IT201600120204A1

IT201600120204A1 - Mimotopi conformazionali per il rilevamento di anticorpi specifici

Info

Publication number: IT201600120204A1
Application number: IT102016000120204A
Authority: IT
Inventors: Salvatore Guglielmino; Plano Laura Maria De; Santina Carnazza; Domenico Franco; Alessandra Nicoletti; Mario Zappia; Sabrina Conoci; Salvo Petralia
Original assignee: Distretto Tecnologico Sicilia Micro E Nano Sistemi S C A R L
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2016-11-28
Publication date: 2018-05-28
Also published as: US20190383834A1; US11982679B2; EP3545312A1; WO2018096512A1

Description

Titolo: “MIMOTOPI CONFORMAZIONALI PER IL RILEVAMENTO DI ANTICORPI SPECIFICI

Descrizione

Forma oggetto della presente invenzione un metodo per l’ottenimento di mimotopi di proteine che si presentano in almeno due conformazioni 3D distinte. In un’ulteriore forma di realizzazione, si rivendica un metodo per la rilevazione di anticorpi di rilevanza diagnostica che utilizza detti mimotopi. In una forma preferita, detti metodi sono applicati alla malattia di Alzheimer.

Stato dell’arte

Secondo le stime riportate dal World Alzheimer Report nel 2015 ci sono nel mondo 46,8 milioni di persone che convivono con una forma di demenza. La più comune tra queste forme, con un’incidenza tra il 50 e il 70% di tutte le forme di demenza, è la malattia di Alzheimer (AD). AD evolve sino a compromettere in un paziente affetto la capacità di svolgere le azioni della vita quotidiana.

L’analisi ed il monitoraggio di due proteine, la proteina � amiloide 1-42 (A�42) e la proteina Tau, sono ad oggi strumenti fondamentali per un corretto e precoce inquadramento diagnostico dell’AD. Tuttavia, queste analisi richiedono tecniche diagnostiche di tipo invasivo.

Approcci alternativi sono stati sviluppati, con esiti incerti.

La ricerca di biomarcatori AD-specifici presenti nel siero risulta essere l’approccio di elezione. E’ noto che autoanticorpi contro A�42 sono naturalmente presenti nel sangue umano, in forma libera o complessata all’antigene, sia in pazienti con AD che in soggetti sani (Szabo et al 2008, Gustaw et al 2008). I livelli di questi cambiano con il progredire della malattia, ma i dati riportati in letteratura relativi alle quote anticorpali presenti nel siero sono contrastanti. Una serie di lavori descrive livelli sierici di βautoanticorpi liberi, non legati all’antigene, diminuiti nei pazienti AD rispetto ai controlli (Song et al 2007, Moir et al 2005, Weksler et al 2002, Du et al 2001, Britschgi et al 2009, Brettschneider et al 2005); un’altra serie di lavori riporta invece valori aumentati (Nath et al 2003, Mruthinti et al 2004), o invariati (Hyman et al 2001, Baril et al 2004). Gli studi di cui sopra sono prevalentemente focalizzati su autoanticorpi verso Aβ42 monomerica.

Pertanto, è stato ipotizzato che autoanticorpi contro la Aβ42 oligomerica o aggregata fossero il bersaglio clinicamente più rilevante (Hock et al 2003). Sono stati proposti metodi di titolazione nel siero di autoanticorpi mediante dissociazione acida dei βimmunocomplessi, evidenziando livelli anticorpali Aβspecifici più elevati in pazienti affetti da AD rispetto ai controlli sani (Gustaw et al 2008, Gustaw-Rothenberg et al 2010). Tuttavia, utilizzando una procedura analoga, Klaver et al (2011) non hanno riscontrato alcuna differenza significativa tra i due gruppi, AD e controllo.

La disomogeneità di dati ad oggi ottenuti non rende fattibile un approccio di tipo diagnostico basato sulla valutazione degli autoanticorpi verso la proteina Aβ42. E’ fortemente avvertito un metodo diagnostico non invasivo e accurato che permetta la diagnosi di AD, così come di altre patologie caratterizzate dalla presenza di proteine che assumono più di una conformazione 3D, anche in fasi iniziali della patologia. E’ altrettanto fortemente avvertito un metodo che permetta, identificata la proteina responsabile di patologia e le conformazioni 3D che la stessa assume, di sviluppare in maniera efficace anticorpi in grado di riconoscerla.

Scopo del presente lavoro è stato quello di identificare metodi e strumenti per lo sviluppo di metodi diagnostici e/o terapeutici con le caratteristiche desiderate.

Descrizione dettagliata

La variabilità dei dati riscontrati nella vasta letteratura disponibile circa i livelli di autoanticorpi verso Aβ42 ha fatto ipotizzare che diverse e distinte varianti o multimeri della Aβ42, coinvolte nella AD, potessero essere riconosciute come antigeni conformazionali. Questo porterebbe alla generazione di diverse popolazioni anticorpali, non ugualmente riconoscibili con i diversi approcci seguiti nei diversi studi. La presenza di autoanticorpi diversi sarebbe pertanto da considerarsi la responsabile della variabilità dei dati osservati.

Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente sviluppato un approccio del tutto nuovo che permette l’identificazione di mimotopi conformazionalmente omologhi alla Aβ42. Detti mimotopi, ovvero sequenze in grado di mimare epitopi conformazionali di una proteina, sono stati utilizzati con successo come sonde per l’identificazione di anticorpi AD specifici in sistemi diagnostici.

L’approccio qui per la prima volta descritto trova una sua applicazione per l’identificazione di mimotopi di qualsiasi proteina che si presenta in più di una conformazione. Il brevetto può essere estero a tutte le patologia dovute all’alterazione di proteine che dalla conformazione standard generano dei misfolding diventando patologiche. Le forme alterate delle proteine potrebbero portare all’esposizione di nuovi epitopi, potenzialmente coinvolti nella risposta anticorpale. Tra queste patologie si segnalano: proteine prioniche coinvolte nella malattia di Malattia di Creutzfeld-Jacob; sinucleina che, trasformata in α-sinucleina, porta alla formazione di forme fibrillari nella patologia del Parkinson; huntingtina, coinvolta nella Corea di Huntington; Tau-fosforilata, coinvolta nelle malattie neurodegenerative; malattia della amiloidosi, caratterizzata dalla deposizione in sede extracellulare di materiale proteico con una struttura a foglietto β, motivo per cui per la malattia si preferisce utilizzare il termine β-fibrillosi, β-fibrillosi che vede coinvolte differenti proteine, tra queste 2βmicroglobulina, transtiretina, lisozima, fibrinogeno; polyA-binding protein, coinvolta nella patologia della distrofia oculofaringea; proteine della superfamiglia delle Serpin (serina proteasi inibitore).

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un metodo per l’ottenimento di mimotopi per proteine di interesse. A titolo di esempio, detto metodo è applicato con successo per l’ottenimento di mimotopi delle proteine selezionate nel gruppo che comprende: Aβ42, anticorpi responsabili di patologie autoimmuni, proteine prioniche, sinucleina, huntingtina, Tau-fosforilata, 2β-microglobulina, transtiretina, lisozima, fibrinogeno, polyA-binding protein, proteine della superfamiglia delle Serpin (serina proteasi inibitore).

Forma ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo diagnostico che comprende l’uso di cloni fagici esprimenti mimotopi di proteine di rilevanza diagnostica per la valutazione della presenza nel siero di anticorpi specifici per detta proteina.

E’ altresì oggetto della presente invenzione l’utilizzo di un target contro il quale generare anticorpi in grado di riconoscere e legare proteine di interesse terapeutico. In una forma di realizzazione preferita, detta proteina di interesse terapeutico è Aβ42 e detto target è la Chaperon protein caf1M di Yersinia pestis. Si descrivono altresì cloni fagici che ricomprendono le sequenze SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 e il loro uso nella diagnosi di AD e nella generazione di anticorpi terapeutici capaci di riconoscere e legare A�42.

Si rivendicano altresì le sequenze SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 e il loro uso nella diagnosi di AD e/o nella generazione di anticorpi terapeutici capaci di riconoscere e legare A�42. In una forma preferita di realizzazione, dette sequenze peptidiche sono sequenze di sintesi.

Descrizione delle figure

Figura 1: rappresentazione 3D dei 10 modelli di predizione conformazionale ottenuti per la Aβ42 singola.

