-TPO nommé T13.

L'alignement des séquences mimotopes avec la molécule TPO, ainsi que l'analyse de la fixation de l'aAc T13 sur les mutants de la TPO exprimés dans des cellules CHO, ont montré que les régions 353-363,377-386, et 713- 720du domaine homologue de la MPO et la région 766-775 du domaine CCP sont une partie de la RID reconnue par l' aAc recombinant T13. De plus, la Demanderesse a démontré que ces régions sont impliquées dans la liaison des aAc antiTPO présents dans les sérums de patients souffrant des maladies auto-immunes de Hashimoto et de Basedow.

Le but de la présente invention est précisément d'offrir de nouveaux moyens de diagnostic et de thérapie des MAIT. En effet, l'identification de la RID permet maintenant d'améliorer le diagnostic des MAIT par l'utilisation 1) d'une "miniTPO" ingéniérée, remplaçant la TPO dans des Kits de dosage des aAc anti-TPO de patients atteints de MAIT et 2) grâce à la définition d'aAc humains recombinants anti-TPO capables de rentrer en compétition avec les aAc anti-TPO de patients et 3) l'utilisation d'aAc humains recombinants anti-TPO servant d'étalons internes.

D'autre part l'utilisation de peptides mimotopes en thérapeutiques permettrait de bloquer les réponses autoimmunes non désirées.

L'invention a donc tout d'abord pour objet un peptide purifié de 5 à 20 acides aminés reconnu par les auto-anticorps dirigés contre la thyroperoxydase humaine,

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ledit peptide définissant un épitope discontinu issu de la région immunodominante discontinue de la thyroperoxydase humaine constituée de quatre régions distinctes de la TPO appartenant aux domaines homologues de la MPO et du CCP.

L'invention se rapporte tout particulièrement, à des peptides comprenant l'un au moins un des trois motifs critiques de formules suivantes : LxPExD (SEQ ID N0.17), QSYP (SEQ ID N0.18) et Ex (E/D)PPV ID N0.19) où x représente n'importe quel acide aminé :
LxPExD (SEQ ID N0.17)
QSYP (SEQ ID N0.17)
ExEPPV ou ExDPPV (SEQ ID N0.18), lesdits peptides définissant un épitope discontinu issu de la RID de la TPOh constituée de quatre régions distinctes de la TPO appartenant aux domaines homologues de la MPO et du CCP.

Ledit épitope discontinu est issu de la région immunodominante discontinue de la thyroperoxydase humaine constituée des régions 353-363 (SEQ ID N0.1), 377-386 (SEQ ID N0.2), et 713-720 (SEQ ID N0.3) du domaine homologue de la myéloperoxydase (MPO) et la région 766-775 (SEQ ID N0.4) du domaine homologue de la protéine de contrôle du complément (CCP).

L'invention concerne plus particulièrement les 12 peptides mimotopes dont les séquences sont identifiées par les numéros SEQ ID N : 5 à SEQ ID No. 12 dans la liste de séquences en annexe :
KLLPEDDESRTYHTV (SEQ ID N0.5)
KLFPEEDEMRTETQR (SEQ ID NO 6)
RLAPEPDDPITPMTK (SEQ ID N0.7)
ELNPEPDTEVFPMTF (SEQ ID NO 8)
TQSYPPPPAWRAASR (SEQ ID N0.9)
QLSPESDYDDHGMRY (SEQ ID NO.10)
SQSYPEPARGSVPMP (SEQ ID N0.11)
GQSYPPRPDTSLHVT (SEQ ID N0.12)
KNSRQSYPEPAPVYH (SEQ ID N0.13)
ENEPPVWTTESKLQS (SEQ ID N0.14)

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ESDPPVASYQWRLIN (SEQ ID N0.15)
ESVMQSYPPHLQIPG (SEQ ID N0.16)
En combinant la technique de peptides présentés par des phages avec l'alignement des séquences de mimotopes sur la molécule TPO, la Demanderesse a précisément identifié trois régions (353-363,377-386, et 713-720) appartenant au domaine homologue de la MPO et une région (766-775) située sur le domaine homologue du CCP qui est une partie de la RID. Aussi la RID qui comprend ces quatre régions qui sont cruciales pour la fixation des aAc anti-TPOh a été localisé sur un modèle 3D de la TPOh. Cette RID est reconnue (i) par l'aAc T13 recombinant humain obtenu à l'aide d'une banque d'aAc recombinant humain construite à partir de cellules B infiltrant la thyroïde de patients atteints de la maladie de Basedow (40,41) et (ii) par aAc anti-TPO présents dans le sérum de patients souffrant des maladies thyroïdiennes de Basedow et de Hashimoto.

De plus, cette démonstration a été obtenue en utilisant l'aAg TPO complet exprimé par des cellules eucaryotes. Sachant que les aAc anti-TPO présents dans les sérums de patients sont dirigés contre cette RID, un tel résultat permet d'améliorer la compréhension de la reconnaissance de la TPO par le système immunitaire lors des MAIT. Aussi, la synthèse d'une "mini-TPO" contrainte qui mime la RID identifiée par la Demanderesse présente une valeur diagnostique importante pour détecter les aAc spécifiques de la TPO.

En conséquence l'invention se rapporte également un procédé de détection d'aAc anti-TPO dans un échantillon d'un individu caractérisé en ce qu'il comprend : a) la mise en contact dudit échantillon avec au moins un peptide défini précédemment, dans des conditions permettant la formation de complexe immunologique, b) la détection de la formation de complexe immunologique entre un aAc anti-TPO et ledit peptide pour

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détecter la présence d'aAc anti-TPO dans l'échantillon de l'individu.

L'échantillon peut être tout fluide biologique d'un sujet susceptible de contenir les aAc.

Le procédé selon l'invention est intéressant pour le diagnostic de pathologies autoimmunes plus particulièrement thyroïdiennes. L'invention se rapporte donc également à un kit pour la mise du procédé ci-dessus comprenant : - une quantité adéquate d'au moins un peptide défini précédemment pour fixer des aAc anti-TPO dans un échantillon, - un ou plusieurs réactifs pour la détection des complexes immunologiques formés entre ledit peptide et les aAc anti-TPO, - éventuellement, un ou plusieurs réactif étalon comme des anticorps recombinants humains de référence.

L'invention a aussi pour objet un anticorps antiTPO humain dirigé contre un peptide ci-dessus. L'invention se rapporte aussi à des anticorps recombinants humains dirigés contre la TPO. Il s'agit d'anticorps recombinants humains obtenus à l'aide de banques combinatoires d'anticorps construites par la Demandresse à partir de lymphocytes B infiltrant la thyroïde de patients atteints de la maladie de Basedow. Ces anticorps sont préparés par des techniques connues de l'homme du métier conformément à la description des méthodes ci-dessous mises en #uvre dans le cadre de l'invention. Les anticorps selon l'invention sont utiles notamment comme référence pour le procédé de détection d'aAc anti-TPO.

L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agent d'actif au moins un peptide ou un anticorps tels que définis précédemment.

Ces compositions sont utiles pour la prévention et le traitement des Maladies Autoimmunes et plus

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particulièrement Thyroïdiennes et/ou des Cancers thyroïdiens.

L'invention à aussi pour objet une méthode de préparation de peptides mimétiques du site de liaison des aAc anti-TPO sur la TPO utilisant les peptides et anticorps définis précédemment. Ces peptides mimétiques sont utiles pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement ou à la prévention des MAIT. En effet, ces peptides mimétiques sont capables de bloquer la présentation de l'Ag par les aAc anti-TPO fixés à la membrane des cellules B (6,7), conduisant à la réponse auto-immune des cellules T dans les MAIT et au blocage de l'activité cytotoxique des aAc de patients souffrant de MAIT, ces deux mécanismes ayant pour résultat la destruction de la thyroïde.

Dans les compositions selon l'invention, les peptides peuvent être sous forme soluble (L-acide aminé, Dacide aminé ou peptide retro-inverso) ou sous la forme de protéines de fusion ou encore présentés par une molécule porteuse.

La dose de peptide sera choisie pour avoir un effet thérapeutique durable, en accord avec la présente invention et en minimisant les effets physiologiques néfastes, qui sera déterminée par le corps médical. L'administration desdits peptides (seul ou en association) pourra se faire par injection intramusculaire, sous-cutanée, intradermique ou orale en fonction des indications décrites par les procédures pharmaceutiques.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent où il sera fait référence aux figures en annexe dans lesquelles : - La figure 1 illustre les tests de pureté et de spécificité de l'aAc anti-TPO T13.