Figura 2: rappresentazione 3D dei 10 modelli di predizione conformazionale ottenuti per la Aβ42 fibrillata.

Figura 3: struttura 3D dell’omologia conformazionale Aβ42 singola – Chaperon protein caf1M. A) struttura 3D che evidenzia la regione di omologia conformazionale negli AA tra la posizione 20-36 di Aβ42 in forma singola con gli AA 149-161 della Chaperon protein caf1M. B) sequenza AA delle due proteine che risulta avere la stessa conformazione.

Figura 4: A) struttura 3D che evidenzia la regione di omologia conformazionale negli AA tra la posizione 1-10 di Aβ42 fibrillata con gli AA 20-29 della Chaperon protein caf1M. B) sequenza AA delle due proteine che risulta avere la stessa conformazione.

Figura 5: struttura 3D che evidenzia la regione di omologia conformazionale tra Aβ42 in forma singola (in grigio) e Chaperon protein caf1M (in nero).

Figura 6: struttura 3D che evidenzia la regione di omologia conformazionale tra Aβ42 fibrillata (in grigio) e Chaperon protein caf1M (in nero).

Figura 7: allineamento delle sequenze dei cloni 12III1 (A), 12cIII1 (B) e 12cIII4 (C) lungo le porzioni di interesse conformazionale sulla caf1M e con Aβ42.

Figura 8: allineamento dell’inserto e degli aminoacidi esposti lungo la pVIII sequenze dei cloni 12III1 (A), 12cIII1 (B) e 12cIII4 (C) con Aβ42.

Figura 9: reattività del clone fagico 12III1 verso i sieri di pazienti AD e sieri di soggetti controllo (CTR).

Figura 10: cella elettrochimica a 3 elettrodi

Forma oggetto della presente invenzione un metodo per l’ottenimento di mimotopi di proteine di interesse caratterizzate dal presentarsi in almeno due conformazioni 3D distinte, dove detto metodo comprende:

a) Ottenere, con tool bioinformatici noti e disponibili all’esperto del settore, le almeno due conformazioni 3D della proteina in analisi;

b) Condurre, con tool bioinformatici noti e disponibili all’esperto del settore, analisi di omologia conformazionale per le due o più conformazioni ottenute al punto a) e selezionare in database di proteine la o le proteine che risultano avere la maggior omologia con le conformazioni della proteina in analisi; a titolo di esempio, detti database sono disponibili attraverso Ncbi; c) Opzionalmente, confermare l’omologia ponendo in query la struttura 3D della una o più proteine selezionate nel passaggio b) e analizzando le proteine restituite, tra le quali deve risultare anche la proteina in analisi;

d) Identificare, in silico, la regione di omologia conformazionale tra la proteina in analisi e la o le proteine selezionate come omologhe;

e) Selezione di un anticorpo che riconosce detta regione di omologia conformazionale, definito anticorpo esca;

f) Messa a disposizione del siero di almeno un soggetto, siero nel quale è espresso un anticorpo in grado di riconoscere la proteina in analisi; g) Messa a disposizione di una libreria fagica;

h) Selezione e amplificazione, in detta libreria fagica, di cloni reattivi verso detto anticorpo esca e verso detto siero di almeno un soggetto, laddove la sequenza espressa da detti cloni è il mimotopo della proteina in analisi.

In una forma di realizzazione preferita, detta procedura di selezione della libreria fagica comprende tre cicli di selezione. Nel primo ciclo, viene isolata la popolazione fagica capace di legare le IgG-proteina in analisi. I fagi eluiti nel primo passaggio sono usati nel secondo ciclo di selezione per lo screening contro il monoclonale esca. Solo i fagi che cross reagiscono con le IgG-proteina in analisi e con l’anticorpo esca hanno la possibilità di essere selezionati. Da ultimo, viene effettuato un terzo ciclo di selezione, nuovamente diretto contro le IgG-proteina in analisi, così da selezionare i cloni fagici più affini a queste ultime. Preferibilmente, dette IgG-proteina in analisi e detto anticorpo esca sono immobilizzati su biglie, ad esempio su Dynabeads Protein G.

Tipicamente, i cloni fagici selezionati sono amplificati e il DNA degli stessi sequenziato. Dalle sequenze genomiche ottenute vengono così dedotte le sequenze amminoacidiche codificate, mediante programmi bioinformatici, ad esempio utilizzando ExPASy.

Cloni fagici esprimenti mimotopi di proteine di rilevanza diagnostica trovano applicazione in metodi diagnostici, dove detto metodo comprende:

a) Mettere a disposizione almeno un clone fagico che esprime almeno un mimotopo di una proteina di rilevanza terapeutica;

b) Incubare, con metodi noti all’esperto del settore, detto almeno un clone fagico con un siero in analisi;

c) Leggere, con metodi noti nello stato dell’arte, l’avvenuta reazione tra detto clone fagico e anticorpi eventualmente contenuti in detto siero.

Tipicamente, si utilizza un saggio di tipo ELISA e la lettura effettuata è una lettura di tipo colorimetrico. L’avvenuta reazione è indicativa della presenza, nel siero in analisi, dell’anticorpo di rilevanza diagnostica ricercato.

In un’ulteriore forma di realizzazione, si rivendica qui l’uso di mimotopi selezionati come sopra indicato per la generazione di anticorpi capaci di riconoscere e legare proteine di interesse terapeutico. A titolo di esempio non esaustivo, detta proteina di interesse terapeutico è Aβ42 e detto mimotopo è la Chaperon protein caf1M di Yersinia pestis. Alternativamente, detto metodo prevede l’uso non dell’intera proteina ma del frammento della stessa per il quale è stato dimostrato il maggior grado di omologia conformazionale con la proteina di interesse. Detto frammento ha una valenza diagnostica, come sopra descritto, oppure terapeutica, laddove detti frammenti proteici vengano utilizzati per la generazione di anticorpi che riconoscono e legano proteine di interesse.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, i saggi ELISA vengono condotti su chip, laddove il clone fagico selezionato è immobilizzato su un chip poi esposto al siero di interesse. Tipicamente, detti chip consentono una lettura di tipo ottico, elettrochimica oppure capacitativa.

Gli esempi che seguono hanno lo scopo di illustrare forme di realizzazione particolarmente preferite dell’invenzione, non sono da intendersi come limitativi per l’ambito di tutela della presente invenzione.

Esempio 1: Ottenimento di modelli delle conformazioni 3D della Aβ42 singola e fibrillata

Attraverso l’utilizzo di piattaforme bioinformatiche, sono state ricercate proteine che eventualmente presentassero conformazioni omologhe alla Aβ42.

Attraverso l’utilizzo del tool bioinformatico UniProt (http://www.uniprot.org/) è stata studiata la sequenza della proteina APP (Amyloid Precursor Protein, UniProt ID: P05067) che è una macro proteina transmembrana di 770 aminoacidi (aa) con l’estremo N-terminale (amminoterminale) extracellulare e il C-terminale (carbossiterminale) citoplasmatico, codificata da un gene situato sul cromosoma 21. La APP è noto essere tagliata in una serie di frammenti funzionali da proteasi, le secretasi. Il meccanismo che conduce alla formazione della Aβ42 da APP prevede un intervento della β-secretasi (BACE: beta APP cleavage enzyme) che taglia sul dominio extracellulare, a livello degli amminoacidi 671-672. Con gli strumenti Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) e Molecular Viewer 3D sono state individuate e rielaborate le conformazioni 3D della Aβ42 nelle sue differenti conformazioni, singola e fibrillata. Le strutture restituite sono 10 possibili modelli conformazionali che la proteina singola considerata può assumere nel mezzo acquoso e 10 possibili modelli conformazionali per la stessa proteina fibrillata. In figura 1 sono riportate le strutture 3D della Aβ42 in forma singola. In Figura 2 le strutture 3D della Aβ42 in forma fibrillata.

Disponendo dei modelli ottenuti come sopra descritto, sono state condotte analisi di omologia conformazionale, utilizzando lo strumento bioinformatico PDBeFold (EMBL-EBI, http://www.ebi.ac.uk/). L’analisi effettuata è basata sull’identificazione di residui che occupano un’equivalente forma geometrica nello spazio. La piattaforma bioinformatica ha permesso una comparazione tra le strutture 3D presenti nel database PDB con la sequenza “esca” da noi selezionata (sequenza query). L’allineamento di conformazione tra le strutture 3D della Aβ42 nelle sue differenti conformazioni è stato condotto ponendo, uno per volta, tutti i filtri proposti dal sistema, ossia: Q-score (Cα-alignment); P-score (che tiene in considerazione RMSD, il numero di residui allineati, gli eventuali gap, il numero corrispondente ad elementi di struttura secondaria); Z-score (che tiene conto delle statistiche Gaussiane); % di identità di sequenza.

Con questo approccio, il sistema ha restituito una serie di proteine. Sono state scartate quelle che risultavano presentare un solo tratto di omologia o per la Aβ42 singola o per la Aβ42 fibrillata, e scelte invece quelle proteine che risultavano avere un’omologia per entrambe le forme. E’ stata così identificata una proteina che risultava essere omologa a più conformazioni della Aβ42, la Chaperon protein caf1M (PDB ID=1p5u) di Yersinia pestis.

Per confermare l’omologia conformazionale, lo stesso approccio seguito utilizzando come esca la struttura 3D della A�42 in PDB è stato effettuato utilizzando come esca la struttura 3D della Chaperon protein caf1M. Le proteine restituite come output di omologia sono state analizzate e tra queste risultava la Aβ42.

Le figure 3, 4, 5 e 6 mostrano le strutture 3D dell’omologia conformazionale delle proteine in questione. Dalla figura 3, si osserva che la Aβ42 in forma singola risulta avere un’omologia conformazionale negli aminoacidi (aa) compresi tra la posizione 20 e 36, con gli aa collocati sulla Chaperon protein caf1M tra la posizione 149 e 161. La porzione evidenziata col colore più scuro nell’immagine si riferisce alla regione di omologia conformazionale tra le due proteine. Accanto, si evidenza la sequenza aa delle due proteine che risultano avere la stessa conformazione.

In figura 4, è riportata la Aβ42 in forma fibrillare, che risulta avere un’omologia conformazionale negli aa tra la posizione 1-10 con gli aa collocati sulla Chaperon protein caf1M dal 20-29. La porzione evidenziata col colore più scuro nell’immagine risulta essere la regione di omologia conformazionale tra le due proteine. Accanto si evidenza la sequenza aa delle due proteine che risultano avere la stessa conformazione. L’indagine di omologia conformazionale è stata verificata anche con un altro strumento bioinformatico presente in PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.dosecondary.do?p=v2/s econdary/analyze.jsp#Sequence), strumento che permette di identificare una omologia conformazionale sulla struttura secondaria tra le proteine di interesse. In questa piattaforma bioinformatica l’omologia con Chaperon protein Caf1M delle differenti forme della A�42 risulta essere presente nei punti evidenziati nelle figure 5 e 6.

In figura 5, si ritrova la Aβ42 singola e la proteina Chaperon caf1M. L’omologia risulta presente sulla Aβ42 singola nella regione 1-20, sulla Chaperon protein caf1M nella regione 148-168 con un p-value = 9,75e-01.

Con la Aβ42 in forma fibrillare, figura 6, l’omologia è presente nelle regioni 27-42 e sulla Chaperon protein caf1M, nella regione 18-33 aa con un p-value = 9,14e-01.

L’omologia conformazionale riscontrata tra le differenti forme assunte dalla Aβ42 e la proteina Chaperon protein caf1M conferma la non probabilità che queste siano casualmente simili. Infatti l’omologia riscontrata da più elementi della stessa matrice di lavoro, in diversi punti di una stessa proteina aumenta la probabilità che queste siano realmente accomunate, e che quindi non sia un caso la loro omologia (Bastas G et al. 2008). L’aver rilevato un grado sufficiente di omologia conformazionale tra Aβ42 in forma singola e Aβ42 in forma fibrillata sulla proteina Chaperon protein caf1M implica che quest’ultima proteina ricomprenda più forme di misfoding, ovvero più conformazioni, della proteina Aβ42.

Esempio 2: Selezione di librerie fagiche

Individuata la/le proteina/e con un elevato grado di omologia conformazionale, nel caso specifico la Chaperon protein caf1M, sono stati utilizzati anticorpi monoclonali diretti verso la/le stessa/e per selezionare, mediante selezioni crociate contro IgG presenti in sieri di pazienti affetti da AD, differenti librerie fagiche costruite sulla pVIII del batteriofago filamentoso M13, mediante la tecnica del Phage Display. Per lo screening di eventuali mimotopi conformazionali, omologhi al caf1M di Yersinia pestis, si è utilizzato l’anticorpo monoclonale YPF19 (AbDSerotec® A Bio-Rad Company) anti-F1 di Y.pestis, reattivo contro il solo ceppo EV76 Y.pestis, in quanto riconosce epitopi discontinui sulla proteina Chaperon protein caf1M. Inoltre, l’anticorpo utilizzato è in grado di riconoscere differenti frammenti di Yersinia pestis uguali e/o omologhi alla regione della Chaperon protein caf1M compresa tra gli aa delle posizioni 1-160, regione che risulta essere quella di interesse per l’omologia conformazionale con le differenti forme della Aβ42.

Come sorgente di anticorpi diretti contro possibili epitopi conformazionali della Aβ42 umana, si è scelto di utilizzare un pool di 5 sieri umani provenienti da pazienti con AD (IgG-AD) (età media di 77,4 anni, valore medio di MMSE = 15.2).

Protocollo di preparazione dei materiali per la selezione:

Librerie fagiche. Sono state utilizzate librerie fagiche M13, gentilmente donate dal prof. Franco Felici, esprimenti peptidi casuali, esposti sulla proteina pVIII, basate sul vettore fagemidico pC89 (Felici et al., 1991) sul quale sono state inserite sequenze oligonucleotidiche random nella regione 5’ del gene VIII presente nel vettore, sotto il controllo del promotore LacZ. La digestione con gli enzimi di restrizione EcoRI e BamHI ha linearizzato il vettore e permesso l’inserimento degli oligonucleotidi con sequenze random che, fiancheggiate dai medesimi siti di restrizione, permettono la ri-circolarizzazione del vettore tramite reazione di ligasi.

Per la selezione sono state utilizzate due tipi di librerie peptidiche, esprimenti dodici amminoacidi nella regione amminoterminale della pVIII: pVIII-12aa e pVIII-12aa-cys, dove quest’ultima presenta una costrizione cisteina-cisteina espressa nel peptide, in modo da stabilizzarne la struttura. L’ampiezza delle librerie è compresa tra i 10 e 100 milioni di cloni indipendenti. Anticorpo monoclonale YPF19 anti-F1 di Yersinia pestis: AbDSerotec® A Bio-Rad Company IgG1-9820-5007.

Anticopri AD umani: pool di 5 sieri umani provenienti da pazienti con AD (età media di 77,4 anni, valore medio di MMSE= 15.2) (IgG-AD). Per l’immobilizzazione degli anticorpi sono state utilizzate Beads super magnetiche Dynabeads® Protein G (Thermo Fischer scientific) da 2,8µm. Le soluzioni saline utilizzate per formare i tamponi di reazione sono state acquistate alla Sigma Aldrich.

Procedura di coating:

Coating delle Dynabeads® Protein G con l’anticorpo monoclonale YPF19:

1) Prelevare 50 µl di Dynabeads® Protein G e risospenderle in 500 µl di citrate-phophate buffer pH 5 in tubi eppendorf; porre in agitazione a 8 rpm per 10’.

2) Separare con dispositivo magnetico per 1-2’ quindi aspirare ed eliminare il supernatante. Ripetere per due volte i passaggi 1 e 2.

3) Aggiungere 100 µl di mAbs anti-F1 Yersinia pestis, dove la soluzione madre è diluita 1:48 così da avere 20,8 µl di anticorpo diluiti in 979,2 µl di PBS/Tween 20 0,5% e una concentrazione finale di 5 mg in 100�l.

4) Incubare per 60’ a temperatura ambiente (RT) in agitazione gentile in ruota inclinata (8 rpm).

5) Separare le Dynabeads, adesso funzionalizzate con il mAb anti-F1 Yersinia pestis (DYN-mAbYPF19) con dispositivo magnetico per 2’ ed eliminare il surnatante.