La pureté et la spécificité ont été étudiées comme décrit dans les Méthodes. (a) Chaque échantillon (2 g de protéines) a été déposé sur deux gels de polyacrylamide 8%

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en présence de SDS. Le premier a été coloré avec du bleu de Coomassie brillant R-250 (lignes 1 et2) et le second a été analysé par Western Blot (lignes 3 et 4). Les lignes 1 et 3 montrent les surnageants de baculovirus avant purification. Les lignes 2 et 4 montrent l'aAc T13 après purification (flèche noire). Les masses moléculaires (MW) en kDa sont indiquées à gauche de la figure. (B) La spécificité de l' aAc T13 a été analysée par ELISA. La fixation de l' aAc T13 (cercles ouverts) et des IgG1 polyclonales humaines comme contrôle (triangles fermés) sur la TPO sont également montrés.

- La figure 2 montre les résultats de l'analyse des mimotopes T13 spécifiques par la technique Spot.

La figure 2A illustre l'immunoréactivité des peptides avec l'aAc T13 étudiée par la technique de Spot.

La réactivité de l'aAc T13 complexé avec un anticorps secondaire ou la réactivité de l'anticorps secondaire seul sont montrées à gauche (voir les Méthodes).

La figure 2B montre l'identification par remplacement en alanine, des résidus critiques des mimotopes. Des séries d'analogues de l'alanine de chacune des séquences peptidiques précédemment trouvées comme étant réactives avec l' aAc T13 ont été préparées et testées par la technique Spot. La légende "acide aminé remplacé" indique quel résidu a été remplacé par l'alanine (ou la glycine quand le résidu naturel est l'alanine). La réactivité spécifique de l'aAc T13 sur la membrane Spot est représentée par un en haut de chaque histogramme, et le pourcentage de fixation de l'aAc T13 sur chaque analogue en comparaison avec la séquence de type sauvage est montré par les histogrammes. Seul un mimotope représentatif de chaque famille a été illustré. Les acides aminés soulignés représentent les résidus critiques observés pour plusieurs peptides appartenant à chaque famille.

- La figure 3 montre l'alignement de séquences entre les mimotopes et la séquence de la TPO humaine. Les alignements ont été obtenus comme décrit dans les Méthodes.

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Les motifs critiques des mimotopes spécifiques de l'aAc T13 sont soulignés. Les résidus identiques entre les mimotopes et la séquence primaire de la TPO humaine sont représentés en lettres grasses.

- La figure 4 montre la localisation des régions mutées sur un diagramme en ruban tridimensionnel de la structure de la TPO humaine.

La figure 4A est une modélisation de la structure de la TPO humaine montrant les domaines homologues de la MPO, du CCP, et de l'EGF, reproduit avec autorisation (13). Cette représentation correspond à la juxtaposition du modèle tridimensionnel de chaque domaine. Les mutations produites par mutagenèse "dirigée" sont représentées, les positions 353-363 (1), 377-386 (2), 506-514 (3), 713-720 (4), 737-740 (5), et 766-778 (6) La flexibilité des régions charnières est représentée par une flèche blanche.

La figure 4B est une modélisation représentant le repliement possible du domaine homologue du CCP sur le domaine homologue du MPO (le domaine homologue de l'EGF n'est pas représenté pour simplifier la figure). Une flèche blanche indique le mouvement possible du domaine homologue du CCP pour former la surface de fixation immunodominante virtuellement représentée par trois lignes gris clair tachées. La jonction entre les domaines homologues de la MPO et du CCP est montrée par les lignes blanches tachées.

La distance (en A) entre les régions 377-387 et 713-720 est montrée. Le modèle a été ajusté en utilisant le logiciel public Swiss-PDB viewer 3.7b2 disponible à l'adresse URL : www.expasy.ch/spdbv.

- La figure 5 montre les résultats des analyses par Western Blot et ELISA qui prouvent que l'aAc T13 reconnaît les domaines homologues de la MPO et du CCP.

La figure 5A montre les Western Blots avec des protéines membranaires natives ou dénaturées réalisés comme indiqué dans les Méthodes. Des anticorps monoclonaux Acm 47

(10 gg/ml), Acm 6F5 (10 jlg/ml), l' aAc T13 (10 jlg/ml), et des antisérums polyclonaux de lapin (1:300) ont été

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utilisés et identifiés sur la droite de la figure. Les bandes spécifiques de la TPO sont montrées par des flèches noires et les masses moléculaires en kDa sont indiquées sur la gauche.

La figure 5B illustre les expériences d'ELISA par compétition réalisées avec des anticorps monoclonaux murins Acm 47, Acm 6F5, et l'Acm 2C2 dirigé contre la digoxigénine (contrôle), comme compétiteurs pour la fixation de l'aAc T13 à la TPO (voir les Méthodes).

- La figure 6 illustre que la liaison des Acm antiTPO et des sérums de patients sur les protéines membranaires est affectée par les mutations de la TPO. Les effets des mutations de la TPO sur la fixation des Acm anti-TPO ou des sérums des patients ont été évalués par ELISA.

La figure 6A montre les résultats obtenus avec l'aAc T13 ou Acm 6F5. (b) Les sérums des patients ayant une thyroïdite de Hashimoto [patient 1 (-#-), patient 2

(HB- ) , patient 3 (-# ) , patient 4 ( + ) , et patient 5 ( -X- )], une maladie de Basedow [patient 6 (-O-),

patient 7 (#Et- ), patient 8 (-- ) , patient 9 (-8- ) , et patient 10 (-X-)], les autres affections auto-immunes ont été testés pour leur capacité à fixer les protéines de membrane extraites des cellules CHO transfectées stables ou de type sauvage (voir les Méthodes). Les résultats sont donnés en absorbance après soustraction des valeurs du bruit de fond correspondant à la fixation des sérums aux protéines de membrane des cellules CHO non transfectées et sont exprimées comme la moyenne des valeurs dupliquées +/SD.

I - Méthodes.

1) Sérums des patients.

Les sérums de cinq patients atteints de la maladie de Basedow, ceux de cinq patients ayant une thyroïdite de Hashimoto, et ceux de quatre donneurs sains ont été obtenus

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(Hôpital Guy de Chauliac, Montpellier, France). Les titres d'aAc anti-TPO ont été déterminés par radio-immunoessai en utilisant un kit TPO AB-CT (Cis bio, Gif sur Yvette, France). Les sérums des patients ont ensuite été caractérisés pour la présence d'aAc anti-récepteurs de la TSH par un essai avec un récepteur radio-marqué en utilisant le kit à usage humain TRAK (BRAHMS, Hennigsdorf, Germany) et pour leurs taux en T3, T4 et TSH. Comme contrôle, huit sérums de patients souffrant d'autres maladies auto-immunes, deux de diabète de type 1 (T1D), quatre d'un lupus érythémateux systémique (SLE), un de vascularite et un d'arthrite rhumatoïde (RA).

2) Matériel.

De la TPOh, purifiée (pureté supérieure à 95%) de glandes thyroïdes, a été utilisée. Le plasmide codant pour la TPO humaine complète a été fourni par le Cedars-Sinai Médical Center, Los Angeles, Californie, USA. Les Acm antiTPO Acm 47 ont été fournis par l'Unité INSERM 555, Marseille, France. (42) . Les Acm anti-TPO Acm 6F5 et les sérums polyclonaux de lapin anti-TPO ont été respectivement obtenus auprès de Hy Test Ltd (Turku, Finlande) et Abcys S.A. (Paris, France).

3) Clonage, expression et purification de l'aAc T13 humain.

Le fragment scFv de l'anticorps anti-TPO recombinant humain T13 a été sélectionné à partir d'une banque d'anticorps présentés par des phages obtenues à partir de cellules B extraites de tissus thyroïdiens de patients atteints de la maladie de Basedow (40). L'aAc T13 a été exprimé sous forme d'immunoglobuline IgGl entière en utilisant le système cellulaire baculovirus/insecte comme décrit (41,43-44). L'IgGl T13 a été purifiée par chromatographie d'affinité sur une colonne de protéine G et la concentration a été déterminée par l'absorbance à 280nm (E0,1% =1,40).

4) Pureté, spécificité, et paramètres cinétiques de l'aAc T13.