6) Lavare le DYN-mAbYPF19 due volte con 200 µl Conjugation Buffer (20 mM sodio fosfato, 0,15 M NaCl, pH 7-9). Separare le Dynabeads, funzionalizzate con il mAb anti-F1 Yersinia pestis (DYN-mAbYPF19), con dispositivo magnetico per 2’ ed eliminare il surnatante.

7) Lavare le DYN-mAbYPF19 due volte con 200 µl Conjugation Buffer (20 mM sodio fosfato, 0,15 M NaCl, pH 7-9).

8) Risospendere le Dynabeads in 250 µl di 5 mM BS3 ((bis(sulfosuccinimidyl)suberate).

9) Incubare a temperatura ambiente per 30’ con inclinazione / rotazione.

10) Bloccare la reazione di crosslinking aggiungendo 12,5 µL di Quenching Buffer, da 25 mM a 60 mM Tris.

11) Incubare a temperatura ambiente per 15’ con inclinazione / rotazione.

12) Lavare le Dynabeads per tre volte con 200 µl PBST (o IP Buffer a scelta). Posizionare il magnete e scartare il surnatante.

13) Risospendere le DYN-mAbYPF19 in 1 ml di soluzione di mantenimento, ossia PBS 1% BSA 0,01% Tween 20 pH 7,4.

Coating delle Dynabeads® Protein G con il pool sieri AD: E’ stata eseguita la procedura di coating delle Dynabeads® Protein G sopra descritta tranne che per il punto 3), variata come segue:

3) Aggiungere 100 µl di pool di sieri AD contenete IgG-AD diluito 1:10.

Pretrattamento delle librerie

100 µl di ciascuna libreria (1 × 10<12>particelle virali) sono stati aggiunti a 50 µl di Dynabeads® Protein G e risospese in 190 µl di TBS-Tween 0,1%. Dopo 30’ incubazione, separazione con dispositivo magnetico per 1-2’; il surnatante viene recuperato e utilizzato per ri effettuare i due passaggi che precedono per due volte prima dell’utilizzo delle librerie per la selezione.

Nuova metodologia di procedura di selezione

Esempio 3: Isolamento fagi di interesse, procedura “double binding”

Al fine di isolare fagi esprimenti sequenze comuni riconosciute sia dal monoclonale YPF19 che dal pool di sieri umani IgG-AD si è sviluppata una procedura di selezione definita “double binding”.

In breve, per ogni libreria sono stati effettuati 3 cicli di selezione, definiti cicli di biopanning, usando lo stesso protocollo di esecuzione. Questa procedura di cross-selezione permette, nel primo round, di selezionare la popolazione fagica in grado di legare le IgG-AD immobilizzate sulle beads. I fagi eluiti in questo passaggio, sono usati nel secondo round di selezione, per lo screening contro il monoclonale YFP19. In questo caso, solo i fagi che cross reagiscono anche con il monoclonale YPF19 avranno possibilità di legare il target, così da restringere il numero di fagi reattivi a quelli comuni tra le due classi anticorpali, IgG-AD e mAb-YPF19. Si esegue poi un altro ciclo di biopanning, con i fagi eluiti dal secondo round di selezione, nuovamente contro le IgG-AD, al fine di selezionare i pools fagici più affini a queste ultime. Primo round di selezione

1) 100 µL di ciascuna delle due librerie fagiche 12aa e 12aa-cys con titolo di 10<12>sono aggiunti a 500 µl di Dynabeads IgG-AD e posti ad incubare per 3 h a RT in agitazione gentile.

2) Separazione con dispositivo magnetico per 1-2’ ed eliminazione del surnatante che contiene i fagi che non hanno legato il target presente sulle beads funzionalizzate.

3) Eluizione dei cloni selezionati con 500 µl di buffer di eluizione, 0,2 M di glicina-HCl (pH 2,2) 0,1% BSA.

4) Neutralizzazione immediata dell’eluato fagico con 100 µl di Tris-HCl buffer 1 M, pH 9,1.

5) Amplificazione delle unità transfettanti (TU) eluite, precipitazione e titolazione secondo i rispettivi protocolli, descritti in seguito, per l’uso nel round successivo.

Secondo round di selezione

1) 100 µL di precipitato fagico del primo round di selezione sono aggiunti a 500 µl di DynabeadsmAbYPF19 e posti ad incubare per 3 h a RT in agitazione gentile.

3) Eluizione dei cloni selezionati con 500 µl di buffer di eluizione 0,2 M di glicina-HCl (pH 2,2) 0,1% BSA.

Terzo round di selezione

1) 100 µl di precipitato fagico del secondo round di selezione sono aggiunti a 500 µl di Dynabeads IgG-AD e posti ad incubare per 3 h a RT in agitazione gentile.

2) Separazione con dispositivo magnetico per 1-2’ e eliminazione del surnatante che contiene i fagi che non hanno legato il target presente sulle beads funzionalizzate.

5) Amplificazione delle unità transfettanti (TU) eluite, precipitazione e titolazione secondo i rispettivi protocolli, e uso per le analisi successive.

Esempio 4: Amplificazione dei fagi selezionati Materiali: stock di IPTG (11,9 mg/ml) Molecular Biology Certified; Soluzione stock di Ampicillina (100 mg/ml) Sigma Aldrich; Soluzione stock di Kanamicina (10 mg/ml) Sigma Aldrich; stock X-Gal Molecular Biology Certified. Le soluzioni saline utilizzate per preparare i tamponi e tutti i reagenti utilizzati per la procedura sono stati acquistati alla Sigma Aldrich. TBS (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl); PEG 20% NaCl 2,5 M.

Amplificazione degli eluati provenienti dal primo, secondo e terzo round di selezione:

I Step (amplificazione in piastra)

1) Incubare una colonia di E. coli TG1 a 37°C in LBphage in agitazione fino a OD600= 0,8.

2) Infettare 800 µl di questa coltura con 200 µl di sospensione di fagi eluiti provenienti da selezione.

3) Il campione è incubato 37°C senza agitazione per 15’, successivamente per 20’ in agitazione.

4) Inoculare l’intera aliquota, pari ad 1 ml di sospensione di cellule infettate, su LA Glucosio Amp in piastre da 120 mm e incubare a 37°C per 12-16h.

5) Versare, sul tappeto di cellule ottenuto, 8 ml di LBphage con 5 µl di ampicillina (Sol. Stock 100 mg/ml) e 2 ml di Glicerolo (Concentrazione finale 20%).

6) Recuperare le cellule con una spatola e trasferirle in tubi da 20ml.

7) Conservare a –20°C (scraping).

II Step (amplificazione in liquido)

1) Incubare 50 µl di cellule infettate provenienti dallo scraping in 10 ml di LB Amp 5 µl (della soluzione stock 100 mg/ml) e incubare a 37°C in agitazione fino a raggiungere una OD600= 0,2.

2) Aggiungere alla coltura 10 µl di fago helper M13KO7 (sol. Stock 10<12>fagi/ml) e 20 µl di IPTG (Sol. Stock 11,9 mg/ml) al fine da avere una concentrazione finale di 109 fagi/ml.

3) Incubare il campione a 37°C senza agitazione per 15’, successivamente per 4h in agitazione.

4) Centrifugare a 3000 rpm (1090 x g, Beckman rotore JA-20108) per 40’ a 4°C; recuperare il surnatante a cui viene aggiunta Azide Sodica (4 µl della soluzione stock 5% per ml recuperato). Conservare a 4°C. (amplificato dell’eluato fagico di selezione). Precipitazione amplificato proveniente dall’eluato dei tre round di selezione:

1) A 3.2 ml di surnatante fagico amplificato aggiungere 800 µl di 20% PEG/NaCl 2,5M. Lasciare decantare a 4°C per 12-16h.

2) Centrifugare a 12000 rpm (con centrifuga refrigerata da banco ‘eppendorf 5417R, 15300 x g) per 30’ a 4°C.

3) Eliminare il surnatante e il pellet è risospeso in 320 µl di TBS1x.

4) Aggiungere 80µl di PEG/NaCl 2,5M 20% ed incubare il campione in ghiaccio per 1h.

5) Centrifugare a 12000 rpm per 30’a 4°C;

6) Il surnatante viene scartato ed il pellet è risospeso in 32 µl di TBS 1x;

7) Incubare a 70 Cº per 15’, al fine di eliminare eventuali cellule di E.coli.

8) Conservare a 4°C.

Procedura di titolazione

La titolazione viene effettuata per determinare il numero di particelle fagiche infettanti per µl. Sono stati eseguite due differenti protocolli di titolazione fagica.

Primo protocollo

1) Incubare una colonia di E.coli TG1 a 37°C in LBphage in agitazione fino a OD600di 0,8.

2) Prelevare 10µl di precipitato ed aggiungerli a 90 µl di TBS (diluizione 10-1); effettuare delle diluizioni decimali con gli stessi volumi fino alla diluizione 10-9.

3) Infettare 90µl E.coli TG1 con 10 µl delle diluizioni fagiche comprese tra 10-5 e 10-9.

4) Incubare le provette campione a 37°C, lasciandole in stasi per 15’ e poi in agitazione per 20’.

5) Versare la soluzione interamente su LA Amp in piastre da 90 mm e incubare per 12-16h a 37°C.

6) Dal numero di colonie di E.coli cresciute sul terreno e considerando il fattore di diluizione, si risale al numero di TU/ml.

Secondo protocollo, titolazione fisica mediante una lettura allo spettrofotometro UV/Vis.

1) Porre in una microcuvetta in quarzo 1 ml di precipitato fagico.

2) Porre la cuvetta nell’apposita celletta dello spettrofotometro; effettuare la lettura alla lunghezza d’onda di 269 nm.

3) Attraverso il valore di assorbanza ricavato sarà possibile risalire alla concentrazione in TU/ml in quanto il valore OD=1 corrisponde a 2,2x10<12>PFU/ml (Lì et al. 2010).

La tabella 1 riporta i valori ottenuti dai diversi round di selezione, indicando l’input della quantità di batteriofagi ingegnerizzati posti all’inizio del processo di biopanning (IN), la quantità restituita alla fine del processo (OUT), ed infine il rapporto tra questi (YIELD) per indicare il numero di batteriofagi che invece sono rimasti adesi al target di selezione: Tabella 1

Selezione dei cloni positivi per entrambi gli anticorpi di interesse

I cloni fagici provenienti dal terzo round sono stati utilizzati in un saggio di doppio immunoscreening che permette di individuare, in una popolazione di fagi, i cloni positivi nei confronti degli anticorpi d’interesse.

1) Incubare una colonia di E.coli TG1 a 37°C in LBphage in agitazione fino a OD600di 0,6.

2) Prelevare 10µl di precipitato ed aggiungerli a 90 µl di TBS (diluizione 10-1); effettuare delle diluizioni decimali con gli stessi volumi fino alla diluizione 10-5.

3) Infettare 90µl E.coli TG1 con 10 µl delle diluizioni fagiche comprese tra 10-3 e 10-5.

5) Versare la soluzione interamente su LA Amp Kan IPTG in piastre da 90 mm e incubare per 12-16h a 37°C.

6) Per le piastre di diluizione in cui sono presenti un numero di colonie comprese tra 50 e 100 si procede con il protocollo.

7) Porre dei filtri di nitrocellulosa (Trans-Blot Transfer Medium 0,45 mm Bio-RAD) sulla piastra.

8) Aggiungere il tampone per replica-plating e pressare leggermente per farlo aderire al terreno.

9) Chiudere la piastra e lasciare a RT per 1 h. Per ogni test venivano preparati due filtri in sequenza.

10) Trasferire il filtro in una nuova piastra petri sterile con le colonie rivolte verso l’alto; quindi ricoprire con 10 ml di Blocking buffer 1X (PBS latte 5% Tween 20 0,05%).

11) Lasciare ad incubare per 1h e 30’ in agitazione basculante (velocità 45-50 rpm) a RT.

12) Eliminare il Blocking buffer e lavare i filtri immergendo in H2O ultra pura sterile per 1’.

Per verificare la reattività nei confronti del monoclonale YPF19:

1) ricoprire il filtro con 6 ml di anticorpo monoclonale YPF19 diluito 1:100 in PBS 1% latte 0,1% Tween 20.

2) incubare 2 h in agitazione basculante (velocità 45-50 rpm) a RT.

3) lavare il filtro per 3 volte con 10 ml di Washing Buffer (PBS Tween 20 0,05%), 5’ per ogni lavaggio, sull’agitatore basculante (velocità 45-50 rpm) a RT.

4) Eliminare il Washing Buffer e aggiungere 6 ml di anti-mouse-HRP (Abcam ab97023) diluito 1:50.000 in PBS latte 1% Tween 200,01%.

5) lavare il filtro per 3 volte con 10 ml di Washing Buffer come in 2).

6) Aggiungere 6 ml di Stable DAB Invitrogen e lasciare da 3’ a 15’ a RT in agitazione.

7) Eliminato il DAB, il filtro è lasciato asciugare. Verifica reattività nei confronti del pool di sieri AD:

1) ricoprire il filtro con 6 ml di pool di sieri AD in PBS 1% latte 0.1% Tween 20.

2) Incubare 2 h in agitazione basculante (velocità 45-50 rpm) a RT.

3) lavare il filtro per 3 volte con 10 ml di Washing Buffer), 5’ per ogni lavaggio, sull’agitatore basculante (velocità 45-50 rpm) a RT.

4) Eliminare il Washing Buffer e aggiungere 6 ml di anti-human-HPR (IgG Fc AP113P) diluito 1:15.000 in PBS latte 1% Tween 200,01%.

5) lavare il filtro per 3 volte con 10 ml di Washing Buffer come in 2).

7) Eliminato il DAB, il filtro è lasciato asciugare. Le colonie che risultavano reattive in entrambi i filtri, sono state amplificate singolarmente.

Esempio 5: Amplificazione e precipitazione dei singoli cloni risultati reattivi

1) Incubare una colonia di E.coli TG1 infettata dal clone risultato reattivo dall’immunoscreening in 10 ml di LB phage 5 µl di Ampicillina (soluzione stock 100 mg/ml) a 37°C in agitazione fino a OD600di 0,2.

2) Aggiungere 20 µl di IPTG (sol. Stock 11,9 mg/ml) e 20µl helper M13K07 titolo 1x10<12>PFU/ml (per avere una concentrazione finale di ~10<9>fagi/ml),

3) Incubare a 37°C per 30’ in statica e 30’ in agitazione a 220 rpm;

4) trasferire la coltura in 250 ml di LB phage 125 µl di Ampicillina (soluzione stock 100 mg/ml) ed incubare a 37°C in agitazione overnight a 220 rpm.

5) Raccogliere la coltura in due provette sterili da 250 ml (tipo Nalgene) e centrifugare a temperatura ambiente per 30’ a 9820xg .

6) Recuperare il surnatante e trasferirlo in due nuove provette sterili da 250 ml;

7) Ripetere la centrifugazione come sopra;

8) Filtrare l’intero amplificato nell’apparato filtratore con apposito filtro da 0,45 µm a bassa avidità proteica (in PVDF) per rimuovere le cellule batteriche residue,

9) Aggiungere azide sodica (4 µl della soluzione stock 5% per ml di sospensione fagica) e conservare a 4°C;

Gli amplificati dei singoli cloni sono precipitati come segue:

1) Aliquotare il filtrato in 2 provette da 250 ml sterili con 125 ml ciascuna;

2) Aggiungere in ciascuna 1⁄4 del volume di PEG/NaCl (ossia 31,25 ml); Incubare in bagnetto di ghiaccio per 1h e 30’;

3) Centrifugare a 4°C a 15300xg. Scartare il surnatante e risospendere ciascun pellet in 12,5 ml di TBS; unificare le sospensioni in un’unica provetta (volume totale 25 ml);

4) Aggiungere 1⁄4 del volume di PEG/NaCl (ossia 6,25 ml) ed Iincubare in bagnetto di ghiaccio per 1h e 5) Centrifugare a 4°C per 45’ a 15300 xg ; Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di TBS;

6) titolare secondo il protocollo descritto sopra e conservare a 4°C (etichettando come precipitato del rispettivo clone fagico)

Dall’immunoscreening della libreria di 12aa sono stati ottenuti 14 cloni positivi, due di questi si sono mostrati significativamente reattivi per entrambi i sieri saggiati; dalla libreria 12cys-cys si sono ottenuti 22 cloni reattivi, di cui 4 mostravano una maggior reattività per entrambi i sieri saggiati.