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La pureté a été analysée par électrophorèse sur gel d'acrylamide 8% en présence de SDS (SDS-PAGE) dans des conditions non-réductrices, suivie d'une coloration au Bleu brillant de Coomassie ou d'un transfert sur une membrane PVDF (Novex, San Diego, Californie, USA) et révélée par un anticorps spécifique anti-Fc de l'IgG humaine conjugué à la peroxydase (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) dilué au 1:1000, en utilisant un système de détection ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA).

Puis, la spécificité de l'aAc a été déterminée par ELISA.

Les puits de la plaque de microtitration ont été recouverts avec 9 nM de TPO 1 g/ml) dans 10 0 mM de NaHC03 , pH 9, pendant toute une nuit à 4 C. Les puits ont été lavés avec 0,05% de Tween 20 dans du PBS (PBS-T), pH 7,3 et saturés avec du lait en poudre 2% dans du PBS-T pendant une heure à 37 C. Après lavage, l'aAc T13, ou l'IgGl humaine purifiée (Sigma) utilisée comme contrôle, a été incubé avec 1% de lait en poudre dans du PBS-T (tampon d'incubation) pendant 1 h 30 à 37 C. Après lavage, un anticorps anti-IgG humaine conjugué à la phosphatase alcaline (Sigma, dilué au 1:1 000) a été ajouté au tampon d'incubation, et les puits ont été incubés pendant 1 h à 37 C. Après trois lavages, la réactivité a été révélée avec du 4-nitrophenyl phosphate 1mg/ml dans du diéthanolamine/HCl 0,5M, pendant 1 h à 37 C.

Les paramètres cinétiques de l'aAc T13 ont été obtenus par l'analyse en temps réel comme cela a été précédemment décrit (41). L'aAc T13, exprimé comme fragment scFv ou comme immunoglobuline IgGl intacte, inhibe entre 7,3 et 100% de la liaison à la TPO des échantillons de sérum des patients atteints de MAIT qui ont été testés (40,41).

5) Sélection et enrichissement (Panning) suivi du criblage des peptides présentés par des phages.

Quatre banques de phages (LX-8/f88.4, X15/f88.4, X8CX8/f88.4 et X3o/f88.4) dans lesquelles les peptides ont été exprimés à l'extrémité N-terminale de la protéine pVIII et présentés à la surface du bactériophage filamenteux M13, ont été obtenus auprès de l'Université Simon Fraser,

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Burnaby, Canada (45). Les phages spécifiques de l'aAc T13 ont été sélectionnés par une méthode de panning comme précédemment décrit (46). Les phages-peptides spécifiques de l'aAc T13 ont été élues (i) au moyen d'une élution acide, avec 3 ml d'une solution : 0,1 M HCl, 0,1 M de glycine, BSA 1 mg/ml, pH 2,2, pendant 30 minutes à température ambiante puis neutralisés par ajout de 300 l de Tris-HCl 5 M, pH 9,2, (ii) par compétition avec une solution de TPO 180nM (20 g/ml dans 5 ml de NaCl/Tris (50 mM Tris base, 150mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5) pendant 2 heures à 37 C. Les phages-peptides ont été amplifiés après chaque tour de panning en utilisant une culture cellulaire K91 d'Escherichia coli en croissance exponentielle et les phages-peptides T13-spécifiques ont été clonés et caractérisés par ELISA comme il a été décrit (46). Les clones ayant donnant une absorbance plus de deux fois supérieure au niveau de base ont été sélectionnés.

Chaque clone sélectionné et purifié a ensuite été vérifié par ELISA pour sa capacité à être inhibé par la TPO soluble à une concentration de 90 nM (10 g/ml). Les puits des plaques de microtitration ont été recouverts avec l'aAc T13 à une concentration 13 nM dans 100 mM de NaHC03, pH9, pendant toute une nuit à 4 C. Les puits ont été lavés avec 0,05% Tween 20 dans du PBS (PBS-T), et ensuite du lait en poudre (2%) dans du PBS-T a été ajouté pendant 1 h à 37 C.

Après saturation et quatre lavages, une dilution au 1:10 des phages purifiés de chaque clone a été co-incubée avec la TPO soluble pendant 1 h 30 à 37 C. Après lavage, un anticorps anti-M13 conjugué à la peroxydase (Amersham Pharmacia Biotech) dilué au 1 :5000 du lait en poudre (1%) dans du PBS-T) a été ajouté pendant 1 h à 37 C. Trois lavages ont été réalisés et les phages résiduels liés ont été révélés avec une solution de 2-phénylènediamine (4mg/ml) contenant 0,03% (vol/vol) de peroxyde d'hydrogène dans 0,1 M de tampon citrate, pH 5,0. Après 20minutes, la réaction a été arrêtée en ajoutant 50 \il de H2SO4 2 M dans chaque puits et l'absorbance résultante a été mesurée à 490

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nm. Les phages sélectionnés, dont la fixation à l'aAc T13 a été inhibée de plus de 15%, ont été séquences pour l'identification de la séquence peptidique. Comme contrôle, l'effet de la solution contenant 90 nM de thyroglobuline soluble (60 g/ml) sur la liaison à l' aAc T13 de ces phages sélectionnés a été testée.

6) Synthèse de mimotopes, mutation successive en alanine de chaque acide aminé (alanine scanning), et immuno-essai sur des peptides fixés sur une membrane de cellulose.

Le protocole général de synthèse de peptides en parallèle Spot a été décrit précédemment (47). Douze pentadécapeptides correspondant aux mimotopes spécifiques sélectionnées de l'aAc T13 et leurs quinze analogues alanine, ont été synthétisés par la méthode Spot. Les peptides fixés à la membrane ont été testés par coincubation d'une solution d'aAc T13 (0,1 M) avec un anticorps spécifique anti-Fc humain conjugué à la peroxydase (Sigma) dilué au 1 :1 pendant 1 h 30 à 37 C.

Après trois lavages, le complexe a été révélé en utilisant le système de détection ECL (Amersham Pharmacia Biotech) sur un film sensible, et les intensités des spots ont été évaluées par le logiciel ScionImage. La membrane a été réutilisée après un cycle de régénération.

7) Alignements de séquence et modélisation moléculaire.

Chaque séquence d'acide aminé correspondant à un mimotope immunoréactif a été alignée avec les autres peptides sélectionnés ou avec la séquence de la TPO humaine en utilisant le programme d'alignement de séquence multiple Multalin (48). Les homologies de séquence entre les mimotopes spécifiques de l'aAc T13 et de la TPO humaine ont été localisées sur un modèle tridimensionnel de la TPO, en utilisant les coordonnées atomiques fournies par Hobby et al. (13).

8) Mutagenèse dirigée et expression stable d'ADN complémentaire de TPO de type sauvage (wt) et muté.

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Un site de restriction de KpnI a été ajouté par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) juste après le codon stop de l'ADNc de la TPO humaine complète. L'ADNc de la TPO sauvage (wt) a été cloné en utilisant les sites de Hind III et Kpn I dans le vecteur d'expression pcDNA5/FRT du système Flp-In (Invitrogen, San Diego, Californie, USA).

Les mutants ont été construits par extension chevauchante PCR comme précédemment décrit (49). Les mutations de substitution ont été réalisées comme suit :
La séquence 353HARLRDSGRAY363 (SEQ ID NO.1) de la TPO sauvage (wt) a été remplacée par la séquence 353NQAFQANGAAL363 (SEQ ID N0.20) dans la TPO353-363 mutante, la TPO sauvage (wt) 377PEPGIPGETR386 (SEQ ID N0.2) par 377LLTNRLGRIG386 (SEQ ID NO. 21) TPO377-386,la TPO sauvage (wt) 506ASFQEHPDL514 (SEQ ID N0.22) par 506NRYLPMEPN514 (SEQ ID NO. 23) TPO506-514,la TPO sauvage (wt) 713KFPEDFES720 (SEQ ID

NO. 24) par '13SYARLAVN'2 (SEQ ID NO. 25) TP0713-720, la TPO sauvage (wt) 737PQDD740 (SEQ ID NO. 26) par 737ALAA740 (SEQ ID NO. 27) TPO737-740,la TPO sauvage (wt) 766YSCRHGYELQ775 (SEQ ID NO. 4) par 766LTCEGGFRIS775 ( SEQ ID NO.28) TPO766-775.