Esempio 6: conferma specificità di legame, saggio ELISA E’ stato effettuato un saggio ELISA adsorbendo i singoli cloni selezionati su pozzetti di piastre ELISA (Multisorp Nunc) per confermare la specificità di legame con l’anticorpo monoclonale YPF19 e con le IgG-AD del pool di sieri AD utilizzati per la selezione.

1) Porre 100 µl alla concentrazione di 10<12>di precipitato fagico dei cloni desiderati in piastra a 96 pozzetti (Multisorp, Nunc, Roskilde, Denmark) Per ogni campione l’esperimento è stato condotto in triplicato.

2) lasciare aderire sul fondo, incubando ON a 4°C. 3) Dopo incubazione, eliminare il surnatante ed aggiungere 300 µl di Blocking Buffer (PBS – Tween 20 0,05% - Non Fat Dry Milk 6%) in ogni pozzetto; incubare per 2h a 37°C in statica.

4) Eliminare il Blocking Buffer lavando una volta per 3’ con 300 µl Washing buffer con l’Immuno-Wash 12 Nunc.

Verifica specificità anticorpo monoclonale YPF19:

1) si aggiungono 100 µl del mAb (anti F1 YPF19 diluito 1:100 in PBS- Tween 20 0,1% Non Fat Dry Milk 1%). I campioni vengono lasciati ad incubare per 2h a 37°C in agitazione.

2) Eliminare il surnatante e lavare con Washing buffer come sopra per 3 volte.

3) Scartato il Washing buffer, in ogni pozzetto si aggiungono 100 µl di anticorpo anti-mouse-HPR (Abcam ab97023) coniugato, diluito 1:50.000 in PBS – Tween 20 0,1% Non Fat Dry Milk 1% e incubare per 1h a 37°C in agitazione

4) lavare con Washing buffer per 5 volte come sopra.

5) aggiunta di 100 μl di TMB, incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30’-45’.

6) Bloccare la reazione con 100 μl di HCl 1N.

7) Effettuare la lettura con ELISA reader (LabsystemMultiskanBichromatic) alla lunghezza d'onda di 450 nm.

Per verificare la specificità di risposta con il pool di sieri AD:

1) si aggiungono 200 µl del pool di sieri AD alla diluizione 1:10 in PBS- Tween20 0,1% Non Fat Dry Milk 1%. I campioni vengono lasciati ad incubare per 1h a 37°C in agitazione.

2) Eliminare il surnatante e lavare con Washing buffer come sopra per 10volte.

3) Scartare il Washing buffer, ed aggiungere 100 µl di anticorpo anti-human-HPR (IgG Fc AP113P), diluito 1:15.000 in PBS- Tween20 0,1% Non Fat Dry Milk 1%. Lasciare incubare per 1h a 37°C in agitazione.

4) Lavare con Washing buffer per 5 volte come sopra.

5) Quindi si procede con aggiunta di 100 μl di TMB, incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30’-45’.

6) Bloccare la reazione con 100 μl di HCl 1N.

7) Effettuare la lettura con ELISA reader (LabsystemMultiskanBichromatic) alla lunghezza d'onda di 450 nm. il PBS è stato utilizzato come controllo negativo per la valutazione del background di legame aspecifico.

Esempio 7: Sequenziamento dei cloni selezionati

I cloni selezionati che mostravano contestualmente maggior reattività nei confronti delle due categorie anticorpali, ovvero IgG presenti nel siero di soggetti AD e anticorpi monoclonali specifici per le proteine identificate aventi un alto grado di omologia conformazionale per A�42, sono stati sequenziati ed è quindi stata valutata la compatibilità con le regioni di omologia conformazionale 3D predetta.

Tra i cloni analizzati, è stato selezionato il clone indicato con 12III1, in grado di discriminare pool di IgG-AD mediante test ELISA.

Il DNA dello stesso è stato amplificato per PCR, sequenziato e dalle sequenze genomiche ottenute sono state dedotte le sequenze amminoacidiche codificate dallo stesso, mediante il programma bioinformatico disponibile al link www.expasy.ch

Il clone 12III1 esprime la sequenza RWPPHFEWHFDD (SEQ ID No.1).

L’indagine è stata estesa contro campioni di sieri di pazienti con AD e di controlli, mostrando la capacità di discriminare tra i due tipi di popolazione saggiate, con significatività superiore al 99% (pValue = 0,0044). Inoltre, mediante test-ELISA con Urea, è stata osservata un’alta avidità di legame da parte del clone 12III1 verso gli anticorpi IgG-AD.

Per l’amplificazione del DNA, sono stati seguiti protocolli noti all’esperto nel settore, qui riassunti:

1) Incubare una colonia di E. coli TG1 a 37°C in LBphage in agitazione fino a O.D.600 di 0,8.

2) Infettare 80 µl di questa coltura con 20 µl di sospensione del clone fagico di interesse.

3) Incubare a 37°C senza agitazione per 15’, successivamente per 20’ in agitazione.

4) Effettuare un isolamento in LA Amp in piastre da 90 mm e incubate a 37°C per 12-16h;

5) Prelevare una colonia di E.coli TG1 infetta dal clone e stemperarla in 20 µl H20.

6) Porre 1 μl di soluzione contenente il campione nella mix di reazione utilizzata per la PCR composta da: 21,25 μl di H20 PCR sterile, 10 μl di Buffer, 5 μl di ogni primer E24, SEQ ID No. 2 5’GCTACCCTCGTTCCGATGCTGTC 3’, -40 RE, SEQ ID No. 3 5’GTTTTCCCAGTCACGAC 3’.

7) La mix è stata quindi denaturata in termociclatore per 10’ a 95°C, ed in seguito aggiunti 0,25 μl di my TAQ. Ogni campione è stato sottoposto ai seguenti cicli PCR: [4’ a 94°C; 25 cicli di: 30” 94°C/ 30” 52°C/ 30” 72°C; 7’ 72°C].

8) A fine processo 35 µl sono stati utilizzati per la purificazione del DNA, il resto del campione è stato visualizzato dopo 30’ di corsa elettroforetica in un gel di agarosio a 2% con 2,5 µl di etidio bromuro.

Per il successivo sequenziamento, il DNA è stato purificato con il kit di estrazione Nucleo Spin® (Macherey-Nagel).

Oltre al già menzionato clone 12III1, sono stati identificati anche i seguenti ulteriori cloni reattivi: 12-cyc-cys, indicato come 12cIII1, sequenza GGGCIEGPCLEG (SEQ ID No. 4).

12-cyc-cys, indicato come 12cIII4, sequenza HRGCIEGPCLDA (SEQ ID No. 5).

I cloni che hanno mostrato una maggior reattività, sono stati analizzati nelle loro sequenze amminoacidiche. I peptidi, quindi, sono stati confrontati per omologia di sequenza e frequenza dei singoli aminoacidi, fra quelli dello stesso gruppo.

Attraverso il programma di allineamento CLUSTAL X sequence alignment program, utilizzando la matrice BLOSUM (Thompson, J.D., D.G. Higgins, and T.J. Gibson.

1994. NucleicAcids Res. 22:4673-4680), sono state allineate le sequenze dei cloni lungo le porzioni di interesse conformazionale sulla chaperon protein caf1M (ossia i frammenti 20-29 e 148-161) e con la A�42; i risultati sono mostrati in figura 7.

I cloni isolati dalle due librerie presentano un basso grado di omologia sia con la porzione della Caf1 interessata al riconoscimento sia con la A�42, come atteso non trattandosi di epitopi lineari. Con il programma CLUSTAL X si identificano tratti omologhi alle due regioni della A�42, così come ai frammenti della chaperon protein caf1M.

Il clone 12III1, proveniente dalla libreria 12-mer, risulta avere un omologia lungo la regione iniziale della A�42, figura 7, pannello A, a differenza delle sequenze dei cloni 12cIII1 e 12cIII4, isolati dalla selezione condotta sulle librerie 12-mer (cys-cys), le quali invece risultano avere un’omologia con la parte terminale della A�42, Figura 7, pannelli B e C.

È stato, inoltre, eseguito l’allineamento sulla A�42delle sequenze dei cloni che presentano oltre che l’inserto anche gli aminoacidi che lungo la pVIII risultano esposti, i quali potrebbero dare un contributo al riconoscimento partecipando al corretto folding del peptide. I risultati sono riportati in figura 8.

Il clone 12III1 (pannello A) allinea sulla regione (1-16) della A�42, regione implicata nel riconoscimento da parte delle immunoglobuline e nella formazione dei protofilamenti di amiloide. Il clone 12cIII1 (pannello B) allinea lungo la regione (25-35), riconosciuta come il più corto frammento della Aβ42 che esibisce la struttura a beta-foglietto (Hughes et al 2000). Il clone 12cIII4 (pannello C) allinea con la regione (16-22) che rappresenta il core idrofobico della Aβ42 principalmente soggetto ad aggregazione, noto come sito di autoriconoscimento (Neddemiep et al 2011).

È possibile notare come in presenza anche della restante parte della pVIII il peptide mantenga comunque la stessa regione di omologia con la A�42, se non per qualche variazione di posizione di pochi aminoacidi. Ad essere maggiormente influenzato dalla presenza degli aminoacidi presenti lungo la pVIII è solo il clone 12cIII4.

Esempio 8: Test diagnostico per AD

I tre cloni fagici selezionati negli esempi sopra riportati, sono stati contemporaneamente testati contro un pool di sieri di 5 soggetti sani, (MMSE > 26, nessuna patologia a carico del sistema nervoso), omogenei per età, media d’età = 77,2 anni e con il pool di sieri AD utilizzato per lo screening, media d’età = 77,4 anni. Pertanto è stato messo a punto un test ELISA, facendo adsorbire sul fondo dei pozzetti diluizioni logaritmiche scalari del clone fagico 12III1 (10<10>, 10<11>, 10<12>, 10<13>PFU/ml) e concentrazioni dei sieri pari a 1:10, 1:50 e 1:100. La procedura è stata standardizzata utilizzando la concentrazione fagica a 1x10<12>PFU/ml (OD269~1), e la diluizione sierica a 1:50. Di seguito viene riportata la procedura ottimizzata del test.

1) Porre 100 µl alla concentrazione di 10<12>di precipitato fagico dei cloni desiderati in piastra a 96 pozzetti (Multisorp, Nunc, Roskilde, Denmark) Per ogni campione, le prove sono state condotte in triplicato.

2) Lasciare aderire sul fondo, incubando ON a 4°C. 3) Dopo l’incubazione, eliminare il surnatante ed aggiungere 300 µl di Blocking Buffer (PBS- Tween20 0,05%- Non Fat Dry Milk 6%) in ogni pozzetto e incubare 2h a 37°C in statica.

4) Eliminare il Blocking Buffer e lavare i singoli pozzetti 1 volta (per 3’) con 300 µl Washing buffer (PBS-Tween20 0,05 %) con l’Immuno-Wash12 Nunc.

5) Aggiungere 200 µl del pool di sieri AD, o del pool dei sieri controllo alla diluizione 1:50 in PBS-Tween20 0,1% Non Fat Dry Milk 1%. I campioni vengono lasciati ad incubare per 2h a 37°C in agitazione.

6) Eliminare il surnatante e lavare con Washing buffer come sopra per 10 volte.

7) Scartare il Washing buffer ed aggiungere 100 µl di anticorpo anti-human IgG HPR coniugato (IgG Fc AP113P), diluito 1:15.000 in PBS- Tween20 0,1% Non Fat Dry Milk 1%. Lasciare incubare 1h a 37°C in agitazione.

8) Lavare con Washing buffer per 5 volte come sopra.

9) Aggiungere 100 μl di TMB, incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30’-45’.

10) Bloccare la reazione con 100 μl di HCl 1N.

11) Effettuare la lettura con ELISA reader (Labsystem Multiskan Bichromatic) alla lunghezza d'onda di 450 nm. Il PBS è stato utilizzato come controllo negativo per la valutazione del background di legame aspecifico.

I valori ottenuti dalla prova sono riportati nella tabella 2, in cui sono state inseriti il valore medio dei risultati ottenuti dalle tre repliche di ogni campione; la significatività è stata valutata con il test di Student.

Tabella 2:

Cloni Pool pazienti Pool soggetti t-test

AD controllo

Pvalue = 0,03 12III1 1,266 0,464 (significatività al 95%)12cIII1 0,55 0,33<Non significativo>12cIII4 0,64 0,31 Non significativo I risultati ottenuti mostrano che solo il clone 12III1 discrimina con significatività i due gruppi di soggetti. Forma pertanto forma preferita di realizzazione della presente invenzione il clone fagico 12III1 e il suo uso come mimotopo antigenico per determinare i livelli anticorpali IgG-AD.

Al fine di validare il sistema sono stati reclutati 20 pazienti affetti da AD con indice di MMSE compreso tra 20,8-6,8 e 18 controlli sani e i campioni sono stati testati secondo la metodica ELISA come segue:

1) Porre 100µl alla concentrazione di 10<12>di precipitato fagico dei cloni desiderati in piastra a 96 pozzetti (Multisorp, Nunc, Roskilde, Denmark) Per ogni campioni le prove sono state condotte in triplicato.

4) Lavare i singoli pozzetti vengono 1 volta (per 3’) con 300 µl Washing buffer (PBS-Tween20 0,05%) con l’Immuno-Wash12 Nunc.

5) Aggiungere 200 µl dei rispettivi sieri campione alla diluizione 1:50 in PBS- Tween20 0,1% Non Fat Dry Milk 1%. I campioni vengono lasciati ad incubare per 2h a 37°C in agitazione.

6) Eliminare il surnatante e lavare con Washing buffer come sopra per 10 volte.

7) Scartare il Washing buffer, ed aggiungere 100 µl di anticorpo anti-human IgG HPR (IgG Fc AP113P) diluito 1:15000 in PBS- Tween20 0,1% Non Fat Dry Milk 1%. Lasciare incubare per 1h a 37°C in agitazione.

8) Lavare con Washing buffer per 5 volte come sopra.

10) Bloccare la reazione con 100 μl di HCl 1N.

I risultati ottenuti sono riportati in figura 9.

La differenza tra le medie del gruppo dei controlli sani e quella relativa ai pazienti con AD, è significativa al 99% (pValue = 0,0044).

Si è quindi testato se gli anticorpi presenti nei sieri dei pazienti con AD che riconoscono la sequenza peptidica del 12III1 mostrassero una bassa o elevata avidità, mediante test ELISA con l’utilizzo dell’Urea 4M. Il test è stato condotto su 20 campioni, 10 sieri AD e 10 sieri Controllo, come da protocollo che segue:

1) Porre 100 µl alla concentrazione di 10<12>di precipitato fagico dei cloni desiderati in piastra a 96 pozzetti (Multisorp, Nunc, Roskilde, Denmark) Per ogni campioni condotte prove in triplicato 2) Lasciare aderire sul fondo, incubando ON a 4°C. 3) Dopo incubazione eliminare il surnatante ed aggiungere 300 µl di Blocking Buffer (PBS- Tween20 0,05%- Non Fat Dry Milk 6%) in ogni pozzetto e incubare per 2h a 37°C in statica.

4) Lavare i singoli pozzetti 1 volta (per 3’) con 300 µl Washing buffer (PBS-Tween20 0.05%) con l’Immuno-Wash12 Nunc.

6) Eliminare il surnatante e lavare per 10 volte con 250 µl di una soluzione Urea 4M- Tween20 0.05% in PBS di 3’ circa.

7) Scartare il Washing buffer ed aggiungere 100 µl di anticorpo anti-human IgG HPR (IgG Fc AP113P) diluito 1:15000 in PBS- Tween20 0,1% Non Fat Dry Milk 1%. Lasciare incubare per 1h a 37°C in agitazione.

8) Lavare con Washing buffer per 5 volte come sopra.

10) Bloccare la reazione con 100 μl di HCl 1N.

L'avidità (Avi%) viene valutata determinando il rapporto tra il risultato ottenuto senza l’utilizzo di Urea e quello ottenuto dopo trattamento con Urea.

Il test di avidità ha mostrato che il trattamento con urea non altera in maniera significativa il legame con il target (Avidity % media dei campioni considerati = 81%, compresa tra 121,53 e 61,33). Per tale ragione si presuppone che gli anticorpi legati dal clone fagico 12III1 siano anticorpi liberi ad alta avidità.