Toutes les séquences ont été vérifiées par la méthode de terminaison par didéoxynucléotide (50). Le système Flp-In a été utilisé pour générer des cellules de lignée isogéniques stables de mammifère exprimant les TPO sauvage (wt) et mutées. Les cellules CHO (ATCC CCL61) ont été cultivées selon des techniques de routine dans le milieu DMEM/F-12 contenant 10% de sérum de veau f#tal (SVF). Les transfectants stables ont été obtenus comme il est recommandé par le fabricant. La lignée de cellules hôtes CHO a été construite par transfection avec 0,5 g du vecteur pFRT/lacZeo et sélection dans un milieu de croissance contenant 500 g/ml de zéocine (Cayla, Toulouse, France). Les clones résistants à la zéocineTM ont été criblés en identifiant ceux qui contiennent un seul site intégré FRT et exprimant la P-galactosidase à un niveau élevé. Un clone unique a été sélectionné et amplifié pour d'autres études. La génération de la TPO sauvage (wt)

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ou mutée a été obtenue par cotransfection, dans la lignée de cellules hôtes CHO sélectionnées résistantes à la zéocineTM, du plasmide pcDNA5/FRT résistant à l'hygromycine portant chaque forme de TPO et du plasmide pOG44 exprimant de façon constitutive la recombinase Flp. Deux jours plus tard, les cellules ont été cultivées dans un milieu supplémenté avec de l'hygromycine B 300 g/ml (Life Technologies, Carlsbad, Californie, USA). Les clones d'intérêt ont été sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine, leur sensibilité à la zéocineTM, et l'absence d'activité P-galactosidase.

9) Extraction de la protéine membranaire.

Les cellules CHO stables transfectées ont été lavées trois fois avec du PBS et placées à 4 C.

L'extraction des protéines membranaires a été réalisée comme suit : après centrifugation à 1 000 rpm pendant 5 min à 4 C, les protéines membranaires ont été solubilisées en ajoutant 500 l de tampon de lyse [50 mM de Tris/HCl, pH7,3; 150 mM NaCl ; 5 mM EDTA; 10% de glycérol; 1% Triton X100 et une tablette d'un mélange d'inhibiteurs de protéases par 10 ml de tampon de lyse (Roche diagnostics GmbH, Manheim, Germany)]et ont été incubées 30 min dans la glace. Après centrifugation à 13000 rpm pendant 30 min à 4 C, les surnageants contenant les protéines membranaires ont été récupérés et conservés à -80 C. Les concentrations de protéines ont été évaluées au moyen du réactif d'essai des protéines BCA (Pierce, Helsingborg, Sweden).

10) Analyse par Western Blot et expériences de compétition.

Environ 20 g de protéines membranaires ont été mélangées dans un tampon pour protéines (0,2 mM Tris/HCl, pH 6,8; 50% de glycérol; 1% SDS; et 0,1% de bleu de bromophénol) pour les conditions natives, supplémenté avec 10% DTT, 10% 2-mercaptoéthanol et chauffé pendant 5 min pour les conditions dénaturantes. Chaque échantillon a été chargé dans un puits individuel et a subi une électrophorèse dans un gel de polyacrylamide (9%) en

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présence de SDS. Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose, qui a été saturée avec du lait en poudre (5%) dans du PBS-T pendant 10 min à température ambiante, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase dilués dans un tampon d'incubation pendant 1 h à 37 C. Après trois lavages, le signal a été détecté par chimioluminescence ECL (Amersham Pharmacia Biotech) sur un film sensible.

Des expériences d'ELISA par compétition ont été réalisées comme suit. Les puits ont été recouverts avec de la TPO 9nM (1 g/ml) dans 100 mM de Na HCO3, pH 9, pendant toute une nuit à 4 C. Puis ils ont été lavés et bloqués avec BSA 2% dans du PBS-T (tampon de saturation), pendant 1 h à 37 C. Après trois lavages, 3 nM de mAb T13 (à une dilution donnant une absorbance de 1,5 à 490 nm) ont été incubés avec ou sans des concentrations décroissantes d'inhibiteur dans un tampon de saturation pendant 1 h 30 à 37 C sous agitation douce. Les puits ont été lavés et un anticorps anti-IgG humaine conjugué à la peroxydase dilué au 1 :2000 un tampon de saturation a été ajouté pendant 1 h à 37 C. Trois lavages ont été réalisés puis l'aAc T13 fixé à la TPO a été détecté par ajout d'une solution de 2-phénylènediamine 4 mg/ml contenant 0,03% (vol/vol) de peroxyde d'hydrogène dans un tampon citrate 0,1 M, pH 5,0. La réaction a été arrêtée par du H2S04 2 M et l'absorbance résultante a été mesurée à 490nm.

11) ELISA avec les anticorps monoclonaux (Acm) et les sérums humains.

Les puits ont été recouverts avec 20 g/ml de protéines membranaires dans du PBS pendant toute une nuit à 4 C. Les plaques ont été lavées avec du PBS-T et bloquées avec un tampon de saturation, pendant 1 h à 37 C. Après trois lavages, les Acm ou le sérum de patients ont été incubés dans un tampon de saturation pendant 1 h 30 à 37 C.

Les puits ont été lavés et l'on a ajouté l'anticorps antisouris ou anti-IgG humaine conjugués à la peroxydase (HRP),

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l'anticorps étant dilué au 1:2000 dans un tampon de saturation, pendant 1h à 37 C. Trois lavages ont été réalisés et la réactivité a été révélée comme décrit cidessus.

II - Résultats.

1) Caractérisation de l'aAc T13 exprimé sous forme d'IgG1 complète dans des cellules d'insectes.

L'aAc T13 anti-TPO a été d'abord produit sous la forme de fragment scFv humain (40). Pour la présente étude, nous avons préparé l'IgG1 T13 humaine complète en utilisant le système cellulaire baculovirus/insecte et nous l'avons purifiée par chromatographie d'affinité sur protéine-G. La pureté a été analysée sur gel d'acrylamide (10%) en présence de SDS, coloré avec du bleu de Coomassie brillant dans des conditions non réductrices (Figure 1A, cadre de gauche). Une bande de 150 kDa correspondant à l'IgG1 T13 a été visualisée et la pureté a été estimée comme étant supérieure à 95%. L'identité de la bande a été confirmée par Western Blot, sous conditions non réductrices, avec un anticorps spécifique anti-Fc d'IgG humaine conjugué à la peroxydase (Figure 1A).

Le tableau 1 ci-dessous décrit les sérums de patients souffrant de maladies de la thyroïde auto-immunes.

Tableau 1

<tb>
<tb> Patient <SEP> Maladie <SEP> Titre <SEP> en <SEP> TSH <SEP> T3 <SEP> T4 <SEP> TRAK
<tb> No. <SEP> auto- <SEP> (U/ml) <SEP> (pg/ml) <SEP> (ng/dl) <SEP> (U/ml)B
<tb> anticorps
<tb> (U/ml)A
<tb> 1 <SEP> Hashimoto <SEP> 9309 <SEP> 11,84 <SEP> 2,13 <SEP> 0,98 <SEP> ND
<tb> 2 <SEP> Hashimito <SEP> 3141 <SEP> 32,2 <SEP> 2,38 <SEP> 0,95 <SEP> ND
<tb> 3 <SEP> Hashimito <SEP> 7148 <SEP> 16,05 <SEP> 1,85 <SEP> 1,59 <SEP> ND
<tb>

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<tb>
<tb> 4 <SEP> Hashimito <SEP> 23867 <SEP> 14,80 <SEP> 1,60 <SEP> ND <SEP> ND
<tb> 5 <SEP> Hashimito <SEP> 3141 <SEP> 0,01 <SEP> 3,74 <SEP> 3,15 <SEP> ND
<tb> 6 <SEP> Basedow <SEP> 2242 <SEP> 6,02 <SEP> 2,85 <SEP> 17,2 <SEP> ND
<tb> 7 <SEP> Basedow <SEP> 4633 <SEP> 6,00 <SEP> 2,60 <SEP> ND <SEP> 19,00
<tb> 8 <SEP> Basedow <SEP> 3793 <SEP> 0,01 <SEP> 16,2 <SEP> 2,00 <SEP> 13,50
<tb> 9 <SEP> Basedow <SEP> 1429 <SEP> 2,82 <SEP> ND <SEP> ND <SEP> ND
<tb> 10 <SEP> Basedow <SEP> 1443 <SEP> 0,01 <SEP> 1,40 <SEP> ND <SEP> 1,15
<tb>

A : Les valeurs ont été obtenues par radioimmunoessai et standardisés pour le WHO/National Institue for Biological Standards and Control 66/387 (voir les Méthodes) . ' : Les valeurs ont été obtenues par un essai de radio récepteur en utilisant le kit pour usage humain DYNOtest TRAK et standardisées pour le WHO 90/762 (voir les Méthodes). c ND : Non déterminé.

Environ 5 mg d'aAc T13 purifiés ont été obtenus par litre de surnageant de culture de cellules d'insectes sf9. La spécificité de la fixation de l'aAc T13 à la TPO humaine (TPOh) a été déterminée par ELISA. Comme il est montré dans la Figure 1B, l'aAc T13 se lie spécifiquement à la TPOh de façon dose-dépendante, alors que l'IgG1 polyclonale humaine utilisée comme contrôle ne se lie pas. De plus, aucune liaison de l'aAc T13 pour la thyroglobuline n'a été observée (données non montrées).

Les paramètres cinétiques de l'aAc T13 ont été évalués par analyse en temps réel, en utilisant le BIACORE 2000 comme décrit précédemment (41), en injectant trois concentrations de TPOh purifiée sur l'aAc T13 ou sur un anticorps irrelevant (Table 2).

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Le Tableau 2 ci-dessous représente les paramètres cinétiques de l'aAc T13 comme évalués par l'analyse en temps réel.

Tableau 2

<tb>
<tb> Anticorps <SEP> Concentration <SEP> Liaison <SEP> Ka <SEP> Kd <SEP> (s-1) <SEP> KD <SEP> (nM)
<tb> en <SEP> TPO <SEP> (nM) <SEP> (RU) <SEP> (M-1 <SEP> s-1) <SEP> (x10-3) <SEP> (kd/ka
<tb> (x105) <SEP> ratio)
<tb> T13 <SEP> 45 <SEP> 72 <SEP> 1,30 <SEP> 0,14 <SEP> 1,09
<tb> 90 <SEP> 91,9 <SEP> 2,61 <SEP> 0,18 <SEP> 0,68
<tb> 180 <SEP> 106,0 <SEP> 1,64 <SEP> 0,16 <SEP> 0,98
<tb> Control <SEP> 180 <SEP> NDB <SEP> NMC <SEP> NM <SEP> NM
<tb>

A : La fixation de la TPO purifiée humaine aux anticorps monoclonaux a été mesurée par des unités de résonance (RU) comme décrit (41). Les valeurs RU ont été corrigées en soustrayant la ligne de base. NDB : Non déterminé. NMC : Non mesurable.

Il a été trouvé que l'aAc T13 montrait une affinité forte pour TPOh (KD 0,9 nM, moyenne de trois expériences), alors que la TPOh ne liait pas l'anticorps irrelevant.

2) Sélection de mimotopes fixées à aAc T13 par la technique de phage.

Il a déjà été démontré que l'aAc T13 inhibe fortement la fixation de la TPO aux aAc présents dans les sérums de patients souffrant de MAIT (40,41). De plus, il a été montré que l'aAc T13 ne reconnaît pas un épitope linéaire (données non publiées), ce qui suggère la nature conformationnelle de cet épitope dominant. Pour répondre à cette question, des biopannings ont été réalisés avec un mélange de quatre banques de phages présentant des peptides de 8, 15,17 ou 30 acides aminés à leur surface, dans le

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but d'obtenir des mimotopes spécifiques sélectionnés par l'aAc T13 et qui miment l'épitope conformationnel. Une centaine de phages ont été élués avec un tampon pH 2,2 après trois tours de panning sur l'aAc T13 et 100 autres phages après 4 tours de panning pour l'élution par compétition. Ces 200 phages ont été isolés et ensuite purifiés.

Le tableau 3 ci-dessous représente les séquences de peptides sélectionnées par banques de phages présentant à leur surface des peptides.

Tableau 3

<tb>
<tb> Procédure <SEP> Nombre <SEP> Séquence <SEP> Absorbance <SEP> Inhibition
<tb> d'élution <SEP> de <SEP> clonesA <SEP> B <SEP> (490 <SEP> nm) <SEP> c <SEP> (%)
<tb> Acide <SEP> 1 <SEP> KLLPEDDESRTYHTV <SEP> 1,32 <SEP> 19
<tb> 2 <SEP> RLAPEPDDPITPMTK <SEP> 1,25±0,06 <SEP> 22±3
<tb> 1 <SEP> TQSYPPPPAWRAASR <SEP> 2,11 <SEP> 53
<tb> 1 <SEP> QLSPESDYDDHGMRY <SEP> 3,00 <SEP> 40
<tb> 1 <SEP> KLFPEEDEMRTETQR <SEP> 1,60 <SEP> 24
<tb> 1 <SEP> SQSYPEPARGSVPMP <SEP> 3,00 <SEP> 29
<tb> Compétition <SEP> 1 <SEP> GQSYPPRPDTSLHVT <SEP> 0,50 <SEP> 28
<tb> 1 <SEP> ELNPEPDTEVFPMTF <SEP> 0,91 <SEP> 38
<tb> 1 <SEP> KNSRQSYPEPAPVYH <SEP> 0,59 <SEP> 28
<tb> 1 <SEP> ENEPPVWTTESKLQS <SEP> 0,74 <SEP> 31
<tb>

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<tb>
<tb> 1 <SEP> ESDPPVASYQWRLIN <SEP> 0,79 <SEP> 36
<tb> 1 <SEP> ESVMQSYPPHLQIPG <SEP> 0,50 <SEP> 24
<tb>
A : Clones avec la même séquence. B Absorbance correspondant à la fixation de chaque clone à l'aAc T13.

: La fixation de chaque clone à l'aAc T13 a été inhibée par la TPOh soluble ou la thyroglobuline à 90 nM ; les clones montrant une inhibition supérieure à 15 % avec la TPOh sont indiqués ; inhibition n'a été observée avec la thyroglobuline comme inhibiteur. D : Lorsqu'un clone a été représenté au moins deux fois, les valeurs d'absorbance et de pourcentage d'inhibition sont données en valeur moyenne +/- SD.

Comme il est montré dans le tableau 3, douze mimotopes spécifiques de l'aAc T13, six obtenus par élution acide et six obtenus par compétition, ont ensuite été sélectionnés en fonction de (i) leur taux de liaison à l'aAc T13 par ELISA et (ii) leur capacité à entrer en compétition avec la TPOh soluble comme inhibiteur pour la liaison à l'aAc T13 ; seuls les mimotopes avec au moins 15% d'inhibition ont été montrés. Cette inhibition a été classée de 19% à 55% pour les mimotopes sélectionnés. La fixation de ces mimotopes n'a pas été inhibée par la thyroglobuline, utilisée comme protéine de contrôle (données non montrées). Seuls les peptides dérivés de la banque X15/f88.4 ont été obtenus, suggérant que la conformation des peptides de 15-mers conduit à une meilleure reconnaissance par l'aAc T13. D'autre part, des expériences similaires ont été réalisées avec un autre aAc humain anti-TPO et ont permis la sélection de peptides issus des banques X15/f88.4, X8CX/f88.4 et X3o/f88.4 (résultats non publiés). Excepté pour le mimotope RLAPEPDDPITPPMTK (Table 3), chaque séquence peptidique a été obtenue individuellement.

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3) Analyse des mimotopes spécifiques de aAc T13 par alignement de séquence et technique Spot.

Les mimotopes spécifiques de l'aAc T13 ont été alignés les uns avec les autres et regroupés en trois familles selon leur homologie de séquence (Tableau 4).

Le tableau 4 ci-dessous indique la classification des mimotopes par homologie de séquence.

Tableau 4

<tb>
<tb> Famille <SEP> 1 <SEP> Famille <SEP> 2 <SEP> Famille <SEP> 3
<tb> QLSPESDYDDHGMRY <SEP> KNS-RQSYPEPAPVYH <SEP> ENEPPVWTTESKLQS
<tb> KLLPEDDESRTYHTV <SEP> S--QSYPEPARGSVPMP <SEP> ESDPPVASYQWRLIN
<tb> KLFPEEDEMRTETQR <SEP> T--QSYP-PPPAWRAASR
<tb> RLAPEPDDPITPMTK <SEP> GQSYP-PRPDTSLHVT
<tb> ELNPEPDTEVFPMTF <SEP> ESVMQSYP-PHLQIPG
<tb>

Les familles 1, 2 et 3 contiennent des mimotopes portant les motifs homologues qui sont respectivement LxPExD, (S/T)x2QSYPxP, et E x2PPV x6L (où x représente n'importe quel acide aminé). Cependant, les peptides KNSRQSYPEPAPVYH, QLSPESDYDDHGMRY, et SQSYPEPARGSVPMP ont montré des similarités trouvées dans les familles 1 et 2. Plus généralement, les mimotopes ont souvent une séquence riche en proline représentant entre 6,6 et 27% de leurs résidus. Les résidus acides étaient fortement représentés dans les séquences de la famille 1 (entre 6,6 et 33% de leurs résidus) et pour une moindre part dans la famille 3 (entre 13,3 et 20% de leurs résidus).