Esempio 9: implementazione su chip per la rilevazione integrata

Detection ottica

E’ stata ottenuta utilizzando un dispositivo composto da un chip in silicio (substrato) e un supporto in plastica policarbonato che crea una camera di reazione di volume di circa 400 �l. In particolare, detto substrato ha una dimensione di circa 1,2 * 1,7 cm ed è ricoperto da uno strato in alluminio, tipicamente con uno spessore di 1 �m sul quale poggia uno strato in SiO2 (TEOS 8000 A). Con l’obiettivo di ottenere un legame stabile tra detto supporto ed il batteriofago, si effettua una funzionalizzazione che prevede l’utilizzo di un agente di coupling quale ad esempio 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimmide (EDC).

I pozzetti vengono ricoperti con 20 µl di tampone MES (acido 2-(N-morfolino)etansolfonico) e lasciati decantare in statica per 10’.

Al momento dell’uso, viene preparata una soluzione di 10 mg EDC/250 µl di MES e la stessa viene dispensata in ciascun pozzetto nel quale vanno poi aggiunti 10 µl di sospensione fagica del clone 12III1 (titolo 1,4 x 10<13>PFU/ml), per avere una concentrazione finale totale di 1 x 10<11>fagi in reazione.

Il chip viene incubato per 2h a temperatura ambiente in camera umida in statica. Dopo eliminazione del surnatante e lavaggio del pozzetto con 20 µl di PBS per 5’, viene aggiunta la soluzione di blocking (PBS MILK 6% Tween20 0,05%) ed il chip viene incubato in camera umida per 2 h in statica a temperatura ambiente. Infine, il surnatante è eliminato e viene effettuato un ulteriore lavaggio come sopra.

Un test ELISA viene quindi effettuato sulla superficie di silicio, operando come segue:

-dispensare, nei pozzetti dei chip funzionalizzati con il clone fagico 12III1, 20 µl di siero AD o CTR diluito 1:50 in diluition buffer (PBS 1% MILK Tween200,05%) e incubare in camera umida a 37°C per 1 ora in leggera agitazione (100rpm).

-eliminare l’eccesso ed effettuare 10 lavaggi da 3’ ciascuno con 20 µl di washing buffer (PBS Tween20 0,05%)

-aggiungere 20 µl di anti-human IgG HPR (IgG Fc AP113P) ed incubare al buio a 37°C per 1h in leggera agitazione (100 rpm).

-eliminare l’eccesso ed effettuare 5 lavaggi da 3’ in agitazione a 50 rpm.

-aggiungere 100 μl di TMB, incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30’-45’.

-bloccare la reazione con 100 μl di HCl 1N.

-effettuare la lettura con ELISA reader (Labsystem Multiskan Bichromatic) alla lunghezza d'onda di 450 nm. Il PBS è stato utilizzato come controllo negativo per la valutazione del background di legame aspecifico.

L’esperimento condotto ha originato i risultati che seguono (i numeri si riferiscono alla lettura spettrofotometrica):

Siero AD 1: 0,939

Siero AD 2: 0,787

Siero CTR: 0,230

Alternativamente alla detection ottica, si può operare mediante detection elettrochimica. In questo caso, Viene utilizzato un chip in silicio sulla cui superficie sono stati integrati elettrodi a formare una cella elettrochimica, secondo lo schema indicato in figura 10.

Tipicamente, ogni cella elettrochimica (1) comprende tre elettrodi: reference (2), working (4) e counter (3).

In questo caso, il test ELISA avviene con l’utilizzo di un probe elettrochimico al quale fa seguito una lettura di tipo elettrochimico.

In una terza forma alternativa, la detection è di tipo capacitativo e non necessita di marcatore. In questa forma, il dispositivo in silicio ha un materiale dielettrico in superficie sul quale viene immobilizzato il fago. In seguito a saggio ELISA, viene misurata la capacità elettrica di detto dispositivo immerso in acqua.

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Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per l’ottenimento di mimotopi di proteine che si presentano in almeno due conformazioni 3D distinte che comprende: a)ottenere, con tool bioinformatici, dette almeno due conformazioni 3D della proteina in analisi; b)condurre, con tool bioinformatici, analisi di omologia conformazionale per le due o più conformazioni ottenute al punto a) e selezionare in database di proteine la o le proteine che risultano avere la maggior omologia con le conformazioni 3D della proteina in analisi; c)opzionalmente, confermare detta omologia ponendo in query la struttura 3D di dette una o più proteine selezionate nel passaggio b) e analizzando le proteine restituite, tra le quali, a conferma dell’omologia, deve risultare anche la proteina in analisi; d)identificare, in silico, la regione di omologia conformazionale tra detta proteina in analisi e detta una o più proteine selezionate come omologhe; e)selezionare un anticorpo che riconosce detta regione di omologia conformazionale, definito anticorpo esca; f)mettere a disposizione il siero di almeno un soggetto, siero nel quale è espresso un anticorpo in grado di riconoscere la proteina in analisi; g)mettere a disposizione almeno una libreria fagica; h)selezionare e amplificare, all’interno di detta libreria fagica, cloni reattivi verso detto anticorpo esca e verso detto siero di almeno un soggetto; laddove la sequenza peptidica espressa da detti cloni che possiedono detta duplice reattività è mimotopo della proteina in analisi.
2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, dove detto passaggio di selezione h) comprende tra cicli di selezione: i)esposizione di detti fagi a IgG che riconosco detta proteina in analisi, contenute nel siero di un soggetto; ii)selezione dei fagi che legano dette IgG-proteina in analisi ed esposizione degli stessi a detto anticorpo esca; iii)selezione dei fagi che legano anche detto anticorpo esca ed esposizione degli stessi a IgG che riconosco detta proteina in analisi arrivando a selezionare i cloni fagici più affini a queste ultime IgG.
3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, dove dette IgG-proteina in analisi e detto anticorpo esca sono immobilizzati su biglie.
4. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, dove dette proteine che si presentano in almeno due conformazioni 3D sono selezionate nel gruppo che comprende: Aβ42, anticorpi responsabili di patologie autoimmuni, proteine prioniche, sinucleina, huntingtina, Tau-fosforilata, 2βmicroglobulina, transtiretina, lisozima, fibrinogeno, polyA-binding protein, proteine della superfamiglia delle Serpin (serina proteasi inibitore).
5. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4, dove detta proteina in analisi è Aβ42 e detta proteina selezionata come omologa è la Chaperon protein caf1M (PDB ID=1p5u) di Yersinia pestis.
6. Un metodo per la rilevazione di anticorpi di rilevanza diagnostica che comprende: a)Mettere a disposizione almeno un siero di un soggetto in analisi; b)Mettere a disposizione almeno un clone fagico che esprime mimotopi di proteine di rilevanza diagnostica; c)Incubare detto almeno un clone fagico con detto siero; d)Leggere l’avvenuta reazione tra detto clone fagico e anticorpi eventualmente contenuti in detto siero; laddove la positività di detta reazione indica la presenza in detto siero dell’anticorpo di rilevanza diagnostica ricercato.
7. Il metodo per la rilevazione di anticorpi di rilevanza diagnostica secondo la rivendicazione 6, dove si impiega un saggio ELISA e la lettura è una lettura di tipo colorimetrico.
8. Il metodo per la rilevazione di anticorpi di rilevanza diagnostica secondo la rivendicazione 6 o 7, dove detto saggio ELISA è condotto immobilizzando detto clone fagico su chip e quindi esponendolo a detto siero in analisi e detta lettura è di tipo ottico, elettrochimica oppure capacitativa.
9. Il metodo per la rilevazione di anticorpi di rilevanza diagnostica secondo una delle rivendicazioni da 6 a 8, dove detto almeno un clone fagico è stato ottenuto con il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 5.
10. Un peptide che comprende la sequenza amminoacidica selezionata nel gruppo che comprende NH2-RWPPHFEWHFDD-COOH (SEQ ID No. 1), NH2-GGGCIEGPCLEG COOH (SEQ ID No. 4), NH2-HRGCIEGPCLDA-COOH (SEQ ID No. 5).
11. Uso di una o più delle sequenze peptidiche secondo la rivendicazione 10 per la diagnosi di AD, dove detto uso comprende: a)Preparare un clone fagico che esprima uno dei peptidi di cui alla rivendicazione 10; b)Esporre il precipitato di detto clone fagico al siero di un soggetto; c)Dopo opportuna incubazione e lavaggi, incubare con un anticorpo anti-human IgG, preferibilmente HPR coniugato; d)Leggere il risultato della reazione, laddove una positività della reazione è indicativa di patologia AD.