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Pour déterminer les acides aminés critiques impliqués dans la reconnaissance de chaque peptide par l'aAc T13, chaque mimotope, dont chaque acide aminé a été muté successivement en l'alanine (alanine scanning), a été synthétisé sur une membrane de cellulose par la méthode Spot. La plupart des douze mimotopes ont réagi fortement avec l'aAc T13. Le mimotope 8 qui n'a pas montré de réactivité avec l'aAc T13, et le mimotope 3 qui a montré une réaction croisée avec l'anticorps secondaire (Figure 2B), ont été éliminés pour les études suivantes d'alanine scanning. Comme il est montré dans la Figure 2B, le remplacement systématique en l'alanine de chaque acide aminé et pour chaque mimotope a révélé les résidus critiques pour la fixation de aAc T13 et a montré trois motifs critiques différents, LxPExD, QSYP et Ex(E/D)PPV pour les familles 1, 2 et 3 respectivement ; ces motifs ont été corrélés avec ceux démontrés par l'homologie de séquence. De plus, les résultats d'alanine scanning ont clarifié l'ambiguïté pour l'attribution des peptides indiqués ci-dessus, par exemple, les peptides 7 et 12, KNSRQSYPEPAPVYH et SQSYPEPARGSVPMP, ont été définitivement attribués à la famille 2, alors que le peptide 10, QLSPESDYDDHGMRY, appartient à la famille 1 (tableau 4).

4) Localisation des sites putatifs d'interaction de l' aAc T13 sur la TPO humaine.

Les séquences d'acides aminés des mimotopes spécifiques de aAc T13 ont été alignées avec la séquence primaire de la TPOh afin d'identifier les régions qui contiennent des homologies de séquence avec la TPO. Tout d'abord, l'alignement des motifs critiques préalablement identifiés par la technique de Spot (Figure 2B) , avec la séquence primaire de la TPOh a été effectué. Ensuite, les autres acides aminés de chaque peptide ont été alignés selon la meilleure homologie avec la séquence primaire de la TPOh. Comme montré sur la Figure 3, cette procédure a permis d'identifier quatre régions différentes (les résidus 356-382,713-720, 737-747, et 766-775) qui ont montré le

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meilleur appariement avec les mimotopes et leurs motifs critiques. De façon intéressante, les deux régions portent les acides aminés LYS713 et Tyr772 décrits précédemment comme critiques pour l'immunodominance (15,32). L'analyse du modèle tridimensionnel de la TPOh a montré que ces régions étaient localisées à la surface de la structure globulaire (Figure 4A) et peuvent former une surface de liaison immunodominante entre les domaines homologues de la MPO et du CCP, dû à la flexibilité de la région charnière (Figure 4, A et B). Comme ces localisations correspondent aux sites putatifs d'interaction de l'aAc T13 sur la TPO, nous avons produit six TPO mutantes par extension chevauchante PCR (Table 5) en se basant sur l'alignement de séquence.

Le tableau 5 ci-dessous représente la comparaison des séquences d'acides aminés entre les TPO de type sauvage et mutées.

Tableau 5

<tb>
<tb> MutantA <SEP> Séquence <SEP> de <SEP> Séquence
<tb> type <SEP> sauvage <SEP> mutée
<tb> TPO353-363 <SEP> HARLRDSGRAY <SEP> NQAFQANGAAL
<tb> TPO377-386 <SEP> PEPGIPGETR <SEP> LLTNRLGRIG
<tb> TPO506-514 <SEP> ASFQEHPDL <SEP> NRYLPMEPN
<tb> TPO713-720 <SEP> KFPEDFES <SEP> SYARLAVN
<tb> TPO737-740 <SEP> PQDD <SEP> ALAA
<tb> TPO766-775 <SEP> YSCRHGYELQ <SEP> LTCEGGFRIS
<tb>
A : Les mutants sont indiqués par la position du premier et du dernier acide aminé dans la séquence primaire de la TPOh.

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Le modèle tridimensionnel a révélé que la région 356-382 présentait deux boucles exposées autour du site putatif d'interaction ; par conséquent, deux TPO mutantes distinctes ont été construites, chacune montrant une région mutée sur chaque boucle distincte (TPO353-363 et TPO377-386).

Comme contrôle, une TPO mutante, portant une région mutée (résidus 506-514) non identifiée par l'alignement des mimotopes mais localisée à proximité de l'RID (site d'identification de la liaison) (Figure 4, A et B), a aussi été générée. Toutes les mutations sont réalisées selon deux règles : (i) lorsqu'ils sont différents, les acides aminés sont remplacés par ceux présents dans la séquence primaire

de la MPO humaine pour les mutants TPO353"363, TPO377"386, TPO506" 514 et TPO713-720 ou par la séquence primaire du domaine CCP de la protéine du facteur H pour le mutant TPO766-775, et (ii) lorsqu'ils sont similaires, les résidus sont présents dans les séquences TPO/MPO et les séquences TPO/facteur H, les acides aminés sont alors remplacés par des résidus non chargés (alanine ou leucine). Par exemple, l'acide aminé Arg355 a été remplacé par Ala355 dans la protéine mutée (TPO353-363).Pour le mutant TPO737-740, localisé en périphérie des parties des modules MPO et CCP, seulement les substitutions de l'alanine et de la leucine ont été utilisées. Finalement, le résidu Cys768 n'a pas été changé puisqu'il peut contribuer au repliement total de la molécule de TPO par la formation d'un pont disulfure dans le domaine homologue du CCP.

5) Expression et analyse des TPO mutées et de type sauvage.

Pour démontrer que les régions mutées font partie de la RID, les protéines sauvages (wt) et chimériques ont été exprimées dans des cellules eucaryotes en utilisant le nouveau système d'expression Flp-InTM capable de produire un taux similaire de différentes protéines d'intérêt. Par immunofluorescence, il a été observé un défaut dans le transport du mutant TPO766-775 dans la membrane plasmatique (données non montrées). Une observation similaire a été

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récemment décrite par Umeki et al. (51) qui a montré que lorsque la Gly771 est remplacée par Arg771 dans les gènes de la TPO de patients, il en résulte un défaut de localisation (accumulation de TPO mutée dans le réticulum endoplasmique) et cause un hypothyroïdisme congénital. Pour résoudre ce problème, il a été décidé d'extraire toutes les protéines de membrane des cellules CHO sauvages et transfectées stables, et de les étudier par Western Blot et ELISA. Tous les anticorps testés par Western Blot sont réactifs, sous conditions non réductrices, avec une protéine d'environ 110kDa, correspondant à la TPOh (Figure 5A). L'antisérum polyclonal de lapin est capable de reconnaître toutes les TPO mutantes quelles que soient les conditions. Les mutations en général n'affectent pas le niveau d'expression pour la plupart des protéines chimériques, bien que l'expression de la TPO737-740 mutée est plus faible qu'avec les cinq autres. Cette expression plus faible a été confirmée avec tous les Acm testés. Comme attendu, l'Acm 47, qui reconnaît un épitope linéaire (713-721) (42), ne fixe pas le mutant TPO713-720 mais réagit avec tous les autres mutants dans des conditions natives ou dénaturantes. De façon surprenante, l'Acm 6F5, de même que l'aAc T13, ne réagissent pas dans des conditions dénaturantes avec la TPO sauvage (wt) ou mutée (Figure 5A). De plus, seule la liaison de l'Acm 6F5 à la TPO766-775 mutante était éliminée dans des conditions natives. Ces résultats démontrent que l'Acm 6F5 et l'aAc T13 sont dirigés contre deux épitopes conformationnels différents qui se chevauchent dans la région 766-775. Ces observations permettent de conclure que (i) le repliement des TPO mutantes est homologue à celui de la TPO sauvage (wt) et (ii) dans les régions mutées, les acides aminés 766-775 composent seulement une partie de l'épitope conformationnel reconnu par l'Acm 6F5. Enfin, les réactivités de l'aAc T13 sur les protéines natives sont différentes en fonction des mutants. Des signaux forts ont été observés avec la TPO sauvage (wt) et la TPO506-514 mutée, alors que la liaison de l' aAc T13 aux mutants TPO353-363,

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TPO377-514,et TPO766-775 était notoirement diminuée ou n'existait plus pour le mutant TPO713-720. Pour confirmer que l'épitope reconnu par l'aAc T13 est localisé à la fois dans les domaines homologues de MPO et du CCP, les Acm 47 et 6F5 ont été utilisés en compétition avec l'aAc T13 pour la liaison à la TPO en ELISA. Comme cela est illustré Figure 5B, les Acm entrent en compétition de façon dose-dépendante avec l'aAc T13 et inhibent partiellement la liaison de l'aAc T13, l'inhibition étant de 45% et de 35% pour les Acm 47 et 6F5 respectivement, avec un excès molaire de 100 pour l'inhibiteur. Aucune inhibition n'a été observée avec un Acm contrôle. Toutefois, il ne peut pas être exclu un effet d'encombrement stérique en utilisant la méthode par compétition, c'est pourquoi nous avons étudié l'interaction de l'Acm 6F5 et l'aAc T13 avec les protéines membranaires des TPO sauvage (wt) et mutées par ELISA (Figure 6A). Alors que l'Acm 6F5 reconnaît de façon similaire les TPO sauvages (wt) et mutées (exceptée la TPO mutée 766-775), l'aAc T13 qui a montré une liaison significative et spécifique pour la TPO sauvage (wt) et, comme attendu pour la TPO506-514 mutant, présente une diminution significative de liaison sur les autres mutations de la TPO. Les mutations 353-363,377-386, 766-775, ont partiellement affecté la reconnaissance de l'aAc T13 pour la TPO, alors que les changements d'acides aminés de 713-720 ont complètement empêché la liaison de l'aAc T13 à la TPO. Ces résultats renforcent les observations précédemment obtenues par Western Blot (Figure 5A) .

6) Analyse de la reconnaissance des TPO mutées par les sérums des patients.

Pour placer cette étude dans un contexte d'étude pathologique, la liaison des aAc anti-TPO présents dans les sérums des patients souffrant de MAIT, d'autres affections auto-immunes et de donneurs sains a été testée par ELISA comme cela a été réalisé ci-dessus avec l'Acm 6F5 et l'aAc T13 (Figure 6B). Alors que les sérums des donneurs sains ou des patients souffrant de maladies auto-immunes (T1D, SLE,

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RA, ou vascularite) ne réagissent avec aucun des clones, tous les sérums des patients atteints des maladies de Hashimoto ou de Basedow lient spécifiquement la TPO sauvage (wt) de façon dose-dépendante. Les mutations contrôles dans les positions 506-514 n'affectent pas globalement la liaison des aAc présents dans les sérums des patients, alors que les mutations dans les autres positions diminuent leur fixation à la TPO. De façon intéressante, ces mutants peuvent être classés en deux groupes, ceux qui affectent faiblement la liaison des aAc anti-TPO (TPO377-386) et ceux

qui l'affectent fortement (TP0353-363, TPO713"720, Tpo766-775) Par opposition avec les études de compétition entre les Acm anti-TPO et aAc polyclonaux présents dans les sérums des patients précédemment décrits par notre groupe ou par d'autres équipes (13,14,25,40-41) dans lesquels les résultats pouvaient être biaisés par l'encombrement stérique, les effets de chaque mutation sur la fixation des aAc polyclonaux anti-TPO présents dans les sérums ont ici le même profil pour une mutation particulière. Des résultats similaires ont été obtenus par le groupe de McLachlan et Rapoport (30).

III - Discussion.

La structure tridimensionnelle de la molécule de TPOh n'a pas été résolue par des études de cristallographie, même si des cristaux diffractants de faible résolution ont été obtenus (17,18). Cependant, l'analyse de la structure tridimensionnelle de la TPOh évaluée par modélisation d'homologie, révèle une structure hautement complexe comprenant trois parties distinctes, les domaines homologues de la MPO, du CCP, et du EGF (13).

Cette architecture hautement organisée de l'aAg TPO est une explication plausible pour la réactivité des aAc anti-TPO, qui est principalement dirigée contre une RID sur la structure native de leurs aAg (19,53). Des investigations préalables ont eu pour but de définir la RID en utilisant

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des antisérums polyclonaux de lapin dirigés contre les fragments polypeptidiques de TPO (13,24) ou des Acm (25) en compétition avec les aAc humains. Ces études, même si elles conduisent à une meilleure connaissance de la RID, ont utilisé les anticorps produits par immunisation d'animaux qui ne reflètent pas exactement le répertoire des anticorps anti-TPO spécifiques humains dans les MAIT. D'autres études (33-35), qui ont utilisé des cellules eucaryotes transfectées avec des chimères MPO-TPO, n'ont pas conduit à l'identification de la structure de la RID, probablement à cause de la faible expression de l'Ag dans des clones transfectés et/ou de l'importante hétérogénéité de l'expression de la TPO par les clones. Plus récemment, Guo et al. (30) a clairement exclu le domaine homologue de l'EGF comme étant une partie de la RID et a localisé cette région à la jonction entre les domaines homologues de la MPO et du CCP mais avec une plus large extension dans la partie MPO. Bien que ces résultats soient cruciaux pour localiser globalement la RID, jusqu'à maintenant peu de données ont été rapportées pour l'identification des régions restreintes sur ces domaines reconnus par les anticorps humains et sur la localisation dans la structure tridimensionnelle de la TPO, de la RID.

La technique de phage présentant des peptides suivie par l'alignement des séquences semble être la stratégie la plus puissante pour positionner les épitopes discontinus sur une structure hautement complexe comme la TPOh (38, 39, 53). Dans la présente étude, cette technique a été appliquée à l'aAc anti-TPO T13 humain bien connu, dans le but d'identifier les peptides capables de mimer son épitope discontinu et immunodominant. Après avoir effectué les alignements des séquences entre les motifs peptidiques critiques et la séquence primaire de la TPOh, il a été clairement montré par mutagenèse dirigée sur la TPOh et la génération (avec le nouveau système "Flp-In") de cellules isogéniques stables de mammifère exprimant le même taux de TPO sauvage (wt) et de TPO mutée que quatre régions

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restrictes (les régions 353-363,377-386 et 713-720 dans le domaine MPO-like et la région 766-775 dans le domaine CCPlike de la TPO) définissent la surface de fixation immunodominante (RID) sur la structure 3D de la TPOh. De plus, la comparaison de la liaison, sur les TPO sauvage (wt) et mutées, de l' aAc T13 et des aAc anti-TPO présents dans les sérums des patients a montré différents niveaux de liaison dépendant de la région mutée. Alors que les mutations de la région 377-386 affectent faiblement la fixation des aAc humains, les mutations dans les régions 353-363, 713-720, et 766-775 ont fortement réduit leur reconnaissance (Figure 6, A et B).

Ces données soulignent la nature discontinue de la RID et fournissent de nouveaux éclaircissements sur le positionnement des domaines homologues de la MPO et du CCP.

En effet, la partie homologue du CCP doit être proche du domaine homologue de la MPO pour former la surface d'interaction putative avec l'aAc T13 recombinant humain.

Comme montré dans la figure 4B, les régions 377-386,713- 720, et 766-775 (constituant les extrémités de la RID) délimitent un aAg de surface. Les zones d'interface Ag/Ac ont été identifiées pour d'autres épitopes discontinus par des analyses de cristallographie aux Rayons X et les études RMN et ont montré que ces zones d'interface Ag/Ac sont comprises entre 650 A2 et 1000 A2 (54,55). Ainsi, pour former une RID compatible avec ces zones, les distances entre les régions 377-386,713-720, et 766-775 doivent être assez proches les unes des autres. Le repliement de la structure de ces trois domaines constituant la TPOh semble être homologue de celui de protéines connues comme la MPO, la partie CCP du facteur H, et l'EGF (13), mais aucune information n'est disponible concernant le repliement exact d'un domaine par rapport aux autres. Estienne et al. (15) ont souligné la haute flexibilité de la région charnière séparant les domaines homologues du CCP et de l'EGF. Il est supposé qu'une flexibilité similaire existe entre les domaines homologues de la MPO et du CCP pour former la RID.

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De plus, deux hypothèses sont proposées pour expliquer ce phénomène : soit les domaines homologues de la MPO et du CCP interagissent directement par des interactions de type liaisons hydrogène ou liaisons salines, soit la flexibilité de la région charnière résulte d'un réarrangement permanent entre les trois modules et la liaison de l'aAc, comme par exemple l'aAc T13, sur au moins deux domaines "gèle" la structure dans une conformation stable. Si la dernière hypothèse est la bonne, cela pourrait expliquer pourquoi il est si difficile d'obtenir des cristaux avec une haute résolution de diffraction de l'ectodomaine de la TPO (17,18). La co-cristallisation de la TPO avec un Fab spécifique, stabilisant la structure, devrait définitivement résoudre ce problème.

En utilisant la technique de phage présentant un peptide, des peptides reconnus par l'aAc T13 ont été sélectionnés et les motifs critiques [LxPExD, QSYP, et Ex(E/D)PPV] impliqués dans sa reconnaissance avec les mimotopes ont été identifiés. Des résultats controversés ont parfois situé l'épitope Acm47/C21 (713-721) à l'intérieur de la RID (25,32,56) et d'autres à l'extérieur de cette région (23,35,57). L'équipe de McLachlan et Rapoport a déduit de leurs études, en utilisant l'anticorps recombinant TR1.9, que la Lys713 de la TPO située à l'intérieur de la RID reconnue par l'aAc humain, se trouve à la frontière de l'épitope reconnu par l'Acm 47/C21, comme cela est aussi suggéré pour la région 713-720 identifiée par les investigations de la Demanderesse. De façon intéressante, d'autres résidus de cette région comme la Promis, la Glu716 et l'AsP717 sont alignés avec le motif PexD, identifié dans les mimotopes de la famille 1 spécifiques de aAc T13, suggérant qu'ils pourraient contribuer à la liaison de l' aAc à la TPO. De plus, le résidu Tyr772, récemment identifié par le groupe de Ruf et de Carayon comme étant critique pour l'immunodominance (15), est compris dans la région 766-775 que la Demanderesse a caractérisée comme appartenant à la RID. Le motif QSYP,

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identifié comme critique pour la liaison de l'aAc T13 aux mimotopes de la famille 2, comprend trois résidus aussi trouvés dans la région 766-775 du domaine homologue du CCP.

Il est fait l'hypothèse que le motif QSYP mime un motif composé de résidu Tyr772 proche de la Ser667 et de Gln775 dans la structure tridimensionnelle de la TPO. Ces résidus pourraient être des acides aminés de contact à l'intérieur de l'épitope immunodominant de l'aAc. L'autre région, ayant une forte contribution, 353-363, présente aussi des résidus (Ser359, Tyr363) qui sont alignés avec le motif mimétique de la famille 2 (QSYP) identifié par l'aAc T13. Ces observations devraient offrir des pistes rationnelles pour mener les expériences de mutagenèse sur la TPOh et identifier précisément les acides aminés impliqués dans la RID, même si nous ne pouvons pas formellement exclure que l'une de ces régions contenant des acides aminés essentiels pour le repliement de la RID ne soit pas directement impliquée dans l'interaction avec les aAc.

Une autre région précédemment décrite appelée C2 (16,58), a été limitée à la région 599-617 sur la TPO et a été défini, par inhibition des aAc anti-TPO humains avec des antisérums polyclonaux de lapin dirigés contre ce peptide (13), comme un déterminant auto-antigénique majeur.

L'examen du modèle 3D de la TPO montre que l'épitope est localisé sur le site opposé du domaine homologue de la MPO par rapport à la surface immunodominante de fixation décrite par la Demanderesse. Cette observation pourrait être expliquée par le fait que des domaines antigéniques chevauchants ont été caractérisés sur la molécule de TPO.

En particulier, deux domaines immunodominants chevauchants nommés A et B (23,25) ont été décrits sur la base d'une compétition entre les anticorps anti-TPO de patients et les anticorps murins ou humains. Il est important de noter que le domaine A défini par les Acm (25) au domaine B défini par les Fabs humains (23) et vice versa. Etant donné que la Demanderesse a utilisé un aAc anti-TPO humain dans ses expériences comme l'a fait l'équipe de McLachlan et

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Rapoport (23) , il a été choisi d'utiliser la nomenclature de la RID/A et B définie par ce groupe. En conséquence, le résidu Lys713 fait partie de l'épitope reconnu par l'anticorps TR1.9 spécifique de la RID/B (32), et la région 713-720 appartient à l'épitope immunodominant représenté par l'aAc T13. De plus, l'anticorps Acm 47, qui reconnaît la RID/B, rentre en partie en compétition avec l' aAc T13 humain pour la liaison à la molécule de TPO (Figure 5B). En plus, les aAc non-IGKVl-39 comme l'aAc T13 IGLVl-40 ont été décrits comme interagissant avec la RID/B de la TPO, alors que les anticorps qui utilisent le gène de la chaîne légère de la lignée germinale IGKV1-39 ont été attribués à la reconnaissance de la RID/A (23). Compte tenu de l'ensemble de ces résultats, il est possible que l'aAc T13 recombinant humain reconnaisse la RID/B sur la molécule de TPO, même si une réaction croisée avec le domaine A due à l'imbrication de la RID/A et B ne peut pas être formellement exclue.

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Claims (10)

REVENDICATIONS

1) Peptide purifié de 5 à 20 acides aminés reconnu par les auto-anticorps dirigés contre la thyroperoxydase humaine, ledit peptide constituant un épitope discontinu issu de la région immunodominante discontinue de la thyroperoxydase humaine constituée de quatre régions distinctes de la TPO appartenant aux domaines homologues de la MPO et du CCP.

2) Peptide comprenant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'un au moins un des trois motifs critiques de formules suivantes : LxPExD (SEQ ID N0.17), QSYP (SEQ ID N0.18) et Ex (E/D)PPV ID N0.19) où x représente n'importe quel acide aminé.

3) Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit épitope discontinu est issu de la région immunodominante discontinue de la thyroperoxydase humaine constituée des régions 353-363 (SEQ ID NO.1), 377- 386 (SEQ ID N0.2), et 713-720 (SEQ ID N0.3) du domaine homologue de la myéloperoxydase (MPO) et la région 766-775 (SEQ ID N0.4) du domaine homologue de la protéine de contrôle du complément (CCP).

4) Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il répond à une séquence choisie dans le groupe comprenant les séquences suivantes identifiées par les numéros SEQ ID NO.

5 à SEQ ID NO. 16 dans la liste de séquences en annexe :

KLLPEDDESRTYHTV (SEQ ID N0.5)

KLFPEEDEMRTETQR (SEQ ID NO 6)

RLAPEPDDPITPMTK (SEQ ID N0.7)

ELNPEPDTEVFPMTF (SEQ ID NO 8)

TQSYPPPPAWRAASR (SEQ ID N0.9)

QLSPESDYDDHGMRY (SEQ ID NO.10)

SQSYPEPARGSVPMP (SEQ ID NO.11)

<Desc/Clms Page number 46>

5) Procédé de détection d'auto-anticorps anti-TPO dans un échantillon d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la mise en contact dudit échantillon avec au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 4, dans des conditions permettant la formation de complexe immunologique, b) la détection de la formation de complexe immunologique entre un auto-anticorpss anti-TPO et ledit peptide pour détecter la présence d'auto-anticorps anti-TPO dans l'échantillon de l'individu.

ESVMQSYPPHLQIPG (SEQ ID N0.16)

ESDPPVASYQWRLIN (SEQ ID N0.15)

ENEPPVWTTESKLQS (SEQ ID N0.14)

KNSRQSYPEPAPVYH (SEQ ID N0.13)

GQSYPPRPDTSLHVT (SEQ ID N0.12)

6) Procédé de diagnostic de pathologies autoimmunes plus particulièrement thyroïdiennes et ou de cancers thyroïdiens, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en #uvre d'un procédé selon la revendication 5.

7) Kit pour la mise en place d'un procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend : - une quantité suffisante d'au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 4 pour fixer des autoanticorpss anti-TPO dans un échantillon, - un ou plusieurs réactifs pour la détection des complexes immunologiques formés entre ledit peptide et les auto-anticorps anti-TPO, - éventuellement, un ou plusieurs réactif étalon comme des anticorps de référence.

8) Un anticorps anti-TPO humain dirigé contre un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.

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9) Composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent d'actif au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou un anticorps anti-TPO capable de reconnaître lesdits peptides selon la revendication 8.

10) Composition pharmaceutique selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit peptide est sous forme soluble ou sous la forme de protéines de fusion ou encore présentés par une molécule porteuse.